tür tayđn panelđ real tıme pcr kđtđ

TÜR TAYĐN PANELĐ REAL TIME PCR KĐTĐ
Kat. No: SNPRT-P
GĐRĐŞ
DNA ĐZOLASYONU
Tür Tayin Paneli Real-Time PCR Kiti, işlenmiş et ürünleri içerisinde at, domuz,
Hayvan mitokondrial DNA’sının izolasyonu, spin kolon yöntemine dayalı herhangi
eşek, hindi, keçi, koyun, martı, mısır, ördek, sığır, soya ve tavuk materyallerinin
bir Kandan Genomik DNA Đzolasyon kiti ile yapılabilmektedir. Bu tip kitlerde
bulunup bulunmadığını tespit eder.
solüsyon isimleri farklı olsa da genelde prensipleri aynıdır. Özetle;
•
50-100 mg örnekten (Et veya işlenmiş gıda) temiz bir tüpe alınıp üzerine
KĐT PRENSĐBĐ
300 µl Lizis buffer ve 25 µl enzim konularak enzimin aktivasyon
Test prensibi, Taq DNA polimerazın 5’-3’ exonuclease aktivitesine dayanmaktadır.
sıcaklığında 30 dk inkübe edilir.
Probun 5’ ucunda bir reporter boya ve 3’ ucunda da bir quencer boya
bulunmaktadır. Quencer boya reporter boyanın ışımasını baskılamakta aynı
•
Đnkübasyondan sonra tüpler 13.000 rpm’de 2 dk santrifüj edilip, berrak
•
Bu tüp içerisine kitin protokolünde belirtildiği miktarda alkol eklenip oluşan
kısım temiz bir tüpe aktarılır.
zamanda da probun primer gibi davranarak uzamasına engel olmaktadır. PCR
esnasında enzim aktivitesi ile birlikte reporter ve quencer arasında bulunan prob
karışım spin kolona aktarılır ve belirtilen hızda ve sürede santrifüj edilir.
parçalanarak ayrılır, baskılanmanın ortadan kalkmasıyla ışıma meydana gelir. Bu
işlem sadece hedef bölge üzerinde hibridize olmuş problarda gerçekleşir.
•
Sonraki aşamalar da kitin protokolünde belirtildiği şekilde yapılarak yıkama
ve elüsyon işlemi tamamlanır.
Amplifikasyon miktarı arttıkça, reporter boyanın açığa çıkmasıyla birlikte ışıma
doğrusal olarak artmakta ve bu artış cihaz tarafından eş-zamanlı olarak tespit
Tür Tayin Paneli Real-Time PCR Kiti, MN NucleoSpin®Blood ve Axygen Blood
edilmektedir.
Genomic DNA izolasyon kitine göre optimize edilmiştir.
ÜRÜN ÖZELLĐKLERĐ
TEST PROSEDÜRÜ
Kit, PCR için gerekli tüm bileşenleri içerisinde bulundurur. Đlgili türlere spesifik
•
Her tür ayrı tüplerde çalışılmalıdır.
primer ve problar yardımı ile örneğin içeriği tespit edilir.
•
Bir örnek için, her optik kapaklı strip veya tüpe, 20 µl master miks ve 0,3
Kit ayrıca internal
µl Hot Start Taq DNA Polimeraz konulur. Sonra 5 µl (~10-100 ng)
kontrol içeriği ile PCR reaksiyonunuzun çalışmasını da kontrol etmektedir.
örnek DNA ‘sı ilave edilir.
KĐT ĐÇERĐĞĐ
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
•
Bileşen
At Master Miks
Domuz Master Miks
Eşek Master Miks
Hindi Master Miks
Keçi Master Miks
Koyun Master Miks
Martı Master Miks
Mısır Master Miks
Ördek Master Miks
Sığır Master Miks
Soya Master Miks
Tavuk Master Miks
Pozitif Kontrol DNA (*)
Negatif Kontrol DNA (*)
Hot Start Taq DNA Polymerase
20 Test
430 µl
430 µl
430 µl
430 µl
430 µl
430 µl
430 µl
430 µl
430 µl
430 µl
430 µl
430 µl
30 µl
30 µl
80 µl
•
Hafifçe pipetlenerek karıştırılır.
•
Aşağıda belirtilen programla çalıştırılır.
•
Birden fazla örnek için, Master miks ve Hot Start Taq DNA Polimeraz
miktarları, çalışılacak örnek sayısı ile çarpılmalı, oluşan karışımdan 20 µl
tüplere bölünmeli ve ayrı ayrı örnek DNA’ları konulmalıdır.
