sperm dna integrite testleri

SPERM DNA İNTEGRİTE
TESTLERİ
Prof. Dr. G.Serdar Günalp
Hacettepe Üniversitesi Tıp Fakültesi
Kadın Hastalıkları ve Doğum Anabilim Dalı ,
Üreme endokrinolojisi, İnfertilite ve Androloji Ünitesi
GİRİŞ
• Sperm analizi infertil çiftin değerlendirilmesinde en önemli tetkiklerden biridir.
• Ancak bazı sperm defektlerini (özellikle
DNA hasarını) göstermede yetersizdir.
• Erkek infertilitesi olan olguların %15’inde
normal spermiogram bulguları vardır.
Agarwal A et al. Fertil Steril 2005;84:850 –3.
ALTIN STANDART ERKEK
İNFERTİLİTESİ TESTİ ??
•
•
•
•
Kolay uygulanabilir.
Kısmen ucuz
Doğru tanı vermeli
Spermin oosite ulaşabilme kalitesinin
değerlendirilmesi yanında;
• Spermin oositi fertilize edebilme ve embriyo
gelişimini başlatabilmesi hakkında da bilgi
verebilmelidir.
• Sperm DNA hasar düzeyinin
saptanması bu kriterleri sağlayabilir.
SPERM DNA HASARI
• Bir çok çalışma sonucuna
göre teknoloji ilerledikçe
–Sperm kalitesi
–Testis kanseri
• NEDEN ??
SPERM DNA HASARI
ARTIYOR.
Aitken RJ, et al. Nature 2004;432:48–52.
İNSAN SPERM DNA’SI VE
KROMATİN YAPISI
• Somatik hücrelerden farklıdır.
• Spermiyogenezis sırasında nükleer
histon proteinleri yerini ara
proteinlere, bunlar da protaminlere
bırakır.
• Protamin sayesinde DNA halka
(toroidal) şeklini alarak sperm
başına sığacak boyuta gelir.
Balhorn R. J Cell Biol 1982;93:298–305.
İNSAN SPERM DNA’SI VE
KROMATİN YAPISI
• Sisteinden zengin protamin kısımları
arasındaki bağlar sayesinde DNA daha sıkı ve
korunaklı hale gelerek dış etkenlerin neden
olabileceği olası DNA kırık etkilerinden
korunur.
• Fertil erkekte DNA kırığı minimaldir.
• Anormal semen parametreleri olan infertil
erkekte DNA kırık oranı yüksektir.
• İnfertil, normal semen parametreleri olan
erkeklerin %8’inde anormal DNA integritesi
olabilir.
Kodama H. Fertil Steril 1997;68:519–24.
Spano M, et al. Fertil Steril 2000;73:43–50.
Zini A, et al. Fertil Steril 2001;75:674–7..
SPERM DNA HASARI VE ERKEK
İNFERTİLİTESİ
• Spermin genetik yapısındaki bozulma ile
infertilite arasında kuvvetli bir birliktelik
vardır.
• DNA hasarlı spermatozoa oranı arttıkça
(>%30-40) doğal yolla gebe kalma şansı
da azalmaktadır.
• İnfertil erkeklerde denatüre ve
fragmante DNA (%25 ve %28), fertillere
göre (%10 ve %13) daha yüksek
bulunmaktadır.
Agarwal A et al, Fertil Steril 2003;79:829–43.
Zini A, et al. Fertil Steril 2001;75(4):674-7
Evenson DP, et al. Hum Reprod 1999;14(4):1039-49.
Spano M, et al. Fertil Steril 2000;73(1):43-50.
SPERM DNA HASARI NEDENLERİ
• İç etkenler
– Protamin eksikliği veya
mutasyonu (Kompakt DNA
yapısını bozar)
– DNA paketleme defektleri
– İleri erkek yaşı
• Spermatozoların %75’i
spermatogenezis
sırasında apoptozis
sürecini tamamlar.
• Apoptozis sürecinden
kaçanlarda (abortif
apoptozis) DNA hasarı
yüksek.
Carrell DT, et al. J Androl 2001;22:604–10.
Gatewood JM, et al. J Biol Chem 1990;265:20662–6.
Singh NP, et al. Fertil Steril 2003;80:1420–30.
Sinha Hikin AP, et al. Rev Repro 1999;4:38–47.
Sakkas D, et al. Reprod Biomed Online 2003;7:428–32.
• Dış faktörler
– ROS
• İnfertil erkeklerin %25’inde
semende var.
