Amino Asitler, Peptidler ve Proteinler Proteinler

Biyokimyaya Giriş
Yrd. Doç. Dr. Ahmet GENÇ
Adıyaman Üniversitesi
Sağlık Hizmetleri Meslek Yüksekokulu
Kaynaklar
1.
2.
3.
Lehninger Biyokimyanın İlkeleri, Çeviri Editörü:
Prof.Dr. Necdet Kılıç, Palme Yayıncılık, 3. Baskı,
2005
Harper’ın Biyokimyası, Çeviri Editörü: Prof. Dr.
Nurten Dikmen, Prof. Dr. Tuncay Özgünen, 26.
Baskı, 2004
Lippincott Biyokimya, Çeviri Editörü: Doç. Dr.
Engin Ulukaya, 3. Baskı, 2007
Yaşamın Moleküler Anlamı
Canlı organizmalar cansız moleküllerden
oluşur. Bu moleküller birbirinden ayrılıp
tek başlarına incelendiğinde, cansız
maddenin davranışını tanımlayan tüm
fiziksel ve kimyasal kurallara uydukları
görülür.
Ayrıca canlı organizmalar gelişigüzel
bir araya getirilmiş herhangi bir
molekül topluluğunca sergilenmeyen
olağanüstü niteliklere sahiptir.
Canlı organizmalar kendini-eşleme ve
kendini oluşturma özellikleri vardır.
Biyokimya Yaşamın Farklı Biçimlerini Birleştirici
Kimyasal Terimlerle Açıklar
Canlı organizmalar
cansız
moleküllerden
oluşuyorsa, bu
moleküller yaşam
birlikteliği nasıl
sağlanmaktadır?
Biyokimya tüm organizmalarda ortak olan yapıları,
mekanizmaları ve kimyasal süreçleri moleküler anlamda
tanımlar ve bütünüyle yaşamın moleküler anlamını
diyebileceğimiz yaşamın tüm değişik formlarının, ilkelerinin
yaşamla bağdaşan düzenleyici ilkelerini açıklar.
Biyokimya tüm organizmalarda ortak olan yapıları,
mekanizmaları ve kimyasal süreçleri moleküler anlamda
tanımlar
Monomerik altbirimler
Tüm Makromoleküller Birkaç
Basit Bileşikten Oluşur


Deoksiribonükleotidler
(4 farklı
çeşit)
Amino
asitler
(20 farklı
çeşit)
Canlı sistemlerin moleküler yapıtaşlarının
pek çoğu, H, O, N ve diğer C atomlarıyla
yada kovalent şekilde bağlı karbon
atomlarından oluşur.
Amino asitler, nükleotidler ve
monosakkaritler gibi organik bileşikler olan
makromoleküllerin (proteinler, nükleik
asitler ve polisakkaritlerin) monomerik alt
birimleri olarak işlev görürler

DNA; 4 çeşit deoksiribonükleotidlerden

RNA; 4 çeşit ribonükleotidlerden

İngilizce
alfabesinin
harflari (26
farklı çeşit)
Proteinler; 20 farklı aminoasitlerden
oluşmaktadır
Düzenli doğrusal diziler
8 altbirimden oluşan bir parça için olası dizi
çeşitlerinin sayısı


Bütün monomerler organizmalarda aynıdır. Bu monomerlerin üç
boyutlu düzenlenmeleri,genler, katalizörler, hormonlar ve
diğerleri gibi özel biyolojik işlevlerini belirler.
Tüm makromoleküllern monomerlerin birçoğu hücrelerde birden
fazla işlev görmektedir.

Nükleotidler: enerji-taşıyıcı moleküller

Amino asitler: hormonlar, nörotransmitörler, pigmentler..
1.
2.
3.
Tüm canlılar moleküllerini aynı çeşit
monomerik altbirimlerden oluşurlar
Bir makromolekülün yapısı ona özel
biyolojik işlevini belirler.
Her cins ve tür, belirleyici makromolekül
dizisiyle tanımlanır
Kimyasal Bileşim ve Bağlanma
 Doğal olarak bulunan 90’dan fazla kimyasal elementten
sadece 30 kadarı canlı organizmalar için esastır.
