moleküler biyolojide kullanılan yöntemler

advertisement
6.3.2016
Dersin içeriği
MOLEKÜLER BİYOLOJİDE
KULLANILAN YÖNTEMLER
• Nükleik asitler
• Hücre parçalama yöntemleri
• Ayırma ve saflaştırma yöntemleri
(filtrasyon, diyaliz, çöktürme santrifüjleme vb)
• DNA izolasyonu ve analizi
• RNA izolasyonu ve analizi
• DNA’nın polimeraz zincir reaksiyonu ile çoğaltılması
• Rekombinant DNA teknolojisi
• Nükleik asit hibridizasyonu yöntemleri
• Protein saflaştırma yöntemleri
GİRİŞ
• Ara Sınav 50
• Ödev
30
• Performans Görevi (Seminer) 20
Yıl İçinin Başarıya 55
Final 45
• Doğada milyonlarca farklı canlı türü bulunur.
Bununla beraber canlılar hücre ve molekül
düzeyinde araştırıldığında tek bir kalıp planı
olduğu ortaya çıkar.
• Buna göre moleküler biyolojinin temel amacı
canlılarda hücre yapısını oluşturan yapısal ve
işlevsel analizini yapmaktır.
Hücreyi oluşturan temel organik moleküller başlıca iki
grupta toplanabilir:
• Bir hücrenin ağırlığının yaklaşık %99 u C, H, N
ve O den oluşur.
• İnorganik ve organik kimyasal bileşenlerden
oluşan hücrelerde C atomlarından türevlenen
organik bileşikler yaşam molekülleri olarak
kabul edilirler.
• Küçük moleküller: hücrenin temel kimyasal
yapıtaşlarının sentezinde ve enerji elde edilmesinde
kullanılırlar
• Büyük moleküller (Makromoleküller): küçük
moleküllerin polimerleri olan makromoleküller
biyolojik süreçlerin özgüllüğünden ve biyolojik bilginin
transferinden sorumludurlar.
• Polimerik yapıdaki büyük moleküller monomerik
yapıdaki küçük moleküllerin kovalent olarak birbirlerine
bağlanmasıyla oluşurlar.
1
6.3.2016
Hücrelerde küçük organik moleküllere ait
başlıca dört temel aile vardır:
basit şekerler
yağ asitleri
aminoasitler
nükleotitler
• Makromolekülerin kendilerini oluşturan küçük
moleküllerle çok az benzerlikleri vardır.
• Makromoleküller arasında özellikle nükleik asitler
ve proteinler hücrenin ve dolayısıyla bireyin
yapısal oluşumu ve canlılık işlevleri açısından çok
önemli rol oynarlar.
• Nükleik asitler canlılık özelliklerini yönettikleri için
biyolojik açıdan en önemli makromoleküllerdir.
• Nükleik asitlerden DNA canlıların tümüne yakın kısmında,
genetik bilginin ana deposudur. Bu bilgi RNA molekülleri
biçiminde kopyalanır (transkripsiyon) ve daha sonra proteine
çevrilir (translasyon).
• Protein sentezi nükleotit dizisindeki şifreye göre yapılır.
Moleküler biyolojide genetik bilginin akış yoluna ana kural
(sentral dogma) denir.
Moleküler biyolojinin
santral dogması
• Bir makromolekül küçük molekül ağırlıklı alt
birimlerin birbirine eklenmesiyle oluşan uzun
ve zincir biçiminde polimerdir.
• Makromoleküller
Proteinler
polisakkaritler
nükleik asitler
• Nükleik asitlerin temel rolü genetik bilginin
yaşam boyunca korunmasının nesilden nesile
geçişinin sağlanmasıdır.
• Genetik bilginin önemli bir kısmının anlatımı
proteinler biçiminde ortaya çıkar.
• Yani nükleik asitler bireyin oluşumunu ve
türüne özgü karakterlerini kazanmasını
proteinler aracılığıyla yönetirler.
• Canlı bir hücrede pek çok metabolik olay ve reaksiyon proteinler
tarafından yürütülür.
