DNA Dizi analizi

DNA dizi analzi
Giriş.
DNA sekanslama veya dizi analizi biyokimya laboratuvarlılarında bir canlının yaşam
planının veya genetik kodunu belirlemek için kullanılır.
Biyolojik makromoleküllerin dizisinin belirlenmesinde nükleik asit sekansını belirleme
işlemi nispeten daha geç gerçekleşmiştir. 1980'lerin sonuna kadar protein dizilemesi
hayat moleküllerinde bulunan kodları belirlemek
için birincil araçtı. Protein dizilemesi
yavaş ve pahalı bir girişimdir ve 500 amino asitlik bir proteini dizilemek bir yıldan daha
fazla zaman almaktaydı. Günümüzde DNA analizlerinden yararlanarak bir proteinin
dizilimi yalnızca birkaç gün içinde tespit edilebilir. DNA dizi analizi otomatik olarak
otomatik makinelerin reaksiyonları ve veri analiz merk3ezlerinde yapılmaktadır.
Otomatik sekans Analizi

Özet: Nükleik asit dizileme işlemi nispeten yeni bir işlemdir

Protein dizileme ise yavaş ve zor bir uğraştır.

Protein dizileme işlemi nükleik asit dizileme işlemine dayalı olarak elde edilebilir.

Otomatik DNA dizileme işlemi hızlı ve etkili bir yöntemdir.
GENOMİK DNA
DNA'nın hücredeki genetik bilgimizi taşıyan materyal olduğu keşfedildiğinden, DNA'yı
anlamak, genetik araştırmanın ana odak noktası haline gelmiştir. Kromozomlarımız
veya genomumuz, düzgünce sarılmış DNA ipliklerinden oluşur. Bakterilerden insanlara
kadar tüm canlı organizmalar, hücrelerinin her birinde DNA içerirler. Her hücre, o
organizma için tüm genetik kodu içerir.
DNA hücrenin çekirdeğinde yer alır.
 DNA genetik bilgiyi depolar
 DNA Kromozomlarımızda yer alır.
 Organizmanın her hücresi genomik DNA içerir.
 DNA 4
nükleotidden oluşur.

