gıda biyoteknolojisi-2

6.3.2016
• DNA’nın replikasyonu
GIDA BİYOTEKNOLOJİSİ-2
1
2
• Replikasyon sırasında iki
atasal
iplik
ayrılır,
tamamlayıcı yavru ipliklerin
oluşmasında
kalıp
(template) olarak görev
yapar.
DNA Replikasyonu (DNA çoğalması, DNA ikileşmesi, DNA
sentezi)
• Bir hücrenin bölünebilmesi için DNA’nın da çoğalması
gerekir.
• DNA replikasyon mekanizmasının anahtarı, DNA ikili
sarmalındaki iki ipliğin de aynı bilgiyi taşımasıdır
(birbirleriyle komplementer olmaları).
Atasal
(eski) iplik
• Daha sonra oluşan yeni çift
zincirli DNA moleküllerin
bölünme sırasında iki yavru
hücreye geçer.
• Böylece oluşan iki yavru hücre de aynı DNA’ya sahip olur.
Yavru (Yeni)
iplik
Yavru (Yeni)
iplik
3
4
Replikasyonun aşamaları
• Bu yüzden DNA’nın replikasyonu yarı
korunumludur (semikonservatif). Yani oluşan
ikili sarmalin zincirlerinden biri yeni
sentezlenen zincirken, diğeri eski var olan
zincirdir.
1) replikasyon orijinine özel başlangıç proteinlerinin
bağlanması
Replikasyon orijini: replikasyonun başladığı genomdaki sabit bir noktadır. Prokaryotlarda OriC (E.coli)
olarak bilinir.
Replikasyon orijini özel başlangıç proteinleri (dnaA) tarafından tanınan ve yaklaşık 300 bazlık özel bir
diziden oluşur.(E.coli’de 245 bazdır) .
Replikasyon orijini AT zengin bölgelerdir. Böylece zincirlerin ayrılması daha kolay olur.
5
6
1
6.3.2016
•
Prokaryotlarda tek bir replikasyon orijini vardır. Ökaryotlarda çok fazla orijin bulunmaktadır
•
•
Replikon: tek bir orijinden başlayıp sentezlenen DNA’ya replikon denir
(insan genomumda 30.000 orijin bulunmaktadır)
•
Mayalarda 250-400 arasındadır..
• Replikasyonun ilk aşamasında Orijin bağlama
proteinleri (dnaA) orijine bağlanır ve
kompleksi açmak için erimeyi gerçekleştirir.
• Bu bağlanma daha sonra zincirin açılmasını
kolaylaştırır.
7
2) Çift zincirin açılması
•
8
• Genellikle orijinden itibaren iki replikasyon çatalı çift yönlü olarak çalışır
ve iplikler terminale ulaşıncaya kadar ayrı ayrı kopyalanır.
dnaA orijine bağlandıktan sonra helikaz enzimi (dnaB) çift sarmaldaki H bağlarını
kırarak zinciri açar ve replikasyon çatalı oluşur.
Replikasyon çatalı:
İpliklerin ayrıldığı ve yeni DNA sentezinin gerçekleştiği noktaya replikasyon çatalı
denir.
Replikasyon çatalı
• DNA replikasyonu E.coli hücrelerinde açığa kavuşturulduğundan,
Replikasyon için E. Coli örnek oluşturmaktadır.
• Ökaryotlarda replikasyon çok daha karmaşık olmakla birlikte temelde
bakteriyel DNA replikasyonuna benzer.
9
• Replikasyon süresince helikaz DNA üzerinde ilerleyerek sürekli
olarak ikili zinciri açar.
• Helikaz sarmalın çözülmesini çok hızlı gerçekleştirir.
• Helikaz ile çift zincir açıldıktan sonra, tek iplikler üzerine tek iplik
bağlama proteinleri (ssb) bağlanarak ipliklerin yeniden
birleşmesini (renatürasyonunu) önlerler.
10
3) RNA primer sentezi
• Yeni DNA sentezinde nükleotitlerin
eklenmesini (zincirin uzamasını)
sağlayan enzim DNA polimerazdır.
