AMİNO ASİTLER, PEPTİTLER VE PROTEİNLER II: Peptitler ve

AMİNO ASİTLER, PEPTİTLER VE PROTEİNLER II:
Peptitler ve Proteinler
1
Peptitler amino asitlerden oluşmuş zincirlerdir.
İki amino asit molekülü bir amit bağı ile kovalent olarak
birbirine bağlandıklarında bir dipeptit oluşur.
Bu bağın oluşumu için bir amino asidin α-karboksi grubundan
ve diğer bir amino asidin α-amino grubundan bir molekül suyun
ayrılması gerekir.
2
Peptit bağı oluşumu bir kondensasyon reaksiyonudur.
Biyokimyasal şartlar altında bu reaksiyonun dengesi amino asit
oluşumu yönündedir.
Reaksiyonun termodinamik olarak tercih edilir hale gelmesi için
karboksil grupları kimyasal olarak aktive edilmelidir.
Üç amino asit iki peptit bağı ile birbirlerine bağlandıklarında bir
tripeptit ve benzer şekilde dört amino asitten tetrapeptit ve beş amino
asitten pentapeptit oluşur.
Genellikle 8 ve üzeri amino asitten oluşan peptitler oligopeptit olarak
isimlendirilirler.
20 ve üzeri amino asitten oluşan peptitler ise polipeptit olarak
adlandırılırlar.
Üç boyutlu yapıya katlanarak bir fonksiyon gösteren polipeptitlere
protein adı verilir.
3
 Peptit yapısında yer alan bir amino asit birimi (amino grubundan bir
hidrojen atomu ve karboksi grubundan bir hidroksil molekülü
kaybetmiş olan kısım) genellikle amino asit kalıntısı olarak adlandırılır.
Uçta serbest bir α-amino grubu taşıyan amino asit kalıntısı amino
terminali veya N-terminali olarak, serbest bir α-karboksil grubu taşıyan
amino asit kalıntısına karboksi terminali veya C-terminali denir.
4
Peptitler zincirin her iki ucunda
serbest bir amino ve serbest bir
karboksil grubu taşırlar.
Bu gruplar pKa değerlerinin altında
ve üstünde farklı yüklenirler.
Ayrıca zincir içindeki iyonlaşabilen
yan gruplara sahip amino asit
kalıntıları da pKa değerlerinin altında
ve üstünde farklı yüklenirler.
Peptit bağı oluşumuna katılan
amino ve karboksil grupları ise yük
alamazlar.
5
Küçük peptitler oldukça düşük hücresel konsantrasyonlarda etkilerini
gösterirler.
Nonapeptit oksitosin ve bradykinin vücutta hormon olarak görev alır.
Pek çok antibiyotik peptit yapılıdır, ayrıca amanitin gibi mantar
zehirleri de küçük peptitlerdir.
Daha fazla amino asit sayısına sahip olan insulin ve glukagon
polipeptit hormonlarıdır.
Proteinlerin amino asit sayıları son derece farklılık gösterebilir.
Bazı proteinler tek polipeptitten oluşurken (çoklu alt üniteli),
diğerleri bir veya daha fazla polipeptidin kovalent olmayan bağlarla bir
araya gelmesiyle oluşmuştur.
Bir çoklu alt üniteli proteini oluşturan polipeptit zincirlerinden her
birine alt ünite adı verilir.
6
Bazı proteinler birbirlerine kovalent bağlarla (genellikle disülfit)
bağlanmış polipeptit zincirlerinden oluşmuştur.
Bu durumda proteini oluşturan her bir polipeptit alt ünite olarak
değil zincir olarak isimlendirilir.
Polipeptitler kuvvetli asitlerle ısıtılmak suretiyle tamamen
kendilerini oluşturan amino asitlere hidrolizlenebilirler.
Her bir polipeptit için elde edilen amino asitlerin bileşimi
karakteristiktir.
Ancak hidroliz tek başına yeterli değildir, bazı yan reaksiyonlar
nedeniyle bazı amino asitlerin tayini zordur.
Asparajin ve glutamin işlem sırasında aspartat ve glutamata
dönüşürken, triptofanın yan zinciri tamamen degrade olur. Serin,
treonin ve tirozinin küçük bir kısmı ise parçalanır.
7
Pek çok protein sadece amino asit kalıntılarından oluşmuştur.
Böyle proteinlere basit proteinler denir.
