helena

helena
www.helena-biosciences.com
BioSciences
Europe
Kullanım Talimatları
SAS-MX YÜKSEK RESOLÜSYON
Katalog No: 101300
KULLANIM AMACI
SAS-1 Plus Yüksek Resolüsyon Kit agaroz jel elektroforezi tarafından serum veya
plazma proteinlerini ayırmayı amaçlamıştır.
Serum, farklı patolojik koşullarda ve konsantrasyonda belirli varyasyona bağlı olan
fonksiyonların belirli bir dizisi 100’den fazla özel protein içerir1. Tiselius tarafından sınır
elektroforez hareketinin girişi ve bölge elektroforezinin sonraki kullanımı için, serum
proteinleri kendi yükleri bazında belirli bir pH’da fraksiyonlara ayrılmıştır.
Yüksek Resolüsyon kiti 10-15 ayrı fraksiyonlar içinde klasik 5 bant paternine doğru
serum proteinlerini ayırır, böylece protein paternlerinin teşhis kullanışlılığı artar.3-5
Yaklaşık 15 serum proteinini kapsamlı olarak incelenmiştir çünkü kolayca ölçülebilir.6-9
SAS-1 Plus Yüksek Resolüsyon kiti bufferlanmış bir agaroz jeldeki yüke göre serum/
plazma proteinlerini ayırır. Protein bantları, sonra görüntüleme ve kantitatif yorum için
boyanmış ve sabitlenmiştir.
UYARILAR VE ÖNLEMLER
Tüm kitler yalnızca in-vitro diyagnostikte kullanım içindir. Herhangi bir kit bileşenini
ağzınızla pipetlemeyin, ağzınıza sürmeyin. Tüm kit bileşenlerinin işlemi sırasında eldiven
giyin. Risk, güvenlik koşulları ve atım bilgisi için ürün güvenlik kılavuzuna başvurun.
COMPOSITION
BİLEŞENLER
1. SAS-MX High Resolution Jel
Koruyucu olarak sodyum azid ve tiyomersal ile bir Barbital buffer agaroz içerir. Paket
içindeki jel kullanım için hazırdır.
2- Konsantre Tris / Barbital Buffer
Koruyucu olarak sodyum azid ile konsantre Tris/barbital buffer içerir. Şişe içeriğini 1
litre saf su ile dilüe edin ve iyice karıştırın.
3. Konsantre Yüksek Resolüsyon Boyası
Konsantre yüksek resolüsyon boya 5 metanol, 5 su ve 1 glasiyal asetik asit içerir. Şişe
içeriği 700ml saf su ile dilüe edilir. Kullanım öncesi karıştırılır.
4. Diğer Kit Bileşenleri
Her kit kullanım talimatları ve 10 jeli tamamlamak için yeterli miktarda Numune
Aplikasyon Kalıbı, Fitil ve kurutma kağıdı A ve C içerir.
SAKLAMA VE RAF ÖMRÜ
1- SAS-MX Yüksek Resolüsyon jel
Jeller 15-30 derecede saklanmalıdır ve paket üzerinde belirtilen son kullanma
tarihine kadar stabildir. DOLABA KOYMAYIN VEYA DONDURMAYIN. Jelin
bozulmasını belirtebilir,1) jelin dondurulması kristal görünümü belirtir, 2) jelin
kuruması, çatlama ve kuruluğu veya 3)bakteriyal yada fungal kaynaklı agarozun
görülür kontaminasyonunu belirtir.
2 - Tris / Barbital Buffer
Konsantre buffer 15-30 derecede saklanmalıdır ve etiket üzerinde belirtilen son
kullanma tarihine kadar stabildir. Dilüe boya solüsyonu 15-30 derecede 2 ay stabildir.
Dilüe bufferın bulanık ve zayıf performansı, bozulduğunun göstergesidir.
3-Yüksek Resolüsyon Boyası
Konsantre boya 15-30 derecede saklanmalıdır ve etiket üzerinde belirtilen son
kullanma tarihine kadar stabildir. Dilüe boya solüsyonu 15-30 derecede 6 ay stabildir.
Zayıf boyama performansı, boya solüsyonunun bozulduğunun göstergesidir.
SAĞLANMAYAN FAKAT GEREKSİNİLEN ÖĞELER
Katalog No.4063 SAS-MX Oda
Katalog No.1525 EPS600 Güç kaynağı
Katalog No.3039 Chamber Cooling Device
Katalog No. 5141 High Resolution Protein Marker
60...70°C hava üfleme kapasiteli kurutma fırını
Boya arındırıcı solüsyon: 500 ml saf su ve 500 ml metanolle karıştırın. 100 ml glisial
asetik asit ekleyin.
Sıkı kapatılmış şişede saklanır.
