tc istanbul üniversitesi sağlık bilimleri enstitüsü danışman doç. dr

T.C.
İSTANBUL ÜNİVERSİTESİ
SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ
(YÜKSEK LİSANS TEZİ)
ALLERJİK ASTIMDA T HÜCRELERDE KEMOKİN
EKSPRESYONU VE SİTOKİNLER
LAÇİN CEVHERTAŞ
DANIŞMAN
DOÇ. DR. GAYE ERTEN
İMMÜNOLOJİ ANABİLİM DALI
İMMÜNOLOJİ PROGRAMI
İSTANBUL-2015
ii
iii
BEYAN
Bu tez çalışmasının kendi çalışmam olduğunu, tezin planlanmasından yazımına
kadar bütün safhalarda etik dışı davranışımın olmadığını, bu tezdeki bütün bilgileri
akademik ve etik kurallar içinde elde ettiğimi, bu tez çalışmayla elde edilmeyen bütün
bilgi ve yorumlara kaynak gösterdiğimi ve bu kaynakları da kaynaklar listesine
aldığımı, yine bu tezin çalışılması ve yazımı sırasında patent ve telif haklarını ihlal edici
bir davranışımın olmadığı beyan ederim.
Laçin Cevhertaş (İmza)
iv
İTHAF
Anne ve babama ithaf ediyorum.
v
TEŞEKKÜR
Yüksek Lisans Tez çalışmamda engin desteğini gördüğüm, beni her zaman
cesaretlendiren danışmanım Doç. Dr. Gaye ERTEN’e ve çalışmamın her aşamasında
yardımlarını esirgemeyen İmmünoloji Anabilim Dalı Başkanı Sayın Prof. Dr. Günnur
DENİZ’e, deneylerim sırasında bana her açıdan destek olan çalışma arkadaşlarım
Abdullah YILMAZ, Msc. İlhan TAHRALI ve Dr. Yusuf Metin GELMEZ’e, klinik
katkılarından dolayı Dr. Ayşe Bilge ÖZTÜRK, Prof. Dr. Bilun GEMİCİOĞLU ve
tezimin istatistik hesaplamalarındaki yardımlarından dolayı Doç. Dr. Umut Can
KÜÇÜKSEZER’e teşekkür etmeyi bir borç bilirim.
Sıkıntılarımı paylaşan ve bana zor anlarımda daima yanımda olduklarını
gösteren özellikle Funda Pehlevan, Pınar İrfan, Gülce Özçit, Murat Giriş, Canan
Ulusoy, Çiğdem Şener, Demet Sapan, Müşerref Kocabalkan, Nilgün Sallakçı ve diğer
arkadaşlarıma…
Öğrenim hayatım boyunca bana destek olan aileme ve tezimde emeği geçen
herkese ayrı ayrı teşekkürlerimi sunarım.
Laçin CEVHERTAŞ
Bu çalışma, İstanbul Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Birimi tarafından
desteklenmiştir. Proje No: 25996
vi
İÇİNDEKİLER
TEZ ONAYI .................................................................................................................... İİ
BEYAN ...........................................................................................................................İİİ
İTHAF ............................................................................................................................ İV
TEŞEKKÜR..................................................................................................................... V
İÇİNDEKİLER .............................................................................................................. Vİ
TABLOLAR LİSTESİ ................................................................................................... İX
ŞEKİLLER LİSTESİ ....................................................................................................... X
SEMBOLLER / KISALTMALAR LİSTESİ ............................................................... Xİİ
ÖZET .......................................................................................................................... XİV
ABSTRACT.................................................................................................................. XV
1. GİRİŞ VE AMAÇ .........................................................................................................1
2. GENEL BİLGİLER ......................................................................................................3
2.1. Astım ........................................................................................................................3
2.1.1. Tanım ve Sınıflandırma ......................................................................................3
2.1.2. Belirtiler ..............................................................................................................3
2.1.3. Sıklık - Epidemiyoloji .........................................................................................4
2.1.4. Etiyoloji ...............................................................................................................4
2.1.4.1. Kişisel Faktörler .............................................................................................4
2.1.4.2. Çevresel Faktörler ..........................................................................................5
2.1.4.3. Epigenetik ......................................................................................................6
2.1.5. Tanı Kriterleri .....................................................................................................7
2.1.6. Klinik Seyir .........................................................................................................7
2.1.6.1. Allerjik Astım.................................................................................................8
2.1.6.2. Non-Allerjik Astım ........................................................................................8
2.2. Astım ve Bağışıklık Sistemi İlişkisi .........................................................................9
2.3. T hücreler .................................................................................................................9
2.3.1. T hücre Astım İlişkisi ........................................................................................11
2.4. Sitokinler ve Astım İlişkisi ....................................................................................11
2.4.1. İnterlökin-4 (IL-4) .............................................................................................12
2.4.2. Interlökin 10 (IL-10) .........................................................................................12
vii
2.4.3. İnterferon- (IFN-γ) ..........................................................................................13
2.5. Kemokinler ve Astım İlişkisi .................................................................................14
2.5.1. CCR3.................................................................................................................15
2.5.2. CCR4.................................................................................................................15
2.5.3. CXCR3 ..............................................................................................................16
3. GEREÇ VE YÖNTEM ...............................................................................................17
3.1. Olgular ...................................................................................................................17
3.1.1. Gönüllülerin Araştırmaya Dahil Edilme Kriterleri ...........................................17
3.1.2. Gönüllülerin Araştırmaya Dahil Edilmeme Kriterleri ......................................17
3.1.3. Non - allerjik Astım ..........................................................................................17
3.1.4. Allerjik Astım ...................................................................................................18
3.2. Deneylerde Kullanılan Kimyasallar .......................................................................18
3.2.1. PBS (Fosfat Tampon Tuz Çözeltisi) .................................................................18
3.2.2. RPMI-1640 (Roswell Park Memorial Institute-1640) ......................................18
3.2.3. Fiksasyon ve Permeabilizasyon Kiti .................................................................19
3.3. Hücre Yüzey Molekül Ekspresyonlarının Belirlenmesi ........................................19
3.4. Periferik Kan Mononükleer Hücre (PKMH) Eldesi ..............................................20
3.5. PKMH Kültürü.......................................................................................................21
3.6. Hücre Yüzey Molekülleri ve Hücre İçi Sitokin Tayini ..........................................22
3.6.1. Hücre Yüzey Boyaması ....................................................................................22
3.6.2. Hücre İçi Boyama .............................................................................................23
3.7. Analiz ve İstatistikler .............................................................................................24
4. BULGULAR ...............................................................................................................26
4.1. Periferik Kan T Hücrelerin Hücre İçi Sitokin İçeriği ............................................26
4.1.1. Allerjik Astım Olguları .....................................................................................26
4.1.2. Allerjik Olmayan Astım Olguları .....................................................................27
4.1.3. Allerjik ve Non-allerjik Astım Hasta Grupları Kıyaslaması .............................28
4.2. Periferik Kan T hücrelerin Kemokin Reseptörü Ekspresyon Profili .....................28
4.2.1. Allerjik Astım Olguları .....................................................................................28
4.2.2. Allerjik Olmayan Astım Olguları .....................................................................29
4.2.3. Allerjik ve Non-allerjik Astım Hasta Gruplarının Karşılaştırılması .................30
4.3. Periferik Kan T Hücrelerin Kemokin Reseptör Profillerine Göre Sitokin İçerikleri
.......................................................................................................................................31
viii
4.3.1. Allerjik Astım Olguları .....................................................................................31
4.3.2. Allerjik Olmayan Astım Olguları .....................................................................32
4.3.3. Allerjik ve Non-allerjik Astım Hasta Gruplarının Karşılaştırılması .................34
4.4. Periferik Kan CD4+ ve CD8+ T Hücrelerin Sitokin İçeriklerine Göre
Karşılaştırılması ............................................................................................................35
4.4.1. Allerjik Astım Olguları .....................................................................................35
4.4.2. Non-allerjik Astım Olguları ..............................................................................36
5. TARTIŞMA ................................................................................................................38
KAYNAKLAR ...............................................................................................................41
FORMLAR .....................................................................................................................47
ETİK KURUL KARARI ................................................................................................50
PATENT HAKKI İZNİ ..................................................................................................51
TELİF HAKKI İZNİ .......................................................................................................52
ÖZGEÇMİŞ ....................................................................................................................53
ix
TABLOLAR LİSTESİ
Tablo 3-1: Hücre yüzey boyamada kullanılan monoklonal antikorlar ........................... 20
Tablo 3-2: Hücre kültüründe kullanılan uyaranlar ve kimyasallar ................................. 22
x
ŞEKİLLER LİSTESİ
Şekil 3-1: Uyarımsız koşulda, CD4+ T hücre CCR4 ve CD8+ T hücre CCR4
ekspresyonu akan hücre ölçer görüntüsü ........................................................................ 23
Şekil 3-2: PMA/iyonomisin sonrası CD4+ T hücresi IL-4 ve uyarımsız CD8+ CCR4+T
hücresi IL-10 sitokin içeriği akan hücre ölçer görüntüsü ............................................... 24
Şekil 3-3: Total lenfositler (R1), CD8+ hücreler (R2) ve CD4+ hücreler (R3) akan hücre
ölçer görüntüsü ............................................................................................................... 24
Şekil 4-1: PMA/iyonomisin uyarımına yanıt olarak CD4+ T hücre IFN-γ ve IL-4
düzeyleri.......................................................................................................................... 26
Şekil 4-2: PMA/iyonomisin uyarımına yanıt olarak CD8+ T hücre IFN-γ, IL-4 ve IL-10
düzeyleri.......................................................................................................................... 27
Şekil 4-3: PMA/iyonomisin uyarımına yanıt olarak CD4+ T hücre IFN-γ, IL-4 ve IL-10
düzeyleri.......................................................................................................................... 27
Şekil 4-4: PMA/iyonomisin uyarımına yanıt olarak CD8+ T hücre IFN-γ, IL-4 ve IL-10
düzeyleri.......................................................................................................................... 28
Şekil 4-5: PMA/iyonomisin uyarımı sonrası CD4+ T hücrelerin CXCR3, CCR3 ve
CCR4 yüzey ekspresyon değişimleri ............................................................................. 29
Şekil 4-6: PMA/iyonomisin uyarımı sonrası CD8+ T hücrelerin CXCR3 ve CCR4
yüzey ekspresyon değişimleri ......................................................................................... 29
Şekil 4-7: PMA/iyonomisin uyarımı sonrası CD8+ T hücrelerin CCR3 yüzey ekspresyon
değişimleri ...................................................................................................................... 30
Şekil 4-8: PMA/iyonomisin uyarımı öncesi ve sonrasında allerjik ve non-allerjik astım
olgularının CD8+ CCR4+ hücre oranları ......................................................................... 30
Şekil 4-9: PMA/iyonomisin uyarımı sonrası CD4+ T hücre CXCR3+IFN-γ, CXCR3+IL4, CCR3+IFN-γ, CCR3+IL-4, CCR3+IL-10, CCR4+IL-10 değişimleri ......................... 31
Şekil 4-10: PMA/iyonomisin uyarımı sonrası CD8+ T hücre CCR3+IFN-γ, CCR3+IL-4,
CCR3+IL-10, CCR4+IL-4, CCR4+IL-10 değişimleri .................................................... 32
Şekil 4-11: PMA/iyonomisin uyarımı sonrası CD4+ T hücre CXCR3+IFN-γ,
CXCR3+IL-4, CXCR3+ IL-10, CCR3+IFN-γ, CCR3+IL-4, CCR3+IL-10 değişimleri . 33
Şekil 4-12: PMA/iyonomisin uyarımı sonrası CD8+ T hücre CXCR3+IFN-γ ve
CXCR3+IL-10 değişimleri ............................................................................................ 34
xi
Şekil 4-13: Uyarımsız koşulda allerjik ve non-allerjik astım olgularının CD4+ T hücre
CCR4+IFN-γ ve CCR4+IL-10 düzeyleri ......................................................................... 34
Şekil 4-14: Uyarımsız koşulda allerjik astım olgularında CD4+ ve CD8+ T hücrelerinde
IFN-γ ve IL-10 hücre içi sitokin düzeyleri ...................................................................... 35
Şekil 4-15: PMA/iyonomisin uyarımı sonrası allerjik astım olgularının CD4 + ve CD8+ T
hücre popülasyonlarında CXCR3 ekspresyonu .............................................................. 36
Şekil 4-16: Uyarımsız koşulda allerjik astım olgularının CD4+ ve CD8+ T hücre
popülasyonlarında CCR3+IFN-γ yüzdeleri .................................................................... 36
Şekil 4-17: Uyarımsız koşulda allerjik olmayan astım olgularının CD4+ ve CD8+ T
hücre popülasyonlarında hücre içi IFN-γ, IL-10 sitokin düzeyi ve CCR4 ekspresyonu 37
xii
SEMBOLLER / KISALTMALAR LİSTESİ
AHR: Hava yolu aşırı duyarlılığı (Airway hyperresponsiveness)
AP-1: Aktivatör protein 1 (Activator protein 1)
ASH: Antijen sunucu hücre
BAL: Bronkoalveolar lavaj
CCR4: CC kemokin reseptörü 4
DH: Dendritik hücre
FSC: Önden saçılım (Forward scatter)
GCPR: G-protein-eşlikçi reseptör
GWAS: Tüm genom
ilişkilendirme çalışmaları (Genome-wide association
studies)
HRV: Human rhino virüs
IFN-γ: İnterferon gamma
IG: İmmünoglobülin
ILCs: Doğal lenfoid hücreler (Innate lymhoid cells)
IL-4: İnterlökin 4
IL-10: İnterlökin 10
MHC sınıf : Doku uyumluluk kompleksi sınıf II (Major histocompatibility
complex class )
MKP-1: Mitojenle aktive protein kinaz fosfataz-1 (Mitogen-activated protein
kinase phospatase-1)
NF-κB: Nükleer faktör kappa B (Nuclear factor kappa B)
NKT: Doğal öldürücü T hücre (Natural Killer T cell)
PBS: Fosfat tampon tuz çözeltisi (Phosphate-buffered saline)
PMNH: Periferik mononükleer hücre (Peripheral blood mononuclear cell)
xiii
PKC: Protein kinaz C
PMA: Forbol miristat asetat (Phorbol myristate acetate)
PMs: Partiküler maddeler (Particular matters)
PUFA: Çoklu doymamış yağ asidi (Polyunsaturated fatty acid)
RPMI-1640: Roswell Park Memorial Institute-1640
RSV: Respiratory syncytial virus
SARP: Severe asthma research program
SSC: Yandan saçılım (Side scatter)
Tc1: Sitotoksik T hücresi 1
Tcreg: Sitotoksik regülatör T hücresi
Tfh: Foliküler T hücre
Th1: Yardımcı T hücresi 1
Th2: Yardımcı T hücre 2
THR: T hücre reseptörü
Treg: Regülatör T hücre
US: Uyarımsız (Unstimule)
xiv
ÖZET
Cevhertaş L. Allerjik Astımda T hücrelerde kemokin ekspresyonu ve sitokinler.
İstanbul Üniversitesi Sağlık Bilimleri Enstitüsü, Deneysel Tıp ve Araştırma Enstitüsü,
İmmünoloji ABD. Yüksek Lisans Tezi. İstanbul. 2015.
Allerjik ve allerjik olmayan astım gelişiminde T hücre alt grupları önemli rol
oynamaktadır. Bu çalışmada GINA 2014 Rehberine göre en az 1 yıl önce astım tanısı
konulmuş, orta-yüksek doz inhale steroid ve uzun etkili beta agonist tedavisine yanıtsız,
FEV1 değeri < %80 olan ve sigara içmeyen veya 10 yıl altında içip en az 6 ay önce
bırakmış olan allerjik (n:4, yaş ort. 47,2±8,6) ve nonallerjik (n:5, yaş ort. 47,25±10,3)
bireylerde periferik kan mononükleer hücrelerin (PKMH) hücre yüzey belirteçleri
(CD4, CD8, CCR3, CCR4, CXCR3) ve hücre içi sitokin (IFN-g, IL-4 ve IL-10)
düzeyleri PMA/iyonomisin uyarımlı ve uyarımsız olarak akan hücre ölçer ile
değerlendirilmiştir. Uyarım sonrasında, allerjik astımlı hastalarda yardımcı T (Th) hücre
CXCR3+IFN-g, CXCR3+IL-4, CCR3+ IFN-g, CCR3+IL-4, CCR3+IL-10, CCR4+IL-10;
allerjik olmayan astımlılarda ise CXCR3+IFN-g, CXCR3+IL-4, CXCR3+IL-10,
CCR3+IFN-g, CCR3+IL-4 ve CCR3+IL-10 ekspresyonu artmıştır. Sitotoksik T hücreler
uyarıldığında ise; CCR3+IFN-g, CCR3+IL-4, CCR3+IL-10, CCR4+ IL-4, CCR4+IL-10
ekspresyonunda artış saptanmıştır. Allerjik olmayan astımda ise hem
CD8+CXCR3+IFN-g hem de CD8+CXCR3+IL-10 seviyelerinde artış gözlenmiştir.