• Bütün bilinen DNA polimerazlar
deoksirobozun 3’ OH grubuna
nükleotit ekleyebilirler.
• Bu nedenle DNA’nın replikasyonu
daima 5’-3’ yönünde olur.
Zincir açıldıkça oluşan süpersarmal yapı topoizomerazlar (DNA
giraz)tarafından giderilir.
11
12
2
6.3.2016
• Ancak hiçbir DNA polimeraz DNA
sentezini başlatamaz. Bu enzim sadece
daha önce var olan 3’-OH grubuna
nükleotit ekleyebilir.
• Helikaz enzimi ile çift zincir açılır açılmaz primaz
enzimi replikasyon çatalının hemen başında yerini alır
ve gerektikçe primer sentezler.
• Bu nedenle yeni DNA zincirinin
başlayabilmesi için mutlaka önce
primer sentezlenmesi gerekir.
•
• Primer eklendikten sonraDNA polimeraz sentezi
sürdürür.
Primer: 10-15 nükleotit dizisinden oluşmuş
kısa bir RNA parçacığıdır ve özel bir RNA
polimeraz olan primaz enzimi tarafından
sentezlenir. Daha sonra zincirin uzaması DNA
polimeraz tarafından gerçekleştirilir.
13
14
• 3’-5’ yönündeki sentez mekanizması Okazaki tarafından çözülmüştür
4) Zincirin uzaması
• Okazaki DNA sentezinde bir zincirdeki sentezin 5’-3’ yönünde sürekli
devam ettiğini karşı zincirde ise kesikli sentezin gerçekleştiğini
belirlemiştir.
• Replikasyon çatalında yer alan helikaz ve
primaz enzimlerinin ardından açılan her iki
polinükleotit kalıbına yerleşen DNA
polimeraz enzimi sentezi her iki zincir de de
sürdürür.
• DNA polimeraz yeni DNA zincirini yalnızca 5’3’ yönünde gerçekleştirir.
• Açılan kalıp DNA zincirlerinde sadece birinde komplementer
polinükleotit sentezi sürekli olur. Her zaman yeni bir nükleotitin
ekleneceği serbest bir 3’-OH grubu olduğundan kesiksiz olarak DNA
sentezi gerçekleşir.
• Ancak, kalıp DNA zincirlerinin antiparaleldir
(zincirin biri 5’-3’, diğeri 3’-5’ yönünde)
• Diğer zincirde ise ters yönde ve kesikli ve kısa zincirler halinde sentez
gerçekleşir.
• Bu durumda DNA polimeraz ters zincirdeki
sentezi diğeri ile aynı anda nasıl
gerçekleştirir?
15
•
DNA sentezinin kesintisiz sürdüğü zincire kesintisiz DNA zinciri (leading strand), diğerine ise
kesintili DNA zinciri (lagging strand) denir.
•
Kesikli zincirde zincir uzaması replikasyon çatalına ters yönde olur.
•
Kesintisiz DNA zinciri tek bir primer kullanarak ve başlangıç noktasından başlayarak 5’-3’ yönünde
replikasyon çatalının açılma yönünde sentezi sürdürür.
•
Kesintili zincirde ters yönde herbiri ayrı primer gerektiren 1000-2000 nükleotitlik fragmanlar
sentezlenir ve bunlar birbirine eklenir. Bu nükleotit fragmanlarına Okazaki fragmanları denir.
16
• Kesikli zincirde primaz
tarafından defalarca RNA
primerleri sentezlenerek
serbest 3’-OH grubunun
oluşmasını sağlarlar.
• Bunun aksine kesiksiz
zincire sadece başlangıç
yerinde olmak üzere bir
defa primer eklenir.
17
18
3
6.3.2016
• E. Coli’de 3 tip DNA polimeraz belirlenmiştir.
DNA polimerazlar:
• DNA polimeraz I (Pol I): Birden fazla aktiviteye sahiptir.
 RNA primerlerini uzaklaştırıcı 5’-3’ ekzonükleaz aktivitesi (bu
özellik sadece bu enzimde vardır)
 DNA sentezi
kesintili zincirde kalan boşlukları tamamlar. Daha önce oluşmuş olan
RNA primerlerini uzaklaştırır ve yeni sentez yapar.
