HCV-TS

KULLANICI KILAVUZU
HCV-TS
REF. 03-07R
Striplerde reverse hibridizasyon ile
Hepatit C virus tiplendirme kiti
03-07R-20_8033622780359_TR.doc
1 ÜRÜN BİLGİSİ
2
2 KİT İÇERİĞİ
3
3 REAKTİFLERİ SAKLAMA KOŞULLARI
4
4 KULLANIM İÇİN ÖNLEMLER
4
5 GÜVENLİK KURALLARI
5
5.1
Genel Güvenlik Kuralları
5
5.2
Kit Hakkında Güvenlik Kuralları
6
6 KİT İÇERİĞİNDE OLMAYAN GEREKLİ MATERYALLER
8
7 GİRİŞ
9
8 TEST PRENSİBİ
10
9 ÜRÜN TANIMI
12
10 ÖRNEK MUAMELESİ VE SAKLAMA
13
11 PROSEDÜR
13
11.1
Ön hazırlık
13
11.2
Denatürasyon
13
11.3
Hibridizasyon
13
11.4
Sıkı yıkama
14
11.5
Kolorimetrik belirleme
15
12 SONUÇ YORUMLAMA
16
13 SORUN GİDERME
19
14 TEST PERFORMANSI
21
14.1
21
Özgünlük
15 REFERANSLAR
21
16 İLGİLİ ÜRÜNLER
22
pag.1
03-07R-20_8033622780359_TR.doc
1 ÜRÜN BİLGİSİ
HCV-TS (kod 03-07R-20)
Striplerde reverse hibridizasyon ile Hepatit C virus tiplendirmesi için kit
Bu ürün in vitro diagnostik direktifin (IVDD) 98/79/EC (CE markası)
gerekliliklerine uygundur.
Kod
03-07R-20
Ürün
HCV-TS
Pkg
20 test
AB ANALITICA srl
Via Svizzera 16 - 35127 PADOVA, (ITALY)
Tel +39 049 761698 - Fax +39 049 8709510
e-mail: info@abanalitica.it
2 KİT İÇERİĞİ
KUTU R
+2 / +8 DE SAKLANIR
AÇIKLAMA
ETİKET
TÜP
YA DA KAPAK
RENGİ
20 test
Spesifik problar bağlı
Nitroselüloz stripler
HCV STRIP
20
SOLUSYON 1
BUFFER 1
2 X 100 mL
Pre-BUFFER 2
1 X 100 mL
SOLUSYON 3
BUFFER 3
1 X 100 mL
Skim Milk toz
SKIM MILK
6g
Skim Milk çözülme Solusyonu
Streptavidin-Alkaline
phosphatase konjugat
Substrat:
Tablette NBT/BCIP
Konjugat
Sarı
1 X 30 μL
NBT/BCIP
Karanlık Şişe
5 tablet
Hibridizasyon ve boyama için
8 tek kullanımlık inkübasyon
tray ile pleytler
Hibridizasyon Solusyonu
Sıkı Yıkama Solusyonu
3
Hibridizasyon
Solusyonu
Sıkı Yıkama
Solusyonu
Sonuç yorumlama için
Referans şebeke
1 X 50 mL
2 X 100 mL
1
pag.3
03-07R-20_8033622780359_TR.doc
3 REAKTİFLERİ SAKLAMA KOŞULLARI
Kitin herbir komponenti, tekli kutuların etiketlerinde belirtilen talimatlara gore
saklanmalıdır.
Önerilen sıcaklıkta saklandığında, tüm test reaktifleri son kullanım tarihine
kadar stabil kalır.
