T lay Ak ay Ders Notu DNA Replikasyon Sunu 2012

DNA Sentezi(Replikasyon)
Prof.Dr.TülayAkçay
1
2
Translasyon sonrası
işlem
3
Replikasyonda görevli enzimler,
kalıba bağımlı polimerazlardır.
Yüksek organizmalarda,
daha karmaşık olan DNA sentezi,
E.Koli ile aynı tip mekanizma ile
gerçekleşmektedir.
4
5
DNA Sentezi (Replikasyonu)
DNA molekülünün
bir zincirinde bulunan (A), karşılığında tamamlayıcı
zincirde mutlaka (T)
benzer şekilde (G) ile (C) çift oluşturmalı.
Bir zincirin dizilimi hakkındaki bilgi,
tamamlayıcı zincirde ters yönde yer almaktadır.
İki zincir birbirinden ayrıldığında her biri,
yeni tamamlayıcı zincir için kalıp olarak hizmet eder.
Ana zincirin,
iki zincire ayrılarak,
her bir zincirin, yeni çiftin bir zincirini oluşturması ,
semikonservatif replikasyon olarak isimlendirilir
.
6
Kromozomal DNA molekülü,
hücre döngüsü ile birlikte bir defa replike olmaktadır.
Herhangi bir nedenle DNA replikasyonu durursa,
hücre bölünmesi de durur.
Hücre bölünmesinin çok yavaş olduğu durumlarda ise,
DNA replikasyonu zaman içinde aynı miktarda
tamamlanmaktadır.
DNA sentezi,
hücre döngüsünün S fazında meydana gelir.
7
Replikasyonda,
DNA polimerazdan başka,
herbirinin özel bir görevi olan,
20’den fazla enzim ve proteinler gerekmektedir.
Tümüne DNA replikaz sistemi veya
replizom denir.
8
DNA Sentezinin Başlaması,
Zincir Ayrılması (kol ayrımı)
Polimeraz,
kalıp olarak sadece tek zincirli DNA molekülünü
kullanır
DNA molekülünün replikasyon öncesi,
zincirlerinin birbirinden tamamen veya
küçük bir bölümünün
ayrılması gerekmektedir.
9
10
11
DNA replikasyonu;
prokaryotlarda replikasyon merkezinde,
ökaryotlarda DNA üzerindeki pek çok
yerde başlar
Böylece,
büyük bir ökaryotik DNA molekülünün,
kısazamanda replikasyonu sağlanmaktadır.
12
Aktif sentezin başladığı bölgede,
dönmeyen iki zincir, birbirinden ayrılarak,
replikasyon çatalı’nı oluşturur.
DNA molekülü üzerindeki replikasyon çatalı,
sentez sırasında merkezden başlayarak ilerler.
DNA çift sarmalın replikasyonu, çift yönlü
olmaktadır.
13
Özel bir grup protein,
replikasyon çatalının ilerlemesini,
çift sarmal DNA molekülünün dönmemesi
ebeveyin zincirlerin ayrı durmasını sağlar.
DNA Helikaz,
Heliks Bozucu (HD=Heliks Destabilize)
Proteinler,
14
15
Heliks Bozucu (HD) Proteinler
Tek zincirli DNA yapısına bağlı protein,
(SSB) olarak da isimlendiriler.
DNA molekülünün tek zincirine bağlanmaktadır.
HD proteinleri ,enzim değildirler.
Bu proteinlerin DNA’ya bağlanmaları kooperatiftir;
bir molekül HD proteini bağlandıktan sonra,
Diğer HD proteinlerinin bağlanmaları kolaylaşır.
16
HD Proteinler,
Replikasyon merkezinde,
iki zinciri birbirinden ayrı tutarlar
dönmelerine de mani olarak
tek standart kalıp bulunmasını sağlarlar,
DNA molekülünü,
tek zinciri parçalayan
nükleaz enziminin etkisinden de korururlar.
17
18
DNA Helikaz
DNA helikaz,
çift sarmal DNA zincirlerini birbirinden
ATP harcıyarak ayırmaktadır.
Replikasyon merkezindeki, ori C olarak tanımlanan
kısmındaki 9 baz çiftinin dört kez tekrarlanan bölgesine
20 tane DNA-A proteini,histon benzeri protein(HU)
varlığında ve ATP tüketilerek bağlanmaktadır.
DNA-A proteini etrafında katlanan DNA,
denatüre olur.
19
Bir helikaz olan DNA-B proteini,
DNA-C proteini ve ATP gerektiren bir tepkime ile
13 baz çiftinin üç kez tekrarlandığı
A=T çiftince zengin bölgeye bağlanır.
DNA-B proteini,
DNA çift zincirini
iki tane replikasyon çatalı olacak şekilde açar.
20
Ayrılmış zincirlere,
HD proteinlerinin bağlanması,
yeniden çift heliks oluşmasını önler.
Zincirlerin birbirlerinden ayrılması sonucu,
çift sarmal heliks DNA yapısında oluşan
topolojik gerilim,
topoizomerazlar tarafından giderilir.
21
Her İki DNA Zinciri,
DNA Sentezi İçin Kalıp Olarak Kullanılır
Replikasyon çatalında, iki ana zincir
ters yönde ilerleyen DNA sentezi için
kalıp görevi yapmaktadır.