 Canlı organizmalarda bulunan elementlerin çoğu nispeten
düşük atom numaralarına sahiptir; sadece 5 tanesinin atom
numarası 34’ten büyüktür.
 Canlı organizmalarda, bütün atomların yüzdesi olarak, en
fazla bulunan element H, O, N ve C’dur, hepsi hücrenin
%99’undan fazlasını oluşturur. Bunlar, sırasıyla bir, iki, üç ve
dört bağ yapabilmektedir
Moleküler Bileşim Dinamik Kararlı Durumu Yansıtır
Enzimler Kimyasal Tepkime Dizilerini Başlatır




Birkaçı dışında metabolik katalizörler, proteinlerdir (Birkaç RNA
molekülünün katalitik rolü vardır).
Birkaçı dışında her enzim, özgül bir tepkime katalizler ve
hücrede her bir tepkime farklı bir enzim tarafından katalizlenir
Enzimlerin çokluğu, özgüllükleri ve düzene duyarlılıkları, hücrelere
aktivasyon engellerini seçici şekilde düşürme yeteneği sağlar.
Hücrelerde enzim-katalizli binlerce kimyasal tepkime, yol adı
verilen, bir tepkimenin ürününün bir sonrakinde reaktan (tepken)
olduğu, birçok farklı ardışık tepkime dizininde işlevsel olarak
düzenlenmiştir
Enzimler Kimyasal Tepkime Dizilerini Başlatır




Bazı yollar organik besinleri kimyasal enerjiye özütlemek ve
hücre için yararlı biçime çevirmek üzere basit son ürünlere
dönüştürür. Bu yıkan, serbest enerji oluşturan tepkimelere
katabolizma adı verilir
Diğer yollar küçük öncül moleküllerle başlar; proteinler, nükleik
asit gibi daha büyük ve karmaşık moleküllere çevrilir. Enzimkatalizli yolları değişmez bir şekilde enerji alınmasını gerektirir
ve buna anabolizma adı verilir
Katabolizma ve anabolizma yolları hücresel metabolizmayı
oluşturur.
ATP bu yollarda katabolik ve anabolik bileşenleri arasında başlıca
bağlayıcı halkadır
Metabolizma Denge ve Ekonomi Sağlamak Üzere
Düzenlenir

Canlı hücreler aynı anda karbohidrat, yağ, protein ve nükleik asit
moleküllerinin binlerce çeşidini ve onların basit altbirimlerini
sentezlemekle birlikte sadece hücrenin gereksinim duyduğu
miktarlarda sentezlenmesini sağlar


Ör, hücre çoğalmasında proteinler ve nükleik asitlerin öncülleri
yüksek oranda bulunurken, çoğalmayan hücrede gereksinim
duyduğu miktar kadar bulunur.
Her metabolik yoldaki anahtar enzimler öyle düzenlenir ki, öncül
molekülünün her tipi, hücrenin o andaki gereksinimlerine uygun
miktarda oluşturulur.
İzolösin Sentezi



Eğer hücre protein sentezi için
gerektiğinden fazla izolösin
sentezlemeye başlarsa, kullanılmayan
izolösin molekülleri birikir.
İzolösinin yüksek derişimleri,
sentezine ait yolun ilk enziminin
aktivitesini inhibe eder; izolösin amino
asidinin üretimi yavaşlar.
Bu şekilde geribeslemeli (feedback)
inhibisyon her metabolik araürünün
üretimi ve kullanımı dengede
tutmaktadır.
Depo
besinler
Diğer
hücresel iş
Karmaşık
Sindirilmiş
besinler
biyomoleküller
Solar
fotonlar
Mekanik
iş
Osmotik iş
Katabolik
tepkime
yolları
(egzergonik)
Anabolik
tepkime
yolları
(endergonik
)
Metabolizma Denge ve Ekonomi Sağlamak Üzere
Düzenlenir


Canlı hücreler kendi katalizörleri olan enzimlerin sentezlerini de
düzenler. Böylece bir hücre, bir ürünün yeterince sağlandığı
durumda, bu ürünü yapmak için gereken enzimin sentezini
durdurabilir.