Ancak, bazı proteinler kalıcı olarak başka moleküllerle
birleşmişlerdir. Bu tür proteinlere konjuge proteinler adı verilir.
Konjuge amino asitler ağlanmış olan gruba bağlı olarak
lipoproteinler, glikoproteinler ve metaloproteinler gibi gruplara
ayrılabilirler.
Proteinler görevlerini yerine getirebilmeleri için üç boyutlu
yapıya katlanmak zorundadır.
Proteinler, üç boyutlu yapılarının incelenebilmesi amacıyla dört
temel yapıya ayrılırlar.
8
 Bir polipeptit zincirinde birbirine kovalent bağı ile bağlanmış
amino asit kalıntıları o polipeptidin primer yapısını oluşturur.
Primer (birincil) yapı için en önemli öge o polipeptidin amino
asit dizilimidir (sekuansıdır).
Sekonder (ikincil) yapı amino asitlerin birbirini tekrar eden
kararlı düzenlenmelere sahip olmasıyla ortaya çıkar.
9
Tersiyer yapı proteinlerin üç boyutlu yapıya nasıl
katlandıklarının bilgisini verir.
Bir protein birden fazla alt birimden oluşuyorsa bu alt
birimlerin boşluktaki yerleşimleri kuaterner yapıyı oluşturur.
Protein yapı ve fonksiyonu hakkındaki bilgilerimiz ayrı ayrı
proteinler üzerinde yapılan çalışmalardan elde edilmiştir.
Bir proteini ayrıntılı olarak çalışabilmek için
araştırmacıların bu proteini diğer proteinlerden
ayırabilmeleri gereklidir.
Proteinleri ayırmak için boyut, yük ve bağlanma
spesifikliği gibi proteinlerin farklı özelliklere sahip
olmasından yararlanılır.
10
Protein kaynağı genellikle bir doku veya hücredir.
Protein saflaştırma yöntemlerinin ilk basamağı hücrelerin
parçalanarak açılması ve içlerindeki proteinlerin çözeltiye
alınmasıdır.
Bu çözeltiye ham ekstrakt adı verilir.
Fraksiyonlama yapmak veya spesifik organelleri izole etmek
amacıyla kademeli (diferansiyel) santrifüj uygulanabilir.
 Dokular izotonik bir sükroz çözeltisi içinde mekanik olarak
homojenize edilir.
Küçük ve büyük moleküller farklı hızlarda santrifüj uygulanarak
birbirinden ayrılabilir.
Farklı yoğunluktaki molekülleri birbirinden ayırmak için farklı
yoğunluk gradyenti oluşturularak izopiknik santrifüj uygulanır
11
12
Ekstrakt veya organel hazır olduğunda içerdiği proteinlerden
bir veya daha fazlasını saflaştırmak üzere fraksiyonasyon işelmleri
uygulanır.
Bu amaçla pH, sıcaklık, tuz konsatrasyonu ve iyonik şiddetin bir
fonksiyonu olan protein çözünürlüğünden yararlanılarak tuzla
fraksiyonlu çöktürme kullanılır.
Genellikle amonyum sülfat kullanılarak proteinler fraksiyonlu
olarak çöktürülürler.
Bu amaçla protein içeren çözeltiye belli bir yüzde için
hesaplanmış olan amonyum sülfat miktarı katı olarak eklenir.
Farklı amonyum sülfat doygunluklarında farklı proteinler çöker.
13
Eğer amonyum sülfat ile çöktürme ile fraksiyonlama yapılmışsa
daha sonraki işlemleri bozacağı için tuzun uzaklaştırılması gerekir.
Bu amaçla diyaliz işleminden yararlanılır. Yarı geçirgen bir zar
kullanılarak proteinler tuz ve diğer küçük moleküllerden
kurtarılabilir.
14
Proteinleri fraksiyonlamak için kullanılan en güçlü yöntem
kolon kromotografisidir.
Uygun kimyasal özelliklere sahip porlu katı bir madde (sabit
faz) kolona doldurulur ve tamponlanmış bir çözelti (hareketli faz)
sabit fazın içinden geçer.
Örneği içeren çözelti kolonun yüzeyinden tatbik edilir ve mobil
fazla taşınarak kolonun içine doğru ilerler.
Kimyasal ve fiziksel özelliklerine göre sabit fazla en fazla
etkileşen moleküller en yavaş olarak ilerlerken, sabit fazla en az
etkileşen moleküller en hızlı olarak ilerler.
