helena

helena
www.helena-biosciences.com
BioSciences
Europe
Kullanım Talimatları
SAS-1 PLUS YÜKSEK RESOLÜSYON-12
Katalog No: 200700
KULLANIM AMACI
SAS-1 Plus Yüksek Resolüsyon Kit agaroz jel elektroforezi tarafından serum veya
plazma proteinlerini ayırmayı amaçlamıştır.
Serum, farklı patolojik koşullar altında konsantrasyonda spesifik varyasyona bağlı olan
fonksiyonların belirli bir seti100’den fazla özel protein içerir.1 Tiselius2 tarafından yapılan
hareketli sınır elektroforezin başlangıcından ve zone elektroforezinin sonraki
kullanımından beri, serum proteinleri kendi yüklerine göre belirli bir pH’da fraksiyonlara
ayrılırlar. Yüksek Rezolüsyon kiti 10-15 ayrı fraksiyonlar içinde klasik 5 bant paterninden
başka serum proteinlerini ayırır, böylece protein paternlerinin teşhis kullanışlılığı artar.3-5
Yaklaşık olarak 15 serum proteinini kapsamlı olarak incelenmiştir çünkü kolayca
ölçülebilir.6-9
SAS-1 Plus Yüksek Resolüsyon kiti bufferlanmış bir agaroz jeldeki yüke göre serum/
plazma proteinlerini ayırır. Protein bantları, sonra görüntüleme ve kantitatif yorum için
boyanmış ve sabitlenmiştir.
UYARILAR VE ÖNLEMLER
Tüm kitler yalnızca in-vitro diyagnostikte kullanım içindir. Herhangi bir kit bileşenini
ağzınızla pipetlemeyin, ağzınıza sürmeyin. Tüm kit bileşenlerinin işlemi sırasında eldiven
giyin. Risk, güvenlik koşulları ve atım bilgisi için ürün güvenlik kılavuzuna başvurun.
BİLEŞENLER
1. SAS-1 Plus High Resolution Jel
Koruyucu olarak sodyum azid ve tiyomersal ile bir Barbital buffer agaroz içerir. Paket
içindeki jel kullanım için hazırdır.
2. Konsantre Yüksek Resolüsyon Boyası
Konsantre yüksek resolüsyon boya içerir. Şişe içeriği 700ml saf su ile dilüe edilir.
Kullanım öncesi karıştırılır ve filtre edilir. İyi kapatılmış bir şişede saklanır.
3. Diğer Kit Bileşenleri
Her kit kullanım talimatları ve 10 jeli tamamlamak için yeterli miktarda kurutma kağıdı
C içerir.
SAKLAMA VE RAF ÖMRÜ
1. SAS-1 Plus Yüksek Resolüsyon jel
Jeller 15-30 derecede saklanmalıdır ve paket üzerinde belirtilen son kullanma
tarihine kadar stabildir. DOLABA KOYMAYIN VEYA DONDURMAYIN. Jelin
bozulmasını belirtebilir,1) jelin dondurulması kristal görünümü belirtir, 2) jelin
kuruması, çatlama ve kuruluğu veya 3)bakteriyal yada fungal kaynaklı agarozun
görülür kontaminasyonunu belirtir.
2. Yüksek Resolüsyon Boyası
Konsantre boya 15-30 derecede saklanmalıdır ve etiket üzerinde belirtilen son
kullanma tarihine kadar stabildir. Dilüe boya solüsyonu 15-30 derecede 6 ay stabildir.
Zayıf boyama performansı, boya solüsyonunun bozulduğunun göstergesidir.
SAĞLANMAYAN FAKAT GEREKSİNİLEN ÖĞELER
Katalog No.210200 Numune Aplikatör Ucu (1 x 10)
Katalog No.210300 Numune Aplikatör Ucu (5 x 10)
Katalog No.210100 Tek kullanımlık numune kapları (100)
Katalog No. 5141 High Resolution Protein Marker
Katalog No.3100 REP Prep
Boya arındırıcı solüsyon: 500 ml metanol ve 500 ml saf suyu karıştırın. 100 ml glisial
asetik asit ekleyin.