Canlı hücreler sürekli olarak en ekonomik duruma ayarlanmak üzere
kendini düzenleme özellikleri vardır
Biyomoleküller
Çok bulunan elementler: H, C, N, O, Na, P, S, Cl, K, Ca
Bunlar hücre ve dokuların yapısal bileşenleridir ve gram düzeyinde
bulunması gerekir
Diğer elementler ise eser (iz) elementler olup gereksinimleri insanlar için
çok azdır: insanlar için birkaç miligram Fe, Cu ve Zn, diğerleri ise çok az
daha miktarda kullanılmaktadır
 İz (eser) elementler insan vücut ağırlığının çok küçük kısmını
temsil eder anacak tümü genellikle enzimleri de içeren özgül
proteinlerin işlevleri için şart olduklarından, yaşam için
vazgeçilmezdir.
Fe, I, P, S, Cu, Zn vb.
 Ör, hemoglobin molekülünün oksijen-taşıma kapasitesi
kesinlikle, kütlesinin sadece %0.3’ünü oluşturan dört demir
iyonuna bağlıdır.
Biyomoleküller Karbon Moleküllerdir
 Canlı organizmanın kimyası,
hücrelerin kuru ağırlığının yarısından
fazlasına karşılık gelen karbonun
çevresinde düzenlenmiştir.
 Karbon, hidrojen atomlarıyla tek bağ,
oksijen ve azot atomlarıyla hem tek, hem
de çift bağ yapabilir.
 Karbon atomlarının biyolojideki en
büyük önemi, çok dayanıklı olan karbonkarbon tek bağlarını oluşturmak amacıyla
elektron çiftlerini diğer karbon
atomlarıyla paylaşabilmesidir
Kimyasal bağlar
 Kovalent bağlar
 Hidrojen bağları
 İyonik bağlar
 Van der Waals bağları
Kovalent bağlar
 İki ametal arasında elektronların ortaklaşa kullanımıyla oluşan
bağa kovalent bağ denir.
 Farklı cins iki ametâl arasında oluşan bağa polar kovalent bağ
denir. Son yörüngelerdeki elektronlar ortaklaşa kullanılır. Polar
kovalent bağ sonucunda oluşan molekül bileşik molekülüdür.
Ör, H2O
 Negatif yüklü elektronun bağa katılan iki atom tarafından eşit
kuvvette çekildiği kovalent bağa non-polar (apolar) kovalent bağ
denir. Aynı cins iki ametâl atomu arasında oluşan bağa denir
Ör, H2
Polar Kovalent Bağ
Apolar Kovalent Bağ
Hidrojen bağları
 Bir hidrojen (H) atomunun oksijen (O) ve azot (N) gibi bir
elektronegatif atoma kovalent bağlanması halinde sonucunda
oluşur
İyonik bağlar
 İyonik bağ, zıt ve eş yüklü iyonlar
arasındaki elektrostatik kuvvetlere
dayanan bir kimyasal bağ türüdür.
Ör, NaCl
Wan der Waals Bağ
 Bir molekülün pozitif diğerinin de negatif yüklü kısımları
arasında kısa süreli zayıf çekim kuvvetleri oluşur. Bu
kuvvetlerin etkisi ile moleküller arasında oluşan bağlara Wan
der Waals bağları denir. Oldukça zayıf olan bu bağ çeşidinin
kuvveti molekül büyüklüğü arttıkça artar.
 Kovalent bağlı apolar moleküllerde (H2, CO2, N2 gibi) ve
soygazlarda yoğun fazlarda sadece kütlelerinden kaynaklanan
bir çekim kuvvetine denilmektedir
Amino Asitler, Peptidler
ve Proteinler
Proteinler
 Tüm hücrelerde ve hücrelerin de tüm bölümlerinde en çok
bulunan biyolojik makromoleküllerdir. Tek bir hücrede bile
binlerce farklı çeşitte ve büyüklükte bulunur.
 Genetik bilginin ifadelendiği moleküler araçlardır.
 Tüm proteinler 20 aminoasidin doğrusal diziler halinde
kovalent olarak bağlanmasıyla oluşur.
 Farklı organizmalar bu 20 amino asidin farklı dizilimleri
sonucunda enzimler, hormonlar, antikorlar, taşıyıcılar, kas,
tüyler, örümcek ağları, boynuz, mantar zehirleri, gibi sayısız
faklı biyolojik aktiviteye sahip ürünler oluşturmaktadır.