Çalışmamızda, sitokin içerikleri açısından gruplar arasında anlamlı fark
saptanmamasına karşılık düzeylerde artma eğilimi gözlenmiştir. Hasta grupları
karşılaştırıldığında, allerjik astımda CCR3+ ve CCR4+ yardımcı T hücrelerinin uyarım
sonrasında CD4+CXCR3+ hücrelere kıyasla daha fazla IL-10 içerdikleri; allerjik astımda
uyarımsız CD4+CCR4+ hücrelerin IFN-g seviyelerinin; allerjik olmayan astımlılarda ise
IL-10 içeriğinin yüksek olduğu saptanmıştır.
Çalışmamız astım patogenezinde T hücrelerinin önemli rolünü göstermekle beraber,
hastalık gelişiminin sadece Tip 1 ve 2 paradigması kullanılarak açıklanamayacağını
ortaya koymaktadır.
Anahtar Kelimeler: Astım, Allerji, Kemokin, Sitokin, Th1/Th2
Bu çalışma, İstanbul Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Birimi tarafından
desteklenmiştir. Proje No: 25996
xv
ABSTRACT
Cevhertas L. Chemokine expression and cytokines on T cells in allergic asthma.
Istanbul University, Institute of Health Science, Institute for Experimental Medicine,
Immunology Department, Msc Thesis. Istanbul. 2015
T cell subgroups are known to play important roles in pathogenesis of allergic and nonallergic asthma. The study group consisted of allergic (n:4, mean age 47,2±8,6) and
nonallergic (n:5, mean age 47,25±10,3) patients with asthma diagnosed according to
GINA criteria (disease duration ≥1 year, FEV1<80%, resistant to moderate-high dose
inhaled steroids/long acting beta agonists; nonsmokers or quitted smoking at least 6
months ago after ≤10 years smoking). In this study the expression of surface markers
including CD4, CD8, CCR3, CCR4, CXCR3 and intracytoplasmic cytokines (IFN-g,
IL-4 and IL-10) of PBMCs in stimulated (PMA/ionomicin) and unstimulated conditions
in both groups were investigated by flow cytometry. Stimulated Th cells increased
their CXCR3+IFN-g, CXCR3+IL-4, CCR3+IFN-g, CCR3+IL-4, CCR3+IL-10, CCR4+IL10 expressions in allergic asthma; but CXCR3+IFN-g, CXCR3+IL-4, CXCR3+IL-10,
CCR3+IFN-g, CCR3+IL-4 and CCR3+IL-10 in non-allergic asthma. Tc cells in allergic
asthma expressed higher CCR3+IFN-g, CCR3+IL-4, CCR3+IL-10, CCR4+ IL-4,
CCR4+IL-10 after stimulation. CD8+CXCR3+IFN-g and CD8+CXCR3+IL-10 increased
in non-allergic asthma under the same stimulation.
In our study T cells tended to elevate their intracellular cytokine levels in all groups
under both conditions. Comparing allergic and non-allergic asthma patients, CCR3+ and
CCR4+ Type 2 Th cells produced higher amounts of IL-10 compared to Type 1
CD4+CXCR3+ cells in allergic asthma. CD4+CCR4+ cells expressed higher IFN-g and
IL-10 without stimulation in allergic and non-allergic asthma respectively.
In summary, our results indicate the role of T cells in pathogenesis of allergic/nonallergic asthma, but also the complexity of disease which can not be explained by using
only Th1/Th2 paradigma.
Key Words: Asthma, Allergy, Chemokine receptors, Cytokine, Th1/Th2
The present work was supported by the Research Fund of Istanbul University. Project
No: 25996
1. GİRİŞ VE AMAÇ
Astım dünya genelinde yaklaşık 300 milyon kişiyi etkileyen hava yollarının
kronik inflamatuvar bir hastalığıdır. Hava yolu inflamasyonunun astım patogenezine
katkısı olduğu bilinmekle beraber, inflamasyon ve hava yolu aşırı duyarlılığı (airway
hyperresponsiveness, AHR) arasındaki ilişki henüz tamamen aydınlatılamamıştır [1].
Astımlı çoğu hasta nefes yolu ile alınan anti-inflamatuvar kortikosteroid
tedavisine yanıt verir. Ancak, hastaların % 5-10’luk bir kısmı çoğunlukla uzun süreli 
agonist ve diğer kontrol nitelikli terapilere ilaveten kortikosteroid tedavisine rağmen
devam eden astım semptomları göstermektedir. Bu hastalar ağır veya terapi-dirençli
astmatikler olarak farklı fenotiplere sahip heterojen bir hasta grubunu oluşturmaktadır
[2].
Hava yolunun yapısal ve inflamatuvar hücrelerin katıldığı kronik inflamasyon ve
bronş aşırı duyarlılığı, astımın temel özelliklerindendir. Astımla ilişkili çok sayıda
medyatör mevcut olup, bu mediyatörler hava yollarındaki karmaşık inflamasyonu
yönetirler. Astım patogenezinde rol alan anahtar medyatörler kemokinler ve sisteinil
lökotrienlerdir [3].
Kemokinler, inflamatuvar hücreleri alevlenen dokuya çekerek immün yanıtı
yönetirler [4]. Pek çok araştırma farklı T hücre alt gruplarının kendilerine özgü kemokin
reseptörleri eksprese ettiklerini göstermiştir [5]. Yardımcı T hücresi 1 (Th1) ve
sitotoksik T hücresi 1 (Tc1) CXCR3 reseptörünü eksprese ederken, Th2 ve Tc2 grubu
CCR3 ve CCR4 moleküllerini seçici olarak eksprese eder. Astmatik hastalar antijene
maruz kaldıklarında CCR4 eksprese eden hücrelerin akciğerde kümeleştiği, geç-faz
allerjik reaksiyonlarda CCR4 ligandlarının arttığı, CCR4’ün antijen-spesifik Th2
hücreleri allerjik inflamasyon bölgesine çektiği yapılan çalışmalarla gösterilmiştir [5].
Astım modeli oluşturulan farelerde, CCR4, CCR8 ve CXCR3 ligandlarının allerjene
maruz bırakıldıktan sonra akciğer ve bronkoalveolar lavaj içinde (BAL)
arttığı
bulunmuştur [6].
T lenfositler CD4 ve CD8 T hücreler olarak iki ana gruba ayrılır. Sitokin
profillerine bakıldığında; CD4 yardımcı T hücreler Th1, Th2, Th9, Th17, Th22, CD8
sitotoksik T hücreler ise Tc1, Tc2 ve Tcreg (Sitotoksik T regülatör hücreler) alt
2
gruplarına ayrılmaktadır [7]. Th1 hücreleri hücresel immün yanıta teşvik ederken; Th2
tipi hücrelerin allerjik yanıtları desteklediği gösterilmiştir. Th1 ve Tc1 hücreleri baskın
olarak interferon gamma (IFN-γ) üretiminden sorumludur. Th2 hücreleri, interlökin
(IL)-4, IL-5, IL-9 ve IL-13 üretiminden sorumlu olup, B hücrelerinden allerjene özgü
immünoglobülin (Ig) E üretimi, eozinofil oluşumu ve birikimi, mukus üretimi ve düz
kas kasılması gibi çeşitli efektör ve düzenleyici mekanizmaları tetikler [8]. İmmün
sistemi baskılayıcı fonksiyonlara sahip IL-10 salgılayan, başka bir T hücre alt grubu
olan T regülatör hücrelerinin (Treg) allerjik yanıtları baskılayabildiği bilinmektedir [8,
9]. Tc1 hücrelerin inflamasyonu hafifletebilme yeteneğine sahip oldukları ve hava yolu
aşırı yanıtını baskıladığı, Tc2 hücrelerin astımda üstün oldukları ve uygunsuz immün
yanıtları arttırabilecekleri kabul edilmiştir. Hem insan hem de hayvan modelleri
üzerindeki çalışmalar, astımlı deneklerin akciğerlerinde Tc2 hücrelerin hastalık
gelişimine neden olabileceği gösterilmiştir [10].
Bu çalışmada esas olarak nonallerjik ve allerjik astımda T hücreleri üzerindeki
olası kemokin reseptör ekspresyon farklılıklarının ve salgıladıkları sitokinler arasındaki
ilişkinin gösterilmesi amaçlanmıştır. Yardımcı ve sitotoksik T hücrelerinde CXCR3,
CCR3 ve CCR4 kemokin reseptör ekspresyonlarının IFN-γ, IL-4 ve IL-10 sitokin
üretimlerine göre değerlendirilmesi ve hastalıkla olan ilişkilerinin ortaya çıkarılması
amaçlanmıştır. Özellikle astmatik süreçte inflamatuvar hücrelerin hava yollarına göçünü
azaltmak üzere çeşitli çalışmalar yürütülmektedir. Astım tedavisi için inflamatuvar
hücre trafiğine aracılık eden kemokin reseptörlerinin hedef alınması araştırılan alternatif
bir yolaktır.
İnsan astım patogenezini anlayabilmek ve tedavi edebilmek amacıyla yürütülen
pek çok çalışmanın hayvan modelinde yapılması ve insan çalışmalarının sayıca azlığı
araştırmanın önemini vurgulamaktadır.
3
2. GENEL BİLGİLER
2.1. Astım
2.1.1. Tanım ve Sınıflandırma
Astım, alt hava yollarının kronik inflamasyonu ile karakterize zaman içinde
ağırlığı ve sıklığı değişen hırıltı/hışıltı (wheezing), öksürük, göğüste baskı hissi ve nefes
darlığı semptomlarının görüldüğü, değişken hava yolu darlığı saptanan heterojen bir
hastalıktır [11]. Astım çok sayıda çevresel faktörün, 100’den fazla minör ve majör
duyarlı genin kombinasyonunun neden olduğu, kişiye özgü özellik gösteren ve bir çok
farklı formu veya fenotipi bulunan bir hastalıktır [11].
Severe Asthma Research Program (SARP) klinik küme analizi (cluster analysis)
yaparak, astım alt fenotiplerini erken başlangıçlı allerjik astım, geç başlangıçlı şiddetli
astım ve kronik obstrüktif akciğer hastalığı niteliklerine sahip şiddetli astım olarak
tanımlamıştır [12].
Yapılan başka bir çalışmada dört farklı astım alt fenotipi tanımlanarak;
hastalığın şiddet yelpazesini minimal/eozinofil baskın sputum inflamasyonlu hafif-orta
allerjik astım ve nötrofil baskın/karışık granülosit inflamasyonlu orta-ağır astım
şeklinde tarif etmektedir [12].
Eozinofilik astım patolojik açıdan taban zarının incelmesi ve farmakolojik
yönden kortikosteroidlere duyarlılık ile ilişkilendirilen farklı bir astım fenotipidir. Buna
karşın; nötrofilik astım, ağır astım hastalarında görülmekle beraber nispeten
kortikosteroid dirençlidir [13].
2.1.2. Belirtiler
Astımın klinik belirtileri ve semptomları hastadan hastaya değişkenlik gösterir
[13]. Kronik hava yolu inflamasyonu ve ilişkili bronş aşırı duyarlılığı özellikle
geceyarısı veya sabaha karşı hırıltı/hışıltılı solunum, nefes darlığı, göğüste sıkışıklık ve
öksürük nöbetlerine yol açar. Bu ataklar genellikle değişen derecede hava yolu
obstrüksiyonu ile birlikte olup, sıklıkla tedaviyle veya kendiliğinden düzelmektedir [3].
4
2.1.3. Sıklık - Epidemiyoloji
Dünya Sağlık Örgütü (The World Health Organization, WHO) dünya çapında
300 milyon kişinin astımdan etkilendiğini öngörmektedir. Ülkemiz için bu rakam
yaklaşık 3,5 milyon kişiye tekabül etmektedir [3]. Astım, çocuklar arasındaki en yaygın
kronik hastalık olup, yılda 250.000 çocuğun ölümünden sorumludur. Görülme sıklığı
dünya genelinde % 7-10 olmasına rağmen, global prevalansında bölgesel eşitsizlik
mevcuttur. Gelişmiş ve batılılaşmış ülkelerde, gelişmekte olan ülkelere göre daha hızlı
bir artış göstermektedir [14]. Zengin toplumlarda daha yaygın olan bu hastalık
neredeyse her 10 çocuktan ve her 12 yetişkinden birini etkiler [15] ve kadınlarda daha
yaygın görülür.
2.1.4. Etiyoloji
Astım ve allerjik hastalıkların etiyolojisi oldukça kompleks olmakla beraber
bileşenleri genetik ve çevresel etmenlerdir [16]. Fizyopatogenezi halen tam olarak
bilinmeyen astımın gelişiminde kişisel faktörler, poligenik geçişli genetik yatkınlık ve
çevresel maruziyetlerin etiyolojide birlikte rol aldığı düşünülmektedir [17].
Hastalığın oluşumunda rol oynadığı düşünülen etmenler şu başlıklar altında
toplanabilir:
2.1.4.1. Kişisel Faktörler
a. Genetik
Anne ve babadan birinin astımlı olması durumunda çocukta astım görülme riski
% 20-30’a yükselmekte, ebeveynlerin her ikisinin de astımlı olması durumunda bu risk
% 60-70’e ulaşmaktadır [3]. Tüm genom ilişkilendirme çalışmaları (Genom Genomewide association studies, GWAS) IL1RL1, TSLP ve IL-33 gibi farklı gen lokuslarındaki
polimorfizmlerin astım ile olan ilişkisini, Avrupa toplumunda yaptıkları başka bir
çalışmada ise; ILR1RL1, WDR36 ve IL-33 genetik varyantlarının eozinofillerin sayısını
ve aynı zamanda astım ve allerjik astım ile bağlantısını göstermiştir [18, 19].
b. Obezite
Obezite astım için bir risk faktörüdür. Astım vücut kitle indeksi >30 kg/m2 olan
bireylerde daha sık gözlenmekte ve kontrolü daha güç olmaktadır [20, 21]. Obezitenin
genetik duyarlılık, hormonal ve nörojenik etkilerine ilave olarak akciğer üzerinden
solunum yolu fonksiyonlarını etkilediği, ayrıca adipoz dokudan IL-6, tümör nekroz
5
faktör (TNF) ve eotaksine ilaveten çeşitli proinflamatuvar sitokinlerin ve leptin gibi
çeşitli medyatörlerin salınımına sebep olduğu gösterilmiştir [3, 22].
c. Cinsiyet
Erkek cinsiyet çocukluk dönemi için önemli bir risk faktörüdür. Yaş ilerledikçe
astım kadınlarda daha sık görülür hale gelmektedir [23].
2.1.4.2. Çevresel Faktörler
Çevre faktörü, ana rahminde başlayarak yaşın ilerlemesine paralel olarak etkisini
sürdürür ve astımın gelişimini, klinik fenotipini ve semptomların şiddetini belirler [16].
a. Allerjenler
Allerjen teması ve çocuklardaki duyarlanma arasındaki ilişkinin allerjene, doz
ve maruziyet dönemine, yaş ve genetik faktörlere bağlı olduğu düşünülmektedir [3].
Hamam böceği, kedi ve köpek tüyü, Aspergillus cinsi küfler, çeşitli ev tozu akarları ve
polenler astım gelişimi için risk oluşturan allerjenlerdir [3, 24].
b. İnfeksiyonlar
Yapılan son araştırmalarda elde edilen veriler astım gelişimi ve alevlenmesinde
solunum yolu virüslerinin rolü olduğunu desteklemektedir. Virüslerin indüklediği
mekanizmanın yetersiz IFN-γ ve IL-10 yanıtı ve artmış IL-4, IL-5 ve IL-10 yanıtı ile
ilişkili olduğu görülmüştür. Özellikle insan rhino virüs (HRV) varlığında duyarlı
bireylerin aşılandıktan sonra astımlarının indüklendiği gözlenmiştir [25]. Ayrıca tek
zincir RNA virüsü olan respiratory syncytial virus (RSV)’ün allerjik astım riskini
arttırdığı uzun dönem süren bir çalışma ile gösterilmiştir. Bebeklik döneminde geçirilen
akut RSV infeksiyonlu 47 çocuk, 18 yaşına kadar takip edilmiş; hastalarda astım
görülüş sıklığının ve allerjene duyarlılığın arttığı gözlemlenmiştir [26].
c. Meslek astımına neden olan faktörler
İzosiyanat gibi yüksek derecede reaktif küçük moleküller, immünojen olarak
bilinen ve hava yolu yanıtını etkileyen platinyum tuzu, nikel tuzu gibi irritanlar ile IgE
yapımını uyaran un, kahve tozu vb. kompleks bitki ve hayvan ürünleri gibi üç yüzden
fazla maddenin mesleksel astım ile ilişkili olduğu bulunmuştur [3].
d. Sigara
6
Sigara kullanımı (aktif) ve/veya dumanına maruz kalma astımlı kişilerin akciğer
fonksiyon
bozukluklarının
şiddetlenmesine,
astım
semptomları
ve
hastalığın
ciddiyetinde artışa yol açmaktadır [23]. Tütün dumanı inhale tedavi ve sistemik
steroidlerin etkilerinin azalmasına ve astım kontrolününün zorlaşmasına neden
olmaktadır [3].
e. Hava kirliliği (İç ve Dış Ortam)
Hava kirliliğine çevresel maruziyet sonucu oksidatif stres oluşur. Hava kirliliği
komponentlerinden gaz ve partiküler maddelere (particulate matters, PMs) ilaveten
krom, demir, mangan, vanadyum ve bakır gibi değişken metallerin de reaktif oksijen
ürünlerinin doğrudan uyarılması ile astımı indüklediği bilinmektedir. Oksidatif stresin
çok sayıda etkileri olduğu ve inflamatuvar hücrelerin aktivasyonu, proinflamatuvar
sitokin ve medyatörlerin salınımı ile ilişkili olduğu gösterilmiştir [27].
