KULLANICI KILAVUZU Genequality THROMBO STRIP Kod 09-10A Kod 09-10R Faktör II, faktör V ve MTHFR kodlayan genlerdeki mutasyonların eş zamanlı belirlemesi ve tanısı için reverse hibridizasyon testi (RHA) 09-10A-20_8033622781288_TR.doc 1 ÜRÜN BİLGİSİ 3 2 KİT İÇERİĞİ 4 3 REAKTİFLERİ SAKLAMA KOŞULLARI 7 4 KULLANIM İÇİN ÖNLEMLER 8 5 GÜVENLİK KURALLARI 8 5.1 Genel güvenlik kuralları 9 5.2 Kit hakkında güvenlik kuralları 10 6 KİT İÇERİĞİNDE BULUNMAYAN GEREKLİ MATERYALLER 11 6.1 Reaktifler 11 6.2 Cihazlar 11 6.3 Materyaller 11 7 ÖN MUAMELE VE REAKTİF HAZIRLAMA PROSEDÜRÜ 12 7.1 Faktör II, faktör V ve MTHR kodlayan genlerin uygun kısımlarının amplifikasyonu 12 7.2 Reverse hibridizasyon için reaktifler 12 8 GİRİŞ 14 9 TEST PRENSİBİ 16 10 ÜRÜN TANIMI 17 11 ÖRNEK TOPLAMA,MANİPULASYON VE ÖN-MUAMELESİ 18 12 PROTOKOL 18 12.1 DNA ekstraksiyonu 18 12.2 Trombosis ile ilişkili genlerin uygun kısımlarının amplifikasyonu 18 12.3 Reverse hibridizasyon 20 12.3.1 İnkubasyon için talimatlar 20 Page 1 09-10A-20_8033622781288_TR.doc 12.3.2 Oluklardaki sıvı değişimi için talimatlar 20 12.3.3 Beyanat ve önlemler 21 12.3.4 Denaturasyon ve hibridizasyon prosedürü 21 12.3.5 Sıkı yıkama prosedürü 23 12.3.6 Boyama prosedürü 23 13 SONUÇLARIN YORUMLANMASI 24 13.1 Kalite Kontrol 24 13.2 Yorumlama 24 14 SORUN GİDERME 25 15 TEST LİMİTLERİ 28 16 TEST PERFORMANSI 28 16.1 Özgünlük 28 17 REFERANSLAR 29 18 İLGİLİ ÜRÜNLER 30 Page 2 09-10A-20_8033622781288_TR.doc 1 ÜRÜN BİLGİSİ Bu kullanıcı kılavuzu aşağıdaki ürünleri içerir: THROMBO STRIP (Kod 09-10A) Faktör II, faktör V ve methylentetrahydrofolate reductase (MHTFR) kodlayan genlerdeki mutasyonların eş zamanlı belirlenmesi ve tanımlanması için kit. Tanımlanan mutasyonlar: Faktör V Leiden, G1691A (Arg505Gln), Faktör V Cambridge, G1091C (Arg306Thr), Faktör II, G20210A, MTHFR C677T. Kit, striplerde reverse hibridizasyon (RHA) ile DNA amplifikasyonu ve belirlemesi için reaktifler içerir. Kod 09-10A-20 Ürün THROMBO STRIP Pkg 20 test THROMBO STRIP (Kod 09-10R) Faktör II, faktör V ve methylentetrahydrofolate reductase (MHTFR) kodlayan genlerdeki mutasyonların eş zamanlı belirlenmesi ve tanımlanması için kit. Tanımlanan mutasyonlar: Faktör V Leiden, G1691A (Arg505Gln), Faktör V Cambridge, G1091C (Arg306Thr), Faktör II, G20210A, MTHFR C677T. Kit, striplerde reverse hibridizasyon (RHA) ile DNA amplifikasyonu için primerler ve belirleme için reaktifler içerir. Kod 09-10R-20 Ürün THROMBO STRIP Pkg 20 test Page 3 09-10A-20_8033622781288_TR.doc 2 KİT İÇERİĞİ NOT: Kit içeriğinde farklı kodlarda (A ve R) farklı komponentler bulunur. (kısaltma: X= kit içeriğinde bulunan komponent; 0= kit içeriğinde bulunmayan komponent) KUTU R kod 09-10A kod 09-10R +2 / +8 DE SAKLANIR AÇIKLAMA ETİKET TÜP (T) YA DA KAPAK RENGİ 20 test Mavi 1 X 300 μL X X Primer Miks PRIMER MIKS (PM) X X Spesifik problar bağlı Nitroselülöz strip Thrombo Strip X X EDTA (Ethylene-diamine-tetraacetic acid) alkaline solution) 20 Denatürasyon Solusyonu 1 X 1 mL R 36/38 S 23-24-26 X X Sodium dodecyl sulfate (SDS) solusyonu Hibridizasyon solusyonu 1 X 80 mL X X Sodium dodecyl sulfate (SDS) solusyonu Sıkı Yıkama Solusyonu 2 X 80 mL X Protein stabilizörleri ve koruyucu olarak Micro-O-Protect 0.4% içeren Tris-bufferda alkaline phosphatase ile streptavidin işaretli 100X konsantre solusyon KONJUGAT 100X 1 X 800 μL X 87.5% dimethylsulphidede 100X konsantre Nitro blue tetrazolium chloride ve Bromo-chloro-indolylphosphate solusyonu X X NBT/BCIP Tahriş edici 1 X 800 μL toksik R 36/37/38 S 36/37 X X NaCl, Triton®, protein stabilizör ve koruyucu olarak 0.05% ProClin 300® içeren Phosphate buffer. X X X X Koniugat diluent 1 X 80 mL NaCl, MgCl2 ve koruyucu olarak 0.05% ProClin 300® içeren Trisbuffer. Substrat Buffer 2 X 60 mL X NaCl, Triton ve koruyucu olarak 0.05% ProClin 300® içeren Trisbuffer. Yıkama Solusyonu 1 X 80 mL X Her birinde 8 oluk içeren İnkübasyon tray 3 Page 4 09-10A-20_8033622781288_TR.doc Triton® and ProClin® are registered trademark of Röhm e Haas Co Page 5 09-10A-20_8033622781288_TR.doc KUTU F* kod 09-10A kod 09-10R – 20°C DE SAKLANIR AÇIKLAMA ETİKET TÜP (T) YA DA KAPAK RENGİ 20 test Mastermiks Sarı 2 X 520,5 μL AB Taq 5 U/μL Kırmızı X 0 Amplifikasyon Miks (10X Buffer ,MgCl2 ve dNTP içeren) X 0 