Sıkı kapatılmış şişede saklanır.
60-70 derece hava üfleme kapasiteli kurutma fırını.
Saf su
NUMUNE TOPLANMASI VE HAZIRLANMASI
Tercih edilen numune taze toplanmış plazma veya serumdur. Numuneler maksimum 48
saate kadar 2-6 derecede kapalı olarak saklanmalıdır. Plazma kullanımı beta ve gama
fraksiyonları arasında bir fibrinojen bandına sebep olur. Eski numunelerin kullanımı
transferrin bölgesinde C3 bandına göçe neden olacaktır.
İdrar ve CSF numuneleri aşağıda uygun konsantrasyon adımında kullanılabilir:
(Total protein=Toplam protein, Concetration Factor=Konsantrasyon faktörü)
Konsantrasyon ardından, ürine ve CSF numuneleri direk olarak jele uygulanır.
ADIM-ADIM PROSEDÜR
1. Numune tepsisine veya tek kullanımlık numune kaplarının uygun kuyusuna
numunenin 35 μl pipetleyin.
i) SAS- I Plus kullanıcıları: SAS-1 numune tepsisini kullanın. Aplikatör çekmecesinde
numune tepsisi dikkatlice yerleştirilir. Tepisinin pozisyonuna kuvvetlice itilmesi
sağlanır.
ii)SAS-3 kullanıcıları: SPIFE / SAS-3 numune tepsisi kullanın. Kullanılan numune
dikkatlice numune tepsisine yerleştirin. Tepsinin güvenli bir şekilde yerleştirilmiş
olduğundan emin olun.
2. Jel paketinden çıkarılır ve:
İ) SAS-1 Plus kullanıcıları: Sıcak havuza 400μL REP Prep boşaltılır. Sıcak havuza jel
yerleştirilir, agaroz toplanır, uygun elektrod kolları ile pozitif ve negatif uçları ayarlanır,
jelin altında hava kabarcığı oluşumunu önlemeye dikkat edin.
İİ)SAS-3 kullanıcıları: Havuza ayarlama klavuzunu yerleştirin ve 400μL REP prep
tankın merkezine boşaltın. Jeli agarozun toplandığı kuyuya yerleştirin, kılavuzu
kullanın, uygun elektrot kolları ile negatif ve pozitif uçları ayarlayın, jelin altında hava
kabarcığını oluşumunu önlemeye dikkat edin.
3.Jelin yüzeyi kurutma kağıdı C ile kurutulur, kurutma kağıdını atın.
4.i)SAS-1 Plus kullanıcıları: Elektrot kollarına elektrotlar eklenir böylece buffer blokları
ile temas ederler. JELİN ÜZERİNİ KAPATMAYIN.
ii)SAS-3 kullanıcıları: Elektrot kollarına elektrotlar eklenir böylece jel blokları ile
temasa gelirler.
5.Cihaz üzerindeki pozisyonda bir aplikatör ucu bir araya getirilerek yerleştirilir.(SAS-3
kullanıcıları: delik 8)
6. High Resolution elektroforezi yapılır:
i) SAS-1 Plus kullanıcıları: Elektroforez: 250 Volt, 12 dakika, 18°C, 1 aplikasyon
ii) SAS-3 kullanıcıları:
Adım
Zaman(dk:sn)
Sıcaklık(°C)
Voltaj
Diğer
Numune Yükleme
00:10
21
Hız 1
Numune Uygulama
00:10
21
Hız 1*
Elektroforez
02:00
18
Elektroforezler
250
* Yerleştirme 1 kullanılır
7. Elektroforezin ardından, Jel Blok Kaldırıcı kullanılarak her iki jel bloklarını ve
elektrotları çıkarın.
