12/12/13 Hücre Bölünmesi ve Kontrolü Tıbbi Biyoloji Anabilim Dalı Erciyes Üniversitesi Tıp Fakültesi GENERASYON ZAMANI 12 Aralık 2013 BÜYÜME Hücre siklusu BÖLÜNME mitoz ve mayoz Doç. Dr. Metin Aytekin Deniz kestanesi ve embriyonik hücrelerde bir kaç dakika Bitkilerde genellikle 10-30 dakika Hayvanlarda 18-24 saat Insan hücre kültüründe 24 saat HÜCRE BÖLÜNMESİ İNTERFAZ • Tek hücreli canlıların çoğalması G1 M ito z z ne ki ito S Mİ (M) TOZ EVR ESİ S (DNA sentezi) G2 • Çok hücreli canlıların büyüme, gelişme ve çoğalması hücre bölünmesiyle olur. • Hücre bölünmesi için belli bir büyüklüğe erişmesi gerekir. • Hücre bölünmesi hücrelerin çoğalması ve eşeysel üreme için gametlerin oluşumunu sağlar. • Temel nokta: DNA nın replikasyonu ve Sitoplazma bölünmesidir. • Prokaryot ve Eukaryot hücrelerde temelde aynıdır. Ancak bazı farklılıklar vardır. Prokaryotlarda Bölünme DNA sitoplazmaya değer 1. Prokaryotlarda bölünme daha hızlıdır 2. DNA halkasaldır. 3. İki halkasal DNA meydana gelir, hücre zarı ve çeperine değdiği noktadan hücre duvarı boğumlanarak sitoplazma bölünmesi olur. 4. DNA replikasyonunda kısalıp, kalınlaşma ve yoğunlaşma yoktur bölünmeye başlar Sitoplazma bölümeye başlar Hücre tamamen bölünür 1 12/12/13 Prokaryotlarda bölünme Ökaryotlarda bölünme Halkasal kromozom Birbiri ile aynı iki Yavru hücre Ökaryotlarda bölünme Nükleus Birbiri ile aynı Iki haploit Yavru hücre Mitoz bölünme (diploit hücrelerde) • DNA replikasyonu hücre siklusunun belirli evrelerinde olur. • Her organizmanın hücre bölünmesi farklı sürelerde olur • DNA materyali yavru hücrelere eşit olarak aktarılır. • DNA sentezi devamlı değildir. Hücre Döngüsü Fazları (evreleri) Birbiri ile aynı Iki diploit Yavru hücre Haploit yavru hücreler Mayoz bölünme Mayosit İnterfaz { { • • • • G1 (gap 1) S (sentez) G2 (gap 2) G1 M (mitoz) S MİTOZ BÖLÜNME 1. Karyokinez 2. Sitokinez G2 Sitoplazmik Kontrol M evresi -- G1 evresi: G1 M evresi -- S evresi: M evresi -- G2 evresi: M M G1 kromozom S S M sentromer Kromatit Kromatit G2 G2 G1 - S - G2 deki nükleusun yoğunlaşması M evresi hücrelerinin sitoplazması mitotik olayları uyaran faktörler içerir! 2 12/12/13 G1 (Gap) Evresi • RNA ve protein sentezlenir. S (Sentez) Evresi: • RNA sentezi devam eder. • Fakat DNA sentezi henüz yoktur • Zaman olarak en değişken olanıdır ve memelilerde yaklaşık 11 saat sürer • Protein sentezi en yüksek seviyeye çıkar. • Çok sayıda replikasyon orijini aktive olur. • Hücreyi bölünmeye iten proteinler aktive olur (büyüme faktörleri) • DNA sentezi başlar ve iki misline çıkar • Büyüme için şartlar uygun değilse siklus geçiktirilir ve hücre G0’a girer. • Sentrozom (sentrioller) kendini eşlemeye başlar. G2 (Gap=Aralık) Evresi: M evresi • Kromozom kondensasyonu ve mitoz için hazırlık aşamasıdır. • Profaz, Metafaz, Anafaz, Telofaz evreleri vardır. • Yoğunlaşan kromozomlar mikroskop altında görülebilir. • Mitotik ipliklerin oluşumu ilk sinyallerdir. • Yaklaşık 1-4 saat arasında sürer. • DNA sentezi durur, RNA ve protein sentezi devam eder. • Sentrozom dublike olur • Sentrozom dublikasyonu tamamlanır. • Organeller