Thermostabil Taq DNA polimerase X 0 Mineral Yağı Mineral Yağı Page 6 09-10A-20_8033622781288_TR.doc 1 X 20 μL 1 X 1 mL 3 REAKTİFLERİ SAKLAMA KOŞULLARI Kitin herbir komponenti, tekli kutuların etiketlerinde belirtilen talimatlara gore saklanmalıdır. Özellikle: KUTU F* KUTU R -20°C de saklanır +2 / +8°C DE SAKLANIR Önerilen sıcaklıkta saklandığında, tüm test reaktifleri son kullanım tarihine kadar stabil kalır. Kutu R de test stripi içeren tüm reaktifler ve tüpler kullanılmadan önce oda ısısında (20 - 25°C) eritilmelidir ve kullanımdan sonra hemen dondurucuya kaldırılmalıdır. Denaturasyon solusyonunu içeren şişe kullanımdan sonra hemen kapatılmalıdır; bu solusyonun uzun süreli açık kalıp hava ile temasında hızlı bozulmalar oluşur. Geliştirilmiş kuru stripler karanlıkta, oda ısısında (20 - 25°C) saklanmalıdır. Farklı lotlardaki reaktifleri karıştırmayın. Page 7 09-10A-20_8033622781288_TR.doc 4 KULLANIM İÇİN ÖNLEMLER • Kit; moleküler biyoloji tekniklerini diagnostikte uygulama eğitimi almış ve tecrübesi olan araştırmacı tarafından kullanılmalıdır; • Kit prosedürüne başlamadan önce kullanım kılavuzunu dikkatlice ve tamamen okuyun; • Ürünleri ısı kaynağından uzakta tutun; • Son kullanım tarihi geçmiş kit parçalarını kullanmayın; • Saklama koşulları, kutu bütünlüğü ya da metod uygulaması ile ilgili herhangi bir şüpheniz olduğunda, AB ANALITICA teknik destek ile bağlantı kurun: laboratorio@abanalitica.it; Nükleik asitlerin amlifikasyonunda, araştırmacı aşağıdaki özel önlemleri almalıdır: • Filtreli uç kullanın; • Biyolojik örnekler, ekstrakte edilmiş DNA, kit içeriğindeki referans DNA ve tüm amplifikasyon ürünleri, amplifikasyon reaktiflerinden farklı bir yerde saklanmalıdır. • PCR öncesi ve sonrası için farklı alanlar hazırlayın ve iki alan arasında materyal (pipetler, uçlar, tüpler, vs.) paylaşımı yapmayın. • Sık sık eldiven değiştirin. • Benç yüzeyini %5 sodyum hipoklorit ile temizleyin. • Ekstrakte edilmiş DNAyı kısa bir süre için +2° / +8°C de saklayın ya da daha uzun süreli saklamak için -20°C de dondurun. • Kullanmadan once PCR premiksi oda ısısında eritin; Taq DNA polymerase ekleyin ve oda ısısında ya da buz kabında oldukça hızlı DNA purifiye edin. Page 8 09-10A-20_8033622781288_TR.doc 5 GÜVENLİK KURALLARI 5.1 Genel Güvenlik Kuralları • Reaktifler ve klinik örnekler ile çalışırken tek kullanımlık eldiven kullanın ve çalışma bitiminde ellerinizi yıkayın. • Ağızla pipetleme yapmayın. • Bilinen hiçbir diagnostik metod enfektif ajalnların yok olduğunu garanti etmez. Tüm klinik örnekleri potansiyel enfeksiyonu ajanı olarak kabul edip o şekilde kullanmak gerekir; • Klinik örnekler ile direk temasta olan cihazların kontaminasyonlu olduğu ve bu şekilde kullanılması gerektiği göz önüne alınmalıdır. Örneklerin kazara etrafa dökülmesi durumunda, %10 Sodyum Hipoklorit ile temizleyin. Temizlenmiş materyaller, kontamine ürünler için olan özel konteynerlere atılmalıdır. • Klinik örnekler, materyaller ve kontamine dekontaminasyondan sonra atılmalıdır: ürünler aşağıdaki 30 dakika %5 Sodyum Hipoklorit (1 volüm %5 Sodyum Hipoklorit solusyonu herbir 10 volüm kontaminasyonlu sıvı için) solusyonuna batırılmalı YA DA en az 2 saat 121°C de otoklavlanmalı (NOT: Sodyum Hipoklorit içeren solusyonları otoklavlamayın !!) Page 9 09-10A-20_8033622781288_TR.doc 5.2 Kit Hakkında Güvenlik Kuralları Bu kit kullanımı için riskler tekli komponentler ile ilişkilidir: Tehlikeli Komponentler: BCIP/NBT (5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-phosphate (X-phosphate) 4toluidine salt and 4-nitro blue tetrazolium chloride (NBT) in dimethysulphide Risk tanımı: Xi Tahriş edici RİSK İBARESİ VE S İBARESİ R 36 R 37 R 38 S 36/37 Gözler için tahriş edici. Solunum sistemi için tahriş edici. Deri için tahriş edici. Koruyucu giysi ve uygun eldivenler kullanın. Denatürasyon Solusyonu Sodium Hydroxide içerir. Risk tanımı: Xi Tahriş edici RİSK İBARESİ VE S İBARESİ R 36 ve R 38 S 23-24-26 Gözler için tahriş edici. Deri için tahriş edici. Buharını solumayınız. Deri ile temasından kaçının. Gözler ile temas etmesi halinde, bol su ile yıkayın ve doktora başvurun. Page 10 09-10A-20_8033622781288_TR.doc 6 KİT İÇERİĞİNDE MATERYALLER BULUNMAYAN GEREKLİ 6.1 Reaktifler • • • • DNA ekstraksiyonu için reaktifler Steril DNase ve RNase free su; Distile su; DNA amplifikasyonu için reaktifler (kit kodu 09-10R için). 