4 KULLANIM İÇİN ÖNLEMLER
•
Bu ürün sadece IN VITRO kullanım içindir;
•
Kit; moleküler biyoloji tekniklerini diagnostikte uygulama eğitimi almış ve
tecrübesi olan araştırmacı tarafından kullanılmalıdır;
•
Kit prosedürüne başlamadan önce kullanım kılavuzunu dikkatlice ve
tamamen okuyun;
•
•
Ürünleri ısı kaynağından uzakta tutun;
•
Son kullanım tarihi geçmiş kitparçalarını kullanmayın;
•
Saklama koşulları, kutu bütünlüğü ya da metod uygulaması ile ilgili
herhangi bir şüpheniz olduğunda, AB ANALITICA teknik destek ile
bağlantı kurun: laboratorio@abanalitica.it
•
Tüm prosedür sırasında oda ısısı 15°C ve 28°C arasında olmalıdır ve
nem %20-80 arasında olmalıdır. Yukarıdaki aralıkların altında ya da
üstünde olan sıcaklık ve nem değerleri test performansını etkileyebilir.
•
IFO tarafından önerilen her bir deneysel negatif ve pozitif kontrollerin kit
içeriğinde bulunması önemlidir.
AB ANALITICA srl
Via Svizzera 16 - 35127 PADOVA, (ITALY)
Tel +39 049 761698 - Fax +39 049 8709510
e-mail: info@abanalitica.it
•
İyi bir kit performansı için her bir aşamada yeterli miktarda reaktif dozu
kullanmak kesinlikle gereklidir.
•
Nükleik asitler, çevrede ve kullanıcının derisinde bulunan nukleazlar
tarafından kolayca yıkılır; kullanıcıdan DNase ve RNase tarafından
örneklerin kontaminasyonunu önlemek için daima tek kullanımlık eldiven
ve laboratuar giysisi kullanılmalıdır.
•
Filtreli uç kullanın;
•
Farklı lot numarasındaki reaktifleri kullanmayın ya da karıştırmayın.
•
PCR öncesi ve sonrası için farklı alanlar hazırlayın ve iki alan arasında
materyal (pipetler, uçlar, tüpler, vs.) paylaşımı yapmayın.
•
Reaktifleri, ekstrakte edilmiş DNA örneklerinden uzakta saklayın.
•
Benç yüzeyini %5 sodyum hipoklorit ile temizleyin.
5 GÜVENLİK KURALLARI
5.1 Genel Güvenlik Kuralları
Moleküler biyolojide HCV belirlemesi için başlangıç biyolojik örnekleri serum
ve plazmadır. Her bir tekli örneği aşağıdaki kuralları içeren uygun güvenlik
kuralları ile çalışmak gerekir:
•
Serum ve plazma gibi biyolojik örnekler ile çalışırken biyozararlı laminar
flow kabini kullanın;
•
Tek kullanımlık eldivenler ve koruyucu gözlükler kullanın;
•
RNA ekstraksiyonu için tahsis edilmiş pipet ve sarf malzemeleri kullanın;
•
Ağızla pipetleme yapmayın.
•
Her bir giysideğişiminden sonra ellerinizi yıkayın;
pag.5
03-07R-20_8033622780359_TR.doc
•
Klinik örnekler ile direk temasta olan cihazların kontaminasyonlu olduğu
ve bu şekilde kullanılması gerektiği göz önüne alınmalıdır.
•
Örneklerin kazara etrafa dökülmesi durumunda, %10 Sodyum Hipoklorit
ile temizleyin. Temizlenmiş materyaller, kontamine ürünler için olan özel
konteynerlere atılmalıdır.
Klinik örnekler, materyaller ve kontamine ürünler aşağıdaki
dekontaminasyondan sonra atılmalıdır:
•
30 dakika %5 Sodyum Hipoklorit (1 volüm %5 Sodyum Hipoklorit
solusyonu herbir 10 volüm kontaminasyonlu sıvı için) solusyonuna
batırılmalı
YA DA
en az 2 saat 121°C de otoklavlanmalı (NOT: Sodyum Hipoklorit içeren
solusyonları otoklavlamayın !!)
5.2 Kit Hakkında Güvenlik Kuralları
Bu ürün kullanımı ile ilgili risk yoktur.