–
–
–
–
–
–
–
Sıcaklık
Kemoradyasyon
Gonadatoksik ajanlar
Sigara
Genital kanal enf
Varikosel
Hormon eksiklikleri
Zini A, et al. Int J Androl 1993;16:183–8.
Irvine DS, et al J Androl 2000;21:33–44.
Brinkworth MH, et al. Mutat Res 2000;447:149–54.
Kunzle R, et al. Fertil Steril 2003;79:287–91.
Potts RJ, et al. Mutat Res 1999;423:103–11.
Saleh RA, et al. Fertil Steril 2003;80:1431–6.
Xing W, et al. Biochem Biophys Res Commun 2003;312:697–701.
EN ÖNEMLİ DNA HASAR MEKANİZMALARI
Abortif apoptozis
Anormal kromatin paketlenmesi
Oksidatif stress
Reproductive BioMedicine Online Vol 14 No 6. 2007 727-33
Mol. Hum. Reprod, 2009
SPERM DNA DEĞERLENDİRME TESTLERİ
TEST
PRENSİP
TANIMLAMA
YÖNTEMİ
AVANTAJ
DEZAVANTAJ
DNA HASARI VEYA FRAGMANTASYONUNUN DEĞERLENDİRİLMESİ
Sperm Chromatin
Structure Assay®
(SCSA) or DNA
Integrity Assay
Susceptibility to DNA
denaturation
Flow cytometry
Correlation to other tests
Standardized
High sensitivity
Clinically significant
Large number of cells
analyzed
Special equipment
Acridine Orange Test (AOT)
Susceptibility to DNA
denaturation
Fluorescent
microscopy
Simple
Inexpensive
Indistinct colors
Poor correlation with other test
Interlaboratory variations
Terminal Deoxynucleotidyl
Transferase-mediated
Deoxyuridine
Triphosphate Nick
End Labeling (TUNEL)
Single- and doublestrand
breaks
Fluorescent
microscopyBright field
microscopy
Flow cytometry
Correlation to other tests
Standardized
High sensitivity
Clinically significant
Special equipment
Interlaboratory variations
In Situ Nick Translation
(ISNT)
Single-strand breaks
Specific to endogenous
breaks
Clinically not proven
Comet assay (neutral and alkaline)
Single- and double strand
breaks
(double-strand breaks for
neutral)
Single-cell gel
electrophoresis
Fluorescent
microscopy
High specificity
Quantification of DNA
damage in individual
cell
Interlaboratory variations
Time consuming Not
standardized
8-Hydroxydeoxyguanosine
(8-OHdG) Assay
Measurement of DNA
oxidation
Detecting 8-OHdG
High performance
Liquid chromatography
Flow cytometry
Quantitative
High specificity
Special equipment
Artifactual oxidation
DNA PAKETLENMESİ VEYA KONDENSASYONUNUN DEĞERLENDİRİLMESİ
Staining lysine residues
of remaining histones
Bright field
microscopy
Simple
Inexpensive
Interlaboratory variations
Heterogeneous slide staining
Toluidine blue stain
Staining phosphate
residues of chromatin
Bright field
microscopy
Simple
Inexpensive
Correlation to other tests
Interlaboratory variations
Heterogeneous slide staining
Chromomycin A3 stain
(CMA3)
Protamination of mature
sperm
Fluorescent
microscopy
Simple
High sensitivity
Interlaboratory variations
Aniline Blue stain
SPERM DNA HASAR TESTLERİ
DİREKT YÖNTEMLER
• Direkt olarak DNA kırık
sayısını analiz eder.
–Comet assay “single-cell gel
electrophoresis assay”
–TUNEL assay “the terminal
deoxynucleotidyl transferase-mediated 2’deoxyuridine 5’-triphosphate (dUTP)-nick endlabeling “
Zini A et al. Journal of Andrology, Vol. 30, No. 3, May/June 2009
SPERM DNA HASAR TESTLERİ
İNDİREKT YÖNTEMLER
• Sperm kromatin integrite testleri
– SCSA “spermchromatin structure assay”,
• Akridin orange boyasını kullanarak tek ve çift sarmal DNA’yı
birbirinden ayırır.
• DNA hasar olasılığı olan kısmın %’sini verir.
• Tek sarmallı (anormal), çift sarmallı DNA (normal) yüzdesini
verir.
– SCA “sperm chromatin dispersion test”
• Asit denaturasyonuna sperm DNA’sının duyarlılığını ölçer.