6.2 Cihazlar • • • • • • • • • • Laminar flow kabini (kontaminasyondan korunmak için amplifikasyon premikse TAQ polymerase eklenirken kullanılması önerilir; ekstrakte DNa eklenirken başka bir laminar flow kabini kullanılması önerilebilir); Mikropipetler (aralık: 0,2-2 µL; 0,5-10 µL; 2-20 µL; 20-200 µL; 100-1000 µL); Thermalcycler; Çalkalama platformu ile su banyosu (80 rpm; eğimli kapak ile; 50°C ± 0,5°C ye ayarlanabilir) Manyetik ısıtıcı ya da mikrodalga; Mikrosantrifüj (max 12-14.000 rpm); Hibridizasyon kuyucuklarından likit aspirasyonu için cihaz Dağıtıcı multipipet (opsiyonel). Vorteks; Orbital, resiprokal ya da salıncak platformlu shaker. 6.3 Materyaller • • • • Tek kullanımlık eldivenler; Mikropipetler için steril filtreli uçlar (aralık: 0,2-2 µL; 0,5-10 µL; 2-20 µL; 20-200 µL; 100-1000 µL); Stripi tutmak için pens; Dereceli silindirler (10, 25, 50 ve 100 mL); Page 11 09-10A-20_8033622781288_TR.doc 7 ÖN MUAMELE VE REAKTİF HAZIRLAMA PROSEDÜRÜ 7.1 Faktör II, faktör V ve MTHFR kodlayan genlerin uygun kısımlarının amplifikasyonu NOT: Mastermiks sadece kit 09-10A da bulunur. • Mastermiksi eritin. Amplifikasyon reaksiyonunun tüm kurulumu sırasında reaktifler buzda tutulmalıdır. 7.2 Reverse hibridizasyon için reaktifler • Kullanmadan once tüm test materyallerinin oda ısısında (20° - 25°C) erimesine izin verin. • Hibridizasyon Solusyonu ve Sıkı Yıkama Solusyonu en az 37°C ye kadar ön-ısıtılmalıdır (tüm kristaller kullanılmadan önce çözdürülmelidir) fakat hibridizasyon ısısı 50°C nin üzerine çıkmamalıdır. • Konsantre Rinse Solusyonunu 1:5 seyrelterek Rinse Solusyonunu hazırlayın (1 volüm konsantre solusyon + 4 volüm distile ya da deiyonize su). Herbir test oluğu için 8 mL Rinse Solusyonu + 10 mL fazladan hazırlayın. Hazırladıktan sonra, seyreltilmiş Rinse Solusyonu +2/+8°C de saklanırsa 2 hafta stabildir. • Konsantre Konjugatı 1:100 Konjugat Diluentte seyrelterek Konjugat solusyonu hazırlayın. Herbir test oluğu için 2 ml Konjugat Solusyonu + 2ml fazladan hazırlayın (konjugat solusyonu sıkı yıkama aşaması sırasında hazırlanabilir). • Konsantre NBT/BCIP solusyonu Substrat Bufferda 1:100 seyrelterek Substrat solusyonunu hazırlayın. Page 12 09-10A-20_8033622781288_TR.doc • Herbir test oluğu için 2 ml Sustrat Solusyonu + 2ml fazladan hazırlayın (substrat solusyonu sıkı yıkama aşaması sırasında hazırlanabilir). • Konjugat ve substrat solusyonu hazırlamak için kullanılan tüm şişeler iyice temizlenmelidir ve distile su ile yıkanmalıdır. • Hazırlanmasından sonra, seyreltilmiş Konjugat ve Substrat solusyonları karanlıkta oda ısısında (20° / 25°C) 8 saat stabil kalır. Page 13 09-10A-20_8033622781288_TR.doc 8 GİRİŞ Venöz tromboz, venlerde lokalize olan ya da trombustan salınan pıhtı ile sirkülasyonun tıkanmasıdır. Trombus formasyonunun genel bölgeleri yüzeyeldir ve bacaklardaki derin venlerdir, fakat beyinde, retinada, karaciğerde ve mezenterdeki venlerde de görülebilir. En önemli soru venöz tromboz gelişim riski ön görülüp görülmediğidir. Travma, cerrahi, immobilizasyon, hamilelik ve oral kontraseptif kullanımı gibi koagülasyon sisteminin lokal aktivasyonundan başka bireylerin genetik altyapısı da önemli bir rol oynar. Venöz trombozun artmış riski, hemostatik ve fibrinolitik ilerleyişi de içeren proteinleri kodlayan genlerdeli mutasyonların görülmesi yüzünden yaşamı boyunca devam eder. Şimdi, venöz tromboz gelişiminde önemli rol oynayan çeşitli mutasyonlar tanımlanmıştır: Faktör II, Faktör V ve MHTFR (methylentetrahydrofolate reductase). Faktör V geni, inaktif pro-kofaktör olarak kanda görülen homonim proteinleri kodlar. Protrombinin trombine dönüşümünde faktör Xa nın kofaktörü olarak iş gören iki zincirli bir formasyonda (faktör Va) sonuçlanarak trombin ile aktive hale gelebilir. Faktör Va nın inaktivasyonu aktive protein C (APC) ile Arg306, Arg506 ve Arg679 de ağır zincirde direk seçici proteolitik ayrılma gösterir. Trombozis, faktör V proteininde kritik bölgeyi etkileyen çeşitli genetik mutasyonlarla sonuçlanabileceğine dair bir hipotez bulunmaktadır. Faktör V geninin exon 10 unda G-A transisyonu pozisyon 506 daki argininin glutamin ile yer değişimi sonucuna