AB ANALITICA srl
Via Svizzera 16 - 35127 PADOVA, (ITALY)
Tel +39 049 761698 - Fax +39 049 8709510
e-mail: info@abanalitica.it
pag.7
03-07R-20_8033622780359_TR.doc
6 KİT
İÇERİĞİNDE
MATERYALLER
•
•
•
•
•
•
•
•
BULUNMAYAN
GEREKLİ
Mikropipetler (aralık: 0,5-10 µL; 2-20 µL; 20-100 µL) ve filtreli uçlar;
Otomatik pipetör ve dereceli steril pipetler;
Thermalcycler;
Hibridizasyon kuyucuklarından sıvı aspirasyonu için sistem;
Orbital karıştırıcı;
65°C ye kadar ısıya programlanabilen su banyosy (Dubnoff);
Tek kullanımlık eldivenler;
Bazı reaktifleri hazırlamak için Falcon ® tipi test-tüpleri.
AB ANALITICA srl
Via Svizzera 16 - 35127 PADOVA, (ITALY)
Tel +39 049 761698 - Fax +39 049 8709510
e-mail: info@abanalitica.it
7 GİRİŞ
İnsan Hepatit C Virusu (HCV); Kronik Hepatit, hepatik siroz ve
hepatokarsinomaya neden olan en genel virustur.
HCV, non-A ve non-B hepatitlerin (NANBH) %70-90 ında etiyolojik ajandır ve
post-transfuzyonel Hepatitlerin en büyük nedenidir.
İnsan Hepatit C enfeksiyonu parenteral geçiş ile aktarılabilir ve kronik
lezyonda belirlenen hepatik hücrelerde kalmaya eğilimlidir.
Viremi,
bulaşmadan 1-3 hafta içinde belirlenebilir ve akut enfeksiyonlu hastalarda 4-6
ay, kalıcı enfeksiyonlu hastalarda 10 yıldan fazla kalabilir.
HCV nin etiyolojik tanısı; viral antijenlere karşı antikor için araştırma olan
immunoenzimatik testler ve her bir tekli antijene karşı antikorun tanımlanması
için immunoblot gibi başarılı ilave testler ile konulabilir.
Böyle testler, enfeksiyonun birinci fazında ya da antiviral tedavi sırasında viral
aktivite ya da viral replikasyon durumu hakkında bilgi vermezler.
Glycoprotein of envelope 1
Protein/s of capsid (Core)
RNA+ genome
Glycoprotein of envelope 2
HCV virus
Section
HCV virus
Surface
HCV mükletidik dizi oldukça çeşitlidir; ilk dizilenen HCV genomu genotip 1 dir
(Choo ve arkadaşları, 1991). 5’ ve 3’ ucunda translasyon olmamış bölge,
Core 21 bölgesi (p21 ya da capsid, Core protein, nukleocapsid, C protein),
zarf (E1, E2/NS1) ve yapısal olmayan proteinler (NS2, NS3, NS4,NS5) içerir.
HCV, yaklaşık 9,6 kb pozitif polarite RNA molekülü ile karakterizedir: Bu
molekül, 3011 aminoasitleri polipeptidi için kodlayan tekli ORF (Açık Okuma
Çerçevesi) içerir. 5’ ucunda 324-340 bp translasyon olmamış bölge (5’ NCR
ya da 5’ NTR, 5’ UR, 5’ UTR, 5’ NC) ve 3’ ucunda çeşitli boyutlarda başka bir
translasyon olmamış bölge (3’ NCR ya da 3’ NTR, 3’ UR, 3’ UTR, 3’ NC)(poli
U dizisi içeren; Choo ve arkadaşları, 1991) içerir.
ORF translasyon, ORF nin başlama kodonunun yakınında bulunan
ribozomun bağlanmasına izin veren 5' UTR nin 324-340 nukleotidleri ile
tetiklenir.
pag.9
03-07R-20_8033622780359_TR.doc
Polipeptid, translasyon ilerleyişisırasında ya da sonrasında on farklı protein
(C, E1, E2 yapısal protein olarak; NS1, NS2, NS3, NS4A, NS4B, NS5A ve
NS5B yapısal olmayan protein olarak) azaltır.
Region codifying for the polypeptidic precursor
5’ NTR
Nucleocapsid
(core)
Structural Proteins
C
E1
Glycoprotein
of envelope 1
NON Structural Proteins
3’ NTR
E2
Glycoprotein
of envelope 2
Diğer genotipler, HCV genotip1areferansı ile tanımlanır. Onların
sınıflandırılması, viral genomun farklı bölgelerinde nukleotidik dizilerin
karşılaştırılması temeline dayanır.
