elektroforez

ELEKTROFOREZ

Karışımda bulunan maddelerin tümü veya
bazıları iyonlaşabiliyorsa, karışım bir elektrik
alana konmak suretiyle bir dereceye kadar
ayrılabilir. Bilindiği gibi bir elektrik alanda
iyonlar hareket ederler. Bu hareketin hızı
iyonun cinsine, yüküne, alanın şiddetine
bağlıdır. Bu metot “elektroforez” olarak
nitelendirilir ki elektrolizin tamamlanmamış
şeklidir. Çünkü elektroforezde maddeler
elektrolizde olduğu gibi, kendilerini çeken
elektroda kadar gidemeyip yolları üzerindeki
bir noktada durdurulmaktadır.

İyonik bileşiklerin iyonlaşması, elektroforezin
temelini oluşturur. Zıt yükteki elektrodlara
doğru, farklı hızlarda hareket eden değişik
yükteki iyonlar elektriksel alanda birbirinden
ayrılırlar. Yüksüz, kovalans moleküller
elektriksel alandan etkilenmezler,
elektroforetik hareket göstermezler.
Elektroforezde Etki Eden Faktörler




İncelenen örneğin özelliği (yükü, boyutu,
şekli)
Elektrik alanının etkisi (voltaj, akım, direnç)
Tamponunun etkisi (bileşim, konsantrasyon,
pH)
Destek ortamın etkisi (Adsorbsiyon, elektroosmoz, moleküler ayırma)
Genel Teknikler


Alet ve ekipmanlar
Genel olarak gerekli ekipmanlar güç ve
elektroforez ünitesinden oluşmaktadır. Güç
ünitesi sabit doğru akım sağlamalı voltaj ve
akım çıkışının her ikisinide kontrol
edebilmelidir. Düşük voltaj elektroforezi için
ya sabit voltaj yada sabit akım sağlayabilen 0500 V ve 0-150 mA çıkışa sahip güç üniteleri
kullanılabilir.

Elektroforez ünitesi elektrotları, tampon
rezervuarlarını, elektroforez ortamı için bir
destek ve şaffaf güvenlik kapağını içerir.
Elektrotlar paslanmaz çelikten olabilir. Ancak
bunlar bazı tamponlar tarafından korozyona
uğratıldıklarından platin elektrotlar tercih
edilmektedir.
Destek ortamının seçimi:



Molekülleri boyutlarına göre de
ayırabildiğinde daha iyi bir elektroforetik
ayrım sağlar.
Kağıt, selüloz asetat, ince tabaka ortamı,blok
ortamı, jeller (nişasta, agar jeli, poliakrilamid
jeli) kullanılan destek ortamlarıdır.
En çok kullanılan ortam olan jellerden kısaca
bahsedersek:

Nişasta jeli: kısmi hidrolize olmuş nişasta
karışımının uygun bir tampon içerisinde
ısıtılması ve ardından soğutulması ile
hazırlanır. Bu işlem nişastanın amilopektin
bileşeninin dallanmış zincirinin birbirine
bağlanmasına ve yarı sert bir jel oluşturmasına
neden olur. Jeller kullanılmadan önce 0-4
°C’de saklanırlar.

Agar Jeli:Agar ucuz toksik olmayan abcak
kimyasal olarak iyi tanımlanmamış toz
karışımı agaroz ve amilopektin olmak üzere iki
galaktoz esaslı polimerdir.Agaroz 38 C dejel
oluşturur. Tamponda %1 (w/v) agar bulunması
durumunda iyi bir fiber yapı büyük gözenek
boyutları ve düşük sürtünme kuvveti gösterir.
Sonuçta elektroforez sırasında iyonların çok
hızlı hareket etmesini sağlarlar. Bu yüzden
makro moleküllerin ayrımını
kolaylaştırmaktadırlar.

Poliakrilamid jeli:Bu jeller kullanımdan hemen önce
çok toksik sentetik kimyasallarla hazırlanmaktadır.
Akrilamid monomeri bir cross linking ajan ile
çoğunlukla N’N’ methylenebisacrylamide, bir
katalizör varlığında kopolimerize edilir. Katalizör
olarak taze hazırlanmış amonyum persülfat başaltıcı
olarak yaklaşık aynı konsantrasyonda
dimetilaminopropionitril veya N’N’N’N’ tetrametilen
diamin (TEMED) kullanılır. En çok TEMED
kullanılır ve bunun oranındaki artış jelin
polimerizasyon hızını artırmaktadır.Deterjanlar,
substratlar, enzimler gibi diğer kimyasal maddeler de
jel oluşturmak için kullanılan tampona ilave
edilebilirler. Ayrıca jelin gözenekliliği akrilamid
monomerinin cross linking ajana oranıyla belirlenir.