neden olur. Faktör V in bu mutasyonlu formu faktör V Leiden mutant olarak bilinir. Aktive faktör V Leiden APC ile yarılmaz ve bu nedenle APC-direnci göstermektedir. Bu APC direncinin laboratuar fenotipinin moleküler temelidir. Beyaz populasyonda faktör V Leiden taşıyıcı populasyon sınırı 2-15 kişidir. Mutasyonlar beyaz olmayanlarda çok yüksek orandadır. Heterozigot taşıyıcılar genel populasyonda 7 kata kadar derin venöz tromboz riski taşırlar; homozigot taşıyıcılarda risk 80 kata kadar çıkar. Faktör V Leiden mutasyonu olmadan APC direnci ve derin venöz trombozu olan hastaların %5-10 unda, APC direnci hamilelik ya da yüksek faktör VIII seviyesi gibi diğer faktörlere bağlı olabilir. Ayrıca, yakın zamanda yeni bir faktör V mutasyonu APC direnci ile ilişkili bulunmuştur. Bu G-C mutasyonu ekson 7 de görülür ve faktör V proteininde Arg306Thr de değişim ile sonuçlanır: Bu mutasyon Faktör V Cambridge olarak adlandırılmıştır. Protrombin ya da Faktör II trombinin inaktive öncüsüdür. Gen, 5’UTR, 13 intron ile 14 ekson ve 3’UTR içerir. Yakın zamanda, yükselmiş protrombin Page 14 09-10A-20_8033622781288_TR.doc seviyesi ile ilişkili ve venöz trombozda artmış 3'UTR de genel bir genetik varyasyon bulunmuştur. Nukleotid 20210 da bu G-A transisyonunun önemi henüz tam olarak anlaşılamamıştır, fakat çeşitli araştırmacılar; heterozigot taşıyıcıların taşıyıcı olmayanlardan yüzde 30 daha yüksek plazma protrombin seviyesine sahip olduğunu ve genel populasyondan 3-6 kez daha yüksek derin-ven tromboz riskine sahip olduğunu rapor etmişlerdir. Mutasyon beyaz olmayanlarda nadir görülür. Beyazlarda, taşıyıcı oranı 0,7-4 kişi aralığındadır. G20210A, serebral-ven trombozu için önemli bir risk faktörü olarak görülür. Ayrıca, G20210A mutasyonu oral kontraseptif kullanımı ile sinerjetik olarak görülebilir. Bu nedenle, hem G20210A mutasyon taşıyıcısı olan hem de oral kontraseptif kullanıcısı olan bayanlar serebral-ven trombozunun yüksek riski altındadırlar. Hiperhomosisteinemi, serebrovasküler, periferal vasküler ve koroner hastalıklar için bir risk faktörü olarak tanımlanmıştır. Plazma homosisteinin yükselmiş seviyesi, homosistein metabolizması için trans-sülfürasyon ya da re-metilasyon yollarında genetik ya da beslenme-ilişkili bozukluklar ile sonuçlanabilir. 5,10-methylenetetrahydrofolate reductase (MTHFR), 5,10 methylenetetrahydrofolate to 5-methyltetrahydrofolate indirgenmesini katalizler. Isıya dayanıksız enzimler ile indirgenmiş MTHFR aktivitesi koroner ve periferik arter hastalığı olan hastalarda rapor edilmiştir. Yakın zamanda, MTHFR da genel bir mutasyon (C677T; Ala-Val) tanımlanmıştır ve bu değişim seçilmemiş kişilerin yaklaşık %38 inde sıklıkla görülür. Mutasyon için heterozigot ya da homozigot kişiler MTHFR önemli düşük spesifik aktivitesi gösterirler. Mutasyon için homozigot olan kişiler önemli derecede yükselmiş plazma homosistein seviyesine sahiptirler. Multiple mutasyon görülmesi sinerjistik etkilere sahiptir. Bu nedenle, bu eş zamanlı testlerin performansı için avantajdır. Page 15 09-10A-20_8033622781288_TR.doc 9 TEST PRENSİBİ PCR (Polimeraz Zincir Reaksiyonu) literatürlerde ilk DNA amplifikasyonu metodudur. (Saiki RK ve arkadaşları, 1985). Thermostable DNA polymerase ile DNA nın spesifik bir parçasının (hedef dizi) in vitro amplifikasyon reaksiyonu olarak tanımlanabilir. Reaksiyonda nükleik asitin üç segmenti yer alır: Amplifiye olması için çift iplikli DNA kalıbı (hedef DNA) ve iki tek iplikli oligonükleotid “primerler” kalıp DNA ya spesifik olarak dizayn edilmiştir. DNA polymerase primerler tarafından işaretlenen bölgeden sentez işlemine başlar ve solusyonda serbest olarak bulunan tamamlayıcı nükleotidlerin (dNTPler) eklenmesi ve bağlanması ile orjinal çift iplikli hedef DNA bölgesi ile aynı olan yeni çift iplikli DNA molekülünü sentezler. Çeşitli sikluslardan sonra, hedef diziye uygun olan milyonlarca DNA molekülü oluşturabilir. Bu testin duyarlılığı, laboratuar tanısında uygulamaya olanak sağlar. Strip üzerinde immobilize spesifik prob ile işaretli amplifiye ürünlerin sonraki hibridizasyonu (alel spesifik hibridizasyon/ Reverse Dot Blot) farklı mutasyonları ayırt edebilir. Page 16 09-10A-20_8033622781288_TR.doc 10 ÜRÜN TANIMI Thrombo-strip metodu reverse