– Yüksek performans sıvı kromotografisi
• Oksidize (8-hydroxydeoxyguanosine) DNA nükleotid
kısımlarını saptayan DNA oksidasyon ölçüm testi.
– Protamin/histon protein analizi
Zini A et al. Journal of Andrology, Vol. 30, No. 3, May/June 2009
NORMAL DEĞERLER
HANGİ YÖNTEM ??
• SCSA
• TUNEL
• COMET
• SCD
BENZER
SONUÇ
HANGİ TEST YARARLI?
• SCD ve TUNEL’da benzer DFI oranları.
• Açık alan mikroskobisi kullanıldığında SCD
kısmen daha duyarlı yöntem ??
Li-hong Zhang et al. Fertil Steril 2009 (inpress)
SPERM DNA FRAGMANTASYON
TESTLERİNİN PREDİKTİF DEĞERİ
• DNA HASARININ TİPİ
– TEK SARMAL (İyi prognoz)
– ÇİFT SARMAL (Kötü prognoz)
• DNA HASARLI SPERM %’Sİ
– EN YÜKSEK %’DE BİLE HASARSIZ SPERM İLE
FERTİLİZASYON OLABİLİR
• TEK BİR SPERMATOZOA’DAKİ HASAR %’Sİ
– Bu HASARIN OOSİT TARAFINDAN TAMİR EDİLEBİLME
YETENEĞİ. (%8’DEN AZ OLMALI)
• DNA FRAGM. İLE BERABER NÜKLEOTİD HASARI
– -OH RADİKAL /x-RAY = EN KÖTÜ PROGNOZ.
• DNA HASARININ İNTRON/EXON TUTMA ORANI
– %90 ÜZERİNDE İNTRONLARI İLGİLENDİRİR
– PROTEİNLERİ KODLAYAN EXON’LARIN TUTULUMU
OLDUKÇA AZDIR
SPERM DNA FRAGMANTASYON
TESTLERİNİN PREDİKTİF DEĞERİ
• FERTİLİZE EDEN SPERMDEKİ DNA HASARININ OOSİT
TARAFINDAN DÜZELTİLEBİLME KAPASİTESİ.
– KADIN YAŞI /DNA HASAR TİPİ
– BUNU TEST EDECEK BİR DNA FRAGM. TESTİ HENÜZ YOK.
• KULLANILAN SPERM DNA FRAGM. TESTİNİN TİPİ
– DİREKT ÖLÇEN TESTLER (TUNEL) + FLOW CYTOMETRY
• GÜVENİLİRLİK VE TEKRAR EDİLEBİLİRLİK EN FAZLA
• ART SIRASINDA YAPILAN SPERM İŞLENMESİ
– SANTRİFÜJ /KRİOPREZERVASYON/İNKÜBASYON.
• OOSİT SAYISI
– IVF / ICSI ‘DE ÖNEMLİ
– IUI DA İSE TESTİN NEGATİF PREDİKTİF DEĞERİNİ
ARTTIRIYOR (TEK YUMURTA )
GEBELİK SONUÇLARINI ÖNGÖRME
AÇISINDAN DNA İNT. TESTİ NELERİ
GÖSTERMELİ
• DNA HASARI TÜM SPERM POPÜLASYONUNU
KAPSIYORMU ?
• BU HASAR OOSİT TARAFINDAN TAMİR
EDİLEBİLİYOR MU ?
SPERM DNA HASARI VE
SEMEN PARAMETRELERİ
Yaş
P=0.001
Abstinens süresi
P=0.006
TMSC
P<0.0001
Atipik morfolojide hücre oranı
P<0.0006
Hızlı progresif motilite
P<0.0001
Vitalite
P<0.0001
Anormal boyun morfolojisi
P=0.016
Halka şeklinde kuyruk morfolojisi P<0.0006
Fertil Steril 2009;91:1801–5.
SPERM DNA HASARI VE
SPERM PARAMETRELERİ
• Prospektif çalışma
• 87 olgu.
• Anormal baş
morfolojisi ile
%HDS (high DNA
stainability, SCSA)
arasında pozitif
korelasyon vardır.
r=0.40
Fertil Steril 2009;91:2495–500
SPERM DNA HASARI VE
SPERM PARAMETRELERİ
• Sperm DNA fragmantasyon oranı
– Konsantrasyon
– Motilite
– Morfoloji ile ilişkilidir.
