tc ege ünġversġtesġ sağlık bġlġmlerġ enstġtüsü
advertisement
T.C. EGE ÜNĠVERSĠTESĠ SAĞLIK BĠLĠMLERĠ ENSTĠTÜSÜ ĠN VĠTRO STRES MODELĠNDE NĠKOTĠNĠN GLUKOKORTĠKOĠD ĠLE AKTĠVE OLAN GENLERĠN EKSPRESYONUNA OLAN ETKĠSĠNĠN ARAġTIRILMASI Sinirbilim Anabilim Dalı Programı Yüksek Lisans Tezi Hasibe ġAHĠN ĠZMĠR 2015 T.C. EGE ÜNĠVERSĠTESĠ SAĞLIK BĠLĠMLERĠ ENSTĠTÜSÜ ĠN VĠTRO STRES MODELĠNDE NĠKOTĠNĠN GLUKOKORTĠKOĠD ĠLE AKTĠVE OLAN GENLERĠN EKSPRESYONUNA OLAN ETKĠSĠNĠN ARAġTIRILMASI Sinirbilim Anabilim Dalı Programı Yüksek Lisans Tezi Hasibe ġAHĠN DANIġMAN Prof. Dr. Ersin Oğuz KOYLU ĠZMĠR 2015 i DEĞERLENDĠRME KURULU ÜYELERĠ Adı Soyadı Ġmza BaĢkan : Prof.Dr.Ersin Oğuz KOYLU ………………. (DanıĢman) Üye : Prof.Dr. Nuran EKERBĠÇER ............................ Üye : Doç.Dr. Oğuz GÖZEN ............................ Yedek Üye : Prof.Dr. Lütfiye KANIT ........................... Yedek Üye : Prof.Dr. Burcu BALKAN ............................ Yüksek Lisans Tezinin kabul edildiği tarih: ii ÖNSÖZ Yüksek lisans öğrenimim süresince her türlü yardımı sağlayan, bilgi, tecrübe ve güler yüzü ile çalıĢmama ıĢık tutan danıĢmanım Sayın Prof. Dr. Ersin KOYLU‟ya, Tez çalıĢmam süresince laboratuvar çalıĢmalarımda tüm bilgi birikimini benimle paylaĢan sayesinde pek çok konuda bilgi edindiğim, deneylerin yürütülmesi, analizlerin yapılması ve değerlendirilmesi konularında beni yönlendiren, tez süresince değerli vaktinin çoğunu bize ayıran, sadece teknik konularda değil hayata karĢı farklı bakıĢ açıları kazanmamı sağlayan Sayın Doç. Dr. Oğuz GÖZEN‟e, Bölüme kaydolduğum andan itibaren her türlü konuda yardımını esirgemeyen, bilimsel desteği ve sağladığı olanaklar için hocam Sayın Prof. Dr. Lütfiye KANIT‟a, Tez çalıĢmamda kullandığım hücreleri temin etmemize yardımcı olan Ġstanbul Teknik Üniversitesi‟nden Prof. Dr. Arzu KARABAY KORKMAZ ve doktora öğrencisi Ece SELÇUK ġAHĠN‟e, Tezimin yazım aĢamalarında fikirleri ve yardımlarıyla yanımda olan arkadaĢlarım Ar. Gör. Alper ERDOĞAN ve Ar. Gör. Meltem KARATAġ‟a, Yüksek lisans öğrenimim süresince her zaman yanımda olan arkadaĢım Müzeyyen UĞUR‟a, tezimin hazırlanması sırasında beni cesaretlendiren ve manevi destek sağlayan değerli arkadaĢlarım Elif ENGĠN, Tuğçe AKGÜL, Fatma TUNCER‟e Ġzmir‟deki ailem Fizyoloji Anabilim Dalı ailesine ve aileme TeĢekkürlerimi sunarım. ĠZMĠR, Haziran 2015 Hasibe ġahin iii ÖZET Nikotin, merkezi sinir sistemi üzerindeki etkileri ile HPA (HipotalamoHipofizer-Adrenal) eksenini stimüle ederek hipofiz bezinden ACTH (Adrenokortikotropik hormon) salgılanmasına sebep olmaktadır. ACTH, adrenal korteksten bir glukokortikoid olan kortizol salınmasını sağlamaktadır. Glukokortikoidler, hücrede etkilerini intrasellüler glukokortikoid reseptörlerine (GR) bağlanarak göstermektedir. Kortizol bağlanmasından sonra dimerize olan GR nükleusa geçmekte ve DNA üzerinde bulanan “Glukokortikoid yanıt elementi (GRE)” bölgelerine bağlanarak gen transkripsiyonunda değiĢikliklere neden olmaktadır. GR‟de bulunan bazı serin grupları fosforile olabilmekte ve fosforilasyon durumu GR‟ünün nükleusa geçiĢini ve dolayısıyla gen anlatımını etkilemektedir. GR fosforilasyonunda JNK (c-Jun N-terminal kinaz) ve CDK5 (siklin bağımlı kinaz 5) görev almaktadır. Bu çalıĢmanın amacı, in vitro stres modelinde, nikotinin glukokortikoid reseptörü fosforilasyonuna olan etkisinin ve varsa bu etkinin nikotinik asetilkolin reseptörleri üzerinden olup olmadığının araĢtırılmasıdır. Proje kapsamında ayrıca nikotinin, eğer mevcutsa, GR fosforilasyonu üzerine olan etkisinin JNK ve CDK5 üzerinden olup olmadığı araĢtırılmıĢtır. Stres modeli oluĢtumak için kullanılan deksametazonun konsantrasyonu arttıkça incelenen genlerde gen anlatım seviyelerinde artıĢ görülmüĢtür. Nikotinin düĢük konsantrasyonda uygulanmasında tüm genlerde anlamlı artıĢ gözlenmiĢtir. SGK1 ve KLF11 genlerinde deksametazon ve nikotinin birlikte uygulamasında gen anlatımlarında anlamlı artıĢ gözlenmiĢtir. Bu artıĢ CDK5 inhibitörü kenpaullone eklenmesiyle SGK1 gen anlatımındaki artıĢ ortadan kalkmazdan JNK inhibitörü SP600125‟in eklenmesiyle SGK1 gen anlatımındaki artıĢ ortadan kalkmıĢtır. Anahtar Kelimeler: Stres; nikotin; glukokortikoid; glukokortikoid reseptörü; nikotinik asetilkolin reseptörü; gerçek zamanlı PCR iv ABSTRACT Nicotine stimulates HPA (Hypothalamo-Pituitary-Adrenal) axis through its central nervous system effects and causes ACTH (Adrenocorticotropic hormone) release from pituitary gland. ACTH induces the release of cortisol, a glucocorticoid, from adrenal cortex. Glucocorticoids show their effects on cells by binding to intracellular glucocorticoid receptors (GR). After cortisol binding, dimerized GRs enter the nucleus and bind “Glucocorticoid Response Element (GRE)” regions on DNA and cause changes in gene transcription. Certain serine groups on GR can be phosphorylated and their phosphorylation state can affect GR entry into nucleus and thus gene transcription. JNK (c-Jun N-terminal kinase) and CDK5 (Cyclin Dependant Kinase 5) phosphorylate GR. The aim of this study is to demonstrate the possible effect of nicotine on glucocorticoid receptor phosphorylation and to show whether this effect is via nicotinic acetylcholine receptors in an in vitro stress model. Within the scope of this project, we further investigated the role of JNK and CDK5 on the possible nicotine-induced changes in GR phosphorylation. Dexamethasone is used for the stress model and with its increased concentrations there was an inrease in transcription of studied genes. Nicotine administration in low doses resulted in significant increase in transcription of all genes analysed. Transcription of SGK1 and KLF11 genes increased significantly with concurrent use of dexamethasone and nicotine. This increase in SGK1 gene transcription was not prevented by the addition of CDK5 inhibitor kenpaullone, whereas the administration of JNK inhibitor SP600125 prevented an increase in SGK1 transcription. Keywords: Stress; nicotine; glucocorticoid; glucocorticoid receptor; nicotinic acetylcholine receptor; real-time PCR v Ġçindekiler ÖNSÖZ ....................................................................................................................... iii ÖZET........................................................................................................................... iv ABSTRACT ................................................................................................................. v ġEKĠLLER LĠSTESĠ ................................................................................................. vii TABLO LĠSTESĠ ........................................................................................................ ix KISALTMALAR ......................................................................................................... x 1.GĠRĠġ VE AMAÇ ..................................................................................................... 1 2. GENEL BĠLGĠLER ................................................................................................. 2 2.1. STRES ................................................................................................................... 2 2.1.1. STRES YANITI ................................................................................................. 2 2.1.1.1. KORTĠZOL SENTEZĠ ................................................................................... 4 2.1.2. GLUKOKORTĠKOĠDLER ................................................................................ 6 2.1.2.1.GLUKORTĠKOĠDLER ĠLE ĠLĠġKĠLĠ BAZI HEDEF GENLER ................... 9 2.1.3. GLUKOKORTĠKOĠD RESEPTÖRLERĠ.......................................................... 9 2.1.3.1.GLUKOKORTĠKOĠD RESEPTÖRÜ TRANSKRĠPSĠYONEL AKTĠVASYONU ....................................................................................................... 11 2.1.3.2. GLUKOKORTĠKOĠD RESEPTÖRÜ TRANSKRĠPSĠYONEL REPRESYON ............................................................................................................ 11 2.1.4. CDK5 ............................................................................................................... 12 2.1.5. JNK .................................................................................................................. 15 2.1.6. GLUKOKORTĠKOĠD ĠLE ĠLĠġKĠLĠ GENLER ............................................. 16 2.1.6.1. BCL2L .......................................................................................................... 16 2.1.6.2.SGK1 .............................................................................................................. 17 2.1.6.3. GILZ .............................................................................................................. 18 2.1.6.4.KLF11 ............................................................................................................ 19 2.1.6.5.NFKB1 ........................................................................................................... 19 2.1.6.6. G6PD ............................................................................................................. 20 2.1.7. GLUKOKORTĠKOĠDLERĠN FĠZYOLOJĠK ETKĠLERĠ ............................... 20 2.1.8. GLUKOKORTĠKOĠDLERĠN GERĠ BĠLDĠRĠM ETKĠLERĠ ......................... 22 2.2. NĠKOTĠN ............................................................................................................ 22 2.2.1. NĠKOTĠNĠN YAPISI ....................................................................................... 22 2.2.2. NĠKOTĠNĠN ETKĠ MEKANĠZMASI ............................................................. 25 2.2.3. NĠKOTĠNĠK ASETĠLKOLĠN RESEPTÖRLERĠ ............................................ 25 2.2.4.NĠKOTĠNĠK ASETĠLKOLĠN RESEPTÖRÜ KODLAYAN GENLER .......... 27 2.2.4.1. CHRNA3 ....................................................................................................... 28 iv 2.2.4.2. CHRNA5 ....................................................................................................... 29 2.2.4.3. CHRNA7 ....................................................................................................... 29 2.2.4.4.CHRNB2 ........................................................................................................ 30 2.2.4.5.CHRNB4 ........................................................................................................ 30 2.2.5. NĠKOTĠNĠN ETKĠLERĠ .................................................................................. 30 2.3. STRES VE NĠKOTĠN ......................................................................................... 30 2.4. SH-SY5Y HÜCRE HATTI ................................................................................. 32 2.4.1.RETĠNOĠK ASĠT .............................................................................................. 34 2.5. POLĠMERAZ ZĠNCĠR REAKSĠYONU ............................................................ 36 2.5.1.GERÇEK ZAMANLI (REAL-TİME) PCR ....................................................... 37 2.5.1.1.DNA‟YA ÖZGÜL OLMADAN BAĞLANAN BOYALARLA GENEL BELĠRLEME ............................................................................................................. 40 2.5.1.2.DNA‟YA ÖZGÜL OLARAK BAĞLANAN PROBLARLA BELĠRLEME 41 3. GEREÇ VE YÖNTEM .......................................................................................... 44 3.1. KOLLAJEN KAPLAMA.................................................................................... 45 3.2. HÜCRE KÜLTÜRÜ ........................................................................................... 45 3.2.1. HÜCRELERĠN AÇILMASI ............................................................................ 46 3.2.2. HÜCRELERĠN SAYILMASI.......................................................................... 46 3.2.3. HÜCRELERĠN PASAJLAMASI .................................................................... 47 3.2.4. HÜCRELERDEN STOK ALINMASI ............................................................ 47 3.2.5. HÜCRELERĠN FARKLILAġTIRILMASI ..................................................... 48 3.3. ĠLAÇ UYGULAMASI ....................................................................................... 48 3.3.1. ALL-TRANS RETĠNOĠK ASĠT ...................................................................... 48 3.3.2. DEKSAMETAZON ......................................................................................... 49 3.3.3.NĠKOTĠN .......................................................................................................... 49 3.3.4.MEKAMĠLAMĠN ............................................................................................. 49 3.3.5. KENPAULLONE (CDK5 ĠNHĠBĠTÖRÜ) ...................................................... 49 3.3.6. SP600125 (JNK ĠNHĠBĠTÖRÜ) ...................................................................... 49 3.4. DENEY GRUPLARI .......................................................................................... 49 3.5. RNA ĠZOLASYONU.......................................................................................... 50 3.6. RNA AGAROZ JEL ELEKTROFOREZĠ .......................................................... 51 3.7. cDNA SENTEZĠ ................................................................................................. 52 3.8. PRĠMER TASARIMI.......................................................................................... 52 3.9. POLĠMERAZ ZĠNCĠR REAKSĠYONU ............................................................ 54 3.9.1. SYBR Green I .................................................................................................. 54 3.9.2. TaqMan Probları .............................................................................................. 56 3.10. ĠSTATĠSTĠK ..................................................................................................... 56 v 4. BULGULAR .......................................................................................................... 57 4.1. FARKLILAġTIRMA .......................................................................................... 57 4.2. RNA AGAROZ JEL ELEKTROFOREZĠ .......................................................... 57 4.3. PCR ..................................................................................................................... 58 4.3.1. SYBR GREEN I............................................................................................... 58 4.3.2. Deney Gruplarına Göre Genlerde Ekspresyon Seviyeleri Sonuçları ............... 61 4.3.3. Seçilen Genlere Göre Deney Gruplarında Ekspresyon Seviyeleri Sonuçları .. 70 4.3.3.1. BCL2L .......................................................................................................... 70 4.3.3.2. GILZ .............................................................................................................. 73 4.3.3.3.KLF11 ............................................................................................................ 75 4.3.3.4.NFKB1 ........................................................................................................... 78 4.3.3.5.SGK1 .............................................................................................................. 80 5. TARTIġMA ........................................................................................................... 83 6. SONUÇ VE ÖNERĠLER ....................................................................................... 87 8. KAYNAKLAR ...................................................................................................... 88 8.ÖZGEÇMĠġ ............................................................................................................ 92 vi ġEKĠLLER LĠSTESĠ ġekil 1: Hipotalamus-Hipofiz-Adrenokortikal Eksen (HPA) ...................................... 3 ġekil 2: Adrenal bez[4] ................................................................................................ 5 ġekil 3: Kortizol sentezi ............................................................................................... 6 ġekil 4: GR proteini 3 domaini .................................................................................. 10 ġekil 5: Kenpaullone .................................................................................................. 14 ġekil 6: SP600125 kimyasal yapısı ............................................................................ 16 ġekil 7: Nikotinin kimyasal yapısı ............................................................................. 23 ġekil 8: Asetilkolinin kimyasal yapısı........................................................................ 24 ġekil 9: Mekamilaminin kimyasal yapısı ................................................................... 24 ġekil 10: Nikotinik reseptör yapısı (A) Pentamerik yapı; kas tipi, nöronal hetomerik a4b2 ve a3b3b4a5 tipleri ve homomerik a7,a8 ve a9 nikotinik reseptörler bağlanma bölgesi sayısı ve alt birim stokiyometrisi. (B) Nikotinik reseptör sekansında hidrofilik ektraselüler ACh bağlanma bölgesini içeren domain, 4 transmembran segmenti, M1±M4, intraselüler hidrofobik domain ve küçük C terminal domaini. Kutu içinde belirtilen M2 transmembran segmenti iyon kanalı hattıdır. ................... 26 ġekil 11: Ġnsan karyotipi. Nikotinik asetilkolin reseptörler kodlayan genler ve lokasyonları tipik insan karyoripinde gösterilmiĢtir. ................................................. 28 ġekil 12: : Gerçek zamanlı PCR döngüsündeki fazlar ............................................... 37 ġekil 13: A: SYBR Green, B: Taqman, C: Molecular Beacons; D: LightCycler ...... 40 ġekil 14: SYBR Green yöntemi[55] .......................................................................... 41 ġekil 15: Taqman yöntemi[55]................................................................................... 43 ġekil 16: SH-SY5Y hücreleri görüntüsü A:10X retinoik asit, B: 20X retinoik asit, C: 40X retinoik asit, D: 10X kontrol, E: 20X kontrol. ................................................... 57 ġekil 17: RNA jel elektroforez görüntüsü .................................................................. 58 ġekil 18: Sybr green PCR optimizasyonu erime eğrileri ........................................... 59 ġekil 19: SH-SY5Y hücrelreinde farklılaĢtırılmıĢ ve farklılaĢtırılmamıĢ hücre kültürlerinde nikotinik asetilkolin reseptör gen anlatımları ....................................... 60 ġekil 20: FarklılaĢtırılmıĢ ve farklılaĢtırılmamıĢ hücrelerde bazal ektresyon sonuçları .................................................................................................................................... 60 ġekil 21: FarklılaĢtırılmıĢ SH-SY5Y hücre kültürlerine deksametazon uygulaması . 61 ġekil 22: FarklılaĢtırılmıĢ SH-SY5Y hücre kültürlerine nikotin uygulaması ........... 62 ġekil 23: FarklılaĢtırılmıĢ SH-SY5Y hücre kültürlerine farklı konsantrasyonlarda deksametazon + nikotin uygulaması .......................................................................... 64 ġekil 24: FarklılaĢtırılmıĢ SH-SY5Y hücre kültürlerine farklı konsantrasyonlarda deksametazon + nikotin + mekamilamin uygulaması ................................................ 66 ġekil 25: FarklılaĢtırılmıĢ SH-SY5Y hücre kültürlerine farklı konsantrasyonlarda deksametazon + nikotin + SP600125 uygulaması ..................................................... 68 ġekil 26: FarklılaĢtırılmıĢ SH-SY5Y hücre kültürlerine farklı konsantrasyonlarda deksametazon + nikotin + kenpaullone uygulaması .................................................. 69 ġekil 27: FarklılaĢtırılmıĢ SH-SY5Y hücrelerinde deney gruplarına göre BCL2L gen ekspresyon seviyeleri ................................................................................................. 72 ġekil 28: FarklılaĢtırılmıĢ SH-SY5Y hücrelerinde deney gruplarına göre GILZ gen ekspresyon seviyeleri ................................................................................................. 74 vii ġekil 29: FarklılaĢtırılmıĢ SH-SY5Y hücrelerinde deney gruplarına göre KLF11 gen ekspresyon seviyeleri ................................................................................................. 77 ġekil 30: FarklılaĢtırılmıĢ SH-SY5Y hücrelerinde deney gruplarına göre NFKB1 gen ekspresyon seviyeleri ................................................................................................. 79 ġekil 31: FarklılaĢtırılmıĢ SH-SY5Y hücrelerinde deney gruplarına göre SGK1 gen ekspresyon seviyeleri ................................................................................................. 82 viii TABLO LĠSTESĠ Tablo 1: PCR yönteminde kullanılan primerler ....................................................... 533 Tablo 2: SYBR Green PCR KoĢulları ...................................................................... 555 Tablo 3: Taqman PCR için gerekli olan bileĢikler ve miktarları ............................. 566 Tablo 4: Taqman PCR koĢulları............................................................................... 