Saf su
NUMUNE TOPLANMASI VE HAZIRLANMASI
Tercih edilen numune taze toplanmış plazma veya serumdur. Numuneler maksimum 48
saate kadar 2-6 derecede kapalı olarak saklanmalıdır. Plazma kullanımı beta ve gama
fraksiyonları arasında bir fibrinojen bandına sebep olur. Eski numunelerin kullanımı
transferrin bölgesinde C3 bandına göçe neden olacaktır. Serum ve plazma numuneleri
buffer (1 parça numune +1 parça buffer) ile 1+1 oranında dilüe edilir.
İdrar ve CSF numuneleri aşağıda uygun konsantrasyon adımında kullanılabilir:
(Total protein=toplam protein, Concetration Factor=Konsantrasyon faktörü)
Konsantrasyon ardından, ürine ve CSF numuneleri direk olarak jele uygulanır.
ADIM-ADIM PROSEDÜR
NOT: Oda soğutma cihazının kullanım öncesi en az 60 dakika 2...6°C’de saklanmış
olduğundan emin olun.
1. Jeli paketinden çıkarın ve kağıt havlu üstüne koyun. Ambalajını çıkarın ve kurutucu C
ile jel yüzeyini kurutun ve kurutucuyu atın.
2. Jel köşesindeki oklarla numune aplikasyon kalıbını hizalayın ve kalıbın başına
kurutucu A’yı koyun ve iyi temas sağlaması için yarığın içine parmağınızı sürtün.
Kurutucuları alın ve adım 5'te kullanmak için saklayın.
3.Her yarığa 2μl numune uygulayın ve 5 dakika absorbe olması için bırakın (Koyu
bantlar tercih edilirse, 4μl bir numune uygulanır.)
4. Numune emiliyorken, SAS-MX odasının her dış bölümüne 150ml buffer dökün.
Odanın merkezi çukur içine soğutma cihazı yerleştirin ve bufferın birkaç damlası ile
yüzeyi ıslatın.
5. Numune emilimi ardından, adım 2 den kalan kurutucu A ile kalıbı kurutun ve hem
kurutucuyu hem de kalıbı alın.
6. Jeli oda içine agoraz tarafı aşağı olacak şekilde yerleştirin. Odanın başına karşılık
gelen pozisyonlar ile pozitif (+) ve negatif (-) tarafları hizalayın. Jel altında hava
kabarcığı oluşturmamaya dikkat edin.
7. 2 kalın fitilleri yapmak için 2 sette 3 fitilleri yerleştirerek jelin her tarafı için bir fitil
hazırlayın. Aşırı bufferı yavaşça sıkarak buffera her fitili daldırın ve soğutma cihazının
kenarına paralel olarak jele her bir fitili takın. Fitilin bir kenarının buffera batırıldığından
emin olun ve iyi temas sağlamak için jelin fitil kısmına doğru parmağınızı sürtün.
8.Elektroforez jel: 250 volt, 25 dakika.
9. Elektroforez ardından, 15 dakikada boyama solüsyonuna jeli daldırın.
10. 30 saniye boyunca boya arındırıcı solüsyonunda jeli boyadan arındırın.
11. 60...70°C’de jeli kurutun.
12. Boya arındırıcı solüsyon 2 x 30 saniye yıkanana kadar jeli boyadan arındırın.
13. Jeli kurutun.
Alternatif Boyama Prosedürleri
İki alternatif boyama protokolu kullanıcının istenen boyama gereksinimine bağlı olarak
kullanılabilir.
1. Yüksek Resolüsyon Boyama için Amino Siyah Boya yer değiştirmesi (Kat. No. 3048).
SADECE SERUM/PLAZMA NUMUNELERİ İÇİN. Aşağıda özetlenmiş boyama
protokolunu kullanın. Amino siyah boya koomassie boyadan daha hassastır, fakat daha
düzgün boyama kalitesi sağlar ve bant yoğunluğunda farklılıklar daha iyi bir kantitatif
değerlendirme verir.
2.Çift boyama tekniği. SADECE CSF VE ÜRİNE NUMUNELERİ İÇİN. Elektroforezden
sonra tamamlanmış jel ile amido siyah boyama yapın ve sonra tamamlanmış jel ile
koomassie boyama tekniği yapın. Çift boya tekniği idrar protein bantları ve CSF’de
oligoklonal bantların daha net görüntülenmesini sağlar.
NOT: Boya ve boya arındırıcı solüsyon metanol içerdiği için SAS-4’de jeli boyamayın.
SONUÇLARIN YORUMLANMASI
Jelin değerlendirmesi, her laboratuarda bu yöntem için üretilen normal paternlere karşı
yapılması önerilir. Belirli protein bantlarının varlığı veya yokluğu jelde görsel olarak
incelenecektir.
Şekil 1’de SAS-MX Yüksek Resolüsyon Prosedür kullanılarak belirlenen ana plazma
proteinlerin göç paternlerini göstermektedir.