DNA polimeraz ana zincir nükleotid dizisini,
sadece 3’ 5’ yönünde okuyabilir
yeni DNA zincirini,5’ 3’ yönünde sentezler.
22
Bir çift ana heliks zincirinden,
biri 5’ 3’ yönünde replikasyon çatalına doğru,
diğeri ise
5’ 3’ yönünde replikasyon çatalından
uzağa doğru ilerleyen
iki yeni, düz nükleotid zincir oluşur.
Replikasyon çatalına doğru,
kesintisiz olarak sentezlenen yeni zincire,
öncül zinicir adı verilir.
23
RNA primeri
24
Replikasyon çatalından uzaklaşarak,
aralıklı olarak yapılan sentez sırasında,
küçük DNA parçaları
replikasyon çatalının yanında sentezlenir.
Okazaki parçacıkları deinlen bu küçük
parçaların, daha sonra birleşmesi ile tek ve
sürekli, artçıl zincirler oluşturulur.
25
Öncü RNA
DNA polimerazların,
artçıl zincir sentez edebilmeleri için,
tek zincirli kalıp üzerinde,
DNA zincirinin tamalayıcısı olarak
sentezin başlamasını sağlayacak
3’ ucu serbest,
kısa bir zincir olan primer gerekir
26
DNA Sentezini yapan asıl enzim
DNA polimerazdır
Ancak bu enzim
iki serbest deoksiribonükleotid arasında bir
fosfodiester bağı kuramaz
Sentez için,serbest bir 3’ hidroksil ucunu
sağlayan molekül primerdir
Primer, ribo nükleotidlerden oluşan kısa RNA
molekülüdür
Artçıl DNA kolunun sentezinde
serbest 3’ hidroksil grubu,
DNA dan değil,
kısa RNA zincirinden sağlanır
27
Primaz (DNA G proteini):
Spesifik RNA polimeraz,
DNA kalıbına tamamlayıcı ve ters yönde paralel
öncül RNA molekülünün,
yaklaşık 10 nükleotid uzunluğundaki zincirini,
sentezler.
Kısa RNA dizisi,
artçıl zincir üzerinde,
replikasyon çatalında devamlı sentez edilir.
28
Artçıl zincirde,
öncü RNA molekülünün sentezinden önce
bir araya gelen çeşitli protienler
DNA tek zincirine bağlanarak primazla birliktre
primozom olarak
isimlendirilen,
protein kompleksini oluştururlar.
DNA-B ve DNA-G primozomun bileşenleridir.
5’ 3’ yönünde hareket eden primozom,
periyodik olarak
okazaki parçacıklarının sentezini başlatır. 29
Zincir Uzatılması
DNA polimeraz III,
ilk deoksiribonükleotidin alıcısı olarak,
öncü RNA molekülünün ,
3’-hidroksil grubunu kullanır.
DNA polimeraz III,
ana zincire ters yönde paralel,
5’ 3’ yönünde sentezlenen zincirin ,
nükleotidlerini ekler.
30
Nükleotid zincirinin yapı birimi,
5’deoksiribonükleozid trifosfattır.
DNA zincir uzamasında
dATP, dTTP, dCTP ve dGTP olmak üzere
4 tür deoksiribonükleozid trifosfat
kullanılmaktadır.
Deoksiribonükleozid trifosfatlardan
bir tanesinin eksikliğinde
DNA sentezi durur.
31
32
33

Primer ,DNA polimeraz için bir nukleotidi ilk kabul
edici yer olarak görev yapar.

Primer, primaz olarak adlandırılan bir enzim
tarafından sentez edilen ve birkaç nukleotidden
oluşan bir RNA parçasıdır.
DNA kalıbı
T
C
G
A
G
C
A
3’
OH
Primer
T
C
C
G
G
C
C
G
dG TP PPi
OH
DNA zincirinin büyümesi bloke edilebilinir.
Nükleotidin
şeker kısmının değiştirilmesi ile elde edilen
bazı nükleotid analogları kullanılır
DNA replikasyonunun engelleyen bu bileşenler,
virus ve hızlı büyüyen hücrelerin bölünmesini
yavaşlatırlar.
Sitozin arabinozid (araC), kanser kemoterapisinde
Adenin arabinosid, antiviral tedavide kullanılmaktadır.
37
Folat girişlerini inhibisyonla
(metotoraksat ,aminopiterin,trimetoprin)
denova sentez ve timidilat sentaz inhibe edilir.
38
DNA nükleotid dizisinin,
mümkün olduğunca az hata ile replikasyonu,
organizmanın yaşamı için çok
önemlidir
Zararlı ve belkide öldürücü mutasyonlar
kalıp dizisinin yanlış okunması
DNA polimeraz III tarafından kontrol edilir.
DNA polimeraz III enzimi,
5’ 3’ polimeraz aktivitesine ilaveten,
sağlamalı okuma(3’ 5’ ekzonükleaz)
39
aktivitesi de gösterir.
DNA polimeraz III , her bir nükleotidin
kalıp üzerindeki tamalayıcı bazına uygun olarak,
yeni zincire eklenmesini
kontrol eder.
