8. Genetik Transfer

Genetik Transfer
Bakteriyel Hücrelerdeki Genetik
Organizasyon
• Bakteriyel hücrelerde
genetik bilgi
kromozomlarda
şifrelenmiştir.
• Bakteriyel hücreler
hücreden hücreye
aktarılan plazmitleri
taşırlar.
• Plazmidlerin bazı özellikleri:
• Kromozomlardan bağımsız bir
şekilde çoğalabilirler
• Kromozomal DNA ile plazmid
DNA’nın benzer olması zorunlu
değildir
• 2-200 kb büyüklüğündedir
• 20 kb’den büyük plazmidler
kendi transferini sağlayacak
bilgiyi taşırlar.
Genetik Transfer
• Bakteriler arasında genetik materyalin bir vericiden
başka bir alıcıya transferi normal koşullar altında, in vivo
veya in vitro olarak kolayca gerçekleştirilebilmektedir.
• Aktarılan genler, eğer bakteriler birbirlerine genetik
olarak çok yakınsalar veya DNA sekansları arasında
büyük bir homoloji varsa, alıcının kromozomu ile kolayca
birleşebilirler.
• Eğer, homoloji çok azsa veya ayrı cinslere ait türler ise
bu birleşme çok daha az oranda olabilmektedir.
• Yabancı DNA’nın vericiden alıcıya transfer mekanizması
ile bu segmetlerin alıcı DNA’sı ile birleşmesi ayrı
olgulardır.
Genetik Transfer
• Vericinin DNA’sının alıcıya aktarılması doğal olarak veya
suni olarak meydana gelebilir.
• Elektroporasyon
• CaPO4 presipitasyonu
• Mikroenjeksiyon
• Vektörler vb…
• Genetik materyal sadece bakterilere ve ökaryotiklere ait
değildir. Plasmid, faj ve virüslere ait sekansların aktarımı
da gerçekleştirilebilmektedir.
• Rekombinant DNA teknolojisinde gen aktarımları başarı
ile yapılmaktadır.
Genetik transferin başarısı için gerekli olan
faktörler
• DNA istenilen konukçuya dahil
olmalıdır,
• DNA kısıtlayıcı enzimlerle
azaltılmamalıdır,
• DNA’ nın devamlılığını
sürdürmesi gerekir,
• DNA tarafından şifrelenmiş
enzimlerin üretilebilmesi
gerekir,
• İstenilen DNA’nın transferinin
seçilebilir olması gerekir.
Genetik transfer teknikleri
•
•
•
•
•
Konjugasyon
Transdüksiyon
Transformasyon
Hücre füzyonu
Rekombine DNA teknikleri
Transformasyon
• İkinci bir canlı hücre yada
bakteriyofaj bulunmaksızın
verici hücre tarafından
ortama bırakılmış,erimiş
DNA’nın alıcı hücre
tarafından alıkonularak
rekombine hücreler
oluşmasına denir.
• DNA, hücrenin
parçalanması yada
kimyasal maddelerle
ekstrakte olur.
Transformasyon
• DNA’nın parçalanması veya kimyasal maddelerle
muamelesi
• DNAaz enzimi etkisinden korunması
• Alıcının alabilecek yetenekte olması
• Haemophilus, Bacillus, Streptococcus sanguis,E. coli
• Alıcı hücrenin yüzeyinde DNA tanıma bölgeleri bulunması
gerekir
• 4x105’ten küçük olmamalı
• Çift sıralı DNA, tek sıralı DNA’ya göre daha çok tercih
edilir. Hücre tarafından salınan bir ekzonükleaz ile
DNA’nın bir sırası eritilir ve içeriye tek sıralı DNA girer.
• Haemophilus influenzae çift iplikcik
Transformasyon
• DNA parçasının bakteri DNA’sı ile birleşebilmesi için
homologluğun yüksek olması gerekir. Böyle
durumlarda bakteri DNA’sının özel bölgeleri ile ilişki
kurar ve birleşir.