• Proteinler yapısal eleman olarak da önem taşırlar
Kan plazma proteinleri
Hormonlar
Antikorlar
Enzimler
Kloroplast
Mitokondri
Hücre duvarı ve proteinde yer alan proteinler vb yapısal ve işlevsel
protein gruplarıdır
Her hücre tipinde binlerce farklı tipte çeşitte protein bulunur
2
6.3.2016
Nükleik asitler
• Bu nedenlerle moleküler biyolojiye ilişkin
çalışmalarda özellikle nükleik asitlerin ve
proteinlerin yapısal ve işlevsel analizlerinde
moleküler biyolojik yöntemlerin bilinmesi ve
kullanımı büyük önem taşır.
Hücrenin canlılığının sürdürülmesi ve neslinin devam ettirilmesini sağlayan
komponentler
Hem ökaryotik hem de prokaryotik hücrelerde iki tip nükleik asit bulunur.
DNA
RNA
Nükleik asitlerin yapısı
Nükleik asitler 3 bileşenden
oluşur
- şeker
- baz
- fosfat (PO43- )
• Deoksiribonükleik asit Genetik bilgiyi (şifreyi) taşıyan ve bu bilginin
kuşaklar boyunca aynı şekilde korunmasını sağlayan polimer.
• 3 farklı RNA vardır (mRNA, rRNA, tRNA)
• Herbiri farklı işleve sahiptir. DNA’nın taşıdığı genetik bilgiyi
kullanarak hücre için gerekli proteinleri sentezlerler.
Bazlar
1. Purin bazlari
2. Pirimidin bazlari
Şekerler
Deoksiriboz
Riboz
DNA
RNA
Pirimidin halkası
Purin halkası
Adenin (A)
Guanin (G)
Sitozin (C)
Timin (T)
Urasil (U)
Riboz
Deoksiriboz
RNA
DNA
DNA
RNA
Nükleozitler
Şeker+ Baz = nükleozit
A,G,C,T
A,G,C,U
Nükleotitler
Şeker + baz + fosfat = nükleotit
Riboz veya deoksiribozun 1. C atomuna purin veya pirimidin bazları glikozidik bağlarla
bağlanır
Nükleotitlerin birleşmesi ile de polinükleotitler oluşur.
3
6.3.2016
Polinükleotit (nükleik asit)
•
Zincir sentezlenirken her bir deoksiribozun 3’ karbonuna diğer bir deoksiribozun
5’ucundaki fosfat grubu ile forfodiester bağı ile bağlanır
•
Nükleik asitlerde, birbirini izleyen
şeker ve fosfat molekülleri nükleik
asitlerin iskeletini oluşturur.
(fosfodiester bağı: tek bir fosfat ester bağı ile iki ayrı şekere bağlanmıştır)
Zincirdeki ilk nükleotit 5’ pozisyonunda daima
PO4 grubu içerir.
Diğer ucunda ise zincire son eklenen
deoksiribozun 3’ pozisyonunda ise serbest bir
OH grubu bulunur.
• Tek zincir halindeki nükleik asitler kural olarak daima 5’ ucu solda
ve 3’ ucu sağda olacak şekilde 5’
3’ yönünde yazılır
Örn 5’-AAGCTCTTAGG-3’
• RNA’nın yapısı da DNA gibidir
RNA molekülleri ribonükleotit
ünitelerinin 5’
3’ yönünde fosfat
diester köprüleri kurmasıyla
oluşmuştur.
DNA zincirinin omurgasında bulunan bütün fosfat grupları tamamen
iyonize durumdadır ve negatif yüklüdür.
BU NEDENLE DNA BİR ASİTTİR
RNA’nın DNA’dan farkları
•
RNA yapısındaki ribozun 2’ OH grubundan dolayı DNA’dan daha az stabildir
Alkalilerle muamele edildiğinde kolaylıkla 2’ - 3’ siklik monofosfat türevlerine
parçalanır.
• RNA’nın yapısındaki şeker ribozdur
• Primidin bazlarından timinin (T) yerine urasil (U)
geçmiştir.
• Çoğunlukla tek zincir halindedir, ancak kendi etrafında
geriye dönebilir,baz çiftleri oluşturarak molekülün özel
bir konformasyon kazanmasını sağlayabilir
• Alkalilere dirençli değildir. Genelde DNA’ya oranla çok
daha kolay nükleotitlerine parçalanır.
