RIDA® Quick Cryptosporidium/Giardia Combi Makale no: N 1122 R-Biopharm AG, Landwehrstr. 54, D-64293 Darmstadt, Germany Tel: +49 (0) 61 51 81 02-0 / Fax: +49 (0) 61 51 81 02-20 Χ 1. Kullanım amacı In vitro diyagnostik kullanım içindir. RIDA® Quick Cryptosporidium/Giardia Combi testi hızlı immunokromatografik test olup gaitada,kalitatif olarak Cryptosporidium parvum ve/veya Giardia lamblia tespiti için kullanılır. 2. Özet ve testin açıklaması Giardia lamblia bağırsak kamçılısıdır. Morfolojik olarak Tropozoitler sadece kısa bir sure host organizmanın dışında yaşarlar. Bulaşma yüksek derecede, bulaşıcı kistlerle olur. Giardia kistlerinin yenmesinden sonra insan ince bağırsağında ürer.Tüm dünyada yaygın olup özellikle yolculuk esnasında olan kronik ishal sebebidir.Kirli sular ve yiyeceklerin yenmesinden sonra enfeksiyon oluşur. Amerika’da, Giardia lamblia patojeni sıklıkla su yoluyla geçip ishale sebep olur. Gelişen ülkelerde, 10 yaşın altındaki çocukların % 15-20 sinde hastalığa sebep olur.Kişilerdeki yetersiz hijyenden, fekal-oral yol ile insandan insana geçer.Geçiş modu özellikle çocuklar, anaokulu çocukları, homoseksüel kişiler (%19 a kadar) ve kurumlardaki insanlar arasındadır.Enfeksiyon aynı zamanda çocuklardan ailelerine geçebilir.Bebekler ve daha büyük çocuklarda belirtiler görülmeyebilir.Bununla beraber onlarda kist salgılar ve diğer insanlara bulaştırır. Giardiayazın semptomları; akut ya da kronik diaredir .İnkübasyon süresi 3-42 gün arasındadır. Akut enfeksiyon aşağıdaki semptomları gösterir: Ani sulu isal(sık,sarı, pis koku ve gaz)iştah kaybı, kusma,halsizlik ve kilo kaybı; kanlı ve mukuslu isal normalde görülmez.Geçmişte kistler mikroskop ile tespit ediliyordu, bu da deneyimli bir kişi gerektiriyordu.Bu araştırmalar uzun sürer , kistin çıkması güçlü dalgalanmalara bağlıdır. Mikroskopla taramaya alternatif aşağıda anlatılan immunokromotografik testdir. Monoklonal antikorlar kullanır ve mikroskop prosedürüne eş değerde hassas ve spesifiktir.Test hızlı ve basittir, çalışmak deneyimli bir kişi gerekmez. Cryptosporidium parvum hayvanlarda çok görülen bir parasit olup özellikle evcil hayvanlarda önemli patojen bir organizmadır ve calve hastalığında görülür. Çoğu ülkelerde, insanlarda enfastasyon gözlemlenir, bu günlerde eskiden olduğundan daha fazladır. Tropik bölgelerde olan gelişmekteki ülkelerde, parasitler sıklıkla endemik ve çocuklar arasında epidemik diareye sebep olur. İmmunokompetent hastalarda, hastalık kendi kendini gösterir, kendiliğinden gastroenterit iyileşmesi gibi. Diare 3-10 gün sürer ve ateş, gastrointestinal semptomlar örn. Kusma ve ağrı gibi,devam eder bu konuda giardiasise benzerlik gösterir. Semptomlar ve etkiler aslında immunoinkompetent hastalarda daha ciddidir ve ısrarla dinmeyen isal görülür. İnfestasyon, hayvanlardan insanlara kontamine olmuş su ile ve insandan insana geçer. Komünal fasilitelerin üyeleri, anaokulu çocukları ve yüksek risk grupları, homoseksüel erkekler, HIV hastaları yüksek risk taşır. Geçmişte, cryptosporidiosis tespiti için kullanılan metot , Oocystin gaitaya ve ince bağırsaktan alınan biyopsiye mikroskobik incelemesiydi ve deneyimli eleman gerektiriyordu. Bu RIDA® Quick Cryptosporidium/Giardia Combi 04-11-18 2 metoda alternatif metot, hızlı immunokromotografik test tanımlandı. Bu test monoklonal antikorlar kullanır , mikroskobik prosedüre eşdeğer hassasiyet ve özgüllüktedir. 