0.00-0.19 : İlişki yok
0.20-0.39 : Zayıf ilişki
0.40-0.59 : Orta düzey ilişki
0.60-0.79 : Dikkate değer ilişki
0.80-1.00 : Yüksek ilişki
• Her üç grupta da anlamlı negatif
korelasyon ancak zayıf ilişki mevcuttur.
Fertil Steril 2008;90:1792–9.
SPERM DNA HASARI VE
SPERM PARAMETRELERİ
DFI artışı ile beraber sperm motilite ve
morfoloji oranları da bozulmaktadır.
Asian J Androl 2008 Sep; 10: 786–790
SPERM DNA HASARI VE GEBELİK
İLİŞKİSİ
• DOĞAL GEBELİK İLE OLAN İLİŞKİ:
– ÖNEMLİ ÖLÇÜDE DÜŞÜRÜYOR
• OR:7.01
IUI İLE OLAN GEBELİKLE İLİŞKİ:
– ÖNEMLİ ÖLÇÜDE DÜŞÜRÜYOR
• OR: 9.9 (Bungum 2007 – tek çalışma)
IVF İLE OLAN GEBELİKLE İLİŞKİ:
•
ORTA DERECEDE NEGATİF İLİŞKİ
OR:1.7
ICSI İLE OLAN GEBELİKLE İLİŞKİ:
İLİŞKİ GÖSTERİLEMEDİ (COLLİNS)
OR: 1.15 (0.90-1.55)
SPERM DNA HASARI VE IUI
• TUNEL yöntemi ile saptanan DNA
fragmentasyon oranı ile IUI başarısı ilişkisi
çalışılmıştır.
• Gebe olgularda DNA fragmentasyon oranı 7.3
iken gebe kalamayan olgularda ise 13.9 olarak
saptanmıştır (p<0.05).
• DNA fragmentasyon oranı >%12 olan olguların
hiç biri gebe kalamamıştır.
• Yüksek oranda DNA fragmentasyon oranı olan
spermler ile yapılan inseminasyonda ise gebelik
düşük ile sonuçlanmıştır.
SPERM DNA HASARI VE IUI
• DFI oranı yüksek ise IUI’da biyokimyasal
gebelik, klinik gebelik ve doğum oranlarında
istatistiksel olarak anlamlı bir bozulma olur.
Human Reproduction Vol.22, No.1 pp. 174–179, 2007
SPERM DNA HASARI VE ICSI
• ICSI işlemi ile sperm direkt olarak oosit
içine verilmesine rağmen bir çok klinikte
fertilizasyon oranları % 75’i
geçememektedir.
• Bunun için önerilen olası mekanizma
işlem sırasındaki sperm DNA hasarı ya da
erkek infertilitesi nedeni olan ve gizli
kalan bir sperm DNA hasarının varlığı
olabilir.
Foresta et al. Int. J. Androl. 1992, 15, 330-337
Palermo et al. Reprod. Fertil. Dev., 1995, 7, 211-218.
ICSI FERTİLİZASYON ORANLARI
REF: Textbook of Assisted Reproductive Technologies. 3rd Ed. 2009
ED . :GARDNER Vol:1 Chp:12 P:176 Table: 12.1-12.2
SPERM DNA HASARI VE IVF/ICSI
FERTİLİZASYON ORANI
Prospektif çok
merkezli çalışma
SCD test.
621 infertil çift
değerlendirilmesi
• Sperm DNA fragmantasyon oranı fertilizasyon
oranı açısından prediktif olabilir.
– Sınır %18
Fertil Steril 2008;90:1792–9.
DNA FRAGMANTASYON İNDEKSİ
(%DFI; DNA HASARLI SPERM YÜZDESİ)
– < % 15
– % 15 – 30
– > % 30
DFI = Çok iyi fertilizasyon
potansiyeli
DFI = İyi fertilizasyon
potansiyeli
DFI = Kötü fertilizasyon
potansiyeli
SPERM DNA HASARI VE IVF/ICSI
KLİNİK GEBELİK VE DOĞUM
Fertil Steril 2008;90:1792–9.
• Sperm DNA fragmentasyon oranı, klinik
gebelik ve doğum oranları ile ilişkili değil.
SPERM DNA HASARI VE IVF/ICSI
• Konu ile ilgili 18 çalışma ve 2162 siklus
değerlendirilmesi içeren sistematik derleme
sonucuna göre;
• Gebelik oranlarını öngörme açısından DNA
testinin;
– Sensitivitesi ve spesifite değerleri 0.83 ila – 1.59
arasında değişmektedir.
