09.11.2007 GENETĐK 111-503 GENOM PROJELERĐ Doç. Dr. Hilâl Özdağ Genom Projeleri • Dizileme • Klon kütüphaneleri • Stratejiler – Genom Dizilemesi • Tekrar eden DNA dizileri • Biraraya getirme (Assembly) – PHRAP, PHRED,CONSED • Bitiş • Boşlukların kapatılması 1 09.11.2007 Genetik harita Genetik haritaların bazı eksiklikleri vardır. Bunlardan en önemlisi çözünülürlük veya ayrıntıdır. Đnsan genomu 3.2 milyar baz çifti içermektedir, yaklaşık 4000 cM uzunluğundadır, yani 850000bç/cM. Herbir sentimorganda bir belirteç bulunsa dahi (hayal bile olamaz) fiziksel haritaya göre çözünülürlüğü çok düşüktür. Fiziksel harita 2 09.11.2007 Genetik / Fiziksel Fiziksel Harita 3 09.11.2007 (Ureta-Vidal et al., Nature Review Genetics 2003) DĐZĐLEME • Đlgilenilen DNA’nın altklonlanması – Değişik “insert” boyutları • Herbir klon – Büyür, DNAsaflaştırılır – Dizileme reaksiyonu yapılır – Dizileme fragmentleri kapiller elektroforezle ayrıştırılıp lazer eksitasyonu ile tanımlanır. – Reaksiyon başına 500-1000 bç okuma yapılabilir (bugünkü teknoloji ile) 4 09.11.2007 DNA Dizi Analizi 5 09.11.2007 6 09.11.2007 Vektörler • • • • Plazmid (2kb) Kozmid (40kb) BAC (>= 100kb) YAC (1Mb) Vektörler insert Çoklu klonlama bölgesi 7 09.11.2007 Kavramlar • Fiziksel harita – Örtüşmeyen klonlar ((non)-overlapping clones) • Genetik harita – Moleküler belirteçler (marker) Shotgun yaklaşımı • Sanger et al., 1977 • bacteriophage λ genomuna uygulandı (1980) • 1980’lerde:- plazmid, kloroplast, virusler, kozmidler • 1990’larda:- mitokondri/BAC/bakteri • Küçük prokaryotik genomlarda başarılı 8 09.11.2007 Shotgun yaklaşımı • Rasgele fragmentlerin dizilenmelerinin ardından yap boz misali biraraya getirilmeleri • Bir genomdan örtüşen/kesişen fragmentler toplamak gerekir. birçok • Bir genom 10x kez 500 bç’lik parçalar halinde okunduğunda 106 bç’de 1 boşluk olur. Shotgun yaklaşımı • L boyundaki bir DNA fragmenti: Bu fragmentin bir diğer kopyasını daha bulabilmemiz için genomun 4L bç olması gerekir. • Rasgele diziler – Đki okumanın 30 bç kesişmesi – Beklenen 430 >>>> 1.2X1018 bç. – 3 milyarlık bir genomda bu kesişmeyi bulmak pek de kolay değil. 9 09.11.2007 Shotgun yaklaşımı • DNA tekrar yapıları içerir • • LINE segmental duplikasyon (Samonte and Eichler 2002) 10 09.11.2007 Hiyerarşik Yaklaşım Klon-Klon • Genom 1.5Mb fragment’lere ayrılır • Fragmentler BAC ve YAC’lara klonlanır • Insertler > 100kb ve tekrar bölgelerinden daha büyüktür. • Bu şekilde klonlar örtüşen/kesişen fragmentlerin tanımlanması ile bir kontig haline getirilip dizilenir. Hiyerarşik Yaklaşım Klon-Klon • Klon kontiglerin biraraya getirilmesi – Klon parmakizi yaklaşımı • Klonlanmış DNA fragmentinin yapısına dair bilgi. • Parmakizindeki örtüşmeler tanımlanabilir. • Restriksiyon paternleri; Tekrar eden DNA parmakizleri; Tekrar eden DNA PCR; STS haritalama 11 09.11.2007 12 09.11.2007 Restriksiyon Haritası Flow sorting: özgül kromozomlar 13 09.11.2007 Klon-Klon Harita Temelli Yaklaşım 14 09.11.2007 15 09.11.2007 Watson ve Crick, May Mayıs ıs 1953 16 09.11.2007 • http://www.dnai.org/text/mediashowcase/i ndex2.html?id=562 17