4
6.3.2016
DNA’nın çift zincirli yapısı
• RNA’nın hücrede 3 kritik rolü vardır
• Elçi RNA (mRNA): DNA’nın bir zincirindeki genetik
bilgiye komplementer olan bilgiyi içerir.
• Transfer RNA (tRNA): protein sentezindeki adaptör
moleküllerdir. Nükleotit dilindeki genetik bilgiyi
aminoasit diline dönüştürür.
• Ribozomal RNA (rRNA): hücrenin protein sentez
sistemi olan yapısal ve katalitik bileşenidir.
•
DNA’nın çift polinükleotit zincirinden oluştuğunu Watson ve Crick (1953) ispatlamışlardır.
•
•
Hücre içinde DNA çift zincirli formda bulunur. Her kromozom iki zincirli bir DNA taşır
Bu zincirlerin her biri fosfodiester bağlarıyla bağlı yüzbinlerce ya da milyonlarca nükleotit içerir.
•
Şeker ve fosfat DNA’nın omurgasını oluşturur
•
Bazlar ise diğer zincirdeki bazlarla eşleşir.
Bütün DNA moleküllerinde Adenin, Timin ile çift H bağı
oluşturur
Guanin ise Sitozin ile 3’lü Hidrojen bağı oluşturur.
A
=
T
Guanin
• Adenin ile Timine
• Guanin ile de Sitozin’e birbirinin komplementeri denir
Çift zincirli bir DNA molekülündeki iki zincir de birbirinin
komplementeridir.
İki iplik birbirinin komplementeri olduğu için DNA’daki tüm bilgi
her iki iplikte de kopyalanmış durumdadır. Bu durum DNA’nın
kopyalanmasındaki temel özelliktir
=1
C
Sitozin
Adenin
Timin
DNA molekülündeki Adenin miktarı Timin miktarına; Guanin
miktarı da Sitozin miktarına eşittir.
• DNA molekülündeki A+T miktarının G+C miktarına oranı hiçbir
zaman 1 olmaz. Daima 1’de büyük veya küçüktür.
• Bu oran aynı tür içindeki canlılar arasında değişmez, türden
türe ise farklılıklar gösterir
• Çift sarmaldaki polinükleotitler antiparalel şekilde oluşur.
• Bir polinükletit 5’ 3’ yönünde; karşındaki polinükleotit ise 3’ 5’
yönünde ilerler
H bağları kovalent bağlardan
daha zayıf olduğu için iki DNA
ipliği çeşitli koşullarda kolayca
ayrılıp tekrar birleşebilirler
G
DNA’nin çift sarmal yapısı
•
•
İki zincir birbirinin etrafında sarılarak ikili sarmal oluşturur.
DNA’nın 3 boyutlu bilinen 3 farklı yapısı vardır:
A-DNA (Sağ el formu)
B-DNA (sağ el formu)
Z-DNA (sol el formu)
Hücrelerde B-DNA hakimdir
A-DNA su kaybetmiş DNA
örneklerinde görülebilir
Z-DNA DNA’nın metilasyona
uğramış kısımları bu formda
görülebilir.
Sağ el
Sağ el
Sol el
5
6.3.2016
B-DNA’nın çift sarmal yapısı
•
Watson ve Crick tarafından belirlenen ve hücrelerde hakim olan yapıdır.
İkili sarmal halindeki DNA birbirinden ayırt edilebilen
büyük oluk ve küçük oluk adında iki oluktan oluşur.
Herbir baz çifti arasındaki uzunluk 0.34 nm
Büyük oluk
Küçük oluk
Sarmalın her döngüsü yaklaşık 10 baz çifti (bp) içerir
(3.4 nm).
1 kb DNA 100 sarmal döngü içerir ve 0.34 µm
uzunluktadır.
DNA molekülünün büyüklüğü
• Bir DNA molekülünün büyüklüğü, herbir molekülde
binlerce nükleotit bazları veya baz çiftleri şeklinde ifade
edilir.
• İnsan genomunda yaklaşık 3 milyar nükleotit
bulunmaktadır.
• E. coli’de ise 4 milyon 640 bin nükleotit vardır.