Viral genotipler, peg-IFN-α ve Ribavirin ile tedaviye farklı yollarla cevap verir:
HC—2 ya da HCV-3 ile enfekte hastalar tedaviye cevap verirken, HCV-1b ile
enfekte hastalar direnç gösterirler. Dahası, 1b genotip sık sık, bu hastaların
serumunda yüksek viral yük veren yüksek replikatif kapasite gösterir.
1b genotip, siroz ve hepatokarsinomada hastalık gelişimi ile ilişkilidir. Farklı
genotipler karakteristik coğrafik dağılım gösterir: Avrupa’da en çok görülenler:
1a, 1b, 2a, 2b, ve 3a.
HCV1, her İtalyan bölgesinde en büyük Hepatit C nedenidir. Prevalans aralığı
%50den %90a kadar değişir.
HCV2 yaklaşık %34 prevalansa sahiptir, daha nadir görülür.
HCV3 %3 ila %10 arasında görülür. Bu nedenle, HCV tipi terapi ve prognoz
ilişkisi açısından çok önemlidir.
AB ANALITICA srl
Via Svizzera 16 - 35127 PADOVA, (ITALY)
Tel +39 049 761698 - Fax +39 049 8709510
e-mail: info@abanalitica.it
8 TEST PRENSİBİ
PCR (Polimeraz Zincir Reaksiyonu) literatürlerde ilk DNA amplifikasyonu
metodudur. (Saiki RK ve arkadaşları, 1985). Thermostable DNA polymerase
ile DNA nın spesifik bir parçasının (hedef dizi) in vitro amplifikasyon
reaksiyonu olarak tanımlanabilir.
Reaksiyonda nükleik asitin üç segmenti yer alır: Amplifiye olması için çift iplikli
DNA kalıbı (hedef DNA) ve iki tek iplikli oligonükleotid “primerler” kalıp DNA
ya spesifik olarak dizayn edilmiştir. DNA polymerase primerler tarafından
işaretlenen bölgeden sentez işlemine başlar ve solusyonda serbest olarak
bulunan tamamlayıcı nükleotidlerin (dNTPler) eklenmesi ve bağlanması ile
orjinal çift iplikli hedef DNA bölgesi ile aynı olan yeni çift iplikli DNA
molekülünü sentezler. Çeşitli sikluslardan sonra, hedef diziye uygun olan
milyonlarca DNA molekülü oluşturabilir.
Bu testin duyarlılığı, laboratuar tanısında uygulamaya olanak sağlar. Eğer
RNAnın DNAya retrotranskripsiyonunun ilk aşaması (RT-PCR, Reverse
Traskriptaz PCR) bu teknik ile ilişkili ise, çalışmak ve bir RNA genomu ile
belirlenen diziyi ya da patojenleri tanımlamak mümkündür.
Spesifik prob eklenerek (Alel Spesifik/Reverse Dot blot) desteklenen işaretli
amplifikasyon ürününün izleyen hibridizasyonu farklı viral genomların
diferansiyasyonunu sağlar.
Amplifikasyon ürünü işaretlemek için çeşitli metodlar vardır; amplifikasyon
sırasında radyoaktif, digoksinli ya da biotinli nukleotidler kullanılarak. Bu
nukletoidler, reaksiyon miskine ya da basitçe primerlere eklenebilir.
Alel-spesifik hibridizasyon tekniği bir katı fazda hibridizasyondur ve hibridize
nukleik asitleri görüntülemek için en uygun metoddur (Meinkoth e Wahl,
1984). Nukleik asit immobilizasyonu için çeşitli tipte filtreler mevcuttur:
Nitroselüloz, tek iplikli DNA yüksek bağlanma kapasitesi (non kovalent)
(500 nukleotidden uzun iplikler için 80 µg cm-2 ) fakat asit ve alkalilerin
varlığında kırılgan;
• Naylon, tek iplikli DNA yüksek bağlanma kapasitesi (kovalent ya da
değil) (400 µg cm-2), fakat çift iplikli ve oligonukletoidlere de
bağlanabilen;
• Pozitif yüklü naylon, dördüncül amonyum grupları ile (pozitif yüklü),
alkalin durumda denatüre DNAya kovalent ve geri dönüşümsüz
bağlanma avantajı olan.
