1 giriş - Yıldız Teknik Üniversitesi

YILDIZ TEKNİK ÜNİVERSİTESİ
FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ
PLASMODIUM VIVAX YABANIL TİP LAKTAT
DEHİDROGENAZ ENZİMİNİN SAFLAŞTIRMASININ
OPTİMİZASYONU VE YABANIL TİP İLE MUTANT
ENZİMLERİNİN KİNETİK ANALİZLERİNİN YAPILMASI
Biyolog Özal MUTLU
FBE Biyomühendislik Anabilim Dalında
Hazırlanan
YÜKSEK LİSANS TEZİ
Tez Danışmanı
: Doç. Dr. Dilek TURGUT-BALIK (YTÜ)
İSTANBUL, 2009
İÇİNDEKİLER
Sayfa
SİMGE LİSTESİ……………………………………………………………………….……..v
KISALTMA LİSTESİ…………………………………………………………………….….vi
ŞEKİL LİSTESİ…………………………………………………………………………. ….ix
ÇİZELGE LİSTESİ……………………………………………………………….………….xii
ÖNSÖZ………………………………………………………..……………………………..xiv
ÖZET…………………………………………………………….………………………...…xv
ABSTRACT……………………………………………………………………………….....xvi
1.
GİRİŞ…………………………………………………………………………….1
1.1
Sıtma…………………………………………………………………………......1
1.2
Sıtma Parazitleri ve Yaşam Döngüsü…………………………………………....5
1.2.1
Sivrisinekteki (Vektör) Yaşam Döngüsü………………………………………...5
1.2.2
Omurgalıdaki (Konak) Yaşam Döngüsü………………………………………...6
1.3
Sıtma Genom Projesi ve Sıtma Parazitlerinin Genetik Özellikleri……………....8
1.4
Sıtma Tedavisinde Kemoterapötik Hedefler ve Antimalaral ilaçlar……………11
1.5
Laktat Dehidrogenaz Enzimi (LDH)………………………………………...….16
1.6
Plasmodium Laktat Dehidrogenaz Enzimi ………………………………...........19
1.7
Plasmodium ve Diğer Apicomplexan LDH'ları ………………….……..…..…...22
2.
MATERYAL VE YÖNTEM…………………………………………………...25
2.1
Materyal…………………………………………...............................................25
2.1.1
Kimyasal Maddeler, Enzimler ve Kitler…………………………………..…....25
2.1.2
Ekspresyon Vektörü…………………………………………….…………........26
2.1.3
Echerichia coli Soyu………………………………………………………....…26
2.1.4
Deneylerde Kullanılan Cihazlar………………………………………...…........26
2.1.5
Bakteriyolojik Gelişim İçin Besiyerleri ve Solüsyonlar…………....………..…..27
2.1.6
Stok Solüsyonlar ve Tamponlar...........................................................................27
ii
2.2
Yöntem……………………………………………………………………….....32
2.2.1
Plazmid DNA İzolasyonu.....................................................................................32
2.2.2
2.2.3
Proteinin C Terminaline Polimeraz Zincir Reaksiyonu ile HisTag Eklenmesi...32
Etidyum Bromür İle Boyanan Agaroz Jel Elektroforezi …………………...….…33
2.2.4
Kristal Viyole ile Boyanan Agaroz Jel Elektroforezi..........................................33
2.2.5
DNA’nın Jelden Geri Kazanılması……………………………………………..33
2.2.6
Restriksiyon Endonükleaz Enzimleri ile DNA’nın Kesilmesi………………….34
2.2.7
PvLDH Geni İle İfade Vektörünün Birleştirilmesi……………………….…….34
2.2.8
Kalsiyum Klorür Etkileşimi ile Kompetant E. coli Hücrelerinin Hazırlanması...35
2.2.9
Transformasyon………………………………………………………………....35
2.2.10
Koloni PCR…………………………………………..…………………….........35
2.2.11
Sodyum Dodesil Sülfat Poliakrilamid Jel Elektroforezi (SDS-PAGE)…….…...36
2.2.12
PvLDH Enziminin Saflaştırılması………..………...………………………..….37
2.2.12.1
Yöntem 1: QIAGEN Ni-NTA ile PvLDH Enziminin Saflaştırılması….……....37
2.2.12.2
Yöntem 2: QIAGEN Ni-NTA ile PvLDH Enziminin Saflaştırılması……….…38
2.2.13
Protein Saklama Koşullarının PvLDH Enzimi Üzerindeki Etkisi……………...39
2.2.14
Enzim Aktivitesinin Spektrofotometre İle Tayini……………….……...............39
2.2.15
Enzimlerin Molekül Ağırlıklarının ve Ekstinksiyon Katsayılarının
Hesaplanması……………………………………………………………...…....40
2.2.16
Saflaştırılmış Mutant PvLDH Proteinlerinin Konsantrasyonlarının
Hesaplanması ………………………………………………………………..…40
2.2.17
Kinetik Analiz…………………………………………………………..……....41
2.2.17.1
Enzim Kinetiği………………………………………………………………….41
2.2.17.2
Saflaştırılan Proteinin Kinetik Analizi………………………………………….43
3.
BULGULAR VE TARTIŞMA……………………………………….………....44
3.1.
PvLDH’ın Analizi……………………………………………………………….44
3.1.1
PvLDH Proteininin C Terminaline 6 Histidin Amino Asidinin İlave Edilmesi
İçin PvLDH Geninin Yeniden Alt Klonlamasının Yapılması ve Proteinin
İfade Edilmesi…………………………………………………………………...44
3.1.2
PvLDH Proteininin Saflaştırılması……………………………………………...46
iii
1.6.1.1
3.1.2.2
Yöntem 1 ………………………………………………………………….……..47
Yöntem 2………………………………………………………………………...53
3.1.3
Protein Saklama Koşullarının PvLDH Enzimi Üzerindeki Etkisi………………56
3.1.4
PvLDH’ın Kinetik Analizi……………………………………………………....58
3.1.4.1
PvLDH Proteininin Molekül Ağırlığı ve Extinction Coefficient
Hesaplamasının Yapılması……………………………………………………....58
3.1.4.2
Kinetik Tampon Çözeltisinin Hazırlanması ve Ölçümlerin Yapılması………….58
3.1.4.3
Sonuçların Grafit ile Analizi ve Yorumlanması………………………………...59
3.1.5
PvLDH’ın Aktif Bölge Halkasının Analizi……………….………….……….....61
3.1.5.1
PvLDH Aktif Bölge Halkasındaki Aspartik Asit108A Aminoasidinin
Delesyonunun (PvDLDH) Analizi.......................................................................62
3.1.5.1.1
PvDLDH Proteininin C Terminaline 6 Histidin Amino Asidinin İlave
Edilmesi ve Proteinin İfade Edilmesi..................................................................62
3.1.5.1.2
PvDLDH Proteininin Saflaştırılması....................................................................63
3.1.5.1.3
PvDLDH Proteininin Kinetik Analizi..................................................................65
3.1.5.2
PvLDH Aktif Bölge Halkasındaki Aspartik Asit108A Lisin108B Amino
Asitlerinin Delesyonunun (PvKLDH) Analizi.....................................................67
3.1.6
PvLDH Aktif Bölge Amino Terminal Ucunun Analizi…………………….…..71
3.1.6.1
PvLM3Tg1 Mutant LDH Enziminin Analizi……………………………….…..72
3.1.6.2
PvLM2Tg2 Mutant LDH Enziminin Analizi…………………………………....76
3.1.6.3
PvLM2Ea Mutant LDH Enziminin Analizi…………………………………..…80
3.1.6.4
PvLM3Et Mutant LDH Enziminin Analizi..........................................................84
4.
SONUÇLAR……………………………………………………………………..89
KAYNAKLAR………………………………………………………………….……………95
ÖZGEÇMİŞ……………………………………………………………………………..…..103
iv
SİMGE LİSTESİ
aa
Aminoasit
Å
Angstrom
bp
Baz çifti
Da
Dalton
ε
Extinction Coefficient
g
Gram
kDa
Kilodalton
kcat
Kinetik -Katalizleme
Km
Kinetik- Michaelis-Menten
l
Litre
µg
Mikrogram
µl
Mikrolitre
µM
Mikromolar
mA
Miliamper
ml
Mililitre
mM
Milimolar
M
Molar
MW
Moleküler Ağırlık
nm
Nanometre
nM
Nanomolar
OD
Optik dansite
u
Ünite pmol Pikomol
ºC
Santigrat
Vmax
Maksimum hız
v
KISALTMALAR
A
Adenin
AIDS
Kazanılmış immün yetmezlik sendromu
ATP
Adenozin trifosfat
A/Ala
Alanin
R/Arg
Arjinin
N/Asn
Asparajin
D/Asp
Aspartik asit/ Aspartat
DNA
Deoksiribonükleikasit.
DAB 3
3,3’- Diaminobenzidin
dNTP
Deoksiribonükleotidtrifosfat
dH2O
Distile su
EtLDH
Eimeria tenella laktat dehidrogenaz enzimi
eH2O
Elgastat H2O
EDTA
Ethilendiamintetra-asetik asit
F/Phe
Fenilalanin
G/Gly
Glisin
E/Glu
Glutamik asit/ Glutamat
Q/Gln
Glutamin
GNDA
Gossilik nitril-1,1’ diasetat
G
Guanin
H/His
Histidin
IPTG
Isopropil-B-D-thiogaltopiranosid
I/Ile
Isolösin
CV
Kristal viyole
LDH
Laktat dehidrogenaz
K/Lys
Lisin
LMW
Low Molecular Weight
L/Leu
Lösin
mRNA
Mesajcı RNA
vi
M/Met
Metionin
NAD+
Nikotiamid adenin dinükleotid
NADH
Nikotinamid adenin dinükleotid (indirgenmiş)
PBS
Phosphate buffered saline
pLDH
Plasmodial LDH.
Pf
Plasmodium falciparum
Pk
Plasmodium knowlesi
Pm
Plasmodium malariae
Po
Plasmodium ovale
Pv
Plasmodium vivax
PfLDH
Plasmodium falciparum laktat dehidrogenaz enzimi
PkLDH
Plasmodium knowlesi laktat dehidrogenaz enzimi
PmLDH
Plasmodium malariae laktat dehidrogenaz enzimi
PoLDH
Plasmodium ovale laktat dehidrogenaz enzimi
PvLDH
Plasmodium vivax laktat dehidrogenaz enzimi
PCR
Polimeraz Zincir Reaksiyonu
P/Pro
Prolin
RNA
Ribonükleikasit
SAB
Sample Amplification Buffer
S/Ser
Serin
C/Cys
Sistein
C
Sitozin
SDS
Sodyum dodesil sülfat
TpLDH
Theileriaparva laktat dehidrogenaz enzimi
T
Timin
Tg1LDH
Toxoplasma gondii’nin LDH1 izoformu
Tg2LDH
Toxoplasma gondii’nin LDH2 izoformu
T/Thr
Treonin
W/Trp
Triptofan
TAE
Tris-Asetat-EDTA
TEMED
NNN’N’-Tetramethilenethilendiamin
vii
Y/Tyr
Tirozin
V/Val
Valin
WT
Yabanıl tip
WHO
Dünya Sağlık Örgütü
viii
ŞEKİL LİSTESİ
Şekil 1.1 Dünya genelinde sıtmanın dağılım haritası……………………………………….....2
.
Şekil 1.2 Türkiye’de 1926–2007 yılları arası sıtma vakalarının şematik gösteri……………...3
Şekil 1.3 Plasmodium’un hayat devri……………………………………………………….....7
Şekil 1.4 LDH enzimi tarafından L-laktatın pürivata oksidasyonunu veya pürivatın laktata
Redüksiyonu……………………………………………………………………….16
Şekil 1.5 PfLDH ve memeli LDH’ında substrat bağlanma bölgesi ve substrat
spesifik halkaya bitişik yarığın varlığı ve yokluğunun gösterilmesi……………….20
Şekil 1.6 GNDA’nın PfLDH ve Memeli LDH’ında ki farklı davranışı………….…………...20
Şekil 2.1 Bir enzim tepkimesinde substrat (S) konsatrasyonu ile hız (v) arasındaki ilişkiyi
gösteren doyma eğrisi……………………………………………………….……..41
Şekil 2.2 Enzimatik reaksiyon ile substratın (S) ürüne (Ü) dönüşmesinin gösterimi.