Şekil 1
Yüksek Resolsüyon protein elektroforez paternleri öncelikle normal bireyler elde edilen
bilinmeyen numunelerin bantlarının relatif yoğunluğu ile karşılaştırılarak yorumlanır.
Anormal serum protein paternlerinde en yaygın olanlardan biri spesifik olmayan
inflamatuar tepkisi olarak görülmektedir ve bu yanıt azalmış prealbumin, albümin ve
transferrin ile haptoglobin ve α1 –antitripsin’de bir artış ile karakterizedir. Genel bir
teşhis kurulmasında yararlı değil iken, tedavi için bir hastanın tepkisinin izlenmesi
yararlıdır.
Klinik olarak önemli varyasyonların diğer örnekleri şunlardır:
1. Transferrin bandının yüksekliği, demir düşük seviyesini gösterir.
2. Monoklonal proteinlerin varlığı, immun sistemde abnormalitesini gösterir.
3.Düşük haptoglobin, yüksek eritrosit turnover veya in-vitro hemoliz gösterir.
4. CRP Vvarlığı, akut enflamatuar yanıt gösterir.
5.Düşük prealbumin, albümin ve yaygın hypergammaglobulinaemia ile transferrin,
kronik inflamasyon, enfeksiyon veya antijenik stimülasyon gösterir.
6.Taze numunelerde düşük C3, tamamlayıcı tüketimi gösterir.
Yüksek Resolsüsyon protein elektroforezi ürin proteinin geniş bir açıklamasını elde
etmek için mükemmel bir analitik araçtır3,10. Normal ürine normalde albumin bir iz ve
bazen hafif bir transferrin bant içerir. Glomerüler-tür proteinüri genellikle geniş bir α1
bölgesinde ve transferrin β1 bölgedesinde hem α1-asit glikoprotein hem de a1antitrypsinden ve albuminin güçlü bandından oluşur. Serum patern, glomerul tarafından
tutulmuş proteinlerde artış ile bu proteinlerde düşüşler gösterir. Tübüler proteinüri’de
ürine paterni, genellikle α2-mikroglobulin nedeniyle α2 bölgesinde çift bant, zayıf bir
albümin bandından, β2-mikroglobulin nedeniyle orta-beta bölgesinde güçlü bir banttan
ve bazen serbest hafif zincirlerden dolayı gama bölgesinde yaygın arka plan
boyanmasından oluşur. Kronik böbrek hastalığı veya böbrek yetmezliği, hem tübüller
hem de glomerul oluşan hasardan kaynaklanan karışık tip paternine yol açabilir.
Belirli numunelerdeki bileşenlerin azalması veya yükselmesi veya olağandışı numune
bileşenlerinin tespiti daha fazla araştırma gerektirir. Tamamlanmış SAS-MX Yüksek
Resolsüyon jeli süresiz bir zaman için stabildir.
BİBLİYOGRAFİ
1. Alper, C.A. ‘Plasma Protein Measurements as a Diagnostic Aid’, N. Eng. J. Med., 1974; 291 :
287-290.
2. Tiselius, A. ‘A New Approach for Electrophoretic Analysis of Colloidal Mixtures’, Trans.
Faraday Soc., 1937; 33 : 524.
3. Laurell, C.B. ‘Composition and Variation of the Gel Electrophoretic Fractions of Plasma,
Cerebrospinal Fluid and Urine’ Scand. J. Clin. Lab. Invest., 1972; 29 (Suppl. 24) : 71.
4. Killingsworth, L.M. et al. ‘Protein Analysis, Deciphering Cerebrospinal Fluid Patterns’ Diag.
Med., 1980; March/April : 1-7.
5. Killingsworth, L.M. et al. ‘Protein Analysis, Finding Clues to Disease in Urine’ Diag. Med.,
1980; May/June : 69-75.
6. Killingsworth, L.M. ‘Clinical Applications of Protein Determinations in Biological Fluids Other
Than Blood’ Clin. Chem., 1982; 28(5) : 1093-1102.
7. Ritzmann, S.E and Daniels, J.C. ‘Diagnostic Proteinology: Separation and Characterization of
Proteins. Qualitative and Quantitative Assays’ in Laboratory Medicine, Harper & Row, Inc.,
Hagerstown,1979.
8. Killingsworth, L.M. et al. ‘Protein Analysis’ Diag. Med., 1980; Jan/Feb : 3-15.
9. Killingsworth, L.M. ‘Plasma Protein Patterns in Health and Disease’ CRC Critical Reviews in
Clinical Laboratory Sciences, August 1979.
10. Peterson, P.A., Ervin, P.E. and Beggard, I. ‘Differentiation of Glomerular, Tubular and
Normal Proteinuria: determination of Urinary Excretion of a2-microglobulin, Albumin and Total
Protein’ J. Clin. Invest., 1969; 48 : 1189-1198.