566 ix KISALTMALAR 6-OHDA 6- hidroksi dopamin µM Mikromolar ACh Asetilkolin AChBP Asetilkolin bağlanma proteini AChRs Asetilkolin reseptörü ACTH Adrenokortikotropik hormon ADH Antidiüretik Hormon AF Aktivasyon fonksiyon domaini AP1 Aktivatör protein AVP Arjinin-vazopresin BCL2L BCL2-like 1 BDNF Beyin kaynaklı nörotrofik faktör cAMP Siklik adenozin monofosfat CAT Kolin asetil transferaz CDI Siklin bağımlı kinaz inhibitörleri CDK Siklin bağımlı kinaz cDNA Tamamlayıcı DNA ChAT Kolin asetil transferaz CHRNA3 Nikotinik kolinerjik reseptör, alfa 3 CHRNA5 Nikotinik kolinerjik reseptör, alfa 5 CHRNA7 Nikotinik kolinerjik reseptör, alfa 7 CHRNB2 Nikotinik kolinerjik reseptör, beta 2 CHRNB4 Nikotinik kolinerjik reseptör, beta 4 CO2 Karbondioksit CRH Kortikotropin salgılatıcı hormon D2R ve D3R Dopamin reseptör 2 ve 3 alt tiplari DAT Dopamin taĢıyıcı DBD DNA bağlanma bölgesi DEPC Dietilpirokarbonat DMEM Dulbecco's Modified Eagle's medium DMSO Dimetil sülfoksit DNA Deoksiribonükleik asit x dNTP Deoksinükleotitfosfatlar DTT Ditiyotretol EDTA Etilendiamin tetraasetik asit EtBr Etidyum bromür FKBP Ġmmunofilin FRET Floresans rezonans enerji transferleri g g kuvveti veya relatif santrifüj kuvveti G6PD Glukoz 6 Fosfat Dehidrogenaz GC Glukokortikoid GILZ Glukokortikoid ile uyarılmıĢ lösin fermuarı GM-CSF Granulositmakrofaj koloni uyarıcı faktör GR Glukokortikoid reseptörü GRE Glukokortikoid yanıt elementi GSK-3β Glikojen sentaz kinaz-3 beta HAT Histon asetilaz HDAC Histon deasetilaz HPA Hipotalamus-Hipofiz-Adrenokortikal Eksen hsp Isı Ģoku proteinleri JNK c-Jun N-terminal kinaz KLF11 Kruppel-like faktor 11 LBD Ligand bağlanma bölgesi LDL Lipoprotein mAChR Muskarinik asetilkolin reseptörü MAP2 Mikrotubul iliĢkili protein 2 MAPK Mitojen-aktive edici protein kinaz MC Mineralokortikoid MEM NEAA Minimum essential medium nonessential amino acid Mg+2 Magnezyum MgCl2 Magnezyum klorür MKK Mitojen aktive edici kinaz kinaz MKP MAP kinaz fosfataz MPP+ 1-metil-4-fenil piridinyum iyonu MPTP 1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetrahidropiridin MR Mineralokortikoid reseptörleri xi nAChR Nikotinik asetilkolin reseptörü NeuN Nöronal spesifik nuklear protein. NFKB1 Nükleer faktör Kapa B NF-κb Nükleer faktör kapa B NGF Nöron büyüme faktörü nM Nanomolar NSE Nöron spesifik enolaz NTD N terminal bölge PCNA Proliferasyon hücre nuklear antijeni PCR Polimeraz zincir reaksiyonu PEPCK Fosfoenolpirüvat karboksikinaz pH Hidrojenin gücü PLA2 Sitoplazmik fosfolipaz A2 POMC Proopiomelanokortin PVN Paraventriküler nükleus RA Retinoik asit RNA Ribonükleik asit SAP-97 Sinaptik bağlantılı protein 97 SAPK Stres aktiviteli protein kinaz SGK1 Serum/glukokortikoid düzenleyici kinaz SH-SY5Y Nöroblastoma hücre hattı SLPI Serum lökoprotaz inhibitör TAE Tris asetat EDTA TH Tirozin hidroksilaz Tm Erime sıcaklığı TPA 12-O-tetradekanoyilforbol 13-asetat U Enzim birimi UV Ultraviyole VDAC DıĢ mitokondrial membran kanalı VMAT Veziküler monoamin transporter α-BGT α-bungarotoksin xii 1.GĠRĠġ VE AMAÇ Stres, yaĢamımızın kaçınılmaz bir parçasıdır. Stres pozitif etkilere sahip olabildiği gibi negatif etkilere de sahip olabilmektedir. Yüksek düzeyde olmayan ve kontrol edilebilen stres kiĢinin yaĢamına heyecan katarak baĢarılı olmasını sağlarken, yoğun düzeydeki stres hastalıklara yatkınlığı artırabilmektedir. Sigara kullanımı ile stres arasındaki iliĢki uzun zamandır tartıĢma konusu olmuĢtur. Bilimsel sonuçlar sigara bağımlılığın stresi arttırdığını göstermesine rağmen, sigara içenler sigaranın streslerini azalttığını söylemektedir. Tütün kullanımına bağlı olarak ortaya çıkan hastalıkların neden olduğu ölümler, dünyada önlenebilir ölüm nedenleri arasında ilk sıralarda yer almaktadır. Tütün ürünlerinin kullanımının yaygınlığının arkasında yatan en önemli neden, bu ürünlerin içinde yüksek derecede bağımlılık yapıcı etkileri ile bilinen nikotinin bulunmasıdır. Nikotin, dopamin adlı norötransmitterin salgılanmasına neden olur. Dopamin içiciye haz verir, konsantrasyonunu artırır, enerji düzeyini yükseltir. Bu nörotransmiterlerin salınması mutluluk hissine neden olur. Uzun süre nikotin kullananımında beyin normal fonksiyonlarını yerine getirebilmek için nikotine ihtiyaç duyar ve böylece kiĢi bu etkileri yaĢayabilmek için daha fazla sigara tüketmeye baĢlar. Nikotin, merkezi sinir sistemi üzerindeki etkilerinin yanı sıra HPA (Hipotalamo-Hipofizer-Adrenal) eksenini stimüle ederek hipofiz bezinden ACTH (Adrenokortikotropik hormon) salgılanmasına sebep olmaktadır. ACTH, adrenal korteksten bir glukokortikoid olan kortizol salınmasına neden olmaktadır. Glukokortikoidler, hücrede etkilerini intrasellüler glukokortikoid reseptörlerine (GR) bağlanarak göstermektedir. Kortizol bağlanmasından sonra dimerize olan GR nükleusa geçmekte ve DNA üzerinde bulanan “Glukokortikoid yanıt elementi (GRE)” bölgelerine bağlanarak gen transkripsiyonunda değiĢikliklere neden olmaktadır. GR‟de bulunan bazı serin grupları fosforile olabilmekte ve fosforilasyon durumu GR‟ünün nükleusa giriĢini etkilemektedir. Bu çalıĢmanın amacı, in vitro stres modelinde nikotinin, glukokortikoid ile aktive olan genlerin ekspresyonuna olan etkisinin ve varsa bu etkinin nikotinik asetilkolin reseptörleri üzerinden ya da GR fosforilasyonu üzerinde etkisi olan JNK (c-Jun N-terminal kinaz) ve CDK5 (Siklin bağımlı kinaz) üzerinden olup olmadığının araĢtırılmasıdır. 2. GENEL BĠLGĠLER 2.1. STRES Stres fizyolojisi, canlıların yaĢamda kendisini tehdit eden durumlarla karĢılaĢtığında, homeostatik dengesini korumak için geliĢtirdiği fizyolojik mekanizmaları inceler. Claude Bernard (1813–1878), canlıların dıĢ çevreden bağımsız yaĢamak üzere evrimleĢtiklerini ve fizyolojik sistemlerin iç ve dıĢ çevre kaynaklı değiĢkenlere karĢı bir tampon oluĢturmayı amaçladığını vurgulamıĢtır. Walter Cannon (1871– 1945), homeostaz için stres ile stres yanıtının oluĢturduğu adaptif doğaya dikkat çekmiĢ, bunu takiben ”kaç ya da savaĢ” kavramını tanımlanmıĢtır. Aç aslanın yaralı zebrayı yakalamaya çalıĢtığı senaryodaki iki hayvanın da organizmasında benzer fizyolojik yanıtlar olduğundan yola çıkan Hans Selye (1907–1982), çalıĢmalarıyla stres yanıtının daha ziyade adrenokortikal kısmıyla ilgilenmiĢtir. Daha sonraki dönemde stres yanıtının patolojik özelliklerine dikkat çekilmiĢtir. Stres konusundaki araĢtırmalar bu temel bulgu ve çalıĢmalar ıĢığında gerçek bir bilimsel disiplin haline gelmiĢtir. Strese yol açan etmenlere stresör denir. Stresörler homeostatik dengeyi bozan fiziksel veya psikolojik etmenlerdir. Stresörlere yaralanma, açlık, hemoraji, hastalıklar ya da her çeĢit duygudurum değiĢikliği gibi örnekler verilebilir[1]. 2.1.1. STRES YANITI Stresörlere ait bilgi korteks, limbik sistem ve beyin sapından gelen yollar ve duysal afferent lifler (spinohipotalamik yollar->lateral hipotalamus –>paraventriküler nükleus (PVN)) aracılığıyla hipotalamusa iletilmektedir. Bu bilgi hipotalamustaki PVN‟dan kortikotropin salgılatıcı hormon (CRH) ve arjinin-vazopresin (AVP) salımına yol açar. CRH ve AVP‟nin güçlendirici etkisiyle hipofizin ön lobundan adrenokortikotropik hormon (ACTH) salımı sağlanır. ACTH ise adrenal korteksten kortikosteroid üretimini artırmaktadır. PVN‟daki CRH nöronlarının bir kısmı, beyin sapındaki (ventral lateral medulla) ve medulla spinalisteki (intermediolateral kolon) 2 sempatik sisteme ait çekirdeklere aksonal projeksiyonlar vermektedir. Aynı zamanda bu sempatik çekirdekler AVP ve arkuat çekirdekte proopiomelanokortin (POMC) sentezleyen nöronlardan da uyarıcı projeksiyonlar almaktadır. Sempatik sistem çekirdekleri uyarıldığında adrenal bez medullasından adrenalin salımı artmaktadır. Stres ortaya çıktığında sempatik katekolaminlerin salınmasıyla, kardiyovasküler ve pulmoner tonus artıĢı gibi metabolik etkiler görülür. UzamıĢ streste ise anabolizan fonksiyonlar, inflamatuar yanıtlar, ağrı algısı, sindirim, üreme, parasempatik sinir sistemi ve büyüme hormonu salgısı baskılanır. Organizma, hayatta kalabilmek için, bir mantık içersinde stresle savaĢır: Glukoz ve oksijen, alarm durumundaki organizma için sadece enerji gereksinimi olan bölgelere ulaĢtırılır, ağrı algısı baskılanır, biliĢ ise daha iyi mücadele edebilmek için keskinleĢir. Daha yıkıcı stresörlerin zararlı etkileri, sempatik sinirsistemi ile düzenlenir. Stres yanıtında glukokortikoidler, β-endorfin, prolaktin, vazopresin ve pankreastan da glukagon salımı artar. Glukoz, serbest yağ asitleri, aminoasitler, ve gliserol depo organlardan taĢınır, bu maddelerin karaciğer ve yağ dokusuna alınmaları önlenirken bu organlarda da trigliserid, protein ve glikojen sentezi baskılanır. Böylece aktivitesi artan kaslara enerji yönlendirmek için kanda glukoz, serbest yağ asitleri ve gliserol seviyeleri yüksek tutulur [1]. ġekil 1: Hipotalamus-Hipofiz-Adrenokortikal Eksen (HPA) Stres yanıtı, çevreye olan beyin ve vücut yanıtlarını yönetir. Ġnsanlarda kortizol kemirgenlerde ise kortikosteron hormonu stres yanıtındaki önemli düzenleyicilerdir. 3 Kortizol ve kortikosteronlar hücre içindeki pek çok farklı mekanizma üzerinde etkilidir. Bunlar arasında membran aracılığı ile ortaya çıkan değiĢiklikler ve değiĢen gen transkripsiyonu sayılabilir[2]. Psikolojik, enfeksiyöz ve travmatik her türlü stres CRH nöronlarını aktive eder. HPA ekseninin son ürünü olan glukokortikoid (GC) hormonlar, stres mücadelesinde homeostatik ve adaptif süreçlerde hayati rol oynar (ġekil 1). Bu süreçler metabolik, immün, nöral ve davranıĢsal mekanizmalardır. GC düzeyleri, birkaç saat orta stres derecesine ulaĢtığı zaman (günlük yaĢam için bu „stimülasyon‟ olarak adlandırılabilir) hipokampustaki sinaptik plastisite hızlandırılarak biliĢ kuvvetlenir. Ancak stresörlere uzun süreli maruz kalındığı durumlarda stres yanıtı da artarak GC miktarları yüksek düzeylere ulaĢır ve bu durumda hipokampus nöronlarına doğrudan toksik etki eder. UzamıĢ stres ile stres yanıtı, katabolik doğası gereği homeostazisi dengelemek yerine kendisi zararlı hale gelebilir. Stres yanıtının kronik olarak çok fazla aktive olması miyopati, steroid diyabeti, hipertansiyon, peptikülser, üremede bozukluk, psikojenik cücelik, immünosupresyon gibi stres iliĢkili hastalıkların ortaya çıkmasına neden olur. Akut strese uygun stres yanıtını verilememesi gibi, kronik strese yanıtın çok fazla verilmesi de yıkıcı olur. Bu iki uçlu stres fizyolojisi ile yaĢlanma arasında etkileĢim görülmektedir. YaĢlanma stres yanıtı kapasitesinde bozulma dönemi olarak tanımlanabilir. UzamıĢ stres, yaĢlılığın dejeneratif süreçlerini hızlandırmaktadır[3]. 2.1.1.1. KORTĠZOL SENTEZĠ Adrenal bez böbreğin hemen üzerinde, posteromedial yüzeyinde retroperitoneal yerleĢimli, korteks ve medulladan oluĢan bir bezdir. Ağırlığının % 90‟ ını oluĢturan adrenal korteks, dıĢtan içe doğru, zona glomerulosa, zona fasikülata ve zona retikülaris olmak üzere 3 tabakadan oluĢur (ġekil2). 4 ġekil 2: Adrenal bez[4] Zona glomerulosa aldosteron yapımından sorumlu iken, zona fasikülata ve zona retikülaris kortizol ve androjen üretir. Aldosteron üreten zona glomerulosa renin –anjiotensin sistemi ve potasyum seviyesi ile düzenlenirken, zona retikülaris temel olarak androjenlerin üretimi ile iliĢkilidir. Ġnsan zona retikülaris tabakasında kortizol üretimi ile iliĢkili 17-alfa hidroksilaz enzimi bulunmakla birlikte, kortizol üretiminden sorumlu asıl bölge zona fasikülata tabakasıdır. Her iki zonda, ACTH eksikliğinde atrofi, fazlalığında ise hiperplazi ve hipertrofi ortaya çıkar. Akut olarak ACTH uyarısına cevapta kortizol artıĢından sorumlu olan zona fasikülata hücreleri iken, zona retikülaris hücreleri uzun süreli ACTH etkisi altında bazal glukokortikoid salınımından sorumludur. Tüm adrenal steroidlerin sentezi kolesterol ile baĢlar. Adrenal kolesterolün temel kaynağı plazma lipoproteinleri olup, asetattan da adrenal kortekste de novo kolesterol sentezi yapılabilir. Adrenal beze ulaĢan kolesterolün %80‟i düĢük dansiteli lipoprotein (LDL)‟den sağlanır. Adrenal bezde küçük bir serbest kolesterol havuzu mevcut olup, uyarı oluĢtuğunda, depo kolesteril esterlerinin serbest kolesterole hidrolizi, plazmadan lipoprotein alımı ve kolesterol sentezi artar. Kolesterolün sitokrom-P450 enzimleri aracılığıyla pregnenolona dönüĢmek üzere iç mitokondrial zara transferi, adrenal steroidogenezin hormon bağımlı hız kısıtlayıcı basamağıdır. Pregnenolon, daha sonra ileri steroid sentezinin gerçekleĢtiği mitokondri dıĢına geçer ve birçok enzimatik reaksiyon sonucunda kortizol sentezlenir (ġekil 3). Bazal koĢullarda günlük kortizol sekresyonu 8-25 mg/ gündür. 5 ġekil 3: Kortizol sentezi Kortizol sentezi nöroendokrin olarak kontrol edilir ve adrenal bezde kortizol depolanmaz. Kortizol sentezi hipofiz bezinden salgılanan ACTH ile düzenlenirken, ACTH‟nın kendisi de primer olarak hipotalamustan pulsatil tarzda salınan kortikotropin salgılayıcı hormon ile düzenlenir. Nöroendokrin kontrolde üç mekanizma mevcuttur: sirkadyan ritm, hipotalamus-hipofiz-adrenal ekseninin (HPA) stres yanıtı ve ACTH salınımının kortizol ile geri inhibisyonu[5]. 2.1.2. GLUKOKORTĠKOĠDLER Glukokortikoidler (GC) vücut stres altındayken homoestatik dengeyi sağlamak için doğal olarak salınan hormonlardır. HPA eksende glukokordikoid üretimi ile ilgili olarak, beyindeki GC-bağlayan mineralokortikoidler (MC),mineralokortikoid reseptörleri (MR) ve glukokortikoid reseptörleri (GR) bulunmaktadır. GR beyinde yaygın olarak bulunurken; MR, hipokampusta sınırlıdır. GR, GC düzeylerindeki yükselmelerde negatif geri bildirimi düzenler. MR, HPA eksen aktivitesindeki limbik etkinin tonik inhibisyonunda görevlidir. Hipokampal MR endojen GC‟lerle sürekli iliĢki içersindeyken; GR, stres ya da sirkadyan ritim ile iliĢkili olarak glukokortikoid düzenlenmesine katılırlar. Kolesterolden kortikosteron sentezi adrenal bezin zona retikülaris, zonafasikulata ve zona glomerüloza bölgelerinin üçünde de gerçekleĢmektedir. Kortizol ise sadece zona fasikulata ve zona retikülariste sentezlenmektedir. Ġnsanda en çok sentezlenip salınan glukokortikoid, kortizoldür. Kortikosteron ise çok daha az 6 miktarda sentezlenip salınmaktadır. Sıçanda ise hemen hemen sadece kortikosteron sentezlenmektedir. DolaĢımda kortizol büyük oranda bir α globulin olan transkortine ve çok daha az oranda albumine bağlı olarak bulunmaktadır. Proteinlere bağlı olarak bulunan steroidler fizyolojik açıdan inaktiftir. ACTH, glukukortikoidlerin bazal sekresyonunu ve strese bağlı sekresyon artıĢını sağlamaktadır. ACTH‟nın tekrarlayan dozlarıyla adrenal bezde ACTH reseptörleri anlatımı artmaktadır (up-regule olmaktadır). GC düzeylerinin yükselmesi ACTH salgısını uzun süreli olarak inhibe etmektedir. Glukokotikoidlerin yüksek düzeyde salgılanmaları kısa vadede yaĢamsal değere sahiptir ancak uzun vadede kesinlikle zararlı ve yıkıcıdır. Patolojik anlamda ve uzun süreli yükselen GC seviyeleri aĢırı katabolizma sonucu protein depolarını tüketir; hiperglisemi, hipertansiyon ve osteoporoz geliĢmesine neden olur; vücutta yangı süreci ve bağıĢıklık sistemi baskılanır[6]. Sentetik glukokortikoidler çok sayıda inflamatuar hastalıklarda ve kanser tedavisinde terapötik olarak kullanılmaktadır. Glukokortikoidlerin etkileri kendilerine ait reseptöre (GR) bağlanması sonucunda ortaya çıkar. GR; MAPK (Mitojenle aktive olan protein kinaz), CDK ve GSK-3β (glikojen sentez kinaz-3 beta) gibi kinazlar tarafından fosforillenir ve fosforillenen dimerize GR nukleusa geçerek hedef genlerde transkripsiyonel aktivite değiĢikliklerine neden olur[7]. Kortizol, glukokortikoid aktivitesini düzenleyen en önemli faktörlerden biridir. Hensch, romatoid artrit tedavisinde kortizol kullanarak 1950 yılında Nobel tıp ödülünü kazanmıĢtır. Bu yıllarda astım tedavisinde de kortizol kullanılmaya baĢlanmıĢtır. Son yıllarda klinik uygulamalarda glukokortikoid moleküllerinin genellikle sentetik pek çok tipi kullanılmaktadır. Bu moleküllerin kimyasal yapısının temeli doğal kortikosteroidlere dayanır. Glukokortikoidler; mekanik, kimyasal, enfeksiyöz ve immunolojik uyarıların neden olduğu inflamasyonu engelleyen ve baskılayan en güçlü ve etkili ilaçlardır. Glukokortikoidlerin temel antiinflamatuar etkileri proinflamatuar proteinleri kodlayan çok sayıda genin transkripsiyonunun inhibisyonu sonucuortaya çıkar. Bu genler arasında sitokin içeren interlökin 1, 2, 3, 4, 5, 6, 11 ve 13, tümör nekroz faktör α, granulositmakrofaj koloni uyarıcı faktör (GM-CSF), kemokinler (interlökin 8, aktivasyonu düzenleyen, normal T-hücre- ekspese eden ve kemokin salgılayan, makrofaj inflamatuar protein 1α, monosit kemotaksik protein 1, 2, 3 ve 4 eotaksin), adhezyon molekülleri (intraselüler adhezyon molekülü 1, vasküler hücre adhezyon 7 molekülü 1, E-selektin) ve sentezi düzenlemeye aracılık eden enzimler (nitrik oksit sentaz, siklooksigenaz 2, sitoplazmik fosfolipaz A2 [PLA2] ) sayılabilir. Glukokortikoidler ek olarak immun yanıtta hücre düzeyinde önemli etkilere sahiptir. Glukokortikoidler eozonofillerin ömrünü kısaltabilir ve dendritik hücre etkilerinin sayısını (antijen sunan) azaltır, alerjilerde antiinflamatuar etkiden de kısmen sorumlu olduğu gözlenmiĢtir.[8] Glukokortikoidlerin birçok antiinflamatuar etkisi transkripsiyon faktörlerinin inhibisyonuyla (transrepresyon) olur. Oysaki endokrin ve metabolik etkilerde DNA‟ya GRE‟lerin bağlanması (transaktivasyon) aracılık eder. Glukokortikoidler, hücre nukleusunda DNA üzerindeki GRE‟ye bağlanırken aktif homomerik formda bulunmalıdır. Diğer yandan, AP1 (aktivatör protein) ve NF-κB ( nuklear faktör kapa B) gibi transkripsiyon faktörleriyle etkileĢiminde monomerik formda bulunur. Bu etkilerin ayrımı hücrelerde GR mutasyonu yapılarak ve sonra viral bir vektörle infekte edilerek gösterilmiĢtir. RU248585, RU486 ve ZK98299 gibi bazı glukokortikoid molekülleri hücrelerde transaktivasyondan daha büyük transrepresyon gösterirler. Son zamanlarda glukokortikoidlerin yeni bir sınıfı tanımlanmıĢtır. Bu glukokortikoidlerin de güçlü transrepresyon aktivitesi vardır ancak, transaktivasyon minimaldir. [8] Glukokortikoid antagonisti olarak RU248585, RU486 ve ZK98299 molekülleri kullanılırken, GC agonisti olarak antiinflamatuar ve immun baskılayıcı etkilere sahip olan deksametazon kullanılır. Deksametazon, romatolojik problemler ile bazı alerjiler, astım, kronik obstrüktif akciğer hastalığı ve serebral ödem gibi daha birçok alanda yaygın olarak kullanılmaktadır. Glukokortikoidlere direnç geliĢimini açıklayan bazı mekanizmalar vardır. Hastalardan izole edilen monosit ve T lenfositlerin in vitro koĢullarda glukokortikoidlere yanıtının azaldığı gösterilmiĢtir. Bu hücrelerden bazılarında glukokortikoidlerin GR için afinitesi azalmıĢtır. T hücrelerinin interlökin 2 ve interlökin 4 ile inkubasyonuyla, glukokortikoid etkilerinin fonksiyonel inhibisyona yol açtığı gösterilmiĢtir.[8] Glukokortikoidlerin antiinflamatuar etkisi, antiinflamatuar proteinlerin (lipokortin 1, serum lökoprotazinhibitör (SLPI), interlökin 10 ve interlökin 1 reseptör antagonisti gibi) anlatımının artması ile meydana gelir. Bu etki GRE‟lerde promotor bölgedeki genler tarafından düzenlenir. Glukokortikoid reseptörleri de, koaktivatör faktörlerinin bağlanmasıyla transkripsiyonu artırabilir. 8 2.1.2.1.GLUKORTĠKOĠDLER ĠLE ĠLĠġKĠLĠ BAZI HEDEF GENLER Ġnflamatuar enzimler: Glukokortikoidler astım inflamasyonu siklogenaz 2 ve sitosolik PLA2 gibi proinflamatuar sitokinlerin ürünü olan nitrik oksit sentaz sentezini inhibe eder. Adhezyon molekülleri: Adhezyon molekülleri inflamasyon bölgesine hücre göçünde önemli rol oynar. Pek çok inflamatuar sitokinler endoteliyal hücrelerin yüzeyinde adhezyon molekülünün ekspresyonununa neden olur ve glukokortikoidler bu ekspresyonu ya dolaylı olarak inflamatuar sitokinlerin azaltılarak düzenlenmesiyle (downregulasyon) ya da doğrudan bu molekülleri (intraselüler adhezyon molekülü, E selektin ya da vasküler hücre adhezyon molekülü 1 gibi) kodlayan genlerin ekspresyonunu düzenleyerek etkileyebilir. Apoptoz: Glukokortikoidlerin eozinofil gibi bazı inflamatuar hücrelerinde yarı ömrü kısalır. Bu hücrelerin hayatta kalması, interlökin 5 ve GM-CSF gibi sitokinlerin bulunmasına bağlıdır. Glukokortikoidler bu sitokinlerin sentezini bloklar ve onların ölümünü tetikler (apoptoz) ancak bu etkinin moleküler mekanizması henüz açıklanmamıĢtır. Glukokortikoidler nötrofillerde apoptozu inhibe ederek bu hücrelerin hayatta kalma süresini uzatır. β adrenareseptör: Glukokortikoidler β adrenareseptörlerin ekspresyonunu artırırlar. Bu etki hem in vivo hem de in vitro olarak gösterilmiĢtir.[8] Tüm insan genomunda GR bağlanması kromatin immünopresipitasyonu kullanarak ve sonrasında son-jenerasyon DNA sekanslaması yöntemi ile belirlenmiĢ ve glukokortikoid dekzametazona yanıtla ilgili ortaya çıkan gen ekspresyonu değiĢiklikleri mRNA sekanslaması ile gösterilmiĢtir. GR'nin yer aldığı 4392 genomik pozisyonda deksametazona yanıt olarak ekspresyonunu anlamlı biçimde değiĢtiren 234 gen tanımlanmıĢtır. Bu genetik sayım GR'nin gen aktivasyonu ve baskılaması arasında belirgin farklılıklar olduğunu göstermiĢtir.[9] 2.1.3. GLUKOKORTĠKOĠD RESEPTÖRLERĠ Glukokortikoidler etkilerini belirli intraselüler glukokortikoid reseptörlerine bağlanarak gösterirler. GR genetik kodu kromozom 5‟in uzun kolunda tespit 9 edilmiĢtir (bölge 5q31-32). Bu genomik yapıda 9 ekson ve 3 farklı gen promotorü tanımlanmıĢtır. Farklı hücre tiplerinde farklı promotorlerin bulunması, hücre tipine bağlı olarak farklı reseptörlerin bulunabileceğini düĢündürmektedir.[8, 10] Glukokortikoidler ve reseptörlerinin yaĢam için gerekli olduğu bazı çalıĢmalarla gösterilmiĢtir. Glukokortikoid reseptörü eksik olan farelerde bazı anomaliler görülmüĢtür ve doğumdan kısa süre sonra ölmüĢlerdir. Ġnsan GR‟nin iki izoformu vardır; GRα ve GRβ ve bu izoformlar tek genin alternatif kırpılmalarından oluĢmuĢlardır. Her iki izoform da insan dokularında bulunur. GRα, 777 aminoasit içerir, hormona bağlanır ve glukokortikoid yanıt genlerini aktive eder, predominant izoformdur. Tersine GRβ sadece 742 rezidü uzunluğundadır, C-terminus bölgesi GRα‟dan farklıdır, bu zamana kadar bilinen hiç bir glukokortikoide bağlanmaz. GRβ‟nın fonksiyonu net değildir. GRα aracılı transaktivasyonu dominant negatif düzenleyici etkisi olabildiği ve inflamatuar yanıtlarda glukokortikoid aracılı direnç sağlayabildiği düĢünülmektedir. GRα, memelilerde her hücre tipinde ekprese edilir[8, 10]. GRα proteini, N terminal (NTD), DNA bağlanma bölgesi (DBD) ve ligand bağlanma bölgesi (LBD) olmak üzere üç domain içerir (Ģekil 4). N terminal, AF1/tau1/enh2 transaktivasyon bölgesi içerir, AF-1 (transaktivasyon domaini) transkripsiyonun artırılması, reseptör ve bazal transkripsiyon faktörlerinin birleĢmesi için gereklidir[10, 11]. Merkezde DNA bağlanma domaini bulunur, nüklear reseptörler boyunca iyi korunmuĢtur. Reseptör dimerizasyonunda ve hedefe bağlanmada kritik olan iki tane “zinc finger” bölgesi içerir. C-terminal bölgesi hormon bağlanan yerdir, ısı Ģoku proteinlerinin bağlanma bölgesinde de görev alır. Bu hormon bağlanma domainleri, ligand bağlı aktivasyon fonksiyon domaini (AF-2) gibi nuklear lokalizasyon sinyallerini içerir. ġekil 4: GR proteini 3 domaini 10 Glukokortikoidler lipofilik özellikleri sayesinde plazma membranından difüze olabilirler ve intraselüler GRα‟ya bağlanırlar. GRα sitoplazmada inaktif kompleks halinde bulunur. Isı Ģoku proteinleri 90 (hsp90), hsp70, hsp56, hsp40, düĢük molekül ağırlıklı protein (p23) ve bazı immunofilinlerden (hsp56) oluĢur. Ġmmunofilinlerin strese yanıtta kortizol-HPA ekseni ve kronik beyin hastalıklarıyla iliĢkili olduğu öngörülmüĢtür. Kortizole maruz bırakılan nöronal hücre kültürlerinde FK506 bağlama proteinlerinin (immunofilinlerin) (FKBP) -52 ve -51 yanıtı ve glukokortikoid reseptörleri translokasyonuna etkisindeki moleküler olaylar araĢtırılmıĢtır. GR-immunofilin etkileĢiminde (FK506 kullanılan) nöronal nukleusta GR formasyonu ve stabilitesi etkileri görülmüĢtür. FK506‟nın, GR nuklear lokalizasyonunu değiĢtirdiği ve GR yanıt genlerinin ekspresyonunu inhibe ettiği farkedilmiĢtir.[12] Glukokortikoid bağlanmasıyla GRα multimerik kompleks proteinlerden (özellikle hsp90) ayrılarak transkipsiyonel faktörlerin aktivasyonunu baĢlatır. Böylece nükleer lokalizasyon sinyallerine maruz kalır ve hızla nükleusa transloke olur. Burada ligand reseptör kompleksi inflamatuar genlerin transkripsiyonel yanıtını uyarma veya baskılama Ģeklinde module eder[10]. 