ISO 9308-1 - mikrobiyoloji.org

ISO 9308-1 (2014) ve CCA
Prof. Dr. Kadir HALKMAN
Ankara Üniversitesi,
Gıda Mühendisliği Bölümü
09 Nisan 2015; Merck Millipore, İstanbul
Koliform Grup ve E. coli Analizi
Gıdalarda, çevre örneklerinde koliform grup ve
E. coli aranması ve sayılmasına ilişkin çok
sayıda standart yöntem vardır.
Devamında henüz standartlara geçmemiş ancak
sanayide yaygın şekilde kullanılan pek çok
uygulama da vardır.
Bu seminerde ISO 9308 ve CCA besiyeri
hakkında bilgi verilecektir. CCA, başka
analizlerde de kullanılabilir.
ISO 9308 – CCA (01)
TS EN ISO 9308-1, numaralı standart 2014 yılı
sonunda revize edilmiş ve koliform grup ve E. coli
analizleri için bir besiyeri sunulmuştur: Chromogenic
Coliform Agar (CCA). Bu standardın 9308-2 (EMS) ve
9308-3 (mikroplak) bölümlerinde değişiklik yoktur.
ISO’da geçen ismi ile Lactose TTC Agar with sodium
heptadecylsulfate ve CCA arasındaki en önemli fark
CCA’da E. coli ve diğer koliform bakterilerin çok açık
bir şekilde ayırt edilmesidir. Diğer besiyeri
bileşiminde böyle bir ayrımı sağlayacak bileşen
yoktur, dolayısı ile tüm koliformlar aynı renk ve
büyüklükte koloni oluştururlar.
ISO 9308 – CCA (02)
CCA’da E. coli ile diğer koliformların farklı renkte
koloni oluşturmasını sağlayan özellik tümüyle
enzimatik reaksiyonlardır.
Bütün koliform bakterilerde (Escherichia coli;
Enterobacter aerogenes; Enterobacter cloacae,
Citrobacter freundii ve Klebsiella pnemoniae)
bulunan ve laktozun kullanılmasını sağlayan ß-Dgalactosidase enzimi, CCA bileşimindeki SalmonGAL kromojenik substratını parçalayarak E. coli
dahil bütün koliform bakterilerin pembemsi kırmızı
koloni oluşturmasını sağlar.
ISO 9308 – CCA (03)
E. coli, diğer koliformlardan farklı olarak ß-Dglucuronidase enzimine sahiptir. CCA bileşimindeki
X-Glucuronide substratı bu enzim ile parçalanır ve
bu şekilde E. coli mavi/ mor renkte koloni oluşturur.
Bir diğer deyiş ile bu mavi/ mor renk, pembemsi
kırmızı rengi örter. Bu enzime sahip olmayan E. coli
O157:H7 sadece pembemsi kırmızı renkli koloni
oluşturur.
ß-D-glucuronidase enzimi, MUG reaksiyonlarında
da kullanılır. Enzim  Substrat
ß-D-galactosidase  laktozdan asit ve gaz
oluşumu.
ISO 9308 – CCA (04)
Kromojenik besiyerleri, karakteristik bakteriyel
enzimlerin, kromojenik substratlar aracılığı ile
belirlendiği hızlı tanımlama besiyerleridir. Besiyerinin
bileşimi bir yandan hedef bakterinin gelişmesini
özellikle desteklerken, diğer yandan karakteristik
enzimlerin optimum aktivite göstermesini sağlar.
Tanımlama, koloninin tipik rengi ile yapılır.
Kromojenik besiyerlerinde oluşan renk, besiyerine
difüze olmadığı için ışık, pH ve sıcaklık gibi
olumsuzluklardan etkilenmez ve sabit kalır.
Kromojenik olmayanlarda koloni rengi zamanla
değişebilir.
ISO 9308 – CCA (05)
Besiyeri bileşiminde bulunan seçilmiş peptonlar,
piruvat ve fosfat tampon, ağır hasar görmüş/ stres
altındaki koliform bakterilerin kendilerini onarmalarını
sağlarken tergitol-7, Gram pozitiflerin ve bazı Gram
negatiflerin gelişimini baskılar.