Lusiferaz enziminin katalizlediği,
lusiferin proteini ve ATP’nin
tepkimesi sonucu ışık oluşur
Kreatin proteini tüm omurgalılarda;
saç, pul, boynuz, yün, tırnak ve tüyün
başlıca yapısal elemanıdır
Proteinler
 Aminoasitlerin dehidrate (su kaybetmiş) polimerleridir,
her bir amino asit kalıntısı (rezidüsü; bir amino asidin
diğeriyle bağlanırken su kaybetmesini yansıtır) yanındakine
özel bir tip kovalent bağla bağlanmaktadır.
 Proteinler çok çeşitli yöntemlerle yapısal amino asitlerine
yıkılabilir (hidrolizlenebilir)
 Proteinlerin yapı taşı olan amino asitlerin isimleri, bazen ilk
izole edildiği kaynaktan türetilmiştir.
Asparajin  Asparagus (kuşkonmaz)
Tirozin  peynir (tyros)
Glisin  (glykos, tatlı)
Amino Asitler Ortak Yapısal Özellikleri
 Doğada 300 den fazla amino asit tanımlanmış olmasına rağmen
bunlardan sadece 20 tanesi memelilerin proteinlerinin yapısında
bulunmaktadır.
 Proteinlerde bulunan 20 standart amino asidin hepsi de α-amino
asittir.
 Aynı karbon atomuna bağlı (α-karbon) bir
karboksil grubu (COO-), bir amino grubu
(NH3+) ve yan gruba (R-Grubu) sahiptir
 Aminoasitlerin sudaki çözünürlüğünü etkileyen elektrik yükü,
büyüklük ve yapısal yönden farklı olan yan zincirleri veya Rgruplarıyla birbirlerinden ayrılırlar
Bu yapı bir α-amino
asit hariç hepsinin
ortak yapısıdır
Amino Asitler Ortak Yapısal Özellikleri
 Standart amino asitler proteindeki kompozisyon ve
dizilimlerini belirlemek amacıyla 3-harfli kısaltma veya tek
harfli sembol olarak gösterilmektedir.
Ör, Alanin-Ala-A; Glisin-Gly-G; Glutamin-Gln-Q
 Glisin dışındaki tüm standart amino asitlerde α-karbon
atomu 4 farklı grupla bağ yapar:
 Karboksil grubu
 Amino grubu
 R grubu
 H atomu
Amino Asitler Ortak Yapısal Özellikleri
 Proteinlerde bu karboksil ve amino gruplarının hemen
tamamı peptid bağının yapısında yer alır ve genellikle
(hidrojen bağı oluşumu hariç) kimyasal reaksiyonlara girmez
 Bu nedenle, bir amino asidin proteindeki rolünü belirleyen
yan zincirlerin yapısıdır.
Amino Asitler R Gruplarına Göre Sınıflandırılırlar
 Amino asitler R gruplarının özelliklerine göre, özellikle
polariteleri veya biyolojik pH’ta suyla tepkimeye girme
eğilimlerine göre 5 ana sınıfta gruplandırılırlar.
 R gruplarının polaritesi, tamamen polar olmayan ve hidrofobik,
yüksek oranda polar veya hidrofiliğe kadar çeşitlidir
 Polar olmayan (nonpolar), Alifatik R grupları
 Aromatik R Grupları
 Polar, Yüksüz R Grupları
 Pozitif Yüklü (Bazik) R Grupları
 Negatif Yüklü (Asidik) R Grupları
1. Polar Olmayan, Alifatik R Grupları
 Bu amino asitlerin yan
zincirleri (R grupları)
polar olmayan ve
hidrofobiktir.
Glisin
Alanin
Valin
 Proteinlerde alanin,
valin, lösin ve izolösinin
yan grupları bir araya
gelip kümeleşerek,
hidrofobik etkileşimlerle
protein yapısını sabitler.
Lösin
Metiyonin
İzolösin
2. Aromatik R Grupları
Aromatik (halkasal) yan zincirli fenilalanin, tirozin ve triptofan
polar olmayan (hidrofobik) aminositlerdir
 Hepsi hidrofobik
etkileşimle katılabilir.
 Triptofan ve tirozin,
bir dereceye kadar da
fenilalanin ultraviyole
ışığını absorblar. Bu
özellik proteinlerin
tanımlanmasında
kullanılmaktadır.