E: enzim; k1, k2 ve k3 hız sabitleri………… ………………………………...…….42
Şekil 3.1 Pv7 ve Pv15 primerleri kullanılarak kristal boyalı agaroz jelde yürütülen PCR
örnekleri…………………………………………………………………………....45
Şekil 3.2 Pv7 ve Pv15 primerleri kullanılarak EtBr boyalı agaroz jelde yürütülen
PCR örneği…………………………………………………………………...……..45
Şekil 3.3 Koloni PCR sonrası DNA bantlarının jelde görüntülenmesi…………………...…..46
Şekil 3.4 Protokol 2’nin SDS-PAGE görüntüsü………………………………………….......49
Şekil 3.5 Protokol 2’nin elüsyonlarının tamamının SDS-PAGE görüntüsü………………….49
Şekil 3.6 Protokol 3’ün SDS-PAGE görüntüsü…………………………………………...….50
Şekil 3.7.Protokol 3’ün elüsyonlarının tamamının SDS-PAGE görüntüsü………………..…50
Şekil 3.8 Protokol 4’ün SDS-PAGE görüntüsü…………………………………………...….51
Şekil 3.9 Protokol 4’ün elüsyonlarının tamamının SDS-PAGE görüntüsü………………......51
Şekil 3.10 Protokol 5 proteininin saflaştırılması sonucu elde edilen saf proteinlerin
SDS-PAGE görüntüsü…………………………………………...………………..52
Şekil 3.11. Protokol 5 proteininin saflaştırılması sonucu elde edilen saf proteinlerin
elüsyonlarının tamamının SDS-PAGE görüntüsü…………………………...…..52
Şekil 3.12 PvLDH proteininin Yöntem 3 ile saflaştırılması sonucu elde edilen
saf proteinlerin SDS-PAGE görüntüsü……………………...…………………….54
ix
Şekil 3.13 PvLDH proteininin saflaştırılması sonucu elde edilen saf proteinlerin
elüsyonlarının tamamının SDS-PAGE görüntüsü……………………………......55
Şekil 3.14 Enzim aktivitesinin, kullanılan koruyucu madde ve saklama sıcaklığına göre
değişimini gösteren grafik……………………………………………………........57
Şekil 3.15 PvLDH’ın Steady-State kinetik davranışı………………………………………....60
Şekil 3.16 Aktif bölge halkasından D amino asitinin uzaklaştırıldığının gösterildiği
PvDLDH dizileme sonucu………………...……………………………………....63
Şekil 3.17 PvDLDH mutant LDH enzimine eklenen 6-HisTag’ın mutant gendeki yerinin
gösterilmesi………………………………………………………………………..63
Şekil 3.18 PvDLDH proteininin saflaştırılması sonucu elde edilen saf proteinlerin SDSPAGE görüntüsü…………………………………………………..………….…...64
Şekil 3.19 PvDLDH proteininin saflaştırılması sonucu elde edilen saf proteinlerin
elüsyonlarının tamamının SDS-PAGE görüntüsü. ……………………….…..….64
Şekil 3.20 PvDLDH’ın Steady-State kinetik davranışı ………………………..…………......66
Şekil 3.21 Aktif bölge halkasından D ve K amino asitlerinin uzaklaştırıldığının
gösterildiği PvKLDH dizileme sonucu…………………………….………….......67
Şekil 3.22 PvKLDH mutant LDH enzimine eklenen 6-HisTag’ın mutant gendeki yerinin
Gösterilmesi………………………………………………………………..….......68
Şekil 3.23 PvKLDH proteininin saflaştırılması sonucu elde edilen saf proteinin
SDS-PAGE Görüntüsü………………………………………………………..…....68
Şekil 3.24 PvKLDH proteininin saflaştırılması sonucu elde edilen saf proteinlerin
elüsyonlarının tamamının SDS-PAGE görüntüsü………………………….….....68
Şekil 3.25 PvKLDH’ın Steady-State kinetik davranışı……………………………………….70
Şekil 3.26 Plasmodium vivax LDH’ ının Toxoplasma gondii LDH-1’e benzetilmesi
ile elde edilen mutant genin dizi analizi sonuçları...................................................72
Şekil 3.27 PvLM3Tg1 enzimine eklenen 6-HisTag’ın mutant gendeki yerinin gösterilmesi..73
Şekil 3.28 PvLM3Tg1 proteininin saflaştırılması sonucu elde edilen saf proteinlerin
SDS-PAGE görüntüsü………………………………………………………...…..73
Şekil 3.29 PvLM3Tg1 proteininin saflaştırılması sonucu elde edilen saf proteinlerin
elüsyonlarının tamamının SDS-PAGE görüntüsü. ………………………...……73
x
Şekil 3.30 PvLM3Tg1’ın Steady-State kinetik davranışı……………………...…………......75
Şekil 3.31 Plasmodium vivax LDH’ ının Toxoplasma gondii LDH-2’ye benzetilmesi
ile elde edilen mutant genin dizi analizi sonuçları...................................................76
Şekil 3.32 PvLM2Tg2 enzimine eklenen 6-HisTag’ın mutant gendeki yerinin gösterilmesi..77
Şekil 3.33 PvLM2Tg2 proteininin saflaştırılması sonucu elde edilen saf proteinlerin
SDS-PAGE görüntüsü.. ..........................................................................................77
Şekil 3.34 PvLM2Tg2 proteininin saflaştırılması sonucu elde edilen saf proteinlerin
elüsyonlarının tamamının SDS-PAGE görüntüsü..................................................77
Şekil 3.35 PvLM2Tg2’nin Steady-State kinetik davranışı......................................................79
Şekil 3.36 Plasmodium vivax LDH’ ının Eimeria acervulina LDH ’ına benzetilmesi
ile elde edilen mutant genin dizi analizi sonuçları..................................................80
Şekil 3.37 PvLM2Ea enzimine eklenen 6-HisTag’ın mutant gendeki yerinin gösterilmesi….81
Şekil 3.38 PvLM2Ea proteininin saflaştırılması sonucu elde edilen saf proteinlerin SDSPAGE görüntüsü. …………………………………………………………..…....81
Şekil 3.39 PvLM2Ea proteininin saflaştırılması sonucu elde edilen saf proteinlerin
elüsyonlarının tamamının SDS-PAGE görüntüsü………………………………..81
Şekil 3.40 PvLM2Ea’nın Steady-State kinetik davranışı……………………….………..…...83
Şekil 3.41 Plasmodium vivax LDH’ ının Eimeria tenella LDH ’ına benzetilmesi ile elde
edilen mutant genin dizi analizi sonuçları................................................................84
Şekil 3.42 PvLM2Ea enzimine eklenen 6-HisTag’ın mutant gendeki yerinin gösterilmesi.…85
Şekil 3.43 PvLM3Et proteininin saflaştırılması sonucu elde edilen saf proteinlerin SDSPAGE görüntüsü. ……………………………………………………………….....85
Şekil 3.44 PvLM3Et proteininin saflaştırılması sonucu elde edilen saf proteinlerin
elüsyonlarının tamamının SDS-PAGE görüntüsü……………………………....85
Şekil 3.45 PvLM3Et’nın Steady-State kinetik davranışı…………………………………......87
xi
ÇİZELGE LİSTESİ
Çizelge 1.1 P. yoelii yoelli, P. vivax, P. knowlesi ve P. falciparum’un bazı genomik
özellikleri …………………………………………………………………….…..10
Çizelge 1.2 Sıtma tedavisinin amacı, hedefler ve kullanılan ilaçlar ………………………....12
Çizelge 1.3 Plasmodium’da temel kemoterapötik hedeflerin özeti ………………………….13
Çizelge 1.4 İnsan-m, P. falciparum, P. vivax, P. ovale, ve P. malariae LDH
enziminin ilave 5 amino asitin gösterimi………………………………………...22
Çizelge 1.5 Plasmodium vivax ve diğer bazı Apicomplexan LDH’larının
aktif bölgesindeki amino asit dizisi…………………….……………….…….....23
Çizelge 2.1 Yöntem 1’in uygulama koşulları………………………………………………...40
Çizelge 3.1 Optimizasyon çalışmalarında kullanılan çözeltiler ve içerikleri………………....47
Çizelge 3.2 PvLDH proteininin Ni-NTA agaroz ile saflaştırılması çalışmalarının
optimizasyon denemeleri…………………………….……………………….....48
Çizelge 3.3 Optimizasyon çalışmalarında kullanılan çözeltiler ve içerikleri………………...54
Çizelge 3.4 PvLDH proteininin Ni-NTA agaroz ile saflaştırılmasında kullanılan kolon ve
tampon miktarları………………………………………………………………..54
Çizelge 3.5 PvLDH’ın hücre lizatı, süzüntüler, yıkamalar ve elde edilen elüsyonalardaki
enzim aktivitesinin tespiti………………………………………………………..55
Çizelge 3.6 25 günlük saklama süresi sonunda alınan aktivite sonuçları……………..….…..57
Çizelge 3.7 PvLDH enziminin aktivitesinin 340 nm’de (Δ A340/dakika) ölçülmesi……...….59
Çizelge 3.8 PvLDH’ın Grafit ile analizi sonucunda elde edilen sonuçlar……………...…….60
Çizelge 3.9 PvLDH’ın Steady State kinetik parametreleri…………………………...……...60
Çizelge 3.10 PvLDH’ın aktif bölge halkasındaki ilave 5 amino asidin delesyonu…………..62
Çizelge 3.11 PvDLDH’ın hücre lizatı, süzüntüler, yıkamalar ve elde edilen
elüsyonalardaki enzim aktivitesinin tespiti…………………………….……....64
.
Çizelge 3.12 PvDLDH enziminin aktivitesinin 340 nm’de (Δ A340/dakika) ölçülmesi….…..65
Çizelge 3.13 PvDLDH’ın Grafit ile analizi sonucunda elde edilen sonuçlar………………...65
Çizelge 3.14 PvDLDH’ın Steady State kinetik parametreleri…………………………...…...66
Çizelge 3.15 PvKLDH’ın hücre lizatı, süzüntüler, yıkamalar ve elde edilen
elüsyonalardaki enzim aktivitesinin tespiti………………………….………...69
xii
Çizelge 3.16 PvKLDH enziminin aktivitesinin 340 nm’de (Δ A340/dakika) ölçülmesi……...69
Çizelge 3.17 PvKLDH’ın Grafit ile analizi sonucunda elde edilen sonuçlar……..……….....70
Çizelge 3.18 PvKLDH’ın Steady State kinetik parametreleri………………………….….....70
Çizelge 3.19 Plasmodium vivax ve diğer bazı Apicomplexan LDH’larının
aktif bölgesindeki amino asit dizisi …………..………………………………....72
Çizelge 3.20 PvLM3Tg1’in hücre lizatı, süzüntüler yıkamalar ve elde edilen
elüsyonalardaki enzim aktivitesinin tespiti……………………..…………..…..74
Çizelge 3.21 PvLM3Tg1 enziminin aktivitesinin 340 nm’de (Δ A340/dakika) ölçülmesi…....74
Çizelge 3.22 PvLM3Tg1’ın Grafit ile analizi sonucunda elde edilen sonuçlar……………....75
Çizelge 3.23 PvLM3Tg1’ın Steady State kinetik parametreleri…………………………...…75
Çizelge 3.24 PvLM2Tg2’nin hücre lizatı, süzüntüler, yıkamalar ve elde edilen
elüsyonalardaki enzim aktivitesinin tespiti. …………………………………...78
Çizelge 3.25 PvLM2Tg2 enziminin aktivitesinin 340 nm’de (Δ A340/dakika) ölçülmesi……78
Çizelge 3.26 PvLM2Tg2’nin Grafit ile analizi sonucunda elde edilen sonuçlar……………..79
Çizelge 3.27 PvLM2Tg2’nin Steady State kinetik parametreleri…….……………………….....…79
Çizelge 3.28 PvLM2Ea’ın hücre lizatı, süzüntüler, yıkamalar ve elde edilen
elüsyonalardaki enzim aktivitesinin tespiti……………………..……………...82
Çizelge 3.29 PvLM2Ea enziminin aktivitesinin 340 nm’de (Δ A340/dakika) ölçülmesi……..82
Çizelge 3.30 PvLM2Ea’nın Grafit ile analizi sonucunda elde edilen sonuçlar………………83
Çizelge 3.31 PvLM2Ea’nın Steady State kinetik parametreleri………………………….…..83
Çizelge 3.32 PvLM3Et’nin hücre lizatı, süzüntüler, yıkamalar ve elde edilen
elüsyonalardaki enzim aktivitesinin tespiti……………………...…………..….86
Çizelge 3.33 PvLM3Et
ölçülmesi……...86
enziminin
aktivitesinin
340
nm’de
(Δ
A340/dakika)
Çizelge 3.34 PvLM3Et’nın Grafit ile analizi sonucunda elde edilen sonuçlar…………….....87
Çizelge 3.35 PvLM3Et’nin Steady State kinetik parametreleri………………………….…...87
Çizelge 4.1 Plasmodium vivax’ın LDH Geninin Aktif Bölge halkasının kısaltılmasının
toplu sonuçları……………………………………………………….………....91
Çizelge 4.2 Plasmodium vivax’ın LDH geninin aktif bölgesinin amino terminal uç bölgesi
ve aktif bölge halkasındaki yönlendirilmiş mutagenez toplu sonuçları………93
xiii
ÖNSÖZ
Öncelikle bu tez çalışmasını yapmamda bana her türlü desteği veren, deneyim ve tecrübesiyle
yol gösteren ve kendisinden çok şey öğrendiğim değerli hocam Doç. Dr. Dilek Turgut-Balık’a
çok teşekkür ederim.
Tez çalışmasının yürütülmesine maddi destek sağlayan TÜBİTAK, Yıldız Teknik
Üniversitesi’ne ve Yıldız Teknik Üniversitesi Biyomühendislik Bölümü’ne ve bölümdeki
hocalarıma teşekkür ederim.
Lisansüstü çalışmamı yürütmemde sürekli destek olan Marmara Üniversitesi, Biyoloji
Bölümü’ne ve bölümdeki hocalarıma teşekkür ederim.
Çalışmamın yürütüldüğü laboratuarın altyapısının kurulması yönünde ek destek sağlayan
Devlet Planlama Teşkilatına ve DPT Projesinin ilk yürütücüsü Prof. Dr. Mehmet Mustafa
Akdeste’ye teşekkürü bir borç bilip yakın zamanda kaybettiğimiz hocamızı saygı ile
anıyorum. Söz konusu DPT projesini devralan ve büyük bir özveri ile yürütmekte olan
Kimya-Metalürji Fakültesi Dekanı Prof. Dr. Sabriye Pişkin’e de yine teşekkürü borç bilirim.
Bristol Üniversitesi, İngiltere, Medikal Bilimler Okulu’ndan Prof. Dr. Leo Brady ve grubuna
ve yine aynı grupta bulunan Dr. Richard Sessions, Dr. Debbie Shoemark ve Kathleen
Moreton’a bilimsel destekleri için teşekkür ederim.
Grup içi çalışmaları ile tez çalışmasının yürütülmesine katkıda bulunan Biyomühendislik
Bölümü, Moleküler Genetik Laboratuarı grup arkadaşlarım Arş. Gör. Yunus Sarıçay, Mustafa
Çiçek ve Aslıhan Huri Balcıoğlu’na ve Arş. Gör. Venhar Çelik’e teşekkür ederim.
Dostluklarıyla her zaman yanımda olan Ayşe, Olga, Rabia, Serhat, İsa ve diğer yüksek lisans
ve doktora öğrencisi arkadaşlarıma ve bütün Biyomühendislik Bölümü personeline teşekkür
ederim.