• 1000 bazlık bir DNA molekülü 1 kilobaz içerir (kb)
• Eğer DNA ikili sarmal ise 1 kilo baz çifti (kbp) denir.
DNA’nın denatürasyonu
DNA’nın süpersarmal yapısı
• Gevşek bir DNA molekülünün baz çifti
sayısı bilindiğinde heliks döngü sayısı
tahmin edilebilir.
• Ancak, E. Coli kromozomu lineer hale
getirilirse 1 mm’den daha uzun olacaktır.
• Bu uzunluk E.coli’nin kendi çevresinden
400 kat daha fazladır.
• Böyle küçük bir alan içerisine bu kadar
fazla DNA nasıl paketlenir?
DNA’nın replikasyonunda ve protein
sentezinin ilk evresi olan
transkripsiyonda sentezin başlayabilmesi
için iki DNA ipliğinin birbirinden
ayrılması gerekir.
Bazların H bağları kırılarak birbirinden
çözülür ve ayrılır.
Hücrede (in vivo) doğal olarak gerçekleşen
çözülmesi ayrılması ve tekrar birleşerek
eski formunu kazanması deneysel olarak
hücre dışında da (in vitro)
gerçekleştirilebilir.
• Bu, DNA’nın süpersarmal adlı bir işlemle
kıvrılarak katlanmasıyla gerçekleşir.
DNA hücrelerden izole edildiği oda
sıcaklığına yakın ortamda fizyolojik tuz
konsantrasyonunda muhafaza edildiğinde
ikili sarmal değişmeden kalır.
A=T
G≡C
Eğer sıcaklık arttırılırsa iki zincir arasındaki H
bağları kırılarak birbirinden ayrılır. Bu işleme
denatürasyon (erime) denir.
Tek zincirli ve çift zincirli nükleik asitler
260 nm’de UV ışığı absorblamada farklılık
gösterdiklerinden bu durum deneysel
olarak belirlenebilir.
Burada esas nükleik asit bazlarının UV
ışığı absorblamalarıdır. Çift zincirli DNA’
nın absorbsiyonu tek zincire göre oldukça
azdır
G ve C eşleşmesi daha
güçlüdür.
DNA’daki GC içeriği arttıkça Tm
değeri de artar.
Renatürasyon:
Sıcaklık artışıyla DNA çözülmeye başladığında
absorbansda ani artış gözlenir.
DNA içeren çözeltide sıcaklık yükseltilerek
alınan en yüksek absorbans değerinin yarısı
için gerekli sıcaklık derecesine Tm (erime
sıcaklığı-melting temperature) denir.
Isıtılarak denatüre edilen DNA yavaşça soğutulursa DNA’nın doğal yapısı olan çift
zincir yeniden oluşur. Bu olaya da renatürasyon denir.
Denatürasyon ve renatürasyon DNA hibridizasyon tekniğinin esasını oluşturur.
Hibridizasyon: iki farklı DNA önce denatürasyonla ayrılır sonra ayrılan farklı zincirlerin
eşleşmeleri sağlanır.
Tm: yarı maksimal absorbans için gerekli
sıcaklık
6
6.3.2016
DNA Replikasyonu (DNA çoğalması, DNA ikileşmesi,
DNA sentezi)
• Bir hücrenin bölünebilmesi için DNA’nın da
çoğalması gerekir.
• DNA’nın replikasyonu
• DNA replikasyon mekanizmasının anahtarı, DNA ikili
sarmalındaki iki ipliğin de aynı bilgiyi taşımasıdır
(birbirleriyle komplementer olmaları).
• Böylece oluşan iki yavru hücre de aynı DNA’ya sahip
olur.
37
• Bu yüzden DNA’nın replikasyonu yarı
korunumludur (semikonservatif). Yani oluşan
ikili sarmalin zincirlerinden biri yeni
sentezlenen zincirken, diğeri eski var olan
zincirdir.
• Replikasyon sırasında iki
atasal iplik ayrılır, tamamlayıcı
yavru ipliklerin oluşmasında
kalıp (template) olarak görev
yapar.
• Daha sonra oluşan yeni çift
zincirli DNA moleküllerin
bölünme sırasında iki yavru
hücreye geçer.