Hava kirliliğinin olduğu ortamda büyüyen çocuklarda akciğer gelişiminin kısıtlı
olduğu görülmüştür; fakat bu durumla astım arasında olası net bir ilişki
gösterilememiştir [23]. Diğer yandan, astıma bağlı hastahane başvuruları ve astım
alevlenmeleri ile hava kirliliği düzeylerindeki artışlar arasında ilişki olduğu bir çok
çalışmada gözlenmiştir [3, 23].
f. Diyet
Çocuk ve erişkinlerde sürdürülen epidemiyolojik çalışmalardan bir kaçı besinsel
antioksidan ve lipidlerin, astım ve atopik hastalık parametreleri ile ilişkili olduğunu
bildirmiştir [3, 28].
İnek sütü veya soya proteini içeren hazır mamalar ile beslenen çocuklarda,
emzirilen çocuklara göre daha yüksek oranlarda wheezing ortaya çıktığı bulunmuştur
[29]. Artmış oranlarda hazır gıda ile beslenme, düşük antioksidan (meyve, sebze) alımı,
margarin ve bitkisel yağlarda bulunan artmış n-6 çoklu doymamış yağ asidi
(Polyunsaturated fatty acid, PUFA) ve yetersiz oranlarda n-3 PUFA alımlarının son
zamanlarda astım ve atopik hastalıklarda görülen artışa katkıda bulunduğu ileri
sürülmektedir [28].
2.1.4.3. Epigenetik
Gen ekspresyonlarının epigenetik kontrolü immün sistemin gelişim, farklılaşma
ve regülasyonunda önemlidir. Kalıtsal ya da kazanılmış epigenetik mekanizmalar genler
7
ve çevresel etkileşimin bir sonucudur [17]. Astımın genetik faktörü, doğum öncesi
(prenatal) ve erken dönemde tütün, sigara, endotoksin ve hava kirliliği gibi etmenlere
maruz kalınması ile iç içe geçerek astımı etkiler [16]. DNA metilasyonu, histon
modifikasyonu ve miRNA ile yapılan genetik modifikasyonlar; astım gelişimi ile ilişkili
yolakları, ilaveten T efektör ve regülatör genetik yolaklarındaki transkripsiyonel
aktiviteyi etkileyebilmektedir [16]. Aspirin ile ilişkili allerjik astım ve hırıltı/hışıltılı
ısrarcı astım ile ilişkili genlerde DNA’da hipo- ve hipermetilasyon alanları saptanmıştır
[17].
2.1.5. Tanı Kriterleri
Astımda ortaya çıkan bir çok semptomun (öksürük, dispne, göğüste baskı hissi
ve wheezing) zaman içinde ağırlık ve sıklığının değişmesi çeşitli etkenlerle ortaya
çıkması öyküde tanı koydurucu olarak kabul edilir. Spirometri ile hava yolu darlığının
varlığı ve bunun düzelebilir olduğunun gösterilmesi veya pozitif metakolin provokasyon
testi ile tanı konulmaktadır [25].
Astım klinikte iki sınıf olarak tanımlanmıştır. Çoğu çocuk ve yetişkinlerin
tahminen % 50’si allerjik astımdır. Allerjik astım hastanın duyarlı madde ile
yakınmalarının artması yanında ev tozu akarları, evcil hayvan tüyleri, mantar sporları,
bitki veya ağaç polenleri ve hamam böceği gibi yaygın olarak solunan veya yutularak
vücuda alınan allerjenler olan (lipo)proteinlere karşı pozitif deri-prik testi ve/veya
serum IgE antikorlarının varlığı ile eş zamanlı allerjik duyarlılık ile tanımlanır [15].
Bunun dışında kalan kokular, viral infeksiyonlar, sigara dumanı, psikolojik sebepler gibi
tetikçilerle oluşan diğer grup ise non-allerjik olarak isimlendirilmektedir. Çoğu kronik
inflamatuvar hastalıkta olduğu gibi astımı sadece iki klinik sınıfa ayırmak hastalığı
basitleştirmektir. Herbiri ayrı patolojiye sahip farklı astım fenotipleri, astım endotipleri
(alt grup) olarak sınıflandırılmaktadır.
2.1.6. Klinik Seyir
Hastalık kişiye özgü değişken klinik tablo ve dereceler göstermektedir [3].
Güncel astım tedavisi semptomların kontrol ve ciddiyeti temel alınarak uygulanan,
inhale kortikosteroid içeren yaklaşımlardır [25]. Çoğu hasta inhalasyon terapiden fayda
sağlarken, daha şiddetli astıma sahip hastalar tedaviye bağlı kalmayı başaramayarak
kontrol edilemez olgular olarak kalır [30]. İnflamasyonun ve bronş lümeninin
daralmasının klinik sonucu olan hava akışı darlığı, özellikle nötrofil baskın olanlara
8
nazaran
eozinofil
baskın
astım
fenotipindeki
hastalarda
glukokortikoidler
kullanıldığında genellikle geriye döner [25]. Kısa astım atakları genellikle β2
agonistlerin inhalasyonuna iyi tepki verirken, ısrarcı astım kortikosteroid inhalasyonuna
yanıt verir. Daha şiddetli veya tedaviye cevap vermeyen durumlarda, ek olarak
lökotrien-antagonistleri ve antikolinerjik ilaçlar kullanılabilmektedir [30].
Kortikosteroidler, hücre membranını geçerek sitoplazmadaki glukokortikoid
reseptörüne bağlanarak değişik yolakları tetiklemektedir. Kortikosteroidler nükleer
faktör-kappa B (nuclear factor-kappa B, NF-κB) ve aktivatör protein-1 (activator
protein-1, AP-1) gibi proinflamatuvar proteinlerin transkripsiyonunu baskılayarak veya
proinflamatuvar genleri içeren MAPK yolağının inhibisyonunu sağlamak üzere
mitojenle aktive protein kinaz fosfataz-1 (mitogen-activated protein kinase phosphatase1, MKP-1) gibi genlerin transkripsiyonunu sağlayarak etki gösterir [25]. Ancak;
sitokinlerin immün aracılı disregülasyonu ya da ilaçların immün aracılı glukokortikoid
reseptörüne bağlanmasında veya nükleusa girmesinde bir defekt mevcut ise astımın
tedavisi zorlaşmaktadır [31].
Günlük dozu 20 mg prednizole eşdeğer olmak üzere bir hafta uygulanan oral
steroid tedavisine rağmen FEV1’in % 15 yükselmemesi, klinikte steroide dirençli astım
olarak tanımlanır. Astmatik hastalar % 0.01 oranında bu alt sınıfa dahildir.
2.1.6.1. Allerjik Astım
Bu hastalarının çoğunluğunda atopi mevcuttur. Allerjik astımın ayırıcı özelliği;
eozinofillerin bronşiyal mukozaya infiltrasyonu ve devamlı olmasıdır [13]. Bununla
birlikte hastalar, yüksek düzeylerde bulunan allerjen spesifik IgE yüksekliği ile
ilişkilendirilmektedir [32]. Sayıca artmış eozinofiller kanda, havayolu mukozasında ve
bronkoalveolar lavaj sıvısında bulunabilmektedir [13].
2.1.6.2. Non-Allerjik Astım
Allerjik olmayan astım çoğunlukla hayatın ilerleyen döneminde gelişir. Serumda
allerjenlere spesifik IgE reaksiyonu görülmez. Deri testleri negatiftir [15]. Astımın
allerjik olmayan biçimi; sigara dumanı, dizel partikülleri, ozon gibi hava kirliliğine
neden olan maddeler veya viral infeksiyonlar, aspirin, egzersiz, obezite veya stres gibi
faktörler tarafından nöral mekanizmaların C lifleri ve non-adrenerjik non-kolinerjik
mekanizmaların tetiklenmesi ile başlar, bunlar da immün sistem hücrelerini tetikleyerek
9
Th2 baskın veya baskın olmayan eozinofilik veya nötrofilik veya hücreden fakir
inflamasyona neden olur [11].
2.2. Astım ve Bağışıklık Sistemi İlişkisi
Oldukça heterojen bir hastalık olan astımın farklı patojenik mekanizmalara sahip
birçok klinik formu veya fenotipi bulunmaktadır. Bu mekanizmalar allerjik yolaklar
(edinsel immünite) ve allerjene maruziyet, viral infeksiyon, oksidatif stres ile beraber
eozinofiller, bazofiller, Tip 2 yardımcı T hücreler (Th2), dendritik hücreler (DH),
nötrofiller, doğal öldürücü T hücreler (NKT), doğal lenfoid hücreler (ILCs), epitelyal
hücreler, Th17 hücreler ve makrofajları içeren geniş bir hücre grubu tarafından
indüklenen yolaklardır [11].
Allerjik
astımlı
hastaların
hava
yollarına,
hücre
yüzeylerinde
FcεRI
reseptörlerine bağlı allerjen spesifik IgE bulunan mast hücreleri infiltre olur. Bu
reseptörlerin allerjen tarafından birbirlerine çapraz bağlanması, mast hücrelerinin
degranülasyonuna ve inflamatuvar medyatörler olan histamin, lipid medyatörler,
enzimler, sitokin ve büyüme faktörlerinin salınmasına neden olur [32].
Aeroallerjen ve virüslere beraber maruz kalma, inflamatuvar yolakları tetikler.
IFN ile ilişkili ilk sinyaller, infekte olmuş hava yolu mukozasında erken dönemde
oluşturularak, astımda inflamasyonu şiddetlendirmektedir. Bu sinyaller yerleşik
dendritik hücreler üzerindeki FcεRI ekspresyonunu arttırmaktadır. Ayrıca kemik iliğine
Th2 ve IFN sinyallerinin beraber translokasyonu, akciğerde yerleşik alternatif olarak
aktive olmuş doku tamiri ve yeniden düzenlenmeyle ilişkili makrofajların üretimiyle
sonuçlanmaktadır [33].
2.3. T hücreler
Edinsel immünitenin hücreleri olan lenfositler, vücutta klonal ekspresyona sahip
dağılmış antijen reseptörleri bulunan ve her biri spesifik, farklı antijenik etmeni tanıyan
tek hücre grubudur. Sağlıklı bir erişkinde toplam lenfosit sayısı yaklaşık 5 × 1011’dir.
Bunların % 2’si kanda, % 10’u kemik iliği içerisinde, % 15’i gastrointestinal ve
solunum yolları içerisindeki mukozal lenfoid dokularda, % 65’i ise lenfoid organlarda
(çoğunlukla lenf düğümleri ve dalak) bulunur [34].
En büyük T hücre alt grupları αβ antijen reseptörünü eksprese eden yardımcı
CD4+ T lenfositleri ve CD8+ sitotoksik T lenfositleridir. CD4+ regülatör T hücreler ise,
10
αβ reseptör eksprese eden üçüncü özgün T hücre alt grubudur. CD4+ yardımcı T
lenfositler CD3+, CD4+, CD8- fenotipik işaretleyicilere sahip olup, insanda kanda, lenf
düğümünde, hem de dalaktaki tüm lenfositlerin yarısı oranında bulunurken, CD3+,
CD8+, CD4- özelliğindeki sitotoksik T lenfositler bu organlarda sırasıyla % 20-25, %
15-20 ve % 10-15 oranında görülmektedir. En yaygın fenotipi CD3+CD4+CD25+ olan
ancak farklı fenotipleri mevcut olan Treg’ler kanda nadir bulunurken, lenf
düğümlerinde ve dalakta % 10 oranında bulunmaktadır.
Hücresel bağışıklığın aracısı olan T lenfositlerin öncülleri, kemik iliğinden
kaynaklanır, timusa göç eder ve olgunlaşır. Antijenle karşılaşmayan naif lenfositler 1-3
ay içerisinde ölmektedir [34].
Antijenin uyarması ile aktive olan naif T hücreleri, efektör hale geçerek ikincil
lenf dokularından lenf direnajı vasıtasıyla çıkarak sistemik kana katılır. Dolaşımdaki
efektör T hücrelerin, periferik dokulardan infeksiyonlu bölgelere göçü; selektin-,
integrin- ve kemokin bağımlı çok basamaklı bir süreçtir [34].
Farklılaşmış efektör hücre alt gruplarını; ürettikleri sitokinler, eksprese ettikleri
transkripsiyonel faktörler ve sitokin gen lokuslarındaki epigenetik değişiklikler
belirlemektedir [35]. Naif CD4+ T hücreler çevresel sitokinler eşliğinde dendritik
hücreler tarafından antijen-spesifik uyarımdan sonra Th1, Th2, Th9, Th17, Th22,
foliküler yardımcı T (Tfh) ve Treg’lere farklılaşmaktadır [36]. Bu CD4+ T hücre alt
grupları farklı sitokinler üreterek patojenlerin temizlenmesini, otoimmünitenin
kontrolünü, immün dengenin kurulmasını ve tümörlere karşı immün yanıt oluşumunu
sağlayarak edinsel immüniteye katkıda bulunmaktadır [36, 37].
CD8+ T hücre farklılaşma süreci antijenin dozu, eş-uyaran molekül ve sitokinler
tarafından yönetilmektedir. Bu çevresel başlatıcıların transkripsiyon faktörlerini
uyarması ile CD8+ T hücreler Tc1, Tc2, Tc9, Tc17 veya CD8+ regülatör T hücreler
olmak üzere farklılaşmaktadır [38]. CD4+ Th1 farklılaşmasına benzer olarak IFN-γ
üreten ve ana kemokin reseptörleri CCR5 ve CXCR3 olan hücreler Tip 1 sitotoksik T
(Tc1) hücreleri olarak isimlendirilmektedir. Th2 hücrelere benzer şekilde IL-4, IL-5 ve
IL-13 gibi Tip 2 sitokinleri salgılayan ve CCR4 eksprese eden CD8+ T hücreler ise Tip 2
sitotoksik T hücreleri (Tc2) olarak adlandırılmaktadır [39, 40]. Son bahsedilen gruptaki
hücreler Tc1 hücrelerle kıyaslandıklarında azalmış sitotoksik aktivite gösterirler [40].
Th1 aracılı yanıtı bastıran Tc9 hücreler, allerjik süreçte Th2 ilişkili immüniteyi
11
arttırmakta ve Th9 hücrelerle benzer olarak IL-9 bağımlı güçlü bir antitümör yanıt
oluşturmaktadır [38]. Farklı bir alt grup olarak; CCR6 ve/veya CD161 eksprese eden ve
IL-17 salgılayan Tc17 hücreler proinflamatuvar özelliklere sahiptir. [39]. IL-10 üreten
CD8+ T hücrelerin ise regülatör fonksiyonlara sahip oldukları yapılan çalışmalarla
tanımlanmıştır [39]. Sitotoksik T lenfositlerin proliferasyonu, farklılaşması ve
fonksiyonel hale geçmesi; bir çok hücre içi patojen, virüs ve bakterilere karşı bağışıklığı
sağlamaktadır [36]. Bu hücreler aynı zamanda otoimmünite ve allerjik hastalıklar gibi
patolojik süreçlerin düzenlenmesine katkıda bulunmaktadır [38].
2.3.1. T hücre Astım İlişkisi
Son zamanlarda yapılan araştırmalar klinik astımın Th1, Th2, Th9 ve Th17
hücrelerin katıldığı oldukça karışık bir T yardımcı hücre profiline sahip olduğunu
göstermiştir [41, 42].
Hayvan modellerinde yapılan çalışmalar sonucu CD8+ T hücrelerin, astımın
karakteristik özellikleri olan AHR ve allerjik akciğer inflamasyonunda kritik rol
oynadıklarını, CD4+ T hücrelere ilaveten CD8+ T hücrelerin de Th2 sitokinleri
yapabildikleri, aynı zamanda allerjik inflamasyon ve hava yolu duyarlılığı içinde de rol
oynadıkları gösterilmiştir [43, 44]. Akciğerde bulunan CD8+ T hücre sayılarının, CD4+
T hücrelerle benzer oldukları ve son zamanlarda bu hücrelerin astıma bağlı ölümlerde
rol oynadıkları kanıtlanmıştır [43].