Eğer kalıp bazdaki adenine uyan, timin yerine
sitozin taşıyan nükleotid
yeni zincire eklenirse,
DNA polimeraz III,
yapıya yanlışlıkla katılan nükleotidi
hidrolitik olarak uzaklaştırarak,
40
Öncül RNA molekülünün
Çıkartılıp Atılarak
DNA ile Yer Değiştirmesi
DNA polimeraz III sentezi,
yeni bir öncü RNA ile karşılaşıncaya kadar
devam eder.
Öncü RNA molekülüne gelindiğinde,
DNA polimeraz I ile RNA çıkarılarak
DNA polimeraz I ile boşluk doldurulur
.
41
DNA Polimeraz I’ in aktiviteleri:
DNA polimeraz I ‘in
DNA sentezini sağlayan 5’ 3’ polimeraz aktivitesi
ve
polimeraz III de olduğu gibi
DNA zincirinin yeni sentezinin doğru okunmasını
sağlayan
3’ 5’ ekzonükleaz aktivitesine ilaveten,
5’ 3’ ekzonükleaz aktivitesine de sahiptir.
42
İlk olarak DNA polimeraz I,
DNA polimeraz III tarafından yeni sentezlenen
DNA molekülünün 3’ ucu ile
komşu öncü RNA molekülünün 5’ ucu arasındaki
kırık bölgede yerleşir.
5’ 3’ yönünde hareket eden DNA polimeraz I,
RNA nükleotidlerini hidrolitik olarak uzaklaştırarak
yerine deoksiribonükleotidleri yerleştirir.
DNA molekülünü, 5’ 3’ yönünde polimeraz aktivitesi ile
sentezleyen DNA polimeraz I,
3’ 5’ ekzonükleaz aktivitesini kullanarak yeni zincirin
doğru okunmasını sağlar.
43
Uzaklaştırma,
sentez ve
doğru okuma işlemleri,
RNA molekülünün tamamen uzaklaştırılarak
boşluğun DNA ile doldurulmasına kadar
devam eder.
44
DNA Ligaz
DNA polimeraz III tarafından sentezlenen
DNA zincirinde, 5’ fosfat grubu ile
DNA polimeraz I tarafından sentezlenen
DNA’ nın 3’ hidroksil grubu arasındaki
son fosfodiester bağının oluşması,
DNA ligaz tarafından katalizlenmektedir.
DNA molekülünün iki zincirinin birbirine
bağlanması için enerji gerekir.
Enerji ATP molekülün AMP ve inorganik fosfata
46
parçalanması ile sağlananır.
3-Sonlanma safhası
 E.coli’de
DNA’nın iki replikasyon çatalı
terminal bölgede birleşir.
 Bu
bölge 20 baz çiftinden oluşur ve Ter.
adını alır.
 Bu
bölge aynı zamanda TUS (terminus
utilization substance) adlı protein için
bağlanma bölgesi içerir ve sentez bu
bölgede durur.
Ökaryotik DNA polimerazlar
DNA
polimera
z
α
Yerleşim nükleer
δ
nükleer
ε
β
γ
nükleer
nükleer
mitokondri
Sentez Sentezin Yeni
onarım
deki
başlama kolun
fonksiy
sı
uzaması
on
Diğer
_
fonksiyo
nlar
onarım sentez
3’-5’
3’-5’
_
ekzonükleaz ekzonükleaz
(doğrulama) (doğrulama)
3’-5’
ekzonükleaz
(doğrulama)
49
Ökaryotik kromozomlar, prokaryotik kromozomlardan farklı olarak
doğrusal yapıdadır
Kromozomların ucu telomer olarak adlandırılan yapılar
ile sonlanır.
Normalde sentez sırasında
3‘-OH grubuna nükleotid ilavesi yapılır
koromozom ucunda, 3’-OH grubunu sağlayacak pirimer yoktur
Bu yüzden her DNA sentezi sonunda, kromozom
RNA primeri kadar kısalacaktır
Bu problem telomeraz enzimi tarafından giderilir.
TELOMER- TELOMERAZ
Kromozom uçlarındaki tekrarlanan
nukleotid dizileri
TELOMER
TELOMERAZ
53
telomeraz
Ribonükleoprotein yapıda,
bir revers transkriptaz olup
RNA ve protein alt birimlerini içerir
Yapısında yer alan RNA alt birimi
telomerik tekrarların sentezlenmesinde
(TTAGGG) kalıp olarak kullanılır
Telomerik tekrar dizilerini
artçıl zincirin 3‘ ucuna ilave ederek
telomeri uzatır.