3. Test Prensibi Bu hızlı test , tek basamaklı, immunokromotografik yan - akış testidir. Cryptosporidia karşı yöneltilmiş monoklonal antikorlar kendi kendilerine mavi lateks partiküllere karşı ve Giardia’ ya karşı yöneltilmiş monoklonal antikorlar ise kırmızı lateks partiküllere bağlanır. Patojenlere karşı olan diğer spesifik antikorlar membrana sıkıca bağlanır. Gaita numunesi ekstraksiyon bufer içinde önce asılı kalır sonra çöker. Üzerinde kalan süpernatant kasetin üzerindeki yuvarlağa damlatılır ve numune ilerler. Numune renkli partiküllerle içeri geçer test pozitif ise membran boyunca özel toplama bantlarında antijenler bağlanır.Test pozitif ise Mavi ve /veya kırmızı bantlar oluşur. Sağlanan Reaktifler Pakette 25 teste yetecek kadar reaktif bulunur. . Strip 25 test. Test kutusunda 25 test stripi Diluent 30 ml Extraksiyon bufer, kullanıma hazır; % 0.1 sodyum azid Pipet 25 adet. 25 adet tek kullanımlık pipet 5. Saklama koşulları Paket 2 – 30 °C de saklanabilir paketin üzerinde yazan tarihe kadar kullanılabilir. Miadı geçenler için, kalite garantisi yoktur.Buna benzer olarak, zarar görmüş paketteki striplerin kalite garantisi yoktur. 6. Gerekli materyaller ama sağlanmayanlar - Gaita süspansiyonu için test tüpleri -Tüpler (Opsiyonel: kaplanmamış kuyucuklar) - Vorteks mikser (opsiyonel) - Mikropipet (200 μl - 1000 μl) - % 0.5 sodyum hipoklorit solüsyonu içeren atık kabı RIDA® Quick Cryptosporidium/Giardia Combi 04-11-18 3 7. Kullanıcılar için önlemler Sadece in vitro diyagnostik kullanım içindir.Mutlaka eğitimli bir personel tarafından kullanılmalıdır.Medikal laboratuvar çalışanları için olan rehber takip edilmeli ve oradaki direktiflere tamamen uyulmalıdır.Numune dilüsyonu için olan bufer, koruyucu olarak sodyum azid içerir.Bu madde deriye ya da mukoz membrana temasından sakınılmalıdır. Numuneler ya da reaktifler ağız ile pipetlenmemeli ve yaralı deriyle, mukoz membran ile teması önlemelidir. Numuneler , eldiven giyilerek çalışılmalı ve test bittiği zaman eller yıkanmalıdır. Numuneler veya reaktifler ile çalışırken sigara içmeyiniz, yemek yiyip içmeyiniz. Tüm reaktifler ve metaryaller enfekte bir malzemeye dönüşür. Aynı numuneler davranıldığı gibi uygun bir dezenfektan ile dezenfekte edilmelidir.(Örn: Sodyum hipoklorit) ya da 121 °C’de en az bir saat otoklavda bekletiniz. 8. Numune toplama ve saklama Gaita numuneleri hiçbir katkı maddesi olmayan temiz bir kaba konmalıdır ve test başlamadan önce 2 – 8 °C de bekletilmelidir.Eğer 3 günden fazla saklamak gerekiyorsa, numuneler –20 °C’de saklanmalıdır. Bu durumda da numuneler test edilmeden önce oda ısısında tamamen çözülmelidir. Tekrar tekrar çözüp dondurmaktan kaçınılmalıdır. Eğer rektal swap kullanıldıysa, test için , yeteri kadar gaita (yaklaşık 50 mg) alındığından emin olunuz. 9. Test prosedürü Genel bilgi Numuneler çalışılmadan önce ekstraksiyon bufer ve test stripleri (20 – 25 °C) oda sıcaklığına getirilmelidir. Striplerin kutusu oda sıcaklığına gelmeden önce açılıp strip çıkarılmamalıdır.Gerekli olan strip alındıktan sonra kutunun kapağı hemen kapatılmalıdır. Bir kere kullanılan strip tekrar kullanılmamalıdır. Test direk gün ışığı almamalıdır. Kalan reaktifleri tekrar geri kaplarına dökmeyiniz kontaminasyona sebep olabilir. 