2.4. Sitokinler ve Astım İlişkisi
Sitokinler hücrelerin sinyalizasyonunda önemli immün modülatör proteinlerdir.
Sitokinler, reseptör alt ünitelerinin dimerizasyonu aracılığı ile hücre içi JAK/STAT
aktivasyonunu başlatarak hücrelerin ana fonksiyonları olan farklılaşma, çoğalma ve
apoptozunu düzenlemektedir [45]. Sitokinler immün sistem hücrelerinden makrofaj, B
ve T lenfositleri ve bunlara ilaveten pek çok hücre tipi tarafından üretilip,
salgılanmaktadır [9].
Sitokinlerin esas görevi allerjen, virüs ve çevresel kirleticilere karşı oluşan
inflamatuvar, immün ve rejeneratif yanıtın kontrolüdür [46]. Hücreler arası
etkileşimlerde kritik rol oynayan sitokinler; allerjik, inflamatuvar ve otoimmün
hastalıkların immünolojik mekanizmalarını yönetirler.
12
Astımın koordinasyonu geniş bir sitokin ağı tarafından sağlanmaktadır [9]. Th2
hücreler tarafından üretilen proinflamatuvar sitokinlerin, kronik inflamasyonda IgE
disregülasyonu (IL-4, IL-13), eozinofili (IL-3, IL-5), mast hücre proliferasyonu (IL-3,
IL-9), IgE izotip dönüşümü (IL-4, IL-13), mukus hipersekresyonu ve hava yolu aşırı
duyarlılığının regülasyonu olmak üzere önemli rolleri bulunur. IL-10 proinflamatuvar
sitokin sentezini engelleyen bir diğer sitokindir [47].
2.4.1. İnterlökin-4 (IL-4)
IL-4, klasik 4 adet α-heliks demetine sahip bir sitokin olup, birincil bağlayıcı
zinciri IL-4Rα’dır [45]. Tip 1 hematopoietin süper ailesine ait 17kDa’luk monomerik
bir glikoprotein olmakla beraber Th2 hücre, NKT hücre, mast hücre ve bazofiller
tarafından salgılanmaktadır [48].
IL-4, Th2 hücre gelişimsel belirleyicisi, T/B hücre büyüme faktörü, IgE/IgG1
izotip dönüşümü tetikleyicisi ve kas hücre kasılması indükleyicisi olmak üzere çeşitli
fonksiyonlara sahiptir [49].
IL-4 astım patofizyolojisine, Th2 hücre farklılaşması ve genişlemesi, B
hücrelerden IgE sentezi için izotip dönüşümü, eozinofillerin katılımı ile mast hücrelerin
gelişimini indükleyerek katkıda bulunur. IL-4 ayrıca kollajen ve fibronektin yapımını
arttırarak hava yolu yeniden düzenlenmesinde de görev almaktadır [50].
2.4.2. Interlökin 10 (IL-10)
IL-10 bir homodimer oluşturarak IL-10R1 ve IL-10R2 reseptör kompleksi
üzerinden biyolojik fonksiyonunu gerçekleştiren bir sitokindir [51]. Uzun bir süre
boyunca güçlü ve geniş spektrumlu antiinflamatuvar olarak bilinen IL-10’nun çeşitli
infeksiyonlarda, inflamasyon ve kanserde rol oynadığı çeşitli araştırmalar sayesinde
belirlenmiştir [52].
Tip 2 sitokinlerden biri olan IL-10, IL-19, IL-20, IL-22, IL-24, IL-26, IL-28 ve
IL-29 gibi sitokinleri içeren ailenin kurucu üyesidir [51]. Başlıca T hücre IL-10
kaynakları Th2 hücreler, Tr1 olarak tanımlanan regülatör T hücre alt grubu, Th1 ve
Th17 hücrelerdir. Aynı zamanda CD8+ T hücreler de IL-10 üretmektedir. Monositler,
uygun uyarımı alan makrofajlar ile DH’lerin bazı alt grupları da diğer önemli IL-10
üreten hücrelerdir [52]. B hücreler ile eozinofil ve mast hücreleri de potansiyel IL-10
13
üreten hücreler arasında bulunmaktadır [53, 54]. Keratinositler, epitelyal hücreler ve
hatta tümör hücreleri immün olmayan (non-immün) IL-10 kaynaklarındandır [55, 56].
Güncel çalışmalar, Th1 ve Th17 hücrelerin de IL-10 üretebilme yetenekleri
olduğunu, hatta infeksiyöz hastalıklar sırasında önemli bir IL-10 kaynağı olabildiklerini
ortaya koymuştur [57, 58]. Ancak; bu homeostatik mekanizmanın kontrolsüz T hücre
aktivasyonunu engellemek adına oluşabileceği kuvvetle muhtemeldir [52].
Birçok biyoaktivitesi mevcut olan IL-10 antijen sunumunda kuvvetli bir
inhibitördür. MHC sınıf II (major histocompatibility complex class II) ekspresyonu ile
birlikte eş-uyaran moleküller olan CD80 ve CD86 ekspresyon artışını inhibe etmektedir.
Birçok immüno-inhibitör özellikleri bulunan IL-10 sitokininin; antijen sunan hücreler
üzerine olan etkileri Th1 ilişkili sitokinler olan IL-2 ve IFN-γ ile Th2 ilişkili IL-4 ve IL5’in yapımının engellenmesi şeklinde özetlenebilmektedir [52].
İmmün yanıtları baskılamasının yanı sıra IL-10, bir büyüme faktörü gibi
davranarak, CD8+ T hücrelerin belirli alt gruplarının sayıca çoğalmalarını uyarmaktadır
[52]. Eş-uyaran olarak B hücre aktivasyonu ve izotip değişimine katkıda bulunan IL-10,
aynı zamanda NK hücrelerin çoğalması ve sitokin yapımında yardımcı uyaran olarak
görev almaktadır [59].
Yapılan çalışmalarda sağlıklı ve astmatik olgularda BAL sıvısında IL-10
konsantrasyonları hastalarda daha düşük bulunmuştur [47]. Astımda IL-10 yokluğu,
astmatik hava yolu inflamasyonuna katkı sağlayan IL-6, IL-5, IL-4, TNF-α, GM-CSF
ve IL-1 gibi proinflamatuvar sitokinlerin devamlı olarak salgılanmasına neden
olmaktadır [47].
2.4.3. İnterferon- (IFN-γ)
Tip II interferonların temsilcisi olan IFN-γ, doğal ve hücre aracılı immün
yanıtları düzenleyen önemli bir sitokindir ve homodimer bir yapıya sahiptir [60]. Bu
sitokinin aktivitesi IFN-γR1 ve IFN-γR2 genlerinden oluşan 4 adet zincir demetinden
meydana gelen reseptör kompleksine bağlanması sonucu
ortaya çıkmaktadır [60].
Araştırmalar, IFN-γ’nın immün modülasyon, anti-viral yanıt ve anti-tümoral aktivite ile
ilişkili genlerin transkripsiyonunu arttırdığını göstermiştir [61].
IFN-γ hem doğal hem de hücre-aracılı immün yanıtların düzenlenmesinde görev
alan ana sitokindir [60]. İnsan ve farelerde yapılan kapsamlı çalışmalar, IFN-γ’nın
14
çoğunlukla NK hücreler, CD8+ T hücreler ve Th1 hücreleri içeren T lenfositler
tarafından salındığını göstermiştir [62]. B hücrelerin, NKT hücrelerin ve profesyonel
ASH’lerin de IFN-γ üretebildikleri bildirilmiştir [60]. Mikroçevreye göre IFN-γ’nın
pro- veya antiinflamatuvar sitokin olmak üzere çift rolü bulunmaktadır [61]. IFN-γ;
makrofajların sitotoksik ve fagositik aktivitelerini, ASH’lerde bulunan MHC sınıf I ve
sınıf II moleküllerinin yüzey ekspresyonlarını arttırmaktadır [61]. Antiviral aktivitesine
ilaveten IFN-γ işlevleri arasında; antijen sunumunun arttırılması, hücre büyümesi ve
apoptozu, lökosit trafiği ve lökosit endotel etkileşimi, B hücrelerin antikor izotip
dönüşümü [62], Th2 hücre gelişiminin inhibisyonu ve naif CD4+ T lenfositlerinin Th1
yardımcı alt gruba farklılaşmaları [61], CD4+ T hücrelerin Foxp3 ekspresyonuna teşvik
edilmesi ve graft toleransı gibi immün düzenleyici mekanizmalar sayılabilmektedir
[62].
Astımlı çocuklarda IFN-γ’nın serumda sağlıklı kontrollere göre düşük
bulunması
ve
erişkin
astmatiklerde
serum
IFN-γ
seviyelerinin
akciğer
fonksiyonlarındaki düşüş ile olan ilişkisi göz önünde bulundurulduğunda, IFN-γ’nın
astım patogenezine katkı sağlayabilecek bir sitokin olabileceği düşünülmektedir [63].
2.5. Kemokinler ve Astım İlişkisi
Kemokinler düşük molekül ağırlıklı bir protein ailesinin üyesidir. Esas rolü
homeostaz ve inflamasyon sırasında lökosit trafiğini kontrol etmek olan kemokinler,
inflamatuvar hücreleri alevlenen dokuya çekerek immün yanıtı yönetmektedir [4, 64].
Bilinen 50 kemokin ve 20 kemokin reseptörü mevcuttur. N-terminal uçtaki sistein
kalıntılarının dizilimlerine göre C, CC, CXC ve CX3C şeklinde sınıflandırılmaktadır
[65].
Çoğu kemokin reseptörü birçok kemokin ligandına sahiptir [66]. Astım
hastalarının hava yollarına infiltre olan lenfosit ve eozinofil popülasyonlarının farklı
kemokin reseptör ekspresyonlarının astım patogenezini önemli derecede etkilemesi
nedeniyle [44], bu moleküller inflamatuvar hücrelerin hava yollarına akımını azaltmak
amacıyla astım tedavisinde yeni hedefler haline gelmiştir.
15
2.5.1. CCR3
Bütün kemokin reseptörleri gibi bir hücre yüzey G-protein-eşlikçi reseptörü
(GCPR) olan CCR3, A sınıfının bir alt sınıfı olan rodopsin-benzeri reseptör ailesinin bir
üyesidir [65]. Yaklaşık 350 a.a uzunluğundaki reseptör, 7 transmembran burgudan
oluşmakta ve 7 hidrofobik bölge içermektedir [65]. CCR3; eozinofil, Th2 lenfositler,
bazofil ve mast hücrelerinin yüzeylerinde eksprese edilmektedir [67]. Bu hücrelerin
üzerindeki CCR3 ekspresyonu kalıcı veya geçici olarak sitokinler tarafından
indüklenebilmektedir [65].
Allerjik hava yolu inflamasyonu oluşturulmuş hayvan modellerinde CCR3
ligandlarının
(CCL11/eotaksin
ve
CCL24)
allerjik
reaksiyonlarda
yükseldiği
gösterilmiştir [65, 68]. Bir kemokin reseptörü olan CCR3’ün astım, atopik dermatit ve
allerjik rinit gibi allerjik hastalıkların gelişmesinde rol oynadığı düşünülmektedir.
2.5.2. CCR4
Tercihen Th2 hücrelerin üzerinde eksprese olan CC kemokin reseptörü 4
(CCR4) ve ligandları CCL17 ve CCL22/MDC (önceden bilinen adlarıyla: makrofaj
kaynaklı kemokin, timus ve aktivasyonla düzenlenen kemokin) astımda, bronşiyal
dokulara T hücre kemotaksisinde önemli rol oynamaktadır [69].
Yüksek düzeyde CCR4 ekspresyonu ilk olarak timusta ve periferik mononükleer
hücrelerde (PMNH) gösterilmiştir. Sonraki çalışmalar CCR4’ün Th2 hücreler, Treg’ler
ve mast hücreler
tarafından da eksprese edildiğini ve allerjik hastalıklarda rol
oynadığını göstermiştir [70, 71]. In vivo koşullarda allerjik inflamasyon gelişiminde
CCR4’ün katkısı CCR4 veya CCR4 ligandlarını nötralize eden antikorlar veya CCR4
geni bozulmuş farede çalışılmıştır [5, 6]. Yapılan çalışmalar allerjik astım olgularında
antijene maruziyet sonrasında, CCR4 eksprese eden T hücrelerin akciğerde
toplandıklarını göstermiştir [72, 73]. Değişik araştırmalarda astmatik akciğerlerde geç
faz reaksiyonları sırasında CCR4 ligandlarının yükseldiği görülmüştür [73, 74].
Astımlı bireylerde yapılan araştırmalar hafif, steroid kullanmayan astım
olgularında CCR4+ hücre sayılarının ve CCR4 ligandlarının ekspresyon seviyelerinin
allerjene maruziyetten sonra arttığını göstermiştir [69].
16
2.5.3. CXCR3
Özellikle naif T hücrelerin aktivasyonu sonrası yüzeylerinde süratle indüklenen
inflamatuvar bir kemokin reseptörüdür. CXCR3, indüklenebilen IFN-γ ligandları
CXCL9, CXCL10 ve CXCL11 tarafından aktive olmaktadır [66]. Bu ligandların hem
immün yanıtın başlatılmasını hem de periferik T hücre trafiğini indükleyebildikleri
gösterilmiştir [75].
Th2 tip hücreler başta olmak üzere, efektör CD8+ T hücreler ve NK, NKT gibi
doğal lenfositler üzerinde ekspresyon düzeyi yüksek saptanmıştır [66]. Bunlara ilaveten
CXCR3 eksprese eden plazmasitoid DH’ler ve B hücre alt gruplarının da lenf düğümü
içerisindeki göçlerde rol oynadığı düşünülmektedir [66, 76].
Naif T hücre yüzeyinde bulunan CXCR3’ün, DH’lerin indüklediği T hücre
aktivasyonunu takiben, ekspresyonunun süratle yükseldiği gözlenmiştir [77]. CXCR3
ligandlarının geçici veya doku spesifik ekspresyon farklılıkları, CXCR3 eksprese eden
T
hücrelerin
lenfoid
kompartımandan,
yangılı
periferik
dokuya
hareketini
yönetmektedir.
CXCR3-bağımlı inflamatuvar döngünün, sitotoksik T lenfositlerin periferik
dokuya katılımlarına ilaveten oluşumlarının artmasında da olası rolü olduğu
düşünülmektedir [66]. In vivo bir çalışmada CXCR3 yoksun (KO) farelerin OVA
uyarımı sonrası CD4+ T hücrelerinin akciğere infiltrasyonunda azalma gösterilmiştir
[44]. Allerjik astma hastalarında yapılan başka bir çalışmada ise; alınan BAL
örneklerinde 24 saatlik allerjen uyarımı sonrasında CD4+ ve CD8+ T hücrelerin
kemoatraktan
reseptör
profillerine
bakılmış,
hücrelerin
CCR6
ve
CXCR3
ekspresyonlarının azaldığı, diğer kemokinlerde ise önemli bir değişim olmadığı
gösterilmiştir [78].
17
3. GEREÇ VE YÖNTEM
3.1. Olgular
Çalışmaya dahil edilen hasta grupları İstanbul Üniversitesi, Cerrahpaşa Tıp
Fakültesi Göğüs Hastalıkları Anabilim Dalı tarafından Aralık 2013-Eylül 2014 tarihleri
arasında takip edilen allerjik (n: 4; 1 erkek - 3 kadın, ortalama yaş 47,2±8,6) ve
nonallerjik (n: 5; 1 erkek - 4 kadın, ortalama yaş 47,25±10,3) astım hastalarından
oluşturulmuştur. Allerjik astım grubuna ait heparinize periferik kan örnekleri, İstanbul
Üniversitesi Cerrahpaşa Tıp Fakültesi, Göğüs Hastalıkları Anabilim Dalı'ndan temin
edilmiş ve çalışmanın deneysel aşamaları İstanbul Üniversitesi, Deneysel Tıp Araştırma
Enstitüsü, İmmünoloji Anabilim Dalı Laboratuvarı’nda gerçekleştirilmiştir.
3.1.1. Gönüllülerin Araştırmaya Dahil Edilme Kriterleri
a. 18-65 yaş aralığındaki GINA 2014 Rehberi ve TTD Astım Tanı ve Tedavi
Rehberine uygun olarak en az bir yıl önce astım tanısı almış olmak,
b. Orta, yüksek doz inhale steroid ve uzun etkili beta agonist tedavisine rağmen
(basamak 4) kontrolün sağlanamamış olması (astım kontrol testi < 20),
c. FEV1 değerinin <%80 olması,
d. Sigara içmemiş veya 10 yıl altında içip en az 6 ay önce bırakmış olmak.
3.1.2. Gönüllülerin Araştırmaya Dahil Edilmeme Kriterleri
a. Komorbit hastalıklarına veya astıma bağlı olarak son bir ay içerisinde sistemik
steroid veya immünosüpresif kullanımı,
b. Komorbit hastalıklarda kontrolsüzlük,
c. Diyabet veya immün profili etkileyebilecek başka bir hastalık veya hamilelik
durumunun bulunması,
d. Önceden bilinen bir kanser hikayesi olması,
e. Son bir ay içerisinde operasyon geçirilmesi.