Jel boyama
a) SAS-2 (Oto-boyayıcı)
Adım
Boya
Boya arındırma
Solüsyon
Zaman(dk:sn)
Yüksek
15:00
Resolüsyon Boya
Boya arındırma 00:30
Solusyonu
Port
5
3
Sıcaklık(°C)
Kurutma
-
Boya arındırma
Yıkama
Boya arındırma 01:00
Solusyonu
Boya arındırma 01:00
Solusyonu
Saf su
01:00
Kurutma
-
Boya arındırma
10:00
05:00
65
3
3
1
65
b) Manuel
Boya, Boya arındırma ve yıkama adımları için bir boyama banyosu ve kurutma
adımları için 60...70°C de üfleme kapasiteli bir kurutma fırını kullanarak SAS-2 Otoboyayıcı için listelenen adımları izleyin.
Alternatif Boyama Prosedürleri
İki alternatif boyama protokolu kullanıcının istenen boyama gereksinimine bağlı olarak
kullanılabilir.
1. Yüksek Resolüsyon Boyama için Amino Siyah Boya yer değiştirmesi (Kat. No. 3048).
SADECE SERUM/PLAZMA NUMUNELERİ İÇİN. Aşağıda özetlenmiş boyama
protokolunu kullanın. Amino siyah boya koomassie boyadan daha hassastır, fakat daha
düzgün boyama kalitesi sağlar ve bant yoğunluğunda farklılıklar daha iyi bir kantitatif
değerlendirme verir.
2.Çift boyama tekniği. SADECE CSF VE ÜRİNE NUMUNELERİ İÇİN. Elektroforezden
sonra tamamlanmış jel ile amido siyah boyama yapın ve sonra tamamlanmış jel ile
koomassie boyama tekniği yapın. Çift boya tekniği idrar protein bantları ve CSF’de
oligoklonal bantların daha net görüntülenmesini sağlar.
NOT: Boya ve boya arındırıcı solüsyon metanol içerdiği için SAS-4’de jeli boyamayın.
SONUÇLARIN YORUMLANMASI
Jelin değerlendirmesi, her laboratuarda bu yöntem için üretilen normal paternlere karşı
yapılması önerilir. Belirli protein bantlarının varlığı veya yokluğu jelde görsel olarak
incelenecektir.
Şekil 1’de SAS-1 Plus Yüksek Resolüsyon Prosedür kullanılarak belirlenen ana plazma
proteinlerin göç paternlerini göstermektedir.
Şekil 1
Yüksek Resolsüyon protein elektroforez paternleri öncelikle normal bireyler elde edilen
bilinmeyen numunelerin bantlarının relatif yoğunluğu ile karşılaştırılarak yorumlanır.
Anormal serum protein paternlerinde en yaygın olanlardan biri spesifik olmayan
inflamatuar tepkisi olarak görülmektedir ve bu yanıt azalmış prealbumin, albümin ve
transferrin ile haptoglobin ve α1 –antitripsin’de bir artış ile karakterizedir. Genel bir
teşhis kurulmasında yararlı değil iken, tedavi için bir hastanın tepkisinin izlenmesi
yararlıdır.
Klinik olarak önemli varyasyonların diğer örnekleri şunlardır:
1. Transferrin bandının yüksekliği, demir düşük seviyesini gösterir.
2. Monoklonal proteinlerin varlığı, immun sistemde abnormalitesini gösterir.
3.Düşük haptoglobin, yüksek eritrosit turnover veya in-vitro hemoliz gösterir.
4. CRP Vvarlığı, akut enflamatuar yanıt gösterir.
5.Düşük prealbumin, albümin ve yaygın hypergammaglobulinaemia ile transferrin,
kronik inflamasyon, enfeksiyon veya antijenik stimülasyon gösterir.
6.Taze numunelerde düşük C3, tamamlayıcı tüketimi gösterir.