2.1.3.1.GLUKOKORTĠKOĠD RESEPTÖRÜ TRANSKRĠPSĠYONEL AKTĠVASYONU GRα, DNA üzerindeki glukokortikoid yanıt elementlerine homodimer olarak bağlanarak transkiripsiyonu aktive eder. Bu bağlanmanın gerçekleĢtiği GRE sekansı 15 baz çiftlik palindromik bir dizidir ve diziliĢi AGAACAnnnTGTTCT (n herhangi bir nukleotit olabilir) Ģeklindedir. GRE sekansındaki bağlanma sonucunda GRα‟da konformasyonel değiĢim olur, bazı koaktivatörlerin de desteğiyle GR-DNA kompleksi oluĢur. 2.1.3.2. GLUKOKORTĠKOĠD RESEPTÖRÜ TRANSKRĠPSĠYONEL REPRESYON GRα, doğrudan negatif GRE‟ye (nGRE) bağlanarak genleri baskılayabilir. nGRE sekansları çok çeĢitlidir. Glukokortikoidlerin en etkili anti-inflamatar etkisi 11 GRα ve diğer transkripsiyon faktörlerinde (özellikle NF-κB ve AP-1) protein – protein etkileĢimleri sonucunda görülür. Bu mekanizma inflamatuar hastalıklarla iliĢkili sitokin ürün sayısının kısıtlanmasına yol açar. [12] Steroid madde hücreye girdikten sonra reseptöre bağlanır ve sadece birkaç dakika nükleusa ulaĢır. Nükleusta baĢlangıç değiĢimi olarak transkripsiyon birkaç dakika sürer ve yeterli haberci RNA (mRNA) birikir. Post-transkripsiyonel süreç için gereken zaman gen boyutuna bağlı olarak değiĢkenlik gösterir. Böylece steroid alımından sonraki 15 dakika içinde hızlı gen yanıtlarıyla mRNA artıĢı belirlenmiĢ olur ancak temel düzenleme için daha uzun saatler gereklidir[13]. GR, N terminal bölgesindeki (S203, S211 ve S226) çoklu fosforilasyon bölgesi bulunmaktadır. Fosforilasyonun, reseptör aktivitesine etkisini araĢtırmak için yapılan çalıĢmalar sonucunda S226‟nın alanin ile yer değiĢtirmesinin GR transkripsiyonel yanıtı arttırdığı bulunmuĢtur. S211 fosforilasyonu hormon bağımlıdır. Buradaki fosforilasyonun azaltılması; nuklear retansiyonun ve transkripsiyonel aktivasyonun azalması ile iliĢkilendirilmiĢtir. S211 ve S226 fosforilasyonu sonucu GR transkripsiyonel yanıt kofaktör etkileĢimleri ile belirlenmiĢtir[13]. Memeli kültür hücrelerinden ya da mayadan ektopik olarak eksprese edilen hücrelerden elde edilen GR‟de izole edilmiĢ çoklu fosforilasyon bölgeleri bulunmuĢtur. Ġnsanda N terminal transkripsiyon düzenleyici domainde serin 203 (S203), serin 211 (S211) ve serin 226 (S226) içeren 3 bölge bulunmuĢtur[13]. Birçok transkripsiyon faktörünün gen ekspresyonunu düzenlediğine dair kanıtlar artmaktadır. Ligand bağlanması, nükleer translokasyon, reseptör dimerizasyonu ve genel transkripsiyon faktörleriyle etkileĢimde fosforilasyon iliĢkilidir. GR bir fosfoproteindir ve aktivitesi fosforilasyon ile düzenlenir. GR glukokortikoid yokluğunda kısmen fosforillenir, GR‟ye agonisti bağlandığında ise fosforilasyon artar ancak antagonisti bağlandığında bu gerçekleĢmez. Bazı çalıĢmalarda fosforilasyonun GR stabilitesini etkilediği gösterilmiĢtir. Ġnsan glukokortikoid reseptöründe AF1 fosforilasyon rezidüleri S203, S211 ve S226‟dır. Bunlardan en az ikisinin (S211 ve S226) GR transkripsiyonel aktivitesinde önemli olduğu düĢünülür[11]. 2.1.4. CDK5 Siklin bağımlı kinazlar (CDKs), diğer proteinleri fosforile ederek onları akive ya da inaktive eden protein kinaz enzimleridir. Hücre siklusu siklinler (cyc=cln ), 12 siklin bağımlı kinazlar (CDK) ve siklin bağımlı kinaz inhibitörleri (CDI) tarafından kontrol edilir. Bu proteinlerin düzeyleri hücre siklusunun farklı fazlarında farklılıklar gösterir. Siklin bağımlı kinazlar ökaryot hücre siklusu fazlarından interfaz ve mitoza geçisi kontrol eder. CDK'lar protein fosforilasyonu yapan enzimlerdir. CDK aktivitesi DNA sarmalının açılması için de gereklidir[14]. Aktif CDK, bir katalitik alt birim (CDK1-CDK9) ve bir düzenleyici alt birim (siklin A, siklin J ve siklin T) içerir. CDK‟ların aktiviteleri siklin ekspresyonu, fosforilasyon, defosforilasyon ve negatif düzenleyici proteinlerin (örneğin p16INK4, p21Cip ve p27KIP bağlanmasını içeren çeĢitli mekanizmlar tarafından düzenlenir ve hücre içi organellerin ya da proteinlerin doğru yerleĢimi için gereklidir[15]. CDK5, CDK ailesininkendine özgü bir üyesidir. YaklaĢık 20 yıl önce sığır beyin ekstratında keĢfedilmiĢtir. Fonksiyon ve düzenlenmesi diğer CDK‟larla kıyaslandığında kendine özgü özellikler gösterir. CDK5, serin/treonin kinaz yapısındadır ve merkezi sinir sistemi geliĢimi, fonksiyonu ve hastalıklarında rol oynar. p25 bağlanmasına bağlı olarak CDK‟nın yanlıĢ düzenlenmesi sonucunda nöronal hücre ölümü görülebileceği gibi, madde bağımlılığı, ile Alzheimer, Parkinson, Amiyotrofik Lateral Skleroz gibi bazı nörodejeneratif hastalıkların mekanizmalarında rol oynayabilir. CDK5‟in nöronlarda ölümü indüklemesinin yanı sıra hayatta kalımı etkilediği de kapsamlı çalıĢmalarla gösterilmiĢtir. Diğer yandan CDK5/p35 nöronların stres altında hayatta kalmaları için gereklidir ve DNA hasarıyla indüklenen nöronal ölüme karĢı koruyucu niteliktedir. [16, 17] CDK5 prolin yönlendirilmiĢ serin/treonin kinaz ailesine 1992 yılında atipik üye olarak dahil edilmiĢtir. Kendi aktivatörünü kullanır ve çoklu hücre fonksiyonlarında önemli düzenleyici rol oynar. CDK ailesi üyelerinden sadece birkaçı hücre siklusu haricinde görev alır. Bunlardan bir tanesi olan CDK5, CDK1 ile %60 homoloji gösterir. Memelilerde CDK5 mRNA ve proteini böbrek, testis ve ovaryumda da eksprese edilmekle birlikte, en yüksek seviyede yetiĢkin sinir sistemi ve geliĢen post mitotik nöronlarda eksprese edilir. Bununla birlikte CDK5diğer dokularda da bulunur özellikle beyin ekstratlarında aktivitesi saptanmıĢtır.[18] CDK5‟inaktif formu izole edildiğinde yeni sekansın düzenleyici alt biriminde p25 bağı açığa çıkarılmıĢ ve moleküler klonlamada bu alt birimin uzun prekürsörü p35 açığa çıkarılmıĢtır.[19] 13 CDK5, hücre morfolojisini ve hareketini değiĢtirme, nöronal geliĢim ve nöronal hayatta kalım ya da ölümle iliĢkili çeĢitli proteinleri doğrudan fosforiller. Nöronlardaki p35 ya da p39 proteini CDK5 kinaz aktivitesinde anahtar belirteçtir. Nöronal farklılaĢma sırasında, nöronal büyüme faktörleri ya da ekstraselüler matriks proteinleri CDK5 aktivitesinin artmasıyla artması sonucunda p35 sentez uyarımına katılır. Beyin kaynaklı nörotrofik faktör, glial kaynaklı nörotrofik faktör, nöron büyüme faktörü (NGF), retinoik asit, laminin ve nörogilinin CDK5 aktivitesini artırdığı rapor edilmiĢtir. Diğer yandan proteazom tarafından p35 ya da p39 degradasyonu sonucu CDK5 aktivitesi azalır.[17] CDK5 aktivitesi nöronların geliĢimi ve olgunlaĢmasını içeren çeĢitli nöronal fonksiyonlarda gereklidir. CDK5, mitojen-aktiveli protein kinaz- reseptör protein kinazlar, c-Jun N-terminal kinaz 3, fosfotidilinositol-3-kinaz/ protein kinaz ve glikojen sentez kinaz 3β sinyal yolakları gibi çeĢitli düzenleyici yolaklarda rol alır. CDK5 çeĢitli küçük GTPaz ailesinden Rho ve Ras gibi “downsteam” aĢağı akım substratlarını ya da mikrotübül bağlanma proteinlerini (ör. Tau, MAP2, MAP1b) fosfatlar ve nörit büyümesinde ve/ ya da uzantı morfogenezinde aktin dinamiklerini module eder.[17] CDK fonksiyonlarını araĢtırmak için CDK‟lara özgü inhbitörler kullanılmaktadır. Kenpaullone bazı CDK‟lar için ATP yarıĢmalı inhibitördür. Tercihen CDK‟ları inhibe eden özgün bir kemotip bileĢimidir. Açık formülü“9Bromo-7,12-dihydroindolo-[3,2-d][1]benzazepin-6(5H)-one” Ģeklinde olup, “NSC 664704” adıyla da bilinir [15]. (ġekil 5) ġekil 5: Kenpaullone 14 2.1.5. JNK Mitojen aktive edici protein kinaz, serin-treonin kinaz üst ailesidir. Sitokinler, büyüme faktörleri, nörotransmiter, hormonların yanı sıra hücre tutunması ve hücresel stres koĢulları altında aktive olur. Hücre büyümesi, farklılaĢması, sitoskeletal fonksiyonlar ve gen ekspresyonunda anahtar rol oynar[20]. JNK sinyal yolağında negatif düzenleyici bileĢenler tanımlanmıĢtır. Bunlar ikili özellik içeren MAP kinaz fosfataz MKP7 (özellikle JNK ve bazı p38 MAP kinaz izoformlarını inaktive eder) yapısındadır. Isı Ģoku proteini Hsp72‟nin, JNK‟yı inhibe ettiği ve böylelikle stresle indüklenen JNK aktivitesini ve apoptozu düzenleyebildiği rapor edilmiĢtir.[21] Üç tane JNK geni bulunmaktadır: JNK1, JNK2, JNK3 [21-23]. JNK3; beyin, kalp ve testislerde sınırlı kalırken JNK1 ve JNK2 vücudun pek çok yerinde ekprese edilir. Farklı kırpılma ve ekson kullanımı sonucu JNK1,2 ve 3 genlerinin çoklu izoformları ortaya çıkmaktadır. Her bir JNK kısa form (46kDa) ve uzun formunu (54kDa) ekprese eder. JNK1, 2 ve 3‟ün alternatif formları; farklı substrat proteinlerine bağlanma ve bunları fosfatlamanın yanı sıra farklı JNK izoformları farklı yollarla aktive olabilmektedirler.[22] JNK sinyal yolağı analiz edildiğinde, çeĢitli patolojik Ģartlar, kanser, kalp hastalıkları ve çeĢitli inflamatuar hastalıklar ile iliĢkili olabileceği görülmektedir. JNK sinyal yolağını inhibe eden ilaçlar tedavi edici Ģekilde yararlı olabilir. Buna ek olarak bazı ilaçlar (inhibitör SP600125 rapor edilmiĢtir) JNK fonksiyonu araĢtırmalarını kolaylaĢtırır. Bu inhibitör kültür hücrelerinde JNK aktivitesini inhibe eder ayrıca in vivo çalıĢmalarda inflamatuar yanıtları azaltır. SP600125, JNK sinyal yolağı çalıĢmaları için kullanıĢlı bir araçtır [21]. SP600125, MAPK ailesinin bir üyesi olan JNK‟ya inhibitör olarak geliĢtirilmiĢ bir bileĢiktir (ġekil 6). Protein kinaz testlerine yönelik 20 kat seçicilik gösterdiği raporlanmıĢtır. Ayrıca bazı hücre temelli denemelerde bu inhibitör tarafından anti inflamatuvar gen ekspresyonlarının engellendiği, AP1 aktivasyonu, yumurtalık kanser hücrelerinde tipIV kollajenaz ekspresyonu ve insan primer CD4 hücre kültürlerinde farklılaĢma ve aktivasyonu raporlanmıĢtır. Bu nedenlerle SP600125 15 kronik inflamatuar hastalıklar, apopototik hücre ölümü ve kanser uygulamalarında hedef olarak önerilmiĢtir[24]. ġekil 6: SP600125 kimyasal yapısı 2.1.6. GLUKOKORTĠKOĠD ĠLE ĠLĠġKĠLĠ GENLER Glukokortikoidler tarafından doğrudan regüle edilen 10 ila 100 gen olduğu düĢünülmektedir. Glukokortikoid-GR kompleksinin anti-inflamatuar proteinler ya da daha önemlisi transrepresyon mekanizmalarında indirek gen regülasyon etkilerinin olduğu gösterilmiĢtir. Bu mekanizmalar nüklear faktör- κB (NF-κB) ya da aktivatör protein 1 (AP1) gibi proinflamatuar transkripsiyonel faktörlerin, mitojen- aktive edici protein kinazlar (MAPKs) gibi enzimlerin destabilizasyonu, gen ekspresyonunu kapsayan süreçlerdir ve inflamatuar yanıtta hücre çoğalmasının doğrudan inhibisyonu ile iliĢkilidir. Alternatif olarak glukokortikoid-GR kompleksinin histon asetiltransferaz (HAT) ve histon deasetilaz (HDAC) aktivasyonuna katıldığı da tartıĢılmıĢtır. Bunların her ikisi de kromotin konformasyonundan sorumlu enzimlerdir.[4] Glukokortikoid ile aktive olduğu bilinen genlerden araĢtırma için seçilenleri aĢağıda açıklanmıĢtır. 2.1.6.1. BCL2L Bilinen diğer isimleri: BCLX; BCL2L; BCLXL; BCLXS; Bcl-X; bcl-xL; bclxS; PPP1R52; BCL-XL/S. Ġnsan 20.kromozomda bulunur (20q11.21) ve 8 eksonu vardır. Proteini, BCL-2 protein ailesine ait olan gen tarafından kodlanır. BCL-2 ailesi üyeleri hetero ya da homomer yapıdadır. GeniĢ çapta hücresel aktiviteleri içeren anti- ya da pro-apoptotik 16 düzenleyici görevi vardır. Proteini ise, dıĢ mitokondrial membranda bulunan gen tarafından kodlanır. DıĢ mitokondrial membran kanalının (VDAC) açılmasını düzenler. Böylece mitokondrial membran potansiyeli düzenlenir; reaktif oksijen türü ürünler kontrol edilir ve mitokondriden sitokrom C salınır. Bunların her ikisi de hücre apoptozunun güçlü uyarıcılarıdır. Ġki alternatif kırpılma transkript varyantı sayesinde farklı izoformları kodlar. Uzun izoformlar apoptotik inhibitörlerdir ve kısa izoformlar apoptotik aktivatörlerdir [25]. Ġmmunofilinlerin strese yanıtta kortizol- HPA ekseni ve kronik beyin hastalıklarıyla iliĢkili olduğu öngörülmüĢ ve bu amaçla nöronal hücre hattı SH-SY5Y kullanılmıĢtır. Kortizole maruz bırakılan nöronal hücre kültürlerinde FK506 bağlama proteinlerinin (FKBP) -52 ve -51 yanıtı ve glukokortikoid reseptörleri translokasyonuna etkisindeki moleküler olaylar araĢtırılmıĢtır. Kontrol grubu için BCL2L gen ekspresyonuna bakılmıĢtır. 100nM kortizol 24 saatlik uygulamasında BCL2L gen ekspresyon seviyesinde artıĢ görülmüĢtür. FKBP5 ve BCL2L1‟in kortizol tarafından indüklendiği ve GR gen transkripsiyonunu düzenlediği önceki çalıĢmalarda gösterilmiĢtir. FKBP5 geni FKBP51 proteinini kodlar, GR‟ye doğrudan bağlanan glukokortikoid yanıt elementlerini içerir, duygudurumu bozuklukları ile iliĢkili polimorfizmleri vardır. BCL2L1 geni; Bcl-xL proteinini kodlar ve BCL2 ailesinin mitokondrial bir üyesidir. Mitokondrial fonksiyon, metabolizma ve sinaptik iletim ile iliĢkili olduğu düĢünülür. 30 dakika kotizol uygulanması sonrasında FKBP5 ve BCL2L1 genleri mRNA seviyelerinde %30 artıĢ olduğu gösterilmiĢtir.[12]. 2.1.6.2.SGK1 Ġnsanda 6. kromozomda (6q23) bulunur ve 17 eksonu vardır. Serin/treonin protein kinaz kodlar ve hücresel stres yanıtında önemli rol oynar. Bu kinaz bazı potasyum, sodyum ve klor kanallarını aktive eder, hücrenin hayatta kalması, nöronal uyarılabilirlik ve renal sodyum salgılama süreçlerini düzenlemesiyle iliĢkili olduğu belirtilmiĢtir. Bu genin yüksek seviyedeki ifadesi hipertansiyon ve diyabetik nefropatiye neden olabilir. Bu genin bazı alternatif kırpılma transkript varyasyonları sayesinde farklı izoformları kodladığı gösterilmiĢtir [26]. Ġyon kanalı geçirgenliği, hücre hacmi, hücre döngüsü süreci ve apoptozu içeren düzenlenmeleri kapsayan hücresel stres yolakları SGK1 gen anlatımının arttığını 17 gösterir. Son zamanlarda MPTP ile indüklenen Parkinson hastalığının (PD) erken patogenezinde SGK1 gen anlatımı ve farklı nörodejenaratif hastalıklarda hayvan modellerinin kullanılması yararlı sonuçlar elde edilmesini sağlamıĢtır. Farklı geliĢim aĢamalarında ve hipertansiyon, diyabetik nöropati, iskemi, travma, nörodejenaratif hastalıklar gibi patalojik Ģartlarda SGK1 geni iliĢkisi çalıĢmalarda gösterilmiĢtir. SGK1‟in hücre döngüsü sürecinde ve hücre sağ kalım yolaklarında fizyolojik rolü gözlemlenmiĢtir. Örneğin, aktif SGK1; voltaj kapılı K+ kanallarını düzenleyerek nöronal uyarılabilirlikte rol oynadığı ve proapoptotik enzim glikojen sentaz kinaz 3 (GSK3) aktivitesini azalttığı düĢünülmektedir. SGK1 geninin nöroprokretif süreçlerdeki önemi kanıtlanmıĢtır. MPTP uygulamasından önce bir glukokortikoid olan deksametazon kullanılarak SGK1 gen anlatımının uyarılması incelenmiĢ ve SGK1 gen anlatımının arttığı gösterilmiĢtir [27]. S”GK mRNA‟sı en çok insan hücre hattı ve sıçanlarda timus, ovaryum ve akciğerlerde bulunur. SGK mRNA‟sı glukokortikoidler ve serum tarafından 30 dakikada uyarılır ve “de novo” protein sentezinde bağımsız görev alır. Deksametazona bağlı yolakta kloramfenikol asetiltransferaz raportör gen aktivitesi transkripsiyonu uyarabilir. Ġmmünoblot ile özellikle SGK ĢifrelenmiĢ protein antikorları belirlenmiĢtir. Bu proteinler mRNA birikimine paralel olarak glukokortikoid uygulamasında artıĢ göstermiĢtir[28]. 2.1.6.3. GILZ Ġnsan X kromozomunda bulunur (Xq22.3) ve 9 eksonu bulunmaktadır. Bu gen tarafından kodlanan protein sirke sineğindeki bir protein olan shs (shortsighted) ve bir tür kemirgen olan murin TSC-22 proteini ile benzer sekansları paylaĢır. Her ikisinde de fonksiyonel olarak transkripsiyonel düzenleyiciler ve lösin zincir protein bulunur. Bu genin ifadesi glukokortikoidler ve intelökin 10 tarafından uyarılır. Steroid ve kemokinlerin anti-inflamatuvar ve immunsupresif etkilerinde anahtar rol oynadığı görülmüĢtür. Bu gen için tanımlanmıĢ transkript varyantları tarafından kodlanan farklı izoformlar vardır[29]. Deksametazon uygulaması sonrasında mutant S226A içeren ve yabani tip U2OS hücrelerinde GR hedef genleri incelenmiĢ yapılan çalıĢmalar sonucunda tüm genlerde artıĢ olduğu bulunmuĢtur. Yabani tipe göre mutant hücrelerde GILZ geninde 2 katın üstünde artıĢ görülmüĢ. Bu S226 fosforilasyonunun endojen GR 18 hedeflerinin inhibe edildiğini doğrulamıĢtır. Önceki bulgularla tutarlı olarak GR S226 fosforilasyonu hormon yokluğu koĢulları altında, düĢük S211 ve yüksek S226 fosforilasyon seviyelerinde JNK özgü reseptör tarafından olur. S226 fosforilasyonu GR transkripsiyonel aktivitesini azalttığı sonucu bulunmuĢtur[13]. 2.1.6.4.KLF11 Ġnsan 2. kromozomunda bulunur (2p25) ve 7 eksonu vardır. Bu gen tarafından kodlanan protein çinko parmak transkripsiyon faktörüdür ve epsilon ve gama globin gen promoterlerinde SP-1 gibi sekanslara bağlanır. Bu bağlanma hücre büyümesini inhibe eder ve apoptozise neden olur. Bu gen kusurları insüline bağımlı olmayan eriĢkin tip diyabete neden olur. Bu gene ait 3 transkript varyantının iki farklı izoformu kodladığı bulunmuĢtur[30]. Depresyon da dahil olmak üzere pek çok psikiyatrik hastalıkta kronik stres risk faktörüdür ve stresin varlığı kanda glukokortikoidlerin ya da beyin monoamin oksidaz A artıĢıyla belirlenir. Transkripsiyon faktörü KLF11 (TIEG2 olarak da bilinir) ile hücre büyümesini inhibe eden stres arasındaki iliĢki incelenmiĢ, nöron kültür hücrelerinde bir glukokortikoid olan deksametazonun KLF11 mRNA ve protein seviyesini arttırdığı bulunmuĢtur[31]. 2.1.6.5.NFKB1 Ġnsanın 4. kromozomda yer alır (4q24) ve 25 eksonu bulunmaktadır. 50 kD protein ürünü olan 26S protezom tarafından kotrasnkripsiyonel süreçte 105 kD‟luk bir protein kodlar. Bu 105 kD protein bir Rel protein özel transkripsiyon inhibitörüdür ve 50 kD protein NF-kappa-B (NFKB) protein kompleksinin DNA bağlanma alt birim proteinidir. NFKB transkripsiyon düzenleyicidir ve çeĢitli iç ve dıĢ hücresel uyarılarla (sitokinler, serbest oksijen radikalleri, ultraviyole ıĢın ve bakteri ya da viral ürünler gibi) aktive olur. Aktive olan NFKB nukleusa girer ve çok çeĢitli biyolojik fonksiyonları içeren genlerin ekspresyonunu uyarır. Genin iki transkript varyantının farklı izoformları kodladığı bulunmuĢtur[32]. NFKBIA geni GC tarafından düzenlenen anti inflamatuvar yanıtta önemli bir bileĢendir. GC yanıtında kullanılan A549 hücrelerinde GR bölgeleri tanımlanmıĢtır[9]. 19 2.1.6.6. G6PD G6PD1 olarak da adlandırılan G6PD geni (Glukoz 6 Fosfat Dehidrogenaz) insan X kromozomunda bulunur (Xq28) ve 14 eksonu vardır. Glukoz-6-fosfat dehidrogenaz kodlar. Bu protein ana fonksiyonu NADPH üretmektir. G6PD genetik çeĢitlilik için dikkate değerdir. Pek çok mutantı, özellikle missense mutasyonuyla oluĢan, enzim aktivite seviyeleri tanımlanmıĢ ve klinik semptomlarda iliĢkilendirilmiĢtir. G6PD eksikliği yenidoğan sarılığı, akut hemoliz ya da bazı kronik sferositik olmayan hemolitik anemilere neden olmaktadır. Ġki transkript varyantının kodladığı farklı izoformlar bulunmaktadır[33]. 2.1.7. GLUKOKORTĠKOĠDLERĠN FĠZYOLOJĠK ETKĠLERĠ Glukokortikoidler yaĢamsal önem taĢır. Glukokortikoidler etkilerini glukoz üretimi (glukoneojenez), damarlarda katekolaminlere artmıĢ yanıt, yangı ve bağıĢıklık sisteminin baskılanması ve merkezi sinir sisteminin düzenlenmesi biçiminde gösterir. Glukokortikoid hormonlar baĢta karbonhidrat metabolizması olmak üzere organizmanın birçok aktivitesini etkiler. Bu hormonların en temel iĢlevi organizmayı her türlü strese karĢı güçlü kılmaktır. Bu amaçla glukoz ve glikojen sentezi hızlandırılarak enerji depoları güçlendirilir, vasküler tonus düzenlenir. 1.Karbonhidrat metabolizmasına etkisi: Glukokortikoidler temel etki olarak, glukoneogenezisi hızlandırmak suretiyle glukoz sentezini artırırlar. Bu amaçla proteinler yıkılır, aminoasitler oluĢur. Aminoasitlerden de glukoneogenez yoluyla glukoz üretimi sağlanır. A) Glikojen Sentezi: Glukokortikoidler glikojen sentazı aktive etmek suretiyle glikogenezi hızlandırırlar. B) Glukoneogenez: Glukokortikoid hormonların en önemli etkisi bu metabolik yol üzerinedir. Glukokortikoidlerin etkisi ile karaciğerde glukoneogenezin anahtar hormonu olan fosfoenolpirüvat karboksikinaz (PEPCK) ın sentezi artar, ayrıca pirüvatkarboksilaz, fruktoz-1,6-difosfataz ve glukoz-6-fosfataz da (enzim indüksiyonu yoluyla) aktifleĢir. Öte yandan periferik dokularda artan proteoliz 20 nedeniyle serbestleĢen aminoasitler, glukoneogenezin artıĢı için gerekli substrat yükünü oluĢtururlar. C) Periferik dokularda glukoz kullanımı: Glukokortikoidler periferik dokulara glukoz giriĢini ve bu dokularda glukoz kullanımını azaltırlar. D) Yol verici etki (permissive effect):Karbonhidrat metabolizmasında görevli glukagon ve epinefrin gibi hormonlar ancak glukokortikoid hormonların varlığında görev yapabilirler. 2.Yağ metabolizmasına etkisi: Glukokortikoidler lipolizi hızlandırır. Bu nedenle plazmada serbest yağ asitleri artar ve organizmaya enerji desteği sağlanır. 3. Protein metabolizmasına etkisi: Ekstra hepatik dokularda katabolik etki, karaciğerde anabolik etki görülür. Protein yıkımı sonucu ortaya çıkan glikojenik aminoasitler karaciğerde glukoneogeneze girerler. Fizyolojik dozlardaki glukokortikoidlerin RNA sentezini artırmak suretiyle protein metabolizmasında anabolik etkileri gözlenir. 4. Ġmmün fonksiyon üzerine etkisi: Tedavi edici dozlarda kullanılan glukokortikoidler immün fonksiyonu baskılar. Periferik kandaki lenfositlerin sayısı (özellikle T lenfositler) hem lizis, hem de dalak ve kemik iliği gibi organlara göç nedeniyle düĢerek lenfopeni tablosu ortaya çıkar. Organizmanın enflamasyona gösterdiği cevap azalır. Enflamasyon çevresindeki granülositlerin periferik kana geçmeleri, fibroblastik aktivitedeki azalma, lökotrien ve prostaglandin gibi antiflammatuar etkenlerin sentezindeki yavaĢlamalar bu zemini hazırlar. 5. Mineral metabolizmasına etkisi: Glukokortikoid hormonlar aynı zamanda mineralokortikoid aktivitede gösterir. Bu hormonlar böbrekten sodyum geri emilimini, potasyum çıkıĢını artırırlar. D vitamininin barsaktaki etkisi azaldığı için kalsiyum emilimi azalır, ayrıca kalsiyumun böbrek yoluyla itrahı artar ve sonuçta hipokalsemi görülür. 6. Kemik ve bağ dokusuna etkisi: GC etkisiyle yeni kemik oluĢumu engellenir, kemik dansitesi azalır. Bağdokusundaki rejenerasyon gücü yavaĢlar, yara iyileĢmesi gecikir, mikrobik yayılım daha kolay olur. 7. Kan basıncına etkisi: Glukokortikoidler antidiüretik hormon ADH ve anjiyotensinojen salgısını artırır ve dolayısıyla kan basıncını yükseltir. 