miRNA

MikroRNA'lar
ve
Anksiyete Bozuklukları
İlişkisi
Dr. Fikret Poyraz ÇÖKMÜŞ
Nazilli Devlet Hastanesi
21. TPD Yıllık Toplantısı ve KES, Antalya
1
Sunum Akışı
 Tarihçe
 Epigenetik Düzenlenme Nedir?
 Kodlanmayan RNA’lar ve miRNA
 OKB’de miRNA
 PTSB’de miRNA
 Panik Bozukluğunda miRNA
 Yeni Tedavi Seçeneği olarak miRNA’lar
21. TPD Yıllık Toplantısı ve KES, Antalya
2
DNA’nın Keşfi
 1953 yılında James Watson ile Francis
Crick DNA’nın çift sarmal yapısını
keşfettikten (1962 yılı Nobel ödülü)
sonra akıllara şu soru gelmiştir.
 Hücre
nükleusundaki
sitoplazmadaki
proteini
DNA,
nasıl
sentezliyor?
21. TPD Yıllık Toplantısı ve KES, Antalya
3
Santral Dogma Kavramı
 Francois Jacob, Jacques Monod ve
Andre Lwoff tarafından 1961 yılında
DNA’daki bilgilerin tek zincirli RNA yolu
ile sitoplazmada ribozomlarda protein
sentezine aktarıldığı keşfedildi.
 1965 yılında Nobel Tıp Ödülüne layık
görüldüler.
21. TPD Yıllık Toplantısı ve KES, Antalya
4
Santral Dogma
transkripsiyon
Proteinler
RNA
translasyon
DNA
mRNA
Bir Gen- Bir Ribozom- Bir Protein
21. TPD Yıllık Toplantısı ve KES, Antalya
5
Genetik Kodun Çözülmesi
 Non ribozomal kısa ömürlü t(RNA) lar
keşfedildi.
 Genetik kod kırıldı ve 20 aminoaside
ait kodonlar belirlendi.
 Marshall Nirenberg ve Gobin Khorana
1968 yılında Nobel Tıp Ödülü’nü
kazandılar.
21. TPD Yıllık Toplantısı ve KES, Antalya
6
mRNA Özellikleri
Uzun yıllar mRNA’nın kesintisiz bir şekilde
olduğu düşünüldü.
1977 de mRNA’nın genlerden kesintili bir
şekilde,
önce
pre-mRNA
olarak
sentezlendiği daha sonra da matur-RNA
şekline dönüştüğü keşfedildi.
21. TPD Yıllık Toplantısı ve KES, Antalya
7
Proteinler
Pre-mRNA
DNA
Matur-mRNA
Phillip Sharp
Richard Roberts
1993- Nobel Tıp Ödülü
Bir gen- pre-mNA- birçok mRNA- birçok protein
21. TPD Yıllık Toplantısı ve KES, Antalya
8
RNA bağımlı RNA polimerazlar
 Daha
sonra
bir
pre-mRNA’dan
birden
çok
mRNA
sentezlendiği keşfedildi.
 RNA kendi replikasyonunu katalize edebilir ve diğer RNA
molekülleri meydana gelir (1989 Nobel Kimya Ödülü).
 Bu keşiften sonra RNA’ların yeryüzündeki ilk genetik
materyal olduğu ve RNA’nın gen ekspresyonunda daha aktif
rol oynaması gerektiği düşünüldü.
21. TPD Yıllık Toplantısı ve KES, Antalya
9
Psikiyatrik Hastalıklarda Genetik
 Psikiyatrik hastalıklar gerek klinik, gerekse de genetik
açıdan kompleks bir yapı gösterirler. Psikiyatrik
hastalıklara yönelik yapılan genetik çalışmalardaki
temel
soru
işaretini,
psikiyatrik
hastalıkların
oluşmasında genetik faktörlerin ne kadar önemli bir rol
oynadığı, çevresel faktörlerin önemi ve saptanan
genetik değişimlerin nasıl ve ne düzeyde aktarıldığı
oluşturur.