Kültür ortamında;

İnsan fibroblastının replikasyon sayısı: 50 ± 10

Fare fibroblastının replikasyon sayısı: 15 ± 5

Down sendromlu kişinin fibroblast r.s.: 40 ± 15
(Metabolik hastalıklara sahip -örn.diyabet- ayrıca
genetik hastalıklara sahip kişilerde replikasyon sayısı
daha düşüktür)
TELOMERİN İŞLEVLERİ
DNA daki tek zincirli uçları korumak ve
ölümsüzlük
Kromozomları yeni düzenlemelerden korumak
Mayoz profazında eşleşme ve hareketi sağlamak
Kırık kromozomların yapışmasını engellemek
SOMATİK HÜCRELERDE TELOMERLER
1.Hücre kültüründe, Her hücre döngüsü sonunda
kısalırlar
2.In vivo da yaşlı kişilerin hücrelerinde daha
kısadır
3.Telomerdeki boy kısalması yaşlılık sinyalidir ve
belli noktaya kadar kısalma devam eder
Somatik hücrelerde, telomer tekrarları tam olarak
doğarlar
Ancak bu hücrelerde telomeraz geni kapalıdır
Bu nedenle her hücre bölünmesinde telomerin boyu
25-200 nukleotid kadar kısalır
Belli bir noktaya gelindiğinde bölünme durur
Bu olay aynı zamanda replikatif hücre yaşlanması
olarakta tanımlanır
Bu mekanizma somatik hücrelerde, bölünme kontrolü
gibi çalışır
ve
anormal bölünmelere yani kansere karşı korunmayı
sağlar
Telomeraz aktivitesi
Embriyonik hücrelerde
Germ hücrelerinde
Sürekli çoğalan hücrelerde (Hematopetik kök hücreleri,
aktif lenfositler, intestinal hücreler)
Kanser hücrelerinde görülür
Normal koşullarda, somatik hücreler
telomeraz aktivitesi göstermez.
Somatik hücrelerde:
Telomer kaybı ve yaşlılık arasında yakın ilişki vardır
PROGERIA (Hızlı Yaşlanma Hastalığı), ciddi
telomer kısalması ve kaybı gözlenir.
DNA Onarımı
Hasarlı DNA Onarımı
DNA sentezi sırasında,
sağlamalı okuma ve yanlış yerleşimi onarma
olmasına
rağmen
bazı yanlış yerleşmiş bazlar kalır
.
İlave olarak,
hücrelerde oluşan mutagenler veya
inhalasyon veya çevreden absorbe olan mutagenlerle
DNA hasara uğratılır.
Normal hücreleri,
kanser hücrelerine dönüştüren mutagenler,
karsinogenler olarak bilinir.
61
Hücrelerin DNA hasarlarını
onarabilme yeteneği vardır.
Bu onarım mekanizmalarının çoğu,
hasarın tanınması,
hasarlı kısmın DNA zincirinden uzaklaştırılması
ve kalan boşluğun doldurulması gibi
işlevleri kapsar.
Onarım mekanizması olmaksızın,
yaşamamız mümkün olmaz.
62
DNA hasarı,
radyasyonla veya kimyasallarla oluşabilir.
Bu etkenler direk olarak veya indirek olarak
DNA’yı etkiler.
Örneğin, x-ray bir tip ionize radyasyondur,
hücrede, DNA ile etkileşen molekülleri harekete
geçirerek indirek etkiler,
bazların yapısını değiştirir veya
DNA kollarını kırar.
63
X-ray’a maruz kalmak pek sık olmasada,
sigara dumanına maruz kalmaktan kaçınmak daha
zordur ve
güneş ışığından kaçmak mümkün değildir.
Sigara dumanı,
aromatik polisiklik hidrokarbon olan,
benzo(a)pyrene gibi karsinogenleri kapsar ,
hücrede enzimlerle okside olduğunda,
DNA da guanin ile büyük bir yapı oluşturabilir.
Güneşten gelen ultraviole ışığı
komşu pirimidin bazların, kovalent dimmer
oluşturmasını sağlar
64
Bütün hücreler,
çok çeşitli DNA onarım sistemlerine
sahiptirler.
Onarım sistemlerin çeşit ve sayıları,
hücre yaşamı için
DNA onarımının önemini ve
DNA hasarının çeşitliliğini yansıtır.
65
Prokaryat ve ökaryatlarda benzer olan
başlıca 4 tip onarım sistemi
vardır
1. Baz kesip çıkarma onarımı
2. Nükleotid kesip çıkarma onarımı
3. Yanlış eşleşme onarımı (mismatch onarım)
4. Direkt onarım
66
Tablo 1: E.koli’de DNA Onarım Sistemleri
Enzimler / Proteinler
Hasarın Tipi
Baz Kesip Çıkarma Onarımı
DNA glikozilazlar
AP endonükleazlar
DNA polimeraz I
DNA ligaz
Anormal bazlar (urasil, hipoksantin,
ksantin): alkalilendirilmiş bazlar; pirimidin
dimerleri
Nükleotid Kesip Çıkarma Onarımı
UvrABC endonükleaz
(veya ABC excinuclease)
DNA Helikaz
DNA polimeraz I
DNA ligaz
Yapısal değişikliklere neden olan DNA
hasarları (örnek: pirimidin dimerleri)
67
Tablo 1: E.koli’de DNA Onarım Sistemleri (devamı)
Enzimler / Proteinler
Hasarın Tipi
Yanlış Eşleşme Onarımı
Mut proteinler
Helikazlar
Ekzonükleazlar
DNA polimeraz III
DNA ligaz
Yeni sentezlenen kollarda yanlış
eşleşmiş bazlar.
Direkt Onarım
DNA fotoliyazlar
O6-Metilguanin-DNA metitransferaz
Pirimidin dimerleri, O6-Metilguanin
68
Baz Kesip Çıkarma Onarımı
Urasili oluşturmak üzere ,
amino grubunun uzaklaştırıldığı, sitozin örneğinde
olduğu
gibi,
DNA molekülündeki bazlar,
kendiliğinden veya alkillendiren ve deanimasyon yapan
bileşiklerin etkisi ile değişebilmektedir.