3.1.3. Non - allerjik Astım
Non-allerjik astım, allerji ile beraber gözlenmeyen astım fenotipidir. Bu
hastaların sputum örneklerinde nötrofilik, eozinofilik veya az sayıda inflamatuvar hücre
içeren alt tipleri mevcuttur. Non-allerjik astım olguları “Bilgilendirilmiş Gönüllü Olur”
18
formlarını imzalamalarının ardından çalışmaya dahil edilmiştir (n: 5; 1 erkek - 4 kadın).
Bu hastalarda deri prik testleri negatif, inhale kortikosteroidlere tedavi yanıtı ise
allerjiklere nazaran düşüktür.
3.1.4. Allerjik Astım
Allerjik astım, en kolay tanı alan astım fenotipidir. Sıklıkla çocukluk çağında
ortaya çıkan allerjik astım olgularında geçmiş veya ailesel allerjik hastalık (egzema,
allerjik rinit, gıda veya ilaç allerjisi) hikayesi mevcuttur. Tedavi öncesi yapılan sputum
testlerinde eozinofilik bir hava yolu inflamasyonu gözlenmektedir. Bu hastalar inhale
kortikosteroid tedavisine sıklıkla iyi yanıt vermektedir. Çalışmamıza alınan ve deri prik
testleri pozitif olan allerjik astımlı bireylere “Bilgilendirilmiş Gönüllü Olur” formları
imzalatılmıştır (n: 4; 1 erkek - 3 kadın).
3.2. Deneylerde Kullanılan Kimyasallar
3.2.1. PBS (Fosfat Tampon Tuz Çözeltisi)
PBS (Sigma-Aldrich, USA), hücre canlılığının korunması için önemli olan stabil
bir fizyolojik Ph değeri sağlar. Kan ile izotonik bir çözelti (Ph=7,4) olma özelliğinden
dolayı, hücre süspansiyonu hazırlama ve santrifüj ile hücre yıkamada kullanılmaktadır.
3.2.2. RPMI-1640 (Roswell Park Memorial Institute-1640)
RPMI medyumu doku ve hücre kültüründe özellikle insan lenfoid hücrelerin
serumsuz ortamda büyümesini sağlamak amacıyla üretilmiştir. İlaveten yüksek miktarda
fosfat ve atmosferde bulunan % 5’lik karbondioksit seviyesinde kullanılmak üzere
formüle edilmiştir. Özellikle T/B lenfositler, kemik iliği hücreleri ve hibridoma
hücreleri gibi pek çok hücrenin ekimi için besi yeri malzemesi olarak kullanılan RPMI1640 (Gibco, Life Technologies, UK) antibiyotik, antimikotik ve zenginleştirme
maddelerinin eklenmesiyle in vitro deneyler için hazır hale getirilmektedir.
Zenginleştirmede kullanılan malzemeler:
- % 10 FBS (Fetal sığır serumu - Gibco, UK)
- % 1 L-glutamin (Gibco, UK)
- % 1 Streptomisin ve penisilin (Gibco, UK)
19
3.2.3. Fiksasyon ve Permeabilizasyon Kiti
Hücre içi Fiksasyon & Permeabilizasyon Tampon seti (eBioscience, Inc., San
Diego, USA) hücre içi sitoplazmik proteinleri boyama ve akan hücre ölçer analizi için
tasarlanmış olup, özellikle florokrom işaretli spesifik olmayan boyanmanın azaltılması
ve floresan sinyal oranlarının arttırılması için formüle edilmiştir. 1x konsantrasyondaki
125 ml’lik fiksasyon çözeltisi % 4 formaldehit içermekte olup, hücre yüzeyini
sabitlemek
amacıyla
kullanılmaktadır.
Permeabilizasyon
çözeltisi
ise
10x
konsantrasyonda olup, kullanılmadan önce oda ısısına getirilip 1:10 oranında distile
suyla sulandırılması
gerekmektedir. 1x permeabilizasyon çözeltisi % 0,1 oranında
saponin ve % 0,09 oranında sodyum azid içermektedir. İlk aşamada canlı hücreler
fiksasyon tampon ile proteinler çapraz bağlanarak fikse edilir. İkinci aşamada kullanılan
permeabilizasyon tampon ise membran içerisinde delikler oluşturarak antikorların etkin
olarak hücre içine girmesini sağlar.
3.3. Hücre Yüzey Molekül Ekspresyonlarının Belirlenmesi
Heparinli tüp içerisinde gönüllülerden alınan 15 ml periferik venöz kan
örneklerinde hücre yüzey molekül ekspresyonlarını saptamak amacıyla; anti-CD4 FITC,
anti-CD8a PE-Cy5, anti-CD183 APC, anti-CD193 APC, anti-CD194 APC monoklonal
antikorlar ve izotip kontrol olarak IgG1/IgG2a FITC/PE ve PE-cy5/APC ikili boyaları
kullanılarak boyama yapılmıştır (Tablo 3-1).
20
Monoklonal Antikor
Renk
Firma
FITC/PE
IgG1/IgG2a
BD/Simultest, San Jose, CA
PE-Cy5/APC
Diaclone, Besançon Cedex,
CD4
FITC
CD8a
PE-Cy5
BioLegend, San Diego, CA
CD183
APC
eBioscience, San Diego, CA
CD193
APC
eBioscience, San Diego, CA
CD194
APC
Biolegend, San Diego, CA
IFN-γ
PE
IL-4
PE
IL-10
PE
France
Diaclone, Besançon Cedex,
France
Diaclone, Besançon Cedex,
France
Diaclone, Besançon Cedex,
France
Tablo 3-1: Hücre yüzey boyamada kullanılan monoklonal antikorlar
3.4. Periferik Kan Mononükleer Hücre (PKMH) Eldesi
Laminar akım altında heparinli tüp içerisine alınan 15 ml periferik venöz kan
örneği, 50 mL’lik steril falcon tüpü içerisine aktarıldıktan sonra, 1:1 oranında PBS ile
sulandırıldı ve steril pastör pipeti ile üç-dört kez (çekip-verme) karıştırıldı. Ayrı bir 50
ml’lik falcon tüpüne alınan kan örneği ile aynı hacimli oda sıcaklığındaki steril Biocoll
(Biochrom AG, Berlin, Germany - yoğunluk: 1,077 gr/ml) üzerine, sulandırılan kan
pastör pipeti vasıtasıyla tüpün yan duvarından yavaşça sızdırılarak bırakıldı, ficoll ile
örneğin karışmamasına özen gösterildi.
21
Falcon tüpleri içindeki örneklerin 2000 devirde, 20 dakika ve +20°C'de santrifüj
edilmesinin ardından, katmanlara ayrılmış olan kan-PBS karışımının en üstte kalan
plazma kısmı pastör pipeti ile uzaklaştırıldıktan sonra PKMH'lerin bulunduğu, ficoll ile
plazma arasında ince bir tabaka şeklinde gözüken beyaz bulutumsu katman, en alta
çöken eritrositlere dikkat edilerek pastör pipeti kullanılarak 15 ml'lik konik tabanlı steril
falcon tüpüne toplandı. Üzerine 15 ml'ye tamamlanacak şekilde steril PBS çözeltisi
eklendikten sonra, 2000 devirde, 10 dakika ve +8°C'de santrifüj edildi. Santrifüj sonrası
üst sıvının uzaklaştırılması ile elde edilen PKMH'lerin üzerine içinde kalmış olası
eritrositleri lize etmek amacıyla 500-1000 µL distile su eklendi, 1000’lik mikropipet ile
hücreler karıştırılarak (çekme-verme) kırk beş saniye inkübe edildi. İnkübasyon sonrası
hücrelerin üzerine 15 ml steril PBS eklenerek 5 dakika 1250 devirde ve +4°C'de ikinci
kez yıkama işlemi yapıldı.
Yıkamadan sonra üst sıvıları uzaklaştırılan PKMH'lerin üzerine +4°C'deki 2 ml
zenginleştirilmiş kültür ortamı RPMI-1640 eklenerek hücre sayımı aşamasına geçildi.
Trypan blue (tripan mavisi) boyasının yalnız ölü hücreleri boyama özelliğinden
faydalanıldı. 20 μl PKMH hücre süspansiyonu, 20 μl tripan mavisi boyasıyla 96
kuyucuklu plağın bir kuyucuğunda karıştırıldıktan sonra, Neubauer sayma kamarasına
enjekte edildi, boyayı içine almayan canlı hücreler ışık mikroskobunda sayılarak 1 ml'de
bulunan canlı PKMH sayısı hesaplandı.
3.5. PKMH Kültürü
CD4+ T ve CD8+ T lenfositlerini uyarmak için T hücre reseptörü (THR)
bağımsız T hücre aktivasyonu ve proliferasyonu için forbol miristat asetat (Phorbol
myristate acetate, PMA) ve iyonomisin kombinasyonu uygulanan yöntem kullanıldı.
Küçük organik bir komponent olan PMA, hücre membranından difüzyon ile
sitoplazmaya geçerek doğrudan Protein Kinaz C (PKC) enzimini aktive eder.
İyonomisin ise, NFAT sinyalizasyonu için gerekli olan kalsiyum salınımını tetikleyen
bir kalsiyum iyonoforudur [79].
PKMH'ler PMA ve iyonomisin varlığı ve yokluğunda (unstimüle - US) kültüre
edildi (Tablo 3-2). Bu amaçla PKMH'ler, 5’er saat ve her kuyucukta 1x106 hücre olacak
şekilde 24 kuyucuklu düz tabanlı ve kapaklı steril kültür plaklarına alındı. Her bir
kuyucuğa, totalde 1 ml olacak şekilde zenginleştirilmiş RPMI-1640 medyumu eklendi
ve pipetaj yapılarak hücrelerin homojen bir şekilde dağılması sağlandı. Kültür plakları
22
37°C sıcaklıkta % 5 CO2 içeren etüve konulduktan 1 saat sonra, her bir kuyucuğa bir
protein transport inhibitörü olan Brefeldin A (eBioscience, San Diego, CA) ilave edildi
ve pipetaj yapılarak süspansiyonların karışması sağlandıktan sonra toplam 5 saat inkübe
edildi.
Uyaran
Kullanım Dozu
PMA
10 μg/ml
Sigma-Aldrich
Brefeldin A
3 μg/ml
eBioscience
İyonomisin
5 μg/ml
Sigma-Aldrich
Marka
Tablo 3-2: Hücre kültüründe kullanılan uyaranlar ve kimyasallar
3.6. Hücre Yüzey Molekülleri ve Hücre İçi Sitokin Tayini
Hücreler, 5 saatlik kültürün sonunda plaktan akan hücre ölçer tüplerine alınıp,
üzerlerine 2 ml PBS eklenerek 1800 devirde 10 dakika santrifüj edildi. Üst sıvılar
uzaklaştırıldıktan sonra tüplere 300’er l PBS eklenerek PKMH hücre süspansiyonu
elde edildi. PKMH süspansiyonunda hücre yüzey boyaması yapılarak CD4+ ve CD8+ T
hücre grupları ve takiben hücre içi IFN-, IL-4 ve IL-10 sitokin seviyeleri akan hücre
ölçer cihazı ile saptandı (FACSCalibur, Becton Dickinson, San Jose, USA).
3.6.1. Hücre Yüzey Boyaması
Anti-CD4 FITC ve anti-CD8a PeCy5 işaretli monoklonal antikorlar birlikte 3
ayrı tüpe konuldu. Her bir tüpe sırasıyla anti-CD183 APC (CXCR3), anti-CD193 APC
(CCR3) veya anti-CD194 APC (CCR4) işaretli antikorlar eklendi. Antikor konmuş her
bir tüpe 3x105 hücre içerecek miktarda PMA uyarımlı ve uyarımsız koşullara sahip
PKMH süspansiyonu eklenerek karanlıkta, oda sıcaklığında 20 dk inkübe edildi.
İnkübasyonu takiben üzerlerine 2 ml PBS eklenen tüpler, 1800 devirde 10 dk santrifüj
edildikten sonra hücre içi boyama aşamalarına geçildi.
23
Şekil 3-1: Uyarımsız koşulda, CD4+ T hücre CCR4 ve CD8+ T hücre CCR4 ekspresyonu akan hücre ölçer
görüntüsü
3.6.2. Hücre İçi Boyama
Hücre içi sitokin miktarlarını belirlemek için Fiksasyon & Permeabilizasyon kiti
(eBioscience Inc., San Diego, CA) kullanıldı. Bu amaçla öncelikle üst sıvılar
uzaklaştırılıp tüplere 100 l 1x fiksasyon çözeltisi eklenip vorteks ile karıştırıldıktan
sonra 20 dakika karanlık ve oda sıcaklığında inkübe edildi. Fiksasyon işleminin
ardından tüplerin içine 2 ml 1x permeabilizasyon sıvısı eklendi ve hücreler santrifüjde
1800 devirde 5 dakika yıkandı. Üst sıvı uzaklaştırıldıktan sonra tüplere 100 l 1x
permeabilizasyon sıvısı ve ayrı tüplerde olmak üzere anti-IFN-PEGen-Probe Inc.,
San Diego, USA), anti-IL-4 PE ve anti-IL-10 PE (BioLegend, San Diego, CA)
monoklonal antikorlar ilave edilip vorteks ile karıştırıldıktan sonra oda sıcaklığında 30
dakika inkübe edildi. İnkübasyonu takiben tüplere 2 ml 1x permeabilizasyon sıvısı
eklenerek 1800 devirde 5 dk santrifüj edildi. Üst sıvılar uzaklaştırıldıktan sonra
hücrelerin üzerine 300 l FACS flow sheat sıvısı eklenip analize kadar olan süre
içerisinde hücre süspansiyonları karanlıkta ve +4°C’de saklandı.
24
Şekil 3-2: PMA/iyonomisin sonrası CD4+ T hücresi IL-4 ve uyarımsız CD8+ CCR4+T hücresi IL-10 sitokin
içeriği akan hücre ölçer görüntüsü
Örnekler akan hücre ölçerde değerlendirildi. Önden saçılım (Forward scatter,
FSC) - yandan saçılım (Side scatter, SSC) grafiğinde lenfositler R1 ismiyle
kapılandıktan sonra CD8+ T ve CD4+ T hücreler R1 kapısı içinde sırasıyla R2 ve R3
olmak üzere işaretlendi. Şekil 3-1, kapılama stratejisini göstermektedir.
Şekil 3-3: Total lenfositler (R1), CD8+ hücreler (R2) ve CD4+ hücreler (R3) akan hücre ölçer görüntüsü
3.7. Analiz ve İstatistikler
Çalışmada gerçekleştirilen tüm deneylerin sayım ve analizleri BD CellQuest
yazılımı kullanılarak yapıldı. Verilerin istatistiksel analizleri için SPSS 21 programı
kullanıldı. Gruplar arası farkların değerlendirilmesinde non-parametrik Mann-Whitney
25
U testi kullanılırken; grup içi parametrelerin değerlendirilmesi için Wilcoxon testi
kullanıldı. Anlamlılık düzeyi p≤ 0,05 kabul edildi.
26
4. BULGULAR
4.1. Periferik Kan T Hücrelerin Hücre İçi Sitokin İçeriği
PKMH’ler PMA ve iyonomisin varlığında ve yokluğunda in vitro koşulda 5 saat
kültüre edildikten sonra CD4+ T ve CD8+ T hücrelerin hücre içi sitokin düzeyleri akan
hücre ölçer ile değerlendirilmiştir.
4.1.1. Allerjik Astım Olguları
PMA ve iyonomisin uyarımını takiben CD4+ T yardımcı hücrelerin IFN-γ ve IL4 sitokin düzeylerinde anlamlı bir artış (p< 0,05) görülürken, IL-10 düzeyinde saptanan
artış istatiksel olarak anlamlı bulunmamıştır (p= 0,072).
Şekil 4-1: PMA/iyonomisin uyarımına yanıt olarak CD4+ T hücre IFN-γ ve IL-4 düzeyleri (*p= 0,034)
Uyarımı takiben CD8+ sitotoksik T hücrelere bakıldığında ise, tüm sitokin
düzeylerinde anlamlı derecede artış görülmüştür (p< 0,05).
27
Şekil 4-2: PMA/iyonomisin uyarımına yanıt olarak CD8+ T hücre IFN-γ, IL-4 ve IL-10 düzeyleri (*p= 0,034)
4.1.2. Allerjik Olmayan Astım Olguları
PMA/iyonomisin uyarımı altında CD4+ T yardımcı hücrelerin hücre içi IFN-γ,
IL-4 ve IL-10 sitokin seviyelerinin anlamlı düzeyde yükseldiği gözlenmiştir (p< 0,05).
Şekil 4-3: PMA/iyonomisin uyarımına yanıt olarak CD4+ T hücre IFN-γ, IL-4 ve IL-10 düzeyleri (*p= 0,0265)
Aynı şekilde uyarım altındaki CD8+ sitotoksik T hücreleri de hücre içi IFN-γ,
IL-4 ve IL-10 sitokin seviyeleri açısından anlamlı artış göstermiştir (p< 0,05).