21. TPD Yıllık Toplantısı ve KES, Antalya
10
Psikiyatrik Hastalıklarda Genetik
Yapılan çalışmalar sonunda gösterilmiştir ki
hastalık zincirini başlatan deoksiribonükleik
asitteki (DNA) mutasyon ya da polimorfizm
mekanizmaları olsa da gen ekspresyonunu
etkileyen mekanizmalar hastalık oluşumunda
daha etkin rol oynamaktadır
21. TPD Yıllık Toplantısı ve KES, Antalya
11
Epigenetik Nedir?
 Epigenetik tanımı ilk kez 1942 yılında Conrad
Waddington tarafından tanımlanmıştır.
 Günümüzde
ise
epigenetik
mekanizmalar,
DNA
dizisinde değişiklik olmaksızın, özel bir genomik
lokusun
veya
tüm
kromozomun
sonucunu
değiştirebilen moleküler mekanizmalardır.
21. TPD Yıllık Toplantısı ve KES, Antalya
13
Epigenetik Nedir?
 Epigenetik
mekanizmalar
gelişim
sürecinde
değişen çevre koşullarına bağlı olarak gen
ekspresyonunu aktive ederek ya da baskılayarak
bu etkiyi gerçekleştirmektedirler.
 Kısacası epigenetik aynı genom, farklı fenotip ve
farklı gen ekspresyonu olarak ifade edilebilir.
21. TPD Yıllık Toplantısı ve KES, Antalya
14
Epigenetik Neden Önemli?
 Psikiyatri ve genetik mekanizmaların araştırılmasında temel soru
işaretini, psikiyatrik hastalıkların etkeninin ne kadarında genetik
faktörler veya çevresel faktörlerin oluşturduğu, saptanan genetik
değişimlerin ne
kadarının nasıl
ve
ne
düzeyde
kalıtıldığı
oluşturmaktadır.
 Bugüne kadar yapılan bu konuda ki birçok çalışmada, aday
genlerdeki primer dizi değişiklikleri incelenmiştir. Ancak elde edilen
veriler klinik tabloları açıklamada yeterli olmamıştır.
21. TPD Yıllık Toplantısı ve KES, Antalya
15
Epigenetik Neden Önemli?
 Bu da, nedensel zinciri başlatanın DNA’daki mutasyon ya
da
polimorfizm
mekanizmaları
olsa
da,
gen
ekspresyonunu kontrol eden mekanizmaların hastalık
gelişim
sürecinde
etkisinin
yüksek
olduğunu
mekanizmasının,
RNA’nın
düşündürmüştür.
 Gen
ekspresyon
transkripsiyonundan proteinlerin translasyon sonrası
değişikliklerine kadar herhangi bir adımı ayarlanabilir.
21. TPD Yıllık Toplantısı ve KES, Antalya
16
Epigenetik Neden Önemli?
 Gen ekspresyonunun, başka bir deyişle genin ifade
edilmesinin
düzenlenmesindeki
önemli
mekanizmalardan birisi epigenetik değişimlerdir.
 Epigenetik bilginin bu kalıtılabilirliğinin yıllar boyunca
hücresel düzeyde kısıtlı olduğu düşünülürken, son
yıllarda epigenetik sürecin jenerasyonlar boyunca
kalıtılabildiği öğrenildi.
21. TPD Yıllık Toplantısı ve KES, Antalya
17
Epigenetik Düzenlenmeler Nelerdir?
 En sık bilinenleri transkripsiyonel düzenleme sağlayan DNA
metilasyonu ve histon modifikasyonudur.
 Son yıllarda önemi artan kodlanmayan RNA’lar (özellikle
miRNA’lar)
post-transkripsiyonel
epigenetik
düzenlenmelerdendir.
 Ayrıca diet, çevresel maruziyet, mikrobiyal enfeksiyonlar ve
ilaçlar da epigenetik mekanizmalar üzerinden etki gösterir.
21. TPD Yıllık Toplantısı ve KES, Antalya
18
Epigenetik ve Hastalıklar İlişkisi
 Kanser gelişiminde ve sürecinde epigenetik değişikliklerin (DNA
metilasyonu, kromatin modifikasyonu gibi) rol oynadığı uzun zamandır
bilinmektedir.