Hücredeki konsantrasyonu DNA pol lll’den daha fazla
DNA pol l: 400 mol/hücre
DNA pol lll: 10-20 mol/hücre
Nükleotitlerin eklenmesini katalizleyen
enzim.
Bilinen bütün DNA polimerazlar DNA’yı 5’3’yönünde sentezler.
Zincirdeki her yeni nükleotitin öncüsü bir
deoksiribonükleotit trifosfatdır (dNTP)
dNTP: dATP, dTTP, dGTP, dCTP,
dNTP’lerin iki terminal fosfatı uzaklaştırılır,
ve internal fosfat büyüyen zincirin
deoksibozunun 3’-OH grubuna
bağlanır.
19
20
• Ayrıca her 3 DNA polimerazın da 3’- 5’ ekzonükleaz aktivitesi
vardır.
• DNA polimeraz II (Pol ll):
• Polimerizasyon sırasında yanlış bir nükleotitin zincire
eklenmesi durumunda, kalıp DNA’da bu bazın tamamlayıcısı
olmayacaktır. Bu hatanın düzeltilmesi için geriye dönüp bu
nükleotitin çıkarılması ve ve yerine doğrusunun bağlanması
gerekir.
görevi henüz olarak bilinmiyor. Ancak çeşitli çevresel faktörlerle
(UV ışık, kimyasallar vs) oluşan DNA tamirinde kullanıldığı
düşünülüyor.
• Bu onarımlar DNA replikasyonu tamamlandıktan sonra yapılır.
• Her 3 polimeraz da 3’- 5’ ekzonükleaz aktiviteleri ile bu
düzeltmeyi (proofreading) yapabilmektedirler .
• Hata düzeltme fonksiyonu sayesinde replikasyondaki hata
oranı milyarda 1’dir
• DNA polimeraz III (Pol lll):
Her iki zincirde de replikasyonu gerçekleştiren ana enzimdir.
Polimerazlar Kofaktör olarak Mg iyonlarına gereksinim duyarlar
21
22
• DNA ligaz bazların 5’ fosfat uçları ile 3’OH uçlarını
birleştirirek ayrı ayrı oluşan DNA parçalarını fosfodiester
bağları ile birleştirir.
• DNA ligaz DNA parçalarını birleştirebilen tek enzimdir.
• Kesikli zincirde Pol lll daha önce
sentezlenen DNA’ya ulaşıncaya
kadar sentez yapar. Bu noktada Pol
lll durur.
• Sentezde rol alan bir sonraki
enzim olan DNA polimeraz l, önce,
RNA primerlerini uzaklaştırır ve
bunların yerini DNA ile doldurur.
• Son fosfodiester bağı ise DNA ligaz
ile yapılır.
23
24
4
6.3.2016
ÖZET
5) Terminasyon ve ayrılma
• DNA replikasyonundaki enzimler
• İki replikasyon çatalı oriC’nin yaklaşık 180° karşısındaki
bölgede buluşur. Bu bölgede Helikazı durduran tus gen
ürününün bağlandığı bir sonlanma noktası vardır.
• Replikasyon tamamlandığında iki halka birbirine bağlı olarak
kalmaktadır.
• Bunlar bir topoizomeraz olan topoizomeraz IV aracılığıyla
birbirinden ayrılır ve daha sonra membran tutunma
yerlerinin bir kısmıyla hareket ederek iki yavru hücreye
ayrılırlar
25
DNA’nın replikasyonunda çok sayıda protein yer alır. Bunların hepsine DNA
replikaz sistemi veya replizom denir
 Orijin bağlama proteinleri: replikasyon orijinine bağlanarak ilk denatürasyonu
gerçekleştirir.
 Helikaz :Replikasyonun başlaması için ikili sarmalı ayrılmasını sağlayan
enzimler
 Topoizomerazlar: Zincir ayrılması ile oluşan kıvrımları giderir.
 Tek zincir bağlama proteinleri: Ayrılmış zincirler tek zincir bağlama proteinleri
(ssb) ile stabilize edilir.
 Primazlar, RNA parçacıkları olan primerleri sentezler.