Tez çalışması süresince sabır ve desteklerini esirgemeyen aileme ve eşim Aycan Mutlu’ya
çok teşekkür ederim
Özal MUTLU
xiv
ÖZET
Günümüzde kullanılan antimalaryal ilaçlara karşı olan direnç, sıtmanın kontrolünü aksatan bir
temel halk sağlığı sorunudur. Bu durum yeni ilaçların geliştirilmesini zorunlu kılmaktadır. Bu
sebeple, bu tezde Plasmodium vivax’ın glikolotik enzimi olan laktat dehidrogenaz yeni
antimalaryalların tasarımında hedef olarak belirlenmiştir.
Tezin ilk bölümünde, Plasmodium vivax laktat dehidreogenaz enzimi C- terminalinde Histag’a sahip olarak klonlanmış ve saf ve aktif enzim yoğun optimizasyon çalışmaları
sonucunda elde edilmiştir. Optimizasyon çalışmaları neticesinde, rekombinant Plasmodium
vivax LDH enzimi kinetik çalışmalar için yeterli saflıkta ve miktarda saflaştırılmıştır.
Tezin ikinci bölümünde, daha önceden yönlendirilmiş mutagenez çalışmaları sonucunda aktif
bölge halkasından her seferinde bir amino asit çıkarılması ile elde edilmiş olan PvDLDH ve
PvKLDH mutant Plasmodium vivax LDH enzimlerinin kinetik çalışmaları yapılmıştır. Aktif
bölge halkasının kısaltılması sonucunda enzimlerin substratına olan afiniteleri ve benzer
şekilde kcat değeri düşmüştür.
Tezin son bölümü, önceden yönlendirilmiş mutagenez çalışmalarıyla Toxoplasma gondii I
LDH, Toxoplasma gondii II LDH, Eimeria acervulina LDH, Eimeria tenella LDH
enzimlerinin taklit edildiği mutant Plasmodium vivax LDHlarının saflaştırılmasını ve kinetik
analizlerinin yapılmasını içermektedir. Temel fark mutant enzimlerin substratlarına olan
affinitesinde gözlenmiştir.
Elde edilen tüm veriler yabanıl tip Plasmodium vivax laktat dehidrogenaz enzimin kinetik
sonuçlarıyla karşılaştırılmış ve yeni antimalaryalların geliştirilmesinde aktif bölge halkasının
ve aktif bölge halkasının amino terminalinin önemi kanıtlanmıştır.
Anahtar Kelimeler: Sıtma, Laktat dehidrogenaz, Plasmodium vivax, Theileria parva,
Toxoplasma gondii, Eimeria acervulina, Eimeria tenella, Yönlendirilmiş Mutagenez, Protein
Saflaştırma, Aktif bölge Halkası
xv
ABSTRACT
Resistance to currently available antimalarial drugs is a major public healt problem that
hinders the control of malaria. This necessitates development of new drugs. To this end, in
this thesis glycolytic enzyme lactate dehydrogenase of Plasmodium vivax has been targetted
for the design of novel antimalarials.
In the first part of the thesis, Plasmodium vivax lactate dehydrogenase was expressed with
having a C-terminal His-tag and the pure and active enzyme has beeen obtained by applying
intense optimization studies. As a result of optimization studies, recombinant Plasmodium
vivax LDH has been purified in the sufficient purity and quantity for the kinetic analysis.
In the second part of the thesis, kinetic studies have been done on the PvDLDH and PvKLDH
mutant Plasmodium vivax LDH enzymes that were previously obtained by deleting one amino
acids each time from the active site loop by the site directed mutagenesis. As a result of
shortening of the active site loop caused a decrease in the affinity of the enzymes to their
substrate and similarly a decrease in the kcat value.
The last part of the thesis consisted of purification and kinetic analysis of the previously
mutated Plasmodium vivax LDHs to mimick Toxoplasma gondii I LDH, Toxoplasma gondii
II LDH, Eimeria acervulina LDH, Eimeria tenella LDH. Main difference was observed in the
affinity of the mutant enzymes to their substrate.
All of the results were compared with the kinetic results of wilde type Plasmodium vivax
lactate dehydrogenase and proved the importance of the active site loop and amino terminal of
the active site loop in the design of new antimalarials.
Key Words: Malaria, Lactate Dehydrogenase, Plasmodium vivax, Theileria parva,
Toxoplasma gondii, Eimeria acervulina, Eimeria tenella, Site Directed Mutagenesis, Protein
Purification, Active Site Loop
xvi
1. GİRİŞ
1.1 Sıtma
Sıtma, dişi anofel cinsi sivrisineklerin kan emerken konak canlıya bulaştırdıkları Plasmodium
parazitlerinin sebep olduğu bir tropikal parazit hastalığıdır (Kayser, 2005). Plasmodium’lar
başta kuşlar olmak üzere kaplumbağa, kertenkele ve yılan gibi sürüngenleri ve primat,
kemirgen gibi memelileri enfekte etmektedirler (Knell, 1991).
Sıtma parazitleri hayat döngülerinin bir kısmını taşıyıcı olan dişi anofel cinsi sivrisinekte
sürdürürken, diğer bölümünü de konak canlıda tamamlamaktadırlar. İnsanları enfekte eden
beş Plasmodium türü bulunmaktadır. Bunlar; Plasmodium vivax (P. vivax), Plasmodium
falciparum (P. falciparum), Plasmodium ovale (P. ovale), Plasmodium malariae (P.
malariae) ve Plasmodium knowlesi (P. knowlesi)’dir. Yakın zamana kadar insan sağlığını
tehdit eden dört Plasmodium türü bulunmaktayken Plasmodium knowlesi’nin de insanları
enfekte ettiği kesinlik kazanarak, insanları enfekte eden beşinci Plasmodium türü olarak yerini
almıştır (Cox-Singh vd., 2008).
İnsan sağlığını ciddi anlamda tehdit eden ve asıl sıtma ölümlerinin sebebi olan Plasmodium
türü P. falciparum’dur ve bu yüzden falciparum sıtması malign yani kötü huylu sıtma olarak
adlandırılmaktadır. P. falciparum’a bağışıklığı bulunmayan kişilerde hastalık çok çabuk
ilerler ve öyle ki bazı durumlarda belirtilerin ortaya çıkışından 24 saat sonra hastalar hayatını
kaybedebilir. Bu sıtma türünde nöbetler sürekli ateşli bir şekilde veya kötü nöbetler şeklinde
görülmektedir. Ayrıca P. falciparum sıtması serebeller sendromu, anemi, beyin sıtması,
hiperglisemi ve renal fonksiyon bozukluğu gibi hastalıklara neden olmaktadır. P. falciparum
Afrika’da ve Güneydoğu Asya’nın büyük bir bölümünde yaygındır. P. vivax sıtması ise daha
iyi seyirli ve nadir olarak yaşamı tehdit etmektedir. Bu nedenle de P. vivax’ın yapmış olduğu
sıtma benign sıtma olarak da adlandırılmaktadır. Bağışık olmayan insanlarda P. vivax
sıtmasının akut ölüm oranı çok düşük olmakla birlikte çocuklarda ölümcül olabilmektedir. P.
vivax sıtması genel olarak anemi ve dalak büyümesine neden olmaktadır. P. vivax daha çok
sıcak ve tropik bölgelerde enfeksiyona sebep olur ve Plasmodium türleri içerisinde tüm
dünyada en geniş coğrafi yayılım gösteren türdür. Türkiye’de de yerli olarak görülen tür P.
vivax’dır. P. ovale yalnızca Batı Afrika ve Pasifik yerlilerinde hastalık oluşturmakta ve bu tür
ile enfekte kişilerde hastalık hafif seyretmektedir. Diğer ırklar bu türe doğal olarak bağışıklık
kazanmıştırlar. P. malariae olgusuna ise pek rastlanılmamaktadır. P. malariae’nın
1
anofellerdeki evriminin uzun sürede gerçekleşmesi nedeni ile sporogoninin tamamlanamadan
anofellerin yaşamlarını yitirmeleri bunun temel nedeni olarak gösterilmektedir (Unat
vd.,1995; Akdur, 1997; Özcel, 1999).
Plasmodium knowlesi Doğu ve Güney Asya boyunca çok geniş bir alanda dağılım gösteren ve
insanları enfekte eden beşinci sıtma paraziti olarak kayda geçmiştir. Plasmodium knowlesi,
doğal olarak eski dünya maymunlarını enfekte eden bir türdür. İnsanları doğal yollardan
enfekte ettiğine dair bulgular çok az bulunmaktadır. 2001–2006 yılları arasında Malezya da
yapılan araştırmada, Plasmodium knowles’nin çok geniş çapta insanları enfekte ettiği ve
mikroskobik tanı aşamasında P. malariae ile karıştırıldığından dolayı bu güne kadar teşhisinin
kesin bir biçimde yapılamadığı ortaya çıkmıştır. Yapılan klinik araştırmalar sonucu birçok
insanın P. knowlesi sıtmasından dolayı hayatını kaybettiği kaydedilmiştir (Cox-Singh vd.,
2008).
Dünya nüfusunun yaklaşık yarısı (3,3 milyar) sıtmanın bulaşma riskinin olduğu bölgelerde
yaşarken, beşte biri (1,2 milyar) sıtma riskinin yüksek olduğu bölgelerde yaşamaktadır. Diğer
2,1 milyar insan ise düşük risk bölgelerinde bulunmaktadır. Sıtma, günümüzde dünya
genelinde 1 milyona yakın kişinin ölümünden sorumlu olarak, solunum yolu enfeksiyonları
(4.2 milyon), ishal enfeksiyonları (2.2 milyon), AIDS (2 milyon), ve tüberkoloz’dan (1.5
milyon) sonra en çok ölümlere neden olan enfeksiyon hastalığıdır (WHO, 2008a). Afrika ve
az gelişmiş diğer bölgelere baktığımızda ise çoğunluğu Orta ve Güney Afrika, Asya,
Okyanusya, Orta ve Güney Amerika ve Kafkasya’da olmak üzere 109 ülke’de endemiktir.
Herhangi bir sıtma riskiyle karşı karşıya olan en kalabalık nüfus Güney-Doğu Asya ve Batı
Pasifik bölgelerinde bulunurken Afrika ise yüksek sıtma riski altında en fazla insan nüfusunu
barındıran bölgedir ve bu yüzden sıtma ölümlerinin yaklaşık %90’ bu kıtada meydana
gelmektedir (WHO, 2008b).
Şekil 1.1 Dünya genelinde sıtmanın dağılım haritası (WHO, 2008b)
2
Dünya sağlık örgütü 2008 yılı raporuna göre; 2006 yılında, dünya genelinde %91’i P.
falciparum’dan dolayı meydana gelen toplam 247 milyon sıtma olgusu meydana gelmiştir.
Vakaların büyük bir bölümü Afrika bölgesinde (%86) diğer kısmı ise Güney-Doğu Asya (%9)
ve Doğu Akdeniz’de (%3)’dir (Şekil 1.1). 2006 yılında, dünya genelinde, %90’ı Afrika
bölgesinde, %4’ü Güney-Asya ve Batı Akdeniz’de olmak üzere 881 000 kişinin sıtmadan
hayatını kaybetmiştir. Ölüm riski diğer bölgelere göre Afrika’da belirgin bir şekilde daha
yüksektir. Tahmini ölümlerin %85’i 5 yaş altı çocuklarda meydana gelirken, en fazla ölüm
oranı ise Afrika’da (88%) ve Doğu Akdeniz’de (%76) görülmektedir (WHO, 2008b).
Türkiye’de sıtmanın tarihi çok eskilere dayanmaktadır. Anadolu’da sıtma, tarihler boyunca
salgınlar yapmış ve sadece insanların ölümüne neden olmakla kalmamış birçok Ege ve
Akdeniz medeniyetlerinin çökmesinde de büyük rol oynamıştır. Kurtuluş savaşı sırasında ve
onu izleyen Cumhuriyetin ilk yıllarında sıtma toplumsal olarak büyük bir öneme sahip olmuş
ve sıtma ile mücadeleye büyük önem verilmiştir. Bu önem sonucu ve yapılan çalışmalar
sayesinde sıtma ülkemizde 1968 yılı itibariyle büyük oranda kontrol altına alınmıştır. Ancak
1971 yılından başlayarak 1977 yılına kadar sıtma vakaları keskin bir şekilde yükselmiştir
(Şekil 1.2). 1970’ler öncesi P. falciparum en yaygın parazit iken kontrol çalışmaları sonrası
diğer bir sıtma paraziti olan P. vivax sık görülmeye başlamıştır. P. vivax sıtması P. falciparum
sıtması gibi öldürücü olmadığından sıtmadan dolayı ölümler bildirilmemektedir. Ancak P.
vivax sıtması doğrudan ölümlere sebep olmazken, sıtmaya bağlı olarak düşük, erken doğum,
düşük doğum ağırlıklı bebek ve ölü doğum ile anne ölümlerine neden olmaktadır (Özcel,
1999).
Şekil 1.2 Türkiye’de 1926–2007 yılları arası sıtma vakalarının şematik gösterimi [1]
Ülkemizde sıtma en çok Güney-Doğu’da yaygındır. 2006 yılında, olguların %84’ü Diyarbakır
3
ve Şanlıurfa’da olmak üzere 7 ilde (Diyarbakır, Şanlıurfa, Siirt, Bitlis, Mardin, Hakkari ve
Batman) bulaşma rapor edilmiştir. Bu bölgelerimizde P. vivax sıtması görüldüğünden dolayı
ölüm vakası bildirilmemekle birlikte tahmini sıtma bulaşma olgularının 1500 olduğu tahmin
edilmektedir. Ayrıca 2006 yılında Türkiye dışı kaynaklı (emporte) olduğu düşünülen 29 P.
falciparum kaynaklı sıtma olgusu görülmüştür. Türkiye, Afrika ve Asya ülkeleriyle birlikte
2008 yılı Dünya Sağlık Örgütü (WHO) sıtma raporunda yer almıştır (WHO, 2008b).