9.2. Numuneleri Hazırlama 1 ml Extraksiyon bufer Diluent belirtilen test tüpüne konur. Sıvı gaita numunesinden 100 μl tek kullanımlık Pipet ile alınır.Ve daha önce hazırlanan buferlı tüpün içine konur. Katı numunelerden, 50 mg alınıp buferın içine konur.Numune iyice homojen hale getirilmelidir. Vortekslenerek ya da pipetle çekip bırakılarak bu sağlanır. Homojen hale gelen numune çökmesi temiz bir süpernatant oluşana kadar 3 dakika beklenir. Üzerinde ki süpernatantdan en az 200 µl en çok 500 µl temiz tüpe transfer edilir.(ya da kaplanmamış bir kuyucuğa) RIDA® Quick Cryptosporidium/Giardia Combi 04-11-18 4 9.3.Numuneyi Test Etme Test stripini Strip tüpünden çıkarın. Hazırlanan numunenin içine daldırın. Okla işaretli yerden daha ileri daldırılmamalıdır. Test sonucu 5 dakika sonra okunabilir. 10. Kalite kontrol – reaktifin miadı Süspansiyon eklenmeden önce kasetin sağlam olup olmadığı ,renk değişimi olup olmadığına bakılmalı.Buna ilave olarak , test inkübasyonundan sonra en azından yeşil kontrol bantı görülmelidir.Görülmez ise testi tekrar etmeden önce aşağıdakiler kontrol edilmelidir. • Test kasetlerinin ve kullanılan ekstraksiyon buferın miadı kontrol edilmelidir. • Test prosedürünü kontrol edin • Ekstraksiyon buferın kontamine olup olmadığı Bunlardan emin olduktan sonra, yeni kaset ile testi tekrar ettiğinizde , eğer kontrol bandı görünür değilse, lütfen üretici ya da R-Biopharm distirübütörü ile kontak kurunuz. 10. Değerlendirme ve yorumlama 11. Değerlendirme ve yorumlama Maksimum sırasıyla aşağıdaki 3 band görülür: bir mavi(T1=test bandı 1) , bir kırmızı (T2=test bandı 2)ve bir yeşil değerlendirilemez! (C = kontrol band) band. Eğer yeşil band yoksa test geçersizdir, Aşağıdaki olası yorumlar mümkündür: - Cryptosporidien pozitif : mavi ve yeşil band görülür. - Giardia pozitif : kırmızı ve yeşil band görülür. - Cryptosporidium ve Giardia pozitif : mavi, kırmızı ve yeşil oluşur. - Negatif: yalnızca yeşil band görülür. - Geçersiz:Hiçbir band görülmez ya da yukarıda tariflenen kombinasyondan farklı olursa. Banttaki renk değişimi 10 dakika ya da daha sonra olursa bir anlam ifade etmez ve değerlendirilmez. RIDA® Quick Cryptosporidium/Giardia Combi 04-11-18 5 12. Metod Limitleri RIDA®QUICK Cryptosporidium/Giardia Combi testi gaitadaki Cryptosporidium parvum ve/veya Giardia lamblia patojenlerini tespit eder.Test spesifik görünür bantların şiddeti ile klinik semptomların şiddetini ortaya çıkarmak için kullanılamaz. Sonuçlar klinik tablo ile birlikte yorumlanmalıdır. Pozitif sonuçlar, diğer bulaşıcı patojenlerin olmadığı anlamına gelmez. Negatif sonuçlar Cryptosporidium parvum ve Giardia lamblia enfeksiyonu olmadığı anlamına gelmez. Bu enfeksiyon aralıklı olarak salgılanan patojenler ya da numune olan çok küçük miktardaki patojenler tarafından olabilir.Eğer hasta anemik ya da aran patojen tarafından enfekte olduğu şüphesi varsa 4 hafta sonra bir gaita numunesi alınarak test tekrar edilmelidir. Fazla gaita numunesi, spesifik band renklerinin oluşacağına kahve rengin oluşmasına sebep olur. Bu kahve renkli bantların bir anlamı yoktur. Bu gibi durumlarda, daha az miktarda gaita ile testi tekrar etmek gerekli olacaktır. Ya da daha önce hazırlanan süspansiyon dilüe edilir (temiz süpernatant oluştuktan sonra) çok fazla gaita tarafından sonucun maskelenmesi önlenip patojen bakterinin varlığı aranır. 