hibridizasyon prensibine dayanır. Faktör II, Faktör V ve methylenetetrahydrofolate reductase kodlayan genlerin uygun kısımları PCR tarafından amplifiye edilir ve denature biotinli amplikonlar, membran stripinde paralel hatlarda immobilize olan spesifik oligonukleotid problar ile hibridize olur. Hibridizasyon ve sıkı yıkamadan sonra, streptavidin konjuge alkaline phosphatase eklenir ve önceden oluşan biotinli herbir hibiride bağlanır. BCIP/NBT kromojen ile inkübasyon mor bir presipitat üretir ve görünüşte yorumlanabilen bir sonuç oluşturur. Bu kit ile aşağıdaki mutasyonlar tespit edilebilir: Faktör V Leiden G1691A (Arg 506 Gln), Faktör V Cambridge G1091C (Arg 306 Thr), Faktör II nin G20210A mutasyonu ve MTHFR ın C6677T mutasyonu; sonuç yorumlama bunların statüsünü değerlendirmeye izin verir (homozigot, heterozigot, genetik bileşik). --------------------------------------------------- Marker line Control line Factor V wildtype Factor V Leiden Arg506Gln Factor V wildtype II Factor V Cambridge Arg306Thr Factor II wildtype Factor II mutant G20210A MTHFR wildtype MTHFR C677T Figür 1: Thrombo-strip üzerinde spesifik probların lokalizasyonu. Markır çizgisi oryantayon için stripin en üstünde çizilmiştir. Page 17 09-10A-20_8033622781288_TR.doc 11 ÖRNEK TOPLAMA, MUAMELESİ MANİPULASYON VE ÖN- Tromboziste olan genlerin mutasyonlarının araştırılması periferik tam kandan başlayarak yapılır. Örnek toplama genel sterilite önlemlerini takip etmelidir ve örnekler transport medyum olmayan steril kutulara transport edilmelidir. Kan EDTAlı olarak alınmalıdır. Heparin gibi diğer koagülasyon ajanları TAQ polymerase’ın güçlü inhibitörleridir ve bu yüzden amplifikasyon reaksiyonunun verimliliğini bozar. Taze kan +2/+8°C de saklanabilir (toplanmadan 4 saat içinde kullanılmalıdır); eğer DNA hemen ekstrakte edilmeyecekse örnek -20°C de dondurulmalıdır. 12 PROTOKOL 12.1 DNA ekstraksiyonu Saf ve integral DNA ekstrakte eden herhangi bir diğer ekstraksiyon yöntemi de kullanılabilir. 12.2 Tromboz ile ilişkili genlerin uygun kısımlarının amplifikasyonu NOT: Mastermiks sadece kit 09-10A da bulunur. Aşağıdaki reaksiyon miskini hazırlayın: N X 34,7 μL N X 10 μL N X 0,3 μL Mastermiks PRIMER MIKS (PM) AB Taq N= örnek sayısı Amplifikasyon aşamasında kontaminasyondan korunmanın yanında, analiz edilecek tüm örneklere yetecek, DNA solusyonu dışında tüm reaktifler ile (ve mineral yağı sonra gereklidir) bir mastermiks hazırlamanız önerilir; miks daha Page 18 09-10A-20_8033622781288_TR.doc sonra DNA ve mineral yağı eklnecek olan 0.2 ya da 0.5 mL test-tüplerine alikuatlanır. Amplifikasyon için her bir tüpe ekleyin: 5 μL 2 damla Ekstrakte DNA Mineral Yağı Her bir deneyde kontaminasyonları izlemek için bir negatif kontrol içermesi önemlidir (mikse ekstrakte DNA yerine distile su ekleyin). Mikrotüpleri aşağıdaki thermalcycler programına koyun: 1 cycle 94°C 5 min 94°C 30 sec 60°C 45 sec 72°C 45 sec 1 cycle 72°C 5 min storage 4°C 40 cycles Amplifikasyon ürünleri fragmanları uzunluğu: Faktör II: Faktör V Cambridge: Faktör V Leiden: Faktör MHTFR: 115 bp 130 bp 138 bp 134 bp Elde edilen amplifikasyon ürünleri hemen hibridizasyon aşamasında kullanılmalıdır ya da kullanılana kadar -20°C de saklanmalıdır. Page 19 09-10A-20_8033622781288_TR.doc 12.3 Reverse hibridizasyon 12.3.1 İnkübasyon için talimatlar Hibridizasyon ve sıkı yıkama inkübasyonları tamamen 50°C de yapılmalıdır ve yanlış pozitif sonuçlardan (eğer sıcaklık çok düşükse) ya da yanlış negative/düşük sinyal sonuçlardan (eğer sıcaklık çok yüksekse) kaçınmak için en kritik aşamadır. Eğimli kapağı olan çalkalamalı su banyosu sıcaklık değişimlerini control etmek için iyidir. Kalibreli termometre ile sıkı sıcaklık takibi gereklidir. Sıcak hava shaker hibridizasyon ve sıkı yıkama için kullanılmamalıdır. Çalkalamalı su banyosu (hibridizasyon aşaması) ve orbital, resiprokal shaker ya da salıncak platformu (boyama aşaması) tarafından meydana getirilen hareketin büyüklüğü maksimum duyarlılık ve homojen boyama başarısı için kritiktir. Hareketin büyüklüğü, hem sıvının hem de test stripinin oluk içinde ileri geri hareketi için yüksek olmalıdır. Ayrıca, sıvının olukların kenarından sıçramasını da önlemelidir. Hibridizasyon ve sıkı yıkama için oluklar su banyosunun sallama platformu üzerinde olmalıdır. Su seviyesi oluklarun 1/3 ve ½ yüksekliğine ayarlanmalıdır. Olukların suyun içinde yüzmediğinden emin olun. Su direk tray ile temasta olmalıdır. Daima inkübasyon sırasında su banyosunun kapağı kapalı olmalıdır. Trayi kaplamayınız. 