Atasal
(eski) iplik
Yavru (Yeni)
iplik
Yavru (Yeni)
iplik
39
Replikasyonun aşamaları
1) replikasyon orijinine özel başlangıç proteinlerinin
bağlanması
40
•
Prokaryotlarda tek bir replikasyon orijini vardır. Ökaryotlarda çok fazla orijin bulunmaktadır
•
•
Replikon: tek bir orijinden başlayıp sentezlenen DNA’ya replikon denir
(insan genomumda 30.000 orijin bulunmaktadır)
•
Mayalarda 250-400 arasındadır..
Replikasyon orijini: replikasyonun başladığı genomdaki sabit bir noktadır. Prokaryotlarda OriC (E.coli)
olarak bilinir.
Replikasyon orijini özel başlangıç proteinleri (dnaA) tarafından tanınan ve yaklaşık 300 bazlık özel bir
diziden oluşur.(E.coli’de 245 bazdır) .
Replikasyon orijini AT zengin bölgelerdir. Böylece zincirlerin ayrılması daha kolay olur.
41
42
7
6.3.2016
2) Çift zincirin açılması
•
• Replikasyonun ilk aşamasında Orijin bağlama
proteinleri (dnaA) orijine bağlanır ve
kompleksi açmak için erimeyi gerçekleştirir.
• Bu bağlanma daha sonra zincirin açılmasını
kolaylaştırır.
dnaA orijine bağlandıktan sonra helikaz enzimi (dnaB) çift sarmaldaki H bağlarını
kırarak zinciri açar ve replikasyon çatalı oluşur.
Replikasyon çatalı:
İpliklerin ayrıldığı ve yeni DNA sentezinin gerçekleştiği noktaya replikasyon çatalı
denir.
Replikasyon çatalı
43
•
Genellikle orijinden itibaren iki replikasyon çatalı çift yönlü olarak çalışır ve
iplikler terminale ulaşıncaya kadar ayrı ayrı kopyalanır.
•
DNA replikasyonu E.coli hücrelerinde açığa kavuşturulduğundan, Replikasyon
için E. Coli örnek oluşturmaktadır.
•
Ökaryotlarda replikasyon çok daha karmaşık olmakla birlikte temelde
bakteriyel DNA replikasyonuna benzer.
44
• Replikasyon süresince helikaz DNA üzerinde ilerleyerek sürekli
olarak ikili zinciri açar.
• Helikaz sarmalın çözülmesini çok hızlı gerçekleştirir.
• Helikaz ile çift zincir açıldıktan sonra, tek iplikler üzerine tek iplik
bağlama proteinleri (ssb) bağlanarak ipliklerin yeniden
birleşmesini (renatürasyonunu) önlerler.
Zincir açıldıkça oluşan süpersarmal yapı topoizomerazlar (DNA
giraz)tarafından giderilir.
45
3) RNA primer sentezi
46
• Yeni DNA sentezinde nükleotitlerin
eklenmesini (zincirin uzamasını)
sağlayan enzim DNA polimerazdır.
• Ancak hiçbir DNA polimeraz DNA
sentezini başlatamaz. Bu enzim sadece
daha önce var olan 3’-OH grubuna
nükleotit ekleyebilir.
• Bütün bilinen DNA polimerazlar
deoksirobozun 3’ OH grubuna
nükleotit ekleyebilirler.
• Bu nedenle yeni DNA zincirinin
başlayabilmesi için mutlaka önce
primer sentezlenmesi gerekir.
• Bu nedenle DNA’nın replikasyonu
daima 5’-3’ yönünde olur.
•
47
Primer: 10-15 nükleotit dizisinden oluşmuş
kısa bir RNA parçacığıdır ve özel bir RNA
polimeraz olan primaz enzimi tarafından
sentezlenir. Daha sonra zincirin uzaması DNA
polimeraz tarafından gerçekleştirilir.
48
8
6.3.2016
4) Zincirin uzaması
• Helikaz enzimi ile çift zincir açılır açılmaz primaz
enzimi replikasyon çatalının hemen başında yerini alır
ve gerektikçe primer sentezler.