21 2.1.8. GLUKOKORTĠKOĠDLERĠN GERĠ BĠLDĠRĠM ETKĠLERĠ Adrenal korteks tarafından üretilen kortizol kan beyin bariyerini serbestçe geçer. Sistemik dolaĢıma katılan kortizolün negatif geri bildirim düzeneği ile kendi salımını durdurucu bir etkisi vardır. Kortizol HPA eksenini; hipofizin ACTH üreten kortikotrop hücreleri, hipotalamus ve hipokampus düzeylerinde inhibe eder [34]. Glukokortikoidler hipokampus, PVN ve ön hipofize etki ederek ön hipofizden ACTH ve PVN‟den CRH salımını inhibe ederler. Ayrıca stres yanıtında adaptasyon evresinin oluĢmasından ve stres yanıtının sonlandırılmasından GC sorumludur. Glukokortikoidlerin negatif geri bildirim etkisi iki evrelidir. Birinci evre saniyeler içinde baĢlar ve baĢlangıçtan itibaren 20 dakika sürer. Hızlı geri bildirim evresi adını alır. Bu evre hız duyarlıdır; HPA ekseninin ne kadar inhibe edileceği glukokortikoidlerin dolaĢımdaki miktarı değil, artıĢ hızı belirler. Bu evrede glukokortikoidler HPA eksen hormonlarının sadece salımını inhibe eder. Ġkinci evre olan gecikmiĢ geri bildirim evresi ise stresörün uygulanıĢından 40 dakika sonra baĢlar. Bu evre glukokortikoid miktarına duyarlıdır ve dolaĢımdaki konsantrasyon geri bildirimin gücünü belirler. Bu evrenin baĢlangıcında (ilk 2-10 saat) sadece hormon sekresyonu baskılanırken daha sonraları hormon sentezi de baskılanır ve hormon sentezine yol açan reseptörlerde gerileme [down-regulation] geliĢir [1]. 2.2. NĠKOTĠN 2.2.1. NĠKOTĠNĠN YAPISI Nikotin bazı bitkilerde sentezlenen doğal bir alkaloiddir. Solanaceae (patlıcangiller) ailesininden olan bu bitkilere örnek olarak papates, patlıcan, yeĢil biber ve tütün bitkisi verilebilir. Nikotinin birincil ticari kaynağı kurutulmuĢ tütün bitkisi (nicotinia tabacum venicotinia rustica) yapraklarıdır. Tütün bitkisi yüzyıllar önce Güney Amerika yerlileri tarafından yetiĢtirilmiĢ, daha sonra Kuzey Amerika‟da Ģifalı bitki olarak kullanılmıĢtır. Daha sonra da sinir sistemini uyaran bir ajan olarak soluma yolu ile kullanılmaya baĢlanmıĢtır. Nikotin ilk kez 1828 yılında Posselt ve Reiman tarafından tütün yaprağından izole edilmiĢtir. Asetilkoline benzer sıvı alkoloid yapıdadır, merkezi ve periferik sinir sistemindeki nikotinik asetilkolin reseptörleri (nAChR) ile etkileĢime girer. Nikotin 22 ve diğer nikotinik ajanlar Langely ve arkadaĢları tarafından 1890‟larda ve yirminci yüzyılın baĢlarında kullanılarak sinir sistemindeki etkileri araĢtırılmıĢtır [35]. Nikotin, sigarada bulunan polonyum, radon, metanol, toluen, kadmiyum, bütan, DDT, hidrojen siyanür, aseton, naftalin, arsenik, amonyak, karbon monoksit gibi 3.885 toksik maddeden biridir.[36]. Nikotin bitkisinin (Nicotiana) yaklaĢık 60 türü bulunmaktadır. Ancak bunlardan sadece iki türü (N. rustica veN. Tabacumare) ticari olarak kullanılır. En çok bilinen türü N. Tabacum dünyanın çeĢitli yerlerinde yetiĢtirilir ve basitçe tütün olarak adlandırılır. Haziran-Ağustos ayları arasında pembemsi renkli çiçekler açan, 0,75-1,5 m boylarında, bir yıllık kültür bitkisidir. Gövdeleri dik, silindir Ģeklinde, tüylü ve yapıĢkanlıdır. Yapraklar sapsız veya kısa saplı, büyük oval, tüylü ve yapıĢkan, özel kokulu ve acı lezzetlidir. Çiçekler tepede salkım durumunda bulunurlar. Tüp Ģeklinde, pembemsi-kırmızı renkli, tüylü ve beĢ sivri diĢli çiçeklere sahiptir. Meyveleri uzunca ve oval Ģekilli küçük tohumludur. Nikotin, tütün bitkisinin kuru ağırlığının % 0,6-3‟ünü oluĢturur. 1893‟te nikotinin kimyasal yapısı Pinner ve Wolfenstein tarafından belirlenmiĢtir (ġekil 7). Kimyasal formülü C10H14N2ve molekül ağırlığı 162,23‟dür. Elementlerin bileĢikteki yüzde oranları: C%74.03, H %8.70, N %17.27‟dir. Kimyasal yapısı adlandırmada 3(1-Metil-2-pirrolidinil) piridin‟dir. 1904 yılında Pictet, Crepieux ve Ritoschy tarafından sentez edilmiĢtir. Biyolojik aktif formunda tütün bitkisinden seçime bağlı olarak sentezlenen iki steroizomeri (L-nikotin ya da S- nikotin) vardır. ġekil 7: Nikotinin kimyasal yapısı Asetilkolin (ACh), nikotinin bağlandığı reseptörün doğal agonistidir (ġekil 8). ACh vücutta kolin ve asetilCoA‟dan kolin asetilaz (kolin asetil transferaz, CAT) ile yapılır[37]. 23 ġekil 8: Asetilkolinin kimyasal yapısı Mekamilamin, nikotinik asetilkolin reseptörünün yarıĢmasız ve seçici olmayan antagonistidir. 1950‟lerde kan basıncını düĢüren ilaç olarak tanımlanmıĢtır. Mekamilamin kan- beyin bariyerinden kolaylıkla geçebilir. Kilinik çalıĢmalar mekamilaminin, nikotinin merkezi ve periferik etkilerini engellemekte etkili olduğunu göstermektedir[38]. Farmakolojik sınıflandırmada “ganglion blokeri” olarak adlandırılan mekamilamin, sigara bırakma amaçlı kullanılan ajanlardan biridir. Kimyasal yapısı (MEC; N,2,3,3-tetrametil-bisiklo[2.2.1] heptan-2-amin hidroklorid) olarak bilinmektedir (ġekil 9). ġekil 9: Mekamilaminin kimyasal yapısı Mekamilamin, beyinde endojen nörotransmiter olarak asetilkolin tarafından uyarılan nikotinik asetilkolin reseptörünü antagonize eder ve bu da orta beyinde dopaminerjik nöronların bazal ateĢleme oranında azalmaya neden olur. Duygudurum bozuklukları, nikotin bağımlılığı, kokain bağımlılığı, Ģizofreni, otizm, epilepsi, Tourette‟s sendromu, alzheimer hastalığı gibi nöropsikyatrik hastalıkların yanında kan basıncını düĢermek için de mekamilamin kullanılır. Mekamilamin nikotinin nAChR‟e bağlanması azaltır. Sigara bırakma amaçlı kullanılmasının nedeni, mekamilamin nikotinin ödül etkisini baskılaması ve böylece sigara içme isteğini azaltmasıdır [38]. 24 2.2.2. NĠKOTĠNĠN ETKĠ MEKANĠZMASI DıĢardan alınan etken maddeler, vücuttaki etkilerini doğal olarak vücutta bulunan bazı maddeleri taklit ederek ya da devam eden bazı iĢlemleri engelleyerek gösterirler. Nikotinin etkisine aracılık eden spesifik bir reseptör 1905 yılında fizyolog John Newport Langley tarafından bulunmuĢtur. Nikotin etkisini vücutta nörotransmiter olarak bulunan bir madde olanasetilkolini (ACh) taklit ederek gerçekleĢtirir. Nikotin, ACh gibi hücre yüzeyinde bulunan asetilkolin reseptörlerine (AChRs) tutunarak etkisini gösterir. Sir Henry Dale (1914), vücutta temel olarak kendilerine bağlanan maddelerle anılan muskarinik asetilkolin reseptörü (mAChRs)ve nikotinik asetilkolin reseptörü (nAChRs) olarak iki büyük grup asetilkolin reseptör varlığını belirtmiĢtir. Muskarinik reseptörler parasempatik son organlarda, nikotinik reseptörler ise otonomik ganglion ve nöromüsküler kavĢakta yer alır. Santral sinir sistemindeki kolinerjik etkiler hem nikotinik hemde muskarinik mekanizmaları aracılığıyla ortaya çıkar. Böylece nikotinin vücuttaki etki yerlerinin sinir-kas kavĢağı, otonomik ganglionlar ve merkezi kolinerjik sinapslar olduğu görülmektedir[39]. 2.2.3. NĠKOTĠNĠK ASETĠLKOLĠN RESEPTÖRLERĠ Asetilkolin reseptörleri ligandla aktive edilen türde nörottransmitter reseptörlerindendir. BaĢlıca iki altbirimden oluĢur: metabotropik muskarinik reseptörler (mAchR) ve iyonotropik nikotinik reseptörler (nAchR). Her ikisi de endojen nörotransmiter asetilkolin ile aktive olur ve hem nöronal, hem de nöronal olmayan hücrelerde eksprese edilirler. Metabotropik reseptörler yedi geçiĢli transmembran proteinler olup, G-protein iliĢkilidir. Amanita muscaria mantar toksini olan muskarin ile aktifleĢir ve itüzümü(nightshade) ailesi üyesi olan Atropa belladonna toksini atropin ile inhibe edilir[40]. Asetilkolin reseptörlerinin diğer sınıfı iyonotropik katyonik kanalları oluĢturan nikotinik reseptörlerdir. nAchR hakkındaki bilgilere bakıldığında iki doğal kombinasyonu bulunduğu görülür. Ġlk bulgu Torpedo balığındadır, avını sersemletmek için elektiriksel organın elektirik akımı üretmesi sonucu yapılan analizlerde nAChR'lerinin anlatımı olduğu görülmüĢtür. Torpedo balığındaki bu 25 organ nAchR proteinlerinin yaklaĢık %40'ını içerdiğinden dolayı reseptörün saflaĢtırılmasında iyi bir kaynak oluĢturmaktadır. Ġkinci keĢif yılan zehri olarak bilinen α-bungarotoksin (α-BGT)ile iliĢkilidir, kas tipi nAChR‟e bağlanırve iĢlevini baskılayarak sinir-kas kavsağında paralize neden olur. Genetik, immunolojik, mikroskobik ve fonksiyonel analizler birleĢtirildiğinde kas tipi nAChR‟lerin birbirleriyle iliĢkili dört adet heteropentamer yapısından oluĢtuğu anlaĢılmaktadır. Genetik ve immunolojik çalıĢmalar, membrandaki merkez por çevresindeki alt ünitelerin organizasyonunun iki α alt ünite ve birer tane β,δ ve γ stokiyometrisi ile iliĢkili olduğunu göstermiĢtir (ġekil 10). ġekil 10: Nikotinik reseptör yapısı (A) Pentamerik yapı; kas tipi, nöronal hetomerik a4b2 ve a3b3b4a5 tipleri ve homomerik a7,a8 ve a9 nikotinik reseptörler bağlanma bölgesi sayısı ve alt birim stokiyometrisi. (B) Nikotinik reseptör sekansında hidrofilik ektraselüler ACh bağlanma bölgesini içeren domain, 4 transmembran segmenti, M1±M4, intraselüler hidrofobik domain ve küçük C terminal domaini. Kutu içinde belirtilen M2 transmembran segmenti iyon kanalı hattıdır. 26 Nikotinik asetilkolin reseptörlerineACh gibi endojen agonistin bağlanmasıyla reseptörde yapısal bir değiĢiklik olur, iyon kanalı açılarak iyon akımı gerçekleĢir ve hücresel yanıt indüklenir ve bunun sonucunda da biyolojik fonksiyonlar düzenlenir. 1914 yılında Henry H. Dale ve Otto Loewi (1936 yılında Nobel Tıp ve Fizyoloji ödülünü paylaĢmıĢlardır) tarafından kalp hızını azalttığı gösterilen ACh, endojen sinyal bileĢiği olarak tanımlanmıĢtır. Claude Bernard bir alkaloid ekstresi olan kürarın ACh reseptörünü inhibe ederek kurbağa iskelet kasındaki kasılmayı engelleyebileceğini göstermiĢtir[40]. Biyokimyasal araĢtırmalar Torpedo reseptörü ve nöronal reseptörlerin her ikisinde de periferik ve nöranal nAchR varlığını göstermiĢtir. Bunlar membran üzerinde beĢ alt ünite içeren hetero-oligomerler ve merkezinde iyon kanalı olan bir fıçı yapısındadır. Tavuk, sıçan, ve insanda moleküler klonlama çalıĢmalarında alt üniteler için kodlanan çeĢitli genler tanımlanmıĢtır. Sinir-kas kavĢağında bulunan periferik nAChR‟de α1, β1, γ ve δ ya da ε altbirimleri bulunur[36, 40]. Memeli genomunda ve insanda nAchR altünitelerinin 16 farklı gen tarafından kodladığı gösterilmiĢtir. Bu genlerin ortak bir atadan gelip gen duplikasyonları ve mutasyonlarla gittikçe farklılaĢtığı varsayılmaktadır. Bu açıdan nAchR evrimsel açıdan en basit yaĢam formundan (yumuĢakçalar, solucanlar ve derisidikenliler) bu yana korunmuĢtur. Ġnsan iyonotropik nAChR ile yüksek derecede yapısal homoloji gösteren iyon kanalları bakterilerde de bulunur ve bu da kanıt niteliğindedir. Bakteri ve omurgasız kanalları arasındaki yapısal homoloji nematodlarda (Caenorhabditis elegans) glutamat duyarlı klorid kanalları kristalizasyonu ile gösterilmiĢtir[36]. ACh molekülleri iki komĢu altbirimin arasına yerleĢir ve α altbirim bağlanma bölgesinin ilk bileĢenini oluĢtururken komĢu alt birimler yapının tamamlanmasını sağlar. Ach bağlanma domaini ile ilgili daha detaylı bilgi Ach bağlanma proteininin (AChBP) kristal yapı çalıĢmalarından sağlanmıĢtır. YumuĢakçalar tarafından ekprese edilen su geçirgen protein sinapsta Ach salımını gösterir. Doğal nAchR‟lerdeki ölçümler ligand bağlanma domaini ve nAchR agonist ve antagonist dizaynını anlamamızı sağlamıĢtır. 2.2.4.NĠKOTĠNĠK ASETĠLKOLĠN RESEPTÖRÜ KODLAYAN GENLER Pek çok çalıĢmada nAchR‟nin beĢ özdeĢ alt birimden oluĢan homopentamerya da farklı alt birimlerin kombinasyonu sonucu oluĢan heteropentamer yapıda 27 olabileceği gösterilmiĢtir. Alt birimler α ve β alt gruplarından oluĢur, bu da protein sekansına ve Torpedo‟da ligand bağlanma bölgesi α alt birimdeki N terminal domainde birbirine komĢu iki sistein pozisyonu 192 ve 193 varlığına göre belirlenir. α alt birimi kodlayan genler CHRNA (1-10) ve β alt birimi kodlayan genler CHRNB(1-4) olarak belirlenmiĢtir. Bunlara ek olarak kas reseptörleri için 3 alt birim daha tanımlanmıĢtır bunlar; CHRNG geniyle kodlanan γ, CHRND geniyle kodlanan δ ve CHRNE geniyle kodlanan ε‟dur. Kas ve nöronal nikotinik asetilkolin reseptörlerinin kodlandığı farklı genlerin kromozomal lokasyonları Ģekil 11‟te gösterilmiĢtir.[36] ġekil 11: Ġnsan karyotipi. Nikotinik asetilkolin reseptörler kodlayan genler ve lokasyonları tipik insan karyoripinde gösterilmiĢtir. 2.2.4.1. CHRNA3 Bilinen diğer adları; LNCR2, PAOD2, NACHRA3. Ġnsan 15.kromozomunda bulunur (15q24) ve 9 eksonu vardır. Nikotinik asetilkolin reseptör ailesi tarafından kodlanır. Bu aile üyelerinin proteinleri alfa ve beta alt ünitelerin her ikisinden de oluĢan pentamerik kompleks yapıdadır. Alfa tip alt ünitelerin kodladıkları 28 karakteristik bitiĢik sistein rezidüleri içerir. Kodlanan proetin ligand kapılı iyon kanalıdır ve nörotransmisyonda rol oynar. Bu genin polimorfizmleri sigaraya baĢlamada artıĢ ve akciğer kanserine hassasiyette artıĢ ile iliĢkilendirilmiĢtir. Alternatif kırpılmalarla çeĢitli transkriptleri tanımlanmıĢtır[41]. 2.2.4.2. CHRNA5 Bir diğer adıyla LNCR2‟dir. Ġnsan 15. kromozomda bulunur (15q24) ve 6 eksonu vardır. Protein, sinapslarda hızlı sinyal aktarımını sağlayan ligand kapılı iyon kanalları üst ailesi üyesi nikotinik asetilkolin reseptör altbirimi geni tarafından kodlanır. Bu reseptörler heteropentamerden oluĢur ama benzer alt üniteleri içerir. Bu gen kusuru akciğer kanser tipi 2 (LNCR2) ile iliĢkilendirilmiĢtir[42]. 2.2.4.3. CHRNA7 NACHRA7 ya da CHRNA7-2 olarak da bilinir. 10 eksonu vardır ve insan 15. kromozomda bulunur (15q14). Nikotinik asetilkolin reseptörleri, sinapslarda hızlı sinyal iletimini düzenleyen ligand kapılı iyon kanalları süperailesinin üyesidirler. nAChR homolog altbirimlerin oluĢturduğu bir heteropentamer yapısında olduğu düĢünülür. Yapının her bir alt birimi N-terminal ekstraselüler domaini takiben üçlü transmembran domain ile korunmuĢtur; bir değiĢken sitoplazmik ilmek, bir tane dörtlü korunmuĢ transmembran domaini ve bir kısa C-terminal ekstraselüler bölgesi. Protein, homo-oligomerik kanal formunda gen tarafından kodlanır. Kalsiyum iyonlarına geçirgenlik gösterir ve beyin nikotinik reseptörlerinin önemli bir bileĢenidir. Alfa-bungaratoksine yüksek duyarlılık gösterir ve alfa-bungaratoksin beyin nikotinik reseptörlerini bloke eder. Bu reseptör asetilkolini bağlar, konformasyonunda değiĢim olur, bundan tüm alt üniteler etkilenir ve iyon geçiren kanalların plazma membranı boyunca açılmasına yol açar. Bu gen juvenil miyoklonik epilepsi için önemli duyarlılıkta bölge olarak tanımlanmıĢtır ve Ģizofreninin genetik iletiminde kromozomal lokasyonu içerir. Alternatif kırpılmalar sonucu çoklu transkript varyantları bulunmaktadır[43]. 29 2.2.4.4.CHRNB2 Bilinen diğer adları: EFNL3, nAChRB2‟dir. Ġnsan 1. kromozomunda bulunur (1q21.3) ve 6 eksonu bulunmaktadır. Nöronal asetilkolin reseptörleri homo ya da heteropentamerik kompleksleri homolog alfa ya da beta altünitelerden oluĢur. Asetilkolin ve nikotin gibi ligand yanıtlarında plazma membranından sodyum ve potasyum geçiĢine izin veren ligand kapılı iyon kanalları süperailesi üyesidir. Bu gen bazı beta altüniteleri kodlar. Bu gendeki mutasyon otozomal dominant noktürnal frontal lob epilepsisi ile iliĢkilendirilmiĢtir[44]. 2.2.4.5.CHRNB4 Ġnsanın 15. kromozomunda bulunur ( 15q24) ve 6 eksonu vardır[45]. 2.2.5. NĠKOTĠNĠN ETKĠLERĠ Sigarada bulunan temel psikoaktif madde olan nikotin, bağımlılığa yol açan pekiĢtirici özellikten sorumludur. Nikotin, kolinerjik bir ajan olarak merkezi sinir sisteminde spesifik bir uyanıklık etkisi oluĢturmakta ve biliĢsel fonksiyonları geliĢtirmektedir[46]. Nikotin, mezokortikolimbik sistemden dopamin salımını uyararak nikotinin ödül etkilerini sağlamaktadır. Nikotin, nikotinik asetilkolin reseptörleri aracılığıyla ventral tegmental alanda dopaminerjik nöronları uyarır ve nukleus akumbenste dopamin salımı artar[38]. 2.3. STRES VE NĠKOTĠN Sigara içme, kortizol ve nikotin arasında en az üç nedensellik iliĢkisi bulunmaktadır. Birincisi HPA ekseni bağımlılık süreçlerini kapsar. Ġkincisi artmıĢkortizol seviyeleri; lipid profilleri, immun fonksiyonlar, merkezi adipozite, kemik mineral yoğunluğu ve üreme fonksiyonlarını içeren uzun süreli sağlıkla iliĢkili biyolojik süreçlerde olumsuz etki gösterir. Üçüncüsü ise, psikolojik stresin yüksek kortizol seviyelerine duyarlı olmasıdır. Çoğu sigara içicisi için sigarayı bırakmak stresli bir durumdur. Kortizol doğrudanbu sürecin içinde yer alır ve sigarayı bırakanlarda erken dönem kötü etkilerden sorumludur [47]. 30 Nikotinin stres yanıt hormonları, ACTH ve prolaktin salgılanmasında kuvvetli bir uyarıcı olduğu gösterilmiĢtir. HPA ekseni ve nikotinin ACTH salgılanması üzerindeki etkisine değilinen çalıĢmalarda; nikotin etkisi sonucu merkezi bir mekanizma aracılığı ile anterior hipofiz kortikotroptan ACTH salınımının dolaylı olarak uyarıldığı gösterilmiĢtir. Nikotinin ACTH düzenlenmesi açısından CRH bölgesi nöronları ve hipotalamik PVN‟de doğrudan önemli etkileri olduğu anlaĢılmaktadır. Diğer yandan, beyin sapındaki katekolaminarjik nöronlardan, özellikle noradrenarjik/adrenerjik nukleus traktus solitaryus (NTS) nöronları PVN‟ ye projekte olur ve nikotine doza bağımlı duyarlılık gösterir. Bu katekolaminlerin (nörotoksik lezyon, sentetik enzim inhibitörleri ya da adrenarjik reseptör antagonistleri gibi nedenlerle) azalması, nikotinle uyarılan ACTH sekresyonunun inhibisyonu ile sonuçlanır. Buna ek olarak beyin sapında, mekamilamin gibi antagonistler kullanılarak nikotinik kolinerjik reseptör (NAchRs) blokajı, PVN terminalinden norepinefrin (NE) salımında doz bağımlı azalma ve beraberinde plazma ACTH düzeylerinin azalması ile sonuçlanır. Heterojen olarak farklı altbirimleri içeren nikotinik asetilkolin reseptörleri, nikotinik agonistlere karĢı da farklı duyarlılıklar gösterirler. Kronik nikotin uygulamasında nöroendokrin yanıtın duyarsızlaĢması sonrasında nikotin metabolizması değiĢimi yerine nAChR‟lerde değiĢim olur[48]. Mezokortikolimbik sistem dopamin nöronlarındaki nAChR‟lerinin nikotinle duyarsızlaĢtırılması antidepresan benzeri etkiler oluĢturmaktadır. Aynı zamanda nikotinin postgangliyonik sempatik sinir sonlanmalarından noradrenalin salgılanmasına neden olduğuve sempatomimetik etkilere yol açtığı bilinmektedir. Nikotinin sempatomimetik etkileriyle stres yanıtlarını artırması beklenirken sigara içenler genellikle sigaranın stresi azalttığını ifade etmektedirler. Nikotinin uyanıklık ile azalmıĢ stresi birlikte oluĢturması Nesbitt paradoksu olarak adlandırılmaktadır [49]. Nikotinle ilgili moleküler mekanizmaların açığa kavuĢturulması bağımlılıkla mücadele edebilmek için önem taĢımaktadır. Yapılan epidemiolojik çalĢmalarda nikotin ile depresyon arasında bağlantı olduğu saptanmıĢtır. Bu çalıĢmalara göre Ģu sonuçlar bildirilmiĢtir: (1) Sigara içicileri depresif bulgular göstermektedir. (2) Depresyona girmiĢ olan kiĢilerde daha sık sigara içiciliği ile karĢılaĢılmaktadır. (3) Depresyon öyküsü olan sigara içicileri sigarayı bırakmada çok daha fazla zorlukla karĢılaĢmaktadır. (4) Sigarayı bırakma programlarından sonra genellikle bu kiĢilerde depresyon görülmektedir. 31 File ve arkadaĢları, orta dereceli stres karĢısında endiĢe, hoĢnutsuzluk ve saldırganlığın anlamlı olarak arttığını ve nikotinin kadınlarda strese karĢı yatıĢtırıcı etkisi olduğu halde erkeklerde stres yanıtını artırcı etkisi olduğunu bildirmiĢlerdir[1]. Tüm bu bulgular; nikotin, stres ve glukokortikoidler arasında önemli bir iliĢki olduğunu göstermekle birlikte, bu iliĢkinin altında yatan mekanizmaların öğrenilebilmesi için yeni araĢtırmaların yapılması kaçınılmazdır. 2.4. SH-SY5Y HÜCRE HATTI SH-SY5Y, nöronal hücre araĢtırmalarında yaygın olarak kullanılan bir hücre hattıdır. Kovalevich ve Langford‟un detaylı tanımlamasına göre; insan SH-SY5Y (ATCC ® CRL-2266™) hücre hattı, parental metastatik kemik biyopsi hücre hattı olan SK-N-SH (ATCC ® HTB-11™) alt kültüründen 1970‟li yıllardaJune Biedler tarafından elde edilmiĢtir. SH-SY5Y hücreleri farklılaĢmadan sürekli çoğalabilir, morfolojileri nöroblast gibidir ve olgunlaĢmamıĢ nöronal iĢaretleyicileri eksprese edebilirler. FarklılaĢtırılmıĢ SH-SY5Y hücre morfolojileri primer nöronlara benzer, çoğalma hızında, hücre siklusundan çıkıĢta ve G0 giriĢte azalma gösterirken, nöron spesifik marker ekspresyonunda artıĢ gösterirler. Hücrelerin farklılaĢmasını indüklemek için kullanılan bazı ajanlar retinoik asit, forbol esterleri ve dibütiril cAMP (Siklik adenozin monofosfat)‟dir[50]. Bunların yanı sıra BDNF (Beyin kaynaklı nörotrofik faktör), NGF (Nöron büyüme faktörü) gibi büyüme faktörleriyle nörogulinler de kullanılmaktadır. Daha az kullanılan farklılaĢtırma faktörleri vitamin D metaboliti ve kolesteroldur[51]. FarklılaĢtırma için iĢaretleyiciler βIII tübulin, sinaptofizin, mikrotubul iliĢkili protein 2 (MAP2), nöron spesifik enolaz, sinaptik bağlantılı protein 97 (SAP-97) ve nöronal spesifik nuklear protein NeuN olarak sıralanabilir. Embriyonik merkezi sinir sistemi dokularından köken alan primer memeli nöronlarının olgun nörona farklılaĢması sınırlıdır. Ġn vitro transforme nöron tipi hücre hattı kullanımı bu sınırlandırmayı ortadan kaldırır. SH-SY5Y hücre hattının in vitro çalıĢmalarda kullanılmasında üç önemli karakteristik özelliği sayılabilir. Ġlk olarak, bu hüvre hattı yüzeye bağımlı ve süspanseolmak üzere her iki tip hücreyi de içerir. Bazı çalıĢmalarda süspansehücre 32 fenotipine karĢı yüzeye bağımlı hücre tipinin biyolojik olarak önemine olmakla birlikte, birçok çalıĢmada ortam değiĢimi sırasında süspansehücrelerin uzaklaĢtırılmasıyla yüzey bağımlı hücreler kullanılmıĢtır. Ġkinci olarak, Biedler‟in grubu tarafından parental farklılaĢtırılmıĢ SK - N - SH hücre hattının morfolojik olarak nöroblast hücreler ve epitelyal hücreler olmak üzere iki farklı fenotip içerdiği belirtilmiĢtir. Daha sonraki çalıĢmalarda SH-SY5Y hücrelerindeki bu iki fenotip Encinas ve arkadaĢları tarafından “N” ve “S” tipi olarak adlandırılmıĢtır. Üçüncüsü, SH-SY5Y hücreleri nöronal markerlar tarafından karakterize edilen olgun nöron fenotipine farklılaĢabilir. SH-SY5Yhücrelerinin ikilenme zamanı tam olarak belirtilmemesine rağmen parental nöroblast benzeri populasyonda ikilenme zamanı yaklaĢık 27 saattir ve alt kültürleri benzer ikilenme zamanı göstermiĢtir. SH-SY5Y nöroblastoma hücrelerinin farklılaĢabilmesi sinirbilim araĢtımaları için avantajlıdır. Primer nöron kültürlerine göre daha düĢük maliyet sağlar. Hücre hattı olmasından dolayı primer insan nöronal kültür çalıĢmalarında olduğu gibi etik kaygıları içermez. Bunlara ek olarak insan kaynaklı hücreler olmasından dolayı insan özel proteinleri ve protein izoformlarını eksprese ederler. FarklılaĢtırılmıĢ ve farklılaĢtırılmamıĢ SH-SY5Y hücreleri nöron benzeri hücre kullanımının gerekli olduğu in vitro deneylerde kullanılmaktadır. Bu tür hücrelere; nöronal farklılaĢmayla nöritlerin uzaması ve formasyonu, plazma membranında artan elektriksel uyarı, fonksiyonel sinapslarda sinaptofizinpozitif formasyonu, nörona özel enzimler, nörotransmiterler ve nörotransmiter reseptörleriile iliĢkili özel araĢtırmalarda ihtiyaç duyulur. SH-SY5Y hücrelerinin farklılaĢtırılmamıĢ formunun morfolojisi nöroblast benzeri ve non-polarize hücre gövdesi Ģeklinde karakterize edilir. Bu hücreler kümeler halinde büyüme eğilimindedir ve hücre kümeleri baĢka bir hücre kütlesinin merkezinde üste doğru büyüme izlenimi verir. Kültürler süspanse ve yüzeye bağımlı hücreleri içerir ve bazı çalıĢmalarda retinoik asit uygulamasıyla farklılaĢtırma sırasında süspanse hücrelerin yüzeye bağımlı hücrelere göre “N” tipi hücrelere dönüĢmesinin daha muhtemel olduğu gösterilmiĢtir. FarklılaĢmamıĢ SH-SY5Y hücreleri immatür nöronal markerları eksprese ederler ve sürekli çoğalabilirler. FarklılaĢan hücrelerde çoğalama hızı yavaĢlar ve nöron spesifik enolaz (NSE), nöronal ve nöroendokrin dokularda bulunan baskın enolaz-izoenzimaktivitesi artar. SH-SY5Y hücreleri medium Ģartlarına bağlı olarak kolinerjik, adrenarjik ya da 33 dopaminerjik çeĢitli nöronal fenotiplere yönelebilir. SH-SY5Y hücrelerinin farklılaĢtırılması için en yaygın olarak kullanılan ajan retinoik asittir (RA). FarklılaĢmamıĢ SH-SY5Y hücreleri olgunlaĢmamıĢ katekolaminerjik nöronlara benzerler. Proliferasyon hücre nuklear antijeni (PCNA) gibi hücre çoğalmasını gösteren belirteçlerin yanı sıra, nestin gibi olgunlaĢmamıĢ nöronal belirteçler ile karakterize edilir. SH-SY5Y hücreleri farklılaĢmayı takiben, βIII tubulin, mikrotubul bağlantılı protein 2 (MAP2), sinaptozin, NeuN, sinaptik bağlantılı protein 97 (SAP97) ve NSE gibi bazı olgun nöron markerlarını eksprese eder. SH-SY5Y hücreleri; hem farklılaĢmıĢ hem de farklıĢmamıĢ durumda dopaminerjik nöron markerlarını eksprese eder. RA ya da 12-O-tetradekanoyilforbol 13-asetat (TPA) ile farklılaĢmayla adrenarjik fenotipe dönüĢürler. Muskarinik ve nikotinik asetilkolin reseptörlerinin ikisi de bu hücrelerde eksprese edilir. G proteini ile eĢleĢtirilmiĢ muskarinik reseptörler farklılaĢmıĢ ve farklılaĢmamıĢ hücelerin membranında bulunurlar. TPA ve RA uygulanmıĢ hücreler farklılaĢmamıĢ hücrelerle kıyaslandığında asetilkolinesteraz aktivitesinde belirgin artıĢ görülür. Buna rağman sadece RA uygulandığında kolin asetiltransferaz aktivitesinde artıĢ görülür. Ligand kapılı iyon kanalı oluĢturan nikotinik asetilkolin reseptörleri de SH-SY5Y hücrelerinde bulunur ve insandakiganliyon tipi nAChR analoğu kabul edilri. SHSY5Y hücrelerindeki nACh reseptörlerinikotine yanıtta desensitizasyon gösterir. SHSY5Y hücrelerinde bulunan nAchR, nikotine desensitize yanıt gösterir ancak primer nöronlardaki reseptör aktivasyonuna benzer Ģekilde, yıkamayı takiben yeniden sensitizeolur [50]. 