Nitrozaminler, nitritler ve nitratlar gibi öncül maddelerden
hücreler tarafından oluşturulan nitroz asid,
sitozin, adenin ve guaninden
69
amino grubunu uzaklaştırır.
71
Hücrede günde yaklaşık 10.000 pürin
kendiliğinden kaybolur.
Baz değişimi veya kaybıyla ilgili hasarların
düzeltilmesinde
ilk olarak anormal bazlar,
glikozilazlar tarafından özel olarak tanınarak
deoksiriboz-fosfat iskeletinden
N-glikozidik bağını yıkarak
hidrolitik olarak uzaklaştırılırlar
72
pürin veya pirimidini uzaklaştırılmış
apürinik/apirimidinik (AP) olarak tanımlanan
bir bölge oluşur.
AP endonüklezlar,
AP bölgesini 5’ tarafından veya 3’ tarafından (AP
endonükleazın türüne gore değişir) keserler.
AP bölgeyi kapsayan DNA parçası uzaklaştırılıp
DNA polimeraz I tarafından boşluk doldurulur.
Kırık, DNA ligaz ile bağlanır.
73
Urasil-DNA glikozilazdan başka,
hipoksantini, 3-metiladenini ve 7 metilguanini
tanıyan glikozilaz da vardır.
Pirimidin dimerlerini tanıyan glikozilaz da
bulunmuştur.
74
Nükleotid Kesip Çıkarma Onarımı
DNA onarımı ile ilgili ilk çalışmalar,
hasarlı nükleotidlerin onarılması üzerinedir.
Güneş ışınlarının etkisinde kalan bir hücrede
komşu primidinlerin,
kovalent bağlanmaları ile oluşan
timin dimerleri
DNA polimerazların çalışmalarını ve
DNA zincirinin replikasyonunu önler
DNA heliks yapısında bozulmalara yol açan hasarlar
genellikle nükleotid kesip çıkarma sistemleri ile tamir edilir
75
Timin dimerleri
önce özel bir endonükleaz taafından tanınır
sonra hasarlı kısmın iki tarafından zincir kırılır
76
77
78
Bu mekanizmada yer alan multi-fonksiyonl enzim
Uvr ABC hasar spesifik endonükleaz
(veya eksonükleaz) olarak adlandırılır.
Bu enzim UvrA, UvrB ve UvrC proteinlerinden
(alt birimlerinden)
oluşur
UvrA proteini
ATPaz aktivitesi olan bir DNA bağlayıcı proteindir.
UvrB proteininin tek başına ATPaz aktivitesi
yoktur.
UvrA proteinine bağlanarak aktive olduğunda
ya da spesifik proteolizle yıkıldığında ATPaz 79
(UvrA)2-(UvrB)1 kompleksi
DNA üzerinde hasarlı bölgeye yakın bir yere
bağlanır ve
helikaz aktivitesi gösterir.
DNA kıvrımın açarak ilerleyen (UvrA)2-(UvrB)1
kompleksi
hasarlı bazların bulunduğu yere gelince
UvrA proteini kompleksten ayrılır.
80
Ayrılma işlemi, ATP hidrolizini gerektirir.
UvrA proteini ayrılınca
UvrC proteini UvrB ,
hasarlı DNA kompleksine bağlanır.
UvrC proteininin komplekse bağlanmasıyla
hasarlı bazların 3’ ve 5’ yönlerinde birer kırık
oluşur.
81

Hasarlı kısım helikazla ayrılır.

Boşluk DNA polimeraz I tarafından doldurulur ve

DNA ligazla zincir bağlanır
82
Az rastlanan bir genetik hastalık olan,
kseroderma pigmentozumda ,
DNA yapısında meydana gelen dimerlerin
hücreler tarafından onarılamaması,
mutasyonların birikimine ve
sıklıkla deri kanserine yol açar.
83
84
Yanlış Eşleşme Onarımı
Yanlış eşleşme
daima kalıp zincirdeki bilgi
baz alınarak tamir edilir
DNA sentezi esnasında
sentezlenen yeni zincir
kısa bir süre için
metillenmemiş bir yapıya sahiptir.
Tamir sistemine ait proteinler
metillenmeye göre
kalıp zincir ve yeni sentez edilen zinciri
ayırd edebilir ve
yeni zincirdeki yanlış eşleşmeleri düzeltebilir
Yanlış Eşleşme Onarımı
Direk onarım ve kesip çıkartma onarımında esas,
normalde DNA molekülünde bulunmayan bazların
tanınmasıdır.
Yanlış eşleşme onarımında ise, değiştirilen
normalde DNA molekülünde bulunan bazlardır.
Bu nedenle, direk veya kesip çıkarma onarımı ile
tanınmazlar.
Yanlış eşleşme en çok replikasyon hatası olarak
görülürsede rekombinasyon ve onarım işlemleri
sırasında da yanlış eşleşme olabilmektedir.