 DNA polimeraz III 5’-3’ OH yönünde dNTP’leri ekleyerek sentezi gerçekleştirir.
 DNA polimeraz l primerleri çıkararak boşlukları yeni DNA ile doldurur
 DNA ligaz: RNA primeri çıkarılıp yeni DNA sentezi yapıldıktan sonra boşluğu
kapatır.
26
Özet
•
•
•
•
•
•
Replikasyon orijinine orijin bağlama
proteinleri bağlarak bu bölgeyi
denatüre eder.
Helikaz enzimi zinciri iki yönlü olarak
açarak replikasyon çatalları oluşturur.
Zincir bağlama proteinleri her iki zincire
de tutunarak zincirin tekrar birleşmesini
önler
DNA primaz enzimi her iki zincir
üzerinde de primerleri sentezler. DNA
pol lll 5’-3’ yönünde dNTPleri zincire
ekleyerek sentezi gerçekleştirir.
Ters yönde olan zincirde ise
replikasyonda ters yönde gerçekleşir.
Burada primer 1000-1500 bazda bir
yeni primer sentezlenerek Pol lll
Okazaki fragmentlerinin sentezini yapar.
DNA Pol I sentezlenen primerleri
zincirden uzaklaştırır ve yerine DNA
sentezler. Son nükleotitler arasındaki
boşluk DNA ligaz ile kapatılır.
• Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR)
(DNA’nın in vitro çoğaltılması)
27
28
• Hücrede doğal olarak (in vivo)gerçekleşen replikasyon, in vitro
koşullarda da (hücre dışında) yapılabilmektedir.
• PCR ile istenilen genlerin ya da DNA dizilerinin
replikasyonu hızlandırılmış bir şekilde gerçekleştirilir.
İn vitro koşullarda DNA çoğaltılmasının nedenlerinden
başlıcaları:
- özgün bir DNA parçasının bol miktarda elde edilmesi,
moleküler analizinin yapılması
-Genetik mühendisliği amaçları doğrultusunda rekombinant
organizmalar elde edilmesi gibi
• Doğal hücre bölünmesinde olduğu gibi, PCR
replikasyon sürecini taklit ederek yaklaşık 30
jenerasyon sonra seçilmiş bir DNA dizisinin yaklaşık
milyar katını elde edebilir.
29
30
5
6.3.2016
Polimeraz zincir reaksiyonunun oluşum mekanizması
• Polimeraz zincir reaksiyonu spesifik bir DNA parçasının
kopyalarının primerler tarafından yönlendirilerek, enzimatik
olarak sentezlenmesine dayanan bir yöntemdir.
• 1980 yılında Cetus (Kary Millus) firması araştırıcıları tarafından
geliştirilmiş ardından temel moleküler biyolojik araştırmalarda
(klonlama, dizi analizi, DNA haritalaması gibi) ve birçok
hastalığın DNA temeline dayalı tanısı için de klinik tıpta hızla
kullanılmaya başlanmıştır.
• PCR, çift iplikli bir DNA molekülünde hedef zincirlere iki oligonükleotit
primerin bağlanması ve uzaması esasına dayanır.
• Kalıp DNA molekülleri yüksek sıcaklıklarda denatüre edildikten sonra,
primerler tek iplikli DNA molekülleri üzerinde kendilerine tamamlayıcı olan
bölgelerle düşük sıcaklıklarda birleşir.
• DNA polimeraz enzimi, uygun tampon ve 4 çeşit deoksiribonükleotit
trifosfat (dNTP) varlığında primerin 3’OH ucundan uzamasını sağlar.
• Böylece kalıp DNA ipliğine tamamlayıcı olan yeni DNA molekülü
sentezlenmiş olur.