Fenilalanin
Tirozin
Triptofan
 Ör, Aromatik R Grupları
olan triptofan ve tirozin 280
nm
Absorbans
 Birçok molekül ışığı belirli
dalga boyunda absorblar.
Dalgaboyu (nm)
3. Polar Yüksüz R Grupları
 Polar olmayan amino
asitlere göre suda daha fazla
çözünebilir ve hidrofiliktir
Serin
Treonin
Sistein
Asparjin
Glutamin
Bu amino asitler: serin,
treonin, sistein, prolin,
asparajin ve glutamindir.
Prolin
4. Pozitif Yüklü (Bazik) R Grupları
 R gruplarında ikinci
bir amino grubuna
sahip olan lizin, arjinin
ve histidin pH 7’de
pozitif yüklü R grubu
içeren amino asitlerdir.
Lizin
Arjinin
Histidin
5. Negatif Yüklü (Asidik) R Grupları
 R gruplarında ikinci
bir karboksil grubuna
sahip aspartat ve
glutamat pH 7’de
negatif yüke sahip R
grubu içeren amino
asitlerdir.
Aspartat
Glutamat
Lambert-Beer Yasası: Işığın Moleküller
Tarafından Emilimi (Absorbsiyonu)
 Işık absorbansının spektrofotometreyle ölçümü moleküllerin
saptanması, tanımlanması ve çözelti içerisindeki derişimlerinin
ölçümünde kullanılır. Belli bir dalga boyunda bir çözelti tarafından
absorblanan ışığın miktarı; ışığın katettiği mesafenin uzunluğuna
ve absorblayan maddenin derişimine bağlıdır.
Gelen ışığın
yoğunluğu Io
Işık
Geçen ışığın
yoğunluğu I
Monokromatör
C mol/litre
absorblayan
türleri içeren
örnek küveti
Dedektör
 I0: Gelen ışığın yoğunluğu,
I: geçen ışığın yoğunluğu,
Є: molar ekstinksiyon katsayısı (mol-cm başına litredeki birim),
c: absorblayan maddenin derişimi (litre başına mol cinsinden) ve
l: ışığı abroblayan örneğin yolunun uzunluğu (cm cinsinden)
 Absorbans = A =
Işığın katettiği yolu 1.0
cm ve sabit olduğunda
absorbans çözeltinin
derişimiyle doğru
orantılıdır
Gelen
ışığın
yoğunluğu
Io
Işık
Monokromatör
Geçen
ışığın
yoğunluğu
I
Dedektör
C mol/litre
absorblayan
türleri içeren
örnek küveti
Standart Dışı Amino Asitler Önemli İşlevlere
Sahiptir
 Proteinler, 20 standart amino asit dışında polipeptidlerde yer
alan ve standart amino asit kalıntılarının modifikasyonuyla oluşan
standart dışı amino asit kalıntıları da içerebilir.
 Standart dışı amino asitlerden 4-hidroksiprolin prolinin, 4hidroksilizin lizinin türevidir. 4-hidroksiprolin bitki hücre duvarı
proteinlerinde ve her ikisi de bağ dokunun fibröz proteini olan
kollajende bulunurlar.
 6-N-Metillizin kas dokusunun kontraktil proteini olan
miyozinin yapısal elemanıdır.
 γ-karboksiglutamat pıhtılaşma proteinlerinde protrombinde ve
biyolojik işlevi Ca2+ bağlayan diğer proteinlerde bulunur
Standart Dışı Amino Asitler Önemli
İşlevlere Sahiptir
Standart Dışı Amino Asitler Önemli
İşlevlere Sahiptir
 Ornitin ve sitrülin arjinin biyosentezinde ve üre
döngüsünde anahtar ürünlerdir.
Peptitler Amino Asit Zincirleridir
 İki amino asit molekülü peptit bağı adı verilen bir amit
bağıyla kovalent bağlanabilir ve sonuçta dipeptit oluşur.
 Peptit bağı bir amin asitin α-karboksil grubu ile diğerinin αamino grubu arasında suyun uzaklaşmasıyla oluşur.
Dipeptit Bağı
 Üç amino asit, iki peptit bağıyla bağlanırsa tripeptit oluşur.
Benzer şekilde tetrapeptitler, pentapeptitler ve çok sayıda amino
asidin bağlanmasıyla polipeptitler oluşur.