•
Filtre hibridizasyonu aşağıdaki aşamalardan oluşur:
pag.11
03-07R-20_8033622780359_TR.doc
Denatürasyon: İşaretli amplifikasyon ürünlerinin 95°C de
inkübasyonu.
• Hibridizasyon: Membran, spesifik ısıda, çalkalamada ve pHda olan
işaretli amplifikasyon ürünü içeren solusyon ile inkübe edilmiştir;
• Yıkama: Hibiridizasyon “şiddeti” sağlayan işaretli ürün fazlalığının
uzaklaştırılması için gereklidir.
• Kullanılan probun tipine bağlı olarak hibrid formunun belirlenmesi.
•
9 ÜRÜN TANIMI
HCV-TS kiti, biotinli viral bölgenin amplifiye DNası ile spesifik prob bağlı olan
nitroselüloz striplerin reverse hibridizasyonu temeline dayanır.
Bu kit aşağıdaki HCV tipleri ve alttiplerinin tanımlanması için dizayn edilmiştir:
1, 1a, 1b, 1c, 1d, 1f, 2, 2a, 2b, 2c, 3, 4, 5a, 6a, 7.
Her bir olguda, diğer genotipler evrensel HCV probları için pozitif sonuçlanır.
Strip, 5’ UTR ve Core bölgesindeki probların görülmesi sayesinde virus
genotiplendirilmesine izin verir. Bu nedenle, hibridizasyon, amplifikasyon
bölgesine bağlı olarak stripte paterni toplar. Eğer amplifiye bölge Core
bölgesinde görülmezse, bu bölge ile ilişkili stripte tüm problar genotiplendirme
için yararlı hiçbir hibridizasyon sinyali vermez; tersi sadece Core bölgesi
içeren amplifiye bölgelerde görülür, fakat 5'UTR bölgesinde değil.
Bu nedenle, HCV-TS kiti, HCV AMPLICOR kit ile gözlenen 5’-UTR bölgesinin
biotinli amplifiye ürünleri ile yarışabilir; fakat bu durumda alttip 2ave 2c
arasında ayırıma izin vermez, çünkü bu alttipler HCV AMPLICOR metodu ile
amplifiye olmayan Core bölgesinde farklılaşır.
AB ANALITICA srl
Via Svizzera 16 - 35127 PADOVA, (ITALY)
Tel +39 049 761698 - Fax +39 049 8709510
e-mail: info@abanalitica.it
10 ÖRNEK MUAMELESİ VE SAKLAMA
Başlangıç örneği HCV genomunun 5’-UTR bölgesinde amplifikasyonun biotinişaretli ürünüdür.
HCV-TS metoduna başlamadan önce, amplifiye ürünler örnek pozitivitesinin
doğrulanması için agaroz jel elektroforezi ile görüntülenmelidir.
Amplifiye ürünler hibridizasyondan önce kısa bir süre için + 2°/+ 8°C de ya da
uzun sure için – 20°C de saklanmalıdır.
11 PROSEDÜR
11.1 Ön Hazırlık
•
•
•
Agaroz jel elektroforezi ile örneklerin pozitivitesinin doğrulanması
Su banyosunu 50°C de kurun; tüm deney boyunca sıcaklığın 50°C de
olduğundan emin olun (maksimum hata aralığı: +/- 0.5°C).
HCV-TS kitini kullanmadan önce, reaktifleri en az 30 dakika oda
ısısında bırakın.
NOT:
•
50°C de su banyosunda Sıkı Yıkama Solusyonuve Hibridizasyon
Solusyonunu ısıtın;
•
Her bir stripi pozisyon çizgisinin üstünde en altta bir numara ile kalemle
işaretleyin.
11.2 Denatürasyon
•
•
Amplifiye ürünler thermocyclerda 95°C de 5 dakika denature edin.