2.4.1.RETĠNOĠK ASĠT All-trans retinoik asit, retinolun doğal bir metabolitidir ve A vitamininin biyolojik özelliklerini taĢır. Normal büyüme hücre farklılaĢması ve bağıĢıklık fonksiyonlarında gereklidir. Retinoik asit biyolojik fonksiyonlarını RA reseptörü (RAR) ve retinoid X reseptörü (RXR) olarak adlandırılan nükleer retinoid reseptörleri aracılığıyla düzenler. Bu reseptörler retinoid yanıt genlerinde transkripsiyonel aktivasyonu sağlar. Böylece retinoidler hücre büyümesini düzenlerken, çeĢitli hücre kültürlerinde ve hayvan modellerinde hücre farklılaĢmasını sağlar[52]. 34 SH-SY5Y hücrelerinin farklılaĢtırılmasında en yaygın kullanılan ve en iyi tanımlanan metod, kültür ortamına retinoik asit eklenmesidir. Retinoik asit güçlü büyüme inhibe edici ve hücresel farklılaĢmayı teĢvik edici özelliktedir. Genel olarak En az 3-5gün süreyle 10 µM konsantrasyonda RA uygulaması ile hem serumsuz hem de düĢük serumlu ortamlarda farklılaĢma indüklenir. SH-SY5Y hücrelerinde retinoik asit uygulmasının fosfotidilinozitol 3 kinaz/Akt sinyal yolağını aktive ettiği ve antiapoptotik Bcl-2 proteini artırdığı gösterilmiĢtir. Buna ek olarak bazı çalıĢmalardaRA-farklılaĢtırılmıĢ hücrelerin,6hidroksi dopamin (6-OHDA), 1-metil-4-fenil-1,2,3,6-tetrahidropiridin (MPTP) ya da metabolitleri ve1-metil-4-fenil piridinyum iyonu (MPP+) içeren ajanlar tarafından indüklenen toksin aracılı hücre ölümünde farklılaĢmamıĢ hücrelere göre daha dayanıklı olduğu gösterilmiĢtir. RA uygulaması SH-SY5Y hücrelerindeöncelikle kolinerjik nöron fenotipini farklılaĢtırır ve bu farklılaĢma kolin asetil transferaz (ChAT) aktivitesi ve veziküler monoamin transporter (VMAT) ekspresyonu artıĢı ile gösterilebilir. Hücreler RA uygulamasıyla olgun dopaminerjik fenotipe de dönüĢebilirler ancak, bu durum forbol esterleri gibi ek ajanların birlikte uygulanmasını gerektirir. FarklılaĢmamıĢ SH-SY5Y hücrelerinde bulunan dopaminerjik markerlar retinoik asit ile indüklenen farklılaĢtırma sonrasında önemli derecede artar. ÇalıĢmalar forbol esterleri uygulamasını takiben RA uygulamasıyla tirozin hidroksilaz (TH), dopamin reseptör 2 ve 3 alt tiplari (D2R ve D3R) ve dopamin transporter (DAT) ekspresyonuyla bu artıĢı göstermiĢtir. Ġlginç bir Ģekilde Encinas ve arkadaĢları RA-farklılaĢtırılmıĢ SHSY5Y hücrelerindekarbakol stimulasyonuna artmıĢnoradrenalin salgılanmasıyla yanıt oluĢtuğunu 2000 yılında rapor etmiĢlerdir[50]. Retinoik asitin SH-SY5Y hücre kültüründe büyüme ve farklılaĢmasını incelemek için retinoik asit içermeyen besi ortamı ve 1µM RA içeren besiortamı olacak Ģekilde 2 deney grubu oluĢturulmuĢ, RNA izolasyonu sonrasında mikroarray hibridizasyonu, seçilen genler ile qPCR, protein izolasyonu sonrası western blot yöntemleriyle analizler yapılmıĢ ve sonuç olarak RA uygulamasıyla ile gen anlatımının değiĢtiği, hücresel farklılaĢma ve çoğalmanın düzenlendiği bulunmuĢtur[53]. 35 2.5. POLĠMERAZ ZĠNCĠR REAKSĠYONU Polimeraz zincir reaksiyonu (PCR), laboratuvar ortamında spesifik DNA dizilerinin; primer olarak adlandırılan sentetik oligonükleotid diziler yardımıyla çoğaltılması iĢlemidir. PCR metodu ilk kez Kary Mullis tarafından (1987) tanımlanmıĢ olup, Mullis bu buluĢundan dolayı 1993 yılı Nobel Kimya Ödülüne hak kazanmıĢtır. PCR, bir çeĢit "in vitro klonlama" olarak kabul edilebilir. Tipik bir PCR üç temel basamakta gerçekleĢir: 1. Denatürasyon: Ġlk aĢamada DNA molekülünün çift zincirli yapısı yüksek ısı yardımıyla birbirinden ayrılır (denatürasyon) .Çoğunlukla 94°C- 97°C arasında 1560 saniye süresince uygulanır. Ġlk denatürasyon tek döngü olarak 5-15 dakika olarak uygulanır. 2. Bağlanma (annealing): Denatürasyonu takiben daha düĢük ısılarda oligonükleotid primerler, ayrılmıĢ olan tek zincirli DNA üzerinde kendilerine özgül bölgelere bağlanırlar. Bu olay çoğunlukla 47°C- 60°C arasında 30-60 saniyede gerçekleĢir. 3. Uzama (elongasyon): Uzama aĢamasında ısı 72°C‟ye kadar arttırılarak DNA polimeraz enziminin tamamlayıcı DNA zincirini uzatması sağlanır. Uzama basamağının süresi kullanılan polimerazın cinsine ve amplifiye edilecek DNA„nın uzunluğuna göre değiĢir. PCR‟ın bu üç basamağının her tekrarında DNA miktarı teorik olarak iki katına çıkar. OluĢan ürün; ilk koyulan DNA miktarı ve döngü sayısına bağlıdır.Bu teknikle; bir DNA hedefini 106-1012 kat arasında çoğaltmak mümkündür. Yöntemin temeli, çoğaltılmak istenen bölgenin iki ucuna özgü, bu bölgedekibazdizilerine tamlayıcı bir çift sentetik oligonükleotid primer (18-20 baz uzunluğunda) kullanılarak; bu iki primer ile sınırlandırılan genin enzimatik olarak sentezlenmesine dayanır. PCR Teknolojisi için: 1) DNA örneği (genelde genomik DNA),2) Çoğaltılacak olan bölgeyi sağdan ve soldan çevreleyen bir çift sentetik primer,3) dNTP'ler (A,T,C,G),4) Isıya dayanıklı DNA-Polimeraz enzimi, ve 5) Uygun pH ve iyon koĢullarını (Mg+2) sağlayan tampon karıĢımı gereklidir. PCR'nin orijinal protokolünde E.Coli DNA polimeraz I'in Klenowparçası, birleĢen oligonükleotidlerin polimerizasyonunda kullanılmıĢtır. Ancak DNA'yı denatüre etmek için gerekli olan ısıya ulaĢıldığında; enzim inaktive olur. Her ne 36 kadar bu yöntem 200 bp altındaki reaksiyonlar için iyi çalıĢsa da; uzunsegmentlerde baĢarılı olmamıĢtır. Uzun segmentlerde PCR ürünü çok iyi olmayıp; primerin yanlıĢ bölgeye yapıĢmasına (mispriming)bağlı olarak farklı büyüklüklerde PCR ürünü elde edilmektedir. Bu tip problemler ısıya dayanıklı Taq Polimerazlarin bulunması ile önlenmiĢtir. 2.5.1.GERÇEK ZAMANLI (REAL-TİME) PCR PCR ürünü kantitasyonunun özgün, hassas ve diğer metodlara göre daha kolay tespit edilebildiği bir yöntemdir. Gerçek zamanlı PCR sisteminin temelini floresan taĢıyıcı moleküllerin ıĢınımlarının tespiti ve miktarının belirlenmesi oluĢturur. Sinyal artıĢı PCR ürün artıĢıyla direkt orantılıdır. DNA amplifikasyonunu belirlemek için değiĢik floresan sistemler kullanılır. Bu geliĢim sayesinde gen kopya ürünlerinin düzeylerini sayısal değerlere dönüĢtürerek ölçmek, devam eden PCR reaksiyonunu ekranda izleyerek gerçek zamanlı (real-time) olarak reaksiyonun gidiĢine müdahale etmek ve PCR döngülerinin sayısıyla oynayabilmek de mümkündür. Birçok adlandırmayla anılan bu teknolojiye floresan okuma yapması nedeniyle Floresan Kantitatif RT-PCR, Kantitatif-kinetik PCR gibi çeĢitli isimler verilebilmektedir [54]. ġekil 12: : Gerçek zamanlı PCR döngüsündeki fazlar Gerçek zamanlı PCR döngüsündeki fazlar: 1.Üssel Faz (Exponential Faz) PCR ürün miktarı her siklusta tam olarak iki kat artar, 37 Reaksiyon spesifik ve tamdır, Reaksiyonun etkinliği %100‟dür, Reaksiyonun tüm bileĢenleri tazedir. 2.Linear Faz (yüksek farklılık) Reaksiyonun bileĢenleri tükenmeye baĢlar, Reaksiyon yavaĢlar, OluĢan PCR ürünleri degrade olmaya baĢlar, 3.Plato Fazı (Plateu Phase -End-point) Reaksiyon sonlanmakta, Yeni PCR ürünü oluĢmamakta, PCR ürünleri degrade olması artmaktadır. Gerçek zamanlı PCR yöntemi çeĢitli amaçlarla nükleik asitlaerin kalitatif veya kantitatif olarak saptanabilmesi amacıyla kullanılabilmektedir. Gerçek zamanlı PCR yöntemini, daha önceden geliĢtirilmiĢ olan standart PCR yönteminden ayıran iki önemli özellik vardır: Birincisi, real-time-PCR yönteminde termal döngü cihazıyla birleĢtirilmiĢ bir optik okuma sisteminin kullanılmasıdır. Ġkincisi ise, PCR iĢlemi sırasında amplifikasyonu bilgisayar ekranına yansıtacak bir probun veya probların bulunması gereğidir. Bu nedenle özellikle uygun prob seçimi, gerçek zamanlı PCR iĢleminin verimliliğini etkileyen en önemli basamaklardan biridir. Probun iĢlevi, cihaz içerisinde gerçekleĢtirilmiĢ olan çoğaltma iĢleminin, gözle görülür hale getirilmesidir. Prob kullanılmadan da, PCR tüpü içerisinde uygun primerlerin, dNTP‟lerin ve enzimin kullanımıyla PCR iĢlemi gerçekleĢecektir. Ancak prob kullanılmadan sonucun gerçek zamanlı PCR cihazının bilgisayarında görüntülenmesi mümkün olmayacaktır. Problar, florofor denen ve belirli dalga boyundaki ıĢıkla uyarıldığında floresan ıĢıma yayabilme özelliğine sahip sentetik oligonükleotidlerdir. Genel olarak bakıldığında prob dizileri, PCR tüpü içerisinde çoğaltma iĢlemi gerçekleĢirken, çoğaltılmıĢ olan hedef DNA zincirlerine bağlanarak floresan ıĢıma oluĢmasına neden olurlar. Bu iĢlemin gerçekleĢebilmesi için problar, hedef DNA‟nın belirli bir dizisine tamamlayıcı olacak Ģekilde tasarlanmalıdır. Prob, tek zincirli hedef DNA üzerinde tamamlayıcı olduğu bölgeye bağlandıktan sonra, gerçek zamanlı PCR cihazının ıĢık kaynağı, PCR tüpü içine 38 uyarıcı kısa dalga boylu ıĢık gönderir. Kısa dalga boylu ıĢığın absorpsiyonu sonrasında, uzun dalga boylu ıĢık salınımı oluĢur. Böylece gerçekleĢen floresan ıĢıma, cihaz tarafından algılanır. PCR tüpü içerisinde ne kadar çok hedef DNA varsa o kadar çok prob bağlanacak ve floresan ıĢıma miktarı da o derecede fazla olacaktır. Gerçek zamanlı PCR iĢlemi ile çoğaltılmıĢ olan hedef dizilerin görüntülenebilmesi amacıyla kullanılan çeĢitli problar mevcuttur. Buradaki temel amaç, çoğaltımlı olan PCR ürünleriyle, kullanılan probun etkileĢime girmesinin sağlanmasıdır. Bunun sonucunda hedef DNA‟ya floresan veren boyaların bağlanmasıyla DNA kantitasyonu mümkün olabilmektedir. Gerçek zamanlı PCR yönteminde floresan kimyası, iki sınıf altında incelenebilir: Genel yöntemler ve zincire özgül yöntemler. Genel yöntemlerde DNA‟ya özgül olmadan bağlanan problar kullanılır. Bir baĢka deyiĢle bu yöntemde kullanılan problar PCR tüpü içerisindeki her çift zincirli DNA‟ya bağlanarak floresan oluĢmasına neden olurlar. Zincire özgül yöntemlerde kullanılan problar ise, primer bağlanma bölgeleri arasındaki hedef DNA‟nın komplementer bir bölgesine bağlanarak floresan ıĢımaya neden olurlar. Bu yöntemlerin avantajı, primer-dimer bağlanması gibi özgül olmayan çoğaltma ürünlerinin floresan ıĢımayla sonuçlanmamasıdır. Bu nedenle özgüllükleri daha yüksektir ve daha iyi sinyal oluĢumu sağlarlar. Gerçek Zamanlı PCR’da kullanılan prob sistemleri ve boyalar: A. Özgül Floresan ĠĢaretli Problar FRET (Fluorescence Resonance Energy Transfer) Taqman Molecular Beacons Scorpion Primerleri Hibridizasyon Probları B. Özgül Olmayan Floresan ĠĢaretli Problar Sybr Green I Etidyum Bromid 39 ġekil 13: A: SYBR Green, B: Taqman, C: Molecular Beacons; D: LightCycler 2.5.1.1.DNA’YA ÖZGÜL OLMADAN BAĞLANAN BOYALARLA GENEL BELĠRLEME Bu yöntemde, çift zincirli DNA‟ya özgül olmadan bağlanan özel boyalar prob görevi görürler. Bu amaçla en sık kullanılan boya molekülleri “SYBR Green I” ve “SYBR Gold”dur. Bu boyaların çift zincirli DNA arasına girerek bağlanması sonucunda 20-100 katlık bir floresan ıĢıma artıĢı olur ve bu ıĢıma gerçek zamanlı PCR cihazı tarafından okunur. Primerlerin bağlanmasını takiben gerçekleĢtirilen uzama aĢamasında hedef DNA‟nın çift sarmal hale gelmesiyle DNA‟ya bağlanan “SYBR green” miktarı artar ve buna bağlı olarak yayılan floresan miktarında artıĢ gözlenir. “SYBR green”, yalnızca çift zincirli DNA‟ya bağlandığında floresan veren bir boyadır. Ancak floresan artıĢı her zaman özgül amplifikasyonu göstermeyebilir. Çünkü ortamda hedef DNA bulunmadığı durumlarda “SYBR green”, primerlerin kendi aralarında gerçekleĢebilecek bağlanmalar (primer dimerleri) sonucunda bu yapılara katılarak floresan oluĢumuna neden olabilmektedir. Böyle durumlarda elde edilen floresan ıĢımanın istenen hedef bölgenin amplifikasyonuyla mı gerçekleĢtiği, yoksa primer dimer oluĢumu ile ortaya çıkmıĢ özgül olmayan bir ürün mü olduğunu anlayabilmek için erime eğrisi (“melting curve”)analizi yapılır. Her çift sarmal DNA kendine özgü erime sıcaklığı (“melting temperature” Tm) (çift sarmal DNA‟nın %50‟sinin tek sarmal hale geçmesi için gerekli sıcaklık) değerine sahiptir. PCR amplifikasyonu 40 sonrasında sıcaklık yavaĢ yavaĢ yükseltilerek, belirli aralıklarla tüpteki floresan miktarı kaydedilir. Çift sarmal DNA zincirleri birbirlerinden ayrılmaya baĢlayınca “SYBR green” boyası serbest kalır ve floresan miktarı azalmaya baĢlar. Erime eğrisinden yararlanılarak Tm derecesi hesaplanır. Test edilecek örneğe ait Tm derecesi, aynı koĢullarda iĢleme alınan pozitif kontrolün Tm derecesiyle karĢılaĢtırılarak PCR sonucu elde edilen ürünün özgül ürün olup olmadığına karar verilir. Tm dereceleri aynı ise, aranan hedef bölgenin amplifikasyonu gerçekleĢtirilmiĢ demektir. Farklı Tm dereceleri saptanması durumunda, elde edilen amplifikasyonun özgül olmayan bir ürüne ait olduğu sonucuna varılır. ġekil 14: SYBR Green yöntemi[55] 2.5.1.2.DNA’YA ÖZGÜL OLARAK BAĞLANAN PROBLARLA BELĠRLEME Bu tür yöntemlerde prob, çoğaltılmıĢ olan ürünün tamamına değil, ürün içindeki özgül bir bölgeye bağlanır. Bir baĢka deyiĢle, floresan ıĢıma oluĢması aslında tam olarak hedef bölgenin değil, hedef bölge içindeki proba komplementer dizinin varlığını göstermektedir. Böylece hedef bölgenin varlığı dolaylı yoldan gösterilmiĢ olmaktadır. Bu yöntemde probların verimliliği çok önemlidir. Kullanılan 41 problar, çoğaltma iĢleminin baĢlangıç aĢamasındaki az sayıdaki hedef bölge varlığını da saptayabilmelidir. Farklı Ģekilde iĢlev gören değiĢik problar mevcuttur. Özgül problar kullanılarak gerçek zamanlı PCR ile amplifikasyonun saptanması (FRET: Fluorescence Resonance Energy Transfer): Özgül problardan biri 3‟ ucundan floresan boya ile iĢaretli (donör boya), diğeri 5‟ ucundan alıcı boya (acceptor dye) ile iĢaretlidir. Bu tür problara dual hibridizasyon probları adı verilir ve uzunlukları 30 nükleotide kadar olabilir. Lineer hibridizasyon probları kullanılarak gerçek zamanlı PCR ile amplifikasyonun saptanması, direkt hibridizasyon esasına dayanır. Bağlanma sonrasında ikinci probun 5‟ ucundan sentez olmaması için bu uca bir fosfat bağlanmıĢtır. Problar hedef bölge üzerinde birbirine yakın yere (1-5 nükleotid uzaklıkta) bağlanır ve iĢaretli uçlar yanyana gelmiĢ olur. Ġki boyanın yanyana gelmesiyle açığa çıkan enerji, ikinci prob üzerindeki alıcı boyayı etkileyerek floresan oluĢumuna neden olur. OluĢan floresan miktarı, ortamdaki hibridizasyonun derecesine (PCR ile oluĢan ürün miktarına) bağlı olarak artar. Her PCR döngüsünün düĢük sıcaklık basamaklarında prob hedef DNA‟yabağlanarak ıĢıma sağlar, yüksek sıcaklık basamaklarında hedeften ayrılır. Her döngüde, probların bağlanabileceği hedef DNA miktarı arttığı için, sinyal miktarıda artar. TaqMan probları kullanılarak gerçek zamanlı PCR ile amplifikasyonun saptanması (5‟ekzonükleaz aktivitesi): Bu sistemde 5‟ ve 3‟ uçlarından florokrom maddelerle iĢaretli TaqMan probları kullanılır (“dual labelled probe”). Probun 5‟ ucunda raportör florokrom, 3‟ ucunda ise baskılayıcı florokrom bulunur. Prob, tek sarmal halegetirilen hedef bölge üzerinde, primerlerin bağlanma bölgesinin arasındakalan yere bağlanır. Prob ile hedef bölge arasındaki hibridizasyon devam ettiği sürece raportör florokrom maddenin sinyal oluĢturması, 3‟ ucundaki baskılayıcı florokrom madde tarafından engellenir. Primerlerin hedef nükleik asite bağlanmasını takiben baĢlatılan primer uzaması probun bağlandığı noktaya geldiğinde, sentezin devam edebilmesi için TaqDNA polimeraz enzimi 5‟-3‟ekzonükleaz aktivitesini kullanarak probu 5‟ ucundan itibaren yıkmaya baĢlar. Böylece raportör florokrom serbest hale geçer ve sinyal oluĢturur. Her döngüde üretilen ürün arttıkça, floresan miktarında artma gözlenir. Bu yöntemde dikkat edilmesi gereken nokta, ıĢımanın probun DNA‟ya bağlanmasıyla oluĢmadığı, probun kırılarak ayrılmasını sağlayan 5‟3‟ ekzonükleaz aktivitesi ile oluĢtuğudur. Bu nedenle bu tür problara hidroliz probları adı verilir. 42 ġekil 15: Taqman yöntemi[55] Gerek hibridizasyon probları kullanıldığında, gerekse hidroliz probları kullanıldığında, her PCR döngüsünde oluĢan floresan ıĢıma miktarı artar. Ancak floresan sinyali oluĢumu, hibridizasyon problarında hedef DNA‟ya bağlanma sonucunda oluĢurken, hidroliz problarında hedef DNA‟dan ayrılma sonucunda oluĢur. Hibridizasyon probları özellikle mutasyonların saptanmasına yönelik erime eğrisi analizi için uygunken, hidroliz probları erime eğrisi analizinde kullanılamazlar. “Molecular beacon” ve diğer konformasyonel problar kullanılarak real-timePCR ile amplifikasyonun saptanması: Konformasyonel problarla PCR ürününün saptanması, DNA‟ya bağlandıktan sonra meydana gelen yapısal değiĢiklik sonucunda ıĢıma oluĢması esasına dayanır. “Molecular beacon” yapıları, TaqMan problarından geliĢtirilmiĢtir. Bu nedenle kimyasal yapısı, 5‟ ve 3‟ uçlarında raportör ve baskılayıcı florokrom bulunması nedeniyle 5‟ nükleaz aktivitesinde kullanılan problara benzerdir. Ancak saptama aĢaması, probun kırılmasıyla ıĢımanın oluĢması esasına dayanmaz. Bu yapılar 5‟ ve 3‟ uçları bir firketenin iki ucunu oluĢturacak Ģekilde, bükülmüĢ bir yapıda tasarlanmıĢlardır. Raportör vebaskılayıcı moleküllerin komĢuluğunda birbirine tamamlayıcı diziler vardır.“Molecular beacon” yapısının komplementer olduğu hedef DNA‟ya tam olarak bağlanabilmesi için, bu yapının doğrusal olarak açılması ve bu Ģekilde bağlanması gereklidir. Bu açılarak bağlanma 43 sonucunda iki florokrom birbirinden uzaklaĢır ve baskılayıcı etki ortadan kalktığı için ıĢıma oluĢur. Kantitasyon için kullanılacak probların tasarımı sırasında dikkat edilecek noktalar Ģunlardır: 1- Probların bağlanacakları bölgenin primerlerden uzakta olması tercih edilmelidir. Primer bölgesinden amplifikasyon baĢladığı sırada probun bağlanacağı hedef bölgesi kapatılabilir. 2- Probların Tm değerleri primerlerin Tm değerlerinden 5-10oC yüksek olmalıdır. Eğer problarla primerlerin bağlanma değerleri aynı olursa primerler problardan daha hızlı bir bağlanma gösterirler. 3- Probların Tm değerleri “annealing” değerinden yüksek olmak zorundadır. Sinyal “annealing” sırasında okunduğundan daha önce probun bağlanması gereklidir. 4- Probların Tm değerleri primerlerden baĢlayan yeni DNA sentezi(amplifikasyon) sıcaklığını aĢmamalıdır. Bağlı kalan problar sentezi engelleyebilir. 3. GEREÇ VE YÖNTEM Agarose ( 15510-027 Ġnvitrogen) All-trans retinoik asit (R2625 sigma aldrich), Asetik asit (27225 sigma aldrich) SH-SY5Y hücre hattı (ATCC® CRL-2266™), Rat-tail collagen (11 179179 001 Roche), DMEM (41965-039 gibco), Ham‟s F12 (BE12-615F lonza), Glutmax (35050-038 gibco), MEM NEAA (11140-050 gibco), FBS (F9665 sigma aldrich), Penicilin streptomycin (15140-122 gibco), Dexamethasone (D4902 sigma aldrich), Tripsin-EDTA (T4049 sigma aldrich), DMSO (D2650 sigma aldrich), Nikotin (N5260 sigma aldrich), Mekamilamin (M9020 sigma aldrich), SP600125 (S5567 sigma aldrich), 44 Kenpaulon (K3888 sigma aldrich), Tripure (11667165001 Roche), Kloroform ( 24216 sigma aldrich), Ġzopropanol (19516 sigma aldrich), DEPC (Diethylpyrocarbonate) ( 750023 Ġnvitrogen), Etanol (32221 sigma aldrich), 1 Kb Plus DNA Ladder (10787-018 invitrogen) Transcriptor high fidelity cDNA synthesis kit (05081963001 Roche), LightCycler DNA Master SYBR Green I (12158817001 Roche), LightCycler 480 Probes Master (04707494001 Roche) RealTime Ready Custom Single Assays (05532957001 Roche) 3.1. KOLLAJEN KAPLAMA Kollajeni çözmek için gerekli olan %20 asetik asit hazırlandı. Filtreden geçirildi. Laminar flow altında hazırlanan %20 asetik asitin 50 µl‟si liyofilizatın üzerine damla damla eklendi ve 5 ml otoklavlanmıĢ su eklendi . Bir gece liyofilizatın çözünmesi beklendi. 2 mg/ml stok kollajen hazırlandı. Bu Ģekilde +4 ̊C‟de saklandı. Kollajen kaplama iĢlemi için önerilen miktar 5 µg/cm2 „dir. Stoktan dilüsyon yapılarak hazırlanan 50 µg/ml kollajen solüsyonu cm2 basına 100 µl kullanılarak plate veya flakslar kollajen ile kaplandı ve gece boyunca laminar flow altında kuruması sağlanarak kaplama iĢlemi tamamlandı . Alüminyum folyoya sarılarak +4 ̊C‟de en çok bir ay süre ile saklandı. 3.2. HÜCRE KÜLTÜRÜ Ġstanbul Teknik Üniversitesi‟den temin edilen SH-SY5Y hücre hattı DMEM/F12 (1:1), %10 FBS, %1 Glutamax, %1 MEM NEAA ve %1 Penisilin + Streptomisin içeren besiyeri kullanılarak kollajen kaplı plate ya da flasklarda 37 ̊C‟de ve %5 CO2 içeren nemlendirilmiĢ ortamda üretildi. SH-SY5Y hücre hattının in vitro devamlılığının sağlanması için besiyeri her 2 – 3 günde bir değiĢtirildi. Hücre yoğunluğu ıĢık mikroskobu analizleri ile kontrol edilerek, % 80 doluluk oranında pasaj iĢlemi gerçekleĢtirildi. 45 3.2.1. HÜCRELERĠN AÇILMASI Hücreler için DMEM/F12 (1:1), %10 FBS, %1 Glutamax, %1 MEM NEAA ve %1 Penisilin + Streptomisin içeren besiyeri hazırlandı ve su banyosunda 37˚C‟ye ısıtıldı. Hücreler sıvı azot tankından veya -80˚C‟den çıkarılır çıkarılmaz 37˚C‟lik su banyosunda hızla çözüldü (Hücrelerin bulunduğu tüpün tamamen suya batırılmamasına dikkat edildi). Çözülen hücreler 15 mL‟lik santrifuj tüpüne aktarılıp üzerine 10 ml ortam yavaĢça eklendi. 500g‟de 5 dakika santrifüj edildi. Pellete değmemeye özen göstererek süpernatan uzaklaĢtırıldı. Hücre pelleti üzerine 2ml yeni medium eklendi ve hücreler iyice süspanse edildi. Hücreler istenilen plate/flaska ekildi. Mikroskop altında incelendi. 