GDM 203 06 - Ankara Üniversitesi Gıda Mühendisliği

GDM203
Genel Mikrobiyoloji
Prof. Dr. Kadir HALKMAN
Ankara Üniversitesi,
Gıda Mühendisliği Bölümü
2014/ 15 Güz Dönemi Ders notu 06
http://food.eng.ankara.edu.tr/index.php?p=622&l=1
EMS Devam
Çoklu tüp yöntemi EMS’nin standart
uygulanış şeklidir. Sonucun EMS
olarak verildiği başka mikrobiyolojik
analizler de vardır.
Hydrophobic Grid Membrane Filtration
ve Colilert sistemi bunlara örnektir.
HGMF 01
Hydrophobic Grid Membrane
Filter; ABD’de kullanılan özel
bir membran filtrasyon
sistemidir. 40x40 olmak
üzere filtrasyon alanı 1600
kareden oluşur. Karelerin
sınırında hidrofobik bir
ızgara sistemi vardır.
Filtrasyon sonunda hücre ızgara üzerinde
kalamaz, her koşulda ya alttaki ya üstteki ya
sağdaki ya da soldaki kareye geçer ve burada
koloni oluşturur. İnkübasyon sonunda koloniler
değil, pozitif kareler sayılır ve sonuç, özel bir
formül ile hesaplanarak EMS olarak verilir.
HGMF 02
1600 karenin her birinin alanı
yaklaşık 1,5 mm2 olup, aynı
kareye birden fazla canlı hücre
düşerse fark edilmesi mümkün
değildir.
FDA tarafından önerilen formül:
EMS: {N X ln [N / (N - A)]}
Burada N = membran filitre üzerindeki toplam kare
sayısı ve A = pozitif olarak sayılan kare sayısıdır.
Formüle göre toplam kare sayısının toplam negatif
kareye (N-A) bölünmesi ile elde edilen sayının e
tabanına göre logaritması (ln) toplam kare sayısı ile
çarpılmaktadır.
Colilert Sistemi
100 mL su numunesine steril dehidre besiyeri
ilave edilir, iyice karıştırılır. Böylece su
numunesi besiyeri haline gelmiş gibi olur (suya
süttozu ilave edip süt yapmak gibi). Bu karışım,
özel bir torbaya konulur, özel bir cihaz bu
torbayı 50 ya da daha farklı sayıda kuyucuğa
ayırır. İnkübasyondan sonra pozitif kuyucuk
sayısı özel bir çizelgeden yine EMS olarak
verilir.
Tanımlama (İdentifikasyon) 01
Mikroorganizmanın cins ve tür düzeyinde
tanımlanmasıdır (Escherichia coli). Bazen
sadece cins (Salmonella) bazen familya
(Enterobacteriaceae) tanımlama yeterlidir.
Tanımlama için ön koşul kültürün saf
olmasıdır. Önce koloni morfolojisi incelenir.
Küfler hifli yapıdaki kolonileri ile bakteri ve
mayalardan kolaylıkla ayrılır. Ancak yine de
mikroskopta inceleme gerekir. Bazı
bakteriler hifli yapıda koloni oluştururlar.
Tanımlama 02
Mikroskobik morfoloji için basit boyama
önerilir. Doğrudan Gram boyama yapmak da
mümkündür. Böylece bakteri/ maya/ küf ayrımı
kesinleşir. Bakteri ise Gram reaksiyonu, kok
ya da çubuk görüntüsü önemli ip uçları verir.
Kolonin elde edildiği besiyerinin selektif ya da
genel olması, inkübasyon koşulları (sıcaklık/
süre/ aerob/ anaerob inkübasyon) da önemli
bilgiler verir. VRB Agar besiyerinde 37 oC’ta 24
saat aerobik inkübasyon sonrası koyu kırmızı
renkli, 1-2 mm çaplı koloniler koliform grup
bakterilerdir.
Tanımlama 03
Eğer inkübasyon 44,5 oC’ta VRB Agar
besiyerinde aynı koşullar altında yapılmış olsa
idi aynı koloniler fekal koliformlar olarak
tanımlanacaktı.
Eğer inkübasyon 44,5 oC’ta
VRB Agar + MUG besiyerinde
aynı koşullar altında yapılmış
olsa idi aynı kolonilerden 366
nm UV lamba altında floresan
ışıma verenler doğrudan E.
coli olarak tanımlanacaktı.
Tanımlama 04
Tanımlamada mevcut kaynaklardan yararlanılır.
Bu amaçla çeşitli biyokimyasal ve fizyolojik
testler uygulanır.
Bakteri
İnd.
E. coli (tip 1)
Citr. freundii
+
–
–
+
+
+
–
–
–
–
–
+
+
+
–
+
+
–
Ent. aerogenes

–
+
+
–
–
Ent. cloacae
–
–
–
–
+
+
+
+
–
–
–
–
E. coli (tip 2)
Kleb. pneumoniae
MR VP Sit. 44,5 oC MUG
Tanımlama 05
Örneğin, besiyeri bileşiminde triptofan varsa
ve bakteri triptofanaz enzimine sahipse
triptofanı deaminasyona uğratarak, indol,
pirüvik asit ve amonyağa dönüştürür.