12.3.2 Traydeki sıvının değiştirilmesi için talimatlar - Sıvı, tercihen aspiratöre bağlı pipe tile oluklardan aspire edilmelidir. Tray sıvının bir köşeye akmasını sağlayacak açı ile tutulmalıdır. Her bir oluğa uygun solusyondan 2 ml ekleyin ve protokole devam edin. NOT: Dağıtıcı multipipet (Eppendorf gibi) bu amaç için yararlıdır. - Bu aşamayı test protokolünde belirtildiği kadar tekrar edin. Striplerin yıkama aşamaları arasında kurumasına izin vermeyin. Sıvı aspirasyonu sırasında striplerin yüzeylerinin zarar görmediğinden emin olun. Tercihen, sıvıyı stripteki markır çizgisinin üzerinden aspire edin. Tüm striplerin tamamen solusyon altına batıp yıkandığından emin olun. Eğer gerekli ise shaker hızını değiştirin. Page 20 09-10A-20_8033622781288_TR.doc 12.3.3 Beyanat ve önlemler - Test striplerinin kaplı yüzleri (bu kısım işaretlidir) yukarı gelecek şekilde oluklara yerleştirildiğinden emin olun. Test striplerini tanımlarken kalem kullanın. Diğer işaretleyicileri kullanmayınız. Tanımlama numaralarını markır çizgisinin üzerine yazın. Striplere elle dokunmayın, temiz pens kullanın. Herbir örnek için yeni bir filtreli uç kullanın. Stripler güçlü gün ışığından ve ısıdan uzakta saklanmalıdır. Yorumlamadan önce stripleri karanlıkta tamamen kurutun. 12.3.4 Denatürasyon ve hibridizasyon prosedürü Bu test aşağıdaki prosedüre göre manuel olarak yapılabilir. NOT: Farklı inkübasyon aşamaları boyunca, test stripleri aynı oluk içinde tutulmalıdır. 1. 2. çalkalamalı su banyosunu tamamen 50°C ye ısıtın. Kalibreli termometre kullanarak sıcaklığı kontrol edin ve eğer gerekirse sıcaklığı ayarlayın. Hibridizasyon Solusyonu ve Sıkı Yıkama Solusyonunu en az 37°C ve 50°C yigeçmeyecek şekilde ön-ısıtın. Kullanmadan önce karıştırın, tüm kristaller çözülmelidir. Pens kullanarak gerekli miktarda stripi tüplerden alın (herbir örnek için bir strip) ve kalem kullanarak markır çizgisi üzerine tanımlama numaralarını yazın. 3. gerekli miktarda test oluğu alın (herbir strip için bir oluk) ve tray içine yerleştirin. 4. Figür 2 de (aşama 1)gösterildiği gibi herbir oluğun üst köşesine 10 μL Denatürasyon Solusyonu (DS) ekleyin. NOT: Kullandıktan sonra hemen şişe kapaklarını kapatın. 5. Denaturasyon Solusyonuna 10 μL biotinli amplifikasyon ürünü ekleyin ve pipet yardımı ile dikkatlice karıştırın (Figür 2, Aşama 2). Daima steril filtreli uç kullanın. Oda ısısında (20°-25°C) 5 dakika inkübe edin. Page 21 09-10A-20_8033622781288_TR.doc 6. 7. Ön-ısıtılmış Hibridizasyon Solusyonunu çalkalayın ve amplifikasyon ürünlerini denatüre etmek için herbir oluğa 2ml ekleyin. dikkatlice çalkalayarak karıştırın (Figür 2, aşama 3). Pipetleme sırasında komşu oluğu kontamine etmemeye özen gösterin. Stirpleri işaretli yüzleri yukarı bakacak şekilde hemen oluklara yerleştirin. Stripler tamamen solusyon içine gömülmelidir. NOT: Tek kullanımlık eldiven ve pens kullanın. 8. Trayi 50°C deki çalkalamalı su banyosuna koyun (yaklaşık 80 rpm, İnkübasyon için talimatlara bakın), kapağını kapatın ve 60 dakika inkübe edin. NOT: Su banyosundan suyun olukların içine sıçramasına engel olun. Su seviyesi olukların 1/3 ve ½ yüksekliğine ayarlanmalıdır. Trayin kaymasını önlemek için iki ağırlık ile trayi hareketsiz hale getirin. 10 μL of denaturation solution tough add 10 μL of amplification product add 2 mL of hybridization solution MIX BY PIPETTING Fig. 2: Denatürasyon ve hibridizasyon aşamaları Page 22 09-10A-20_8033622781288_TR.doc put the strip into the tough 12.3.5 Sıkı Yıkama Prosedürü 9. Hibridizasyondan sonra trayisu banyosundan alın. 10. Trayi küçük bir açı ile tutun ve tercihen bir vakum aspiratöre bağlı pipet ile sıvıyı oluklardan aspire edin. Herbir oluğa 2 ml ön-ısıtılmış Sıkı Yıkama Solusyonu ekleyin ve oda ısısında 10-20 saniye çalkalayarak yıkayın. Her bir oluktan sıvıyı aspire edin. 11. Bu yıkama aşamasını tekrar edin (oluklardaki sıvıyı değiştirme talimatlarına bakın). 