DNA sadece dört yapı taşından veya nükleotidden oluşur. Kısaltmaları A, T, G ve C
olarak bilinen bu dört yapı taşı, genetik kodumuzu yazmak için "alfabe" olarak kullanılır.
Bedenlerimizi inşa etmek için gereken tüm talimatlar sadece bu dört harfi kullanarak
kodlanır.
Tablo: Bazı organizmaların genom
büyüklükleri
Ökaryot genomlarında ekzon ve intronlar birlikte bulunur. Prokaryot genomlarında ise inrton
yer almaz bu yüzden daha kısa bir genoma sahiptirler.
Genomlar çeşitli boyutlarda olurlar. Bir konak hücresi olmadan yaşayamayan virüsler en
küçük genomlara sahipken, bitkiler ve hayvanlar gibi daha üst düzey organizmalar
milyarlarca baz uzunluğunda genomlara sahiptir. Genomlar gibi, bireysel genler de birkaç
yüz bazdan milyonlarca baza kadar büyüklüğe sahip olabilir. Ortalama insan geni
yaklaşık 3.000 baz uzunluğundadır, fakat bu bazların yalnızca yaklaşık 1.000-2.000
bazı bir proteini kodlar. DNA'nın bu protein kodlayan dizilerine ekzon denir. İntronlar,
tam olarak anlaşılamayan DNA dizilerini kesintiye uğratan ve genin kaln kısmını
oluşturan kodlamayan kodlar intron adını alır ve genin kalan kısmını oluştururlar. En
büyük insan geni olan distrofin (kas distrofisinde rol oynayan bir kas proteini) 2.4
milyon baz uzunluğundadır. Genellikle intronlar içermeyen viral ve bakteriyel DNA
dizileri en kısa genlerdir.
Dideoksi DNA dizileme
Bu metot 1977’de Fredrick Sanger
tarafından bulunmuştur.
Metot bu gün de kullanılmaktadır.
Bu yöntemle uzun zincirli DNA’ lar otomotik
olarak sekanslanabilir.
Bu yöntem genom sekanslamak için kullanılır.
Dideoksi DNA sekanslama prosedürü, 1977'de Frederic Sanger ve meslektaşları
tarafından keşfedilmiştir. Biraz daha geliştirilişmiş haliyle bu yöntem bugün hala
kullanılmaktadır. Tamamıyla otomatikleştirilebilen bu yöntem, büyük dizileme
merkezlerinin 1.000 baz DNA dizisinin saniyede okumasını sağlar.
Sekanslama işlemi aşağıdaki şekilde özetlenebilir.
Özet olarak DNA dizi analizi yandaki
şekildeki işlemler uygulanarak yapılır. İlk
olarak, incelenen organizmanın
hücrelerinden DNA izole edilir ve çıkarılır.
Ardından DNA üzerinde dizileme ya da
sekanslama reaksiyonu gerçekleştirilir.
Sonra dizilenmiş DNA iplikçikleri kapiler
elektroforez kullanılarak boyutlarına göre
sıralanır. Son olarak, DNA kodu bir
bilgisayar tarafından okunur, bilim
insanları için kullanılacak veriler
görüntülenir.
1. DNA’nın hazırlanması
DNA dizilemeden önce, DNA'nın hücrelerden saflaştırılıp çıkarılması gerekir. Önce
hücreler ve bunların çekirdeği mekanik veya hücre membranlarını parçalayan kimyasal
yöntemlerle parçalanır. Ortaya çıkan çözeltide hala DNA hala koruyucu proteinlerle
kaplıdır. DNA çöktürülerek seçici olarak bu çözeltiden çıkarılır ve DNA'ya bağlanan
proteinler temizlenir.
Tüm kromozomlar veya genomlar gibi DNA'nın çok büyük parçaları daha küçük
parçalara ayrıldıktan sonra yerleştirildiklerinde çoğaltılabilen DNA parçacıkları olan
vektör (plasmidler) içeren bakteri gibi konakçı hücrelerde saklanır.
Bir vektör içeren bakteri, kültür ortamına yerleştirilir ve milyon kat çoğaltılırlar. Her
bakteri bölünmesinde içindeki DNA vektörü de kopyalanır. Bu şekilde, hedef DNA’nın
çok sayıda kopyası elde edilir. Kopyalanan her DNA parçasına bir klon denir.
DİZİ (sEKANSLAMA) REAKSİYONU
Bu bölümde dört adımdan oluşan Dizileme reaksiyonunu ayrıntılı olarak ele alınacaktır.
İlk önce, çift sarmallı DNA tek sarmallara ayrılır ve primer adı verilen küçük bir
başlangıç DNA parçası, kalıp adı verilen sarmallardan birine bağlanır.
Uzatma aşamasında, kalıp ipliğini tamamlayan yeni bir DNA ipliği yapılır. Primerden
başlayan DNA polimeraz, ikinci DNA iplikçilerinin yeniden oluşturulması için kalıp
