Slayt 1

İşlevsel Genomik Nedir?
• İşlevsel Genomik, yapısal genomik tarafından sağlanan bileşenlerin
ve bilginin kullanımı ile gen işlevinin değerlendirilmesinde, deneysel
yaklaşımların (genom veya sistem boyunca) geliştirilmesini ve
uygulanmasını içermektedir.
• Geniş ölçekte uygulanan deneysel teknolojilerin, elde edilen
sonuçlarla istatistiksel veya bilgisayar analizleriyle birleştirilmesiyle
tanımlanabilir.
• Klasik bir gen anlatımı araştırmasında, in vivo’da bir organizmanın
gelişimiyle birlikte bir genin anlatımının nasıl değişeceği
araştırılırken, modern işlevsel genomik yaklaşımı, organizmanın
gelişimiyle birlikte sayıca 1,000’den 10,000’e kadar değişen genin
anlatımının nasıl değiştiğini incelemektedir.
İşlevsel Genomik
• Amaç: Genomik bilgiye biyolojik bir anlam
kazandırma
• Çeşitli sistematik yaklaşımlar, bir genomdaki genlerin
bir çoğu için sorulan basit sorulara cevaplar
oluşturabilirler
– Gen anlatımı ne zaman gerçekleştirilir?
– Gen ürününün yerleşimi nerede olur?
– Bir gen hangi genlerle etkileşime girer?
– Bir gende mutasyon yapılırsa hangi fenotip ile
sonuçlanır?
Klasik dizi analizi
İşlevsel Genomik’in Üç Merkezi
Uygulaması:
- Genome-wide knock-out
- Gen Anlatımı
- Genetik Haritalama Çalışmaları
Dizileme İçin Gerekli Olan
Teknikler
• Restriksiyon Enzimleri – DNA’yı parçalara
ayırmada
• Klonlama – DNA’yı 2-200kb’lık bazlık diziler
halinde çoğaltma
• Dizileme – Kısa DNA dizisinin okunması.
– fluoresan maddeler ve jel-elektroforezi
kullanılarak.
• Dizilerin Birleştirilmesi – parçaların bir araya
getirilmesinde kullanılan bilgisayarlı aşama.
Genom Dizilemesi
- Büyük genomlar robotik ve otomasyon
gerektirir.
• Ortak dizilerin birleştirilmesi
- ideal olan, kromozom başına bir ortak dizi
- standart, her bir nükleotidin 10 kez
okunması
- bilgisayar kullanımı ile birleştirme
• İki temel dizileme stratejisi
- Düzenli klon dizilemesi
* fiziksel bir haritayı oluşturan klonlardan
yapılan birleştirme
* pozisyonların bilinmesinden dolayı
tekrarlı diziler için uygun yerleştirilme
• Tüm genom shot-gun dizilemesi
- rastgele dizilenen klonların birleştirilmesi
- küçük (ör:bakteri) genomlar için uygun
- boşluklar primer yürüme ile doldurulur
•
•
•
•
•
•
•
WGS: Whole Genome Shotgun sequencing
1. Klon Kitaplığının Oluşturulması
2. Her bir Klonun iki ucunun dizilenmesi
3. Çakışan okumaların kontigler içine birleştirilmesi
4. Kontiglerin super-kontigler içine birleştirilmesi
5. Super kontiglerin genom içine dahil edilmesi
6. Genomun Tamamlanması
DNA Dizilenmesinde Otomasyon
Dzi analiz cihazı:
MegaBACE
Dizi analiz cihazı:
ABI 3700
Otomatik jel
okuyucu
Kapiler elektroforez cihazı
Klon Temelli Fiziksel Haritalama
DNA Dizilemesi
• Çoğunlukla dideoksi metodu (zincir
sonlandırma metodu) ile yapılır.
• Dizilemesi yapılacak olan DNA dizilerinin
birçok kopyası aşağıdaki bileşikler ile
karıştırılır.
– Primer
• DNA tek zincirine bağlanan kısa dizi (~20bp)
– Normal (deoksi) nükleotidler
• dNTP – dATP, dGTP, dCTP, dGTP
– dideoksi nükleotidler
• ddNTP – ddATP, ddGTP, ddCTP, ddGTP
– DNA polimeraz I
• Enzim
DNA
Dizilemesinde
Zincir
Sonlandırma
Metodu
Voet Fig. 3-23
Sequencing 2
Sequencing 3
Bir Klonun Okunması
• 2,4,6,10, 12 ve 40 kb’lik
büyüklüklerdeki
parçalardan oluşan
kitaplıkların elde edilmesi
• Her bir ayrı klon, her bir
kitaplıktan seçilir.