87
Yanlış eşleşme her zaman eski zincirdeki bilgiye
gore düzeltilir
Onarım sisteminin, eski zincir ile yeni
sentezlenen zinciri ayırd edebilmesi gerekir.
Ayırım eski zincir üzerinde bulunan fakat yeni
sentezlenmiş zincirde henüz bulunmayan metil
grupları aracılığı ile olur.
Dam metilaz, 5’ GATC dizisindeki
adenini N6 pozisyonunda metiller.
Replikasyondan hemen sonra yaklaşık ilk bir
dakika içinde eski zincir metillenmiş iken, yeni
sentezlenen zincir henüz metillenmemiştir
Bu kısa geçiş süresi yeni zincirin tanınmasını
sağlar.
E.coli yanlış eşleşme onarım sisteminde
MutS, MutH ve MutL proteinleri anahtar role sahiptirler
MutS proteini yanlış eşleşmiş baz çiftinin içinde bulunduğu geniş
bir bölgeye bağlanırken,
MutH proteini GATC dizisini içeren bölgeye bağlanır.
MutL proteini ise MutS ve MutH proteinlerini birbirine bağlayarak
bir konmpleks oluşturur
Sadece bir zincir GATC dizisinde metillenmiş ise ve yanlış
eşleşmiş baz çiftine yakınsa (ilk 1000 baz çifti içinde ise)
MutH proteini bir bölgeye özel endonükleaz olarak metillenmiş
kolu GATC dizisinin 5’ ucundan keser. Böylece onarılacak olan
kısım belirlenmiş olur.
89
Metillenmemiş kolda kıvrım açılır ve
3’5’ yönünde yıkıma uğrar
Oluşan
boşluk
DNA
polimeraz
I
ile
doldurulduktan sonra zincir bağlanır
Bu işlemler DNA helikaz II, SSB, ekzonükleaz I
(DNA molekülünde sadece tek zincir 3’5’
yönünde yıkıma uğrar), DNA polimeraz III ve
DNA ligaz gerektirir
Direkt Onarım
Direkt onarım mekanizmalarında hasar,
zinciri kırmadan uzaklaştırılmaktadır
Sadece timin dimerleri ve alkillenmiş bazlar direk olarak
onarılabilmektedir.
Fotoreaktivasyon :
Tek ve çift sarmal DNA üzerinde bulunan timin dimerleri
300-600 nm dalga boyundaki ışıkla indüklenen,
fotoliyaz tarafından birbirlerinden ayrılır.
Bu enzim hem prokaryotlarda hemde ökaryotlarda bulunur.
91
DNA alkilasyonunun onarımı
Alkilleyici maddelerin, mutajenik ve karsinojenik etkilerinden en
fazla sorumlu olan hasar O6-metilguanindir (O6-MG)
O6-MG, O6-metilguanin DNA metil transferaz (O6-MGMT, EC
2.1.1.63) tarfından onarılır.
E.collide Ada geni tarafından kodlanan ve monomerik bir protein
olan O6-MGMT,
guaninin O6 konumundaki metil grubunu kendi üzerindeki spesifik
bir sistein kalıntısına aktarır ve inaktive olur.
Bir intahar enzimi olan O6-MGMT‘nin rejenerasyonu olmaz
İnsan, O6-MGMT geni,
10. kromozomun uzun kolunda telomerik bölgede bulunur.
93
5. DNA Rekombinasyonu
DNA molekülü içerisinde veya moleküller arasında genetik bilginin
yeniden düzenlenmesi, genetik rekombinasyon adı altında
toplanan pek çok işlemi içerir. Genetik rekombinasyon
sistemlerinin fonksiyonları, mekanizmaları kadar çeşitlidir. Genetik
farklılığın varlığı, özel DNA onarım sistemleri, belirli genlerin
fonksiyonlarının açığa çıkışının düzenlenmesi ve gelişim
esnasındaki programlanmış genetik düzenlenmeler, genetik
rekombinasyon olaylarının bazı bilinen sonuçlarıdır. Genetik
rekombinasyon fonksiyonları ile ilişkili tepkimeler üç sınıfta
toplanır :
94
a. Homolog Genetik Rekombinasyon
Homolog serileri kapsayan bölgeleri ortak kullanan, iki DNA
molekülü veya aynı molekülün bazı bölümleri arasındaki genetik
bilgi değişimini ifade eder.
Birbirleri ile etkileşen iki DNA molekülü bir dereceye kadar benzer
olan serileri ortaya koyarlar. Bu seriye koyma işlemi üç veya
muhtemelen dört zincirin etkilendiği yeni DNA ürünlerinin
oluşumunu da kapsayabilir. Rekombinasyon araürünü olarak
dallanmış DNA yapıları da oluşur. Heliks yapıdaki iki
makromolekül arasında bilgi değişimi, sıklıkla DNA zincirlerinin
karmaşık bir şekilde birbirine karışmasını da kapsar.
95
Homolog genetik rekombinasyonun (aynı zamanda genel
rekombinasyon olarak da adlandırılır) ökaryotlardaki hücre
bölünmesi ile çok yakın bir ilişkisi vardır. Bu işlem sıklıkla mayoz
bölünme sırasında gerçekleşir. Eşleşmiş uygun 2n kromozomlu
germ hücresi (diploid hücre) bölünerek yüksek ökaryotlarda sperm
ve ovum hücreleri olan gametleri oluştururlar. Bu gametlerden her
biri kromozom çiftinden yalnızca birini içerir (haploid hücre).