iplikçiklerini bir kılavuz olarak kullanır.
Dizileme reaksiyonunun sonlandırma aşaması reaksiyonun anahtarıdır. İplik uzaması
florasan boya ile işaretlenmiş ve dideoksi nükleotit adı verilen nükleotidin bağlanmasıyla
sonlandırılır.
Birçok dizi sonlandırma tepkimeleri birlikte gerçekleştirildiğinde, bir DNA
ipliğindeki her bir bazın tanımlanması mümkün olur.
ÇiFT SARMALIN AYRILMASI
Dizilenemeden önce, çift sarmallı DNA'nın denatüre edilmesi veya tek sarmal haline
getirilmesi gerekir. Bu işlem, DNA'nın iki zincirini bir çift sarmal içinde bir arada tutan
hidrojen bağlarını ve VanDerWaals kuvvetlerini kesintiye uğratan ISI UYGULAMASIYLA
gerçekleştirilir.
1.
Aşma DNA ipliklerinin ayrılması
2.
Aşama Pirimerin kalıp ipliğe tutunması
3.
AŞAMA: Kalıp iplik kullanılarak polimeraz enzimi tarafından sentez yapılması
(Ekstensiyon, zincir uzama aşaması)
4.
AŞAMA: Sonlandırma (terminasyon), (Florasan boya ile işaretlenmiş Dideoksi
nükleotit geldiği zaman sentez sonlanır).
DNA polimeraz çoğu kez normal işaretlenmemiş nükleotitleri eklerken arasıra da
DNA zincirine etiketli bir dideoksinükleotidi dahil eder. Çünkü
Dideoksinükleotidlerin konsantrasyonu, reaksiyon karışımındaki dNTP
konsantrasyonundan çok daha düşüktür. O yüzden DNTP (Deoksi nükleotit tri
fosfat)'lerin ddNTP (dideoksi nükleotit tri fosfat) 'ye oranı, zincir sonlandırma
olaylarının doğru sayısını elde etmek için dikkatlice dengelenir.
Gerçek bir sekanslama reaksiyonu karışımı, aynı anda dizilen binlerce DNA
şablonu iplikçikleri içerir. Primerler kalıp ipliğe tutunduktan sonra bazı zincirler
birkaç nükleotit ekeledikten sonra dideoksi nükleotit gelip bağlanacak bazı
zincirlde ise daha fazla normal nükleotit bağlandıktan sonra dideoksiler
bağlanacaktır. Böylece, reaksiyonda bazı DNA zincirleri farklı uzunlukta olacaktır.
Bazıları çok kısa bazıları çok uzun olmak üzere aralarında her olasılık olacaktır.
Sentezlenmiş iplik sayısını arttırmak için dizeleme reaksiyonu ısıtma ve soğutma
aşamalarını düzinelerce değiştiren bir termal döngüleyici Termocycler) içinde
gerçekleştirilir, böylece bir deneyde birçok kez dizileme reaksiyonu tekrarlanır.
Yeni sentezlenen DNA iplikçiklerinin her biri dört boyadan biri ile etiketlenmiştir. Artık
kılcal (Kapiller) elektroforez kullanılarak iplikler uzunluklarına göre sıralanabilirler. İlk
olarak reaksiyon karışımındaki
yeni sentezlenmiş tekli ipliklerin DNA kalıp ipliği ile
birleşmesini önlemek için reaksiyon karışımı ısıtılır. Boya ile etiketlenmiş tek zincirli
iplikler, viskoz jel benzeri bir malzeme içeren küçük bir kılcal tüpe yüklenir.
Elektrik akımı verildiği zaman
negatif yüklü DNA iplikleri kılcallar yoluyla ilerler. Bu
kılcallar bir insan saçığından daha kalın değildir. Küçük boyutlar nedeniyle, kılcal
haznenin hazırlanması ve numunenin yüklenmesi bilgisayarla kontrol edilir.
Daha kısa DNA iplikçikleri, jel boyunca daha hızlı hareket ederler ve daha uzun ipliklere
göre jel materyalinde önde giderler ve en kısa zincir ilk önce jelin alt kısmına uşlaşır.
Uçlarında florasan boya ile boyanmış nükleotitler olduğu için florasana duyarlı bir lazer
ışını verildiğinde her bir boyanın dalga boyu ve rengine göre ışıma ve yansıma ortaya
çıkar. Şeritler kılcalın alt kısmına ulaştığında her bir ipliğin ucundaki dideoksinükleotide
bağlı flüoresan boyayı uyaran bir lazer ışını geçirilir. Bu durum, boyanın belirli bir dalga
boyunda veya renginde floresanlaşmasına veya ışıma yapmasına neden olur. Bu renk
daha sonra bilgisayara bilgi besleyen bir fotosel tarafından algılanır.
Birçok klondan gelen ve üst üste binen (overlap) dizi verisi, güçlü bilgisayarlar yardımıyla
kısa diziler bir bulmaca gibi bir araya getirilir ve tam uzunlukta dizi elde edilir.