Bir Klonun Okunması
>clone47_f
AAGCAATTTCATAAGAATAACTTTGAGCACAAGCCCGTAAACCACCAATAAAAGAATACT
TACCACCACTAAAAATTCCAGATAGCATAATAAAATACGCAGAAACCCCCATTAAGCAAA
ATAAAAAAACACCAGAATAATCAAAAGACATAAAAACAAAAAAATAAGGCAAAGTAAACC
AAAAAAAAATCATCAAAATAAAACTACAAACAGGCATCAATAAAAAAGATAGTCATGAAGA
AAAATAAAAAAAAAGCTGTTCTTTCTTTAATAATTTAAGACCATCAAACAACGCCTGAAAA
ATACCAGAGTAACCAACTTTATTGGGACCAATACGACACTGAGTGCCACCCAAAAAATGA
CGTTCTATTAAAGTTAAAAAAGCAATGGCTTGTAAAATAAAAATAATTATAAGAAAAATAC
CAATATAATAAAAAATAAACAAAGTAAAATCCAAAGAATTTACnnTTCTTTATTCTAATATAA
ACTAATACTTTAAAAAATAGAGACAAGTTTCCTTACCTCTACCATACTACAACTTACGCCC
CTATAGGCCATTGACGGATGGTTTGTACCACTTTGTTTATTAAATTCATTAATATATAAAAA
AAAAATTACTTTCTTTTCCAATTTCAAAAAAAAATAAAAAAATA
>clone47_r
TGATTGGTGTTTGTTTTCTTATTGTTAATTTTTTTCGTGCTAAATTACATAATTTTAATTGGT
ATCATACTCAAGCTTATGATATGTCTATTGACTATTGACGGTTCTTAGAATGAATGTGAGG
TATTATATTTTGTTTATTATATGTTTGAGGTTCTTAATTTTTAATTGTAAGATATCTGTTTTA
CTTCATTATTTTTTATAGCTTATTTTTAATGATGATTTTTTTAATTATTTCTTCTTTTTTTTTTT
TGGTTTTTTTATTTTTTGTACGTTCAATATAATTATGAATAATTATTAGTAATTATTTAAAAA
TAATTACTAAATTAAATACAATTCTCAGAGTATTATAACATTAAAGTTATAATACTCTGTTA
GAATTGTATTTATTTAATAGACCAACTACTTAAATTACTAACTAAAGATTATTTTTTTACTAT
AGTGTATATATTATAnAGTTATTATATTTGATTTGCAATCTTAAGATTTTTATACACTATGGC
TTTTTAGTATAATAAGTATATTCGTTTTAAGCGCGGCTGGTTTTAAGCTATTAGAATTTTA
Dizilerin Birleştirilmesi
• Direkt dizi okuma tekniği, 10kb.’a kadar
olan bir diziyi okuyabilir.
• Uzun dizi bilgisi elde edebilmek için, kısa
okumaların birbirleriyle birleştirilmelerinde
bilgisayara gereksinim duyulur.
Kontiklerin Birleştirilmesi
• Okumaların ucunda
dizilerin üst üste
çakışması
belirlendiğinde, iki
okuma tek bir dizi
şeklinde birleştirilebilir
Superkontiklerin Oluşturulması
“ scaffolds” olarak da tanımlanmaktadır.
BCMHGSC
Büyük Genomlar
• İnsan Genomu, daha büyüktür ve
süperkontiklerin bir şekilde birleştirilmesi
gerekir.
• Bu da genetik haritalama ile yapılmaktadır.
Birleştirmeler Sonucunda
Genom Üzerinde Yerleştirme
• Bir dizi etiketi tüm genom
boyunca tek olan kısa bir
dizidir .
• Genetik Harita,bir çok dizi
etiketini ve onların
yerleşimini içermektedir.
• Böylelikle, etiketlere göre
süper kontiklerin genom
içinde sıraya dizilmeleri
sağlanır.
Primer Yürüme: Genom
Dizilemesinin
Sonlandırılmasında Bir Yol
• Eğer bir baz üç okuma ile belirlendiyse
kesin olarak tanımlanabilmektedir. Kesin
olmayan pozisyonlar da mevcuttur.
• There are gaps in the Süperkontiklerde ve
süperkontikler arasında boşluklar vardır.
• Primer Yürüme bu bölgelerin daha ileri
dizilemesinin yapılmasında kullanılabilir.
