DNA HİBRİDİZASYONU

DNA
HİBRİDİZASYONU
HAZIRLAYANLAR:
Beyhan KORKMAZ (040559019)
Prof. Dr. Figen ERKOÇ
GAZİ EĞİTİM FAKÜLTESİ
DNA hibritleşmesi; birbirine
komplementer iki tek zincir
nükleik asit sekansının çift
zincirli tek bir yapı haline
gelmesi işlemidir.
Sentetik olarak çoğaltılmış ve DNA
probları olarak hazırlanmış spesifik
DNA
parçalarının,
sekansı
araştırılacak olan hedef DNA
molekülü ile birleştirilmesi işlemine
"hibridizasyon" denir.
Nükleotidlerin,
normal
şartlar
altında
komplementer bağlanma özellikleri vardır.
DNA'da Guanin ile Sitozin ve Adenin ile Timin
birbirine komplementerdir. Bu yüzden birbirine
tamamen komplementer iki tek zincir nükleik
asit dizisi kolaylıkla birbirine tanır; eşleşir ve
yeniden çift zincir oluşturur. Buna "yapışma"
adı verilir.
İki zincirden birinde bulunan tek nükleotid
farklılığı bile yapışmayı zorlaştırır. Bu işlemin
tersine "denatürasyon" ya da "erime" adı verilir.
Çift zincirli bir DNA molekülü sıcaklık veya pH
ile denatüre edilebilir. Bu durumda çift zincir
açılıp tek zincir haline gelir. DNA'nın hibritleşme
ve denatüre olma özelliğinden birçok moleküler
teknikte yararlanılmaktadır.
Hibridizasyon, genellikle, iki tür arasındaki genetik
uzaklığın bulunmasında kullanılır. Bu tekniği ilk
geliştiren Charles Sibley ve Jon Alqhuist, DNADNA hibridizasyonunu, kuşlar ve primatlar
arasındaki filogenetik akrabalıkları sınıflandırmada
kullanmışlardır.
DNA
sekans
analizi
ve
hibridizasyon
deneyleri
günümüzde
mikrobiyolojide
bakterilerin
tanımlanmasında
kullanılmaktadır.
Metodun Kısa Özeti
Örnek DNA’nın eritilip, tekrar kendini eşlemesi
ve bu şekilde çoğaltılmasına dayanan bir
tekniktir.
¾ İki türün DNA'sı izole edilir.
¾ Parçalar küçük baz çiftlerine kesilir.
¾ Parçalar izole edilir.
¾ İzole edilen parçalar karşılaştırılır.
z
İnfeksiyonların erken, kesin ve güvenilir
teşhislerinde son 5-10 yıl içinde pratiğe konan
biyoteknolojik yöntemler oldukça yararlı olmuş
ve konvansiyonel tekniklerin boşluklarını
doldurmaya ve gidermeye başlamıştır. Bu
metotlar başlıca 2 grup altında toplanabilirler.
Bunlardan ilki etkenlerin genetik
materyallerinin saptanması (hibridizasyon
yöntemleri) dir.
Hibridizasyon Metodları
Hibridizasyon metodları, genellikle, incelenen materyalde
(doku, organ, hücre kültürü, ekstrakt, sekresyon sıvısı vs.)
bulunan hastalık edici etkenlerin veya bu dokulara ait hücre
DNA’larındaki spesifik genlerin işaretli problarla ortaya
konulmasını amaçlar.
Son yıllarda hibridizasyon tekniklerinde bazı gelişmeler
yapıldığından testler daha kolay, hızlı, etkin ve güvenilir
hale getirilmiştir.
Bunlar arasında en fazla kullanılanlardan bazılarının
dayandığı prensipler aşağıda kısaca verilmektedir.
1. Southern Blot Hibridizasyonu
Bu tekniğin basamakları, sırasıyla:
1) Genomik DNA’nın izolasyonu: Patolojik
materyalden izole edilen mikroorganizma
(bakteri, virus, parazit vs.), saf kültür halinde
üretilir ve DNA’ları ekstrakte edilir.
Eğer,
bakteri
DNA’sı
kullanılacak
ise,
önce
mikroorganizmanın hücre duvarı ve dış membranları lizozim
ve diğer enzimler kullanılarak patlatılır (lizis). Ayrıca,
ekstraksiyon çözeltisine SDS (sodyum dodesil sülfat),
proteinaz K ve RNase’lar da katılarak, DNA dışındaki bütün
komponentler uzaklaştırılır. DNA’nın endojen nükleazlardan
korunması için, enzim aktivatörü olan Mg iyonlarını
bağlayarak bir çok enzimin inhibe edebilen, EDTA eklenir.