37˚C‟ de %5 CO2‟li inkübatöre yerleĢtirildi. Hücre hattının in vitro devamlılığının sağlanması için besiyeri her 2 günde bir değiĢtirildi. Hücreler yaklaĢık % 80 doluluk oranına ulaĢtığında pasajlandı. 3.2.2. HÜCRELERĠN SAYILMASI Hücre sayımı, hücre süspansiyonunun yoğunluğunun belirlenmesi için yapıldı. Sayım için hücre süspansiyonundan 100 µl alınıp tripan mavisiyle 1000 µl‟ye tamamlandı. KarıĢım pipetle homojenize edildi. YaklaĢık 10 saniye vortekslendi. Thoma lamı üzerine lamel koyuldu ve sayılacak hücre süspansiyonu bu ikisi arasına 15-20 µl pipetle kenardan vererek yayıldı. Ġki tarafta da bulunan bir büyük karedeki hücreler sayıldı ve ortalaması alındı. Mililitredeki hücre sayısını (hücre sayısı/ml) belirlemek için: Hücre sayısı / ml = Sayılan ortalama hücre miktarı (canlı) × Dilüsyon oranı × 104 46 Canlı hücre sayısı/ toplam hücre sayısı= % canlılık oranını verir (%75‟in altında olmamalıdır.) Formülleri uygulandı 3.2.3. HÜCRELERĠN PASAJLAMASI Pasajlama iĢlemi yapılırken T25 flasklar için; Medium çekildikten sonra 1,2 ml tripsin (37 ̊C‟ye ısıtılmıĢ) eklendi, 3 dakika inkübatörde tutuldu. Üzerine 1,2 ml serum ve yaklaĢık 5 ml medium eklendi, falkona alındı. 500g„de 5 dakika santrifüj edildi. Üst sıvı pellete değmeden atıldı. 2 ml medium eklenerek pastör pipeti yardımıyla pellet çözüldü. 100 µl alınıp 900 µl tripan mavisi eklenerek 1 ml‟ye tamamlanıp karıĢtırıldı ve Thoma lamı ile hücre sayımı yapıldı. Hücreler gerekli oranlarda medium ile karıĢtırılarak kollajen ile kaplanmıĢ olan plate/flasklara ekim yapıldı. T25 için 2 milyon, 12 well plate her well için 275000 hücre ekimi yapıldı. 3.2.4. HÜCRELERDEN STOK ALINMASI Kullanılan hücreler, yapılan çalıĢmada duyulan ihtiyaçtan daha fazla sayıda çoğalıyor veya yapılan çalıĢma bitmiĢ ya da ara verilecek ise uygun koĢullarda dondurularak saklanabilir. Hücrelerin dondurulması, hücrelerin yeniden çözüldüğünde canlılıklarının iyi olması için çok dikkat edilmesi gereken bir iĢlemdir. Pasajlama iĢlemine benzer Ģekilde yapıldı. Medium, tripsin-EDTA (%0.05) ve serum su banyosunda 37°C‟ye ısıtıldı. Ġnkübatörden alınan hücrelerin durumu, mikroskop altında incelendi. Flask dik konuma getirilerek, hücre tabakasının olduğu yüzeye steril cam pastör pipetleri kullanarak vakum yardımıyla ortam uzaklaĢtırıldı. T25 flask için yaklaĢık 1,2 ml tripsin solüsyonu ilave edildi ve 37°C‟ de %5 CO2‟li inkübatörde 3 dakika hücreler yüzeyden kalkana kadar bekletildi. Ġnkübatörden alınan flaskın tabanındaki tüm hücrelerin kalkması sağlandı. Mikroskopta hücrelerin serbest olup olmadığı kontrol edildi. 47 Tripsinin aktivitesinin azalması için yaklaĢık 1.2 ml serum eklendi ve hücreler falkona aktarılıp medium ile yaklaĢık 10 ml „ye tamamlandı. 500 g, 5 dakika santrifüj edildi. Supernatan atıldı. Peleti çözmek için 1,5 ml serum eklendi. Önce pipet yardımıyla ardından pastör pipeti ile peletin dağılması sağlandı. Uygun oranda DMSO eklendi (toplam %10 DMSO+ %90 serum) (örnek: 1.5 ml medium için 165 µl DMSO eklendi). Hücreler 2 ml hacimde kriyotüplere aktarıldı. Tüpün üzerine gerekli bilgiler yazıldı (hücre hattı/pasaj no/ tarih/ DMSO oranı/ yapan kiĢi adı gibi.). Kriyotüp kademeli soğutucu bloğa yerleĢtirildi ve -80 ̊C dondurucuya kaldırıldı. Ertesi gün sıvı azot tankına transfer edildi. 3.2.5. HÜCRELERĠN FARKLILAġTIRILMASI SH-SY5Y hücre hattı ekildikten bir gün sonra düĢük serumlu medium [DMEM/F12 (1:1), %2 FBS, %1 Glutamax, %1 MEM NEAA ve %1 Penisilin + Streptomisin] ile birlikte 10 uM all-trans retinoik asit içeren besiyeri kullanılarak 37 ̊C‟de ve %5 CO2 ile nemlendirilmiĢ ortamda üretildi. Retinoik asit ıĢığa duyarlı olduğu için iĢlemler karanlıklta gerçekleĢtirildi. Her iki günde medium değiĢikliği yapılarak farklılaĢma için önerilen 5 gün boyunca uygulama yapıldı. Kontrol grubuna %1 DMSO içeren düĢük serumlu medium uygulandı (retinoik asit DMSO da çözüldüğü için). 3.3. ĠLAÇ UYGULAMASI 3.3.1. ALL-TRANS RETĠNOĠK ASĠT Moleküler ağırlığı 300,44 g/mol olan all -trans retinoik asitin 50 mg‟ı 3,33ml DMSO içinde çözülerek 50mM stok hazırlandı . 10 µl stoklar halinde -20 ̊C‟de ıĢıktan korunarak saklandı. 48 3.3.2. DEKSAMETAZON Moleküler ağırlığı 392,46 g/mol olan deksametazon 7,2 mg‟ı tartıldı ve 917 µl DMSO içinde çözülerek 20 mM stok hazırlandı. Bu stoktan 20 µl alınıp DMEM ile 8 ml‟ye tamamlandı , 50 µM stok elde edildi . 50 µM stok solusyon 100 µl ve 200 µl Ģeklinde -20 ̊C‟de stoklandı. 3.3.3.NĠKOTĠN Moleküler ağırlığı 462,41 g/mol olan toz haldeki nikotinden 924 mg tartılıp 15 ml otoklavlanmıĢ distile su içinde çözüldü. Önce 4N NaOH sonra 1N NaOH, pH 7,4 olacak Ģekilde eklendi. OtoklavlanmıĢ distile su ile 20 ml‟ye tamamlandı. HazırlanmıĢ olan 100 mM nikotin 45 mm filtreden geçirildi . 30 µl ve 500 µl stoklar halinde -20 ̊C‟de saklandı. 3.3.4.MEKAMĠLAMĠN Moleküler ağırlığı 203,75 g/mol olan mekamilaminin 5 mg‟ı 491 µl otoklavlanmıĢ distile su içinde çözülerek 50mM stok hazırlandı. 10 µl stoklar halinde -20 ̊C‟de saklandı. 3.3.5. KENPAULLONE (CDK5 ĠNHĠBĠTÖRÜ) Moleküler ağırlığı 327,18 g/mol olan CDK 5 inhibitörü 1 mg‟ı 306 µl DMSO içinde çözülerek 10 mM stok hazırlandı. 5 µl stoklar halinde -20 ̊C‟de depolandı. 3.3.6. SP600125 (JNK ĠNHĠBĠTÖRÜ) Moleküler ağırlığı 220,23 g/mol olan JNK inhibitörünün 2 mg‟ı tartıldı ve 454 µl DMSO içinde çözülerek 20mM stok hazırlandı . 10 µl stoklar halinde -20 ̊C‟de depolandı. 3.4. DENEY GRUPLARI SH-SY5Y hücreleri 12 well platelere her kuyucukta 275000 hücre olacak Ģekilde ekildikten bir gün sonra farklılaĢtırma yöntemi uygulandı. 5 gün sonunda aĢağıdaki gruplarda belirtildiği konsantrasyonda 24 saat süreli uygulama yapıldı. 49 1. Kontrol 2. Deksametazon 10nM 3. Deksametazon 100nM 4. Nikotin 50nM 5. Nikotin 300nM 6. Deksametazon 10nM + Nikotin 50 nM 7. Deksametazon 10nM + Nikotin 300 nM 8. Deksametazon 100nM + Nikotin 50 nM 9. Deksametazon 100nM + Nikotin 300 nM 10. Deksametazon 10nM+ Nikotin 50nM + Mekamilamin 10µM 11. Deksametazon 10nM+ Nikotin 300nM + Mekamilamin 10µM 12. Deksametazon 100nM + Nikotin 50nM + Mekamilamin 10µM 13. Deksametazon 100nM + Nikotin 300nM + Mekamilamin 10µM 14. Deksametazon 10nM + Nikotin 50nM + Kenpaullone 2µM 15. Deksametazon 10nM + Nikotin 300nM + Kenpaullone 2µM 16. Deksametazon 100nM + Nikotin 50nM + Kenpaullone 2µM 17. Deksametazon 100nM + Nikotin 300nM + Kenpaullone 2µM 18. Deksametazon 10nM + Nikotin 50nM + SP600125 10µM 19. Deksametazon 10nM + Nikotin 300nM + SP600125 10µM 20. Deksametazon 100nM + Nikotin 50nM + SP600125 10µM 21. Deksametazon 100nM + Nikotin 300nM + SP600125 10µM 3.5. RNA ĠZOLASYONU Roche Tripure izolasyon yöntemi takip edilerek RNA izolasyonu yapıldı. 12 well platelere ekilen hücreler uygulama sonrasında RNA toplamak için her kuyucuğa 1 ml trizol eklenerek RNase-free ependorflara toplandı. Üzerine 200 µl kloroform eklendi ve 15 saniye hızlı bir Ģekilde çalkalandı. Oda sıcaklığında 10 dakika inkübe edildi. Ġnkübasyonun ardından santrifüj edildi (12000g, +4˚C, 15 dakika). Santrifüj sonucunda üst sıvıda bulunan RNA baĢka temiz ve etiketlenmiĢ RNase-free ependorflara alındı. (Bu aĢamadan sonraki çalıĢmalar buz üzerinde gerçekleĢtirildi.) 50 RNA örneklerinin bulunduğu ependorflara 0,5 ml izopropanol eklendi. Birkaç kez ters-düz edilerek karıĢması sağlandı. 10 dakika oda sıcaklığında inkübasyonun ardından santrifüj edildi (12000g , +4 ˚C, 10 dakika). Santrifüj sonrasında pellete değmeden örneklerin üst sıvısı atıldı. %75‟lik etanolden her ependorfa 1 ml eklendi. (Bu aĢamada +2˚C ile +8˚C arasında 1 hafta ya da -15˚C ile -25˚C arasındaki sıcaklıkta 1 yıl saklanabilir) Pelletin kalkması sağlandı ve kısaca (1-2 saniye) vortekslendi. 7500g‟de, +4 ˚C‟de 5 dakika santrifüj edildi. Pipet yardımıyla üst sıvı atıldı. Etanolun uçmasını sağlamak için ependorfların kapağı açık kalacak Ģekilde kuru ısı bloğuna (55˚C) yerleĢtirildi. Etanolü yeterince uçan RNA örneklerinin üzerine birkaç kez al-ver yapılarak 30 µl DEPC (ya da PCR için kullanılan su) eklendi. 5 dakika kapakları kapatılıp ısı bloğuna bekletildi. Nanodrop cihazında nukleik asit ve RNA özellikleri seçilerek izolasyonu tamamlanan RNA örneklerinin konsantrasyonu ölçüldü. RNA „yı çözdüğümüz DEPC (ya da PCR için kullanılan su) ile 2 kez blank alındı ve 1,5 µl ile ölçüm yapıldı. Ölçüm sonuçlarının güvenilirliği için en az 2 tekrar yapıldı. Konsantrasyon ve 260/280 değerleri kaydedildi. Örnekler -80˚C‟ye kaldırıldı. 3.6. RNA AGAROZ JEL ELEKTROFOREZĠ FarklılaĢtırma prosedürü uygulanan hücrelerden izole edilen RNA‟nın kalitatif analizi için agaroz jel elektroforezi yapıldı. Yürütme tamponu, %10 sukroz (gliserolde kullanılabilir), %90 deiyonize formamid ve %0,05 bromofenol mavisi içerecek Ģekilde hazırlandı. %1 agaroz jel için, 0,5g agaroz tartıldı, 50 ml %1 TAE (Tris-acetate-EDTA) ile erlende karıĢtırılıp mikrodalga fırında agarozun erimesi sağlanarak hazırlandı. Tank-kaset hazırlandı. Jelin biraz soğuması beklenip kasete döküldü, donması beklenildi. Tank %1 TAE ile dolduruldu. 51 RNA örnekleri jele yüklenirken %50 yürütme tamponu, %50 RNA olacak Ģekilde 500 µl‟lik ependorfa hazırlandı (toplam 15-20 µl). 10 dakika 60 ̊C de (kuru ısı bloğunda) ısıtıldı. Her kuyucuğa 15µl olacak sekilde yükleme yapıldı. Marker hazırlanırken 1,5 µl DNA (100 bp–12 kb) ile 7,5µl yürütme tamponu karıĢtırıldı. 6 µl‟si jele yüklendi. Jel 70 voltta yaklaĢık 2 saat yürütüldü. Jeli görüntülemek için 100 ml distile su içerisine %1‟lik 20 µl EtBr (Etidyum bromür) eklendi, EtBr her yere dağılması sağlandı ve jel bu karıĢıma alındı. KarıĢtırıcıda 10 dakika boyanması sağlandı, ardından yıkama yapmak için distile su ile karıĢıtırıcıda 5 dakika bekletildi. Ultraviyole (UV) ıĢık altında görüntü alındı. 3.7. cDNA SENTEZĠ “Transcriptor high fidelity cDNA synthesis kit”i kullanılarak kantitatif RTPCR standart prosedürü uygulandı. Kitte belirtildiği Ģekilde toplam hacim 20 µl olacak Ģekilde 60 µM random hexamer primer, 1000 ng cDNA için gereken miktarda RNA ve toplamı 11,4 µl olacak Ģekilde su eklendi. Techne TC-512 Thermal Cycler cihazında 10 dakika 65˚C inkübasyonun ardından hemen buz üstüne alındı. Tampon (son konsantrasyon 8 mM MgCl2), RNase inhibitörü (son konsantrasyon 20U), dNTP (her birinden son konsantrasyon 1 mM), DTT (son konsantrasyon 5 mM) ve revers transkriptaz enzimi (son konsantrasyon 10U) içeren karıĢımdan 8,6 µl eklenerek toplam 20 µl yapıldı. Thermal Cycler cihazında 10 dakika 29˚C, 60 dakika 48˚C, 5 dakika 85˚C programı uygulandı. Sentezlenen cDNA -20 ˚C‟de saklandı. 3.8. PRĠMER TASARIMI Ġnsan nikotinik asetilkolin reseptör genleri için CHRNA3 (NM_000743), CHRNA5 (NM_000745), CHRNA7 (NM_000746), CHRNB2 (NM_000748), 52 CHRNB4 (NM_000750) ve housekeeping gen olarak 18S ribosomal RNA (X03205) seçildi. Glukokortikoid çalıĢmalarında kullanılan yüzlerce genden bazıları hedef geni olarak olarak seçildi. Bunlar: BCL2L1 (NM_138578), SGK1 (NM_001143677), NFKB1 (NM_001165412), GILZ (NM_001015881), KLF11 (NM_001177716)‟dir ve bu genlere özgü primer dizaynları çevrimiçi araçlar kullanılarak yapıldı. Primer tasarımı yapılırken; oligonükleotidin tek bir dizilime özgül olmasına, saç tokası oluĢturmaması için oligonükleotid kendi içinde karĢılıklı eĢlenik baz dizileri içermemesine, oligonükleotid çiftleri dimer oluĢumuna neden olacak Ģekilde birbirleri ile eĢlenik olmamasına, oligonükleotid uzunluğunun 18-24 baz arasında olmasına, oligonükleotid çiftlerinin Tm‟lerinin birbirine denk veya yakın olmasına, oligonükleotid dizilimleri için 3‟ten fazla tekrar eden baz olmamasına dikkat edildi (Tablo1). gen CHRNA3 NM_000743 CHRNA5 NM_000745 SYBR GREEN CHRNA7 NM_000746 CHRNB2 NM_000748 CHRNB4 NM_000750 18sRNA X03205 BCL2L1 NM_138578 SGK1 NM_001143677 TaqMan NFKB1 NM_001165412 GILZ NM_001015881 KLF11 NM_001177716 primerler sense antisense ürün sense antisense ürün sense antisense ürün sense antisense ürün sense antisense ürün sense antisense ürün sense prob antisense ürün sense prob antisense ürün sense prob antisense ürün sense prob antisense ürün sense prob antisense ürün sekans (5'-3') GGCTCAAGCAAATCTGGAATG GGTAATCAAACGGGAAGTAGGT TTGGTGGATGTGGATGAGAAA TTTGTAGTTTGCCGGTGGA GAACTACAATCCCTTGGAGAGG CGCTCATCAGCACTGTTATAGA CTGGTGACAGTACAGCTTATGG TGCCGTCAGCATTGTTGTA CCAGCTTATCAGCGTGAATGA CCGGACTATCAAGTTGGTGTAG CCCAACTTCTTAGAGGGACAAG GTACAAAGGGCAGGGACTTAAT CCTAAGGCGGATTTGAATCTCT CTCCCTTCAGAATCTTATCTTGGCTTTGGA TGAGTCTCGTCTCTGGTTAGT CCTCTCCAGCTGAAACCAAATA AAATTCCGCAAGACACCTCCTGGA ACTCTTAATCTCCATGAAGTCATCC GCTACTCTGGCGCAGAAATTA AATAATGCCTTCCGGCTGAGTCCT CAGAGACCTCATAGTTGTCCATAAG GGCCATGGATCTGGTGAAG TGCTGTGAGAGAGGAGGTGGAGAT AGGGTGTTCTCACGCTCTA CGACTCTGTGCATAACTCCTC AGCCATCGACAAGGACACCTGTTT GCTGTACATGCTTTGGAATCTG başlangıç uzunluk Tm %GC oranı amplikon bölgesi 758 21 61,833 47,619 1012 22 61,933 45,455 255 447 21 61,851 42,857 701 19 61,916 47,368 255 217 22 61.792 50 474 22 61.906 45.455 258 427 22 62,206 50 640 19 62,218 47,368 214 301 21 62,442 47,619 520 22 61,934 50 220 1435 22 61,975 50 1696 22 62,274 45,455 262 219 22 62,054 45,455 245 30 67,632 43,333 310 21 61,867 47,619 92 1071 22 62,228 45,455 1097 24 67,944 50 1187 25 62,161 40 117 2964 21 62,421 47,619 3000 24 67,657 50 3063 25 62,095 44 100 213 19 62,188 57,895 246 24 67,988 54,167 332 19 62,245 52,632 120 322 21 61,872 52,381 364 24 68,082 50 421 22 61,797 45,455 100 Tablo 1: PCR yönteminde kullanılan primerler 53 3.9. POLĠMERAZ ZĠNCĠR REAKSĠYONU 3.9.1. SYBR Green I Seçilen CHRNA3 (NM_000743), CHRNA5 (NM_000745), CHRNA7 (NM_000746), CHRNB2 (NM_000748), CHRNB4 (NM_000750) ve housekeeping gen olarak 18S ribosomal RNA (X03205) genleri LightCycler DNA Master SYBR Green I kiti ile Roche LightCycler 1,5 cihazında kapiller sistemde çalıĢıldı. Tablo 2„de her gen için ayrı ayrı belirtilen miktarlarda primerler, MgCl2, cDNA ve Taq DNA polimeraz, reaksiyon tamponu, dNTP karıĢımı, SYBR Green boyası ve 10mM MgCl2 içeren 10X konsantrasyondaki SYBR Green Masterdan eklendi ve toplam hacim 20 µl olacak Ģekilde PCR grade su ile tamamlandı. Hazırlanan kapiller 4000g‟de 15 saniye santrifüj edildi ve cihaza yerleĢtirildi. Floresan kanalı 530nm olarak seçildi, örnek isimleri girildi, cihaz tipi seçildi, tablo 2‟de belirtilen Ģekilde PCR koĢulları yazıldı. ĠĢlem bitiminde analizler yapıldı. 54 primer konsantrasyonu CHRNA3 NM_000745 CHRNA5 NM_000745 CHRNA7 NM_000746 CHRNB2 NM_000748 CHRNB4 NM_000750 18sRNA X03205 Tablo Sense Antisense Sense Antisense Sense Antisense Sense Antisense Sense Antisense Sense Antisense 0.4 µM 0.4 µM 0.4 µM 0.4 µM 0.4 µM 0.4 µM 0.4 µM 0.4 µM 0.4 µM 0.4 µM 0.2 µM 0.2 µM 2: Mg+2 miktarı cDNA miktarı denatürasyon PCR kosulları amplifikasyon (45 döngü) denatürasyon bağlanma uzama erime eğrisi denatürasyon bağlanma erime soğuma 3.5mM 50ng 95 ˚C 30 sn 95 ˚C 0 sn 60 ˚C 5 sn 72 ˚C 11 sn 95 ˚C 0 sn 65 ˚C 15 sn 95˚C 0 sn 40˚C 30 sn 2mM 50ng 95 ˚C 30 sn 95 ˚C 0 sn 56 ˚C 5 sn 72 ˚C 11 sn 95 ˚C 0 sn 65 ˚C 15 sn 95˚C 0 sn 40˚C 30 sn 3.5mM 100ng 95 ˚C 30 sn 95 ˚C 0 sn 60 ˚C 5 sn 72 ˚C 11 sn 95 ˚C 0 sn 65 ˚C 15 sn 95˚C 0 sn 40˚C 30 sn 1.75mM 50ng 95 ˚C 30 sn 95 ˚C 0 sn 60 ˚C 5 sn 72 ˚C 11 sn 95 ˚C 0 sn 65 ˚C 15 sn 95˚C 0 sn 40˚C 30 sn 2mM 50ng 95 ˚C 30 sn 95 ˚C 0 sn 60 ˚C 5 sn 72 ˚C 11 sn 95 ˚C 0 sn 65 ˚C 15 sn 95˚C 0 sn 40˚C 30 sn 2mM 25ng 95 ˚C 30 sn 95 ˚C 0 sn 60 ˚C 5 sn 72 ˚C 11 sn 95 ˚C 0 sn 65 ˚C 15 sn 95˚C 0 sn 40˚C 30 sn SYBR Green PCR Koşulları 3.9.2. TaqMan Probları BCL2L1 (NM_138578), SGK1 (NM_001143677), NFKB1 (NM_001165412), GILZ (NM_001015881), KLF11 (NM_001177716) genleri ve referans olarak Roche housekeeping gen G6PD (Glukoz 6 Fosfat Dehidrogenaz) (Catalog Assay 05532957001-assay ID 102098) “LightCycler 480 Probes Master kiti” ile Light Cycler 480 cihazında çalıĢıldı. Tablo 3„de belirtildiği gibi toplam hacim 17 µl olacak Ģekilde hazırlanıp Tablo 4„de belirtilen Ģekilde PCR programı uygulandı. Referans gen olarak 4 µl G6PD kullanılarak total hacim 17 µl‟ye tamamlandı. Stok konsantrasyon Sense 8 µM Antisense 8 µM Prob 2 µM master mix 2x cDNA Su Total Son konsantrasyon 0.4 µM 0.4 µM 0.1 µM 2x Miktar 1 µl 1 µl 1 µl 8.5 µl 4 µl 1.5 µl 17 µl 50 ng Tablo 3: Taqman PCR için gerekli olan bileşikler ve miktarları Program döngü sıcaklık (˚C) süre belirleme inkübasyon 1 amplifikasyon 45 soğutma 1 95 95 59 72 40 07 dk 10 sn 30 sn 01 sn 10 sn yok yok yok tek yok artış oranı (˚C/s) 4.4 4.4 2.2 4.4 4.4 Tablo 4: Taqman PCR koşulları 3.10. ĠSTATĠSTĠK Bulgular SPSS 16 istatistik programı kullanılarak değerlendirildi. Retinoik asit uygulamasıyla faklılaĢtırılmıĢ ve farklılaĢtırılmamıĢ hücre kültürlerinde nikotinik asetilkolin reseptörler genlerinin ekspresyon analizleri için Bağımsız T-Testi uygulandı. Deney grupların ortalamaları arasındaki farkın istatiksel olarak 56 anlamlılığını değerlendirmek için Tek örneklem T-Testi kullanıldı. Deney grupları her gen için tek tek incelenirken bağımsız değiĢkende çok sayıda grup olduğu için ANOVA yapıldı. Tüm istatiksel analizlerde anlamlılık değeri p<0,05 olarak alındı. 4. BULGULAR 4.1. FARKLILAġTIRMA SH-SY5Y hücre hattının farklılaĢtırılması için yaygın olarak kullanılan retinoik asit uygulandı. Hücreler 96 kuyucuklu hücre kültür kabına 2x104 hücre/kuyucuk ekildikten 5 gün sonra 10 µM retinoik asit uygulandı ve retinoik asit uygulamasından sonra üçüncü günde fotoğrafları çekildi. Retinoik asit uygulamasında üçüncü gün itibariyle hücrelerde nöroblast benzeri hücreler gözlendi. Aksonal uzamanın olduğu ıĢık mikroskobu ile fark edilebilir düzeydedir. Kontrol grubunda ise hücrelerin kümeler halinde bulunduğu gözlendi. ġekil 16: SH-SY5Y hücreleri görüntüsü A:10X retinoik asit, B: 20X retinoik asit, C: 40X retinoik asit, D: 10X kontrol, E: 20X kontrol. 4.2. RNA AGAROZ JEL ELEKTROFOREZĠ FarklılaĢtırma yöntemi uygulanan ve kontrol amaçlı olarak yöntem uygulanmayan hücrelerden izole edilen RNA agoroz jel ektroforezi yapılarak kalitatif olarak analiz edildi. UV (ultraviyole) ıĢık altında görüntü alındı. %1‟lik 57 agoroz jel TAE tamponu içinde 70 voltta 2 saat yürütüldü. RNA izolasyonu sırasında herhangi bir sorun olmadığı alınan jel görüntüsünde bantların oluĢumu ile doğrulanmıĢtır. ġekil 17: RNA jel elektroforez görüntüsü 4.3. PCR 4.3.1. SYBR GREEN I Nikotinik asetilkolin reseptörünü kodlayan genlerden seçilmiĢ olanlara (CHRNA3, CHRNA5, CHRNA7, CHRNB2, CHRNB4 ve housekeeping gen olarak 18S ribosomal RNA), retinoik asit uygulaması ile farklılaĢtırılmıĢ ve kontrol için farklılaĢtırılmamıĢ olan hücre kültürlerindeki ekspresyon düzeyine bakmak amacıyla sybr green boyası kullanılarak real time PCR yöntemi uygulanmıĢtır. ġekil 18‟de α3, α7 ve β2 genleri için PCR optimizasyonuna dair erime eğrileri görülmektedir. 58 ġekil 18: Sybr green PCR optimizasyonu erime eğrileri SH-SY5Y hücre hattına retinoik asit uygulaması yapılarak hücreler nöron hücrelerine farklılaĢtırılmıĢlardır. Bu farklılaĢtırılan ve farklılaĢtırılmayan (kontrol) hücrelerde nikotinik asetilkolin reseptör genlerin ekspresyon farklarına bakmak için sybr-green boyası kullanılarak real-time PCR uygulaması yapılmıĢtır(ġekil 19).FarklılaĢtırılmıĢ ve farklılaĢtırılmamıĢ hücrelerde bazal ektresyon sonuçları Ģekil 20‟de gösterilmiĢtir. α3, α5 ve β2 genleri için istatistiksel olarak anlamlı azalma görülmüĢtür α3 (M=3.825; SD=2.683; SEM=1.014; t(13)= -1.266; p=0.048); α5 (M=3.462; SD=2.303; SEM=0.87; t(13)= -0.336; p=0.031); β2 (M=4.854; SD=2.753; SEM=1.04; t(13)= -3.266; p=0.006). 59 ġekil 19: SH-SY5Y hücrelreinde farklılaĢtırılmıĢ ve farklılaĢtırılmamıĢ hücre kültürlerinde nikotinik asetilkolin reseptör gen anlatımları ġekil 20: FarklılaĢtırılmıĢ ve farklılaĢtırılmamıĢ hücrelerde bazal ektresyon sonuçları 60 4.3.2. Deney Gruplarına Göre Genlerde Ekspresyon Seviyeleri Sonuçları Glukortikoid ile aktive olduğu bilinen genler (BCL2L1, SGK1, NFKB1, GILZ, KLF11) üzerinde deney grupları tasarlanmıĢ ve ilaçlar uygulanmıĢtır. ġekil 21: FarklılaĢtırılmıĢ SH-SY5Y hücre kültürlerine deksametazon uygulaması Yapılan PCR sonucunda beĢ gen için de deksametazonun yüksek dozunda (100nM) anlamlı artıĢ görülmektedir. 24 saatlik 100nM deksametozun uygulaması BCL2L geninde anlamlı göstermiĢtir (M=1.2900E2; SD=13.41; SEM=5.07; t(6)= 5.719; p=0.001). SGK1 geninde yine anlamlı bir artıĢ görülmektedir (M=1.3443E2; SD=13.68; SEM=5.17; t(6)= 6.656; p=0.001). KLF11 geni için (M=1.1500E2; SD=14.22; SEM=5.37; t(6)= 2.790; p=0.032), NFKB1 geni için (M=1.8112E2; SD=29.76; SEM=11.24; t(6)= 7.21; p=0.000). Bu uygulama GILZ geninde deksametazonun iki dozu için de anlamlı artıĢa neden olmustur. Deksametazon 10nM (M=1.1733E2; SD=10.51; SEM=4.29; t(5)= 4.036; p=0.010), deksametazon 100nM (M=1.6471E2; SD=24.28; SEM=9.17; t(6)= 7.051; p=0.000). 61 ġekil 22: FarklılaĢtırılmıĢ SH-SY5Y hücre kültürlerine nikotin uygulaması Nikotin uygulamasında SGK1 geni hariç diğer genlerde düĢük doz uygulamasında daha çok artıĢ varken yüksek doz nikotin uygulamasında daha az artıĢ görülmüĢtür. SGK1 geninde ise doz uygulaması arttıkça gen anlatımı artmıĢtır. 50 nM dozunda tüm genlerde anlamlı artıĢ görüldü. BCL2L (M=1.2446E2; SD=14.60; SEM=5.518; t(6)= 4.433; p=0.004), GILZ (M=1.3432E2; SD=34.16; SEM=12.91; t(6)= 2.658; p=0.038), SGK1 (M=1.2573E2; SD=27.56; SEM=10.41; t(6)= 2.470; p=0.048), KLF11 (M=1.2326E2; SD=19.36; SEM=7.31; t(6)= 3.178; p=0.019), NFKB1 (M=1.7568E2; SD=52.87; SEM=19.98; t(6)= 3.787; p=0.009). Nikotin 300nM dozunda BCL2L (M=1.1587E2; SD=13.60; SEM=5.55; t(5)= 2.857; p=0.036) ve SGK (M=1.5823E2; SD=25.24; SEM=10.30; t(5)= 5.651; p=0.002) genleri hariç artıĢ görülmedi. 24 saatlik deksametazon ve nikotinin her iki dozunun kombinasyonları Ģeklindeki uygulamada GILZ geni hariç diğer genlerde artıĢlar görülmektedir. BCL2L için deksametazon 10nM+nikotin 50nM (M: 1.0832E2; SD: 5.42; SEM: 1.45; t(13)= 5.738; p=0.000). Deksametazon 10nM+nikotin 300nM dozunda 62 istatistiksel olarak anlamlı bir sonuç bulunamadı (p=0.080). Deksametazon 100nM+nikotin 50nM (M: 1.1147E2; SD: 9.62; SEM: 3.636; t(6)= 3.155; p=0.020). Deksametazon 100nM+nikotin 300nM (M: 1.0739E2; SD: 4.85; SEM: 1.98; t(5)= 3.731; p=0.014). SGK1 için deksametazon 10nM+nikotin 50nM (M: 1.6318E2; SD: 13.47; SEM: 5.09; t(6)= 12.407; p=0.000). Deksametazon 10nM+nikotin 300nM (M: 1.4979E2; SD: 33.74; SEM: 12.75; t(6)= 3.904; p=0.008). Deksametazon 100nM+nikotin 50nM (M: 1.6835E2; SD: 13.87; SEM: 5.24; t(6)= 13.030; p=0.000). Deksametazon 100nM+nikotin 300nM (M: 1.5338E2; SD: 35.75; SEM: 14.59; t(5)= 3.657; p=0.015). KLF11 için deksametazon 10nM+nikotin 50nM (M:1.2022E2; SD:11.85; SEM:4.47; t(6)= 4.513; p=0.004). Deksametazon 10nM+nikotin 300nM (M: 1.2404E2; SD: 14.91; SEM: 5.63; t(6)= 4.265; p=0.005). Deksametazon 100nM+nikotin 50nM (M: 1.2283E2; SD: 12.69; SEM: 4.79; t(6)= 4.757; p=0.003). Deksametazon 100nM+nikotin 300nM (M: 1.2509E2; SD: 20.28; SEM: 8.28; t(5)= 3.029; p=0.029). NFKB1 için deksametazon 10nM+nikotin 50nM (M: 1.2772E2; SD: 20.71; SEM: 7.83; t(6)= 3.540; p=0.012). Deksametazon 10nM+nikotin 300nM (M: 1.2871E2; SD: 18.97; SEM: 7.17; t(6)= 4.003; p=0.007). Deksametazon 100nM+nikotin 50nM (M: 1.2896E2; SD: 26.30; SEM: 9.94; t(6)= 2.913; p=0.027). Deksametazon 100nM+nikotin 300nM bu yüksek dozlarda uygulamada NKFB1 için anlamlı bir sonuç bulunamadı (p=0.084). 