– Toplam tanısal odd oranı 1.44 (95% CI, 1.03, 2.03),
– Özet likelihood oranı ise gebelik sonucunu
öngörme açısından prediktif değil.
• LR (+) 1.23; 95% CI, 0.98, 1.54
• LR (-) .81; 95% CI, 0.67, 0.98
Fertil Steril 2008;89:823–31
SPERM DNA HASARI VE IVF/ICSI
Sensitivite ve
spesifite değerleri
değişken
Diagnostik odds
oranı 0.44 – 10.1
arasında
değişiyor.
İstatistiksel
anlamlılık sadece
10 çalışmadan
4’ünde var.
Fertil Steril 2008;89:823–31
SPERM DNA HASARI VE IVF/ICSI
En iyi tanısal test oranı
için sadece birkaç
çalışma sol üst köşeye
düşmektedir.
6/18 çalışma tanısal
hattın altında
kalmaktadır.
Testin IVF/ICSI
sonucunu öngörmesi
%50 olguda doğru
olabilir.
Fertil Steril 2008;89:823–31
SPERM DNA HASARI VE IVF/ICSI
SONUÇ
Sperm DNA integrite test sonuçları ve
IVF/ICSI’de gebelik oranları açısından
küçük fakat istatistiksel anlamlı ilişki;
testin rutinde kullanımının önerilmesi
açısından henüz yeterli değildir.
Sperm DNA integrite testi belki alt grup
analinizde gebelik oranlarını
öngörebilmesi açısından yararlı olabilir.
Fertil Steril 2008;89:823–31
SPERM DNA HASARI VE IVF/ICSI
SONRASI GEBELİK KAYBI
• 11 IVF/ICSI sonrası gebelik sonuçlarını
içeren sistematik derlemede sperm DNA
hasarı ve spontan abortus oranları
araştırıldı.
• Sınır %DFI : %27-30.
• Gebe kalan olgularda anormal sperm
DNA olan olguların oranı
– %11 – 40 arasında değişmektedir.
Human Reproduction Vol.23, No.12 pp. 2663–2668, 2008
SPERM DNA HASARI VE IVF/ICSI
SONRASI GEBELİK KAYBI
Human Reproduction Vol.23, No.12 pp. 2663–2668, 2008
SPERM DNA HASARI VE IVF/ICSI
SONRASI GEBELİK KAYBI
DNA hasarı olan
sperm ile yapılan
IVF/ICSI’de
spontan abortus
oranı belirgin
olarak artar.
Sperm DNA hasarının IVF/ICSI sonrası gebeliklerde gebelik kaybını
öngörmesi açısından OR 2.48 (95% CI 1.52, 4.04,P < 0.0001)’dir
Human Reproduction Vol.23, No.12 pp. 2663–2668, 2008
DNA HASARI ETKİLERİ
• Fetal mutasyonlar ve yeni
kuşaklarda kanser riski artışı
• Kötü embriyonik gelişme
• Azalmış implantasyon
• Düşük gebelik oranı
• Tekrarlayan gebelik kayıpları
DNA HASARLI SPERMİN
AYRIŞTIRILMASI
– Annexin-V kolonlarının kullanılması
• Apoptotik spermin ayrıştırılması
– Hyaluronik asit bağlanmasına göre
Sperm seçme yöntemi.
• PICSI-Dish
– Subsellüler yapıların non-invaziv
görüntülenmesini sağlayan yöntemler.
• High-magnification ICSI
• Confocal light absorption scattering
spectroscopy (CLASS) Fertil Steril 2010;93:1027–36.
SONUÇ
• Anormal DNA integritesi ve üreme sonuçları
arasındaki ilişki ile ilgili literatür tartışmalıdır.
• İnfertil erkekte sperm DNA hasarı sıktır ve belirli
populasyonda üreme sonuçlarını etkileyebilir.
– İdiopatik infertilite
– Tekrarlayan Gebelik Kayıpları.
• Sperm DNA testlerinin tek başına spontan gebelik,
IUI, IVF, ICSI sonuçlarını öngörmek için yararı
sınırlıdır.
• İnfertilite değerlendirilmesinde rutin DNA testlerinin
kullanımının önerilmesi için henüz yeterli veri
yoktur.
2008
DİNLEDİĞİNİZ İÇİNTEŞEKKÜRLER