Benzer şekilde hareketli fazla etkileşimler de ilerlemnin hızını
tayin eder.
Bu şekilde farklı proteinler bantlar halinde elde edilir
15
16
17
 İyon değişim kromatografisinde belirli bir pH’da proteinlerin
farklı net elektrik yüküne sahip olmaları esasına dayanarak
ayırma yapar.
Ayırmayı optimize etmek için mobil fazın iyonik gücü kademeli
olarak arttırılır.
Jel geçirgenlik (moleküler elek) kromatografisinde proteinler
boyutlarına göre ayrılırlar.
Bu amaçla genellikle Sephadex olarak bilinen belirli büyüklükte
porlara sahip boncuklar sabit faz olarak kullanılır.
Affinite (ilgi) kromatografisi proteinleri bağlanma özelliklerine
göre ayırır.
İlgilenilen proteine spesifik olarak bağlanabilecek doğru dolgu
18
maddesinin seçimi son derece önemlidir.
En gelişmiş kromatografik
yöntemlerden birisi de
yüksek-perfromans sıvı
kromatografisidir (HPLC).
HPLC yönteminde yüksek
basınçlı pomplar ve çelik
kolonlar kullanılarak
deneme süresini ve deney
sonunda elde edilen
çözünürlüğü önemli ölçüde
arttırır
19
Proteinlerin ayrılmasında kullanılan bir başka önemli teknik,
yüklü proteinlerin bir elektrik alanda göç etmesi esasına dayanan
elektroforezdir.
Elektroforez, daha basit metotlar mevcut olduğundan dolayı
genellikle büyük ölçekli protein saflaştırılmasında kullanılmaz.
Ancak proteinlerin bir arada görünür hale getirilmesini ve
ayrılmasını sağladığından son derece önemli bir analitik
metottur.
En yaygın olarak kullanılan protein elektroforez metotu
Sodyum dodesilsülfat- Poliakrilamit jel elektroforezidir (SDSPAGE).
Bu yöntemde proteinler SDS tarafından eksi yükle kaplandıkları
için ayrım sadece proteinin molekül ağırlığına göre olur.
20
İki boyutlu SDS-PAGE yönteminde ise proteinler önce
izoelektrik noktalarına daha sonra ise molekül ağırlıklarına göre
ayrıldıkları için çözünürlük ve hassasiyet çok daha yüksektir.
21
Eğer bir enzim saflaştırılıyorsa, her bir saflaştırma
basamağından sonra, enzim aktivitesi ve toplam protein miktarı
belirlenir.
Bu iki miktar arasındaki oran spesifik aktiviteyi belirler.
Genellikle her bir saflaştırma adımında aktivite azalırken
spesifik aktivite artar.
22
 Bir proteinin saflaştırılması, yapı ve fonksiyon araştırmaları için ilk
basamağı teşkil eder.
 Bir proteinin primer yapısı o protein hakkında önemli bilgiler taşır.
Primer yapı bir proteinin kendisine özgü üç boyutlu yapıya nasıl
katlanacağının bilgisini taşır ve bu üç boyutlu yapı proteinin
fonksiyonunu belirler.
Farklı fonksiyonlara sahip olan proteinler farklı amino asit
dizilimlerine sahiptir.
İnsanlarda görülen binlerce genetik rahatsızlık hatalı proteinlerin
oluşmasıyla etkilerini gösterir. Bu hatalı proteinlerin üçte birinde amino
asit diziliminde sadece tek bir değişiklik vardır.
Farklı türlerdeki benzer görevli proteinlerin yapıları incelendiğinde
bu proteinlerin benzer amino asit dizilimlerine sahip oldukları görülür.
23
Bununla birlikte amino asit dizilimi her protein için sabit
değildir.
İnsanlardaki proteinlerin %20 ila %30’unun polimorfik olduğu
tahmin edilmektedir.
Polimorfik proteinler insandan insana farklı amino asit
dizilimlerine sahip olabilirler.
Polimorfik proteinlerde görülen sekuans farklılıkları genellikle
proteinin görevini yerine getirmesinde bir sorun teşkil etmezler.
Protein yapısında bazı bölgeler o proteinin üç boyutlu yapıya
katlanmasında çok önemli görevler aldıklarından korunmuşlardır.