CCA, düşük selektiviteye sahip bir besiyeridir.
Dolayısı ile kullanımı kısıtlıdır. Bu besiyerine
dayanarak revize edilmiş ISO 9308-1, sadece düşük
refakatçi flora olan sularda membran filtrasyon
yöntemi ile E. coli ve koliform grup bakterilerin
sayımını tanımlar.
ISO 9308 – CCA (06)
Dolayısı ile bu besiyerinde gelişebilecek yoğun
refakatçi flora olması beklenen yüzey suları ve sığ
kuyu sularının analizine uygun değildir.
Bu standart, filtrasyon sonunda besiyeri üzerinde
100 ve daha az sayıda koloni oluşturabilecek su
numunelerinin analizi için geliştirilmiştir.
E. coli ve diğer koliform grup bakteri sayısı refakatçi
floradan daha yüksek ise numune seyreltilerek
analiz edilebilir ancak böylesi bir numuneye doğal
çevresel koşullarda rastlanması pek mümkün
değildir. Bu gibi suların ISO 9308-2 (EMS) ile analizi
önerilir.
04d. Koliformlar
•
ISO 9308 – CCA (07)
Bu standardın tanımladığı CCA, ısıya duyarlı bir
besiyeridir. Granül formdan hazırlanışında ya da
hazır Merkotube şeklinde pazarlanan ürünün
kullanımında aşırı ısıya maruz kalmamasına özen
gösterilmelidir.
Ancak, hazırlanışı çoğu laboratuvarda koliform
analizlerinde kullanılan VRBL ya da VRBD Agar
hazırlanmasından farklı değildir. Agarın eridiği
sıcaklığa erişilmesi yeterlidir. Kaynar su banyosu
ya da mikrodalga fırın bu amaçla kullanılabilir.
ISO 9308 – CCA (08)
Yoğun refakatçi flora varlığından endişe ediliyorsa,
granül formda hazırlanışında [E. coli/ Coliform
Selective Supplement; Merck 1.00898] ilave edilebilir.
Bu amaçla eritilmiş besiyeri 40-45 oC’a soğudunda 2
mL steril damıtık su ile çözülmüş bu katkı 500 mL
besiyerine eklenir, karıştırılır ve besiyeri amaca göre
kullanılır (yayma, dökme, membran filtrasyon).
5 mg Cefsulodin 2 mL saf suda çözülüp tercihen 0,2
µm porlu filtreden geçirilerek sterilize edilir, aynı
şekilde 500 mL besiyerine eklenir.
Ya da doğrudan Chromocult Coliform Agar ES
(Enhanced Selectivity) besiyeri kullanılabilir.
DİKKAT: Bu uygulama ISO 9308’de yoktur.
ISO 9308 – CCA (09)
Numunede Aeromonas spp gibi bakteriler E. coli
olmayan koliformlar gibi koloni oluşturabilirler.
Dolayısı koliform grup bakteri doğrulaması için
oksidaz testi zorunludur.
CCA bileşimindeki triptofan, koloni üzerinde indol
testi yapılmasına olanak verir. Mavi renkli
kolonilere indol testi uygulamasına gerek yoktur.
Şüphe ediliyorsa koloni üzerinde değil, Tryptone
Water besiyerine geçilip indol testi yapılmalıdır.
ISO 9308 – CCA (10)
Pembemsi kırmızı koloniler üzerine indol testi de
gerekli değildir. Şüpheli bir durum olursa bu test
yapılır, Pembemsi kırmızı koloni oksidaz negatif ve
indol pozitif ise E. coli O157:H7 serotipini gösterir.
İndol testi yapılacak ise oksidaz testinden sonra
yapılmalıdır.
Filtreler Petri kutusuna yerleştirildikten sonra 362
oC’ta 213 saat inkübe edilir. 24 saatten fazla
inkübasyondan kaçınılmalıdır. Devamında,
inkübasyon sonrasında Petri kutularının buzdolabına
kaldırılıp, ertesi sabah okuma yapılması önerilmez.
Teşekkürler,
Sorularınız/ katkılarınız
Prof. Dr. Kadir Halkman
Ankara Üniv. Gıda Mühendisliği Bölümü