 Çoğu zaman “protein” ve “polipeptit” birbirlerine benzer
anlamda kullanılmaktadır
Amino-terminal
uç
Karboksi-terminal
uç
AlanilGlutamilglisillizin
Biyolojik Olarak Aktif Peptitler ve
Polipeptitler Çok Geniş Bir Büyüklük
Sınırına Sahiptir
 Doğadaki peptitler iki amino asitten birkaç bin amino asit
kalıntısına kadar uzunlukta olabilir.
 Birçok ufak peptit çok düşük derişimlerde etkisini gösterir.
Örneğin çok sayıda omurga hormonu küçük peptitlerdir.
 Oksitosin (9 amino asit kalıntısı) arka hipofizden salınan
uterus kasılmasını uyaran bir hormondur
 Küçük polipeptitler ve oligopeptidlere örnek ise biri 30 diğeri 21
amino asit kalıntısı olan iki polipeptit zincirinden oluşmuş
pankreatik hormon insülindir
 Glukagon ise insüline zıt etki gösteren bir diğer pankreatik
hormondur (29 amino asit).
Ticari olarak sentezlenen Aspartam olarak bilinen yapay
tatlandırıcı, küçük amino asitlere örnektir.
Proteinlerdeki polipeptit zincirinin
uzunluğu ne kadardır?
Biyolojik Olarak Aktif Peptitler ve Polipeptitler
Çok Geniş Bir Büyüklük Sınırına Sahiptir
 Bazı proteinler tek polipeptit zinciri içerirler, bazıları ise iki veya
daha fazla sayıda nonkovalent birleşmiş polipeptitten oluşurlar ve
bunlara çoklualtbirimli proteinler denir
Örnek olarak Hemoglobin iki benzer alfa ve iki benzer beta
zinciri olarak dört polipeptit alt birimi içerir ve dördü birbirine
nonkovalent etkileşimlerle bağlıdır.
 Bu çoklualtbirimli protein yapısında her bir alfa alt birimi bir
beta altbirimiyle eşleşmiştir.
Bazı Proteinler Amino Asitler Dışında
Kimyasal Gruplar İçerir
 Pek çok protein, örneğin ribonükleaz enzimi ve
kimotripsinojen, sadece amino asit kalıntıları içerir ve basit
proteinler olarak adlandırılır.
 Bazı proteinler ise amino asitlere ek kalıcı bir kimyasal
kısım içerir ve bunlara konjuge (birleşik) proteinler denir.
 Konjuge proteinin amino asit olmayan kısmına prostetik
grup denir
 Konjuge proteinler prostetik grubun kimyasal yapısı temel
alınarak sınıflandırılır,
ÖR, Lipoproteinler, glikoproteinler, metaloproteinler
Protein Yapısının Birkaç Düzeyi Vardır
 Proteinlerin yapısını tanımlamak için ve anlamak için dört
gruba ayrılmıştır.
 Kovalent bağlarla (başlıca peptit bağları ve disülfit bağları)
bağlanmış amino asit kalıntılarının oluşturduğu polipeptit
zinciri birincil yapıdır (primer yapıdır). Birincil yapının en
önemli yanı amino asit kalıntılarının dizisidir.
Protein Yapısının Birkaç Düzeyi Vardır
 İkincil yapıda ise amino asit kalıntıları kısmen kararlı
düzenlemelerle tekrarlayan yapısal modeller oluşturur.
 Üçüncül yapıda polipeptitin tüm üç boyutlu katlanmalarının
bir görüntüsüdür.
Bir protein iki veya daha çok sayıda polipeptit altbirimi
içerdiğinde uzaysal düzeni dördüncül yapı olarak adlandırılır
Proteinler Ayrılabilir ve Saflaştırılabilir
 Bir proteinin özelliklerini, amino asit birleşimini ve dizisini
tanımlayabilmek için önce saf olarak elde edilmesi esastır.
 Hücreler binlerce farklı çeşit protein içermektedir ve
bunlardan sadece bir tanesi nasıl saflaştırılabilir?
 Bir proteinin diğerinden farklı özeliklerinin olması saflaştırma
için avantaj sağlar
 Ör, pek çok protein özgül olarak başka biyomoleküllerle
bağlanır ve bu bağlanma özellikleriyle proteinler saflaştırılabilir.