24
Bir proteinin amino asit dizilimi kimyasal olarak tayin edilebildiği gibi
kendisine karşılık gelen genin nükleotid dizilimi kullanılarak da
aydınlatılabilir.
Günümüzde pek çok türe ait binlerce proteinin amino asit dizilimi
aydınlatılmıştır.
Amino terminal amino asidini tanımlanması için 1-floro-2,4dinitrobenzen (dinitroflorobenzen, DNFB, Sanger Reaktifi), dansil klorür
ve dabsil klorür gibi farklı reaktifler geliştirilmiştir.
Amino terminali reaktif ile işaretlendikten sonra peptit hidrolizlenir
ve işaretli olan amino asit tanımlanır.
Ancak bu yöntemlerle sekuans tayini yapılamaz çünkü hidroliz
basamağı peptidi parçalar.
25
26
Tüm bir polipeptidin dizi analizinin yapılması için Edman
degradasyonu metodu kullanılır.
Edman yöntemimde sadece N-terminal amino asidi koparılır ve
analiz edilir. Peptidin geri kalanı ise aynen korunur.
Peptit bir polimere tutturularak Edman sekuans analizinin
tamamen otomatik bir şekilde yapılması sağlanabilir.
Ancak yapısında 50’dan fazla amino asit içeren peptitlerin bu
yöntemle tayin edilmesi mümkün değildir.
Bu nedenle daha büyük proteinlerin yapısı aydınlatılmak
isteniyorsa, Edman degradasyonundan önce protein özel
yöntemlerle daha küçük parçalara ayrılır.
Bu amaçla öncelikle disülfit bağları kırılır, daha sonra spesifik
proteazlarla protein parçalanır.
27
28
29
 Proteazlar arasında sindirim sistemi enzimi tripsin polipeptit
bağlarını lizin ve arjinin amino asitlerinden keser.
Bu sebeple tripsin ile muamele edilmiş olan polipeptitten
oluşmuş olan parçalar tahmin edilebilirler.
Tripsin veya başka ajanlarca oluşmuş olan peptit parçaları
kromatografik veya elektroforetik yöntemlerle tayin edilebilirler.
İlk olarak tripsinle parçalama yapıldıysa farklı bir proteaz
kullanılarak ayrı bir parçalama denemesi gerçekleştirilerek peptit
parçalarının nasıl birleştikleri bulunur.
Eğer primer yapıda disülfit bağları içeren bir peptit söz konusu
ise bu disülfit bağlarının yerlerinin bulunabilmesi için disülfit
bağları kırılmadan tripsin ile muamele edilir.
30
31
Bir polipeptitin dizilimini bulmak için farklı yöntemler de
kullanılabilir.
Kütle spektrometreleri kullanılarak 20-30 amino asitten oluşan
peptitler 20-30 saniye gibi bir sürede analiz edilebilirler.
Hızlı DNA sekuans analizörlerinin gelişimi ile söz konusu
proteinin sentezlendiği genin analizi ile de protein dizilimi
belirlenebilir.
Ancak bu yöntemlerin uygulanabilir olması için ilgili proteinin
veya genin dizi analizinin daha önceden yapılmış olması
gereklidir.
Bu sebeple yeni keşfedilmiş bir proteinin analizinde doğrudan
analiz metotları kullanılmalıdır.
32
Bir organizmanın DNA’sının dizilimine o canlının genomu adı
verilir.
Farlı organizmalara ait genom bilgileri veri tabanlarında
mevcuttur.
Belirli bir organizmanın belirli bir zamanda sentezlediği
proteinlerin tamamına ise proteom adı verilir.
Proteom analizi genom analizine göre çok büyük zorluklar taşır
ancak bir organizmanın proteomunun aydınlatılması ile çok
önemli bilgiler elde edilebilir.
33
Pek çok peptit farmakolojik olarak önem taşır ve üretimleri
ticari bir öneme sahiptir.
Bu amaçla 3 farklı yöntem kullanılabilir.
Dokulardan peptitler izole edilebilir,
Genetik mühendisliği kullanılarak çeşitli bakterilere
ürettirilebilir veya,
doğrudan kimyasal sentezleri gerçekleştirilebilir.
Her yöntemin kendine göre avantaj ve dezavantajları vardır
ancak günümüzde kullanılan güçlü teknikler nedeniyle doğrudan
kimyasal sentez yöntemi önem kazanmaktadır.
34
35