Mayoz bölünme DNA molekülünün germ hücresinde coğalması ile
başlar (Şekil 8.52). Hücre içerisinde 4 kopya halinde DNA
oluşmasından sonra hücre iki mayoz hücreye ayrılır. DNA içeriği
haploid(n) düzeye inerken dört yeni gamet ortaya çıkar.
96
Mayoz bölünmenin ilk aşaması olan profaz I sırasında oluşan
DNA kopyaları sentromerlerinden birbirleri ile bağlı olarak
bulundukları için kardeş kromatidler adını alırlar. Bundan dolayı
dört homolog DNA molekülünün her biri kromatid çifti şeklinde
düzenlenir. Genetik bilgi mayoz bölünmenin bu aşamasında
homolog genetik rekombinasyon ile birbirine yakın homolog
kromotidler arasında değiş tokuş edilir. Bu işlem esnasında, DNA
molekülünde kopma ve yeniden birleşmeler görülebilir. Sitolojik
olarak gözlemlenebilen bu değiş tokuş çapraz geçiş olarak
adlandırılır. Çapraz geçiş, iki çift kardeş kromatidi “chiasmata”
denilen noktalarda birbirine bağlar. Dört homolog kromatidinin
hepsi birbirine bağlanır ve bu bağlantı, sonuçta mayotik hücre
bölünmelerinde uygun kromozomların ayrımına yardımcı olur
(Şekil 8.53).
97
Rekombinasyon veya çapraz geçiş, iki homolog kromozomun
uzunluğu boyunca hemen her yerde gerçekleşebileceği için bir
kromozom üzerinde iki noktayı birbirinden ayıran bir bölgedeki
rekombinasyon sıklığı bu noktalar arasındaki uzaklığa bağlı
bulunur. Genetik uzmanları bu bilgiyi, genler arasındaki mesafeyi
ve birbirine göre durumlarını göstermek için uzun bir süredir
kullanmaktadırlar. Bundan dolayı homolog rekombinasyon,
genetik bilimin bir çok klasik bilgisini destekleyen moleküler bir
işlemdir.
Homolog gentik rekombinasyonun tespit edilen en az üç
fonksiyonu vardır. Biri, toplumdaki genetik çeşitliliğe katkıda
bulunur. Diğeri, ökaryotlarda ilk mayotik hücre bölünmesinde
kromozomların düzenli olarak yavru hücrelere aktarılmasında
önemli olan kromatidler arası geçici fiziki bağlantıyı sağlar.
Sonuncusu ise, çeşitli DNA hasarlarının onarınıma katkıda
bulunur.
98
Birinci ve ikinci fonksiyonlar, gen araştırmaları üzerinde çalışan
bilim adamlarının en çok ilgilendikleri konu olan homolog
rekombinasyon, sıklıkla genetik çeşitliliğin kaynağı olarak
tanımlanmaktadır. DNA onarımı hücre içerisindeki en önemli
fonksiyondur. DNA onarımı, bir iplikçikteki DNA hasarının hasar
görmemiş iplikçikte bulunan genetik bilgi ile doğru olarak
onarılması şeklinde tarif edilmektedir.
DNA çift zinciri kopmaları, çift zincir çapraz bağlanmaları veya
replikasyon sırasında tek zincirde oluşan hasarlar gibi belirli hasar
tiplerinde tamamlayıcı kolun kendisi de hasarlı olabilir (Şekil 8.54).
Bu söz konusu olduğunda, doğru DNA onarımı için gerekli bilgi
ayrı bir homolog kromozomdan gelmekte ve onarım homolog
rekombinasyon işlemini kapsamaktadır. Bu tip hasarlar sıklıkla
iyonizasyon yapan radyasyon ve oksidatif tepkimeler sonucu
oluşmakta ve onarımları, ökaryotlarda canlı gametlerin oluşumu
ve bakterilerin bulunması açısından önem taşımaktadır. Homolog
99
genetik rekombinasyon yoluyla yapılan onarım, rekombinasyonel
Homolog DNA molekülleri spesifik olmayan bir mekanizma ile bir
araya gelirler. Her DNA molekülünün bir zinciri koparılmakta ve
Holliday ara ürünü olarak adlandırılan bir çapraz geçiş yapısı
oluşturmak için diğer zincir ile birleşmektedir. Değişik DNA
moleküllerine ait zincirlerin çift oluşturduğu bölge, heterodupleks
DNA olarak isimlendirilmekte ve zincir taşınması ile
uzatılmaktadır. İki zinciri birbirinden ayıran Holliday ara
ürünündeki kopmalar rekombinant ürünleri oluşturmak üzere
onarılırlar.
