ACE I/D POLĐMORFĐZM PCR KĐTĐ Kat. No: SNPACE GĐRĐŞ DNA ĐZOLASYONU Renin-Angiotensin sitemi (RAS) kan basıncı ve böbrek fonksiyonları Kit genomik DNA ile çalışmaktadır. Kaynak olarak tam kan kullanılmalı, açısından önemli bir sistemdir. Yapılan çalışmalar, bu sistemdeki olası kanlar EDTA’lı tüplere alınmalı, alındıktan hemen sonra bir kaç kez tüpü genetik değişikliklerin damar hastalıklarında önemli olduğunu tespit çevirmek suretiyle kanın pıhtılaşmadan tüp içeriğindeki EDTA ile etmiştir. Angiotensin Converting Enzyme-I (ACE), RAS sisteminin en karışması sağlanmalıdır. Kan tüpleri, bir iki hafta içinde DNA izolasyonu önemli yapılacaksa + 4°C ‘de, daha uzun süre bekletilecekse – 20°C de elemanlarından birisidir. Bu enzimi kodlayan gendeki Insersiyon/Delesyon mutasyonları, plazma ve doku içerisindeki ACE saklanmalıdır. miktarını doğrudan etkilemektedir. Kandan Genomik DNA izolasyonu, herhangi bir spin kolon yöntemiyle yapılabilir. DNA elde edildikten sonra – 20°C de saklanmalıdır. Y KĐT PRENSĐBĐ Mikrodelesyon 8 Bölge Real Time PCR Kiti, MN NucleoSpin®Blood ve Test prensibi klasik PCR ve Agaroz Jel Elektroforezidir. Axygen Blood Genomic DNA kitlerine göre optimize edilmiştir. PCR, nükleik asitlerin in-vitro olarak (canlı organizma dışında), uygun koşullar altında çoğaltılmasına dayanmaktadır. Çoğaltılmak istenen TEST PROSEDÜRÜ bölgenin iki ucuna özgü, bu bölgedeki baz dizilerine tamamlayıcı olan, • 18-25 baz uzunluğunda bir çift sentetik oligonükleotid primer Bir örnek için, her 0,2 ml PCR tüpüne, 44,5 µl master miks ve 0,5 µl Hot Start Taq DNA Polimeraz konulur. Daha sonra 5 µl kullanarak, bu iki primer ile sınırlandırılan bölgenin enzimatik olarak (~10-100 ng) örnek DNA ‘sı ilave edilir. sentezlenmesi sağlanır. • Hafifçe pipetlenerek karıştırılır. DNA’nın elektroforetik analizinin temeli, bu molekülün elektriksel bir • Aşağıda belirtilen programla çalıştırılır. alanda, jel üzerinde hareketine dayanmaktadır. • Birden fazla örnek için, Master miks ve Hot Start Taq DNA Polimeraz miktarları, çalışılacak örnek sayısı ile çarpılmalı, oluşan ÜRÜN ÖZELLĐKLERĐ karışımdan 45 µl tüplere bölünmeli ve ayrı ayrı örnek DNA’ları Kit, PCR için gerekli tüm bileşenleri içerisinde bulundurur. Y konulmalıdır. kromozomunun ilgili bölgelerine ait spesifik primerler yardımı ile analiz yapılmaktadır. PCR PROGRAMI KĐT ĐÇERĐĞĐ • • • Bileşen ACE I/D PCR Master Miks Hot Start Taq DNA Polymerase Kontrol DNA 20 Test 950 µl 25 µl 20 µl SAKLAMA KOŞULLARI • Tüm bileşenler – 20°C de ve karanlıkta saklanmalıdır. • Tüm bileşenler, ürün kutusunun üzerinde belirtilen son kullanma tarihine kadar kullanılabilir. • Sürekli eritip çözdürmek, ürünün hassasiyetinde azalmalara neden olabilir. 95 °C 10 dk. 94 °C 30 sn. 52 °C 30 sn. 72 °C 30 sn. 72 °C 5 dk. 35 döngü ANALĐZ OLASI PROBLEMLER PCR işlemi bittikten sonra, PCR ürünleri % 1.5 – 2 lik Agaroz jelde, Eğer bantlar silikse, tank büyüklüğüne uygun voltaj ve sürede yürütülür. Bu süre 10 cm x • Örnek DNA’sı saf değildir veya az miktarda inhibitör içeriyor tank ebatlarına göre değişebilir. Jel yürütüldükten sonra UV tablası • Yeterli miktarda DNA elde edilememiş olabilir. üzerine alınıp, ilgili bantlar açısından analiz edilir. Bant uzunlukları • Hot Start Taq DNA yetersizdir ya da iyi karışmamış olabilir. olabilir. 10 cm bir jel için ortalama 160 V ve 40 dakikadır. Bu değerler farklı aşağıdaki tabloda verilmiştir. UYARILAR • Saklama koşullarına uygun olarak saklanmalıdır. Polimorfizm Uzunluk (bp) • Oda sıcaklığında unutulmuş PCR master miksleri kullanılmamalıdır. Insersiyon (II) 490 • PCR master miksi oda sıcaklığında tamamen eritilip, baş aşağı Delesyon (DD) 190 edilerek hafifçe karıştırıldıktan sonra tüplere bölünmelidir. Heterozigot (I/D) 490 / 190 • Master miksler tüplere bölündükten sonra Hot Start Taq DNA Polimeraz ve DNA eklenerek hemen PCR işlemine geçilmelidir. • Belirtilenden fazla Hot Start Taq DNA Polimeraz koyulmamalıdır. • Yukarıda belirtilen PCR programı uygulanmalıdır. • PCR master miksleri vücut içinde kullanıma uygun değildir. Sadece belirtilen türlerin tespitinde vücut dışı test kiti olarak kullanılır. • PCR master mikslerin raf ömrü 6 aydır. Kullanmadan önce üretim tarihine dikkat edilmelidir. Düzenlenme Tarihi: 12.03.2012