 SLE, RA ve MS gibi otoimmun hastalıklar, Otizm, Rett Sendromu,
Alzheimer ve Hunthington hastalığında,
 Obezite, hipertansiyon ve gestasyonel diabet gibi metabolik hastalıklar,
 Prader-Willi, Angelman ve Silver Russell sendromunda,
 Şizofreni, depresyon ve diğer psikiyatrik hastalıklarda epigenetik
değişiklikler önemli rol oynadığı bilinmektedir.
21. TPD Yıllık Toplantısı ve KES, Antalya
19
Kodlanmayan RNA’lar ve miRNA’lar
 İnsan RNA’sının küçük bir kısmını mRNA oluştururken
(rRNA,tRNA gibi) geri kalan büyük kısmını kodlanmayan
RNA’lar (ncRNA) oluşturmaktadır.
 Burada kodlanmayandan kasıt protein kodlamayan
anlamındadır (translasyon yapmayan).
 Kodlanmayan RNA’lar eğer 200 nükleotidden büyükse
long ncRNA ismini alır.
21. TPD Yıllık Toplantısı ve KES, Antalya
20
21. TPD Yıllık Toplantısı ve KES, Antalya
21
21. TPD Yıllık Toplantısı ve KES, Antalya
22
miRNA’ların Keşfi
 İlk kez 1993 yılında Caenorhabditis
elegans’da Lee ve ark. tarafından
tanımlandı.
 İlk tanımlanan miRNA
 lin-14
geninin
lin 4
mRNA’sının
3’UTR
bölgesine bağlanarak işlevini düzenler.
21. TPD Yıllık Toplantısı ve KES, Antalya
23
miRNA’ların Keşfi
 Daha sonra 2000 yılında Reinhart ve ark. tarafından let-7
tanımlandı.
 let-7’nin C. Elegansta lin-41, lin-28, lin-42 ve daf-12 mRNA’
larının fonksiyonlarını baskıladığı anlaşıldı.
 Daha sonra Pasquinelli ve ark. tarafından 2003 yılında let7’nin tüm canlılarda ortak olduğu gösterildi.
 Şu ana kadar insanlarda binden fazla miRNA tanımlanmıştır
ve sayıları gittikçe artmaktadır.
21. TPD Yıllık Toplantısı ve KES, Antalya
24
miRNA’ların Sentezi
Dizilerin
ayrılması
Tek zincirli
matur miRNA
Genomik DNA’da
miRNA geni
Translasyonu baskılanmış
mRNA
RISC içinde miRNA hedef RNA ya bağlanır ve
protein sentezini inhibe eder ve/veya mRNA
degredasyonunu indükler
21. TPD Yıllık Toplantısı ve KES, Antalya
25
miRNA’ların Sentezi
 miRNA‘lar ilk olarak çekirdekte RNA polimeraz II tarafından, 100-1000
nükleotid uzunluğunda, 3’ şapka ve 5’ poliA kuyruğa sahip, çift iplikli ilmek
(loop) halinde primer mikroRNA transkriptleri (primiRNA) olarak
sentezlenir.
 Sonrasında Drosha adı verilen bir nükleer RNAaz III enzimi, DiGeorge
sendromu kritik bölge protein 8 (DGCR8) ve başka kofaktörlerle birlikte,
mikroişlemci
kompleksini
oluşturur
ve
primiRNA’lardan
60-70
nükleotidden daha uzun pre-miRNA’ların oluşumunu sağlar
21. TPD Yıllık Toplantısı ve KES, Antalya
26
miRNA’ların Sentezi
 Daha sonra Eksportin 5/RanGTP, pre-miRNA’nın çekirdekten
sitoplazmaya taşınmasını sağlar. Sitoplazmada tip III RNAaz olan
Dicer ve onun kofaktörü TRBP (transactivator RNA binding protein)
aracılığıyla yaklaşık 18-24 nükleotid uzunluğunda miRNA-miRNA
dubleksleri oluşur.
 Dicer memelilerde argonaute2 tarafından desteklenir. Argonaute2
pre-miRNA’ların 3’ ucunu keser ve matür miRNA’ların oluşumu
gerçekleşir. miRNA’ların sağ iplikçiği RISC (RNA-induced silencing
complex) içinde depolanır, diğer iplikçik ise salınır ve yıkılır.