63 ġekil 23: FarklılaĢtırılmıĢ SH-SY5Y hücre kültürlerine farklı konsantrasyonlarda deksametazon + nikotin uygulaması 24 saatlik deksametazon ve nikotinin her iki dozunun kombinasyonları Ģeklindeki uygulamada GILZ geni hariç diğerlerinde artıĢlar görülmektedir. BCL2L için deksametazon 10nM+nikotin 50nM (M: 1.0832E2; SD: 5.42; SEM: 1.45; t(13)= 5.738; p=0.000). Deksametazon 10nM+nikotin 300nM dozunda istatistiksel olarak anlamlı bir sonuç bulunamadı (p=0.080). Deksametazon 100nM+nikotin 50nM (M: 1.1147E2; SD: 9.62; SEM: 3.636; t(6)= 3.155; p=0.020). Deksametazon 100nM+nikotin 300nM (M: 1.0739E2; SD: 4.85; SEM: 1.98; t(5)= 3.731; p=0.014). SGK1 için deksametazon 10nM+nikotin 50nM (M: 1.6318E2; SD: 13.47; SEM: 5.09; t(6)= 12.407; p=0.000). Deksametazon 10nM+nikotin 300nM (M: 1.4979E2; SD: 33.74; SEM: 12.75; t(6)= 3.904; p=0.008). Deksametazon 64 100nM+nikotin 50nM (M: 1.6835E2; SD: 13.87; SEM: 5.24; t(6)= 13.030; p=0.000). Deksametazon 100nM+nikotin 300nM (M: 1.5338E2; SD: 35.75; SEM: 14.59; t(5)= 3.657; p=0.015). KLF11 için deksametazon 10nM+nikotin 50nM (M:1.2022E2; SD:11.85; SEM:4.47; t(6)= 4.513; p=0.004). Deksametazon 10nM+nikotin 300nM (M: 1.2404E2; SD: 14.91; SEM: 5.63; t(6)= 4.265; p=0.005). Deksametazon 100nM+nikotin 50nM (M: 1.2283E2; SD: 12.69; SEM: 4.79; t(6)= 4.757; p=0.003). Deksametazon 100nM+nikotin 300nM (M: 1.2509E2; SD: 20.28; SEM: 8.28; t(5)= 3.029; p=0.029). NFKB1 için deksametazon 10nM+nikotin 50nM (M: 1.2772E2; SD: 20.71; SEM: 7.83; t(6)= 3.540; p=0.012). Deksametazon 10nM+nikotin 300nM (M: 1.2871E2; SD: 18.97; SEM: 7.17; t(6)= 4.003; p=0.007). Deksametazon 100nM+nikotin 50nM (M: 1.2896E2; SD: 26.30; SEM: 9.94; t(6)= 2.913; p=0.027). Deksametazon 100nM+nikotin 300nM bu yüksek dozlarda uygulamada NKFB1 için anlamlı bir sonuç bulunamadı (p=0.084) 65 ġekil 24: FarklılaĢtırılmıĢ SH-SY5Y hücre kültürlerine farklı konsantrasyonlarda deksametazon + nikotin + mekamilamin uygulaması Nikotin antagonisti mekamilaminin deksametazon+nikotin içeren hücre kültürlerine 24 saatlik uygulama sonucu tüm genlerde kontrol grubuna göre artıĢ gözlenmektedir. BCL2L için deksametazon 10nM + nikotin 50nM + mekamilamin 10 µM (M: 1.0864E2; SD: 7.38; SEM: 2.04; t(12)= 4.215; p=0.001). Deksametazon 10nM + nikotin 300nM + mekamilamin 10 µM (M: 1.1043E2; SD: 6.57; SEM: 2.48; t(6)= 4.197; p=0.006). Deksametazon 100nM+nikotin 50nM + mekamilamin 10 µM (M: 1.3277E2; SD: 13.92; SEM: 5.26; t(6)= 6.228; p=0.001). Deksametazon 100nM + nikotin 300nM + mekamilamin 10 µM (M: 1.2591E2; SD: 5.64; SEM: 2.13; t(6)= 12.144; p=0.00). GILZ için deksametazon 10nM + nikotin 50nM + mekamilamin 10 µM (M: 1.2919E2; SD: 17.007; SEM: 6.94; t(5)= 4.204; p=0.008). Deksametazon 10nM + nikotin 300nM + mekamilamin 10 µM ygulamasında anlamlı bir artıĢ gözrülmedi (p= 0.062). Deksametazon 100nM+nikotin 50nM + mekamilamin 10 µM (M: 66 1.3731E2; SD: 17.62; SEM: 6.66; t(6)= 5.602; p=0.001). Deksametazon 100nM + nikotin 300nM + mekamilamin 10 µM (M: 1.2620E2; SD: 19.99; SEM: 7.55; t(6)= 3.466; p=0.013). SGK1 için deksametazon 10nM + nikotin 50nM + mekamilamin 10 µM (M: 1.8025E2; SD: 31.98; SEM: 13.05; t(5)= 6.145; p=0.002). Deksametazon 10nM + nikotin 300nM + mekamilamin 10 µM (M: 1.6371E2; SD: 18.94; SEM: 7.15; t(6)= 8.898; p=0.000). Deksametazon 100nM+nikotin 50nM + mekamilamin 10 µM (M: 1.3627E2; SD: 7.82; SEM: 2.95; t(6)= 12.263; p=0.00). Deksametazon 100nM + nikotin 300nM + mekamilamin 10 µM (M: 1.2369E2; SD: 24.18; SEM: 9.14; t(6)= 2.592; p=0.041). KLF11 için deksametazon 10nM + nikotin 50nM + mekamilamin 10 µM (M: 1.4202E2; SD: 21.68; SEM: 8.85; t(5)= 4.747; p=0.005). Deksametazon 10nM + nikotin 300nM + mekamilamin 10 µM (M: 1.3079E2; SD: 22.77; SEM: 8.60; t(6)= 3.577; p=0.012). Deksametazon 100nM+nikotin 50nM + mekamilamin 10 µM (M: 1.4916E2; SD: 20.13; SEM: 7.61; t(6)= 6.460; p=0.01). Deksametazon 100nM + nikotin 300nM + mekamilamin 10 µM (M: 1.4711E2; SD: 17.99; SEM: 6.80; t(6)= 6.927; p=0.00). NFKB1 için deksametazon 10nM + nikotin 50nM + mekamilamin 10 µM (M: 1.5368E2; SD: 33.29; SEM: 13.59; t(5)= 3.950; p=0.011). Deksametazon 10nM + nikotin 300nM + mekamilamin 10 µM (M: 1.5854E2; SD: 25.71; SEM: 9.71; t(6)= 6.025; p=0.001). Deksametazon 100nM+nikotin 50nM + mekamilamin 10 µM (M: 1.8421E2; SD: 35.75; SEM: 13.51; t(6)= 6.231; p=0.01). Deksametazon 100nM + nikotin 300nM + mekamilamin 10 µM (M: 1.7155E2; SD: 23.21; SEM: 8.77; t(6)= 8.153; p=0.00). 67 ġekil 25: FarklılaĢtırılmıĢ SH-SY5Y hücre kültürlerine farklı konsantrasyonlarda deksametazon + nikotin + SP600125 uygulaması MAPK ailesinin bir üyesi JNK‟ya inhibitör olarak geliĢtirilmiĢ bir bileĢik olan SP600125, 24 saat farklı dozlarda deksametazon + nikotin içeren farklılaĢtırılmıĢ SH-SY5Y hücre kültürlerine uygulandı ve glukokortikoid ile aktive olduğu bilinen genler üzeirndeki etkisi incelendi. BCL2L geninde bu uygulamada farklı dozların tümünde artıĢ görülmüĢtür. deksametazon 10nM + nikotin 50nM + SP600125 10 µM (M: 1.1307E2; SD: 7.88; SEM: 2.10; t(13)= 6.199; p=0.000). Deksametazon 10nM + nikotin 300nM + SP600125 10 µM (M: 1.2444E2; SD: 13.42; SEM: 5.07; t(6)= 4.819; p=0.003). Deksametazon 100nM+nikotin 50nM + SP600125 10 µM (M: 1.0796E2; SD: 7.04; SEM: 2.66; t(6)= 2.989; p=0.024). Deksametazon 100nM + nikotin 300nM + SP600125 10 µM (M: 1.1756E2; SD: 7.61; SEM: 2.87; t(6)= 6.098; p=0.001). SGK1 geni için deksametazon 10nM + nikotin 50nM + SP600125 10 µM (M: 65.38; SD: 30.68; SEM: 11.59; t(6)= -2.985; p=0.024). Deksametazon 68 100nM+nikotin 50nM + SP600125 10 µM (M: 70.87; SD: 9.69; SEM: 3.66; t(6)= 7.948; p=0.000). Bu gruplarda azalma görülmüĢtür. ġekil 26: FarklılaĢtırılmıĢ SH-SY5Y hücre kültürlerine farklı konsantrasyonlarda deksametazon + nikotin + kenpaullone uygulaması Kenpaullone bazı CDK‟larda ATP yarıĢmalı inhibitördür. Glukokortioid reseptörü fosforillenmesinde görev alan CDK5 inhibirötü olarak kenpaullone, deksametazon + nikotin içeren SH-SY5Y hücre kültürüne 24 saat uygulanmıĢtır. Dekzametazon, nikotin ve kenpauollone birlikte uygulanması sonucunda SGK1 geninde farklı dozları içeren gruplarda artıĢ, KLF11 geninde tüm dozlarda azalma gözlenirken diğer genlerde herhangi anlamlı bir değiĢim olmamıĢtır. SGK1; deksametazon 10nM + nikotin 50nM + kenpaullone 2µM (M: 1.6228E2; SD: 24.79; SEM: 9.37; t(6)= 6.646; p=0.001). Deksametazon 10nM + nikotin 300nM + kenpaullone 2µM (M: 1.4194E2; SD: 13.31; SEM: 5.03; t(6)= 69 8.335; p=0.000). Deksametazon 100nM+nikotin 50nM + kenpaullone 2µM (M: 1.3195E2; SD: 19.05; SEM: 7.20; t(6)= 4.435; p=0.004). KLF11; deksametazon 10nM + nikotin 50nM + kenpaullone 2µM (M: 69.42; SD: 20.43; SEM: 7.72; t(6)= -3.959; p=0.007). Deksametazon 10nM + nikotin 300nM + kenpaullone 2µM (M: 70.42; SD: 5.66; SEM: 2.14; t(6)= -13.821; p=0.000). Deksametazon 100nM+nikotin 50nM + kenpaullone 2µM (M: 75.13; SD: 9.96; SEM: 3.76; t(6)= -6.600; p=0.001). Deksametazon 100nM + nikotin 300nM + kenpaullone 2µM (M: 71.40; SD: 11.86; SEM: 4.48; t(6)= -6.378; p=0.001). 4.3.3. Seçilen Genlere Göre Deney Gruplarında Ekspresyon Seviyeleri Sonuçları 4.3.3.1. BCL2L Bağımsız değiĢkende çok sayıda grup olduğu için istatistik değerlendirmesi için Anova yapıldı: t(20)= 6.745; p=0.000. Bcl2l geninde deksametazon 100nM (p=0.000) ve nikotin 50nM (p=0.000) kontrol grubuna göre anlamlı artıĢ gösterdi. Stres ile aktive olduğu bilinen bu genin deksametazon 100nM ile aktive olduğu görülmüĢ nikotinin her iki dozunda da artıĢ göstermesi nikotinin aynı yolak üzerinden etki edebileceğini gösterdi. Deksametazon 100nM+ Nikotin 50nM + Mekamilamin 10µM (p=0.000) ve Deksametazon 100nM + Nikotin 300nM + Mekamilamin 10µM (p=0.000) uygulamalarında kontrol grubuna göre anlamlı artıĢ görüldü. Nikotinik asetilkolin reseptör antagonisti mekamilaminin nikotin ile birlikte uygulanması nikotin etkisini bloklamıĢ ve deksametazon 100nM etkisini göstererek istatistiksel anlamlı artıĢ görüldü. Deksametazon 10nM + Nikotin 50nM + SP600125 10µM (p=0.024), deksametazon 10nM + Nikotin 300nM + SP600125 10µM (p=0.000), deksametazon 100nM + Nikotin 300nM + SP600125 10µM (p=0.029) gruplarında kontrol grubuna göre istatistiksel anlamlı artıĢ görüldü. Deksametazon 100nM + Nikotin 50 nM grubuna göre deksametazon 100nM + Nikotin 50nM + Mekamilamin 10µM grubunda (p=0.018) anlamlı artıĢ görüldü. Deksametazon 100nM + Nikotin 50nM + Mekamilamin 10µM grunbuna göre deksametazon 100nM + Nikotin 50nM + Kenpaullone 2µM (p=0.000) ve 70 deksametazon 100nM + Nikotin 50nM + SP600125 10µM (p=0.002) gruplarında anlamlı artıĢ görüldü. Deksametazon 10nM + Nikotin 300nM + Kenpaullone 2µM grubuna göre Deksametazon 10nM + Nikotin 300nM + SP600125 10µM (p=0.050) grubunda anlamlı artıĢ görüldü. 71 ġekil 27: FarklılaĢtırılmıĢ SH-SY5Y hücrelerinde deney gruplarına göre BCL2L gen ekspresyon Dex 100nM+Nic 300nM+JNK inh 10uM Dex 100nM+Nic 50nM+JNK inh 10uM Dex 10nM+Nic 300nM+JNK inh 10uM Dex 10nM+Nic 50nM+JNK inh 10uM Dex 100nM+Nic 300nM+CDK inh 2uM Dex 100nM+Nic 50nM+CDK inh 2uM Dex 10nM+Nic 300nM+CDK inh 2uM Dex 10nM+Nic 50nM+CDK inh 2uM Dex 100nM+Nic 300nM+Mec 10uM Dex 100nM+Nic 50nM+Mec 10uM Dex 10nM+Nic 300nM+Mec 10uM Dex 10nM+Nic 50nM+Mec 10uM Dex 100nM+Nic 300 nM Dex 100nM+Nic 50 nM Dex 10nM+Nic 300 nM Dex 10nM+Nic 50 Nm nic 300nM nic 50nM dex100nM dex 10nM kontrol BCL2L 160 140 120 100 80 60 40 20 0 seviyeleri 72 4.3.3.2. GILZ Anova yapıldı: t(20)= 4.011; p=0.000. Gilz geninde deksametazon 100nM uygulamasında kontrol grubuna göre gen düzeyinde anlamlı artıĢ görüldü (p=0.000). Deksametazonun 10 nM ile Deksametazon 100nM‟a bakıldığında artan dozunun uygulanmasında gen düzeyinde anlamlı artıĢ görüldü (p=0.032). Deksametazon 100nM uygulanan grup deksametazona ilaveten nikotin de uygulandığında nikotin uygulanan gruplarda sadece deksametazon uygulanan gruba göre gilz geninde anlamlı azalma görüldü. Deksametazon 10nM+ Nikotin 50nM (p=0.000), deksametazon 10nM+ nikotin 300nM (p=0.014). Benzer Ģekilde deksametazon 100nM grubuna nikotin ile birlikte kenpaullone eklenmesiyle gilz geninde anlamlı azalma görüldü. Deksametazon 100nM + Nikotin 50nM + Kenpaullone 2µM (p=0.000), Deksametazon 100nM + Nikotin 300nM + Kenpaullone 2µM (p=0.000). Deksametazon 100nM + Nikotin 50nM + SP600125 10µM (p=0.002) grubunda deksametazon 100nM grubuna göre anlamlı azalma vardır. 73 ġekil 28: FarklılaĢtırılmıĢ SH-SY5Y hücrelerinde deney gruplarına göre GILZ gen ekspresyon Dex 100nM+Nic 300nM+JNK inh 10uM Dex 100nM+Nic 50nM+JNK inh 10uM Dex 10nM+Nic 300nM+JNK inh 10uM Dex 10nM+Nic 50nM+JNK inh 10uM Dex 100nM+Nic 300nM+CDK inh 2uM Dex 100nM+Nic 50nM+CDK inh 2uM Dex 10nM+Nic 300nM+CDK inh 2uM Dex 10nM+Nic 50nM+CDK inh 2uM Dex 100nM+Nic 300nM+Mec 10uM Dex 100nM+Nic 50nM+Mec 10uM Dex 10nM+Nic 300nM+Mec 10uM Dex 10nM+Nic 50nM+Mec 10uM Dex 100nM+Nic 300 nM Dex 100nM+Nic 50 nM Dex 10nM+Nic 300 nM Dex 10nM+Nic 50 Nm nic 300nM nic 50nM dex100nM dex 10nM kontrol GILZ 200 180 160 140 120 100 80 60 40 20 0 seviyeleri 74 4.3.3.3.KLF11 Anova yapıldı: t(20)= 13.823; p=0.000. Klf11 geninde Deksametazon 10nM+ Nikotin 50nM + Mekamilamin 10µM (p=0.000), Deksametazon 10nM+ Nikotin 300nM + Mekamilamin 10µM (p=0.024), Deksametazon 100nM+ Nikotin 50nM + Mekamilamin 10µM (p=0.000) ve Deksametazon 100nM+ Nikotin 300nM + Mekamilamin 10µM (p=0.000) gruplarında anlamlı artıĢ görülmüĢtür. Sadece nikotin ya da sadece deksametazon uygulamasında anlamlı artıĢ görülmezken bu deksametazon, nikotin ve mekamilaminin birlikte uygulanmasında artıĢ görülmesi mekamilaminin bu gende artıĢı etkileyebileceğini düĢündürdü. Deksametazon 10nM + Nikotin 50nM + Kenpaullone 2µM (p=0.026) ve Deksametazon 10nM + Nikotin 300nM + Kenpaullone 2µM (p=0.039) gruplarında kontrol grubuna göre anlamlı azalma görüldü. Deksametazon 10nM grubu deksametazon 10nM + Nikotin 50nM + mekamilamin 10µM ile kıyaslandığında nikotin ve mekamilamin eklenen grupta artıĢ görüldü (p=0.002). Benzer Ģekilde deksametazon 100nM grubu deksametazon 100nM + Nikotin 50nM + mekamilamin 10µM grubu ile kıyaslandığında nikotin ve mekamilamin eklenmesinde Bcl2l geninde anlamlı artıĢ oldu (p=0.044). Nikotin ve Kenpaullene eklenmesi deksametozon 100nM grubuna göre karĢılastırıldığında Deksametazon 100nM + Nikotin 50nM + Kenpaullone 2µM (p=0.005) ve Deksametazon 100nM + Nikotin 300nM + Kenpaullone 2µM (p=0.001) istatistiksel anlamlı azalma görüldü. Nikotin 50nM tek baĢına uygulanması ve deksametazon, nikotin, kenpaullone birlikte uygulandığı gruplara bakıldığında tek baĢına nikotin uygulamasına göre anlamlı azalma görüldü. Deksametazon 10nM + Nikotin 50nM + Kenpaullone 2µM (p=0.000), Deksametazon 100nM + Nikotin 50nM + Kenpaullone 2µM (p=0.000). Benzer etki nikotin 300nM dozunda da görüldü. Deksametazon 10nM + Nikotin 300nM + Kenpaullone 2µM (p=0.018), Deksametazon 100nM + Nikotin 300nM + Kenpaullone 2µM (p=0.025). 75 Deksametazon 10nM + Nikotin 50nM grubuna kenpaullone eklendiğinde anlamlı azalma görüldü (p=0.000). Benzer etki Deksametazon 10nM + Nikotin 300nM (p=0.000), Deksametazon 100nM + Nikotin 50nM (p=0.000) ve Deksametazon 100nM + Nikotin 300nM (p=0.000) gruplarında da görüldü. Deksametazon 10nM + Nikotin 50nM + Mekamilamin 10µM grubu kenpaullone ya da SP600125 eklenen gruplar ile karĢılaĢtırıldığında anlamlı azalma görüldü. Deksametazon 10nM + Nikotin 50nM + Kenpaullone 2µM (p=0.000), Deksametazon 10nM + Nikotin 50nM + SP600125 10µM (p=0.001). Benzer Ģekilde Deksametazon 100nM + Nikotin 50nM + Mekamilamin 10µM ve Deksametazon 100nM + Nikotin 300nM + Mekamilamin 10µM grubunda da kenpaullone ya da SP600125 eklenen gruplar ile karĢılaĢtırıldığında anlamlı azalma görüldü. Deksametazon 100nM + Nikotin 50nM + Kenpaullone 2µM (p=0.000), Deksametazon 100nM + Nikotin 50nM + SP600125 10µM (p=0.000). Deksametazon 100nM + Nikotin 300nM + Kenpaullone 2µM (p=0.000), Deksametazon 100nM + Nikotin 300nM + SP600125 10µM (p=0.000). Deksametazon 10nM + Nikotin 300nM + Mekamilamin 10µM grubu kenpaullone eklenen grup ile karĢılaĢtırıldığında anlamlı azalma görüldü. Deksametazon 10nM + Nikotin 300nM + Kenpaullone 2µM (p=0.000). Deksametazon 10nM + Nikotin 300nM + Kenpaullone 2µM grubu ile Deksametazon 10nM + Nikotin 300nM + SP600125 10µM grupları karĢılaĢtırıldığında SP600125 içeren grupta anlamlı artıĢ görüldü (p=0.002). 76 ġekil 29: FarklılaĢtırılmıĢ SH-SY5Y hücrelerinde deney gruplarına göre KLF11 gen ekspresyon Dex 100nM+Nic 300nM+JNK inh 10uM Dex 100nM+Nic 50nM+JNK inh 10uM Dex 10nM+Nic 300nM+JNK inh 10uM Dex 10nM+Nic 50nM+JNK inh 10uM Dex 100nM+Nic 300nM+CDK inh 2uM Dex 100nM+Nic 50nM+CDK inh 2uM Dex 10nM+Nic 300nM+CDK inh 2uM Dex 10nM+Nic 50nM+CDK inh 2uM Dex 100nM+Nic 300nM+Mec 10uM Dex 100nM+Nic 50nM+Mec 10uM Dex 10nM+Nic 300nM+Mec 10uM Dex 10nM+Nic 50nM+Mec 10uM Dex 100nM+Nic 300 nM Dex 100nM+Nic 50 nM Dex 10nM+Nic 300 nM Dex 10nM+Nic 50 Nm nic 300nM nic 50nM dex100nM dex 10nM kontrol KLF11 180 160 140 120 100 80 60 40 20 0 seviyeleri 77 4.3.3.4.NFKB1 Anova yapıldı: t(20)= 6.760; p=0.000. NFKB1 geninde deksametazon 100nM (p=0.000) ve nikotin 50nM (p=0.000) kontrol grubuna göre anlamlı artıĢ gösterdi. Deksametazon 10nM+ Nikotin 50nM + Mekamilamin 10µM (p=0.026) ve Deksametazon 10nM + Nikotin 300nM + Mekamilamin 10µM (p=0.003) uygulamalarında kontrol grubuna göre anlamlı artıĢ görüldü. Deksametazon 100nM+ Nikotin 50nM + Mekamilamin 10µM (p=0.000) ve Deksametazon 100nM + Nikotin 300nM + Mekamilamin 10µM (p=0.000). Nikotinik asetilkolin reseptör antagonisti mekamilaminin nikotin ile birlikte uygulanması nikotin etkisini bloklar, deksametzonun 10nM dozu uygulamasında kontrol gubuna göre artıĢ görülmezken mekamilamin nikotinini bloklamasına rağmen deksametazon ve nikotin birlikte uygulamasında kontrol grubunda istatistiksel anlamlı artıĢ görüldü. Deksametazon 100nM+ Nikotin 50nM + Mekamilamin 10µM grubu ile Deksametazon 100nM + Nikotin 50nM + Kenpaullone 2µM kıyaslandığında p=0.000 anlamlı azalma olduğu görüldü. Deksametazon 100nM+ Nikotin 300nM + Mekamilamin 10µM ile Deksametazon 100nM + Nikotin 300nM + SP600125 10µM kıyaslandığında p=0.010 azalma görüldü. Deksametazon 100nM + Nikotin 50nM + SP600125 10µM ile Deksametazon 100nM+ Nikotin 50nM + Mekamilamin 10µM grubu karĢılaĢtırıldığında p=0.000 artıĢ görüldü. 78 ġekil 30: FarklılaĢtırılmıĢ SH-SY5Y hücrelerinde deney gruplarına göre NFKB1 gen ekspresyon Dex 100nM+Nic 300nM+JNK inh 10uM Dex 100nM+Nic 50nM+JNK inh 10uM Dex 10nM+Nic 300nM+JNK inh 10uM Dex 10nM+Nic 50nM+JNK inh 10uM Dex 100nM+Nic 300nM+CDK inh 2uM Dex 100nM+Nic 50nM+CDK inh 2uM Dex 10nM+Nic 300nM+CDK inh 2uM Dex 10nM+Nic 50nM+CDK inh 2uM Dex 100nM+Nic 300nM+Mec 10uM Dex 100nM+Nic 50nM+Mec 10uM Dex 10nM+Nic 300nM+Mec 10uM Dex 10nM+Nic 50nM+Mec 10uM Dex 100nM+Nic 300 nM Dex 100nM+Nic 50 nM Dex 10nM+Nic 300 nM Dex 10nM+Nic 50 Nm nic 300nM nic 50nM dex100nM dex 10nM kontrol NFKB1 250 200 150 100 50 0 seviyeleri 79 4.3.3.5.SGK1 Anova yapıldı: t(20)= 13.212; p=0.000. Sgk1 geninde deksametazon 100nM uygulamasında gen düzeyinde anlamlı artıĢ görüldü (p=0.24). Nikotin 300nM uygulamasında artıĢ görüldü (p=0.000). deksametazon ve nikotinin birlikte uygulandığı tüm gruplarda artıĢ görüldü. Deksametazon 10nM+ Nikotin 50nM (p=0.000), Deksametazon 10nM+ Nikotin 300nM (p=0.000), Deksametazon 100nM+ Nikotin 50nM (p=0.000), Deksametazon 100nM+ Nikotin 300nM (p=0.000). Deksametazon nikotin ve mekamilamin içeren gruplarda deksametazon ve nikotinin yüksek dozunu içeren grup haricinde diğer gruolarda Sgk1 geninde kontrol grubuna göre artıĢ görüldü. Deksametazon 10nM+ Nikotin 50nM + Mekamilamin 10µM (p=0.000), Deksametazon 10nM+ Nikotin 300nM + Mekamilamin 10µM (p=0.000), Deksametazon 100nM+ Nikotin 50nM + Mekamilamin 10µM (p=0.020). Deksametazon 10nM + Nikotin 50nM + Kenpaullone 2µM (p=0.001) ve Deksametazon 100nM + Nikotin 300nM + Kenpaullone 2µM (p=0.023) gruplarında kontrol grubuna göre anlamlı artıĢ görüldü. Deksametazon 10 nM içeren gruba göre Deksametazon 10nM+ Nikotin 50nM içeren grupta Sgk1 geninde anlamlı artıĢ görüldü (p=0.004). Deksametazon 10 nM içeren gruba göre Deksametazon 10nM+ Nikotin 50nM + Mekamilamin 10µM (p=0.000), Deksametazon 10nM+ Nikotin 300nM + Mekamilamin 10µM (p=0.004)gruplarında artıĢ görüldü. Deksametazon 10 nM içeren gruba göre Deksametazon 100nM+ Nikotin 50nM + SP600125 10µM (p=0.000) grubunda Sgk1 gen düzeyinde azalma görüldü. Nikotin 50 nM grubuna göre Deksametazon 10nM+ Nikotin 50nM + Mekamilamin 10µM (p=0.020)grubunda anlamlı artıĢ görüldü. Deksametazon 10nM+ Nikotin 50nM + SP600125 10µM (p=0.001) grubunda azalma görüldü, nikotin dozunun artırılmasıyla bu azalmanın ortadan kalktığı görüldü; deksametazon dozunun artırılmasıyla yine anlamlı bir azalma görüldü. Deksametazon 10onM+ Nikotin 50nM + SP600125 10µM (p=0.007). 80 Nikotin 300 nM grubuna göre deksametazon ve SP600125 eklenmesiyle Sgk1 geninde azalma görüldü. Deksametazon 10nM+ Nikotin 300nM + SP600125 10µM (p=0.000), Deksametazon 100nM+ Nikotin 300nM + SP600125 10µM (p=0.001). Deney gruplarına SP600125 eklenmesiyle Deksametazon 10nM+ Nikotin 50nM içeren gruba göre anlamlı azalma görüldü. Deksametazon 10nM+ Nikotin 50nM + SP600125 10µM (p=0.000), Deksametazon 10nM+ Nikotin 300nM + SP600125 10µM (p=0.000). Deksametazon 100nM+ Nikotin 50nM + SP600125 10µM (p=0.000), Deksametazon 100nM+ Nikotin 300nM + SP600125 10µM (p=0.000). Benzer sonuçlar deksametazon ve nikotin farklı konsantrasyonlarını içeren diğer gruplar ile karĢılaĢtırıldığında da görüldü. Genel olarak deksametazon, nikotin ve SP600125 içeren grup; deksametazon, nikotin ve mekamilamin içeren deney grubu ile karĢılaĢtırıldığında azalma olduğu görüldü (deksametazon ve nikotin yüksek dozunu içeren grup hariç). Genel olarak deksametazon, nikotin ve SP600125 içeren grup; deksametazon, nikotin ve kenpaullone içeren deney grubu ile karĢılaĢtırıldığında azalma olduğu görüldü (deksametazon ve nikotin yüksek dozunu içeren grup hariç) 81 ġekil 31: FarklılaĢtırılmıĢ SH-SY5Y hücrelerinde deney gruplarına göre SGK1 gen ekspresyon Dex 100nM+Nic 300nM+JNK inh 10uM Dex 100nM+Nic 50nM+JNK inh 10uM Dex 10nM+Nic 300nM+JNK inh 10uM Dex 10nM+Nic 50nM+JNK inh 10uM Dex 100nM+Nic 300nM+CDK inh 2uM Dex 100nM+Nic 50nM+CDK inh 2uM Dex 10nM+Nic 300nM+CDK inh 2uM Dex 10nM+Nic 50nM+CDK inh 2uM Dex 100nM+Nic 300nM+Mec 10uM Dex 100nM+Nic 50nM+Mec 10uM Dex 10nM+Nic 300nM+Mec 10uM Dex 10nM+Nic 50nM+Mec 10uM Dex 100nM+Nic 300 nM Dex 100nM+Nic 50 nM Dex 10nM+Nic 300 nM Dex 10nM+Nic 50 Nm nic 300nM nic 50nM dex100nM dex 10nM kontrol SGK1 250 200 150 100 50 0 seviyeleri 82 5. TARTIġMA Bu tez çalıĢmasında SH-SY5Y hücre hattı kullanılarak in vitro stres modelinde nikotinin glukokortikoid ile aktive olan genlerin ekspresyonuna olan etkisi araĢtırılmıĢtır. SH-SY5Y, nöronal hücre araĢtırmalarında yaygın olarak kullanılan hücre hattıdır. Nöroblastoma hücrelerinin farklılaĢabilmesi sinirbilim araĢtırmaları için bir avantaj oluĢturmaktadır. Bu farklılaĢmayı indüklemek için kullanılan ajanlar arasında retinoik asit, forbol esterleri ve dibütiril cAMP bulunur. Bunların yanı sıra BDNF, NGFgibi büyüme faktörleriyle nörogulinler de kullanılmaktadır. Bu tez çalıĢmasında SH-SY5Y hücrelerini nörona farklılaĢtırmak için yaygın olarak kullanılan ajan retinoik asit uygulanmıĢtır. FarklılaĢtırılmayan hücreler (kontrol grubu) non-polarize hücre gövdesine sahip ve kümeler halinde büyüme eğilimi göstermiĢtir. Retinoik asit uygulamasıyla farklılaĢtırılan hücrelerde dendritik uzuntılar görülmüĢ, çoğalma hızlarının yavaĢladığı ve kümeler halinde çoğalmadıkları belirlenmiĢtir. FarklılaĢtırma daha önceki çalıĢmalarda da gösterildiği gibi nöritlerin uzaması ve formasyonu, nörotransmiter reseptörlerindeki değiĢim Ģeklinde gösterilmiĢtir. Ligand kapılı iyon kanalı oluĢturan nikotinik asetilkolin reseptörleri SH-SY5Y hücrelerinde bulunmakta ve insan ganglion tipi nAChR analoğu kabul edilmektedir. SH-SY5Y hücrelerinin ve α3, α5, α7, β2 ve β4 nAchR genlerini eksprese ettiği daha önceki çalıĢmalarda gösterilmiĢtir. α (α2- α8) ve β (β2- β4) altbirimleri farklı kombinasyonda bir araya gelerek bulunabilirler. SH-SY5Y hücrelerinde bulunan nAchR alt birim kombinasyonları tam olarak bilinmemekle birlikte α3β2, α3β4, α3β4α5, α3β2α5, ve α3β2β4α5olası kombinasyonlardır[56].FarklılaĢtırılan ve farklılaĢtırılmayan hücre kültürlerinde bu nikotinik asetilkolin reseptör gen ekspresyonlarına sybr green boyası kullanılarak gerçek zamanlı PCR yapılmıĢ ve α3, α5 ve β2 genleri için istatistiksel olarak anlamlı azalma görülmüĢtür.SH-SY5Y hücrelerinde bulunan nAchR, nikotine desensitize yanıt gösterir fakat primer nöronlardaki reseptör aktivasyonuna benzer Ģekilde yıkamayı takiben yeniden sensitize hale gelir[50]. Sıçanlarda yapılan kronik kısıtlama stresi deneyinde glukokoritikoid agonisti RU28,362 ya da kortikosteron 7 gün uygulanmıĢ, nAchRα7 mRNA ve protein hipokampal eksresyon seviyesi 125 I α-Bungarotoksin otoradyografi ile ölçülmüĢtür. 