31
32
Kalıp DNA:
• Çoğaltılacak olan DNA saf bir şekilde hücreden izole edilir
1) Hücrenin parçalanması ile yüksek molekül ağırlıklı DNA’nın
açığa çıkması,
2-Denatürasyon veya proteoliz ile DNA-protein kompleksinin
ayrılması ve DNA’nın çözünür duruma getirilmesi,
3-DNA’nın basit enzimatik ve/veya kimyasal yöntemlerle
proteinler, RNA ve diğer makromoleküllerden ayrılması,
PCR’ın temel bileşenleri
• Kalıp DNA olarak kullanılan DNA molekülü
• DNA polimeraz enzimi
• Primerler
• dNTP karışımı
• Tampon ve MgCl2
33
Hücre membranının
parçalanması
Membran lipitlerinin
ayrılması
Hücre içi ve DNA’ya
bağlı proteinlerin
uzaklaştırılması
DNA’nın çöktürülmesi
34
Primerler:
• DNA’nı çoğaltılması için kalıp DNA’ya tamamen
tamamlayıcı olan primere gereksinim vardır.
• Primerler laboratuvarlarda oluşturulan kısa
zincirli DNA molekülleridir
• 20-30 nükleotit uzunluğundadırlar.
Fiziksel, kimyasal ve enzimatik yolla
SDS (sodium dodesil sülfat) CTAB (setiltrimetil bromid gibi
deterjanlar ile
Proteinaz
Soğuk etanol veya
isopropanol ile
35
36
6
6.3.2016
Tamponlar ve MgCl2
• Enzime özgü tamponlar kullanılır (Genellikle KCl ve Tris HCl
içeren tamponlar)
• MgCl2 tamponla birlikte veya ayrı olarak sağlanabilir.
• Polimerazlar
• Genellikle Thermoccus aquaticus’tan izole edilen Taq DNA polimeraz
kullanılır.
• Bu enzim DNA’nın denatürayon sıcaklığında (95 C) aktivitesini
koruyabilmektedir.
MgCl2’ün PCR’ın verimi üzerine önemli etkisi vardır.
• Mg+2 iyonları dNTP’ler ile çözünebilir kompleksler oluşturur
• Polimeraz aktivitesini stimüle ederler
• Primer kalıp etkileşimi sağlarlar
• dNTP (deoksiribonükleotit trifosfat) karışımı
• dATP, dGTP, dTTP, dCTP
• Yüksek saflıkta ticari olarak tek tek veya karışım halinde sağlanır.
37
38
PCR aletlerinde DNA’nın
çoğaltılması 3 aşamada
gerçekleşir
PCR’ın yapılışı
• 1) denatürasyon (92-95 C/1-2 dak)
• 2) primerlerin bağlanması
(annealing) (50-55 C/1-2 dak)
• 3) zincirin uzaması (72 C/1-2dak)
Bu süre ve sıcaklıklar peşpeşe
uygulanarak 25-35 döngü olarak
gerçekleştirilir
PCR aletleri (thermal cycler)
• PCR farklı sıcaklık derecelerini istenilen sürelerde otomatik
olarak ayarlayabilen özel aletlerde gerçekleştirilir.
• İşlem mikrotüpler içinde yapılır
Bu işlem 25-35 kez
tekrarlanır (döngü).
39
40
PCR’ın kullanım alanları
• PCR kullanımı kolay, oldukça duyarlı, özgün ve yüksek
derecede verimlidir.
• Koşullar iyi optimize edilmişse hemen hemen hiç yanlış baz
eşleşmesi olmaz.
• Gen klonlaması ve dizi analizleri için oldukça kullanışlıdır. Gen
bölgeleri bilindiğinde istenilen gen veya genler kolaylıkla
çoğlatılabilir.
• PCR aynı zamanda farklı kaynaklardan olan genleri çoğaltarak
karşılaştırmalı veya filogenetik çalışmalarda kullanılır.
41
42
7
6.3.2016
• Çok duyarlı bir teknik olduğundan çok küçük miktarlardaki
DNA’yı çoğaltmak için de kullanılır. Örn: mumyalanmış insan
kalıntıları ve fosilleşmiş bitki ve hayvanlardan elde edilen
DNA’ları çoğaltmak için kullanılmaktadır.
• Bireylerin tanımlanmasını veya bireyler arasındaki ilişkiyi küçük
bir miktar DNA örneğinden belirlemede kullanılan güçlü bir adli
tıp aracı olan DNA parmak izinde de kullanılmaktadır.
• Genetik hastalıkların teşhisi
• GDO’lu ürünlerin tespiti
43
8