çoğalır, iki katına çıkar • Mitozu aktive edecek proteinler birikir. • Sitokinez meydana gelir • Yavru kromozomlar meydana gelir Go evresi: • Hücrelerin G1 evresinde kaldığı ve büyümelerinin durduğu evredir. • Metabolik aktiviteye sahiptirler. • Uygun hücre-dışı sinyaller tarafından uyarılmadıkça çoğalmazlar. Erken embriyonik hücre döngüsü Somatik hücre döngüsü Sinir hücresi 3 12/12/13 Restriksiyon noktası G2 M G1 G0 S Restriksiyon noktası Büyüme faktörleri • Büyüme faktörleri hücre döngüsünü geç G1 de restriksiyon noktası denilen noktada kontrol eder. • Bu noktada büyüme faktörleri yoksa hücre G0 denilen evreye girer. Bazı Büyüme Faktörleri • Trombosit kaynaklı büyüme faktörü (Platelet-derived Growth Factor) (PDGF): Bağ doku ve nöroglia hücrelerinin çoğalmasını uyarır. • Epidermal Büyüme Faktörü (EGF): Birçok hücre tipinin çoğalmasını uyarır. • İnsulin benzeri büyüme faktörü I (IGF-I): PDGF ve EGF ile birlikte çalışır, yağ hücreleri ve bağ doku hücrelerinin çoğalmasını uyarırlar. Restriksiyon noktası • G1 içindeki dönüşü olmayan noktanın aşılması büyüme faktörleri ve farklılaşma uyarıcıları gibi dış ve iç sinyallere bağlıdır. • Kanser hücreleri bu kontrolü kaybeder ve sürekli döngü içinde kalırlar. • R noktasının açılı S evresine girilmesi CDK’lar tarafından kontrol edilir. • Transforming Growth Factor –β • Transforme edici büyüme faktörü-beta; TGF-β: Diğer büyüme faktörlerine karşı birçok hücrenin cevabını güçlendirir. Hücre tipine göre hücrelerin farklılaşmasını düzenler. • Fibroblast büyüme Faktörü (FGF): Fibroblast, endotel hücreleri ve myeloblastların çoğalmasını uyarır. • Sinir büyüme faktörleri (Nerve Growth Factor) (NGF) : Bazı duyu ve merkezi sinir sistemi nöronların hayatta kalma süresini uzatır. • İnterlökin 2 : T lenfositlerinin çoğalmasını sağlar. Hücreleri petri kabına ektiğimizde bölünmeye başlarlar kesiciler Petri PDGF içermeyen PDGF İÇEREN Hücreler tek tabaka halinde bütün yüzeyi kapladıklarında hücre bölünmesi durur (yoğunluğa bağlı inhibisyon). Eğer bazı hücreler alınırsa, oluşan boşluğu doldurmak için o bölgedeki hücreler çoğalırlar PDGF içermeyen PDGF İÇEREN 10 mm Normal memeli hücreleri 25 µm 4 12/12/13 Kanser hücreleri normal Hücrelerdeki gibi yoğunluğa bağlı Inhibisyon göstermezler Hücre döngüsü zamanı nasıl hesaplanır? Colcemid (kolsemit) Metafazda durdurur Colcemid (kolsemit) 25 µm Kanser hücreleri Mikrotübüller 24. saat G1 evresi ne kadar sürer? • Kolsemit uzaklaştırılır Colcemid (kolsemit) G2 evresi ne kadar sürer? Hydroxyurea DNA sentezi • Bir çok hücre AYNI anda G1 fazında hareket eder • DNA sentezini inhibe eder ve hücreler DNA sentezi yapamayacağı için bu sefer G1 sonunda toplanır. • Anda radyoaktif TİMİN eklenir • Saat başı DNA ekstraktı hazırlanır ve TİMİN değer ölçülür S G1 1 G2 • TİMİN ölçümü başladığı zaman S evresine geçilmiş ve G1 bitmiştir. 