83 Kronik stres sonucunda nAchRα7 protein seviyesi düĢerken, aynı çalıĢmada mRNA seviyesinin CA1, CA3 vedentat girus bölgelerinde arttığı bulunmuĢtur. Kronik stres ürünlerinde hipokampal formasyondaki reseptörlere bağlanma azalırken nAchRα7 mRNA‟sında önemli artıĢ gösterilmiĢtir. Bunun sonuçallostatik aĢırı yüklenme ya da strese karĢı hipokampal adaptasyonlarda nAchRα7‟nin önemli rol oynayabileceğini göstermektedir. Stres, nAchRα7proteininintrafiğini ve posttranslasyonel modifikasyonunu değiĢtirebilir. Diğer yandan stres sırasında reseptörlerin uyarı düzeyiyle bağlantılı olarak mRNA düzeylerinin doğrudan artabildiği (up-regulation) gösterilmiĢtir. [57] Stres yanıtı, karĢılaĢtığında, canlıların homeostatik yaĢamda dengesini kendisini korumak tehdit için eden geliĢtirdiği durumlarla bir dizi mekanizmadan oluĢmaktadır. Psikolojik, enfeksiyöz ve travmatik her türlü stres CRH nöronlarını aktive eder. HPA ekseninin son ürünü olan glukokortikoid hormonlar, stres karĢısında geliĢtirilen adaptif süreçlerde hayati rol oynar. Bu süreçler metabolik, immün, nöral ve davranıĢsal mekanizmalardır. HPA ekseni boyunca GC sentezlenir. Glukokortikoidler mekanik, kimyasal, enfeksiyöz ve immunolojik uyarıların neden olduğu inflamasyonu engelleyen ve baskılayan en güçlü ve etkili ajanlardır. Fizyolojik Ģartlarda endokrin ve metabolik süreçlere GRE‟lerin DNA‟ya bağlanması (transaktivasyon) aracılık eder. Glukokoritkoidlerin birçok antiinflamatuar etkisi ise transkripsiyon faktörlerinin inhibisyonuyla (transrepresyon) olur. Glukokortikoidler lipofilik özellikleri sayesinde plazma membranından difüze olabilirler ve intraselüler GRα‟ya bağlanırlar. Glukokortikoidler tarafından doğrudan regüle edilen 10 ila 100 gen olduğu düĢünülmektedir. Glukokortikoid-GR kompleksinin antiinflamatuar proteinler ya da daha önemlisi transrepresyon mekanizmalarında indirek gen düzenleme etkilerinin olduğu gösterilmiĢtir. Bu mekanizmalar nüklear faktör- κB ya da aktivatör protein 1 gibi proinflamatuar transkripsiyonel faktörlerin, MAPK‟lar gibi enzimlerin destabilizasyonu ve inflamatuar süreçte hücre çoğalması inhibisyonunu içerir. Glukokortikoidler, etkilerini glukokortikoid resptörlerine bağlanıp bu reseptörü aktive ederek gösterirler. Glukokortikoid reseptörleri MAPK, CDK ve GSK-3β gibi kinazlar tarafından fosforillenir ve fosforillenen dimerize GR nukleusa geçerek hedef genlerde transkripsiyonel aktivite değiĢikliklerine neden olur [7]. CDK5, glukokortikoid reseptörünün S211 bölgesinin fosforillenmesinden sorumludur ve bu etki GR aktivitesini artırır; JNK, glukokortikoid reseptörünün S226 bölgesinin 84 fosforillenmesinden sorumludur ve bu etki de GR aktivitesini azaltma yönündedir. Bu fosforillenmeler sonucu transkripsiyonel aktivitede değiĢiklikler ortaya çıkar. Tütün (nikotin) kullanımı ve kortizol arasındaki iliĢki üç boyutta ortaya çıkar. Ġlk olarak HPA ekseni bağımlılık süreçleri ile doğrudan iliĢkilidir. Ġkincisi, artmıĢ kortizol seviyeleri; lipid profilleri, immun fonksiyonlar, merkezi adipozite, kemik mineral yogunluğu ve üreme fonksiyonlarını içeren sağlıkla iliĢkili pek çok biyolojik süreçlerde uzun süreli olumsuz etkiler gösterir. Son olarak, psikolojik stres yüksek kortizol düzeyleri ile iliĢkilidir. Çoğu sigara içicisi için sigarayı bırakmak stresli bir durumdur. Kortizol doğrudanbu süreçile iliĢkilidirve sigarabırakmanınerken dönemindeki kötü deneyimlerin baĢıca sorumlusu kortizol olarak kabul edilir [47]. Bu tez kapsamında nikotin uygulaması sonucunda glukokortikoid ile aktive olan ve nöronlarda bulunduğu bilinen BCL2L1, SGK1, NFKB1, GILZ, KLF11genleri ve referans gen olarak G6PDgen ekspresyon düzeyleri Taqman probu kullanılarak gerçek zamanlı PCR yöntemi kullanılarak incelenmiĢtir. FarklılaĢtırılan SH-SY5Y hücrelerine deksametazonun iki farklı konsrantrasyonu (10nM ve 100nM) 24 saatlik uygulanarak glukokortikoid ile aktive olduğu bilinen ve seçilen bu genlerin ekpresyon düzeyine bakılmıĢtır. Yüksek doz deksametazon uygulamasında her gende istatistiksel olarak anlamlı artıĢ görülmüĢtür. Kullanılan doz aralığı ve uygulama süresi daha önce yapılan deneyler baz alınarak uygulanmıĢtır [58-63]. U2OS ve A549 gibi hücrelerde deksametazon uygulamasıyla GR serin bölgerindeki (S203, S211 ve S226) fosforillenme daha önceki çalıĢmalarda incelenmiĢtir. Bu çalıĢmalarda GR bağımlı gen ekspresyonu üzerindeki fosforilasyon etkilerini daha iyi anlamak için belirli GR hedef genlerden mRNA toplanmıĢ ve U2OS hücrelerinde GILZ, ladinin 1 (LAD1), IGF-bağlanma proteini 1 (IGFBP1) ve interferon düzenleyici faktör 8 (IRF8) gibi genler incelenmiĢtir. Bu amaçla belirlenen dozlarda 2 saat deksametazoın uygulanmıĢ, qPCR için total RNA izole edilmiĢ vedüĢük konsantrasyonda deksametazon uygulanması sonucu (<10nM) GILZ aktivasyonunun bozulduğu gösterilmiĢtir [13]. Sunulan tez çalıĢmasında farklılaĢtırılan SH-SY5Y hücrelerine nikotinin iki farklı konsrantrasyonunun (50nM ve 300nM) 24 saatlik uygulanmasıyla seçilen gen eksresyonlarında nikotin dozu arttıkça bifazik etki görülmüĢtür. DüĢük konsantrasyonda nikotin uygulaması tüm genlerde anlamlı artıĢ gösterirken yüksek dozda düĢük doza göre daha az anlamlı artıĢ olmuĢ ya da olmamıĢtır. Nikotin dozu 85 arttıkça SH-SY5Y hücrelerinde nikotinin toksik etki gösterdiği daha önceki çalĢmalarda gösterilmiĢtir[64]. Deksametazon ile nikotin farklı doz kombinasyonlarda birlikte uygulandığında SGK1 ve KLF11 genlerinde tüm gruplarda kontrol grubuna oranla anlamlı artıĢ gözlenmiĢtir. Nikotinik asetilkolin reseptör antagonisti mekamilamin, deksametazon ve nikotin ile birlikte uygulanıldığında deney gruplarının büyük bölümündeseçilen genlerde ekspresyon artıĢı görülmüĢtür. Bu durum, nikotinin antagonisti mekamilamin tarafından bloke edildiğini ve sonuçta deksametzonun bu genlerin ifadesini kontrol gruplarına göre artırmasından kaynaklı olabileceğini düĢündürmektedir. Glukokortikoid reseptör fosforilasyonunda görev alan ve GR aktivitesini arttırdığı bilinen özel bir siklin bağımlı kinaz olan CDK5‟in inhibitörü kenpaullone, nikotin ve deksametazonun farklı doz kombinasyonlarını içeren hücre kültürlerine 24 saat uygulanmıĢtır. SGK1 geninde tüm gruplarda kontrol grubuna göre istatistiksel anlamlı artıĢ görülmekteyken KLF11 geninde tüm gruplarda kontrol grubuna göre anlamlı azalma görülmüĢtür. Glukokortikoid reseptör fosforilasyonunda görev alan ve GR aktivitesini azaltmaktan sorumlu olan JNK‟nın inhibitörü olan SP600125, nikotin ve deksametazon farklı doz kombinasyonlarını içeren hücre kültürlerine 24 saat uygulanmıĢtır. SGK1 geninde kontrol grubuna göre istatistiksel olarak anlamlı düzeyde azalan gruplar görülmekteyken BCL2L geninde tüm gruplarda kontrol grubuna göre anlamlı artıĢ görülmüĢtür. SGK1 geni deksametazon ve nikotin birlikte uygulandığında artıĢ gösterirken CDK5 inhibitörü uygulaması ile bu artıĢ ortadan kalkmazken JNK inhibitörü uygulaması ile gen ekpresyonunda azalma görülür. KLF11 geni deksametazon ve nikotin birlikte uygulandığında artıĢ gösterirken JNK inhibitörü uygulaması ile bu artıĢ ortadan kalkar. CDK5 inhibitörü uygulaması ile gen ifadesinde tüm gruplarda azalma görülür. BCL2L geni deksametazon ve nikotin birlikte uygulandığında artıĢ gösterirken JNK inhibitörü uygulaması ile bu artıĢ ortadan kalkmazken CDK5 inhibitörü uygulaması ile gen ifadesindeki artıĢ ortadan kalkar. 86 6. SONUÇ VE ÖNERĠLER Stres etmenlerinin vücutta meydana getirdiği değiĢiklikler ve glukokortikoid etkileri uzun zamandır araĢtırma konusu olmuĢtur. Stres yanıtının moleküler mekanizmaları incelenmiĢ ve zararlı etkilerine karĢı tedavi yöntemleri geliĢtirilmeye çalıĢılmıĢtır. Benzer Ģekilde, nikotinin sinir sistemi ve tüm organizmaya olan etkileri de pek çok araĢtırmaya konu olmuĢtur. Mezokortikolimbik sistem dopamin nöronlarındaki nAChR‟lerinin nikotinle duyarsızlaĢtırılması antidepresan benzeri etkiler oluĢturmaktadır. Aynı zamanda nikotinin postgangliyonik sempatik sinir sonlanmalarından noradrenalin salgılanmasına neden olduğu ve sempatomimetik etkilere yol açtığı bilinmektedir. Nikotinin sempatomimetik etkileriyle stres yanıtlarını artırması beklenirken sigara içenler genellikle sigaranın stresi azalttığını ifade etmektedirler. Nikotinin uyanıklık ile azalmıĢ stresi birlikte oluĢturması Nesbitt paradoksu olarak adlandırılmaktadır [49]. Sigaranın içinde bulunan ve temel bağımlılık yapıcı ajan olarak kabul edilen nikotinin moleküler düzeydeki etkilerinin bilinmesi sigara bağımlılığı ve bunun stres ile iliĢkisinin altında yatan mekanizmaları anlama açısından önemli kazanımlar sağlayacaktır. Bu çalıĢmada, stres ve nikotin iliĢkisinde seçilen genlerde, bu genlerin anlatımındaki farklıklar mRNA düzeyinde gösterilmiĢtir. AraĢtırılan genlerin fonksiyonel etkilerinin ortaya çıkarılmasıiçin translasyon sonrası protein etkilerinin incelenmesi gereklidir. Glukokortikoidlerin etkilediği bilenen yüzlerce gen vardır bunlarda nikotin uygulamasıyla protein düzeyinde etkileri moleküler yolaklar ıĢığında araĢtırılarak stres ve nikotin iliĢkisi aydınlatılabilir ve bir paradoks olan nikotin stres iliĢkisine ıĢık tutulabilir. 87 8. KAYNAKLAR 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8. 9. 10. 11. 12. 13. 14. 15. 16. 17. 18. 19. Keser, A., STRES VE NİKOTİNİN NÖRONAL NİTRİK OKSİT SENTAZ EKSPRESYONUNA VE BEYİN NİTRİT/NİTRAT SEVİYELERİNE ETKİSİ, in FİZYOLOJİ ANABİLİM DALI2007, EGE ÜNĠVERSĠTESĠ TIP FAKÜLTESĠ. De Kloet, E.R., Hormones and the stressed brain. Ann N Y Acad Sci, 2004. 1018: p. 1-15. Stein-Behrens, B.A. and R.M. Sapolsky, Stress, glucocorticoids, and aging. Aging (Milano), 1992. 4(3): p. 197-210. University, G.R. adrenal gland. 2015; Available from: http://www.gru.edu/mcg/phy/raineylab/objective.php. Brandt, D., The Adrenal Cortex in Steroid Biosynthesis and Regulation of Cortisol Production Kim E. Barrett, S.M.B., Scott Boitano, Heddwen L. Brooks, Ganong’s Review of Medical Physiology2010. Galliher-Beckley, A.J. and J.A. Cidlowski, Emerging roles of glucocorticoid receptor phosphorylation in modulating glucocorticoid hormone action in health and disease. IUBMB Life, 2009. 61(10): p. 979-86. Cosio, B.G., A. Torrego, and I.M. Adcock, [Molecular mechanisms of glucocorticoids]. Arch Bronconeumol, 2005. 41(1): p. 34-41. Reddy, T.E., et al., Genomic determination of the glucocorticoid response reveals unexpected mechanisms of gene regulation. Genome Res, 2009. 19(12): p. 2163-71. Smoak, K.A. and J.A. Cidlowski, Mechanisms of glucocorticoid receptor signaling during inflammation. Mech Ageing Dev, 2004. 125(10-11): p. 697706. Kumar, R. and E.B. Thompson, Gene regulation by the glucocorticoid receptor: structure:function relationship. J Steroid Biochem Mol Biol, 2005. 94(5): p. 383-94. Tatro, E.T., et al., Modulation of glucocorticoid receptor nuclear translocation in neurons by immunophilins FKBP51 and FKBP52: implications for major depressive disorder. Brain Res, 2009. 1286: p. 1-12. Chen, W., et al., Glucocorticoid receptor phosphorylation differentially affects target gene expression. Mol Endocrinol, 2008. 22(8): p. 1754-66. Cabadak, H., HÜCRE SIKLUSU VE KANSER. ADÜ Tıp Fakültesi Dergisi, 2008. Zaharevitz, D.W., et al., Discovery and initial characterization of the paullones, a novel class of small-molecule inhibitors of cyclin-dependent kinases. Cancer Res, 1999. 59(11): p. 2566-9. Liebl, J., et al., Twice switched at birth: cell cycle-independent roles of the "neuron-specific" cyclin-dependent kinase 5 (Cdk5) in non-neuronal cells. Cell Signal, 2011. 23(11): p. 1698-707. Zhu, J., W. Li, and Z. Mao, Cdk5: mediator of neuronal development, death and the response to DNA damage. Mech Ageing Dev, 2011. 132(8-9): p. 38994. Smith, D.S., P.L. Greer, and L.H. Tsai, Cdk5 on the brain. Cell Growth Differ, 2001. 12(6): p. 277-83. Lew, J., CDK5: A new lead to survival. Cell Cycle, 2013. 12(13): p. 1981-2. 88 20. 21. 22. 23. 24. 25. 26. 27. 28. 29. 30. 31. 32. 33. 34. 35. 36. 37. 38. 39. Qiu, J., et al., Rapid activation of ERK1/2 mitogen-activated protein kinase by corticosterone in PC12 cells. Biochem Biophys Res Commun, 2001. 287(4): p. 1017-24. Weston, C.R. and R.J. Davis, The JNK signal transduction pathway. Curr Opin Genet Dev, 2002. 12(1): p. 14-21. Johnson, G.L. and K. Nakamura, The c-jun kinase/stress-activated pathway: regulation, function and role in human disease. Biochim Biophys Acta, 2007. 1773(8): p. 1341-8. Chen, F., JNK-induced apoptosis, compensatory growth, and cancer stem cells. Cancer Res, 2012. 72(2): p. 379-86. Bain, J., et al., The specificities of protein kinase inhibitors: an update. Biochem J, 2003. 371(Pt 1): p. 199-204. BCL2L1. Jul 2008 17-Mar-2015; Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/?term=NM_138578. SGK1. Jan 2009 17-Mar-2015; Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/?term=NM_001143677. Schoenebeck, B., et al., Sgk1, a cell survival response in neurodegenerative diseases. Mol Cell Neurosci, 2005. 30(2): p. 249-64. Webster, M.K., et al., Characterization of sgk, a novel member of the serine/threonine protein kinase gene family which is transcriptionally induced by glucocorticoids and serum. Mol Cell Biol, 1993. 13(4): p. 203140. GILZ. Jul 2008 17-Mar-2015; Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/?term=NM_001015881. KLF11. Apr 2010 17-Mar-2015; Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/?term=NM_001177716. Grunewald, M., et al., Mechanistic role for a novel glucocorticoid-KLF11 (TIEG2) protein pathway in stress-induced monoamine oxidase A expression. J Biol Chem, 2012. 287(29): p. 24195-206. NFKB1. Sep 2009 17-Mar-2015; Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/?term=NM_001165412. G6PD. Jul 2008 17-Mar-2015; Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/2539. TÜRKÇAPAR, D.D.M.H., HPA (hipotalamik-pituiter [hipofiz]-adrenal) Ekseni. DUYGUDURUM DĠZĠSĠ 2001. 6:257-263. Hofmann, F.B., Nicotine Psychopharmacology, in Handbook of Experimental Pharmacology, J.E.H.E.D. London and S. Pogun, Editors. 2009: SpringerVerlag Berlin Heidelberg. Hurst, R., H. Rollema, and D. Bertrand, Nicotinic acetylcholine receptors: from basic science to therapeutics. Pharmacol Ther, 2013. 137(1): p. 22-54. DOĞAN, Y.H., NİKOTİNİN BEYİNDEKİ ÖDÜL SİSTEMLERİ ÜZERİNDEKİ ETKİSİNDE CİNSİYET FARKLILIĞI, in fizyolji anabilimdalı2006, ege üniversitesi. Bacher, I., et al., Mecamylamine - a nicotinic acetylcholine receptor antagonist with potential for the treatment of neuropsychiatric disorders. Expert Opin Pharmacother, 2009. 10(16): p. 2709-21. Nesil, T., Sıçanlarda Nikotin Tercihinin Olusturulması ve Arastırılması, in Ege Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Biyoteknoloji Anabilim Dalı2007, Ege Üniversitesi. 89 40. 41. 42. 43. 44. 45. 46. 47. 48. 49. 50. 51. 52. 53. 54. 55. 56. 57. 58. 59. 60. 61. Albuquerque, E.X., et al., Mammalian nicotinic acetylcholine receptors: from structure to function. Physiol Rev, 2009. 89(1): p. 73-120. CHRNA3. Nov 2009 17-Mar-2015; Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/?term=NM_000743. CHRNA5 Jun 2010 17-Mar-2015; Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/1138. CHRNA7 Feb 2012 17-Mar-2015; Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/1139. CHRNB2 Jul 2008 18-Mar-2015; Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/1141. CHRNB4 17-Mar-2015; Available from: http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gene/?term=NM_000750. Levin, E.D., et al., The effects of smoking-related sensory cues on psychological stress. Pharmacol Biochem Behav, 1991. 39(2): p. 265-8. Steptoe, A. and M. Ussher, Smoking, cortisol and nicotine. Int J Psychophysiol, 2006. 59(3): p. 228-35. Matta, S.G., et al., Response of the hypothalamo-pituitary-adrenal axis to nicotine. Psychoneuroendocrinology, 1998. 23(2): p. 103-13. Parrott, A.C., Nesbitt's Paradox resolved? Stress and arousal modulation during cigarette smoking. Addiction, 1998. 93(1): p. 27-39. Shohreh Amini, M.K.W., Neuronal Cell Culture, ed. J.M. Walker2013. Agholme, L., et al., An in vitro model for neuroscience: differentiation of SHSY5Y cells into cells with morphological and biochemical characteristics of mature neurons. J Alzheimers Dis, 2010. 20(4): p. 1069-82. Chen, Q. and A.C. Ross, Retinoic acid regulates cell cycle progression and cell differentiation in human monocytic THP-1 cells. Exp Cell Res, 2004. 297(1): p. 68-81. Korecka, J.A., et al., Phenotypic characterization of retinoic acid differentiated SH-SY5Y cells by transcriptional profiling. PLoS One, 2013. 8(5): p. e63862. PCR. 2000 Available from: http://www.bio.davidson.edu/Courses/genomics/RTPCR/RT_PCR.html. Tuba, G., Gen Anlatımının Kantitatif Analizi “Real-Time PCR”. Warpman, U., et al., Regulation of nicotinic receptor subtypes following chronic nicotinic agonist exposure in M10 and SH-SY5Y neuroblastoma cells. J Neurochem, 1998. 70(5): p. 2028-37. Hunter, R.G., et al., Regulation of the nicotinic receptor alpha7 subunit by chronic stress and corticosteroids. Brain Res, 2010. 1325: p. 141-6. Ke, L. and R.J. Lukas, Effects of steroid exposure on ligand binding and functional activities of diverse nicotinic acetylcholine receptor subtypes. J Neurochem, 1996. 67(3): p. 1100-12. Cote-Velez, A., et al., Dexamethasone represses cAMP rapid upregulation of TRH gene transcription: identification of a composite glucocorticoid response element and a cAMP response element in TRH promoter. J Mol Endocrinol, 2005. 34(1): p. 177-97. Thomas, A., et al., Expression of a complete and functional complement system by human neuronal cells in vitro. Int Immunol, 2000. 12(7): p. 101523. Yaniv, S.P., et al., Dexamethasone enhances the norepinephrine-induced ERK/MAPK intracellular pathway possibly via dysregulation of the alpha290 62. 63. 64. adrenergic receptor: implications for antidepressant drug mechanism of action. Eur J Cell Biol, 2010. 89(9): p. 712-22. Lucki, A., et al., Dexamethasone in the presence of desipramine enhances MAPK/ERK1/2 signaling possibly via its interference with beta-arrestin. J Neural Transm, 2014. 121(3): p. 289-98. Casulari, L.A., et al., Dexamethasone blocks the migration of the human neuroblastoma cell line SK-N-SH. Braz J Med Biol Res, 2006. 39(9): p. 1233-40. Ramlochansingh, C., R.E. Taylor, and Y. Tizabi, Toxic effects of low alcohol and nicotine combinations in SH-SY5Y cells are apoptotically mediated. Neurotox Res, 2011. 20(3): p. 263-9. 91 8.ÖZGEÇMĠġ HASĠBE ġAHĠN KocamustafapaĢa Mahallesi Berber ġefik Sokak Karadeniz Apartmanı No:47 Daire:13 KocamustafapaĢa - Fatih/ĠSTANBUL 0505 3971126 hasibeshn@gmail.com EĞĠTĠM 2014 – devam etmekte 2012 – devam etmekte 2009 – 2014 2008 – 2012 2003 – 2007 Yüksek Lisans, Ege Üniversitesi, Sağlık Bilimleri Enstitüsü, FizyolojiAnabilim Dalı Yüksek Lisans, Ege Üniversitesi, Sağlık Bilimleri Enstitüsü, Sinirbilim Anabilim Dalı Lisans, Anadolu Üniversitesi, Açık Öğretim Fakültesi, İşletme Lisans, İstanbul Üniversitesi, Fen Fakültesi, Moleküler Biyoloji ve Genetik Uşak Anadolu Öğretmen Lisesi DENEYĠM Eylül 2014 – devam etmekte CRM-CRO Sözleşmeli Araştırma Kuruluşu, Klinik Araştırma Koordinatörü Mart 2013- Ağustos 2014 EÜBAM Oral Nikotin Tercih Eden ve Etmeyen Sıçan SoylarınınOluşturulması Temmuz 2011 Yeditepe Üniversitesi Mühendislik ve Mimarlık Fakültesi Genetik veBiyomühendislik Bölümü, İstanbul ġubat 2011 İstanbul Teknik Üniversitesi Moleküler Biyoloji ve Genetik Bölümü, İstanbul Ağustos 2010 — Eylül 2010 Ege Üniversitesi Tıbbi Genetik Anabilim Dalı Moleküler Laboratuarı, İzmir Temmuz 2010 İstanbul Üniversitesi Deneysel Tıp Araştırma Enstitüsü Moleküler Tıp AnabilimDalı, İstanbul Temmuz 2009 — Ağustos 2009 Özel Ceyline Hastanesi Mikrobiyoloji ve Biyokimya Laboratuarı, Usak EĞĠTĠM VE SERTĠFĠKALAR Ege Üniversitesi 11. Ulusal Sinirbilim Kongresi (28.04.2013-01.05.2013) İstanbul Üniversitesi Yaşam Bilimlerinde Multidisipliner Ar-Ge ve İnovasyon Sempozyumu (15-17 Haziran 2012) İstanbul Üniversitesi Uluslararası Katılımlı 9.İÜGEN Moleküler Biyoloji ve Genetik Öğrenci Kış Okulu Düzenleyici Sertifikası(24-26 Şubat 2012) İTÜ Girişimcilik Kulübü ‘GO:Beden Dili Eğitimi’ Semineri Katılım Belgesi (25 Ekim 2011) İstanbul Üniversitesi Kariyer Geliştirme Merkezi (KAGEM) Kariyer Günleri’ne Katılım Sertifikası (15-16 Mart 2011) İstanbul Üniversitesi Uluslararası Katılımlı 8.İÜGEN Moleküler Biyoloji ve Genetik Öğrenci Kış Okulu Düzenleyici Sertifikası (4-6 Mart 2011) İSMEK (İstanbul Büyükşehir Belediyesi Sanat ve Meslek Eğitimi Kursları) Web 92 Tasarımcısı Kurs Bitirme Belgesi (22.11.2010-15.02.2011) Ege Üniversitesi Uluslararası Katılımlı 4.Moleküler Biyoloji ve Genetik Araştırma ile Uygulama Platformu Katılım Belgesi (27-30 Ağustos 2010) İstanbul Üniversitesi Disiplinlerarası Fen Öğrenci Kongresi Teşekkür Belgesi (13-15 Mayıs 2010) Boğaziçi Üniversitesi Moleküler Biyoloji ve Genetik Hafta Sonu 5 Katılım Sertifikası (10-11 Nisan 2010) Marmara Üniversitesi I.Kök Hücre Sempozyumu Katılım Sertifikası (5 Mart 2010) İstanbul Üniversitesi Uluslararası Katılımlı 7.İÜGEN Moleküler Biyoloji ve Genetik Öğrenci Kış Okulu Düzenleyici Sertifikası(19-21 Şubat 2010) İstanbul Üniversitesi Uluslararası Katılımlı 6.İÜGEN Moleküler Biyoloji ve Genetik Öğrenci Kış Okulu Düzenleyici Sertifikası(6-8 Mart 2009) İstanbul Üniversitesi Moleküler Biyoloji ve Genetikte Kariyer 2009 Katılım Sertifikası (12.06.2009) Boğaziçi Üniversitesi Moleküler Biyoloji ve Genetik Hafta Sonu 4 Katılım sertifikası (18-19 Nisan 2009) 1.Ulusal Genetiği Değiştirilmiş Organizmalar Sempozyumu (UGDOS) Katılım Sertifikası (20.12.2008) Bilgisayar Operatörlüğü-İşletmenliği Kursu(Uşak Halk Eğitim Merkezi)(01.07.200813.08.2008) AKTĠVĠTELER İSMEK Bendir Kursu(2014-2015) Ege Üniversitesi Türk Halk Dansları Topluluğu (TÜHAD) (2013 - 2014) İstanbul Üniversitesi Fen Fakültesi İÜGEN Kulübü Yönetim Kurulu Üyesi (2010 - 2012) Genç TEMA üyesi (2009 - 2012) İSMEK Ney Kursu (2009 - 2010) İstanbul Üniversitesi Fen Fakültesi İÜGEN Kulübü Üyesi (2009 - 2012) İstanbul Üniversitesi Fen Fakültesi Çevre Koruma Kulübü Üyesi (2009 - 2012) Uşak Anadolu Öğretmen Lisesi -Voleybol Takımı (2003 - 2007) YABANCI DĠLLER İngilizce: İyi Almanca: Başlangıç KĠġĠSEL BĠLGĠLER Doğum Tarihi Doğum Yeri Sürücü Ehliyeti : 03.10.1989 : Uşak : B (2008) 93