• Yapılan çalışmalarda, bazı bakterilerde 75 kadar
böyle özel alıcı bölgenin bulunduğu ortaya
konmuştur.
• Transformasyonla bakterilere özel karakterler
aktarılabilir.
• Bunlar arasında laktoz ve galaktoz pozitif genler,
antibakteriyel maddelere karşı dirençlilik vb.
sayılabilir.
Transdüksiyon
• Bir bakteriyofaj aracılığı ile genetik materyalin bir bakteriden diğerine
aktarılmasıdır
Transdüksiyon
• Bakteriyofajlar, bakterileri parçalayan ve lize eden
virüslerdir.
• Bakteriyofajlar kuyrukları veya kapsitleri ile bakteriye
yapışır.
• Protein kılıf hücre dışında kalır.
• Bakteri faj yararına çalışmaya başlar. Faj DNA’sı ve faj
kapsitleri için gerekli prorteinler üretilmeye başlar.
• Bakteri hücresi faj ile dolar ve hücre yırtılır. Çıkan fajlar
yeni bakterilere girerler.
• Besiyeri bulanıklılığının geçmesi, katı ortamda kültür
yüzeyinde saydam alanların oluşması.
Transdüksiyon
• Bazı bakteriler bakteriyofajlara karşı direnç gösterirler ve
erimezler. İçlerinde bu fajlarla birlikte çoğalırlar.
• İçlerinde bulunan fajla denge sağlamış ve her zaman onu
ortama salabilecek yetenekteki bakterilere Lizojen (eritici)
bakteriler denir.
• Bu bakterilere giren faj DNA’sı çember halini alır ve sonra
bakteri DNA’sı ile birleşir.
• Bakteri faj DNA’sı ile replikasyona uğrar yavru bakterilerde
lizojen olurlar.
• Profaj:Bakteri DNA’sına entegre olmuş faj
• Profaj bazen bakteri hücresini eritebilir veya kaybolabilir
• Ayrılma sırasında bakteri DNA’sı fajla beraber kopabilir
• Transdüksiyonlu fajda bir protein kapsit içinde kalır. Bu
karma bakteri-faj DNA’sı yeni bir bakteriye girdiği zaman
önceki bakteriye ait özellikleri taşınış olur.
•
•
•
•
•
•
•
Gram negatif
Salmonella
Shigella
Escherichia
Pseudomonas
Vibrio
Proteus
• Gram pozitif
• Staphylococcus
• Bacillus
Transdüksiyon iki şekilde olabilir:
• Lokalize (kısıtlı) transdüksiyon
• Generalize (kısıtlanmamış) transdüksiyon
Lokalize (kısıtlı) transdüksiyon
α Faj tipi tansdüksiyon da denir.
Bakteriyofaj, girdiği bakteri
kromozomunun hep aynı
noktasına entegre olduğu için
ayrılırkende “Gal bölgesi”
denilen ve
galaktaz enzimi geninin
bulunduğu bölgeyi alıp yeni
girdiği bakteriye aynı DNA
parçacığını aktardığından o
bakteriyi galaktoz negatif
halden galaktoz pozitif hale
geçirerek galaktozu
parçalayabilme karakteri
kazandırır.
Generalize (kısıtlanmamış) transdüksiyon
• Faj aracılığıyla aktarılan genler belirli olmayıp bütün
genler aynı şansa sahiptir.
• Fajlar bakteri kromozomu ile bütünleşmezler yani
entegre olmazlar. Çoğalma sırasında faj DNA’sı ayrıca
eşleştirilerek çoğalır. Kapsitde ayrıca oluşur.
• Bu sırada raslantı sonucu bakteri kromozomununu bir
parçası kopup boş bir kapsite girebilir. Böylece yanlış faj
oluşur.