28
Şekil 4-4: PMA/iyonomisin uyarımına yanıt olarak CD8+ T hücre IFN-γ, IL-4 ve IL-10 düzeyleri (*p= 0,0265;
**p= 0,0215)
4.1.3. Allerjik ve Non-allerjik Astım Hasta Grupları Kıyaslaması
Uyarımsız ve uyarımlı koşullar altında, CD4+ T ve CD8+ T hücrelerin IL-4, IL10, IFN-γ hücre içi sitokin seviyeleri incelendiğinde, allerjik ve non-allerjik astım
grupları arasında istatiksel olarak anlamlı bir sonuç saptanmamıştır. Tüm hücreler
uyarım sonrasında sitokin seviyelerinde anlamlılık göstermeyen bir artış göstermiştir.
4.2. Periferik Kan T hücrelerin Kemokin Reseptörü Ekspresyon Profili
4.2.1. Allerjik Astım Olguları
PMA ve iyonomisin varlığında CD4+ T hücrelerinin yüzeyinde bulunan CXCR3
ve CCR4 kemokin reseptörlerinin ekspresyon seviyelerinde anlamlı bir düşüş (p< 0,05)
görülürken, CCR3 kemokin ekspresyonunda anlamlı derecede bir artış (p< 0,05)
gözlenmiştir.
29
Şekil 4-5: PMA/iyonomisin uyarımı sonrası CD4+ T hücrelerin CXCR3, CCR3 ve CCR4 yüzey ekspresyon
değişimleri (*p= 0,037; **p= 0,034)
CD8+
sitotoksik
T
hücrelerine
bakıldığında,
uyarım
sonucu
CCR3
ekspresyonunda anlamlı bir değişim görülmezken, CXCR3 ve CCR4 kemokin
ekspresyon düzeylerinde anlamlı derecede bir artış saptanmıştır (p< 0,05).
Şekil 4-6: PMA/iyonomisin uyarımı sonrası CD8+ T hücrelerin CXCR3 ve CCR4 yüzey ekspresyon
değişimleri (*p= 0,034)
4.2.2. Allerjik Olmayan Astım Olguları
PMA ve iyonomisin uyarımı sonrası astım hastalarının CD4+ yardımcı T
hücrelerin CXCR3, CCR3 ve CCR4 kemokin ekspresyon seviyelerinde anlamlı bir
değişim saptanmamış ancak, CD8+ T sitotoksik hücrelerin yüzeyinde bulunan CCR3
kemokin reseptör ekspresyonunun anlamlı derecede düştüğü gözlenmiştir (p< 0,05).
30
Şekil 4-7: PMA/iyonomisin uyarımı sonrası CD8+ T hücrelerin CCR3 yüzey ekspresyon değişimleri (*p= 0,04)
4.2.3. Allerjik ve Non-allerjik Astım Hasta Gruplarının Karşılaştırılması
Farklı hasta grupları arasında, CD4+ T yardımcı hücre CXCR3, CCR3 ve CCR4
kemokin reseptör ekspresyonları kıyaslandığında, uyarımlı/uyarımsız her iki durumda
da istatiksel olarak anlamlılık tespit edilmemiştir. Uyarıma maruz kalan CD4+ T hücre
grubunda CCR4 ekspresyonunun non-allerjik astmatiklerde daha yüksek olmasına
karşın bu artış istatiksel olarak anlamlılık göstermemiştir (p= 0,086).
CD8+ sitotoksik T hücrelerin kemokin reseptörleri her iki koşulda da
incelendiğinde, sadece CCR4 ekspresyonu allerjik olmayan astmatiklerde, allerjik
astımlı gruba nazaran daha yüksek bulunmuştur (p< 0,05).
US
PMA
Şekil 4-8: PMA/iyonomisin uyarımı öncesi ve sonrasında allerjik ve non-allerjik astım olgularının CD8+
CCR4+ hücre oranları (*p= 0,014, **p= 0,05)
31
4.3. Periferik Kan T Hücrelerin Kemokin Reseptör Profillerine Göre Sitokin
İçerikleri
4.3.1. Allerjik Astım Olguları
PMA ve iyonomisin uyarımını takiben CD4+ T hücreleri incelendiğinde,
CXCR3 kemokin reseptörünü eksprese eden hücre popülasyonunda (CD4+CXCR3+)
hücre içi IFN-γ ve IL-4 sitokin miktarlarında anlamlı bir artış gözlenmiştir (p< 0,05).
CD4+CCR3+ T hücrelerin hücre içi IFN-γ, IL-4 ve IL-10 seviyeleri uyarım sonucu
anlamlı düzeyde artarken (p< 0,05), CD4+CCR4+ hücre grubunda sadece IL-10
düzeyinde anlamlı artış (p< 0,05) saptanmıştır.
Şekil 4-9: PMA/iyonomisin uyarımı sonrası CD4+ T hücre CXCR3+IFN-γ, CXCR3+IL-4, CCR3+IFN-γ,
CCR3+IL-4, CCR3+IL-10, CCR4+IL-10 değişimleri (*p= 0,027, p= 0,034, ***p= 0,043).
32
Aynı koşullardaki CD8+ sitotoksik T hücrelerin CXCR3 eksprese eden
popülasyonunda anlamlı bir değişim gözlenmemekle beraber CD8+CCR3+ hücre
grubunda IFN-γ, IL-4, ve IL-10 anlamlı bir artışa (p< 0,05) ek olarak; CD8+CCR4+
popülasyonunda IL-4 ve IL-10 içeriklerinde anlamlı derecede artış saptanmıştır (p<
0,05).
Şekil 4-10: PMA/iyonomisin uyarımı sonrası CD8+ T hücre CCR3+IFN-γ, CCR3+IL-4, CCR3+IL-10,
CCR4+IL-4, CCR4+IL-10 değişimleri (*p= 0,034, **p= 0,04)
4.3.2. Allerjik Olmayan Astım Olguları
PMA ve iyonomisin uyarımına yanıt olarak allerjik olmayan astım hastalarına
ait CD4+ T hücrelere bakıldığında, CXCR3+ grupta IFN-γ, IL-4 ve IL-10 sitokin
içerikleri anlamlı düzeyde artış göstermiştir (p< 0,05). Aynı şekilde CCR3 kemokin
reseptör ekspresyonuna sahip CD4+ T hücre popülasyonunun hücre içi IFN-γ, IL-4 ve
33
IL-10 miktarlarının anlamlı derecede arttığı saptanmıştır (p< 0,05). CD4+CCR4+ T
hücrelerin sitokin içeriklerinde istatiksel olarak anlamlı bir değişim tespit edilmemiştir.
Şekil 4-11: PMA/iyonomisin uyarımı sonrası CD4+ T hücre CXCR3+IFN-γ, CXCR3+IL-4, CXCR3+ IL-10,
CCR3+IFN-γ, CCR3+IL-4, CCR3+IL-10 değişimleri (*p= 0,0215, **p= 0,028, ***p= 0,043)
Uyarım koşullarına cevap olarak CD8+ sitotoksik T hücrelerine bakıldığında,
sadece CXCR3 kemokin reseptörünü eksprese eden grupta hücre içi IFN-γ ve IL-10
sitokin miktarlarında istatiksel olarak anlamlı düzeyde artış görülmüştür (p< 0,05).
34
Şekil 4-12: PMA/iyonomisin uyarımı sonrası CD8+ T hücre CXCR3+IFN-γ ve CXCR3+IL-10 değişimleri (*p=
0,03, **p= 0,0215)
4.3.3. Allerjik ve Non-allerjik Astım Hasta Gruplarının Karşılaştırılması
Uyarımsız CD4+ yardımcı T hücreler kemokin reseptör ekspresyonlarına göre
değerlendirildiğinde, CCR4+ olan popülasyonda hücre içi IFN-γ miktarı non-allerjik
gruba kıyasla allerjik astmatiklerde yüksek (p= 0,05) saptanırken, non-allerjik astım
grubunda ise IL-10 miktarı anlamlı derecede yüksek (p< 0,05) bulunmuştur. Hasta
grupları arasında CXCR3 ve CCR3 eksprese eden popülasyonlar hücre içi sitokin
miktarları açısından anlamlı düzeyde farklılık göstermemiştir.
US
Şekil 4-13: Uyarımsız koşulda allerjik ve non-allerjik astım olgularının CD4+ T hücre CCR4+IFN-γ ve
CCR4+IL-10 düzeyleri (*p= 0,05, **p= 0,027)
PMA ve iyonomisin ile uyarılan CD4+ T hücrelerin CXCR3, CCR3 veya CCR4
kemokin ekspresyonuna sahip olan hücre popülasyonlarında, hasta grupları hücre içi
sitokin seviyeleri bakımından karşılaştırıldığında istatiksel anlamlılık gözlenmemiştir.
CD4+CCR3+ T hücrelerinde IL-10 düzeyi allerjik olmayan astım hastalarında, allerjik
gruba kıyasla gözlenen yükselme, istatiksel anlamlılık düzeyine erişmemiştir (p= 0,086)
35
Uyarımsız koşulda allerjik ve non-allerjik astım grupları karşılaştırıldığında,
CXCR3, CCR3 veya CCR4 kemokin ekspresyonları pozitif olan CD8+ sitotoksik T
hücrelerinin IFN-γ, IL-4 ve IL-10 miktarlarında anlamlı bir değişiklik gözlenmemiştir.
Aynı grup uyarım sonrasında da anlamlı bir sitokin seviye değişimi göstermemiştir.
Sadece CD8+CXCR3+ T hücrelerin IL-10 seviyeleri non-allerjik astım olgularında,
allerjik olgulara nazaran daha yüksek saptanmış, fakat istatiksel olarak bir anlam
bulunmamıştır (p= 0,142).
4.4. Periferik Kan CD4+ ve CD8+ T Hücrelerin Sitokin İçeriklerine Göre
Karşılaştırılması
4.4.1. Allerjik Astım Olguları
Uyarımsız koşullar altında CD4+ yardımcı ve CD8+ sitotoksik T hücreler
birbirleri ile karşılaştırıldıklarında; CD8+ T hücrelerin IFN-γ ve IL-10 sitokin içerikleri
T yardımcı hücrelere nazaran anlamlı derecede yüksek (p< 0,05) bulunurken, hücre içi
IL-4 düzeylerinde farklılık gözlenmemiştir.
Şekil 4-14: Uyarımsız koşulda allerjik astım olgularında CD4+ ve CD8+ T hücrelerinde IFN-γ ve IL-10 hücre
içi sitokin düzeyleri (*p= 0,021, **p= 0,043)
Kemokin reseptör ekspresyonlarına göre hücre grupları incelendiğinde, uyarı
almayan CD4+ yardımcı T hücrelerin, sitotoksik T hücrelere göre CCR4’ü çok daha
yüksek düzeyde eksprese ettikleri saptanmıştır (p< 0,05). PMA ve iyonomisin ile
uyarıma tabi tutulan hücrelere bakıldığında, sadece CD8+ T hücrelerin CXCR3
ekspresyonunun daha yüksek olduğu görülmüştür (p< 0,05). CCR3 ekspresyonuna göre
her iki koşulda da CD4+ ve CD8+ T hücreleri arasında anlamlı düzeyde fark tespit
edilmemiştir.
36
Şekil 4-15: PMA/iyonomisin uyarımı sonrası allerjik astım olgularının CD4 + ve CD8+ T hücre
popülasyonlarında CXCR3 ekspresyonu (*p= 0,043)
Kemokin reseptör ekspresyonlarına göre hücre içi sitokinler incelendiğinde;
CXCR3 ve CCR4’lerde anlamlı bir sonuç görülmezken, sadece uyarımsız koşullar
altında CCR3 eksprese eden CD8+ T hücrelerin, CD4+ yardımcı T hücrelere nazaran
daha yüksek miktarda IFN-γ içerdikleri gösterilmiştir (p< 0,05).
Şekil 4-16: Uyarımsız koşulda allerjik astım olgularının CD4+ ve CD8+ T hücre popülasyonlarında
CCR3+IFN-γ yüzdeleri (*p= 0,021)
4.4.2. Non-allerjik Astım Olguları
Uyarım yapılmayan koşullarda CD8+ sitotoksik T hücrelerindeki IFN-γ ve IL-10
düzeylerinin CD4+ T popülasyonuna göre yüksek olduğu; kemokin reseptör ekspresyon
düzeylerine bakıldığında ise CD4+ T hücrelerin daha yüksek düzeyde CCR4 eksprese
ettikleri gözlenmiştir (p< 0,05). CD4+ ve CD8+ T lenfositleri arasında kemokin ve
sitokin seviyeleri uyarı altında anlamlı fark göstermemiştir.
37
Şekil 4-17: Uyarımsız koşulda allerjik olmayan astım olgularının CD4+ ve CD8+ T hücre popülasyonlarında
hücre içi IFN-γ, IL-10 sitokin düzeyi ve CCR4 ekspresyonu (*p= 0,009)
Kemokin reseptör ekspresyonlarına göre hücre içi sitokin düzeylerine
bakıldığında, sadece uyarımsız örneklerde anlamlı fark tespit edilmiştir. Uyarımsız
ortamda yardımcı ve sitotoksik T hücreleri kıyaslandığında; CCR3 eksprese eden CD8+
T hücrelerin, daha yüksek oranda IFN- içerdikleri, buna karşılık CCR4 eksprese eden
CD4+ T hücrelerin ise anlamlı derecede daha yüksek miktarda IL-10 içerdikleri
gözlenmiştir (p< 0.05)
Şekil 4-18: Uyarımsız koşulda allerjik olmayan astım olgularının CD4 + ve CD8+ T hücrelerinde CCR3+IFN-γ
ve CCR4+IL-10 yüzdeleri (*p= 0,047)
38
5. TARTIŞMA
Hava yollarının kronik inflamatuvar bir hastalığı olan astım sıklığı özellikle
gelişmiş ve gelişmekte olan ülkeler başta olmak üzere tüm dünyada hızla artış
göstermektedir [13]. Astım bireylerin yaşam kalitesini önemli derecede düşürmekte ve
hala tam olarak engellenebilir veya iyileştirilebilir bir tedavi yöntemine ulaşılmamıştır.
Allerjik ve allerjik olmayan tiplerde karşımıza çıkan astımda özellikle T
lenfositleri hastalığın başlaması, ilerleme süreci ve devamlılığında rol oynamaktadır.
Allerjik astım olgularında Tip 2 lenfositler, allerjik olmayan astımda ise nötrofil ve Tip
1 lenfositler genel anlamda baskın hücreler olarak karşımıza çıkmaktadır [25, 80]. Bu
iki farklı T hücre grubu salgıladıkları sitokinler ve taşıdıkları kemokin reseptör
profillerine göre farklılık göstermektedir [81, 82].
Literatürde astım olgularında gerek CD4+ gerekse CD8+ T hücreleri ve
salgıladıkları sitokinleri in vitro olarak inceleyen pekçok çalışma mevcuttur [24, 46].
Bu hücrelerin astımın gelişim sürecinde periferik kan, BAL ve balgam örneklerinde
bulunan pekçok sitokini ürettikleri ve sayıca artmış oldukları yapılan çalışmalarla
gösterilmiştir [2, 24, 43, 78]. Farelerin CD8+ T hücrelerden yoksun hale getirilmesinin
allerjik hava yolu inflamasyonunu azalttığının gösterilmesi; sadece CD4+ T hücrelerin
değil, aynı zamanda CD8+ T hücrelerin de astım patogenezinde önemli görevler
aldıkları görüşünü desteklemektedir [83]. Çalışmamızda bu hücrelerin uyarımlı ve
uyarımsız ortamlarda sitokin içeriklerine ek olarak taşıdıkları kemokin reseptörleri ile
olası ilişkisi irdelenmeye çalışılmıştır.
Allerjik astım hastalarında hücre içi IL-4 ve IFN-γ miktarı hem CD4+ T hem de
CD8+ T hücrelerinde uyarım sonucu artarken, IL-10 düzeyinin sadece sitotoksik T
hücrelerdeki artışı göze çarpmaktadır. Çalışmamızda uyarılan yardımcı T hücrelerin IL10 üretmemesi, allerjik bireylerde immün süpresyonun yetersizliğini destekler
niteliktedir.
Allerjik ve allerjik olmayan astım olguları birbirleriyle kıyaslandığında;
periferik kan CD4+ ve CD8+ hücreleri gerek uyarımsız ortamda gerekse uyarım
sonrasında IL-4, IL-10 ve IFN-γ sitokin içerikleri açısından farklılık göstermemiştir.