Eukaryotlarda, ekstraksiyon tamponuna fenol
veya kloroform da ilave edilerek DNA’nın suda
çözünen proteinlerden ayrılması sağlanır.
Polisakkaridleri uzaklaştırmak için de sezyum
klorür dansite gradiyenti santrifüjlemesi yapılır.
Plasmid, faj ve virüslere ait genetik materyalin
(DNA) elde edilmesinde ve izolasyonunda özel,
modifiye metodlar kullanılmaktadır.
2) Özgül restriksiyon endonükleazlarıyla (RE)
sindirme: Hedef DNA saf olarak elde edildikten
sonra, çok az miktarda (0.5 - 5 µg, bu miktar
kullanılan hedef DNA’nın türüne göre değişebilir)
alınarak ependorf tüpüne konur. Bunun üzerine,
sindirimde kullanılacak RE enziminden, tam bir
sindirim sağlayabilecek miktarda ilâve edilir ve bir
süre (genellikle, 37°C’de 4-6 saat kadar)
inkübasyona bırakılır. Örnek RE enzimler: EcoRl,
Hind III, BamHI.
3)
Parçaların
(fragman)
elektroforezi:
Parçalanan DNA, çözelti halinde agarose jele
(PAGE'de olabilir) uygulanarak uygun bir süre,
bazen bir gece 40-50 volt altında elektroforeze
tabi
tutulur.
Bu
separasyon
sırasında
fragmentler büyükten küçüğe doğru bir sıralama
ile bantlar oluşturur. Büyükler başlangıç yerinde,
küçük segmentler de karşı uçta lokalize olur.
Bu safhada jel üzerinde oluşan bantlar etidyum
bromür ile boyanarak UV-ışını altında
görüntülenebilir ve bantlar, standard bantla
karşılaştırılarak değerlendirilir.
4) Bantların membran üzerine transferi
(Southern transfer): Agarose jel (veya PAGE)
üzerinde bulunan bantların naylon veya
nitroselüloz membran üzerine transferleri
yapılır.
5) Denatürasyon ve fiksasyon: Naylon üzerine
transfer edilen DNA bantları kurutulur ve 0.5 N
NaOH ile muamele edilerek denatüre edilir (çift
zincirli DNA, bazlar arası bağlar koparak tek
zincir haline gelir). Bu aşamadan sonra naylon
membran, 80°C’ye kadar ısıtılarak, tek
zincirlerin membran üzerine sabitlenmesi
(fiksasyon) sağlanır.
6) Hibridizasyon: Naylon membran önce, prehibridizasyon çözeltisi içinde 60-65°C’de 2-4
saat kadar tutulur; sonra yıkanır. Bu aşamadan
sonra, membran üzerine işaretli DNA prob
(veya RNA prob) ilâve edilir.
Problar 32P (veya biyotinle) işaretli olabilir.
Membran üzerine konulan tek zincirli ve işâretli
prob, kendine komplementer olan tek zincirli
hedef DNA segmenti ile non-kovalent bağlarla
karşılıklı olarak birleşir ve çift zincirli DNA x
DNA dubleksi (eğer RNA prob kullanılırsa DNA
x RNA dubleksi) oluşur. Hibridizasyon
gerçekleşir.
Bu işlem bir gece kadar sürdükten sonra,
membran yıkanarak, birleşmemiş olan tek zincir
hedef DNA sekansları ve bağlanmamış olan tek
zincir problar uzaklaştırılır ve böylece membran
üzerinde sadece çift zincirli sekanslar kalır.
7) Otoradyografi: Naylon membran üzerine, Xışınlarına duyarlı bir film (Kodak XAR-2) kapatılarak 70°C’de bir gece tutulur ve radyoaktivitenin filmi
etkilemesi sağlanır.
Bu sürenin sonunda film banyo edilir. Bu film üzerinde,
işaretli problarla birleşmiş hedef DNA sekanslarının
bulunduğu bölgeler siyah renkte görülürler. Bu
bölgeler, aranılan etkene ait spesifik genin lokalize
olduğu yerleri ifade eder. Böylece, aranılan hedef gen
bulunur ve teşhis konulur.