İstatistiklerden anlaşıldığı üzere, sıtma dünya üzerinde coğrafik olarak geniş bir dağılım
gösterirken her yıl yaklaşık bir milyon insanın ölmesine ve yaklaşık 250 milyon insanın
sıtmadan dolayı sağlığını yitirmesine neden olmaktadır (WHO, 2008b). Sıtmanın tüm
dünyada kontrol dışına çıkmasının iki temel nedeni vardır. Bunlardan ilki; sıtma parazitlerinin
tek konağı olan anofel cinsi sivrisineklerin bilinen insektisidlere karşı direnç kazanması,
ikincisi ise bazı sıtma parazitlerinin mevcut antimalarial ilaçlara karşı direnç kazanmış
olmasıdır. Antimalarial ilaçlara ve insektisidlere karşı olan direnç, halk sağlığı alt yapısının
bozulması, populasyon hareketleri, politik kargaşalar ve çevresel değişimler sıtmanın
yayılmasına katkıda bulunmaktadır. Yapılan son çalışmalar yeni kontrol metotları geliştirilip
uygulanmadığı takdirde sıtma vakalarının önümüzdeki 20 yıl içinde iki katına çıkabileceğini
göstermektedir (Vander-Jagt vd.,1981; Greenwood ve Mutabinga, 2002).
Günümüzde sıtma tedavisinde kullanılan ilaçlara karşı geniş çaplı bir ilaç direncinin gelişmesi
yeni antimalaryal ilaçların keşfedilmesini gerekli hale getirmektedir (Olliaro ve Yuthavong,
1999, Chiyaka, 2009). Antimalaryal ilaç geliştirilmesinde ki ilk adım, parazitin yaşam
döneminde hayati rolleri bulunan enzim hedeflerinin belirlenmesini içermektedir. Bu sebeple
bir glikolitik enzim olan ve sıtma parazitleri için yaşamsal önemi olan laktat dehidrogenaz
(LDH) enzimi ilaç hedefi olarak seçilmiştir (Turgut-Balik ve Holbrook, 2001). Bu tez
çalışmasında Plasmodium vivax LDH enziminin aktif bölge halkasının ve aktif bölge amino
terminal ucunun kinetik analizleri yapılarak yeni bir antimalaryal ilaç geliştirilmesi
çalışmalarına katkı sunulmaya çalışılmıştır.
4
1.2 Sıtma Parazitleri ve Yaşam Döngüsü
Sıtma parazitleri, Plasmodium cinsi, Plasmodiidae ailesi, Haemosporidia takımı ve
Apicomplexa şubesi içinde yer alan ökaryotik organizmalardır. Sıtma parazitlerinin hücreleri
işgal ettiği formları olan ookinet, sporozoit ve merozoitlerin uç kısmında yer alan, alyuvar ve
karaciğer hücrelerinin özel antijenik bölgelerini tanıyarak onları istila etmeye yardımcı olan
apikal kompleksin yer alması, bu parazitlerin Apicomplexan şubesi içerisinde yer almalarına
neden olmuştur (Yotoko ve Elisei, 2006). Plasmodium cinsi içinde 200 tür tanımlanmıştır ve
yeni türlerin keşfi devam etmektedir (Perkins ve Austin, 2009). Bu türlerden 5 tanesi olan P.
vivax, P. falciparum, P. ovale, P. malariae ve P. knowlesi insanları enfenkte ederken diğer
Plasmodium türleri kuşlar, kemirgenler, sürüngenler ve primatlar gibi birçok hayvanı enfekte
etmektedirler.
Sıtma parazitlerinin yaşam döngüleri, omurgasız anofel cinsi sivrisineklerdeki eşeyli
üremenin görüldüğü ve sporozoitlerin oluşturulduğu ve omurgalı konak canlıda eşeysiz
üremenin görüldüğü dönem olmak üzere iki dönemde gerçekleşmektedir (Şekil 1.3), (Kayser,
2005).
1.2.1
Sivrisinekteki (Vektör) Yaşam Döngüsü
Sıtma parazitleri, sivrisinekte eşeyli üremenin (döllenme) ve sporogoninin görüldüğü iki evre
geçirmektedirler.
Döllenme:
Sivrisinekler, sıtmalı konaktan kan emerek mikrogametosit (erkek eşey hücresi) ve
makrogametosit’leri (dişi eşey hücresi) almaktadır. Sivrisineğin midesinde mikrogametositler
8 kamçılı bir yapı meydana getirerek mikrogametlere ve makrogametositler ise
makrogametlere dönüşmektedir. Makrogamet ve mikrogametin döllenmesiyle zigot
meydanda gelmekte ve zigotun meydana gelmesinden kısa bir süre sonra ise zigot hareketli
ookinete dönüşmektedir. Ookinet mide duvarını delerek mide epitelyum hücreleri ve basal
membranın arasındaki boşlukta ookist adı verilen yuvarlak şekilli bir duvar oluşturmaktadır
(Kayser, 2005).
5
Sporogoni:
Ookist hızla gelişip (40-60 um çapında) sivrisineğin vücut boşluğuna (hemosöl) doğru şişerek
binlerce sporozoit meydana getirmektedir. Ookist patlayarak sporozoitler, sineğin vücut
boşluğundan tükürük bezlerine hareket eder ve orada yerleşmektedirler. Sivrisinekteki bu
yaşam döngüsü parazit türünden türüne ve ortamın sıcaklığını bağlı olarak 8–14 gün arası
sürmektedir. Sivrisinek kan emerken tükürük bezindeki bu sporozoitler konak canlıya geçip
konak canlıdaki yaşam döngüsünü başlatmaktadır (Kayser, 2005).
1.2.2
Omurgalılardaki (Konak) Yaşam Döngüsü
Sıtma parazitlerinin omurgalı konak canlıdaki yaşam döngüsü, karaciğerdeki dönem (Hepatik
ya da ekzoeritrositik şizogoni) ve alyuvardaki dönem (eritrositik şizogoni) olmak üzere ikiye
ayrılmaktadır.
Ekzoeritrositik (Hepatik) Şizogoni:
Sıtma sporozoitlerini taşıyan anofel sivrisineği konak canlıdan kan emerken binlerce
sporozoit, konağın dolaşım sistemine girmektedir. Enfeksiyonunun ortaya çıkması için çok az
sayıda sporozoit yeterli olmaktadır (10 P.falciparum sporozoiti). Enfeksiyonun meydana
geldiği ilk bir saat içinde sporozoitler kan yolu ile eşeysiz üremenin gerçekleşeceği karacağier
hücrelerine (Hepatosit) girmektedirler. Sporozoitler burada çok çekirdekli bir yapı olan
hepatik şizontu oluştururlar. Sitoplazmik bölünmeler sonucunda bir karaciğer hücresinde
binlerce merozoit oluşmaktadır. Merozoitlerin oluşumu 6–15 gün içinde gerçekleşmektedir.
Fakat P. vivax ve P. ovale gibi parazit türlerinde şizont oluşumu hemen gerçekleşmeyip
sporozoitler uyku dönemi geçirmektedirler. Bu uyku dönemi aylar hatta yılları bulabilir.
Merozoitler oluştuktan sonra karaciğer hücresi patlar ve merozoitler kan dolaşımına
katılmaktadırlar. Merozoitlerin alyuvarlara girmesiyle birlikte eritsositik şizogoni dönemi
başlamaktadır (Kayser, 2005).
Eritrositik Şizgoni:
Kan
dolaşımına
katılan
merozoitler
eşeysiz
üremenin
gerçekleşeceği
alyuvarlara
girmektedirler. Alyuvara giren sporozoit mikroskop altında yüzük şeklinde görülmektedir. Bu
yapı gelişerek çok çekirdekli eritrositik şizontu meydana getirmektedir. Şizont eşeysiz olarak
bölünerek çok sayıdaki merozoitleri oluşturmakta ve merozotilerin alyuvarı patlatarak kan
dolaşımına katılmasıyla eritrositik şizogoni dönemi tamamlanmış olmaktadır (Kayser, 2005).
6
Şekil 1.3 Plasmodium’un hayat döngüsü (Knell, 1991).
Merozoitlerin yeni bir alyuvara girmesiyle bu eşeysiz dönem tekrarlanmaktadır. Kısa bir
zaman sonra bu döngüler belli aralıklarla olmaya başlamaktadır. P. vivax, P. falciparum ve P.
ovale’de döngüler 48 saat, P. malaria’ da ise 72 saatlik döngüler halinde gerçekleşmekte ve
her alyuvarların parçalandığı dönemde konak canlıda ateş nöbetleri (“malarial paroxysm”)
meydana gelmektedir. Birkaç döngü sonrası bazı merozoitler eşey hücreleri olan
mikrogametosit ve makrogametositlere dönüşmektedirler. Anofel sivrisinekleri, hücreleri kan
emerek aldıkları zaman Plasmodium’ların hayat devri yeniden başlamış olmakta ve kan
dolaşımında kalan gametosit hücreleri ise belirli bir zaman sonra ölmektedirler (Kayser,
2005). Temelde Plasmodium türlerinin hayat döngüleri yukarıda anlatıldığı gibi meydana
gelse de, türler arasında döngü süresi, ookinit, sporozoit, merozoit ve gametlerin büyüklüğü
ve hücre içindeki şekilleri bakımından farklılıklar görülmektedir (Özcel, 1999).
7
1.3 Sıtma Genom Projesi ve Sıtma Parazitlerinin Genetik Özellikleri
Plasmodium’ların genetik özellikleri ve genomları hakkında bilgi sahibi olmamız, biyolojik
yapılarının aydınlatılmasında, özellikle insanları enfekte eden parazit türlerine karşı yeni
ilaçların ve aşıların geliştirilmesinde çok önemlidir. Ayrıca karşılaştırılmalı genom analizleri;
Plasmodium cinsine özgü antimalariallerin ve aşıların geliştirilmesini, memeli Plasmodium
genomlarının özellikleri (genom büyüklüğü, gen sayıları, gen uzunlukları, GC oranı vb.) ve
Plasmodium’ların evrimsel kökeni hakkında bilgi sahibi olmamızı sağlamaktadır (Carlton vd.,
2008).
Yüz binlerce insanın sıtmadan dolayı ölmesine neden olan P. falciparum ve yine
milyonlarcasının sağlığını olumsuz yönde etkileyen diğer Plasmodium türlerinin bugüne
kadar bilinen antimalariallere karşı direnç geliştirmeleri ve şu ana kadar etkili bir ilacın ve
aşının olmayışı, Plasmodium genom projesinin ne kadar önemli olduğunu ortaya koymaktadır
(Carlton, 2008). Fonksiyonel genom çalışmalarının artması, genoma dayalı ilaçların ve
aşıların üretilmesine ve aynı zamanda var olan ilaç ve aşı klinik çalışmalarının hızının
artmasına büyük katkı sağlamıştır. Fonksiyonel genomik yöntemler parazit bağışıklığında ve
konak-parazit etkileşimlerinde rol oynayan genlerin keşfinde önemli rol oynamaktadır.
Yapılan çalışmalar bazı genlerin parazit yaşamı açısından kritik rollerinin olduğunu ortaya
koyarken, genomik çalışmalar sayesinde antijenik özellikleri daha önceden bilinen parazit
antijenlerine kıyasla daha gelişmiş olan yeni antijenler de ortaya çıkarılmaktadır (Winzeler,
2008). Bunların yanında genomik varyasyon çalışmaları, niçin bütün sıtma parazitlerine karşı
etkili tek bir aşının geliştirilmesinin zor olduğunu da ortaya koymaktadır (Mu vd., 2007;
Winzeler, 2008). Ayrıca genoma dayalı yöntemler, ilaç direncinin gelişmesinde genlerin nasıl
değiştiğini bulacak potansiyele sahiptir. Geçmişte ilaç direncinden sorumlu olan genler uzun
ve yorucu bir çalışma gerektiren haritalama ve farklı organizmalardaki ilaç direncinden
sorumlu olan genlerle kıyaslanarak bulunurdu. Günümüzde ise genoma dayalı oligonükleotid
çipleri ile ilaç direncinden sorumlu olan genlerin daha hızlı ve kesin bir şekilde taranıp
aydınlatılmasının yolu açılmıştır (Winzeler, 2008).
Genom şifresi üzerinde ilk çalışılan ve çözülen Plasmodium türü P. falciparum’dur. P.
falciparum genom projesi 1996 yılında, Amerikan Ulusal Alerji ve Enfeksiyon Hastalıkları
Enstitüsü (NIAID), the Wellcome Trust, the Burroughs Wellcome Fund ve Amerika Savunma
Bakanlığı’nın bir araya gelmesiyle başlamıştır [2]. Ilk önce nükleer genomun 2. (Gardner vd.,
1998) ve 3. (Bowman vd., 1999) kromozomlarının dizisi; daha sonrada sırasıyla , 1, 3-9 ve
13. (Hall vd., 2002), 2, 10, 11, ve 14. (Gardner vd., 2002) ve 12. kromozomun (Hyman vd.,
8
2002) dizisi yayınlanmıştır. Bu projenin ardından, bir kemirgen paraziti olan P. yoelii yoelii
(2002) ve ardından P. vivax (2008) ve P. knowlesi (2008) genom projelerinin
tamamlanmasıyla beraber insanlar için önemli olan Plasmodium türlerinin genomları deşifre
edilmiştir (Carlton vd., 2002; Carlton vd., 2008; Pain vd., 2008).
Plasmodium’lar üç farklı genoma sahiptirler. Bunlar 14 kromozomlu nükleer genom, 35
kb’lik dairesel apikoplast genomu ve 6 kb’lik lineer mitokondriyal genomudur (Gardner vd.,
2002; Carlton vd., 2002; Carlton vd., 2008; Pain vd., 2008).
Memeli Plasmodium türlerinin (P. yoelii yoelli, P. vivax, P. knowlesi ve P. falciparum)
nükleer genomları birçok açıdan benzerlik göstermektedir. Tahmini olarak 23–27 milyona
yakın bazları, 23–27 Mb ‘lık genomları, 14 kromozomları ve yaklaşık olarak 5.500 genleri
bulunmaktadır. Genlerin çoğunlu (%51) en az bir intron içermektedir. Memeli Plasmodium
türleri arasında genlerin %77’si benzerdir, yani ortologdurlar. Plasmodium’lardaki ortolog
genlerin neredeyse yarısı fonksiyonu bilinmeyen tahmini proteinleri kodlamaktadır (Carlton
vd., 2008).
