PowerPoint Sunusu - Erzurum Teknik Üniversitesi

ELEKTROFOREZ
SDS-PAGE
ARŞ. GÖR. F. NECMİYE KACI,
ERZURUM TEKNİK ÜNİVERSİTESİ, 2017
ELEKTROFOREZ
 Yüklü moleküllerin elektriksel alanda ayrılmaları temeline dayanan bir tekniktir.
 Elektroforezde katedilen mesafe, net yük ile doğru ; molekül büyüklüğü ve
elektroforetik ortamın viskozitesi ile ters orantılıdır.
 Proteinler izoelektrik noktalarının (pI) üzerindeki pH değerlerinde (-)
yüklüdürler ve elektriksel alanda anoda göç ederler; izoelektrik noktanın
altındaki pH değerlerinde ise (+) yüklüdür ve katoda göç ederler.
 Elektroforez için dört şeye ihtiyaç vardır:
-iyonların hareket edebileceği uygun bir ortam (destek ortamı)
-uygun pH’da bir tampon çözelti
-elektriksel alanı oluşturmak için doğru akım sağlayacak güç kaynağı
-birbirinden ayrılan bantları kantitatif olarak değerlendirebilen dansitometre.
ELEKTROFOREZ YÖNTEMLERİ
• Poliakrilamid Jel Elektroforezi
• Agaroz Jel Elektroforezi
• Değişken Alanlı (Pulsed Field ) Jel Elektroforezi
• İzoelektrik Odaklanma
• İki Boyutlu Elektroforez
• Kılcal (Kapiller) Elektroforez
• İmmünoelektroforez
• İmmünfiksasyon Elektroforezi
Poliakrilamid Jel Elektroforezi
 En yaygın kullanım alanı olan elektroforez tipidir.
 Proteinlerin elektroforetik ayrımında nişasta, agaroz ve selüloz asetat gibi
çeşitli jeller kullanılmakla birlikte, genelde en iyi ayrışımın sağlandığı PAGE tekniği
uygulanır.
 PAGE; serum proteinlerinin, proteinlerin genetik varyasyonlarının ve izoezimlerin
analizinde en iyi sonuç veren elektroforez tipidir.
 Poliakrilamid jellerle yapılan elektroforez, örnekteki bileşenlerin daha iyi
ayrışmasına yol açar. Çünkü ayırım hem moleküler elekleme, hemde elektroforetik
harekete dayanır.
 Jelin ayrıştırma gücü ve molekül boyutu aralığı akrilamid ve bis (N, N’-metilen –bis –
akrilamid) akrilamid konsantrasyonuna bağlıdır.
 İki maddenin polimerizasyonu ile (kovalent bağ oluşumu) jelde porlar oluşur.
Düşük konsantrasyonda daha büyük porlar oluşur ve yüksek molekül ağırlıklı
moleküllerin analizi yapılabilir.
 Yüksek konsantrasyonlarda ise küçük porlar oluşur ve düşük molekül ağırlıklı
moleküllerin analizi yapılır.
 Polimerizasyon ya kimyasal ya da fotokimyasal yolla gerçekleştirilir.
 Polimerizasyon başlatıcı olarak:
kimyasal yöntemde: Amonyum persülfat
fotokimyasal yöntemde: Riboflavin
 N,N,N’,N’-tetrametilenetilendimin (TEMED) her iki uygulamada da katalizör
işlevi görür.
 PAGE, tüp veya düzlemsel(slab) jellerde gerçekleştirilir. Düzlemsel(slab) jeller,
aynı anda çok sayıda örneğin destek ortamında analiz edilebilmesine imkan
verdiği için tüp jellere göre daha geniş çapta kullanılırlar.
%T ve %Cbis DEĞERLERİ
%T:total akrilamid %’si (w/v)
%Cbis :bis’in monomere oranı (w/w)
%T= Akrilamid (g) + Bis (g) x 100
Hacim (ml)
%Cbis=
Bis (g)
x 100
Akrilamid (g) +Bis (g)
•
%T arttıkça por çapı küçülür.
•
Herhangi bir %T oranında %5 bis optimum por büyüklüğünün oluşmasını
sağlar. %5’in altındaki veya üstündeki %Cbis değerleri por büyüklüğünü
artırır.
Çeşitli Akrilamid Konsantrasyonlarında Ayrımı
Yapılabilecek Polipeptid Ağırlıkları
Akrilamid Konsantrasyonu (%)
Polipeptidin Molekül Ağırlığı (kD)
15
12-43
10
16-68
7.5
36-94
5
57-212
Poliakrilamid jel elektroforezi:
ND (non denature edici PAGE)
SDS PAGE (denature edici PAGE)
 Proteinlerin doğal (intakt) yapılarını
bozucu ajanlar kullanmadan yapılan PAGE
yöntemidir.
 Doğal jelde proteinin molekül ağırlığı
hakkında kesin bilgi edinmek mümkün
değildir, çünkü molekül büyüklüğü yanında
molekül şekli ve yükü de ayrımı etkiler.
 SDS-PAGE ile proteinler, net yük ve şekillerine
göre değil, sadece molekül büyüklüklerine göre,
birbirinden ayrılırlar.
 SDS’in ( Sodyum dodesil sülfat) bağlanmasıyla ,
doğal yapısını kaybeden proteinler, aynı şekil ve
yük/kütle oranına sahip olurlar. Böylece
elektriksel alan içinde proteinlerin hareketi
sadece molekül ağırlıklarına bağlıdır.
 Daha küçük olanlar, daha hızlı sürüklenir.
(SDS: Polipeptitlerin ana iskeletini çevreleyerek proteinleri denature eden anyonik
bir deterjandır. Moleküle negatif yük kazandırır.)