Proteinler Ayrılabilir ve Saflaştırılabilir
 Protein kaynağı genellikle doku veya mikrobiyal
hücrelerdir. Protein saflaştırmadaki ilk basamak bu hücreleri
parçalamaktır.
 Çoğunlukla proteinlerin büyüklük, yük gibi bazı
özelliklerine göre farklı fraksiyonlara ayrılma işlemine tabi
tutulur.
 Saflaştırmada en önce gelen proteinlerin pH, ısı, tuz
derişimi ve diğer etkenlerden etkilenen bir kompleks işlevi
olan çözünürlüklerindeki farklılıktan faydalanılır.
Proteinler Ayrılabilir ve Saflaştırılabilir
 Genel olarak yüksek tuz derişimlerinde proteinlerin
çözünürlüğü düşüktür ve bu etki tuzla çöktürme olarak
adlandırılır.
 Uygun miktarda tuz ilavesiyle çözelti içerisindeki bazı
proteinler çöktürülürken, diğerleri çözeltide kalır. Amonyum
sülfat [(NH4)2SO4] suda yüksek çözünür olduğu için bu amaçla
sıklıkla kullanılır.
 Büyük proteinler diyaliz işleminde protein çözücüden
ayrıştırılabilir.
 Protein ayrıştırılmasında en çok kullanılan metot kolon
kromatografisidir ve proteinleri yük, büyüklük, bağlanma
affinitesi ve diğer özelliklerine göre ayrılır.
Kromatografi-1
 Bir karışımdaki kimyasal yapıları çok az farklılık gösteren
maddeleri, birbirinden ayrıştırmak veya saflaştırmak amacıyla
kullanılan yöntemlerden birisidir.
 Yöntemi ilk kez geliştiren Rus botanikçi Mikhail Tsweet, bitki
pigmentini kalsiyum karbonat (tebeşir) kolonundan geçirerek
çeşitli renk bantları elde etmiş ve 1906'da yayınladığı
makalesinde bu ayrışmanın kimyasalların adsorbsiyonuna bağlı
olduğunu belirtmiştir. Beyaz tebeşir kolonda renkli bantların
görülmesi üzerine chroma=renk ve graphe=yazı anlamında
kromatografi terimini kullanmıştır.
Kromatografi-2
 1941 yılında Martin ve Synge partisyon (partition)
kromatografiyi geliştirerek suyla kaplı silika jel kolonunda
monoamino monokarboksilik asitleri ayrıştırmayı başarmışlardır.
Silika jelin istenilen performansı göstermemesi üzerine, bunun
yerine kağıt kullanmışlar ve kağıt kromatografisini
oluşturmuşlardır.
 Kromatografik sistemde, durgun ve hareketli faz olmak
üzere iki faz bulunur. Durgun faz (katı veya sıvı) sabit,
hareketli faz (sıvı veya gaz) ise akışkan haldedir.
Kromatografi-3
 Ayrıştırılmak istenen moleküller durgun ve hareketli fazlar
arasında dağılıp bir dengeye ulaşırlar. Hareketli faz içinde daha
iyi çözünen ve durgun faza daha az ilgi gösteren bir molekül;
hareketli fazda daha az çözünen ve durgun faza daha fazla ilgi
gösteren bir başka moleküle oranla daha hızlı hareket edecek ve
bu iki molekül birbirlerinden farklı alanlara göç ederek ayrışmış
olacaktır.
 Eğer bu moleküller renkli maddeler ise doğrudan
görüldükleri halde, renksiz maddeler ikinci bir boyama işlemini
takiben görülebilirler.
Kromatografi-4
 Değişik çalışma prensipleri içeren kromatografik yöntemler
geliştirilmiştir. Bu yöntemleri mekanizmalarına göre
sınıflamak mümkünse de, aynı kromatografik sistem içinde
birden fazla mekanizmadan yararlanmak da mümkündür.
Başlıca kromatografi yöntemleri:
 Adsorbsiyon
 İyon Değiştirici Kromatografi
 Affinite Kromatografi
 Moleküler Eleme
Adsorbsiyon
 Durgun fazı oluşturan destek madde ile molekül arasındaki
elektrostatik etkileşim, hidrojen bağları veya destek madde
içinde molekülün dağılması gibi özellikler adsorpsiyon
kromatografisinin temelini oluşturur.