Bu tür benzerliklerin yanında gen sayıları, G+C oranları, genom büyüklükleri, gen
yoğunlukları ve RNA genlerinin sayıları gibi açılardan türden türe göre farklılık
göstermektedir. Örneğin; P. vivax ve P. knowlesi’nin G+C içeriği P. falciparum’ a kıyasla
daha fazladır. En çok gen içeren tür P. yoelii yoelli’dir (5.876 gen). Bunu yanında P. vivax
kromozomları diğer türlerin kromozomlarından farklı olarak, kromozomların orta
bölgelerinde yüksek G+C oranı ve telomerlere yakın bölgelerde düşük G+C oranları sebebiyle
izokor (isochore) bir yapı göstermektedir. P. falciparum’un özellikle antijenik proteinleri
(%60), P. vivax’a (%39) kıyasla yüksek oranda tandem tekrarları ve düşük kompleksli
bölgeler (LCRs) içermektedir (Carlton vd., 2008). Çizelge1.1’de dizisi bilinen dört
Plasmodium türünün nükleer genomunun karşılaştırması verilmiştir.
Plasmodium’ların nükleer genomlarının haricinde apikoplast ve mitokondriyal genomları da
bulunmaktadır. Apikoplast, fotosentetik fonksiyonunu kaybetmiş olan bir plastid organeli
olup fonksiyonu belli değildir (Gardner vd., 2002).
Apikoplast sirküler olan 35 kb
büyüklüğünde bir genoma sahiptir (McFadden vd., 1996; Köhler vd., 1997). Bu genom 30
proteinin sentezlenmesinden sorumludur (Gardner vd., 2002). Plasmodium’un mitokondriyal
genomu ise 6 kilobaz büyüklüğünde olup lineer yapıdadır (Vaidya vd., 1989; Lau, 2009).
9
Çizelge 1.1 P. yoelii yoelli, P. vivax, P. knowlesi ve P. falciparum’un bazı genomik
özellikleri (Carlton vd., 2008)
10
1.4 Sıtma Tedavisinde Kemoterapötik Hedefler ve Antimalaryal İlaçlar
Günümüzde sıtma tedavisinde kullanılan ilaçlara karşı geniş çaplı bir ilaç direncinin gelişmesi
yeni antimalarial ilaçların keşfedilmesini gerekli hale getirmektedir (Chiyaka, 2009). Bu
durumun aşılması için bir yandan, yeni ilaçların keşfedilmesi doğrultusunda antimalarial ilaç
araştırmaları var olan hedefler üzerine yoğunlaşması ve diğer yandan da yeni ilaç hedeflerinin
bulunması için sıtma parazitlerinin temel metabolik ve biyokimyasal özelliklerinin
araştırılması gerekmektedir. Yeni kemoterapötik hedeflerin ve yeni ilaçların bulunması,
fonksiyonel genom çalışmaları ve yapıya dayalı ilaç tasarım çalışmalarının yardımıyla
sürdürülmektedir. Karşılaştırmalı metabolik çalışmalar, konak organizma ve parazit
arasındaki farklılıkların bulunmasını önemli hale getirmeye devam edecek olup, yeni
tekniklerin yardımıyla geçmişte bulunanlara göre daha fazla etkili hedefin bulunmasını
sağlayacaktır (Olliaro ve Yuthavong, 1999).
Kemoterapötik hedef ve validasyon çalışmaları, hem hedef düzeyinde (in vitro hücre
çalışmaları) hem de in vivo hayvan modellerinde etkili ve seçici potansiyeli olan bir hedefin
bulunacağını amaçlamaktadır. Yeni ilaçların geliştirilmesine yardımcı olacak olan sıtma
genom projesinin çok yakın bir zamanda yeni hedefleri göstermeye başlayacağı ümit
edilmektedir. Antimalarial kemoterapi için seçilen uygun bir hedefin özelliklerini şu şekilde
sıralanabilmektedir (Olliaro ve Yuthavong, 1999):
•
Parazitin hayat döngüsü için vazgeçilmez bir özelliğinin olması ve önemli bir ölçüde
konaktaki herhangi bir benzer aşamadan farklı olması,
•
Hedefi aldatıcı alternatif bir yolun olmaması,
•
Parazite seçici olarak ulaşılabilir olması ve parazitte depolanabilmesi,
•
Direncin gelişmesinde düşük potansiyelin olması,
•
Sınırlandırıcı bir biyokimyasal aşamada rol oynaması,
•
Hedef üzerinde inhibitör çalışmalarının test edilebilmesini sağlaması,
•
Çoklu inhibitör çalışmaları için test sistemlerinin var olması,
•
Bilinen özgü inhibitörlerin olması,
Sıtma parazitlerinin hayat döngülerinin karmaşıklığı uygun bir ilaç hedefinin bulunmasını
zorlaştırmaktadır. Geleneksel olarak, kemoterapötik müdahaleler parazitin eşeysiz aşamalarını
(merozoit, sporozoit gibi) hedeflemektedirler. Fakat bu durum planlı bir stratejiden daha çok,
parazitlerin (P. falciparum) kan kültürlerinin yapılmasının uygunluğundan meydana
11
gelmektedir. Diğer yöntemler parazitlerin karaciğer formlarına karşı (8-aminoquinoline vb.)
etkili olan ilaçları, gametosit oluşumunu ve gametosidal aktiviteye karşı olan ilaçları ve
antimalarial ilaçlarla birleştirilen yardımcı tedavi yöntemlerini kapsamaktadır. Antimalarial
kemoterapi için seçilen hedefler genel olarak üç kısıma ayrılır (Olliaro ve Yuthavong, 1999),
(Çizelge 1.2):
1. Plasmodium sindirim kofulunda meydana gelen olaylar: hemoglobin sindirimi, heme
detoksifikasyonu ve oksidatif stres gibi işlemler,
2. Makromoleküler ve metabolit sentezinde rol alan enzimler: nükleik asit ve fosfolipid
metabolizması, glikolizis ve tübilin oluşumu,
3. Membran işlemlerinden ve sinyalinden sorumlu olanlar: sinyal iletimi, madde ve ilaç
taşanımı olaylarında rol alan makromoleküller,
Sıtma tedavisi; enfeksiyon tipi, enfeksiyonun şiddeti, konağın durumu (yaş, kilo, çevresel
faktörler vb) ve konağın sağlık durumu (gebelik, kalp krizi vb.) gibi faktörlere bağlıdır. Sıtma
tedavisinde kullanılan ilaçlar sıtma parazitinin farklı evrelerini hedeflemektedirler (Çizelge
1.3).
Çizelge 1.2 Sıtma tedavisinin amacı, hedefler ve kullanılan ilaçlar [2]
Amaç
Durum
Terapi
Semptomların
önlenmesi
Semptomlar
Kan-şizonisidal
parazitlerin kan ilaçlar
formları tarfından
meydana
getirilmektedir
Klorokin,
kinin,
primetamin/sulfadoksin,
artemisinin
Döngülerin
durdurulması
Döngüler P. vivax Doku-şizonisidal
ve P. ovale’nin ilaçlar
hipnozoitleri
tarafından
oluşturulmaktadır
Primakin
Yayılımın
durdurulması
Sıtmanın yayılımı Gametosidal
gametositler
ilaçlar
tarafından olur.
Primakin, klorokin
12
Ilaçlar
Çizelge 1.3 Plasmodium’da temel kemoterapötik hedeflerin özeti (Olliaro ve Yuthavong,
1999)
İnsanları enfekte eden türler olan Plasmodium falciparum ve Plasmodium vivax ilaçlara karşı
direnç geliştirmişlerdir. P. falciparum neredeyse kullanılan bütün ilaçlara karşı direnç
geliştirmişken, P. vivax bazı bölgelerde klorokin ve/veya primakine karşı direnç geliştirmiştir
(Bloland, 2001). Bilinen antimalarial ilaçlara karşı geniş çaplı bir ilaç direncinin gelişmesi
yeni ilaçların ve hedef mekanizmalarının bulunmasını ön görmektedir. Sıtmaya karşı
kullanılan bazı ilaçlar ve etki mekanizmaları aşağıda özetlenmektedir.
13
•
Klorokin (Chloroquine): Klorokin her tip sıtma tedavisinde en çok kullanılan, ucuz ve
güvenli bir ilaçtır. Klorokinin hedefi parazitin sindirim kofuludur. Burada toksik hemi toksik
olmayan hemozine dönüştüren parazitik heme polimerazı inhibe ederek toksik hemin parazit
içinde birikmesini sağlamaktadır. Ayrıca nükleik asit biyosentezini de engellemektedir. P.
vivax, P. ovale, P. malariae’nın eritrositik formlarına, P. falciparum’un duyarlı suşlarına ve
P. vivax’ın gametositlerine karşı oldukça etkilidir. 24–48 saat içinde hızlıca akut sıtmaya karşı
etki göstermektedir (Scholar ve Pratt, 2000). 1945 yılında sıtmaya karşı kullanılmaya
başlanmasından 12 sene sonra 1957 de sıtma parazitleri klorokine karşı direnç
geliştirmişlerdir (Wongsrichanalai vd., 2002).
•
Kinin (Quinine): Kinin, Güney Amerika’ya özgü kınakına ağacından elde edilen bir
alkoloidtir. 17. yüzyıldan beri bilinmektedir. Kinin ilk olarak 1820 yılında kınakına ağacından
elde edilmiş (Katzung, 1995) ve 1920’lere kadar sıtmaya karşı kullanılan tek ilaç olmuştur.
Günümüzde de kimyasal sentezi zor olduğundan doğal yollardan elde edilmektedir. Kinin
hem kan-şizontları üzerinde hem de P. vivax, P. ovale ve P. malariae gametositleri üzerinde
etkili olmaktadır. Kinin, klorokin direnci ve çoklu direnç bulunan P. falciparum tedavisinde
kullanılmaktadadır. Toksik hemi toksik olmayan hemozine dönüştüren parazitik heme
polimerazı inhibe ederek toksik hemin parazit içinde birikmesini sağlamkatadır (Scholar ve
Pratt, 2000). Sıtma parazitlerinin kinine karşı 1910’da direnç geliştirdiği bilinmektedir
(Wongsrichanalai vd., 2002).
•
Primetamin/sülfadoksin (Pyrimethamine/sulphadoxine): Primetamin ve sülfadoksin
komplikasyonsuz ve klorokin dirençli P. falciparum tedavisinde kullanılan ilaçlardır.
Primetamin DNA sentezini ve hücre çoğalması için vazgeçilmez olan pürin ve primidin
biyosentezinde görevli olan dihidrofolat redüktaz enzimini inhibe etmektedir. Karaciğer ve
eritrosit şizont formları üzerinde etkilidir (Baker ve Muller, 1990). Sülfadoksin ise
dihidropetorik asit sentezinde para-aminobenzoik asit alımını engellemektedir (Abadi, 1995).
Ne yazık ki diğer antimalariallar gibi bu ilaçlara karşıda bir direnç söz konusudur. 1967
yılında sıtmaya karşı kullanılmaya başlanan ilaçlara karşı direnç yine aynı yıl meydana
gelmiştir (Wongsrichanalai vd., 2002).
•
Meflokin (Mefloquine): Vietnam savaşı sırasında, Amerikan askerlerini çoklu ilaç
direnci bulunan P. falciparum’a karşı korumak amacıyla geliştirilmiştir (Chatterjee, 2004).
Meflokin kan şizontlarında yüksek derecede aktivite gösterirken P. vivax’ın karaciğer
formlarına ve gametositlerde etkili değildir. Genellikle çoklu ilaç direnci bulunan P.
falciparum’a karşı kullanılmaktadır. Ayrıca klorokin direnci bulunan P. berghei’ye karşıda
14
etkilidir. Meflokin parazitin sindirim kofulunda etki göstererek serbest heme ile toksik bir
form oluşturur ve hücre zarına ve diğer hücre elemanları üzerinde etki göstermektedir (Scholar
ve Pratt, 2000). Meflokin’e karşı ilaç direnci 1985 yılında gerçekleşmiştir (Wongsrichanalai
vd., 2002).
•
Artemisin türevleri (Artemisinin): Artemisin 2000 yıldan beri Çin de tıpta kullanılan
Artemisia annua bitkisinden elde edilen bir kimyasaldır (Katzung, 1995). Artemisia annua’nın
antimalaryal etkisi M.S. 340 yılından beri Çin’de bilinmektedir. Atremisin ilk olarak 1971
yılında elde edilmiştir. Atremisnin, arteether, artesunate ve artemether gibi türevleri
bulunmaktadır. Artemisin ve türevleri etkilerini, artemisinindeki peroksidaz köprülerinin
parçalanmasıyla ortaya çıkan oldukça yüksek reaktif organik serbest radikaller oluşturarak
göstermektedir. Artemisin selebral sıtma ve çoklu ilaç direnci bulunan P. falciparum
tedavisinde kullanılmaktadır. En hızlı etki eden antimalarial ilaçtır. Tropozoitler üzerinde etki
göstererek hastalığın ilerlemesini engellemektedir (Scholar ve Pratt, 2000).
•
Antibiyotikler: Tetrasiklinler birçok bakteriyel hastalıkta olduğu gibi sıtmaya karşıda
etkili olmaktadırlar. Tetrasiklin 30S ribozoma etki ederek protein sentezini engellemektedir
(Mascaretti, 2003). Tetrasiklin ilaç direnci geliştirmiş olan P. falciparum tedavisinde
kullanılmaktadır. Yavaş etki gösterdiklerinden dolayı hızlı etki gösteren kinin gibi ilaçlarla
birlikte verilmektedirler (Abadi, 1995).