Besiyerine Kovacs’ ayıracı damlatıldığında
üstte en geç 1 dakika içinde vişne çürüğü
halka oluşması pozitif sonuçtur.
Bakterinin hareketli olup olmaması, belirli
pH’da gelişip gelişememesi gibi testler de
tanımlamada kullanılabilir.
Gram Boyama 01
Sadece bakterilere uygulanır. Bakteriler Gram (+)
ya da Gram (–) olarak ayrılır. Boyamanın esası,
hücre duvarındaki lipit miktarı farkıdır.
Mikroorganizmalarda lipitlere genellikle bileşikler
halinde rastlanır (lipoprotein, lipopolisakkarit).
Gram (+) bakterilerin hücre duvarı, bu
duvarın %95'ini oluşturan kalın bir peptidoglikan
tabakasından oluşmaktadır. Bu oran Gram (–)
bakterilerde %5-10'dur. Gram pozitifler,
negatiflere kıyasla hücre duvarında çok daha az
lipit içerirler.
Gram Boyama 02
Bakteri önce kristal viyole boyası ve iyot ile
boyanır. Hücre içinde boya ve iyot birleşerek
büyük kompleks oluşturur. Alkol ya da
uygun başka bir çözeltiye konulan bakteri
hücresinde yağ tabakası erir. Gram (+)’lerde
erime az olur ve eriyen bu boşluklardan
boya iyot kompleksi çıkamaz, mavi/ mor
renk korunur. Gram (–) olanlarda ise hücre
duvarında büyük boşluklar oluşur, boya iyot
kompleksi buradan dışarı çıkar. Bakteri bu
aşamada renksizdir.
Gram Boyama 03
İzleyen aşama herhangi bir kırmızı renkli boya
ile boyamaktır. Gram (+) olanlar mavi/ mor
rengini korurken Gram (–) olanlar kırmızıya
boyanır.
Gram boyamada işlem sürelerine dikkat
edilmelidir. Renksizlendirme uzun süreli
yapılırsa bazı Gram (+)ler, Gram (–) sonuç
verirler (Gram labil). Kültürün yaşı da önemlidir.
Bazı Gram (+)ler, yaşlandıkça hücre çeperlerinde
daha fazla yağ biriktirirler, Gram (–) sonuç
verirler (Gram varyabl).
Gram Boyama 04
Katı besiyerindeki koloninin Gram reaksiyonu
boyama yapılmadan da belirlenebilir. Yöntemin
esası, lam üzerinde 1 damla %3 KOH çözeltisi
içinde koloninin bir öze yardımı ile sürekli
karıştırılarak suspande edilmesidir.
Gram (+)lerde herhangi bir reaksiyon görülmez.
Gram (–)lerde ise hücre duvarı 3 KOH ile erir ve
arkasından bakteri DNA’sı KOH ile viskoz bir yapı
alır. Bu viskoziteye bağlı olarak özenin bu
karışımdan hafifçe yukarı çekilmesi ile bariz bir
sünme görülür. Bu reaksiyon, KOH Sündürme
Testi pozitif olarak değerlendirilir ve Gram (–)ler
için tipiktir. Standart yöntem değildir.
Hareket ve Hareket testi 01
Bazı bakteriler flagella
denilen organları ile hareket
etme yeteneğine sahiptir.
Flagella 1 adet olabileceği
gibi farklı sayılarda da
olabilir. Titreşim (Brownian
A: Monotrichous
hareket), gerçek hareket
B: Lophotrichous
değildir. Hareketlilik testi
farklı şekillerde yapılır.
C:Amphitrichous
İnkübasyon sıcaklığı kritiktir. D: Peritrichous
Hareket ve Hareket testi 02
Yumuşak agarlı besiyeri:
Tüpte %0,3-0,5 agarlı besiyeri hazırlanır. Bakteri
aşı iğnesi ile dik olarak tüpün ortasına ekilir ve
inkübasyona bırakılır. Bakteri hareketli ise tüpün
her yerinde, hareketsiz ise sadece daldırılan
yerde gelişir.
*Pozitif ve negatif şahit kullanılmalıdır.
*Bazı bakteriler 25-25 oC’ta hareketli, 35-37 oC’ta
hareketsizdir (Listeria monocytogenes).
Hareket ve Hareket testi 03
Flagella Boyama:
Özel bir teknikle bakteri boyanır ve varsa
flagellaları izlenir. 18-24 saatlik genç
kültürler kullanılmalıdır ve flagellanın
bakteriden kopmamış olmasına özen
gösterilmelidir.
Hareket ve Hareket testi 04
Asılı Damla Yöntemi:
Özel bir lam (çukur lam) kullanılır. 2-3 öze kültür
lamele aktarılır, üzerine çukur lam kapatılır, ters
çevrilip, mikroskopta incelenir. Boyama
yapılmadığı için görüntüyü almak deneyim
gerektirir. Ayrıca brownian hareket (titreşme) ile
gerçek hareket karıştırılmamalıdır.
Maya ve Küflerin Tanımlanması
Mayalarda tanımlama, bakterilerde olduğu
gibi mikroskobik inceleme, biyokimyasal ve
fizyolojik testlerle yapılır.
Küf tanımlamasında mikroskobik inceleme
ağırlıklıdır ve deneyimli bir uzmandan
öğrenilmelidir. Solda Aspergillus, sağda
Penicillium.