21. TPD Yıllık Toplantısı ve KES, Antalya
27
miRNA - mRNA Etkileşimi
Her özgün miRNA hedef mRNA’larını
tanıdıktan sonra iki şekilde işlev görür;
1. Translasyonun
baskılanması
(nadiren
artması)
2. mRNA’nın parçalanması
21. TPD Yıllık Toplantısı ve KES, Antalya
28
21. TPD Yıllık Toplantısı ve KES, Antalya
29
miRNA Özellikleri
 Hücrede oluşan mRNA miktarını ve stabilitesini
etkilemezler; translasyon regülasyonunu düzenlerler.
 Translasyonel uzama-sonlanma veya protein stabilitesi
miRNA’lardan etkilenir.
 Bazı mRNA’lar birden çok miRNA bağlanma bölgesi
içerir. Her bağlanma ile translasyon seviyesi azalır.
21. TPD Yıllık Toplantısı ve KES, Antalya
30
miRNA Özellikleri
 mRNA’lar, çok sayıda farklı miRNA’ yı bağlayabilir.
 Hücre içinde ve serum, plazma, idrar, süt gibi
diğer vücut sıvılarında da bulunur.
 miRNA’ların 10000’den fazla genin ekspresyon
düzeyini etkileme kapasitesine sahip oldukları
bilinmektedir.
21. TPD Yıllık Toplantısı ve KES, Antalya
31
miRNA’ların Adlandırılması
 mir pre-miRNA formunu, miR ise olgun miRNA
formunu temsil eder.
 miRNA’lar başlarına ait oldukları türlere göre isim alır.
Örneğin hsa-miR-488 (hsa=homo saphiens)
 İki
olgun
miRNA
ayni
pre-miRNA’nın
karşılıklı
kollarından köken alırsa ilgili dizinin ucuna göre -3p
veya -5p son eki alır. Örneğin hsa-miR-488-3p/5p
21. TPD Yıllık Toplantısı ve KES, Antalya
32
miRNA’ların Fonksiyonları
 2005 yılında Giraldez ve arkadaşları zebra
balığında
DICER
proteini
yokluğunda
özellikle beyinde bir takım anormallikler
olduğunu göstermişler.
 Bu
balıkların
beyinlerinde
ventrikül
hacimlerinde azalma, asimetri ve beyin
bağlantılarında kayıp olduğu gösterilmiş.
21. TPD Yıllık Toplantısı ve KES, Antalya
33
miRNA’ların Fonksiyonları
 Farelerde DICER delesyonu varlığında artmış lateral
ventrikül hacmi, dendritik dallanmada azalma, hızlanmış
hücre ölümü, aksonal iletimde yavaşlama gözlenmiş.
 miRNA sentezinin, beynin normal gelişimi için çok önemli
olduğu bu çalışmalardan sonra anlaşılmıştır
 Bu nedenlerden dolayı son yıllarda beyinde bu kadar
önemli rol oynayan miRNA’ların psikiyatrik hastalıklarda da
önemli bir rol oynadığı düşünülmüştür.
21. TPD Yıllık Toplantısı ve KES, Antalya
34
miRNA’ların Fonksiyonları
Hücresel çoğalma ve farklılaşma,
Apopitozis,
Hareket,
Sinaptik plastisite,
Nörogenezis
21. TPD Yıllık Toplantısı ve KES, Antalya
35
miRNA’ların Psikiyatride Yeri
 Sıklığı son yıllarda artmak üzere psikiyatride bir çok miRNA
çalışması
yapılmıştır.
Bunlardan
bazıları
RT-PCR
ve
mikroarray yöntemleriyle yapılan ekspresyon çalışmaları ile
SNP (tek nükleotid polimorfizmi) ve CNV’yi (kopya sayısı
değişimi) tanımlayan genetik assosiyasyon çalışmalarıdır.
 İlk zamanlarda hayvan çalışmaları sıklıkla yapılmış olsa da
son yıllarda insan çalışmaları artmıştır.
21. TPD Yıllık Toplantısı ve KES, Antalya
36
miRNA’ların Psikiyatride Yeri
 Postmortem
beyin
dokusunda
miRNA
ekspresyonun
değiştiğini göstermek en kesin yöntem olmakla beraber;
son yıllarda periferik dolaşımdan, tükürükten ve idrardan da
miRNA ekspresyonlarına bakılabilmektedir.