• Fajlarda yapışma ve DNA’ aktarma yeteneği kapsittedir
• Böylece alıcı bakteri verici bakterinin bazı özelliklerini
kazanır.
Generalize (kısıtlanmamış) transdüksiyon
Konjugasyon
• Genetik bakımdan cinsel ayrım gösteren iki bakteri
hücresinin yan yana gelip aralarında oluşacak geçici bir
hücre birleşmesiyle bakteriden bakteriye genetik materyal
aktarılmasıdır.
• İlk olarak E.coli K12’de saptanmış.
• Bu bakterilerde ekstra kromozomal olarak fertilite faktörü
belirlenmiştir.
• F(+) erkek hücre F(-) dişi hücre
• F faktörünün bakteriden bakteriye aktarıldığı gözlenmiştir.
F faktörü
• Tra olarak adlandırılan 12 dolayında gen taşır
• Bakteriden bakteriye genetik materyalin
aktarılmasını bu genler yönetir.
• Konjugasyon başlangıcında bu genler
vasıtasıyla bakteride içi boş boru gibi pilus
oluşur.
• Bu seks pilusu F(+) bakterilerde bulunur
• Hücreden hücreye genetik materyalin
aktarılmasında rol oynar.
• Antijen yapısındadır, F antijeni
• F faktörünün F(+) hücrelerden F(-) hücrelere
geçişi şöyle olur:
• İki hücre birleştiğinde sitoplazmik zara tutunmuş
F faktörü replikasyona uğrar.
• Çift iplikçikten bir tanesi F(-) hücre geçer.Bakteri
F(+) karakter kazanır.
Konjugasyon
• Tek katlı F faktörü ve DNA eşleştirilir.
• F(-) hücrelerin %100’ F(+) olabilir.
• F(+) bakterilerin akridin orange ile
muamelesi F faktörünün replikasyonunu
önler ve bol sayıda F(-) hücrelerin
oluşmasına neden olur.
• F faktörü ekstrakromozomaldir yani bir
plazmiddir.
• F faktörü bakteri kromozomuna yapışıp DNA ile
bütünleşebilir bunlara Hfr hücreleri denir
• Özellikleri:
• Bu hücrelerde seks pilusu bulunur ve erkek bakterilere
özgü fajlarla enfekte olma özelliği gösterir.
• F(-) hücrelerle birleşme yeteneği F(+)’lara göre 100 kat
fazladır.
• F(+)’lara oranla dişi hücrelere daha az F(+) faktörü
aktarılır.
• Daha fazla bakteri kromozonu aktarıp rekombinant
olabilmektedir.
• Alıcı bakteri yeni özellikler kazanır.
• F(+) faktörü alıcıda görünmez ( ori den başlayan kısım)
tamamı aktarılabilirse görülür.
• Alıcı bakteriye verilen kromozom parçaları her olgu için
ayrı nitelikte farklı olabilir.
• Hfr hücreleri alıcı olmazlar. F (+) ve F(-) hücrelere bakteri
kromozomu aktarırlar
• F faktörü entegre olduğu bakteri kromozomundan ayrılıp
çembersel şeklini alabilir.
• Böylece Hfr hücreler, F(+) olur.
• F prime: bu plazmid hem F faktörü hem de bakteri
kromozomuna ait bilgileri taşır
• E. coli ,Salmonella, Shigella, Pseudomonas, Serratia,
Vibrio, Streptomyces
Hücre füzyon tekniği
• İki hücrenin peptidoglikan tabakasının hidrolize edilerek
protoplastların birleşmesi esasıda dayanır.
• Sakkarozun varlığında hipertonik koruyucu ortamda
gerçekleştirilir.
• Lizozim, mutanolisin, polietilen glikol
• Koruyucu ortamda Protoplast rejenerasyonu sağlanır.
• Leu. mesenteroides, Lb. reuteri, Lb. casei, Str.
thermophilus, Lc. lactis