Yüksek Resolsüsyon protein elektroforezi ürin proteinin geniş bir açıklamasını elde
etmek için mükemmel bir analitik araçtır3,10. Normal ürine normalde albumin bir iz ve
bazen hafif bir transferrin bant içerir. Glomerüler-tür proteinüri genellikle geniş bir α1
bölgesinde ve transferrin β1 bölgedesinde hem α1-asit glikoprotein hem de a1antitrypsinden ve albuminin güçlü bandından oluşur. Serum patern, glomerul tarafından
tutulmuş proteinlerde artış ile bu proteinlerde düşüşler gösterir. Tübüler proteinüri’de
ürine paterni, genellikle α2-mikroglobulin nedeniyle α2 bölgesinde çift bant, zayıf bir
albümin bandından, β2-mikroglobulin nedeniyle orta-beta bölgesinde güçlü bir banttan
ve bazen serbest hafif zincirlerden dolayı gama bölgesinde yaygın arka plan
boyanmasından oluşur. Kronik böbrek hastalığı veya böbrek yetmezliği, hem tübüller
hem de glomerul oluşan hasardan kaynaklanan karışık tip paternine yol açabilir.
Belirli numunelerdeki bileşenlerin azalması veya yükselmesi veya olağandışı numune
bileşenlerinin tespiti daha fazla araştırma gerektirir. Tamamlanmış SAS-1 Plus Yüksek
Resolsüyon jeli süresiz bir zaman için stabildir.
PERFORMANS ÖZELLİKLERİ
Hassasiyet
Yöntem, tamamlanmış jel üzerinde ayrık bir bant gibi görünen proteinin en düşük
konsantrasyonu olarak belirlendi ve bant başına 60mg/L hassasiyete sahiptir.
Doğrusallık
Metodun doğrusallığı, jel performansı gibi densitometre özelliğinin bir fonksiyonudur.
Laboratuarda kullanılan densitometreye dayalı metodun doğrusallığının belirlenmesi her
müşteriye tavsiye edilir.
BİBLİYOGRAFİ
1. Alper, C.A. ‘Plasma Protein Measurements as a Diagnostic Aid’, N. Eng. J. Med., 1974; 291 :
287-290.
2. Tiselius, A. ‘A New Approach for Electrophoretic Analysis of Colloidal Mixtures’, Trans.
Faraday Soc., 1937; 33 : 524.
3. Laurell, C.B. ‘Composition and Variation of the Gel Electrophoretic Fractions of Plasma,
Cerebrospinal Fluid and Urine’ Scand. J. Clin. Lab. Invest., 1972; 29 (Suppl. 24) : 71.
4. Killingsworth, L.M. et al. ‘Protein Analysis, Deciphering Cerebrospinal Fluid Patterns’ Diag.
Med., 1980; March/April : 1-7.
5. Killingsworth, L.M. et al. ‘Protein Analysis, Finding Clues to Disease in Urine’ Diag. Med.,
1980; May/June : 69-75.
6. Killingsworth, L.M. ‘Clinical Applications of Protein Determinations in Biological Fluids Other
Than Blood’ Clin. Chem., 1982; 28(5) : 1093-1102.
7. Ritzmann, S.E and Daniels, J.C. ‘Diagnostic Proteinology: Separation and Characterization of
Proteins. Qualitative and Quantitative Assays’ in Laboratory Medicine, Harper & Row, Inc.,
Hagerstown, 1979.
8. Killingsworth, L.M. et al. ‘Protein Analysis’ Diag. Med., 1980; Jan/Feb : 3-15.
9. Killingsworth, L.M. ‘Plasma Protein Patterns in Health and Disease’ CRC Critical Reviews in
Clinical Laboratory Sciences, August 1979.
10. Peterson, P.A., Ervin, P.E. and Beggard, I. ‘Differentiation of Glomerular, Tubular and
Normal Proteinuria: determination of Urinary Excretion of α2-microglobulin, Albumin and Total
Protein’ J. Clin. Invest., 1969; 48 : 1189-1198.