•
Sıtma Aşısı:
Sıtma genom projelerinden elde edilen verilerin ilaç çalışmaları için
yardımcı olacağı kadar aynı zamanda sıtmaya karşı aşı geliştirilmesinde de ümit vaat
etmektedir (Winzeler, 2008). Günümüzde sıtmaya karşı etkin bir aşının bulunmayışı genom
tabanlı çalışmaları daha önemli hale getirmektedir. Sıtma aşısı üzerinde çalışan Dünya Sağlık
Örgütü (WHO), Sıtma Aşısı Girişimi (MVI), Wellcome Vakfı ve Bill & Melinda Gates
Vakfı’nın ortak olarak yaptıkları açıklamada yüksek etkinlikte bir sıtma aşısının geliştirilmesi
ve ruhsatlandırılmasının hızlandırılması için ortak faaliyet içerisinde olma çağrısı
yapmışlardır (Winzeler, 2008).
Sıtmaya karşı %80’den fazla koruyucu bir etkiye sahip ve dört yıldan daha uzun süre koruma
sağlayacak bir sıtma aşısının 2025 yılına kadar geliştirilmesi ön görülmektedir. 35 ülkeden
100 örgütü temsilen 230’dan fazla uzman, iki yıldan uzun bir sürede yol haritasını geliştirmek
ve yayınlamak için işbirliği yapmışlardır. Önde gelen sıtma toplumu temsilcileri, uzmanlar ve
fon sağlayıcılar, bir sıtma aşısı geliştirme işinin karşılaşacağı sorunların üstesinden gelme
yollarını belirlemişlerdir. Buna göre, sorunlar arasında, sıtma enfeksiyonu, hastalık ve
15
immünite
mekanizmalarının
tamamı
ile
anlaşılmasındaki
eksiklikler
gibi
bilimsel
bilinmeyenler, yetersiz kaynaklar, sınırlı özel sektör katılımı ve henüz belli olmayan, başarılı
bir aşıyı edinme ve dağıtma mekanizmaları bulunmaktadır. Halen klinik çalışma aşamasında
olan 30’dan fazla potansiyel aşı adayı bulunmaktadır. Bunlardan bazıları sıtma parazitinin
bütün evrelerini hedeflerken diğerleri parazitin karaciğer formu, eritrosit formu ve
gametositleri hedefleyen aşı çalışmalarıdır (MVTR, 2006).
1.5
Laktat Dehidrogenaz Enzimi (LDH)
Geleneksel kemoterapilere karşı sıtma parazitlerinin direnç geliştirmelerinin yaygınlaşması
yeni antimalaryal ilaçların tasarlanmasını zorunlu kılmaktadır (Turgut, 1998). Antimalarial
ilaç geliştirilmesindeki ilk adım parazitin yaşam döneminde hayati rolleri bulunan enzim
hedeflerinin belirlenmesini içermektedir. Bunun yanında belirlenecek olan hedeflerin aynı
zamanda konakçı olan insanınkinden farklı özelliklerinin bulunması gerekmektedir (Vander
Jagt vd., 1981; Royer, vd., 1986).
Bir glikolitik enzim olan laktat dehidrogenaz’ın (LDH) hedef enzim olarak seçilmesi yeni bir
antimalarial ilacın geliştirilmesinde alternatif bir yoldur. LDH parazit için yaşamasal önemi
olan bir enzimdir. Parazit, kırmızı kan hücrelerinin içinde LDH enzimini kullanarak glikozu
laktata çevirip enerji elde ederek yaşamını sürdürmektedir (Turgut, 1998). Sıtma parazitinin
yaşamı için bu metabolik yola ihtiyacının olduğu düşünülürse (Vander Jagt vd., 1981; Basco
vd., 1995) parazit LDH’ını engelleyen fakat aynı zamanda insan LDH’ı ile etikleşmeyen bir
ilaç yapılıması, toksik olmayan yeni bir antimalaryal elde edilmesi anlamını taşımaktadır
(Turgut, 1998).
Şekil 1.4 LDH enzimi tarafından L-laktatın pürivata oksidasyonunu veya pürivatın laktata
redüksiyonu [3]
16
Laktat dehidrogenaz (LDH; EC 1.1.1.27; L-lactate: NAD+ oxidoreductase) enzimi
glikolizis’in son ürünü olan pürivatın L-laktata oksidasyonunu ve tersinir olarak pürivatın
laktata redüksiyonunu NAD+ (nikotinamid adenin dinükleotit) koenzimi aracılıyla katalizler
(Holbrook vd., 1975), (Şekil 1.4). Laktat dehidrogenaz enzimi birçok organzimada
bulunmakta ve oksijensiz solunumda önemli rol almaktadır.
LDH enzimi üzerinde çok iyi çalışılan ve yapısı, katalitik mekanizması ve kinetiği iyi bilinen
bir enzimdir. Birçok prokaryot ve ökaryot organizmanın L-LDH enzimlerinin birincil amino
asit dizilisi belirlenmiştir. Bu diziler, enzimlerin yakın evrimsel ilişkilerini yüksek derecedeki
homoloji ile göstermektedir (Turgut, 1998).
Omurgalı LDH enzimi 140.000 dalton ağırlığında bir tetramer olup dört bağımsız katalitik
altbirim içermektedir. Memeli ve kuşlarda üç farklı LDH izoenzimi bulunmaktadır; M (kas),
H (kalp) ve X (testis ve spermetazoa) ve bunlar a, b, ve c adlı üç gen tarafından ifade
edilmektedirler. Ayrıca H, M ve X altbirimleri dışında LDH enziminin, E ve F gibi diğer
altbirimleri de vardır. E altbirimi kemikli balıkların sinir sistemlerinde, F altbirimi ise bazı
balıkların karaciğerlerindeki LDH enzimlerinde bulunmaktadır. Bakterilerde, molekül ağırlığı
70,000 dalton olan dimer ve 140,000 dalton olan tetramer formlarından biri bulunmaktadır
(Garvie, 1980) ve bir çoğu fruktoz-1,6-bifosfat (FBP) tarafından aktive edilmektedir (Fersht,
1985). Omurgalılar ve bitkilerin LDH’larında sadece laktatın L-izomeri üretilirken;
omurgasızlar, basit yapılı funguslar ve prokaryotik organizmalarda D- veya L-laktatın (NAD+
spesifik dehidrogenaz) ikisinden biri veya her ikisi bulunmaktadır (Holbrook vd., 1975). Bazı
prokaryotlarda ise D ve L-LDH aynı hücre içerisinde bulunabilir (Taguchi vd., 1991; Ficher
vd., 1994).
Her bir LDH altbiriminin aktif bölgesi, bir nükleotid bağlanma bölgesi ve katalitik bölge
içermektedir. Nükleotid bağlanma bölgesi yapısı diğer bazı dehidrogenazların yapısıyla
homologtur (Ohlson vd., 1974). Bu yapısal motif Rossmann katı olarak bilinmektedir (Rao
vd., 1973).
Katalitik bağlanma bölgesi, üç zinciri bulunan (βG, βH, β3J ve βK, βL, βM) iki tabakanın
dışında paketlenmiş dört heliks (α2F, α1G, α2G, ve αH) içermektedir. LDH katalitik
bağlanma bölgesi iki bölüm içermektedir; bir tanesi substrat bağlanma bölgesi, pirüvat veya
laktat, diğer bağlanma bölgesi ise kofaktör içindir, NADH ya da NAD+. Substrat
bağlanmasından ve katalizlenmesinden sorumlu olan amino asitler (Arg-171, Arg-109, Asp168, His-195, Thr-246) X-ışını ile yapısal olarak (Holbrook vd., 1975; Grau vd., 1981;
17
Wigley vd., 1992), kimyasal olarak (Bur vd., 1989; Deng vd., 1994), kinetik ve dengesel
olarak (Clarke vd., 1986) analiz edilmişlerdir.
Histidin-195’in enzimin katalitik işleminde ki vazgeçilmez rolü, domuz H4 LDH ile kimyasal
modifikasyon çalışmaları ile ortaya konmuştur (Woenckhaus vd., 1969). Histidin-195 bir
proton alıcısı/vericisi gibi davranmakta ve aynı zamanda aktif bölge içerisinde substratı
yöneltmektdir. Histidin-195’in imidazol grubu protonlanmadıkça LDH’ın enzim-NADHoxamat ya da enzim-NADH-pirüvat kompleksini oluşturamadığı gösterilmiştir. Histidin asitbaz katalizi gibi davranmaktadır. Laktatın pirüvata dönüşümünde substrat hidroksil
grubundan bir proton almakta ve pirüvatın laktata dönüşümünde ise karboksil oksijene bir
proton vermektedir (Clarke vd., 1988). Kristal yapı 109. ve 171. pozisyonda yer alan iki
arjinin amino asitlerinin aktif bölgede yer aldığını göstermiştir. Ajinin-109 keto-asidin
karbonil bağını polarize etmesinde görev alıp karbona hidrat ve oksijene proton transferini
sağlamaktadır (Clarke vd., 1986). Arjinin-171 substrat karboksili ile iki noktada etkileşim
gerçekleştirerek substratın etkin oryantasyonunu gerçekleştirmektedir (Hart vd., 1987).
Aspartin- 168 ise Histidin-195 ile etkileşerek onun protonlanmış formunu sabitlemektedir
(Clarke vd., 1988; Deng vd., 1994). Diğer bir aktif bölge amino asidi olan Threonin-246
substrat seçiminden sorumludur.
Histidin-195, aspartat-168, arjinin-109 ve arjinin-171’in bilinen tüm LDH dizilerinde
tamamen korunmuş olması bu amino asitlerin enzimin fonksiyonunda hayati rolleri olduğunu
göstermiştir. Bu aynı zamanda yönlendirilmiş mutagenez debeyleri ile de gösterilmiştir
(Holbrook vd., 1973; Clarke vd., 1986, 1988; Cortes vd., 1992).
Laktat dehidrogenazın koenzim bağlanma bölgesinde sekonder yapının temel elementleri, bir
yüzeyinde toplanmış iki sarmal (αB ve αC) ve diğer yüzde toplanmış üç sarmala (αD/αE,
α1F) sahip olan altı paralel zincirin geniş bir tabakasını içeren (βA, βB, βC, βD, βE ve βF )
biriminden oluşmaktadır (Turgut, 1998).
Substrat, NADH’ın nikotinamid halkasının A yüzüne bağlanmaktadır. Substrat, arjinin-171’in
NH1 , NH2 ve substrat karboksili arasında iki kola ayrılan iyon çifti tarafından aktif bölge
içerisine alınmaktadır. Aynı zamanda substrat karboksili ve threonin-246 amino asidi arasında
bir hidrojen bağı oluşmakta ve substrat bağlanması histidin-195 amino asidi ve substrat
karboksili arasında bir hidrojen bağının oluşumu ile tamamlanmaktadır (Holbrook vd., 1975;
Frest, 1985).
18
1.6 Plasmodium Laktat Dehidrogenaz Enzimi
Sıtma parazitlerinin var olan kimyasal ilaçlara karşı direnç mekanizmaları geliştirmeleri ve
henüz nitelikli bir sıtma aşısının bulunmayışı, yeni ilaç arama çalışmalarını önemli hale
getirmektedir. Bu bağlamda aday sıtma ilaçları arasında, parazitlerin oksijensiz solunum
zincirinde rol alan enzimleri hedef alan ilaçlar gündeme gelmiştir. Sıtma parazitinin glikolitik
yolunda görev alan enzimlerden çoğu klonlanmış ve nükleotid dizileriortaya çıkarılmıştır.
Bunlardan bazıları; fruktoz bifosfat aldolaz, glukoz-6-fosfat izomeraz, fosfogliserat kinaz
(PGK), heksokinaz, laktat dehidrogenaz, trioz-fosfat izomeraz (TPI), gliseraldehit-3-fosfat
dehidrogenaz ve enolaz (2-fosfo-D-gliserat hidrolaz)’dır (Gomez vd., 1997).
Sıtma parazitleri eritrositik dönemde, sitrik asit döngüsüne sahip olmadıkları için glikoliz
yoluyla ATP elde ederek yaşamlarını sürdürüp çoğalmaktadırlar. Glikoliz metabolik yolunda
son ürün pürivik asit olup, laktat dehidrogenaz (LDH) enzimi ile laktik aside çevrilmektedir.
LDH‘ın aktivitesinin engellenmesi durumunda parazitin yaşam şansının ortadan kalktığı
yapılan deneysel çalışmalarda gösterilmiştir (Royer vd., 1986). Bu sonuç LDH’ın yeni
antimalaryal ilaçların geliştirilmesinde hedef bir glikolitik enzim olduğu sonucunu ortaya
çıkarmaktadır. Bunların yanında LDH enzimi insanda da önemli bir glikolitik enzimdir. Bu
yüzden LDH’ı hedefleyen antimalaryal ilaçların aynı zamanda insan LDH’ını herhangi bir
etki göstermemesi gerekmektedir. Yapılan araştırmalar Plasmodium laktat dehidrogenaz
enziminin (pLDH) elektroforetik, kinetik ve yapısal olarak insan LDH’ından farklı olduğunu
göstermiştir. Laktat dehidrogenaz enzimi konakçı homologundan farkı gösterilen ilk sıtma
paraziti enzimlerinden biridir (Gomez vd., 1997). Bu farklılıkları şu şekilde özetleyebiliriz:
i) İnsan LDH’ından farklı olarak pLDH yüksek pirüvat konsantrasyonunda inhibe
olmamaktadır (Vander-Jagt vd., 1981),
ii) İnsan M4-LDH’ından farklı olarak, pLDH 3-asetilpiridin adenin dinükleotit (APAD+) adlı
koenzimi 0,5 M laktat konsantrasyonunda daha hızlı kullanabilme yeteğine sahiptir (Makler
ve Hinrichs, 1993),
iii) pLDH’ın gossilik nitril diasetat ve türevleri tarafından inhibisyona insan LDH’ından daha
duyarlı olduğu bildirilmiştir (Royer vd., 1986),
iv) İnsan M4-LDH’ından farklı olarak pLDH, aktif bölge halkasında 5 ilave amino asit
(aspartik asit, lisin, glutamik asit, triptofan, asparagin) içermektedir (Bzik vd., 1993; TurgutBalik ve Holbrook, 2001).