Eğer probları işâretlemede biotin kullanılmış
ise, avidin, peroksidaz ve kromojen madde
yardımı ile oluşan renk değişikliği, aranılan
hedef DNA segmentinin bulunduğu yerleri
gösterir.
2. Northern Blot Hibridizasyon
Bu teknik genelde, Southern blotting yöntemine
benzer. Ancak, DNA yerine mRNA, viral RNA veya
total RNA kullanılır. Buna göre, RNA’nın agarose jel
üzerinde ayrılması, filtreye transferi, spesifik probla
(RNA veya DNA) hibridizasyonu ve otoradyografisi,
Northern Blot Hibridizasyonu olarak adlandırılır. Bu
teknik, genlerin transkripsiyon düzeyinde iken
analizlerini yapmada, doku veya organlardaki mRNA
seviyesini belirlemede ve viral RNA’lar arasındaki
farkın tespitinde kullanılır.
Southern blottinge benzeyen bu teknikte
RNA’ların restriksiyon enzimleri ile kesimi işlemi
yoktur. Bu aşama atlanıldığı için zamandan ve
maliyetten önemli tasarruf sağlanmaktadır.
Northern blot hibridizasyonunun başlıca safhaları
özetle:
1) RNA’nın izolasyonu (total hücresel RNA, mRNA,
viral RNA, vs.).
2)
RNA’nın
elektroforezde
ayrılması.
3) RNA’ların naylon membrana transferi (Northern
transfer).
4) İşâretli DNA veya RNA problarıyla hibridizasyon.
5) Otoradiografı ile görüntüleme ve değerlendirme.
3. Dot Blot Hibridizasyonu
Bu yöntemde, genomik DNA segmentleri
hibridizasyondan
önce
elektroforetik
bir
ayrılmaya tabi tutulmaz.
Patolojik materyalden izole edilen nükleik asit
ekstrakte edilir ve konsantre edilir. Bu
aşamadan sonra örnekler iki veya 5 defa
sulandırılır. Her örneğe ait dilüsyonlardan
naylon veya nitroselüloz membran üzerine birer
damla damlatılır.
Burada denatürasyona tabi tutularak membran
üzerine fikse edilirler. Üzerlerine 32P işâretli
spesifik tek zincir problar ilave edilir. Bu
aşamadan sonraki işlemlere aynen Southern
blotting de olduğu gibi devam edilir. Film
üzerinde oluşan koyu lekeler hibridizasyon
bölgelerini ve dolayısıyla de aranan DNA
sekanslarını veya mikroorganizmaya ait
spesifik bazları gösterir.
4. İn situ Hibridizasyon
Bu teste infekte doku kültürleri, biyopsi
materyalleri, doku süspansiyonları, periferal
kan ve benzeri numunelerden bir damla lam
üzerine konur. Denatürasyondan sonra işâretli
(32P, biotin-avidin, vs.) cDNA prob ilâve edilerek
hibridizasyon sağlanır. Mikroorganizmaların
DNA’larının bulunduğu yerler kolayca belirlenir.
Bu test doku kesitleri ile de yapılabilir. Örnek,
infekte akciğer dokusu nötral formalinli tampon
içinde fikse edilir, parafinlenir ve ince kesitler (5
µm’lik) alınır. Kesitler parafinleri giderildikten
ve dehidrate edildikten sonra temiz bir lam
üzerine alınır ve üzerine biotinle işaretli cDNA
prob konur ve her ikisi birden denatürasyona
tabi tutulur (90°C’de 5 dakika).
Karışım 37°C’de 18-24 saat tutularak
hibridizasyon sağlanır. Sonra ortama
avidin-biotin peroksidaz kompleksi katılır.
Renk değişimi olan bölgeler aranan
mikroorganizma
DNA
segmentlerinin
bulunduğu yerlerdir.
Genomik hibridizasyon. Referans DNA yeşil bir florokrom ile (şekilde açık mavi) boyanır. Teste tabi
tutulan DNA şekilde koyu mavidir. Her iki DNA örneği karıştırılır ve insan DNA sekanslarıyla ya
soldaki gibi metafaz kromozomları üzerinde veya sağdaki gibi cam mikroarray lamında hibritleştirilir.
Test DNA’sında delesyonlar yeşil görülür (şekilde açık mavi verilmiştir) ve duplikasyonlar da kırmızı
hibridizasyonlar olarak verilmiştir (şekilde koyu mavi).