Jel, hem toplam akrilamid monomerin ve
bis’in yüzdesi (T) ve hem de cross linking
ajanın toplam akrilamid içindeki yüzdesi (C)
olarak ifade edilebilir.
% T=(a+b)/m*100
% C=b/(a+b)*100
a: akrilamid (g)
b: cross linking ajan (g)
m:tampon hacmi (cm3)

T değeri % 3 ve 30 arasında değişen jeller
hazırlanabilir.Bu T değerlerine karşılık gelen gözenek
boyutları ise sırasıyla 0.2 ve 0.5 nm dir. Genel olarak
% 30 T içerikli jel molekül ağırlığı 104 dalton
civarında olan bileşiklerin ayrımı için uygun iken, %
3 T içerikli jel molekül ağırlığı 106 dalton civarında
olan bileşikleri ayırmak için uygun olmaktadır.

T (%)

3-5
5-12
10-15
15-



Optimum
Molekül Ağırlığı (dalton)
100 000 üzeri
20 000-150 000
10 000-80 000
15 000 altı


Poliakrilamid jel elektroforezi gerçekte özellikle
proteinlerin molekül ağırlıklarının belirlenmesinde
önemli bir tekniktir.
Makromoleküller ilk olarak yük kütle oranını
sağlamak için değişik maddelerle muamele edilirler.
Bundan sonra jelde gerçekleşen ayırma işlemi sadece
molekül ağırlığı doğrultusunda gerçekleşir. Bu olay
proteinlerin alt ünitelere ayrılmasına neden olan üre,
disülfit bağlarını kıran 2- merkapta etanol ve
çözünürlülüğe yardımcı olan ve daha önemlisi
polipeptit zinciri boyunca düzenli aralıklarla bulunan
iyonik gruplara bağlanan deterjan karışımı ile
proteinlerin muamele edilmesiyle gerçekleştirilir.
Denatürasyonun önemli olmadığı durumlarda
kuvvetli iyonik deterjanlar örneğin sodyum dodesil
sülfat (SDS) kullanılır.

Proteinlerin molekül ağırlığının
belirlenmesinde kullanılan bu metot eğer bir
karışım üzerinde çalışılacak ise her bir
proteinin alt ünite yapısının ve migrasyon
karakteristiklerinin önceden bilinmesi
gerekmektedir. Karışımdaki her bir protein
standart olarak sağlanmalı ve test karışımı
belirli şartlar altında bireysel olarak
ayrılmalıdır. Bu en iyi şekilde plaka jeli
kullanılarak gerçekleştirilir.


Elektroforez Teknikleri
Elektroforez işleminin gerçekleştirildiği
ortama, kullanılan tampona, uygulanış şekline
kullanılan voltaja boyuta göre
sınıflandırabiliriz. Ancak bunları birbirlerinden
kesin sınırlarla ayırmak mümkün değildir.















En yaygın olarak kullanılanlar:
1.Basit elektroforez
2.Üre jeli elektroforezi
3.SDS jeli elektroforezi
4.Gradient Jel elektroforezi
5.Sürekli olmayan elektroforez sistemi
6.Yüksek voltaj elektroforezi
7.İsoelektrik fokusing elektroforezi
8.İsotakoforez
9.İki boyutlu elektroforez
10.Afinite elektroforezi
11.İmmuno-elektroforezi
a. klasik
b. roket
c. ikiyönlü


Basit Elektroforez:
Ayrılacak örneğin stabil ve doğal formda
bulunduğu pH değerine sahip olan tampon
kullanılır.Burada proteinlerin yük ve boyut
özelliklerinin her ikisinden de
yararlanılmaktadır. Kullanılan tamponun pH’sı
proteinlerin büyük bir kısmının negatif yüklü
olduğu ve bundan dolayı da anoda hareket
ettiği hafif alkali olan 8-9 değeri arasındadır.


Üre Jeli Elektroforezi
Düşük iyonik güçte çözünmez durumda olan
proteinler için yararlıdır. Bu nedenle 6-8 M üre
konsantrasyonunda proteinler denatüre
edilerek elektroforez gerçekleştirilir.
Genellikle polipeptit zincirleri arasında disülfit
bağı oluşumunu önlemek için bir miktar
merkaptaetanol ilave edilir.


SDS(sodyum dodesil sülfat) jeli elektroforezi:
Düşük iyonik güçte çözünmez durumda olan
proteinler için kullanılabilir. Günümüzde bütün
protein tipleri için en yaygın şekilde kullanılan
yöntemdir. Bu yöntem proteinlerin sodyum
dodesil sülfat deterjanı ile denatürasyonunu
içermektedir. Bu yöntem sadece relatif
mobilitelere göre değil ayrıca molekül
boyutlarına görede ayrım gerçekleştirdiği için
çok yaygın kullanım alanı bulmuştur.