 Moleküllerin hareket hızları, hareketli faz içinde çözülme
oranlarına ve durgun faza olan ilgi derecelerine bağlı olarak
değişkenlik gösterir ve kimyasal olarak farklı özellik içeren
moleküller birbirlerinden farklı alanlara göç ederler.
 Durgun ve hareketli fazı oluşturan maddeler ayrıştırılmak
istenen moleküllerin özelliklerine göre seçilir.
İyon Değiştirici Kromatografisi
 Bu tip kromatografide moleküllerin iyonik yüklerinin
yönü ve kuvveti ayrışmanın temelini oluşturur. İnorganik
iyonlar, amino asitler, nükleik asitler ve proteinler bu tip
ayrıştırma için ideal moleküllerdir.
 Katyonları ayrıştırmak için negatif yüklü gruplardan
oluşan katyon-değiştirici reçineler (sülfonat veya karboksilat
iyonları gibi); anyonları ayrıştırmak için ise pozitif yüklü
gruplardan oluşan anyon-değiştirici reçineler
(trietilaminoetil) kullanılır.
İyon Değiştirici Kromatografisi
 Karışım halindeki numune kolona uygulandıktan sonra
hareketli fazın pH'sı veya iyonik gücü değiştirilerek istenen
özellikteki moleküllerin akışkanlığı sağlanır.
 Numune içindeki diğer madde ise kolonda kalır. pH veya
iyonik gücü biraz daha değiştirilerek ikinci fraksiyonun da
kolondan alınması mümkündür.
Affinite Kromatografisi ve Moleküler Eleme
 Affinite Kromatografi: Ayrıştırılmak istenen molekülün
biyokimyasal özelliğine göre, durgun fazda onu bağlayabilecek
özel yapıların kullanılması prensibine dayanır. En sık olarak
enzim-substrat, hormon-reseptör veya antijen-antikor
etkileşimleri kullanılır.
 Moleküler Eleme: Her ne kadar şekil ve hidrasyon durumları
etken olsa da, temel olarak molekülleri büyüklüklerine göre
ayrışmasını sağlayan bir kromatografi türüdür.
Kolon kromatogrofisi
 Uygun kimyasal özelliğe sahip delikli katı maddeyle kolon
kaplanır (duran faz) ve tampon çözelti (hareketli veya mobil
faz) buradan filtre edilir.
 Protein içeren çözelti kolonun tepesinden bırakılır, katı
matriks üzerinden bu çözelti filtre olur.
 Her bir protein özelliğine göre hızlı veya yavaş olarak
kolon boyunca hareket eder.
 Kolon uzunluğu artıkça ayrılma daha iyi olur, çözünürlük
artar fakat her protein bandı zamanla düfüzyonel yayılma
nedeniyle genişler ve bu olay proteinlerin saf elde edilmesini
engeller.
İyon
değiştirme
Kromatografisi
Negatif yüklü
işlevsel grup
içeren polimer
yatak
Katyon değiştiriciler
içeren kolona
protein karışımı
ilave edilmiştir
Uygulanan pH’daki net yüklerine göre proteinlerin
kolondan ayrılış hızları tayin edilir. Katyon
değiştiriciler uygulandığında net negatif yükü fazla
olan proteinler daha hızlı ve çabuk ayrışır
Moleküler eleme veya
Boyut ayırma kromatografisi
Affinite
kromatografisi
Yüksek Basınçlı Sıvı Kromatogrofisi (HPLC)
 Yüksek basınçlı pompalar kullanılır ve protein molekülleri
kolonunun aşağısına doğru hızla itilir
 HPLC’de kolondan geçiş süresi oldukça azaltılmış ve yüksek
çözünürlükte ayrışma sağlamaktadır
Proteinler Elektroforezle Ayrıştırılabilir ve
Tanımlanabilir
 Yüklü proteinler elektrik
alanında göçleri sonucunda
birbirinden ayrıştırılabilir
ve tanımlanabilir.
 Elektroforez, proteinlerin
izoelektrik noktaları ve
yaklaşık molekül ağırlıkları
gibi çok önemli özelliklerini
de tanımlamaya olanak
sağlar
Örnek
Göçün
yönü