Hedef DNA’nın DNA SAM probu ile hibridizasyonu. DNA SAM
probunda tek ve çift zincirli kısımlar bulunmaktadır.
Nükleik asit hibridizasyonu. (A) Eğer DNA sarmalı iki zincire ayrılırsa,
uygun iyonik şartlar ve sürede zincirler tekrar birleşir (anneal). (B) Benzer
olarak, eğer DNA iki zincirine ayrıldıysa, RNA kodlanan ilgili genlere
bağlanabilmelidir.
Polimeraz Zincir Reaksiyonu
(PCR)
DNA’da yer alan, sekansı bilinen iki segment
arasındaki belirli bir bölgeyi enzimatik olarak
çoğaltmak için uygulanan reaksiyonlara verilen
ortak bir isimdir. Metod basitçe tüp içerisinde
nükleik asitlerin uygun şartlarda çoğaltılması
esasına dayanır.
z
z
z
94°C-98°C
aralığında
gerçekleştirilen
denatürasyon
37°C-65°C
aralığında
sentetik
oligonükleotidlerin hedef DNA'ya bağlanması
‘hibridizasyonu’
72°C’de gerçekleştirilen zincirin uzaması
‘polimerizasyonu’ (çift zincirli DNA’ların
sentezi) ve bu siklusların belirli sayıda
tekrarlanmasına dayanır.
Metodun temeli
Çoğaltılmak istenen bölgenin iki ucuna özgü,
bu bölgedeki baz dizilerini tamlayıcı bir çift
sentetik oligonükleotid primer (18-20 baz
uzunluğunda)
kullanılarak;
bu
zincirin
uzamasını (polimerizasyonu) (çift zincirli
DNA’ların sentezi) iki primer ile sınırlandırılan
genin enzimatik olarak sentezlenmesine
dayanır.
PCR tekniği, çok az miktarda DNA ile
çalışmaya imkân sağlamaktadır. PCR tekniği ile
laboratuvar teşhisinde çok büyük bir hız ve
kesinlik
kazanılmış;
bir
çok
durumda
radyoaktivite
kullanımını
gereksiz
hale
gelmiştir.
PCR KULLANIM ALANLARI
1.
2.
3.
4.
5.
6.
Kalıtsal hastaliklarda taşıyıcının ve hastanın
teşhisi.
Perinatal teşhisde.
Klinik numunelerde patojen organizmaların
teşhisinde.
Adlî tıp uygulamalrında.
Kanser araştırmalarında.
Probe'ların
oluşturulmasında/klonlamada/gen
ekspresyonu araştırmalarında.
DNA sekans analizinde, büyük miktarda DNA
örneklerinin oluşturulmasında.
8. Bilinmeyen sekansların tayininde.
9. Geçmiş DNA'nin incelenmesi ve moleküler
filogeninin aydınlatılmasında.
10. Restriksiyon Fragment Length Polimorfizm
RFLP) analizinde.
7.
11.
12.
İn vitro fertilizasyon yapılan tek hücrede,
implantasyon öncesi genetik testlerin
yapılmasi
ve
sonra
implantasyon
gerçekleştirilmesi ile bebeğin normal
doğmunun sağlanması.
DNA-protein etkileşmesinin araştırılmasında
(footprinting) kullanilabilir.
PCR CİHAZI
KAYNAKLAR
z
z
z
z
http://www.medicine.ankara.edu.tr/internal_medical/pediatrics/molgen/index.php?PgId=70
http://ansiklopedi.turkcebilgi.com/hibritleşme
http://www.agen.ufl.edu/~chyn/age4660/lect/lect_07/lect_07.htm
http://www.blackwellpublishing.com/korfgenetics/figure.asp?chap=0
6&fig=Fig6-25
• http://8e.devbio.com/printer.php?ch=1&id=32
•
http://www.nanonet.go.jp/english/mailmag/2005/053b.html
•
http://www.mikrobiyoloji.org/dokgoster.asp?dosya=110016200
•
http://evolution.berkeley.edu/evosite/history/genetsims2.shtml
• http://8e.devbio.com/printer.php?ch=1&id=32
•
http://www.nanonet.go.jp/english/mailmag/2005/053b.html
•
http://www.mikrobiyoloji.org/dokgoster.asp?dosya=110016200
z
http://escience.ws/b572/L22/L22.htm