• Replikasyon çatalında yer alan helikaz ve
primaz enzimlerinin ardından açılan her iki
polinükleotit kalıbına yerleşen DNA
polimeraz enzimi sentezi her iki zincirde de
sürdürür.
• Primer eklendikten sonraDNA polimeraz sentezi
sürdürür.
• DNA polimeraz yeni DNA zincirini yalnızca 5’3’ yönünde gerçekleştirir.
• Ancak, kalıp DNA zincirlerinin antiparaleldir
(zincirin biri 5’-3’, diğeri 3’-5’ yönünde)
• Bu durumda DNA polimeraz ters zincirdeki
sentezi diğeri ile aynı anda nasıl
gerçekleştirir?
49
50
• 3’-5’ yönündeki sentez mekanizması Okazaki tarafından çözülmüştür
• Okazaki DNA sentezinde bir zincirdeki sentezin 5’-3’ yönünde sürekli
devam ettiğini karşı zincirde ise kesikli sentezin gerçekleştiğini
belirlemiştir.
• Açılan kalıp DNA zincirlerinde sadece birinde komplementer
polinükleotit sentezi sürekli olur. Her zaman yeni bir nükleotitin
ekleneceği serbest bir 3’-OH grubu olduğundan kesiksiz olarak DNA
sentezi gerçekleşir.
•
DNA sentezinin kesintisiz sürdüğü zincire kesintisiz DNA zinciri (leading strand), diğerine ise
kesintili DNA zinciri (lagging strand) denir.
•
Kesikli zincirde zincir uzaması replikasyon çatalına ters yönde olur.
•
Kesintisiz DNA zinciri tek bir primer kullanarak ve başlangıç noktasından başlayarak 5’-3’ yönünde
replikasyon çatalının açılma yönünde sentezi sürdürür.
•
Kesintili zincirde ters yönde herbiri ayrı primer gerektiren 1000-2000 nükleotitlik fragmanlar
sentezlenir ve bunlar birbirine eklenir. Bu nükleotit fragmanlarına Okazaki fragmanları denir.
• Diğer zincirde ise ters yönde ve kesikli ve kısa zincirler halinde sentez
gerçekleşir.
51
• Kesikli zincirde primaz
tarafından defalarca RNA
primerleri sentezlenerek
serbest 3’-OH grubunun
oluşmasını sağlarlar.
52
DNA polimerazlar:
Nükleotitlerin eklenmesini katalizleyen
enzim.
Bilinen bütün DNA polimerazlar DNA’yı
5’-3’yönünde sentezler.
Zincirdeki her yeni nükleotitin öncüsü
bir deoksiribonükleotit trifosfatdır
(dNTP)
dNTP: dATP, dTTP, dGTP, dCTP,
• Bunun aksine kesiksiz
zincire sadece başlangıç
yerinde olmak üzere bir
defa primer eklenir.
dNTP’lerin iki terminal fosfatı
uzaklaştırılır, ve internal fosfat
büyüyen zincirin deoksibozunun 3’OH grubuna bağlanır.
53
54
9
6.3.2016
• E. Coli’de 3 tip DNA polimeraz belirlenmiştir.
• DNA polimeraz II (Pol ll):
• DNA polimeraz I (Pol I): Birden fazla aktiviteye sahiptir.
 RNA primerlerini uzaklaştırıcı 5’-3’ ekzonükleaz aktivitesi (bu
özellik sadece bu enzimde vardır)
 DNA sentezi
kesintili zincirde kalan boşlukları tamamlar. Daha önce oluşmuş olan
RNA primerlerini uzaklaştırır ve yeni sentez yapar.
Hücredeki konsantrasyonu DNA pol lll’den daha fazla
DNA pol l: 400 mol/hücre
DNA pol lll: 10-20 mol/hücre
görevi henüz olarak bilinmiyor. Ancak çeşitli çevresel faktörlerle
(UV ışık, kimyasallar vs) oluşan DNA tamirinde kullanıldığı
düşünülüyor.
• Bu onarımlar DNA replikasyonu tamamlandıktan sonra yapılır.
• DNA polimeraz III (Pol lll):
Her iki zincirde de replikasyonu gerçekleştiren ana enzimdir.
Polimerazlar Kofaktör olarak Mg iyonlarına gereksinim duyarlar
55
• Ayrıca her 3 DNA polimerazın da 3’- 5’ ekzonükleaz aktivitesi vardır.