 Çalışmalar daha çok şizofreni, uni/bipolar depresyon ve
otizm üzerine yoğunlaşmıştır. Anksiyete bozukluklarına
üzerine yapılan çalışmalar kısıtlıdır.
21. TPD Yıllık Toplantısı ve KES, Antalya
37
21. TPD Yıllık Toplantısı ve KES, Antalya
38
21. TPD Yıllık Toplantısı ve KES, Antalya
39
21. TPD Yıllık Toplantısı ve KES, Antalya
40
Anksiyete Bozukluklarında
miRNA Çalışmaları
21. TPD Yıllık Toplantısı ve KES, Antalya
41
21. TPD Yıllık Toplantısı ve KES, Antalya
42
21. TPD Yıllık Toplantısı ve KES, Antalya
43
21. TPD Yıllık Toplantısı ve KES, Antalya
44
21. TPD Yıllık Toplantısı ve KES, Antalya
45
Obsesif-Kompulsif Bozuklukta
miRNA Çalışmaları
21. TPD Yıllık Toplantısı ve KES, Antalya
46
21. TPD Yıllık Toplantısı ve KES, Antalya
47
21. TPD Yıllık Toplantısı ve KES, Antalya
48
Örneklem ve Sonuç
 Çalışmanın örneklemini 23 OKB tanılı çocuk ve
ergen hasta ile 40 sağlıklı çocuk ve ergen
oluşturmuş.
 7 adet miRNA çalışılmış.
 miR-22-3p, miR-24-3p, miR-106b-5p, miR-125b5p ve miR-155a-5p’nin ekspresyonları OKB tanılı
grupta istatistiksel anlamda yüksek bulunmuş.
21. TPD Yıllık Toplantısı ve KES, Antalya
49
Travma Sonrası Stres
Bozukluğunda
miRNA Çalışmaları
21. TPD Yıllık Toplantısı ve KES, Antalya
50
21. TPD Yıllık Toplantısı ve KES, Antalya
51
Örneklem ve Sonuç
 24 erkek asker emeklisi çalışmanın örneklem
grubunu oluşturmuş.
 15 tanesinde travma sonrası stres bozukluğu
saptanmış.
 TTSB grubunda sağlıklı kontrole göre 8 adet
miRNA ekspresyonunda upregülasyon saptanmış.
21. TPD Yıllık Toplantısı ve KES, Antalya
52
Panik Bozukluğunda
miRNA Çalışmaları
21. TPD Yıllık Toplantısı ve KES, Antalya
53
21. TPD Yıllık Toplantısı ve KES, Antalya
56
Örneklem Grubu ve Uygulama
 Tanısı SCID-I klinik görüşmesi ile konulan, eksen I’de başka bir
psikiyatrik tanısı olmayan 35 panik bozukluğu hastası ile 35 sağlıklı
kontrol çalışmanın örneklem grubunu oluşturdu.
 Psikotrop ilaç kullanımı dışlandı.
 GABA ve 5-HT genlerini düzenleyen 17 adet
miRNA periferik
kandan çalışıldı.
 Sosyodemografik veri formu her iki gruba, Panik Bozukluğu Şiddet
Ölçeği sadece panik bozukluğu grubuna uygulandı.
 Her iki gruptan 2 tüp periferik venöz kan örneği alındı.
21. TPD Yıllık Toplantısı ve KES, Antalya
57
Çalışmanın Hipotezleri
 Panik bozukluğu ve sağlıklı kontrol grubu arasında
miRNA ekspresyon düzeyleri arasında fark vardır
 Panik bozukluğu şiddeti ile miRNA ekspresyon düzeyleri
arasında korelasyon vardır
 Panik
bozukluğu
tanısında
miRNA’lar
periferik
biyobelirteç olarak kullanılabilecektir (ROC analizi ile)
21. TPD Yıllık Toplantısı ve KES, Antalya
58
Gruplar Arası miRNA Ekspresyonları
Upregüle
Downregüle
miR-1297
miR-26b-3p
miR-4465
let-7a
miR-488-3p
miR-4458
miR-98-5p
miR-203a-3p
21. TPD Yıllık Toplantısı ve KES, Antalya
59
Sonuçlar
 Gruplar arasında miR-1297 (p=0.002) ve miR-4465 (p=0.01)
ekspresyonları istatistiksel olarak anlamlı düzeyde farklı
bulundu.