19
Plasmoidal laktat dehidrogenaz geni 316 aminoasitlik bir proteini kodlayan 951 baz çiftlik bir
gendir [4]. PfLDH geni ilk olarak 1993 yılında, Honduras I olarak adlandırılan soydan izole
edilmiş ve ardından (Bzik vd., 1993) K1 (Tayland) ve PF FCBR (Kolombiya) soylarından da
klonlanmıştır. Analiz çalışmaları sonucunda izole edilen tüm bu soyların LDH geninin
nükleotid dizilerinin birbirlerine benzediği gösterilmiştir. Fakat sadece üç soy için yapılan bu
değerlendirmeler tüm soylar için genelleyici olamayabilir (Turgut-Balik ve Holbrook, 2001).
P. falciparum LDH enzimini kodlayan genin klonlanmasından sonra Plasmodium vivax
Belem soyu (Fransa) genomik DNA’sından laktat dehidrogenaz enzimini kodlayan gen izole
edilmiş, klonlanmış ve nükleotit dizisi belirlenmiştir (Turgut-Balık vd., 2004).
PfLDH, amino asit dizisi bilinen diğer türlerin LDH’ları ile karşılaştırıldığında ve Bacillus
stearothermophylus LDH’ı ile %29, köpek balığı LDH’ı ile %29, insan M4-LDH’ı ile %31,
domuz LDH’ı ile %33, insan H4-LDH’ı ile %29 oranında amino asit düzeyinde benzerlik
görülmektedir (Turgut-Balik ve Holbrook, 2001). İnsan LDH’ıyla Plasmodiyal LDH
karşılaştırıldığında pLDH’da dört pozisyonda amino asit eksikliği ve iki pozisyonda da amino
asit fazlalığı görülmektedir. Glu48, Gly217, Gln224/Asn224 (insan-m/insan-h) ve Asp283/Asn283
(insan-m/insan-h) eksik olan amino asitlerdir. Ayrıca Alanin-73 ve serin-74 arasında ilave
bir tirozin bulunmaktadır. Diğer LDH’larla karşılaştırıldığında gözlenen en önemli farklılık
ise serin-108 ve arjinin-109 arasında 5 amino asit (D108A, K108B, E108C, W108D, N108E) ilavesinin
bulunuşudur (Bzik vd., 1993; Turgut-Balik ve Holbrook, 2001).
a)
b)
Şekil 1.6 PfLDH ve memeli LDH’ında substrat bağlanma bölgesi ve substrat spesifik halkaya
bitişik yarığın varlığı ve yokluğunun gösterilmesi. a. PfLDH’ın 108. ve 109. rezidüleri
arasındaki ilave 5 aminoasidin oluşturduğu yarık. b. Aynı pozisyonda ilave 5 aminoasidin
oluşturduğu yarığın memeli LDH’ında yokluğunun gösterimi (Dunn vd., 1996; Chaikuad, vd.,
2005)
20
X ışını kristalografisi çalışmaları ile bu 5 amino asit ilavesinin enzimin aktif bölge halkasına
yakın yüzeyinde bir yarık oluşturduğu (Şekil 1.7), fakat insan LDH’da ise aynı bölgede hiçbir
ilave amino asit olmadığı ve herhangi bir yarığın olmadığı görülmüştür (Dunn vd., 1996).
İnsan LDH’ında bulunmayan fakat pLDH’ında bulunan bu yarık, inhibitörlerin bağlanması ve
buna bağlı olarak enzim aktivitesinin engellenerek parazitin hayatının sona ermesine sebep
olabileceğinden, yeni antimalarial ilaç tarsım çalışmalarında hedef olarak gösterilmektedir
(Turgut, 1998).
Şekil 1.7 a: GNDA’nın PfLDH’ın aktif bölge halkasındaki yarığa kabul edilmesi. b: Memeli
LDH’ında sözkonusu yarığın bulunmaması sebebiyle GNDA’nın yapıya kabul edilmediğini
gösteren modelleme çalışması (Zhu ve Keithly, 2002).
Bu yapıya dayandırılarak yapılan moleküler modelleme çalışmaları gossipol türevi olan
gossilik nitril-1,1´ diasetat’ın (GNDA) malarial LDH’ın belirlenen bu açıklığında
barındırılabileceğini fakat memeli LDH’larında bu açıklık bulunmadığı için bu inhibitörün
LDH’ın yapısına kabul edilmeyeceğini göstermiştir ( Şekil 1.8), (Sessions vd., 1997).
P. falciparum ve P. vivax LDH genlerinin nükleotit dizileri karşılaştırıldığı zaman PfLDH ve
PvLDH genlerinin nükleotit dizileri arasında %90 oranında benzerliğin olduğu görülmektedir.
Bu benzerliğin sonucunda; PvLDH geninde de, PfLDH geninde olduğu gibi aktif bölgede
ilave 5 amino asitin (D108A, K108B, E108C, W108D, N108E) bulunduğu tespit edilmiştir. PvLDH
proteininin X-ışını kristallografisi ile yapı analizi ve bazı kinetik analizleri yapılmış ve bu
yapı eşdeğeri olan P. falciparum’un proteininin yapısı ile karşılaştırılmış ve her iki enzimin de
aktif bölgeleri ve kofaktör bağlanma ceplerinin son derece benzer olduğu ve PfLDH’da
bulunan ilave 5 amino asitin, PvLDH’da da enzim yüzeyinde bir yarık oluşturduğu
gözlenmiştir (Chaikuad vd., 2005).
21
Çizelge 1.4 İnsan-m, P. falciparum, P. vivax, P.ovale, ve P. malariae LDH enziminin 98-109
amino asit dizisi arasındaki aktif bölge ve ilave 5 amino asitin (D108A, K108B, E108C, W108D,
N108E) gösterimi (Turgut-Balık vd., 2006)
P. vivax’ın yanında, LDH enzimi incelenen P. falciparum, P. ovale, ve P. malariae gibi
insanları enfekte eden diğer plasmodium LDH’larınında aktif bölge yakınlarındaki bu 5 amino
asitlik yapıyı koruduğu görülmektedir (Çizelge 1.4), (Turgut-Balık vd., 2006). Bunların
tersine insan LDH enziminin aynı bölgesinde her hangi bir ek amino asit bulunmamaktadır.
Yüksek orandaki bu benzerlikler dolayısıyla genel olarak geliştirilecek olan bir inhibitör ile
Plasmoidial enzimin engellenmesi mümkünken insan LDH enziminin bundan zarar
görmeyecek oluşu yeni bir antimalarial ilaç için umut vaat edicidir. Plasmodial LDH’ların
aktif bölgesindeki ilave 5 amino asidin enzim aktivitesi için ne kadar önemli olduğu yapılan
yönlendirilmiş mutason-delasyon çalışmalarıyla da belirlenmiştir. Yalnızca D ve DK
delasyonu enzim aktivitesinin kaybolmadığını göstermiştir. Fakat DKE, DKEW ve DKEWN
delasyonları enzim aktivitesinin kaybolmasına neden olmaktadır. Bu sonuçlar bu bölgenin
enzim için ne kadar vazgeçilmez olduğunu göstermektedir (Turgut-Balık vd., 2006).
1.7 Plasmodium ve Diğer Bazı Apicomplexan LDH’ları
Plasmodium ve diğer Apicomplexan şubesine ait Toxoplasma gondii LDH1 ve LDH2,
Eimeria tenella ve Eimeria acervulina gibi parazitlerin LDH enzimleri incelendiğinde aktif
bölge yapılarının birbirlerine benzerliği dikkat çekmektedir. Plasmodium’lar ve diğer bazı
Apicomplexan LDH enzimleri insan LDH’ından farklı olarak aktif bölge halkasındaki 108. ve
109 amino asitler arasında bir ilave 5 amino asit içermektedir (Turgut-Balik ve Holbrook,
2001; Winter vd., 2003; Turgut-Balık vd., 2004). Laktat dehidrogenaz enzimindeki bu 5
amino asit insersiyonun dizisi (Plasmodium’lar için D108A, K108B, E108C, W108D, N108E) ve aynı
zamanda aktif bölgesinin amino termal uç bölgesindeki amino asit dizisi (Plasmodium
malariae dışındaki bütün bilinen Plasmodium’lar için F100, T101, K102, A103, P105, G106, K107,
22
S108) Apicomplexan türleri arasında farklılık göstermektedir.
Buna göre bu pentapeptid insersiyonunun dizisi Toxoplasma gondii LDH1 ve LDH2
enzimlerinde DSEWS ve DKEWS (Yang, 1997); Eimeria tenella LDH enziminde DQEWS
(Schaap, 2004); Eimeria acervulina LDH’ında ise DKEWS şeklindedir (Çizelge 1.5).
Çizelge 1.5 Plasmodium vivax ve diğer bazı Apicomplexan LDH’larının aktif bölgesindeki
amino asit dizisi (104. amino asit tanımlanmamıştır.). (insan-m: İnsan LDH’ı kas formu;
pvivax: Plasmodium vivax; toxgo1: Toxoplasma gondii LDH1; toxgo2: Toxoplasma gondii
LDH2; etenella: Eimeria tenella; eacervulina: Eimeria acervulina; tparva: Theileria parva)
98
108
109
insan-m
I T A G A R Q Q E G E S . . . . . R
pvivax
V T A G F T K A P G K S D K E W N R
toxgo1
V T A G L T K V P G K P D S E W S R
toxgo2
I T A G L T K V P G K S D K E W S R
etenella
I T A G I T K A A G K S D Q E W S R
eacervulina
I T A G I T K I P G K S D K E W S R
X ışını kristalografisi çalışmaları ile üç boyutlu yapısı belirlenen Apicomplexan’ların
tamamında bu 5 amino asit insersiyonu enzimin aktif bölge halkasına yakın yüzeyinde bir
yarık oluşturmaktadır (Dunn vd., 1996; Winter vd., 2003; Schaap vd., 2004; Kavanagh vd.,
2004; Chaikuad vd., 2005).
Plasmodium vivax LDH’ının aktif bölge halkası amino terminal ucu amino asitlerinin
yönlendirilmiş mutagenez ile, Toxoplasma gondii I ve II, Eimeria acervulina ve Eimeria
tenella LDH’larına benzetilmesi amacıyla yapılmış olan bir çalışmada amino asit
değişikliklerinin yapılması sonucunda, enzim aktivitesinin korunduğu görülmüştür. Enzim
substratı ile olan bağlantısını kaybetmemiş ve dolayısıyla enzim aktivitesi korunmuştur.
(Atmış, 2007).
Plasmodial LDH ve diğer Apicomplexan LDH enzimleri, bilinen bütün LDH dizilerinde
korunmuş olan His, 195, Asp168, Arg109 ve Arg117 katalitik aminoasitlerini içermektedir.
Bu yüzden bu enzimlerin katalitik mekanizmalarının birbirlerine benzediği düşünülmektedir
(Gomez, 1997).
23
Bütün bu bilgiler ışında Plazmodial laktat dehidrogenaz (pLDH) enzimi yeni antimalarial
ilaçların geliştirilmesi için hedef enzim olarak seçilmiştir. Bu yüksek lisans çalışmasında
önceden pLDH aktif bölgesindeki ilave 5 amino asidin delasyonu sonucunda elde edilen
mutanat LDH’ların (PvDLDH ve PvKLDH) (Turgut-Balık vd., 2006) ve önceden
Plasmodium vivax LDH aktif bölge amino terminal ucuna benzetilen Toxoplasma gondii I
(PvLM3Tg1) ve II (PvLM2Tg2), Eimeria acervulina (PvLM2Ea) ve Eimeria tenella
(PvLM3Et) mutanat LDH’larının (Atmış, 2007)
kinetik analizleri yapılarak yeni bir
antimalaryal ilaç geliştirilmesi çalışmalarına katkı sunulmaya çalışılmıştır.
24
2. MATERYAL VE YÖNTEM
2.1 Materyal
2.1.1 Kimyasal Maddeler, Enzimler ve Kitler
Polimeraz zincir reaksiyonlarında kullanılan Pfu DNA Polimeraz enzimi ve tampon çözelti,
Koloni- Polimeraz zincir reaksiyonunda kullanılan Taq DNA polimeraz enzimi, tampon
çözelti ve MgCl2 çözeltisi Fermentas’tan (Lithuania); DNA’nın kesilmesi için kullanılan
EcoRI ve Pstl restriksiyon enzimleri ve tampon çözeltileri, ligasyon için kullanılan T4 DNA
Ligaz enzimi ve tampon çözeltisi Promega’dan (USA) temin edilmiştir.
Plazmid DNA izolasyonunda kullanılan “QIAprep Spin Miniprep Kit”, PCR ürünlerinin jelde
yürütüldükten sonra saflaştırılmasında kullanılan “QIAquick Gel Extraction Kit” QIAGEN
(Almanya)’den, “Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System” Promega (USA)’dan temin
edilmiştir.
Agaroz jel elektroforezi sırasında DNA bantlarının molekül ağırlıkları ve konsantrasyonunun
tayininde kullanılan “100bp G2101 DNA ladder” Promega’dan (USA) ve “Mass Rular DNA
Ladder, High Range” Fermentas’tan (Lithuania); “Lambda DNA Hind III Digest”, Amersham
Pharmacia Biotech’den (USA); sodyum dodesil sülfat poliakrilamid jel elektroforezi sırasında
protein bantlarının molekül ağırlıklarının belirlenmesinde kullanılan “Protein Molecular
Weight Marker- SM0431” Fermentas’tan (Lithuania) temin edilmiştir.
Ekspresyonu yapılan proteinin saflaştırılması için kullanılan Ni-NTA Agaroz, QIAGEN
(Almanya)’den sağlanmıştır.
Deneysel çalışmalarda kullanılan diğer bütün kimyasallar BDH, Sigma, Bio-Rad, Roche ve
Merck’ten sağlanmıştır.
Polimeraz zincir reaksiyonlarında ve DNA dizi analizinde kullanılan primerler Iontek
(Türkiye) tarafından sentezlenmiştir. Gen klonlama sonrası DNA dizi analizi, Iontek
firmasına yaptırılmıştır.