• Polimerizasyon sırasında yanlış bir nükleotitin zincire eklenmesi
durumunda, kalıp DNA’da bu bazın tamamlayıcısı olmayacaktır. Bu
hatanın düzeltilmesi için geriye dönüp bu nükleotitin çıkarılması ve
ve yerine doğrusunun bağlanması gerekir.
56
• Kesikli zincirde Pol lll daha önce
sentezlenen DNA’ya ulaşıncaya
kadar sentez yapar. Bu noktada Pol
lll durur.
•
• Her 3 polimeraz da 3’- 5’ ekzonükleaz aktiviteleri ile bu düzeltmeyi
(proofreading) yapabilmektedirler .
Sentezde rol alan bir sonraki enzim
olan DNA polimeraz l, önce, RNA
primerlerini uzaklaştırır ve bunların
yerini DNA ile doldurur.
• Son fosfodiester bağı ise DNA ligaz
ile yapılır.
• Hata düzeltme fonksiyonu sayesinde replikasyondaki hata oranı
milyarda 1’dir
57
58
5) Terminasyon ve ayrılma
• DNA ligaz bazların 5’ fosfat uçları ile 3’OH uçlarını
birleştirirek ayrı ayrı oluşan DNA parçalarını fosfodiester
bağları ile birleştirir.
• DNA ligaz DNA parçalarını birleştirebilen tek enzimdir.
• İki replikasyon çatalı oriC’nin yaklaşık 180° karşısındaki
bölgede buluşur. Bu bölgede Helikazı durduran tus gen
ürününün bağlandığı bir sonlanma noktası vardır.
• Replikasyon tamamlandığında iki halka birbirine bağlı olarak
kalmaktadır.
• Bunlar bir topoizomeraz olan topoizomeraz IV aracılığıyla
birbirinden ayrılır ve daha sonra membran tutunma
yerlerinin bir kısmıyla hareket ederek iki yavru hücreye
ayrılırlar
59
60
10
6.3.2016
Özet
ÖZET
•
• DNA replikasyonundaki enzimler
DNA’nın replikasyonunda çok sayıda protein yer alır. Bunların hepsine DNA
replikaz sistemi veya replizom denir
 Orijin bağlama proteinleri: replikasyon orijinine bağlanarak ilk denatürasyonu
gerçekleştirir.
 Helikaz :Replikasyonun başlaması için ikili sarmalı ayrılmasını sağlayan
enzimler
 Topoizomerazlar: Zincir ayrılması ile oluşan kıvrımları giderir.
 Tek zincir bağlama proteinleri: Ayrılmış zincirler tek zincir bağlama proteinleri
(ssb) ile stabilize edilir.
 Primazlar, RNA parçacıkları olan primerleri sentezler.
 DNA polimeraz III 5’-3’ OH yönünde dNTP’leri ekleyerek sentezi gerçekleştirir.
 DNA polimeraz l primerleri çıkararak boşlukları yeni DNA ile doldurur
 DNA ligaz: RNA primeri çıkarılıp yeni DNA sentezi yapıldıktan sonra boşluğu
kapatır.
61
•
•
•
•
•
Replikasyon orijinine orijin bağlama
proteinleri bağlarak bu bölgeyi
denatüre eder.
Helikaz enzimi zinciri iki yönlü olarak
açarak replikasyon çatalları oluşturur.
Zincir bağlama proteinleri her iki zincire
de tutunarak zincirin tekrar birleşmesini
önler
DNA primaz enzimi her iki zincir
üzerinde de primerleri sentezler. DNA
pol lll 5’-3’ yönünde dNTPleri zincire
ekleyerek sentezi gerçekleştirir.
Ters yönde olan zincirde ise
replikasyonda ters yönde gerçekleşir.
Burada primer 1000-1500 bazda bir
yeni primer sentezlenerek Pol lll
Okazaki fragmentlerinin sentezini yapar.
DNA Pol I sentezlenen primerleri
zincirden uzaklaştırır ve yerine DNA
sentezler. Son nükleotitler arasındaki
boşluk DNA ligaz ile kapatılır.
62
11
Download