Literatürde adı geçen sitokinler açısından periferik kanda yapılan çalışmalar genelde
39
astım tiplendirmesinde yararlı bilgiler sağlamamıştır [84]. Aynı çalışmada bu sitokinler
içerisinde sadece IL-4’ün çok ciddi astım olgularında bir biyobelirteç olarak
kullanılabileceği, fakat bu sitokinin bile allerjik olan ve olmayan olguların ayırımında
yeri olmadığı gösterilmiştir. Çalışmaya alınan vakalarımızın orta şiddette astım
olmalarının sonuçları etkilediği düşünülebilir. Uyarım sonrası yapılan çalışmalarda ise
pekçok farklı sonuç elde edilmiştir. Özellikle BAL sıvısından elde edilen IL-4+ T
lenfosit sayısında uyarım sonrası bile artış gözlenmezken, sadece IFN-γ T lenfositlerde
sayıca artış gözlenmiştir [85]. Çalışmamızda uyarım sonrasında da sitokin içerikleri her
iki hasta grubunda farklılık göstermemiş ve tüm sitokinler fark göstermeksizin artma
eğilimi göstermiştir. Çalışmamızda periferik kan T hücrelerinin incelenmiş olması bu
olası sonuca sebebiyet vermiş olabilir.
Allerjik astımlı olgularda yardımcı T hücreleri, uyarım sonrası tip 1 kemokin
reseptörü olan CXCR3 ekspresyonunda azalma, buna karşılık CCR3 ekspresyonunda
ise artış göstermiştir. Bu durum genel olarak allerjideki Tip 2 kemokin reseptör profili
ile uyum göstermektedir [86].
Kemokin reseptör ekspresyonları incelendiğinde; uyarım yapılan ve yapılmayan
CD4+ yardımcı T hücreleri her iki hasta grubu arasında farklılık göstermemiştir. CD8+ T
hücrelerinde ise bir Tip 2 kemokin reseptörü olan CCR4 ekspresyonu allerjik olmayan
astım olgularında gerek uyarımlı gerekse uyarımsız koşulda yüksek gözlenmiştir. Bu
durum gerek allerjik gerekse allerjik olmayan astım olgularında periferik kan lenfosit
hücrelerinde Tip 1 ve Tip 2 kemokin reseptör ekspresyonlarının allerjiden bağımsız
olduğunu gözler önüne koymakla birlikte, olgu sayısının arttırılması ile olası bir
ilişkinin gösterilebilmesi konusunda açık kapı bırakmaktadır. Yapılan başka bir
çalışmada; uyarımsız ortamda CD4+ ve CD8+ T hücrelerde CCR3, CCR4 ve CXCR3
açısından hem astım klinik alt grupları hem de sağlıklı kontroller arasında fark olmadığı
gösterilmiştir [85].
Genel olarak; CD4+ ve CD8+ T lenfositlerinin Tip 1 ve Tip 2 kemokin reseptör
ekspresyonları ve sitokin profilleri beraber değerlendirmeye alındığında; uyarımlı ve
uyarımsız ortamda sitokin içerikleri seçici olmayan bir şekilde yükselme eğilimi
göstermiştir. Bunun olası sebeplerinden biri olarak çalışmamızda T hücre uyarımında
PMA/iyonomisin kombinasyonunun kullanılması düşünülebilir. Bu uyarım yolunun; T
hücre reseptöründen hücre içine doğru ilerleyen sinyal yolağını aktiflediği ve T
40
hücrelerinin gerçek uyarımları sonrası esas sitokin üretiminden ziyade T hücre sitokin
potansiyellerini ortaya koyduğu öngörülmektedir [78].
Çalışmamızda özellikle allerjik astımda CCR3+ ve CCR4+ yardımcı T
hücrelerinin uyarım sonrasında CD4+CXCR3+ hücrelere kıyasla daha fazla IL-10 içeriği
gözlenmiştir, bu bulgu ışığında allerjik astımda Tip 2 kemokin reseptör taşıyan yardımcı
T lenfositlerin immün yanıtı baskılamak yönünde hareket ettikleri düşünülebilir.
Allerjik hastalarda yapılan başka bir araştırmada; azalmış Th1 kemokin reseptörleri ile
artmış Th1, Th2 ve antiinflamatuvar sitokin düzeyleri birlikte gösterilmiştir. Aynı
çalışmada, atopik hastalıklarda periferik kan immün yanıtlarının karmaşık bir ilişki
içinde oldukları da ortaya konulmuştur [87].
Çalışmamızda uyarımsız ortamda ise allerjik astımda CD4+CCR4+ hücrelerde
IFN-γ hücre içi miktarının; allerjik olmayan astımda ise aynı hücrelerde IL-10 içeriğinin
yüksek olduğu gözlenmiştir. Bu bulgular ışığında astım olgularında CD4+ yardımcı T
hücrelerin immün sistemi yavaşlatmak adına allerjik bireylerde IFN-γ, non-allerjik
bireylerde ise IL-10 içeriğini yükseltmiş olduğu söylenebilir. Yardımcı T hücreler;
Th1/Th2 aksını veya IL-10 gibi immün baskılayıcı sitokinleri kullanarak immün yanıtı
kontrol etme çabası içine girmektedir.
Allerjik astımda periferik kan CD4+ ve CD8+ T hücreleri birbirleri ile
karşılaştırıldığında; CD8+ hücrelerin gerek sitokin içeriği (IFN-γ ve IL-10) gerekse
yüzey kemokin reseptör (CXCR3) ekspresyon değişiklikleri ile allerjik immün yanıtı
baskılamak konusunda CD4+ T hücrelerden daha aktif oldukları söylenebilir. Nonallerjik astımda ise IL-10 üzerinden immün baskılama çabasındaki CD8+ T hücrelere
CD4+CCR4+ hücreler de aynı sitokin üzerinden destek vermektedir.
Sonuç olarak çalışmamız astım hastalığının patogenezinde yardımcı ve
sitotoksik T hücrelerin önemli bir rol üstlendiklerini göstermiştir. Bununla beraber
gerek allerjik gerekse non-allerjik astım hastalığının son derece karmaşık bir hastalık
olduğunun ve sadece Th1/Th2 paradigması ile açıklanmasının mümkün olmadığının da
altını çizmiştir. Hastalık patogenezinin aydınlatılması amacıyla halen geniş perspektifli
çalışmalara ihtiyaç bulunmaktadır.
41
KAYNAKLAR
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
15.
Manni, M.L., J.B. Trudeau, E.V. Scheller, S. Mandalapu, M.M. Elloso, J.K.
Kolls ve ark. The complex relationship between inflammation and lung function
in severe asthma. Mucosal Immunol, 2014. 7(5): p. 1186-98.
Tsitsiou, E., A.E. Williams, S.A. Moschos, K. Patel, C. Rossios, X. Jiang, ve
ark. Transcriptome analysis shows activation of circulating CD8+ T cells in
patients with severe asthma. J Allergy Clin Immunol, 2011. 129(1): p. 95-103.
Tanı ve sınıflama. İçinde: Bayram H, Kilinc O. eds. Turkish Thoracic Journal
Suppl. 1. 2014, Turkish Thoracic Society, p. 13-9.
White, G.E., A.J. Iqbal, and D.R. Greaves. CC chemokine receptors and chronic
inflammation--therapeutic opportunities and pharmacological challenges.
Pharmacol Rev, 2013. 65(1): p. 47-89.
Kaminuma, O., T. Ohtomo, A. Mori, D. Nagakubo, K. Hieshima, Y. Ohmachi,
ve ark. Selective down-regulation of Th2 cell-mediated airway inflammation in
mice by pharmacological intervention of CCR4. Clin Exp Allergy, 2011. 42(2):
p. 315-25.
Mikhak, Z., M. Fukui, A. Farsidjani, B.D. Medoff, A.M. Tager, ve A.D. Luster.
Contribution of CCR4 and CCR8 to antigen-specific T(H)2 cell trafficking in
allergic pulmonary inflammation. J Allergy Clin Immunol, 2009. 123(1): p. 6773.
Robinson, D.S. The role of the T cell in asthma. J Allergy Clin Immunol, 2010.
126(6): p. 1081-91.
Kucuksezer, U.C., O. Palomares, B. Ruckert, T. Jartti, T. Puhakka, A. Nandy, ve
ark. Triggering of specific Toll-like receptors and proinflammatory cytokines
breaks allergen-specific T-cell tolerance in human tonsils and peripheral blood.
J Allergy Clin Immunol, 2013. 131(3): p. 875-85.
Pawankar, R., M. Hayashi, S. Yamanishi, ve T. Igarashi. The paradigm of
cytokine networks in allergic airway inflammation. Curr Opin Allergy Clin
Immunol, 2015. 15(1): p. 41-8.
Betts, R.J. ve D.M. Kemeny. CD8+ T cells in asthma: friend or foe? Pharmacol
Ther, 2009. 121(2): p. 123-31.
Kim, H.Y., R.H. DeKruyff, ve D.T. Umetsu. The many paths to asthma:
phenotype shaped by innate and adaptive immunity. Nat Immunol, 2010. 11(7):
p. 577-84.
Moore, W.C., A.T. Hastie, X. Li, H. Li, W.W. Busse, N.N. Jarjour, ve ark.
Sputum neutrophil counts are associated with more severe asthma phenotypes
using cluster analysis. J Allergy Clin Immunol, 2014. 133(6): p. 1557-63.
Akdis M. 2013. The pathogenesis of asthma. İçinde: Akdis AC, Agache I. eds.
Global Atlas of Asthma. European Academy of Allergy and Clinical
Immunology, p.28-30.
Kim, Y.M., Y.S. Kim, S.G. Jeon, ve Y.K. Kim. Immunopathogenesis of allergic
asthma: more than the th2 hypothesis. Allergy Asthma Immunol Res, 2013.
5(4): p. 189-96.
Lambrecht, B.N. ve H. Hammad. The immunology of asthma. Nat Immunol,
2014. 16(1): p. 45-56.
42
16.
17.
18.
19.
20.
21.
22.
23.
24.
25.
26.
27.
28.
29.
30.
31.
32.
33.
Kuo, C.H., C.C. Hsieh, M.S. Lee, K.T. Chang, H.F. Kuo, ve C.H. Hung.
Epigenetic regulation in allergic diseases and related studies. Asia Pac Allergy,
2014. 4(1): p. 14-8.
Duru, S. ve E.B. Kurt. Astım, çevre ve epigenetik. Tuberk Toraks, 2014. 62(2):
p. 165 - 169.
Ober, C. ve T.C. Yao. The genetics of asthma and allergic disease: a 21st
century perspective. Immunol Rev, 2011. 242(1): p. 10-30.
Gudbjartsson, D.F., U.S. Bjornsdottir, E. Halapi, A. Helgadottir, P. Sulem, G.M.
Jonsdottir, ve ark. Sequence variants affecting eosinophil numbers associate
with asthma and myocardial infarction. Nat Genet, 2009. 41(3): p. 342-7.
Beuther, D.A. ve E.R. Sutherland. Overweight, obesity, and incident asthma: a
meta-analysis of prospective epidemiologic studies. Am J Respir Crit Care Med,
2007. 175(7): p. 661-6.
Saint-Pierre, P., A. Bourdin, P. Chanez, J.P. Daures, ve P. Godard. Are
overweight asthmatics more difficult to control? Allergy, 2006. 61(1): p. 79-84.
Rasmussen, F. ve R.J. Hancox. Mechanisms of obesity in asthma. Curr Opin
Allergy Clin Immunol, 2014. 14(1): p. 35-43.
From the Global Strategy for Asthma Management and Prevention, Global
Initiative
for
Asthma
(GINA)
2015.
Available
from:
http://www.ginasthma.org/.
Machura, E., B. Mazur, M. Rusek-Zychma, ve M. Barc-Czarnecka. Cytokine
production by peripheral blood CD4+ and CD8+ T cells in atopic childhood
asthma. Clin Dev Immunol, 2010. 2010: p. 606139.
Trevor, J.L. ve J.S. Deshane. Refractory asthma: mechanisms, targets, and
therapy. Allergy, 2014. 69(7): p. 817-27.
Lotz, M.T. ve R.S. Peebles, Jr. Mechanisms of respiratory syncytial virus
modulation of airway immune responses. Curr Allergy Asthma Rep, 2012.
12(5): p. 380-7.
Huang, S.K., Q. Zhang, Z. Qiu, ve K.F. Chung. Mechanistic impact of outdoor
air pollution on asthma and allergic diseases. J Thorac Dis, 2014. 7(1): p. 2333.
Devereux, G. ve A. Seaton. Diet as a risk factor for atopy and asthma. J Allergy
Clin Immunol, 2005. 115(6): p. 1109-17.
Demir, A.U., G. Karakaya, B. Bozkurt, B.E. Sekerel, ve A.F. Kalyoncu. Asthma
and allergic diseases in schoolchildren: third cross-sectional survey in the same
primary school in Ankara, Turkey. Pediatr Allergy Immunol, 2004. 15(6): p.
531-8.
Scott T. Weiss, K. Tantisira. 2013. Pharmacogenetics of asthma. İçinde: Akdis
AC, Agache I. eds. Global Atlas of Asthma. European Academy of Allergy and
Clinical Immunology, p.25-27.
Barnes, P.J. Corticosteroid resistance in patients with asthma and chronic
obstructive pulmonary disease. J Allergy Clin Immunol, 2013. 131(3): p. 63645.
Catley, M.C., J. Coote, M. Bari, ve K.L. Tomlinson. Monoclonal antibodies for
the treatment of asthma. Pharmacol Ther, 2011. 132(3): p. 333-51.
Holt, P.G. ve P.D. Sly. Interaction between adaptive and innate immune
pathways in the pathogenesis of atopic asthma: operation of a lung/bone
marrow axis. Chest, 2011. 139(5): p. 1165-71.
43
34.
35.
36.
37.
38.
39.
40.
41.
42.
43.
44.
45.
46.
47.
48.
49.
50.
Abul K. Abbas, Andrew H. Lichtman, ve S. Pillai, Cells and tissues of the
immune system, in Cellular and Molecular Immunology 2012, Elsevier. p. 1535.
Hall, B.M., N.D. Verma, G.T. Tran, ve S.J. Hodgkinson. Distinct regulatory
CD4+T cell subsets; differences between naive and antigen specific T
regulatory cells. Curr Opin Immunol, 2011. 23(5): p. 641-7.
Jiang, S. ve C. Dong. A complex issue on CD4(+) T-cell subsets. Immunol Rev,
2013. 252(1): p. 5-11.
Raphael, I., S. Nalawade, T.N. Eagar, ve T.G. Forsthuber. T cell subsets and
their signature cytokines in autoimmune and inflammatory diseases. Cytokine,
2014. 74(1): p. 5-17.
Mittrucker, H.W., A. Visekruna, ve M. Huber. Heterogeneity in the
differentiation and function of CD8(+) T cells. Arch Immunol Ther Exp
(Warsz), 2014. 62(6): p. 449-58.
Geginat, J., M. Paroni, F. Facciotti, P. Gruarin, I. Kastirr, F. Caprioli, ve ark.
The CD4-centered universe of human T cell subsets. Semin Immunol, 2013.
25(4): p. 252-62.
Annunziato, F., C. Romagnani, ve S. Romagnani. The 3 major types of innate
and adaptive cell-mediated effector immunity. J Allergy Clin Immunol, 2015.
135(3): p. 626-35.
Heaton, T., J. Rowe, S. Turner, R.C. Aalberse, N. de Klerk, D. Suriyaarachchi,
ve ark. An immunoepidemiological approach to asthma: identification of invitro T-cell response patterns associated with different wheezing phenotypes in
children. Lancet, 2005. 365(9454): p. 142-9.
Alcorn, J.F., C.R. Crowe, ve J.K. Kolls. TH17 cells in asthma and COPD. Annu
Rev Physiol, 2010. 72: p. 495-516.
Cho, S.H., L.A. Stanciu, S.T. Holgate, ve S.L. Johnston. Increased interleukin-4,
interleukin-5, and interferon-gamma in airway CD4+ and CD8+ T cells in
atopic asthma. Am J Respir Crit Care Med, 2005. 171(3): p. 224-30.
Lin, Y., H. Yan, Y. Xiao, H. Piao, R. Xiang, L. Jiang, ve ark. Attenuation of
antigen-induced airway hyperresponsiveness and inflammation in CXCR3
knockout mice. Respir Res, 2011. 12: p. 123.
Junttila, I.S., R.J. Creusot, I. Moraga, D.L. Bates, M.T. Wong, M.N. Alonso, ve
ark. Redirecting cell-type specific cytokine responses with engineered
interleukin-4 superkines. Nat Chem Biol, 2012. 8(12): p. 990-8.
Schuijs, M.J., M.A. Willart, H. Hammad, ve B.N. Lambrecht. Cytokine targets
in airway inflammation. Curr Opin Pharmacol, 2013. 13(3): p. 351-61.
Trifunovic, J., L. Miller, Z. Debeljak, ve V. Horvat. Pathologic patterns of
interleukin 10 expression--a review. Biochem Med (Zagreb), 2015. 25(1): p. 3648.
Mueller, T.D., J.L. Zhang, W. Sebald, ve A. Duschl. Structure, binding, and
antagonists in the IL-4/IL-13 receptor system. Biochim Biophys Acta, 2002.
1592(3): p. 237-50.