Onları hemen buza koyun ve hibridizasyon ile devam edin (Roche HCV
AMPLICOR amplifikasyon ürünleri aynı yolla yapılır, mavi denaturasyon
solusyonu eklenmeden; alternatif olarak 100 μL Roche amplifikasyon
ürünü yukarıdaki solusyon ile dentaüre edilir.
Roche amplifikasyon
ürünlerini
Amperase
ile
denatürasyondan
korumak
için
amplifikasyondan hemen sonra dondurmak gerekir).
NOT: Daha iyi hibridizasyon etkisi görmek için denatüre edilmiş
örnekleri hemen buz üzerine koymak önemlidir.
•
Trayi tutabilmek için ağırlık kullanın.
pag.13
03-07R-20_8033622780359_TR.doc
11.3 Hibridizasyon:
•
•
•
•
•
•
Denatürasyon aşaması sırasında, stripin içinde bulunduğu her bir
kuyucuğa 2 mL önceden hazırlanmış Hibridizasyon Solusyonu
ekleyin.
20 μL denatüre edilmiş örnek ekleyin (ya da mavisolusyon ile
denatüre edilmiş 100 μL Roche amplifikasyon ürünü).
Nitroselüloz stripin pozisyon çizgisinin üst tarafa baktığından ve
tamamen solusyon içine batmış olduğundan emin olun.
Trayi su banyosuna koyun, su seviyesi tray yüksekliğinin 1/3 olmalıdır:
Suyun kuyucuklara sıçramadığından emin olun. (çapraz kontaminasyon
ya da aspesifik sinyalden kaçının).
50°C de 60 dakika inkübe edin, dikkatlice karıştırın.
Bu arada, analiz edilecek örnek sayısı ile Buffer 2 yi hazırlayın,
aşağıdaki formülü kullanın:
(2,5 mL Ön-Buffer 2 + 0,125 g Skim Milk) X N
(N= örnek sayısı)
NOT: Bu formül, bu protokolde kullanılacak tüm Buffer 2 miktarını içerir
(2mL Buffer 2 ile inkübasyon ve konjugat hazırlama için). Ön-Buffer 2
solusyonunda çözülmüş Skim Milk her zaman taze Buffer 2 kullanmak
için birine izin verir, geri dönüşümsüz presipitasyona neden olabilen
tekrar tekrar soğutup-ısıtma aşamasından kaçının.
11.4 Sıkı yıkama
•
•
•
Aspirasyon ile sıvı içeriği uzaklaştırın ve 2 mL sıcak Sıkı Yıkama
Solusyonu ekleyin, 50°C de 1 dakika sallayın.
Bu aşamayı bir kez tekrar edin.
Sıvıyı uzaklaştırın ve 2 mL sıcak Sıkı Yıkama Solusyonu ekleyin, sıcak
su banyosunda 50°C de 10 dakika sallayın.
AB ANALITICA srl
Via Svizzera 16 - 35127 PADOVA, (ITALY)
Tel +39 049 761698 - Fax +39 049 8709510
e-mail: info@abanalitica.it
11.5 Kolorimetrik belirleme
Boyama prosedürüoda ısısında, plate orbital shakera konularak yapılır.
•
•
Sıkı Yıkama Solusyonunu aspire edin ve önceden hazırlanan ve iyice
çalkalanan 2 mL Buffer 2 ekleyin. En az 10 dakika inkübe edin.
Bu arada, konjugatı hazırlayın. N örneği için seyreltme:
N x 1 μL Konjugat + N x 1.5 mL Buffer 1 ve N x 500μL Buffer 2
(önceden hazırlanan).
•
•
Buffer 2 yi kuyucuklardan uzaklaştırın ve 2 mL konjugat ekleyin;
çalkalayarak oda ısısında 30 dakika inkübe edin.
Bu arada, aşağıda belirtildiği gibi Boyama Solusyonunu hazırlayın:
1 NBT/BCIP tableti 10 mL distile su içinde çözün.
NOT: 1 NBT/BCIP tabletinden oluşan Boyama Solusyonu 5 strip için
yeterlidir!