Dodesil sülfat proteinlere kuvvetli bir şekilde bağlanır.% 0.1
dodesil sülfat konsantrasyonu polipeptit zincirini doyurmak
için yeterlidir. Uygun şartlarda bu teknikle molekül ağırlıkları
% 1 oranında farklılıkları tespit edilebilir.
Gradient Jeller
SDS metodu gibi molekülleri sadece boyutlarına göre ayırır.
Burada poliakrilamid jelin konsantrasyonu üste % 3 ve altta ise
% 30’a kadar değişir. Yüksek pH’ya sahip bir tampon
kullanılarak proteinlerin büyük bir kısmının anoda doğru
hareket etmeleri sağlanır. Bu sırada büyük moleküller
neredeyse başlangıç noktasında, küçük moleküller ise % 25
akrilamid konsantrasyonuna kadar hareket ederler. Akım
sistemde artık hareketin görülmediği ana kadar uygulanır.



Sürekli olmayan (disk) elektroforez :
Disk elektroforez deyimi, örnek iyonlarının küçük gözenek
boyutlu akrilamid jele gelmeden önce büyük gözenek boyutlu
ve farklı pH’da tamponlanmış jelde çok ince keskin bantlar
halinde konsantre olmasından kaynaklanır.
Ayırma jeli için monomerler ve katalizörler önce tampon
içerisinde karıştırılır. Karışım vakum altında bekletilerek gazı
alınır. Ve silindirik tüplere doldurulur. Polimerizasyon
işleminden önce karışımın üzeri tampon veya destile su ile
şırınga veya kapiler tüp kullanılarak dikkatlice kaplanır.
Böylece jelin üst yüzeyi düzgün bir durum alır. Polimerizasyon
tamamlandıktan sonra üst tabakaboşaltılır ve stacking jel
ayırma jelinin üzerine boşaltılır.

Tüpler alt rezervuardaki tampon içerisine
dalmış durumda iken üst jel ile aynı pH’daki
ya büyük gözenekli örnek jelinde ya da daha
yaygın olarak yoğun sakkaroz çözeltisi
içerisinde bulunan örnek jele yüklenir. Daha
sonra örnek tampon ile kaplanır. Elektroforez
sabit akım altında gerçekleştirilir.


Yüksek Voltaj elektroforezi:
Düşük moleküler ağırlıklı bileşikler düşük
voltaj kağıt elektroforezi ile ayrıldığında
önemli diffizyon meydana gelir. Daha iyi ve
hızlı bir ayrım (10-60 dak) büyük ölçüde daha
yüksek voltaj kullanılarak sağlanabilir. 10000
Volt ve 500 mA’e kadar güç ve 200 V/cm
potansiyel gradienti oluşturabilen yüksek
voltaj üniteleri temin edilebilmektedir. Ancak
yüksek voltaj ünitesi o kadar yüksek ısı üretir
ki direk soğutma sistemi gerektirmektedir.


İsoelektrik Fokusing:
pH aralığı örneğin isoelektrik noktasına göre seçilir.
İsoelektrik noktasının altındaki bir pH bölgesinde
bulunan maddeler pozitif yüklenecek ve katota doğru
hareket edecekler, bu yöndeki hareketleri devam
ederken isoelektrik noktaya ulaşacaktır. Sonuçta
anfoterik maddeler dar bantlar halinde sabitleşecektir.
Ayrım dikey tüpler veya yatay plaka jellerde
gerçekleştirilebilir. Kullanılacak jelin mümkün
olduğu kadar az sürtünme direnci oluşturması gerekir.


Eğer ayrılacak proteinlerin tamamı küçük ise
% 5-6’lık poliakrilamid gel uygun olabilir.
Aksi takdirde % 2 (w/v) agaroz jeli çok daha
uygundur.
İsotakoforez:Bir pH gradientinde
gerçekleştirilirken her bir komponentin
yerleştiği noktalarda farklı elektrik alanı
uygulanır. Böylece bütün bileşenler aynı hızda
ama farklı mobilitede hareket ederler.
İnorganik iyonlarda dahil olmak üzere bütün
yüklü maddeler isotachoforez ile ayrılabilirler.


İki Boyutlu Elektroforez
Bu jel analiz tekniği geniş kullanım alanı
bulmaya başlayan bir tekniktir. Elektrofocusing gibi bir prosedür ile hazırlanmış
protein bantlarını içeren örnek çubukları jelin
bir ucundan uygulanır ve SDS içeren jel
içerisinde ayrım ilk boyutta uygulanan
isoelektrik noktaya ve ikinci boyutta ise
moleküler ağırlığa bağlı olarak gerçekleşir.




Afinite Elektroforezi:
Proteinler immobilize ligant içeren jel üzerinde
elektroforeze tabi tutulurlar.
İmmuno-elektroforez:
Bu teknikte antikorları içeren jel üzerinde antijenlerin
elektroforetik migrasyonu ile gerçekleştirilir. Burada
kullanılan tamponlar ve pH değerleri genellikle öyle
seçilirki sadece antijen migre olurken, antikorlar ya
hiç yada çok yavaş migre olurlar. Bu nedenlede
elektroforez işlemi boyunca tüm jel yüzeyinde
dağılmış olarak bulunurlar. Bu teknikte daha çok
agaros jeli kullanılmaktadır.