Aynı lineer gen düzenine sahip olan iki homolog kromozomun
rekombinasyonunda her bir kromozomu meydana getiren bu
genlerin bazılarında farklı baz dizileri bulunabilir. İnsanda
hemoglobin için normal gen taşıyan bir kromozoma karşın bir
diğeri ortak-hücre mutasyonu olan, orak hemoglobin geni
içerebilir. Bu farklılıklar, milyonlarca benzer baz çifti arasından bir
veya iki baz çifti arasında görülebilir. Homolog rekombinasyon,
lineer gen dizilişini değiştirmesine rağmen tek bir kromozom
100
üzerinde değişik genlerin hangilerinin birlikte bağlanacağını
Homolog rekombinasyonun bir veya daha fazla aşamasının
gözlendiği prokaryot ve ökaryotlarda rekombinasyona spesifik
enzimler izole edilmiştir. E.koli ile yapılan çalışmalar bu enzimlerin
tanımlanması ve fonksiyonlarının anlaşılmasına yardımcı
olmuştur. Önemli rekombinasyon enzimleri, recA, B, C, D ve ruvC
genleri ile kodlanmıştır. recB, C ve D genleri, DNA molekülünün
açılması ve bazen iplikçiğin ayrılması sonucu rekombinasyonu
başlatabilen rec BCD enzimini kodlar. Rec A proteini, iki DNA
zincirinin eşlenmesi Holliday ara ürününün oluşumu, zincir
kaydırılması gibi bütün işlemlerde önemli rol oynamaktadır.
Bakteri ve mayalardan da izole edilen ve Holliday ürünlerini
ayrıştıran nükleaz sınıf ‘resolvazlar’ olarak isimlendirilir. E.koli
resolvaz RuvC proteinidir.
101
DNA onarımında önemli olan homolog rekombinasyon, hatalı
DNA zinciri ile oluşturulan çiftten, dizilime ait önemli bilgiler elde
ederek DNA onarımı sağlanır. DNA onarımında rekombinasyonun
rolünü göstermek için normal replikasyon sırasında karşılaşılan ve
tek zincirli DNA molekülünde replike olmamış halde bırakılan
hasarların onarımı replikasyon sonrası onarım olarak adlandırılır
ve E.kolide bu işlem RecA proteini ile yapılır.
102
b. Bölgeye Özel Rekombinasyon
Değişim yalnızca belirlenmiş DNA serileri arasında gerçekleşir.
Replikasyon sonrasında onarım gerçekleştirilir. Her iki DNA
zincirinde kırılmalara yol açarak hücre ölümüne neden olacağı için
çift oluşturmamış DNA zincirindeki hasarlı kısım kesilip atılmaz.
Kromozom kırılmasını önlemek ve onarımını sağlamak için
hasarın bulunduğu bölgede tamalayıcı bir zincir bulundurulmalıdır.
Rekombinasyon yolu, replikasyon çatalının diğer dalında homolog
DNA yapısını kullanır. Rec A proteinine bağlı zincir değişim
tepkimesi lezyonu kapsayan bölgeyi heterojen çift DNA
molekülüne dönüştürerek homolog DNA molekülünden hasar
görmemiş tamamlayıcı zincirin taşınmasını gerçekleştirir. Rec A
proteinine bağlı DNA zincir değişimi ile bir çok DNA hasarı ATP
hidrolizi sonucu sağlanan enerjinin yardımı ile etkin bir şekilde
düzeltilmektedir. DNA çiftinin bir kısmında bir kez oluşan hasar
hemen onarılmaktadır (Şekil 8.56). Bölgeye özel rekombinasyon
103
kesin DNA düzenlenmesi ile sonuçlanır.
Gerçekte bütün hücrelerde oluşan ve bir türden diğerine büyük
oranda değişklik gösteren bölgeye özel rekombinasyon
tepkimelerinin fonksiyonları özelleşmiştir. Bu fonksiyonlar, belli
genlerin açığa çıkışının düzenlenmesi, bir çok organizmada
gelişim süresince oluşan parçalanmış DNA moleküllerinin yeniden
düzenlenmesinin sağlanması bazı virüs ve Plazmid DNA
yapılarında
kopyalama
döngüsüne
bağlı
DNA
yeni
düzenlemelerinden oluşur. Bölgeye özel rekombinasyon sistemi,
rekombinaz adını taşıyan bir enzim ve bu enzimin etkili olabileceği
kısa, sisteme bağlı olarak 20-200 baz çifti içeren, bir
rekombinasyon bölgesini taşıyan bir DNA dizisini içerir. Bazı
sistemler aynı zamanda tepkime zamanlamasını ve sonucunu
düzenleyen bir veya daha fazla sayıda yardımcı proteini de içerir.
104
c. DNA Transpozisyonu
İmmunglobülin Genleri Rekombinasyonla Biraraya Gelir
Gelişim esnasında oluşan programlanmış rekombinasyon olayının
önemli bir örneğini immunglobulin genlerinin genom içinde yer
alan gen bölgeleri oluşturur. B-lenfositler tarafından sentez edilen
ve infeksiyoz bileşikler ile organizmaya yabancı olan bütün
maddelere bağlanan moleküller olan immunoglobulinler
(antikorlar), vertebralıların immun sistemlerinin en önemli
bileşenleri arasında yer almaktadır. Yaklaşık 100.000 civarında
gen taşıyan insan genomunun farklı bağlanma özelliklerinin
milyonlarca değişik antikor üretme yeteneği bulunmaktadır.
Rekombinasyon, bir organizmaya küçük DNA kodlama
kapasitesinden olağanüstü çeşitlilikte antikor üretme olanağı
sağlar.
105