12. Sonunda, solusyonu aspier edin ve herbir stripi 2 ml ön-ısıtılmış Sıkı Yıkama Solusyonunda 50°C çalkalamalı su banyosunda 30 dakika inkübe edin. Su banyosunun kapağını kapatın. NOT: Sıkı yıkama aşaması sırasında Rinse solusyonu ve Konjugatı hazırlayın (reaktifleri hazırlama kısmına bakın). 12.3.6 Boyama prosedürü Aşağıdaki tüm inkübasyonlar 20°-25°C de shakerda yapılmalıdır. 1. 2. 3. Herbir 2 ml seyreltilmiş Rinse solusyonu ile iki kez 1 dakika yıkayın (reaktifleri hazırlama ve oluklarda sıvı değişimi talimatlarına bakın). Aspire edin. Herbir oluğa 2 ml Konjugat solusyonu ekleyin ve 30 dakika çalkalayarak inkübe edin. Aspire edin. NOT: Konjugat inkübasyonunun bitmesin 10 dakika kala Substrat solusyonunu hazırlayın. (reaktifleri hazırlama kısmına bakın). Herbir stripi 2 ml Rinse solusyonu ile iki kez 1 dakika yıkayın ve 2 ml Subsrat Buffer ile bir kez daha yıkayın. Aspire edin. Herbir oluğa 2 ml Substrat solusyonu ekleyin ve 30 dakika (karanlıkta) çalkalayarak inkübe edin. Aspire edin. 5. Stripleri 2 ml distile su ile çalkalayarak en az 3 dakika yıkayarak renk oluşumunu durdurun. 4. Page 23 09-10A-20_8033622781288_TR.doc 6. Pens kullanarak stripleri oluklardan alın ve emici kağıt üzerine koyun. Striplerin tamamen kurumasını sağlayın ve yorumlama kağıdına yapıştırın. En üst çizgi markır çizgisidir. Bu çizgi yorumlama kağıdında striplerin uygun sıra ile dizilmesini sağlar. 13 SONUÇLARIN YORUMLANMASI 13.1 Kalite Kontrol Ilk pozitif çizgi Konjugat Kontrol çizgisidir (hemen markır çizgisinin altında). Bu çizgi prosedür sırasında Konjugat ve Substrat arasındaki reaksiyonu gösterir. Bu bant daima pozitif olmalıdır ve aynı test çalışmasında herbir stirpte yaklaşık aynı şiddette olmalıdır. 13.2 Yorumlama Temiz görünür çizgi olması pozitif reaksiyonu gösterir. Stripte pozitif olan tüm çizgi numaralarını tanımlayın ve yorumlama kağıdı ve aşağıdaki tabloyu kullanarak sonuçları belirleyin: Bant (1) 2 3 4 5 6 7 8 9 Prob reaktivitesi (konjugat kontrol çizgisi; daima pozitif olmalıdır) Faktör V wildtype I Faktör V Leiden G1691A (Arg506Gln) Faktör V wildtype II Faktör V Cambridge G1091C (Arg306Thr) Faktör II wildtype Mutant Faktör II G20210A MTHFR wildtype MTHFR C677T Page 24 09-10A-20_8033622781288_TR.doc 14 SORUN GİDERME Tüm striplerin konjugat control çizgilerinde zayıf sinyal ya da sinyal olmaması • Muhtemelen boyama aşamasında uygun olmayan miktarda Konjugat ya da Substrat eklenmiştir. − Aynı stripler ile taze Konjugat solusyonu ve taze Substrat solusyonu hazırlayarak boyama aşamasını tekrar edin. • Oda ısısı 20°C den düşük olmuştur. − Laboratuarı doğru sıcaklığa ulaşana kadar ısıtın. Konjugat kontrol çizgisi hariç prob çizgisinde yanlış-negatif sonuç ya da oldukça zayıf sinyal. • Hibridizasyon aşaması ya da sıkı yıkama sırasında sıcaklık çok yüksektir − Hibridizasyon ve sıkı yıkama aşamaları sırasında su banyosunun sıcaklığını dikkatlice control edin. • Hibridizasyon solusyonu ya da sıkı yıkama solusyonu uygun şekilde önısıtılmamış ya da karıştırılmamıştır. − Hibridizasyon solusyonu ve sıkı yıkama solusyonunu uygun şekilde önısıtın ve karıştırın. • Hibridizasyon için amplifikasyon ürünleri çok fazla seyreltildiğinden yetersiz amplifikasyon olmuştur. − Amplifiye ürünlerin görünürlüğünü %3 agaroz jelde control edin. 10 µL amplifiye ürün ekleyin. Jelde görünür olan PCR fragmanları stripte de temiz sonuçlar verir. − Artmış DNA hedef miktarı ile amplifikasyonu tekrar edin. − Ekstraksiyondan sonra elde edilen DNA solusyonu saf değildir (O.D. 260/280 oranı çok düşüktür). Ekstraksiyon protokolünü doğru şekilde Page 25 09-10A-20_8033622781288_TR.doc − yaptığınızı kontrol edin ve yeni bir örnek ile doğru şekilde tekrar ekstraksiyon yapın. Ekstraksiyondan sonra elde edilen DNA solusyonu rezidüel RNA içerir (O.D. 260/280 oranı çok yüksektir). RNase sindirim aşaması ile RNA yı uzaklaştırın. − Thermalcycler doğru olarak programlanmamıştır: Thermalcycler programının uygunluğunu ve kullanıcı kılavuzundaki sıcaklık profilini kontrol edin. − Amplifikasyon miksine çok fazla DNA eklenmiştir: DNA örneğini seyreltin ve 10 kez az DNA ekleyerek amplifikasyonu tekrar edin. • DNA ekstraksiyon aşaması sırasında problemler − Ekstraksiyon metodunun uygun olduğundan ve tüm bilgileri doğru şekilde takip ettiğinizden emin olun; − Ekstraksiyon kitinin kullanıcı kıalvuzundaki