13. Performans karakterleri 13.1. Klinik karşılaştırma çalışması Rutin laboratuvar çalışmalarında , RIDA® Quick Cryptosporidium/Giardia Combi metodu ile mikroskopi metodu donmuş ve taze numunelerde yapıldı. Toplam 70 numune kullanıldı.(15 Cryptosporidium pozitif,15 Giardia lamblia pozitif ve 40 negatif numune). Sonuçlar Talo1 ve Tablo 2 dedir. Tablo 1:RIDA® Quick Cryptosporidium/Giardia Combi ile mikroskopinin karşılaştırılması, Cryptosporidium bandı ile birlikte değerlendirme RIDA® Quick Cryptosporidium/Giardia Combi + + 14 1 Mikroskopi Hassasiyet: 93.8 % Özgüllük: 100.0 % 0 40 pos. prognosis değeri: 100.0 % neg. prognosis değeri : 97.5 % RIDA® Quick Cryptosporidium/Giardia Combi 04-11-18 6 Tablo 2: RIDA® Quick Cryptosporidium/Giardia Combi ile mikroskopinin karşılaştırılması Giardia-bandı ile birlikte değerlendirme RIDA® Quick Cryptosporidium/Giardia Combi + + 15 0 Mikroskopy Hassasiyet: 100.0 % Özgüllük: 95.2 % 2 38 pos. prognosis değeri neg. prognosis değeri : : 88.2 % 100.0 % 13.2. Çapraz reaksiyonlar RIDA® Quick Cryptosporidium/Giardia Combi testi aşağıdaki parazitlerle çapraz reaksiyon vermemiştir: Entamoeba coli Blastocystis hominis Jodamoeba buetschlii Chilomastix mesnili Endolimax nana Eggs of Taenia spp. RIDA® Quick Cryptosporidium/Giardia Combi 04-11-18 7 Referanslar 1. Black, R. E. et al.: Giardiasis in day-care centers: Evidence of person-to-person transmission. Pediatrics 60 (No. 4), 486 - 491 (1977). 2. Craun, G. F.: Waterborne Giardiasis in the United States: A review. Am. J. Pub. Health 69 (No. 8), 817 - 819 (1979). 3. Nask, T. E. et al.: Experimental human infections with Giardia lamblia. J. Infect. Dis. 156 (No. 6), 974 - 984 (1987). 4. Smith, H. V. et al.: Giardia and Giardiasis: What's in a name? Microbiol. Eur. 3 (No. 1), 22 - 29 (1995). 5. Thompson, R. C. A., Reynoldson, J. A.: Giardia and Giardiasis. Adv. Parasitol. 32, 71 – 160 (1993) 6. Xiao, L.: Giardia infection in farm animals. Parasitology today 10 (No. 11), 436 - 438 (1994). 7. Schunk, M. et al.: Detection of Giardia lamblia and Entamoeba histolytica in stool samples by two enzyme immunoassays. Eur. J. Clin. Microbiol. Infect. Dis. 20, 389 – 391 (2001) 8. Clavel, A.: Evaluation of the optimal number of fecal specimens in the diagnosis of cryptosporidiosis in AIDS and immunocompetent patients. Eur. Journal Clin. Microbiol. Infect. Dis. 14, 46-49 (1995). 9. Current, W. L., Garcia, L. S.: Cryptosporidiosis. Clinics in Laboratory Medicine 11 (No. 4), 873 - 895 (1991). 10. Current, W. L., Garcia, L. S.: Cryptosporidiosis. Clin. Microbiol. Rev. 4 (No. 3), 325 - 358 (1991). 11. Flanigan, T. P.: Human immunodeficiency virus infection and cryptosporidiosis: Protective immune responses. Am. J. Trop. Med. Hyg. 50 (5) Suppl., 29 - 35 (1994). 12. Guarino, A. et al.: Human intestinal cryptosporidiosis: secretory diarrhea and enterotoxic activity in Caco-2 cells. J. Infect. Dis. 171, 976 - 983 (1995). 13. Hayes, E. B. et al.: Large community outbreak of cryptosporidiosis due to contamination of a filtered public water supply. New. Engl. J. Med. 320 (No. 21), 1372 - 1376 (1989). 14. Le Chevallier, M. W. et al.: Giardia and Cryptosporidium spp. in filtered drinking water supplies. Appl. Environ. Microbiol. 57 (No. 9), 2617 - 2621 (1991). 15. Mc. Anulty, J. M. et al.: A community wide outbreak of cryptosporidiosis associated with swimming at a wave pool. Jama 272 (No. 20), 1597 - 1600 (1994). RIDA® Quick Cryptosporidium/Giardia Combi 04-11-18 8