Oluşturulan Boyama Solusyonu ışıktan uzakta tutulmalıdır.
Taze hazırlanan solusyon kullanılması önerilir; eğer bu mümkün
değilse, karanlıkta 3 günden uzun olmamak kaydı ile buzdolabında +2 /
+8°C de saklanabilir (tüplerin aüminyum folyo ile kapatılması önerilir).
Boyama Solusyonu hazırlanması aşamasında formamide kullanmaktan
kaçının ( likit kromojenlerde bulunan toksik içeriktir).
•
•
•
•
•
•
•
Likiti uzaklaştırın ve 2 mL Buffer 1 ile 1 dakika yıkayın.
Yukarıdaki aşamayı iki kez tekrar edin.
Likiti uzaklaştırın ve 2 mL Buffer 3 ile 1 dakika yıkayın.
Likiti uzaklaştırın ve önceden hazırlanan 2 mL Boyama Solusyonu
ekleyin.
Karanlıkta ve oda ısısında çalkalayarak, bantlar görünür olana kadar
inkübe edin (yaklaşık 30 dakika). Eğer bantlar yeterince görünür
olmazsa, boyama aşamasını buzdolabında bir gece bekleterek uzatın.
Boyama aşamasını oda ısısında 5 dakika distile su ile inkübe ederek
sona erdirin.
Dikkatlice stripleri kurutun.
Bir kere kuruduktan sonra, strip (karanlıkta) yıllarca saklanabilir.
pag.15
03-07R-20_8033622780359_TR.doc
12 SONUÇLARIN YORUMLANMASI
Sonuç yorumlama için referans tabloyu kullanın:
Prob N°
AÇIKLAMA
1
Boyama kontrol
2
Evrensel internal dizi 1
3
Evrensel internal dizi 2
4
Tip 1 (5’UTR)
5
Tip 1a (5’UTR)
6
Tip 1a (CORE)
7
Tip 1b (5’UTR)
8
Tip 1b (5’UTR)
9
Tip 1b (CORE)
10
Tip 1a/b (5’UTR)
11
Tip 1c (CORE)
12
Tip 1b/1f (CORE)
13
Tip 1d (CORE)
14
Tip 2 (5’UTR)
ÇAPRAZ-HİBRİDİZASYON
6, 7,8,9
4, 6
4, 5, 7,9
9
4, 6
15
Tip 2a (5’UTR)
5
16
Tip 2a (5’UTR)
5
17
Tip 2a (CORE)
18
Tip 2b (5’UTR)
19
Tip 2b (5’UTR)
20
Tip 2b (CORE)
21
Tip 2c (CORE)
22
Tip 3 (5’UTR)
AB ANALITICA srl
Via Svizzera 16 - 35127 PADOVA, (ITALY)
Tel +39 049 761698 - Fax +39 049 8709510
e-mail: info@abanalitica.it
23
Tip 3 (UTR)
24
Tip 4 (UTR)
25
Tip 6a (UTR)
26
Tip 7 (CORE)
PROBLAR
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26
1 + + + +
1 + + +
+
1
1a
1a
1a
1a
1b
1b
1b
1b
1b
1b
1b
1b
1b
1b
1c
1d
1f
2
2
2a
2a
2a
2a
2b
2b
2b
2b
2c
2c
2c
2c
3
3
3
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+ + +
+ + +
+ +
+ +
+
+
+
+
+
+
+
+ +
+
+
+
+
+
+
+
+ +
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+ +
+
+ +
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+ +
+
+
pag.17
03-07R-20_8033622780359_TR.doc
4
5a
6a
6a
6a
6a
7
7
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+/+
+ +
+
+ +
+
+
+/-
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
AB ANALITICA srl
Via Svizzera 16 - 35127 PADOVA, (ITALY)
Tel +39 049 761698 - Fax +39 049 8709510
e-mail: info@abanalitica.it
13 SORUN GİDERME
Boyama kontrol bandı haricinde BANT olmaması.
• HCV örneği negatiftir.
– Reverse hibridizasyon prosedüründen önce agaroz jel elektroforezi ile
örneklerin HCV pozitivitesini doğrulayın.