Primer Walking
Seq 1
primer1
Seq 2
primer2
Time consuming
…………
Yeni Dizileme Metotları
1. MALDI-TOF Mass Spektrometri ile Dizileme
2. Hibridizasyon ile Dizileme
3. Pirodizileme
4. Atomic-Force Mikroskopisi
5. Tek Molekül Fluoresans Mikroskopisi
6. Nanopor Dizileme
MALDI-TOF Mass Spektrometrisi Kullanılarak Dizileme
MW spectrum of 33-mer 5’-ACT AAT GGC AGT TCA
TTG CAT GAA TTT TAA AAG-3’
Hibridizasyon ile DNA Dizilemesi
Bu strateji, bilinmeyen etiketli DNA parçasının tüm kısa oligonükleotidlere bağlanmasını
(ör: 8-merlik 65,336 kombinasyon ) ve bilinmeyen dizinin bağlanma kalıbından görüntülenmesini
İçerir.
Pirodizilemenin Temeli
Basamak 1
Bir dizileme primeri tek zincirli, PCR ile çoğaltılmış, DNA kalıbına, hibridize edilir
ve DNA polimeraz, ATP sulfurilaz, lusiferaz ve apiraz, enzimleri, adenozin 5´
fosfosülfat (APS) ve lusiferin substratları ile inkübasyona bırakılır.
Basamak 2
İlk önce dört adet deoksinükleotidtrifosfat (dNTP) reaksiyona ilave edilir. DNA
polimeraz deoksinükleotid trifosfatların, DNA zincire katılmalarını kataliz eder.
Yapıya katılan dNTP ile orantılı olarak PPi (pirofosfat) açığa çıkmaktadır.
Basamak 3
ATP sülfürilaz, adenozin 5´ fosfosülfat varlığında kantitatif olarak PPi’yi ATP’ye
dönüştürür. Bu ATP molekülü, lusiferaz temelli reaksiyon lusiferinin oksilusiferine
dönüşümünü sağlarken, ATP miktarı ile orantılı olarak görünür ışık oluşumu
gerçekleşir. Lusiferaz katalizli reaksiyon sonucunda üretilen ışık CCD kamera
(charge coupled device) ile belirlenir bir pirogramda pikler halinde görüntülenebilir.
Her bir ışık sinyali yapıya katılan nükleotid sayısı ile orantılıdır.
Basamak 4
Bir nükleotid parçalayıcı enzim apiraz, sürekli olarak; yapıya girmeyen dNTPleri ve
fazla ATP’yi parçalar. Parçalama bittiğinde, diğer dNTP eklenir.
Basamak 5
Her bir işlem için dNTPlerin eklenmesi bir kez gerçekleştirilir. Doğal deoksiadenozin
trifosfat (dATP) DNA polimeraz tarafından etkin bir şekilde kullanılmasına rağmen,
lusiferaz tarafından tanınmadığından deoksiadenozin alfa-tiyo trifosfat (dATPaS)
kullanılmaktadır. Süreç devam ederken, kalıp DNA zinciri yapılır ve nükleotid dizisi
pirogramdaki piklerin oluşturduğu sinyaller ile belirlenir.
Pirodizilemenin Özeti
Pirodizileme, DNA’nın enzimatik DNA sentezi ile dizilenmesidir, DNA dizisi sentezi sırasında
açığa çıkan fotonların oluşturduğu sinyallerin şiddetine göre belirlenir .
Zipper-sequencing of DNA
Polinükleotidlerin Nanopor Dizilemesi
Bu yöntemde, tek zincirli polinükleotidlerin ince bir filmdeki nanopor
boyunca ilerlemelerini sağlayan elektrik alan sonucu oluşan iyonik
akım değişimi görüntülenmektedir.
DNA’nın bir yön değiştiren alanda dizilemesi
DNA

E
2nm

E  E cos( wt )iˆ  E sin( wt ) ˆ
j
DNA’nın Zaman ile Translokasyonu
Bir Dizileme Düzeneği
Sonuçlar
- Geleneksel Sanger metodu yavaş, pahalı, ve kesin değildir. İnsan
Genom Projesindeki dizileme 15 yıl almış ve 3 trilyon US dolarına
mal olmuştur.
- Nanopor dizileme daha hızlı, pahalı olmayan, kesin bir yöntemdir.
100 milyon bazın dizilemesi yaklaşık bir gün almaktadır, yüksek
oranda kesinlik, örnek serilerinin çok zamanlı incelenmeleri sonucunda
sağlanmaktadır.