 PBŞÖ
alt
maddeleri
ve
toplam
puanı
ile
miRNA
ekspresyonları arasında korelasyon saptanmadı.
 Yaptığımız ROC analizleri sonucunda miR-1297 ve miR4465’in henüz ideal bir biyomarker özelliği taşımadığı
sonucuna varıldı.
21. TPD Yıllık Toplantısı ve KES, Antalya
60
miR-1297/miR4465 Etkilediği Gen Bölgeleri
miR-1297
miR-4465
GABRA4
GABRA4
GABRB2
GABRB2
GEN BÖLGELERİ
GABRB3
GABRG1
Çalışmanın Kısıtlılıkları
 Örneklem grubu sayısının yetersizliği,
 Periferik kan alımlarının saatinin aynı olmaması, kan alındığı esnada
açlık/tokluğa dikkat edilmemesi,
 Yeterince sayıda miRNA ile çalışılmaması,
 Kronik hastalık (örn: DM,HT, astım) ve kullanılan diğer ilaçların
dışlanmamış olması,
 Eşik altı depresyon ve anksiyete bulgularının göz ardı edilmesi olarak
sayabiliriz.
21. TPD Yıllık Toplantısı ve KES, Antalya
62
Çalışmanın Üstünlükleri
 Hasta örnekleminin sadece panik bozukluğu tanılı
olması,
 Çalışmada kullanılan miRNA’ların panik bozukluğu
etyolojisinde rol oynayan GABA ve 5-HT gen
bölgelerini düzenleyen miRNA’lardan seçilmiş
olması,
 Psikotrop kullanımının dışlanması,
21. TPD Yıllık Toplantısı ve KES, Antalya
63
miRNA Çalışmalarının Kısıtlılıkları
 Seçilen hasta gruplarında eş tanı oranları çok yüksek.
 Çalışmalarda psikotrop veya diğer ilaçların kullanımı dışlanmadığından ilaç
kullanımının ekspresyon üzerine etkisi dışlanmıyor.
 Şu ana kadar izlem çalışması yok.
 Hasta örneklem sayıları az.
 miRNA
ekspresyon
seviyelerini
nelerin
etkilediği
tam
olarak
bilinmemekte… (diet?, BKI?, cinsiyet?, yaş?)
 Çalışmaların maliyeti oldukça yüksek.
21. TPD Yıllık Toplantısı ve KES, Antalya
64
Epigenetik Tedavi
 Epigenetik
mekanizmaların
reversible
olması
onları önemli tedavi seçenekleri haline getirmiştir.
 Epigenetik ilaç geliştirme çalışmaları tıbbın her
alanında devam etmektedir.
 Bu çalışmaların ürünü olarak histon deasetilaz
inhibitörü Vorinostat (Zolinza®) kutanöz T hücreli
Lenfoma tedavisinde FDA onayı almış bir ilaçtır.
21. TPD Yıllık Toplantısı ve KES, Antalya
65
Epigenetik Tedavi
 Günümüzde bir çok ilaç bu alanda denenmektedir
ve çok yakın bir zamanda epigenetik değişiklikler
nedeniyle meydana çıkan bir çok hastalığın
tedavisinde; (örneğin şizofreni, bir çok kanser
türü gibi) miRNA inhibitörleri, yeni tedavi ajanları
olarak umut vaat etmektedirler.
21. TPD Yıllık Toplantısı ve KES, Antalya
66
Psikiyatrik Hastalıklarda miRNA’yı Neden
Araştırıyoruz?
Tanı koymada
Tedaviye yanıtı değerlendirmede
Farmakolojik tedavi
Gen tedavisi
21. TPD Yıllık Toplantısı ve KES, Antalya
67
Psikiyatrik Hastalıklarda miRNA’yı Neden
Araştırıyoruz?
Dikkatiniz ve sabrınız için
teşekkür ederim.
21. TPD Yıllık Toplantısı ve KES, Antalya
69