– Amplifikasyon sistemi, HCV-TS kitinin reverse hibridizasyon prosedürü
ile uyumlu değildir.
– Amplifikasyon ürünlerinin HCVnin 5’-UTR bölgesinde olduğunu teyit
edin.
– Amplifikasyon ürünlerinin biotinli olduğunu kontrol edin.
Bazı amplifikasyon bantları boyama kontrolünün ve evrensel internaz
dizi 1 ve 2 nin ötesindedir.
• Sıkılık problemleri;
– Su banyosu sıcaklığının 50°C de olduğundan ve sıcaklığın tüm deney
boyunca sabit olduğundan emin olun (maksimum hata sınırı +/- 0.5°C);
– Her bir kit komponentini belirtilen şekilde saklayın.
– Kullanmadan önce Sıkı Yıkama Solusyonunu 50°C de ön-ısıtın;
– Hibridizasyon kuyucuğuna su girebilir ve bu kontaminasyon ya da Sıkı
kondisyonun değişmesi ile spesifik olmayan sonuçlara neden olabilir.
• Bir ya da daha fazla solusyon kontamine olabilir;
–
–
–
–
Reaktifleri amplifiye DNA kaynağından uzakta tutun;
Rekatiflerin mikrop kontaminasyonundan sakının;
Yeni bir lot numaralı reaktifler ile testi tekrar edin;
Amplifikasyon sistemi, HCV-TS kitinin reverse hibridizasyon prosedürü
ile uyumlu değildir.
Soluk bantlar uzun süreli (tüm gece) inkübasyonlarından sonra
görülebilir.
pag.19
03-07R-20_8033622780359_TR.doc
• Amplifiye DNA oldukça seyreltilmiştir.
– Önerilen amplifikasyon sistemi nested PCR ürünleri ya da Roche
amplifiye ürünlerdir.
Herhangi bir şüphe ya da sorunuz olduğunda lütfen AB ANALITICA teknik
destek ile bağlantıya geçin: laboratorio@abanalitica.it, faks (+39) 049761698, ya da tel. (+39) 049-8709510.
AB ANALITICA srl
Via Svizzera 16 - 35127 PADOVA, (ITALY)
Tel +39 049 761698 - Fax +39 049 8709510
e-mail: info@abanalitica.it
14 TEST PERFORMANSI
14.1 Özgünlük
Test özgünlüğü %99,9 dur.
Genomik DNA ya dadiğer patojen mikroorganizmaların DNAları ile çapraz
reaksiyonlar belirlenmemiştir.
15 REFERANSLAR
Chen J-D et al., World J. Gastroenterol., 9 (5): 984-204; 2003
Choo et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 1991 Mar 15;88(6):2451-5
Jackson J. B. et al., J. Clin. Microbiol., 2387-2391a; 2002
Meinkoth, J. and Wahl, G. In Analytical Biochemistry, 138: 267, 1984
Mellor J. et al., J. Clin. Microbiol., 2525-2532 ; 1999
Saiki RK, Scharf S, Faloona F, Mullis KB, Horn GT, Erlich HA and Arnheim N,
Science 230, 1350-1354, 1985
Schoroter M. et al., J. Clin. Virol., 27 (2): 200-204; 2003
Simmonds P et al., Hepatology. 1994 May;19(5):1321-4
Simmonds P. et al., J. Gen. Virol., 82a: 693-712a; 2000
pag.21
03-07R-20_8033622780359_TR.doc
16 İLGİLİ ÜRÜNLER
HCV-PM-BIO
Retrotranskripsiyon için reaktifler, kullanıma hazır direk amplifikasyon tek-doz
premiksler, nested PCR (biotinli nested primerler), TAq polymerase enzimi,
agaroz jelde görüntüleme ve pozitif kontrol (rekombinant plazmid DNA) içerir.
Kod
03-06-25
03-06-50
Ürün
HCV-PM-BIO
HCV-PM-BIO
Pkg
25 test
50 test
AB ANALITICA srl
Via Svizzera 16 - 35127 PADOVA, (ITALY)
Tel +39 049 761698 - Fax +39 049 8709510
e-mail: info@abanalitica.it