Koyanagi, M., J.A. Kerns, L. Chung, Y. Zhang, S. Brown, T. Moldoveanu, ve
ark. Diversifying selection and functional analysis of interleukin-4 suggests
antagonism-driven evolution at receptor-binding interfaces. BMC Evol Biol,
2010. 10: p. 223.
Gallelli, L., M.T. Busceti, A. Vatrella, R. Maselli, ve G. Pelaia. Update on
anticytokine treatment for asthma. Biomed Res Int, 2013. 2013: p. 104315.
44
51.
52.
53.
54.
55.
56.
57.
58.
59.
60.
61.
62.
63.
64.
65.
66.
67.
68.
Commins, S., J.W. Steinke, ve L. Borish. The extended IL-10 superfamily: IL10, IL-19, IL-20, IL-22, IL-24, IL-26, IL-28, and IL-29. J Allergy Clin Immunol,
2008. 121(5): p. 1108-11.
Mosser, D.M. ve X. Zhang. Interleukin-10: new perspectives on an old cytokine.
Immunol Rev, 2008. 226: p. 205-18.
Fillatreau, S., D. Gray, ve S.M. Anderton. Not always the bad guys: B cells as
regulators of autoimmune pathology. Nat Rev Immunol, 2008. 8(5): p. 391-7.
Ryan, J.J., M. Kashyap, D. Bailey, S. Kennedy, K. Speiran, J. Brenzovich, ve
ark. Mast cell homeostasis: a fundamental aspect of allergic disease. Crit Rev
Immunol, 2007. 27(1): p. 15-32.
Moore, K.W., R. de Waal Malefyt, R.L. Coffman, ve A. O'Garra. Interleukin-10
and the interleukin-10 receptor. Annu Rev Immunol, 2001. 19: p. 683-765.
Williams, L.M., G. Ricchetti, U. Sarma, T. Smallie, ve B.M. Foxwell.
Interleukin-10 suppression of myeloid cell activation--a continuing puzzle.
Immunology, 2004. 113(3): p. 281-92.
Jankovic, D., M.C. Kullberg, C.G. Feng, R.S. Goldszmid, C.M. Collazo, M.
Wilson, ve ark. Conventional T-bet(+)Foxp3(-) Th1 cells are the major source
of host-protective regulatory IL-10 during intracellular protozoan infection. J
Exp Med, 2007. 204(2): p. 273-83.
Anderson, C.F., M. Oukka, V.J. Kuchroo, ve D. Sacks. CD4(+)CD25(-)Foxp3() Th1 cells are the source of IL-10-mediated immune suppression in chronic
cutaneous leishmaniasis. J Exp Med, 2007. 204(2): p. 285-97.
Cai, G., R.A. Kastelein, ve C.A. Hunter. IL-10 enhances NK cell proliferation,
cytotoxicity and production of IFN-gamma when combined with IL-18. Eur J
Immunol, 1999. 29(9): p. 2658-65.
Savan, R., S. Ravichandran, J.R. Collins, M. Sakai, ve H.A. Young. Structural
conservation of interferon gamma among vertebrates. Cytokine Growth Factor
Rev, 2009. 20(2): p. 115-24.
Mata-Espinosa, D.A. ve R. Hernandez-Pando. [Gamma interferon: basics
aspects, clinic significance and terapeutic uses]. Rev Invest Clin, 2008. 60(5): p.
421-31.
Chen, J. ve X.S. Liu. Development and function of IL-10 IFN-gamma-secreting
CD4(+) T cells. J Leukoc Biol, 2009. 86(6): p. 1305-10.
Nie, W., L. Meng, X. Wang, ve Q. Xiu. Interferon-gamma +874A/T
polymorphism is associated with asthma risk: a meta-analysis. J Investig
Allergol Clin Immunol, 2014. 24(5): p. 324-30.
Heijink, I.H. ve A.J. Van Oosterhout. Targeting T cells for asthma. Curr Opin
Pharmacol, 2005. 5(3): p. 227-31.
Willems, L.I. ve A.P. Ijzerman. Small molecule antagonists for chemokine
CCR3 receptors. Med Res Rev, 2010. 30(5): p. 778-817.
Groom, J.R. ve A.D. Luster. CXCR3 ligands: redundant, collaborative and
antagonistic functions. Immunol Cell Biol, 2011. 89(2): p. 207-15.
Houimel, M. ve L. Mazzucchelli. Chemokine CCR3 ligands-binding peptides
derived from a random phage-epitope library. Immunol Lett, 2012. 149(1-2): p.
19-29.
Zimmermann, N., S.P. Hogan, A. Mishra, E.B. Brandt, T.R. Bodette, S.M. Pope,
ve ark. Murine eotaxin-2: a constitutive eosinophil chemokine induced by
allergen challenge and IL-4 overexpression. J Immunol, 2000. 165(10): p. 583946.
45
69.
70.
71.
72.
73.
74.
75.
76.
77.
78.
79.
80.
81.
82.
83.
84.
Vijayanand, P., K. Durkin, G. Hartmann, J. Morjaria, G. Seumois, K.J. Staples,
ve ark. Chemokine receptor 4 plays a key role in T cell recruitment into the
airways of asthmatic patients. J Immunol, 2010. 184(8): p. 4568-74.
Viney, J.M., D.P. Andrew, R.M. Phillips, A. Meiser, P. Patel, M. LennartzWalker, ve ark. Distinct conformations of the chemokine receptor CCR4 with
implications for its targeting in allergy. J Immunol, 2014. 192(7): p. 3419-27.
Bonecchi, R., G. Bianchi, P.P. Bordignon, D. D'Ambrosio, R. Lang, A. Borsatti,
ve ark. Differential expression of chemokine receptors and chemotactic
responsiveness of type 1 T helper cells (Th1s) and Th2s. J Exp Med, 1998.
187(1): p. 129-34.
Kallinich, T., S. Schmidt, E. Hamelmann, A. Fischer, S. Qin, W. Luttmann, ve
ark. Chemokine-receptor expression on T cells in lung compartments of
challenged asthmatic patients. Clin Exp Allergy, 2005. 35(1): p. 26-33.
Panina-Bordignon, P., A. Papi, M. Mariani, P. Di Lucia, G. Casoni, C.
Bellettato, ve ark. The C-C chemokine receptors CCR4 and CCR8 identify
airway T cells of allergen-challenged atopic asthmatics. J Clin Invest, 2001.
107(11): p. 1357-64.
Pilette, C., J.N. Francis, S.J. Till, ve S.R. Durham. CCR4 ligands are upregulated in the airways of atopic asthmatics after segmental allergen
challenge. Eur Respir J, 2004. 23(6): p. 876-84.
Medoff, B.D., J.C. Wain, E. Seung, R. Jackobek, T.K. Means, L.C. Ginns, ve
ark. CXCR3 and its ligands in a murine model of obliterative bronchiolitis:
regulation and function. J Immunol, 2006. 176(11): p. 7087-95.
Nanki, T., K. Takada, Y. Komano, T. Morio, H. Kanegane, A. Nakajima, ve ark.
Chemokine receptor expression and functional effects of chemokines on B cells:
implication in the pathogenesis of rheumatoid arthritis. Arthritis Res Ther,
2009. 11(5): p. R149.
Xie, J.H., N. Nomura, M. Lu, S.L. Chen, G.E. Koch, Y. Weng, ve ark. Antibodymediated blockade of the CXCR3 chemokine receptor results in diminished
recruitment of T helper 1 cells into sites of inflammation. J Leukoc Biol, 2003.
73(6): p. 771-80.
Thomas, S.Y., A. Banerji, B.D. Medoff, C.M. Lilly, ve A.D. Luster. Multiple
chemokine receptors, including CCR6 and CXCR3, regulate antigen-induced T
cell homing to the human asthmatic airway. J Immunol, 2007. 179(3): p. 190112.
Chatila, T., L. Silverman, R. Miller, ve R. Geha. Mechanisms of T cell activation
by the calcium ionophore ionomycin. J Immunol, 1989. 143(4): p. 1283-9.
Holgate, S.T. Pathogenesis of asthma. Clin Exp Allergy, 2008. 38(6): p. 872-97.
Lukacs, N.W., A.L. Miller, ve C.M. Hogaboam. Chemokine receptors in
asthma: searching for the correct immune targets. J Immunol, 2003. 171(1): p.
11-5.
Bisset, L.R. ve P. Schmid-Grendelmeier. Chemokines and their receptors in the
pathogenesis of allergic asthma: progress and perspective. Curr Opin Pulm
Med, 2005. 11(1): p. 35-42.
Lee, N., M.S. Shin, ve I. Kang. T-cell biology in aging, with a focus on lung
disease. J Gerontol A Biol Sci Med Sci, 2012. 67(3): p. 254-63.
Rogala, B., A. Bozek, J. Gluck, ve J. Jarzab. Prevalence of IgE-mediated allergy
and evaluation of Th1/Th2 cytokine profiles in patients with severe bronchial
asthma. Postepy Dermatol Alergol, 2015. 32(4): p. 274-80.
46
85.
86.
87.
Brown, V., T.J. Warke, M.D. Shields, ve M. Ennis. T cell cytokine profiles in
childhood asthma. Thorax, 2003. 58(4): p. 311-6.
Tian, L., W. Li, J. Wang, Y. Zhang, Y. Zheng, H. Qi, ve ark. The CKLF1-C19
peptide attenuates allergic lung inflammation by inhibiting CCR3- and CCR4mediated chemotaxis in a mouse model of asthma. Allergy, 2011. 66(2): p. 28797.
Casas, R., C. Lindau, O. Zetterstrom, ve K. Duchen. Downregulation of CXCR6
and CXCR3 in lymphocytes from birch-allergic patients. Scand J Immunol,
2008. 68(3): p. 351-61.
47
FORMLAR
Bilgilendirilmiş Gönüllü Olur Formu
1. Deneysel
Tıp
Araştırma
Enstitüsünün
İmmünoloji
Anabilim
Dalı’nda
gerçekleştirilecek bu çalışma, ilaç dışı sadece klinik bir araştırmadır.
2. Araştırmanın amacı, CD4 ve CD8 T lenfosit hücre alt gruplarının atopik astım
patogenezindeki rollerinin anlaşılmasıdır.
3. Araştırmada gönüllüye tedavi uygulanmayacaktır.
4. Araştırma amaçlı gönüllünün kolundan vakumla 20 ml venöz kan alınıp,
heparinle
tüpe
koyulacaktır.
Bunun
haricinde
başka
hiçbir
işlem
yapılmayacaktır.
5. Gönüllünün araştırma için kan vermeye geldiğinde gribal, mikrobiyal infeksiyon
sürecinde olmaması kişinin sorumluluğudur.
6. Periferik kandan periferik kan mononükleer hücre izolasyonunu takiben, T hücre
yüzey molekül ekspresyonu ve hüçre içi sitokin içeriği akan hücre ölçer cihazı
ile tayin edilecektir.
7. Gönüllü için bir risk ve rahatsızlık söz konusu değildir.
8. Araştırmadan makul ölçüde beklenen yararla ilgili olarak gönüllü açısından
hedeflenen herhangi bir klinik yarar olmadığında gönüllü bu durum hakkında
bilgilendirilecektir.
9. Gönüllüye herhangi bir alternatif yöntem veya tedavi şeması araştırma ile ilgili
olarak verilmeyecektir. Bu yüzden olası yarar ve riskler söz konusu değildir.
10. Mevzuat gereğince gönüllüye tazminat ve/veya sağlanacak tedavi yöntemleri
bulunmamaktadır.
11. Gönüllülere ulaşım, yemek gibi masraflar için ödeme yapılmayacaktır.
12. Gönüllünün araştırmaya katılımı isteğe bağlı olduğundan, istediği zaman,
herhangi bir cezaya veya yaptırıma maruz kalmaksızın, hiçbir hakkını
kaybetmeksizin araştırmaya katılmayı reddedebilir veya araştırmadan çekilebilir.
48
13. İzleyiciler, yoklama yapan kişiler, Etik Kurul, Bakanlık ve diğer ilgili sağlık
otoritelerinin, gönüllünün orijinal tıbbi kayıtlarına doğrudan erişimleri
bulunabilecektir, ancak bu bilgiler gizli tutulacaktır. Bu formun imzalanması ile
gönüllü veya yasal temsilcisinin söz konusu erişime izin vermiş olacaktır.
14. Mevzuat gereğince gönüllünün kimliğini ortaya çıkaracak kayıtlar gizli
tutulacak, kamuoyuna açıklanmayacak; araştırma sonuçlarının yayınlanması
halinde dahi gönüllünün kimliği gizli kalacaktır.
15. Araştırma konusu ile ilgili ve gönüllünün araştırmaya katılmaya devam etme
isteğini etkileyebilecek yeni bilgiler elde edildiğinde, gönüllü veya yasal
temsilcisi zamanında bilgilendirilecektir.
16. Gönüllü araştırma hakkında veya araştırmayla ilgili herhangi bir ters olay
hakkında daha fazla bilgi temin etmek için temasa geçeceği ve günün 24 saati
erişebileceği araştırmacı:
Laçin Cevhertaş Telefon numarası: 0533 4387457
17. Gönüllünün araştırmaya devam etmesi için öngörülen süre maksimum 1 yıldır.
18. Araştırmaya tahmini olarak 10 gönüllü katılması beklenmektedir.
19. Gönüllülerden alınacak kan, Deneysel Tıp ve Araştırma Enstitüsü İmmünoloji
Laboratuvarı’na getirilecek, burada deneysel prosedürler uygulanarak allerjik
olan ve olmayan astımda aktif olduğu bilinen T hücre alt gruplarına, hücrelerin
belirli proteinleri eksprese edip etmediklerine bakılacaktır.
20. Gönüllüden
alınan
biyolojik
materyalin
(kanın)
analizi
yurt
dışında
yapılmayacaktır. Türkiye’de İstanbul Üniversitesi, Deneysel Tıp ve Araştırma
Enstitüsü, İmmünoloji Anabilim Dalı Laboratuvarı’nda yapılacaktır.
21. Elde edilen biyolojik materyaller üzerinde genetik araştırma yapılabilmesi için
‘Allerjik astım patogenezinde T hücrelerde kemokin ekspresyonu ve
sitokinler’ araştırması kapsamında alınan biyolojik örneğimin (kanımın);

‘Sadece yukarıda bahsi geçen araştırmada kullanılmasına izin veriyorum.’

‘İleride yapılması planlanan tüm araştırmalarda kullanılmasına izin veriyorum.’

‘Hiçbir koşulda kullanılmasına izin vermiyorum.’
49
22. ‘Bilgilendirilmiş Gönüllü Olur Formundaki tüm açıklamaları okudum. Bana,
yukarıda konusu ve amacı belirtilen araştırma ile ilgili yazılı ve sözlü açıklama
aşağıda adı belirtilen hekim tarafından yapıldı. Araştırmaya gönüllü olarak
katıldığımı, istediğim zaman gerekçeli veya gerekçesiz olarak araştırmadan
ayrılabileceğimi biliyorum.’
23. ‘Bu araştırmaya hiçbir baskı ve zorlama olmaksızın kendi rızamla katılmayı
kabul ediyorum.’
Gönüllünün;
Adı:
Tarih:
Soyadı:
İmza:
Yetkin araştırmacının;
Adı:
Tarih:
Soyadı:
İmza:
Yasal temsilci var ise;
Adı:
Tarih:
Soyadı:
İmza:
50
ETİK KURUL KARARI
51
PATENT HAKKI İZNİ
52
TELİF HAKKI İZNİ
53
ÖZGEÇMİŞ
Kişisel Bilgiler
Adı
Doğ. Yeri
Uyruğu
Email
Laçin
Bursa,
T.C.
lacincevhertas@yahoo.com
Cevhertaş
Soyadı
16.07.1986
Doğ. Tar.
TC Kim No 12562890036
0533 4387457
Tel
Eğitim Düzeyi
Mezun Olduğu Kurumun Adı
Mez. Yılı
Doktora
Yük.Lis.
Lisans
Lise
Haliç Üniversitesi, Fen-Edebiyat
Biyoloji ve Genetik
Bursa Anadolu Lisesi
Fakültesi,
Moleküler
2004-2009
1997-2004
İş Deneyimi (Sondan geçmişe doğru sıralayın)
Görevi
Süre (Yıl - Yıl)
-
Kurum
1.
2.
3.
Yabancı
Dilleri
İngilizce
Okuduğunu
Anlama*
Çok iyi
Konuşma*
Yazma*
İyi
İyi
KPDS/ÜDS
Puanı
68,75
(Diğer)
Puanı
*Çok iyi, iyi, orta, zayıf olarak değerlendirin
LES Puanı
(Diğer)
Sayısal
67,41457
Eşit Ağırlık
68,57090
Puanı
Bilgisayar Bilgisi
Program
SPSS İstatistik Programı
Graftpad Grafik Programı
Kullanma becerisi
Orta
Orta
Yayınları/Tebligleri Sertifikaları/Ödülleri:
Özel İlgi Alanları (Hobileri): Kayak, tenis, piyano çalmak
Sözel
62,99448
54