SDS-PAGE
Elektroforez Tampon Sistemleri
 A) Kesiksiz (Continuous):
Tek bir ayırıcı jel ve tek bir tampon kullanılır. Tanklarda ve jelde aynı tampon
kullanılır.
 B) Kesikli (Discontinuous):
Jel farklı tamponlarla hazırlanmış iki kısımdan oluşur:
1) büyük porlu yükleme (stacking) jeli ( örneğin, % 5 total akrilamid içerir.)
2) Küçük porlu ayırma (seperating) jeli ( örneğin % 10 total akrilamid içerir.)
1) JELİN HAZIRLANMASI
A)AYIRMA JELİ
 Hazırlanan jel sistemi SU ile temizlenir. Alkol jel yapısına zarar vereceği için
kullanılmamalıdır.
 Hazırlanan jel hava kalmayacak şekilde pipetle yavaşça sisteme dökülür.
 Üzeri hemen 2- propanol ile kapatılır. HAVA ile teması önlenir.
 %10’LUK AYIRMA JELİ
 4X Separating buffer tamponu…………….1,25 ml
 %30 Akrilamid Karışımı………………….….…..1,65 ml
 dH2O……………………………..…………………………..2,05 ml
 %10 APS……………………………………..…………..…75 µl
 TEMED………………………………..………………….… 5 µl
Verilen maddeler
bu sıra ile konulur.
B) YÜKLEME JELİ
 Polimerizasyon tamamlandıktan sonra üst yüzeydeki 2- propanol dökülür.
 Jel yüzeyi saf su ile birkaç kez yıkanır.
 Hava boşluğu kalmayacak şekilde 2ml kadar yükleme jeli dökülür.
%10’LUK YÜKLEME JELİ
 4X Stacking jel buffer tamponu………….1,25 ml
 %30 Akrilamid Karışımı………………….….…..850 µl
 dH2O……………………………..…………………………..2,85 ml
 %10 APS……………………………………..…………..…75 µl
 TEMED………………………………..………………….… 5 µl
Verilen maddeler
bu sıra ile konulur.
Notlar:
 Akrilamid: Nörotoksik bir maddedir. Karanlıkta, +4ᵒC’de saklanır.
 Bromofenol blue: Proteinle reaksiyon vermez.
 Β-merkapto etanol: Proteinlerdeki disülfit bağlarını koparır.
 EDTA: Fe, Ca gibi metal iyonlarının şelatörüdür. pH:8’de çözünür.
 Glisin: SDS-PAGE, running buffer bileşenidir. pH‘ın korunmasını sağlar,
elektroforez sırasında örneğin korunmasını sağlar.
 APS(amonyum per sülfat): TEMED’in katalizörüdür. Oksijen free radikalleri
oluşturur.
 TEMED: Reaksiyon başlatıcı ajandır.
 SDS: Polipeptitlerin ana iskeletini çevreleyerek proteinleri denature eden
anyonik bir deterjandır. Moleküle negatif yük kazandırır.
2) ÖRNEKLERİN YÜKLENMESİ
Yüklenecek tüm protein örnekleri aynı konsantrasyona sahip olmalıdır.
 4X LAEMLİ Buffer
SDS-PAGE Gel Loading Buffer  %10’u β-merkapto ethanol olacak şekilde
hazırlanır.
60 µl 4X Laemli buffer
6 µl β-merkapto ethanol
Bu oran kullanılarak protein örneği
sayısına göre hazırlanır.
 Genellikle 20 µl yükleme yapılır.
 Protein: boya= 3:1 olmalıdır.
 Totalde bir protein örneği için:
15 µl ................ Protein
5 µl ..................Boya (Gel loading Buffer)
Denature edilecek
protein karışımı
hazırlanır.
95 derecede 5 dk
bekletilir.
5 dk sonunda
örnekler doğrudan
buza alınır.
70 voltta 3-4 saat
boyunca yürütme
yapılır.
Jele yükleme
yapılır.
3) MARKER YÜKLENMESİ
 Hemoglobin: 64.000 Dalton: 64 kDa
4) PROTEİNLERİN GÖRÜNÜR HALE
GETİRİLMESİ
Marker
 Coomassie brillant blue ile boyama
yapılır.
 Boya arginin gibi bazik amino asitlere
ve bazı aromatik amino asitlere daha
kolay bağlanır.
 Jelin alt kısmı yürümenin sonlandığı
noktayı gösterir.
5) PROTEİNLERİN MOLEKÜL
AĞIRLIKLARININ BELİRLENMESİ
 Proteinlerin molekül ağırlıklarının logaritması ile jeldeki rölatif göç hızları
arasında doğrusal bir ilişki vardır.
Molekül ağırlığı bilinmeyen proteinin Rf değeri =
proteinin ayrıştırma jelinde ilerleme yolu/ayrıştırma
jelinin toplam uzunluğu= 4.2/8.4=0.5
 Standart markerdeki herbir protein bandının molekül ağırlığı grafiğin y eksenine,
Rf değerleri de x eksenine yazılır.Ve bu grafikten elde edilen eğride verilen
denklem kullanılarak istenilen proteinin molekül ağırlığı bulunabilir (istenilen
proteinin de ilerleme yolu yükleme boyasının toplam yoluna bölünerek Rf değeri
hesaplanır).
6) POLİPEPTİTLERİN RF DEĞERLERİNE AİT
STANDART GRAFİK (kalibrasyon eğrileri)
 Molekül ağırlığının saptanmasında kullanılan standart grafik. Araştırmacı,
kullanacağı kalibrasyon grafiğini, kendi çalışmasına göre tekrar düzenlemelidir.