7 8 • Hydroxyurea (Hidroksiüre) ekle (24 saat) • Hücreler hidroksiüre eklemeden önce her fazda bulunabilirler. S evresinde olanlar orada donup kalacaklar ileriye gidemeyecekler çünkü DNA yapamazlar. • Hidroksiüre alınıp Kolsemit eklenir ve devamlı mikroskop altında kromozomlardaki lekeler göründüğü zamana kadar geçen süredir G2 Hücre Döngüsünün Kontrolü ve Düzenleyicileri Hücre Döngüsünün Kontrolü ve Düzenleyicileri • Vücudumuzda 3x1013 hücre bulunur • Ortalama insan yaşamında 1016 hücre döngüsü olur. • Bu demektir ki her saniyede ortalama 107 hücre döngüsü gerçekleşmekte • Sadece şu cümleleri okurken 100 milyon civarında vücudumuzda mitoz geçirilmekte 5 12/12/13 Hasarlı DNA veya kusurlu DNA replikasyonu G2 DUR Kontrol noktaları DUR M Kromozom düzensizliği 2. Hücre siklusunda fazlar arası koordinasyonu sağlar G1 Amaç: Evrelerin düzgün bir sırada olmasını sağlamaktır. S 3. Mitoz bölünmede hücrenin metafazdan anafaza geçişini ve mitozdan çıkışını kontrol eder. Hasarlı DNA DUR 4. G2 kontrol noktasında genom tam replike olana kadar bekletir. DUR G1 Kontrol Noktası G1 Kontrol Noktası • Hücre büyüklüğü ve DNA hasarları olup olmadığı kontrol edilir. DUR G2 1. İnterfazda hasarlı DNA nın ve replikasyonu tamamlanmamış kromozomların yavru hücrelere geçişini engeller • Eğer şartlar uygun değilse p53 siklusu durdurur. Hücrenin G0’da durması sağlanır. DUR M G1 S DUR Hasarlı DNA nın S evresine girmeden onarılabilmesine olanak sağlar. • Büyüme faktörlerinin yokluğu ve kontak inhibisyonu gibi çevre şartları değişirse siklus tekrar başlayabilir. DUR S Kontrol Noktası S Kontrol Noktası DUR G2 DUR M • DNA replikasyonu sırasında yanlış baz eşleşmeleri ya da DNA bölümlerinin eksik replikasyonu gibi hataları bulma ve onarma şeklinde kalite kontrol görevi yapar. G1 Yanlış baz eşleşmeleri ya da DNA bölümlerinin eksik replikasyonu gibi hataları bulma ve onarma şeklide kalite kontrol eder. • Hasarlı DNA nın replike olmadan onarılması için DNA nın bütünlüğünü sürekli izler S DUR DUR 6 12/12/13 G2 Kontrol Noktası DUR G2 G2 Kontrol Noktası • S fazının tamamlanmadan mitozun başlamasını engeller. DUR M • M fazı işlemlerini uyarmak G1 S DUR S fazının Tamamlanmadan mitozun başlamasını engeller. • S fazında tam olarak replike olmamış DNA’yı tanımak • Hücre siklüsünü S fazında durduracak sinyali üretmektir. DUR G2 Kontrol Noktası-­‐2 M Kontrol Noktası • Bu sinyalin etkisiyle M fazı işlemleri uyarılmaz ve Mitozun başlaması engellenir • Metafazdan anafaza geçişi ve hücrenin mitozdan çıkmasını sağlar. • Genom tam replike olana kadar hücre G2 fazında bekler. • Genomun bütünlüğünü korur • DNA replikasyonu tamamlanınca G2 kontrol noktasının inhibisyonu ortadan kalkar ve hücre mitoza başlar • Mitotik iplikciğin kromozomun sentromer bölgesindeki kinetekora bağlanarak metafazdan anafaza geçişi ve kromozomların yavru hücrelere taşınmasını sağlar. • Yavru hücrelere hasarsız ve tam replike olmuş DNA dağıtılır. Hasarlı yada replike olmamış DNA Lisansing faktör (licensing Factor) mekanizması: Algılayıcı Proteinler • G2 noktasından S fazına geri dönüşü engeller Ataxia telangiectasia mutated • Bu mekanizma faktörün mitoz süresince kromozoma bağlı kalmasını sağlar. ataxia telangiectasia and Rad3-related protein ATM ATR Chk2 Chk1 • Bu faktör DNA replikasyon süresince inaktiftir. • M