PCR PROGRAMI
95 °C
10 Dk.
95 °C
15 Saniye
60 °C
1 Dk.
60 °C’de floresan boya olarak FAM ve HEX/JOE seçilmelidir.
Eğer;
(*) Kit içeriğinde tüm türler için ayrı ayrı pozitif DNA bulunmaktadır. Negatif
kontrol DNA’lar ise ilgili türlerin çapraz reaksiyon gösterebileceği türlerden
seçilmiştir (Örn: At için negatif kontrol eşek DNA’ sı, Tavuk için negatif kontrol
Hindi DNA’ sı vb.). Böylece sistemin çapraz reaksiyon kontrolünü de
yapabilirsiniz.
SAKLAMA KOŞULLARI
•
ABI Prism® sistemi kullanıyorsanız, lütfen pasif referans olarak “none”
seçeneğini seçiniz.
•
Mx3000p/Mx3005p kullanıyorsanız,
seçiniz.
Bu sistemin çalışabileceği cihazlar;
•
Tüm bileşenler – 20°C de ve karanlıkta saklanmalıdır.
ABI Prism ® 7000/7300/7500/7900
•
Tüm bileşenler, ürün kutusunun üzerinde belirtilen son kullanma tarihine
Mx3000P/Mx3005P
kadar kullanılabilir.
•
35 Döngü
Sürekli eritip çözdürmek, ürünün hassasiyetinde azalmalara neden olabilir.
Smart Cycler II, iCyler iQ™4 / iQ™5
Roche LightCycler® 480 System
lütfen referans boya olarak “rox” u
ANALĐZ
PCR işlemi bittikten sonra, sonuçlarınızı FAM ve HEX/JOE boyasında analiz
edebilirsiniz. Đnternal Kontrol pikleri HEX/JOE boyası ile, türler ise FAM boyası ile
analiz edilmelidir.
OLASI PROBLEMLER
Eğer internal kontrol çalışmıyorsa,
•
DNA eksikliği,
•
Hot start Taq DNA Polimeraz eksikliği veya yetersizliği,
Đnternal kontrol, tüm kuyularda pik vermeli ve CT değeri 24 ≤ X ≤ 28
•
Test’te inhibitör varlığı ,
aralığında olmalıdır. Pik alamadığınız durumlar için “olası problemler” bölümüne
söz konusudur.
bakabilirsiniz.
Eğer pikler geç başlıyorsa,
Öncelikle örneklerinizin piklerini pozitif kontrol DNA pikleri ile karşılaştırın. Eğer
pozitif kontrol DNA da bir sorun yoksa,
•
Örneğinizin DNA’sı saf değildir veya az miktarda inhibitör içeriyor olabilir.
•
Yeterli miktarda DNA elde edememiş olabilirsiniz.
Böyle durumlarda çalışma tekrar edilmeli eğer aynı problem devam ediyorsa
yeniden DNA izolasyonu yapılmalıdır.
Daha fazla soru ve problem için, lütfen Ar - Ge bölümü ile temasa geçiniz.
tech@snp.com.tr.
UYARILAR
•
Saklama koşullarına uygun olarak saklanmalıdır.
•
Oda sıcaklığında unutulmuş PCR master miksleri kullanılmamalıdır.
•
PCR master miksi oda sıcaklığında tamamen eritilip, baş aşağı edilerek
hafifçe karıştırıldıktan sonra tüplere bölünmelidir.
•
Master miksler tüplere bölündükten sonra Hot Start Taq DNA Polimeraz ve
DNA eklenerek hemen PCR işlemine geçilmelidir.
Türlere ait pikler için de FAM boyasında analiz yapmanız gerekmektedir. Bu
boyada görmeniz gereken CT değer aralığı ise 12 ≤ X ≤ 28 dir. Eğer pik yoksa
sözkonusu tür bölgesi için “negatif” yorumunu yapabilirsiniz.
•
Belirtilenden fazla Hot Start Taq DNA Polimeraz koyulmamalıdır.
•
Yukarıda belirtilen PCR programı uygulanmalıdır.
•
PCR master miksleri vücut içinde kullanıma uygun değildir. Sadece belirtilen
türlerin tespitinde vücut dışı test kiti olarak kullanılır.
•
PCR master mikslerin raf ömrü 6 aydır. Kullanmadan önce üretim tarihine
dikkat edilmelidir.
Düzenlenme Tarihi: 12.03.2012