sorun giderme kısmına başvurun − Yeni bir örnek ile doğru şekilde tekrar DNA ekstraksiyonu yapın. Yanlış-pozitif sinyaller (spesifik olmayan sinyaller). • Hibridizasyon ve sıkı yıkama sırasında su banyosu sıcaklığı çok düşüktür. − Spesifik sinyal elde etmek için hibridizasyon ve sıkı yıkama sırasında sıcaklığın 50°C ± 0.5°C olduğundan emin olun. − Daima inkübasyon sırasında su banyosunun kapağı kapalı olmalıdır; • Hibridizasyon solusyonu ya da sıkı yıkama solusyonu uygun şekilde önısıtılmamış ya da karıştırılmamıştır. − Hibridizasyon solusyonu ve sıkı yıkama solusyonunu uygun şekilde önısıtın ve karıştırın. Page 26 09-10A-20_8033622781288_TR.doc • Renk gelişimi çok hızlıdır − 15 dakika sonra renk gelişimini durdurun (önerilen 30 dakika yerine). Fazla şiddetli renk gelişimi yüksek arka plana ve/veya yanlış-pozitif sinyallere neden olabilir. − Amplifikasyon miksine çok fazla DNA eklenmiştir: DNA örneğini seyreltin ve 10 kez az DNA ekleyerek amplifikasyonu tekrar edin. • Eğer aynı aspesifik patern tüm striplerde görülüyorsa kontaminasyon olabilir. − Tüm DNA ekstraksiyonunu ve PCR amplifikasyonunu taze hazırlanmış solusyonlar ile tekrar edin. Stripin merkezinde renklenmeme ya dab ant oluşmaması ya da homojen olmayan boyanma. • Prosedür sırasında shakerın rotasyon hızı çok düşüktür. − Aynı stripleri kullanarak boyama prosedürünü tekrar edin. Hızı artırın ve striplerin tamamen inkübasyon sıvısına gömülü olduğundan emin olun. Güçlü arkaplan • Konjugat uygun olarak seyreltilmemiştir ya da konjugat fazlası uygun şekilde yıkanmamıştır. − • Aynı amplifiye materyalleri kullanarak dentaürasyon aşamasından başlayarak yeni stripler ile testi tekrar edin. Boyama aşamasında Rinse solusyonu ile yıkama sırasında striplerin oluklarda ileri geri hareket ettiğinden emin olun. Yıkama zamanı en az 1 dakika olmalıdır. Oda sıcaklığı 25°C den yüksektir. − Laboratuarı doğru sıcaklığa ulaşana kadar soğutun. • Stripler substrat solusyonunda çok uzun inkübe edilmişlerdir. − Prosedürde belirtilen inkübasyon zamanını uygulayın. Daha fazla detaylı bilgi için AB ANALITICA teknik destek ile irtibata geçin. laboratorio@abanalitica.it, faks (+39) 049-8709510, ya da tel. (+39) 049761698. Page 27 09-10A-20_8033622781288_TR.doc 15 TEST LİMİTLERİ Kit performansı aşağıdaki durumlarda azalır: Klinik örnekler kullanım için uygun değildir (doğru saklanmamış ya da heparin ile alınmış kan örnekleri) Kit uygun koşullarda saklanmamıştır. 16 TEST PERFORMANSI 16.1 Özgünlük En önemli bilgi bankasında uygulanan primer dizisi spesifik olmayan dizilerin yokluğunu değerlendirir. Eğer protokoldeki sert şartlar doğru olarak yapılırsa striplerdeki problar için bu geçerlidir. Page 28 09-10A-20_8033622781288_TR.doc 17 REFERANSLAR Bagley PJ, Selhub J, Proc Natl Acad Sci U S A 1998; 95:13217-13220. Bertina RM, Koeleman BPC, Koster T, Rosendaal RJ, Dirven RJ, de Ronde H, van der Velden PA, Reitsma PH, Nature 1994; 369:64-67. Malik NM, Syrris P, Schwartzman R, Kaski JC, Crossman DC, Francis SE, Carter ND, Jeffery S, Clin Sci 1998; 95: 311-315. Motti C, Gnasso A, Bernardini S, Massoud R, Pastore A, Rampa P, Federici G, Cortese C, Atherosclerosis 1998; 139:377-383. Poort SR, Rosendaal FR, Reitsma PH, Bertina RM, Blood 1996; 88:36983703. Saiki RK, S Scharf, F Faloona, KB Mullis, GT Horn, HA Erlich and N Arnheim, Science 230, 1350-1354, 1985. Williamson D, Brown K, Luddington R, Baglin C, Baglin T, Blood 1998; 91:1140-1144. Page 29 09-10A-20_8033622781288_TR.doc 18 İLGİLİ ÜRÜNLER HEMO STRIP (Kod 09-11A) Reverse hibridizasyon testi (RHA) ile hemokromatozis-ilişkili HFE genindeki mutasyonları eş zamanlı belirlemek ve tanımlamak için kit. Tanımlanan mutasyonlar: C282Y; H63D; S65C. Kit, striplerde reverse hibridizasyon (RHA) ile DNA amplifikasyonu ve belirlemesi için reaktifler içerir. Kod 09-11A-20 Ürün HEMO STRIP Pkg 20 test HEMO STRIP (Kod 09-11R) Reverse hibridizasyon testi (RHA) ile hemokromatozis-ilişkili HFE genindeki mutasyonları eş zamanlı belirlemek ve tanımlamak için kit. Tanımlanan mutasyonlar: C282Y; H63D; S65C. Kit, striplerde reverse hibridizasyon (RHA) ile DNA amplifikasyonu için primerler ve belirleme için reaktifler içerir. Kod 09-11R-20 Ürün HEMO STRIP Page 30 09-10A-20_8033622781288_TR.doc Pkg 20 test