fazı boyunca nükleus zarı parçalanıncaya kadar nükleusa yeniden giremez. • Bir sonraki siklusun G1 fazına kadar DNA replikasyonu engellenir. • G2 kontrol noktası ayrıca irradyasyondan kaynaklanan DNA hasarına da duyarlıdır. Checkpoint kinase (Chk)2 Checkpoint kinase (Chk)1 Hücre döngüsünün durdurulması 7 12/12/13 DNA hasarı Chk2 ATM p53 düzeyi artar p53 G1’de durma Memeli hücrelerinin G1 noktasında Durması p53 proteini olarak adlandırılan bir protein aracılığı ile olmaktadır. Hücre Döngüsü Gelişiminin Düzenleyicileri Yoshio Masui DNA hasarı p53 düzeyinde artma p53 p21 mRNA p21 Proliferating Cell Nuclear Antigen Cdk’lar Hücre döngüsünün baskılanması PCNA DNA replikasyonunun baskılanması Hücre Döngüsü Gelişiminin Düzenleyicileri Clement Markert 1971 Hormonla uyarılmış kurbağa oositlerinin sitoplazmasını başka bir hücreye aktarmışlar Progesteron G2 p53 proteini Cdk inhibitörü olan p21’in ekspresyonunu uyarır. P21 proteini bir çok Cdk/Siklin kompleksini inhibe eder. • Oositler hormonla tetikleninceye kadar G2 evresinde duraklatılırlar. • Hormonla tetiklenince ise Mayozun M evresine girerler. • Olgunlaşmayı ilerleten faktör = Maturation promoting factor (MPF) • MPF nin somatik hücrelerde de bulunduğu tespit edilmiş • Mitoz bölünmede M evresine girişi uyarır • G2 den M evresine geçişte düzenleyici olarak davrandığı görülmüş Hücre Döngüsü Gelişiminin Düzenleyicileri M G2 M Sitoplazmanın mikroenjeksiyonu • Uyarı olmadan G2 evresinde dururlar • Hormonla uyarı ile G2 evresine geçerler • M evresine geçen hücrenin sitoplazması alınıp G2 evresinde başka bir hücreye enjekte edilir • Bu hücrenin de hormon olmadan da M evresine geçtiği gözlemlenir. • Tomurcuklanan maya Saccharomyces cerevisia ile çalıştılar. • Hücre döngüsü bozuk olan, sıcaklığa duyarlı mutantları tanımladılar (cdc) [cell division cycle]. • Ana karakteristikleri hücre döngüsünün belirli noktalarında büyümelerin durmasıydı. Lee Hartwell Nobel ödülü 2001 8 12/12/13 Hücre Döngüsü Gelişiminin Düzenleyicileri MPF’in keşfi • Deniz Kestanesi çalışmalarından ortaya çıktı. • SİKLİNLER (Siklin A (S evresinde) ve Sikin B (M evresine pik yapar)) • Schizosaccharomyces pompe ile çalıştılar. • Bu mutantlardan cdc2 S. pompe hücre döngüsünü hem G1 hem de G2’den M’e geçiste durdurur. • Her iki maya türünde de HEM START noktasına geçişte hem de MİTOZ’a girişte gerekli olduklarını gösterdi. Tim Hunt Nobel ödülü 2001 Paul Nurse Nobel ödülü 2001 İnterfaz Mitoz İnterfaz İnterfaz Mitoz Mitoz Zaman MPF’in Yapısı Olgunlaşmayı ilerleten faktör = Maturation promoting factor (MPF)’in keşfi • Deniz Kestanesi çalışmalarından ortaya çıktı. • Döllenmeyi takiben bu embriyolar bir seri hızlı hücre bölünmesine uğrarlar. • Tim Hunt isimli araştırmacı bu hücrelerde periyodik olarak biriken ve parçalanan iki protein tanımladı. • Bu proteinler interfaz boyunca birikip daha sonra her Mitozun sonunda parçalanıyorlar. • Hunt bu proteinler SİKLİNLER (Siklin A ve Sikin B) olarak isimlendirdi. MPF MPF, Siklin B ve Cdc2 protein kinazlardan oluşan bir dimerdir. MPF regülasyonu Siklin B 1 G Cdk Siklin B Thr 161 Thr 15 Siklin B Aktif MPF Cdc2 Siklin B Cdc2 M Siklin Yıkımı Mitoz Siklin Yıkılmaya başlar Siklin B sentezi Cdc2 Cdc2 Defosforillenme G2 G2 Cdk Kontrol noktası MPF lin accumulati on S Defosforillenme Cdc2 Cyc Thr 14 Fosforillenme Siklin SiklinB yıkımı Molecular mechanisms that help regulate the cell cycle 9 12/12/13 MPF’in Hedefleri MPF nin hücrede gerçeklemesini sağladığı olaylar MPF Siklin B 1. Kromatin yoğunlaşması Cdc2 2. Nüklear zarfın yıkılım 3. Mitoz iğciğinin oluşumu KromaPn yoğunlaşması Nükleer zarSn yıkılması Golgi ve ER’un parçalanması Kondensinlerin yoğunlaşması Laminlerin fosforillenmesi GM130’un fosforillenmesi İğ ipliği oluşmu 4. Golgi ve ER’un küçük veziküllere ayrışması Mikrotübül kararsızlığı Memeli Hücre Siklusunun Kontrolü Cdc2/Clb1, Clb2, Clb3, Clb4 Cdc2/Cln1, Cln2, Cln3 START Cdc2/Clb5, Clb6 Cdc2/CycB Cdk4, 6/CycD Maya ve Hayvan hücresinde Siklin ve siklin bağımlı kinaz kompleksleri M-phase Cyclins/Cdk G1-phase Cyclins/Cdks S-phase Cyclin/Cdk Restriksiyon noktası Cdk2/CycA Cdk2/CycE Hücre döngüsü kontrolünde 3 önemli faktör 123- Siklinler Siklin bağımlı kinazlar (cdk) Siklin bağımlı kinaz inhibitörleri Siklinlerin evrelere göre ekspresyonu G1/S-siklin S-siklin M-siklin Siklinler 1- Hücre döngüsünün temel regülatörüdürler 2- Siklinler cdk fosforilasyon ile aktive olurlar. 10 12/12/13 S-­‐Evresi Cyclin/Cdk Komplekslerinin AkZvasyonu Cdk düzenleme mekanizmaları Cyclin-Kinase Inhibitor (CKI) DNA replikasyonu başlamasının hücre hazırlanıncaya kadar S evresi Cyclin/Cdk komplekslerini tutar. (S-phase) G1 Cyclin/Cdk komplekslerinin artması CKI ların fosforlanmasına yol açar. S-phase Cyclin/Cdk kompleksleri DNA replikasyonunun başlamasını aktive eder D Zpi siklinlerin uyarılması Cdk İnhibitörleri Büyüme faktörleri Cdk İnhibitörleri İnhibitörler Cdk/Siklin kompleksi Etkilenen evre Ras/Raf/ERK (Büyüme faktörleri) Cip/Kip ailesi (p21, p27, p57) Ink4 ailesi (p15, p16, p18, p19) D Ppi siklin sentezi Cdk4/siklin D G1 Cdk6/siklin D G1 Cdk2/siklin E G1/S Cdk2/siklin A S Cdk4, 6/CycD Cdk4/siklin D G1 Restriksiyon noktası Cdk6/siklin D G1 G2 Kontrol Noktasının Denetimi Replikasyon tamamlanmış Replike olmamış veya hasarlanmış DNA Hücre döngüsünün Rb ve E2F ile düzenlenmesi Algılayıcı proteinler Algılayıcı proteinler Chk1 Chk2 ATM ATR Chk2 Chk1 Rb Cdk4, 6/SiklinD Rb ATM ATR E2F E2F Cdc25C Aktif P Cdc25C inaktif Siklin B Siklin B Cdc2 Cdc2 P inaktif MPF Aktif MPF Mitoza ilerlerme Siklin B Rb E2F Cdc2 E2F RNA P İnaktif MPF G2’de duraklama Transkripsiyon baskılanır S evresi genlerin transkripsiyonu 11 12/12/13 Kaynaklar • WormBook: hap://www.wormbook.org/chapters/www_cellcyclereguln/cellcyclereguln.html • Glossary: hap://www.histol.chuvashia.com/tab-­‐en/ccyc-­‐en.htm • Cancer Genome Anatomy Project: hap://cgap.nci.nih.gov/Pathways/BioCarta/h_cellcyclePathway • Tyson’s Generic Cell Cycle: hap://mpf.biol.vt.edu/research/generic_model/main/pp/index.php • Cells Alive: hap://www.cellsalive.com/cell_cycle.htm • Cell Cycle Tutorial: hap://www.biology.arizona.edu/Cell_bio/tutorials/cell_cycle/main.html Teşekkürler 12