25
2.1.2. Ekspresyon Vektörü
pKK223–3: Pharmacia LKB Biotechnology AB, Uppsala, Sweden
2.1.3. Echerichia coli Soyu
JM105 : { supE endA sbcB15 hsdr4 rpsL thi Δ (lac-proAB) F´ [traD36 proAB+ lacIq
lacZ ΔM15] }
2.1.4 Deneylerde Kullanılan Cihazlar
•
Sonikatör- Blandelin
•
Soğutmalı Santrifüj- Sigma
•
Mikrosantrifüj- Sigma
•
Uv -Visible Spectrophotometre- Thermo
•
Otoklav- Systec
•
Çalkalamalı İnkübatör- GFL
•
Etüv- Binder
•
Vorteks- Heidolph
•
Hassas Terazi- Ohaus
•
Saf Su Cihazı- GFL
•
Jel Görüntüleme sistemi- Biorad
•
Termal Döndürücü- Eppendorf
•
Şarzlı Pipet Ünitesi- Hirschmann
•
pH Metre- Eutech
•
Su Banyosu- Kerman
•
Jel Kurutma Ünitesi- Biorad
•
Manyetik Karıştırıcı- Heidolph
•
Dikey Elektroforez Sistemi- Biorad
•
Yatay Elektroforez Sistemi- Biorad
26
2.1.5 Bakteriyolojik Gelişim İçin Besiyerleri ve Solüsyonlar
Çift Kuvvetli Yeast-Tripton (2xYT) Buyyon
Maya Ekstrakt
10 g/l
Tripton
16 g/l
NaCl
5 g/l
Çift Kuvvetli Yeast-Tripton (2xYT) Agar
Maya Ekstraktı
10 g/l
Tripton
16 g/l
NaCl
5 g/l
Agar
15 g/l
Amfisilin
dH2O ile 100 mg/ml stok solüsyonu hazırlanır, 0,2 µm çaplı filtre ile sterilize edilir. -20 ˚C’de
saklanır.
Isopropyl-β-D-thiogaltopyranoside (IPTG)
dH2O ile 20 mg/ml stok solüsyonu hazırlanır, 0,2 µm çaplı filtre ile sterilize edilir. -20 ˚C’de
saklanır.
2.1.6 Stok Solüsyonlar ve Tamponlar
50x TAE Tampon Çözeltisi (Tris-Asetat-EDTA)
Trizma Base
242 g/l
Asetik Asit
57,1 ml/l
0,5 M EDTA (pH:8.0)
100 ml/l
dH2O ile 1x TAE’ye seyreltilerek çalışma solüsyonu hazırlanır.
27
Agaroz Jel İçin Örnek Uygulama Tamponu (SAB, Sample Application Buffer)
Sükroz
4 g/10 ml
2 M Tris HCI
0,5 ml/10 ml
0,5 M EDTA
2 ml/10 ml
Bromfenol mavisi
4 mg/10 ml
Kristal Viyole (CV) Solüsyonu
dH2O ile 5 mg/ml stok solüsyonu hazırlanır. Karanlık bir ortamda muhafaza edilir.
Kristal Viyole Jel İçin Örnek Uygulama Tamponu (CV-SAB)
Gliserol
500 µl/ml
1xTAE
500 µl/ml
Kristal viyole
10 µl/ml
Karanlık bir ortamda muhafaza edilir.
CaCl2 Solüsyonu
100 mM CaCl2.6H2O
21,9 g/l
5 mM MgCl2.6H2O
1,02 g/l
5 mM Tris HCl (pH:7.6)
5 ml/l (1 M pH:7.6 olan stok Tris HCl çözeltisinden)
Solüsyon hazırlandıktan sonra 121°C’de 15 dakika süre ile otoklavda sterilize edilir
Bis-Tris Solüsyonu
0,02 M Bis-Tris
4,184 g/l
0,05 M KCl
3,725 g/l
pH:6.0
28
SDS-PAGE İçin Örnek Uygulama Tamponu (SDS-SAB)
%10 SDS
1
g/10 ml
0,5 M Tris HCl (pH :6.8)
0,6
g/10 ml
% 5 Gliserol
0,5 ml/10 ml
% 25 2-Merkaptoetanol
0,25 ml/10 ml
% 0,05 Bromfenol mavisi
0,005 g/10 ml
5x Tank Tamponu
0,025 M Trizma Base
15 g/l
0,192 M Glisin
72 g/l
% 0,1 SDS
5 g/l
dH2O ile 1x’e seyreltilerek çalışma solüsyonu hazırlanır ve 5 defa aynı tampon kullanılabilir.
% 30 Akrilamid/Bis Çalışma Solüsyonu
Akrilamid
N, N'-Metilen-Bis-Akrilamid
29 gr/100 ml
1 gr/100 ml
Protein Boyama Solüsyonu
% 0,1 Coomassie Brillant Mavisi
% 40 Metanol
% 10 Glasiyal Asetik Asit
Boya Uzaklaştırıcı (Destaining) Solüsyon
% 5 Metanol
% 7 Asetik Asit
Boya uzaklaştırıcı solüsyon kullanıldıktan sonra aktif kömür tozu ilave edilerek Coomassie
Brillant Mavisi çökeltilir. Solüsyon filtre kağıdından süzülerek tekrar kullanılabilir.
29
Transfer Tamponu
39 mM Glisin
2,93 g/l
48 mM Trizma Base
5,81 g/l
1,3 mM SDS
0,375 g/l
% 20 Metanol
200 ml/l
0,5 M KH2PO4/Na2HPO4 (pH: 7.5) Tampon Çözeltisi
0,5 M Na2HPO4 (pH: 7.5)
0,5 M KH2PO4 ile pH ayarlanır.
Hücre Lizisi ve Kolon Yıkama Tamponu
% 10 0,5 M KH2PO4/Na2HPO4 (pH: 7.5)
% 10 Gliserol
300 mM NaCl
20 mM İmidazol
Bu tampon “Protein Saflaştırma Protokolü-3” için kullanılmaktadır.
Protein Elüsyon Tamponu
% 10 0,5 M KH2PO4/Na2HPO4 (pH: 7.5)
% 10 Gliserol
300 mM NaCl
250 mM İmidazol
Bu tampon “Protein Saflaştırma Protokolü-2” için kullanılmaktadır.
30
Kinetik Ölçüm İçin Pirüvat Çalışma Solüsyonu
2,916 M pirüvat eH2O’da (elgastat H2O) çözülür. 1/3 oranında dilüsyon serileri (972 µM, 324
µM, 108 µM, 36 µM, 12 µM, 4 µM) hazırlanır. Kinetik ölçüm için taze hazırlanmış pirüvat
dilüsyon serisi kullanılır.
Kinetik Ölçüm İçin Stok NADH Solüsyonu
200 mM NADH eH2O’da (elgastat H2O) çözülür. -80 ˚C’de saklanır. Kullanılmadan önce
1/10 oranında seyreltilerek 20 mM konsantrasyonda NADH solüsyonu hazırlanır.
Kinetik Ölçüm Tamponu
50 mM Trizma Base
50 mM KCl
pH: 7.5
Taze Millipore saf su ile hazırlanır.
31
2.2 Yöntem
2.2.1 Plazmid DNA İzolasyonu
PvLDH genini ifade eden pKK223-3 plazmid DNA vektürünü içeren E. coli bakteri soyları –
80 ºC’ deki stok kültüründen 100 μg/ml amfisilin içeren çift kuvvetli (2x) YT agar besiyerine
sürme ekim yapılır ve 37 ºC’de bir gece inkübe edilerek geliştirilir. Seçilen kolonilerden bir
tanesi steril bir kürdan yardımıyla alınarak 100 μg/ml amfisilin içeren 5 ml 2x YT buyyona
aktarılır, bir gece 37 ºC ve 120 rpm’de çalkalamalı etüvde inkübe edilir. Bir gecelik kültürden
1,4
ml
alınarak
1,5ml’lik
mikrosantrifüj
tüpüne
alınır
ve
plazmid
DNAlar
QIAprep®Miniprep, QIAGEN, kullanılarak izole edilir.
2.2.3
Proteinin C Terminaline Polimeraz Zincir Reaksiyonu ile HisTag Eklenmesi
Gen ürü proteinler Ni-NTA agaroz ile saflaştırılacağından dolayı LDH enzimini ifade eden
genin
5’
ucuna
komplementer
olan
GCCGACCCGGAATTCATGACGCCGAAACCCAAAATTGTGC
komplementer
olan
ve
6
adet
histidin
amino
asidine
Pv7
3')
sahip
(5'
ile,
3’
olan
Pv15
TTTTCTGCAGTTAGTGATGGTGATGGTGATGAATGAGCGCCTTCATCC
ucuna
(5'
3')
primerleri kullanılmıştır. PCR şartları aşağıdaki gibidir:
10x PfuTamponu
5 µl (enzim ile beraber verilmiştir.)
dNTP’ler
5µl (stok; herbiri 10mM olan dNTP’lerden 10’ar µl ve 10 µl dH2O)
5’ Prirneri (Pv7)
2,5 µl (stok; 20 pmol/µl) a
3’ Primeri (Pv15)
2.5 µl (stok; 20 pmol/µl)
Kalıp DNA
1 µl
Pfiı DNA Polimeraz
1 µl (stok ; 2,5 u/µl)
Steril dH2O
33 µl (son hacim 50 µl olacak şekilde)
Amplifikasyon, 94oC’de 1.5 dakika, , 50oC’de 2 dakika, 72oC’de 2 dakika ve 30 döngü olarak
gerçekleştirilmiştir. Amplifikasyon sonunda C- ucuna 6 HisTag Eklenmiş LDH enzimini
ifade eden gen çoğaltılmıştır.
32
2.2.3 Etidyum Bromür İle Boyanan Agaroz Jel Elektroforezi
% 1 agaroz içeren 1x TAE tampon çözeltisi kaynatılır. Oda sıcaklığında 55-65oC’ye kadar
soğutulur. Bu arada jelin döküleceği jel tepsisi hazırlanır. Jeli tepsiye dökmeden önce etidyum
bromür ilave edilir (30 ml % 1’lik agaroz jel için 1,5 μl etidyum bromür). Jel tepsiye dökülür,
taraklar yerleştirilir ve katılaşması beklenir. Katılaştıktan sonra tarak çıkartılır. Konsantrasyon
tayininde 7 μl Steril dH2O + 2 μl SAB +1 μl DNA örneği kullanılır. Elektroforez, 40-60
mA’de bromofenol mavisi yaklaşık olarak jelin 2/3’üne ulaşıncaya kadar sürdürülür. Jel
ortamında DNA’lar moleküler ağırlıklarına bağlı olarak bir ayırıma tabi tutulurlar.
Elektroforez sonrası DNA bantları 254-312 nm dalga boyunda UV (ultraviyole)
transilluminatöründe görüntülenir ve konsantrasyon tayini gerçekleştirilir (Sambrook vd.,
2001).
2.2.4 Kristal Viyole ile Boyanan Agaroz Jel Elektroforezi
Kristal viyole ile boyanmış agaroz jel elektroforezi yapılarak LDH genleri PCR sonrası
saflaştırılmış ve geri kazanılmıştır. Elektroforezi için % 1 agaroz içeren 1x TAE tampon
çözeltisi mikrodalga fırında kaynatılır. Oda sıcaklığında 55-65 oC’ye kadar soğutulur. Aynı
zamanda jelin döküleceği jel tepsisi hazırlanır. Jeli tepsiye dökmeden önce son konsantrasyon
2 μg/ml olacak şekilde kristal viyole (CV) ilave edilir. Jel tepsiye dökülüp taraklar uygun
şekilde yerleştirilip jel kurumaya bırakılır. Jel kuruduktan sonra taraklar çıkarılır. Jel tepsisi 2
μg/ml kristal viyole içeren 1x TAE tampon çözeltisi bulunan elektroforez sistemine
yerleştirilir. 50 µl DNA örneklerine 2 μl CV-SAB tamponu ilave edilerek kuyucuklara
yerleştirilip 25-30 mA’ de elektroforez yapılır. Elektroforez, DNA bantları jelin 2/3’lük
kısmına gelinceye kadar yürütülür. DNA bantları beyaz ışık kutusunda görüntülenir (TurgutBalik vd., 2005).
2.2.8 DNA’nın Jelden Geri Kazanılması
Elektroforez sonrası DNA bantları dilimler halinde jelden kesilerek 1,5 ml’lik mikrosantrifüj
tüpü içerisine bırakılır ve DNA, QIAquick jel ekstraksiyon kiti (QIAGEN) kullanılarak
saflaştırılır.
33
2.2.6 Restriksiyon Endonükleaz Enzimleri ile DNA’nın Kesilmesi
Jelden izole edilen DNA örnekleri ve pKK223-3 plazmid DNA vektörü EcoRI ve PstI
restriksiyon endonükleaz enzimleri kullanılarak kesilmiş ve yapışkan uçlar elde edilmiştir.
Reaksiyon şartları aşağıdaki gibidir:
Mutant LDH’lar
pKK223-3 vektörü
DNA
30 μl
10x Tampon H (enzim ile beraber verilmiştir)
4 μl
4 μl
EcoRI (stok 12 ünite/μl)
2 μl
2 μl
PstI (stok 10 ünite/μl)
2 μl
2 μl
Steril dH2O
2 μl
9 μl
40 μl
40 μl
Toplam
30 μl
Restriksiyon endonükleaz enzimleri ile DNA’nın kesilmesi işlemi 37oC’de 1,5 saatte
gerçekleştirilir. Kesim sonrası örnekler kristal viyole ile boyanmış agaroz jelde koşturulur ve
DNA örnekleri QIAquick jel ekstraksiyon kiti (QIAGEN) kullanılarak jelden geri kazanılır.
2.2.7 PvLDH Geni İle İfade Vektörünün Birleştirilmesi
Jelden geri kazanılan mutant LDH DNA örnekleri ve ifade vektörü olan pKK223-3 DNA 1:1
oranında birleştirilir. Raksiyon şartları aşağıdaki gibidir:
1:1 oranı
10x Ligasyon Tamponu
1µl
İnsert
100ng
Vektör
100ng
T4 DNA Ligaz (3 u/µl )
1µl
Steril dH20
Toplam
Xµl
10µl
Ligasyon, örneklerin 4oC’de bir gece bekletilmesiyle gerçekleştirilir.
34
2.2.8
Kalsiyum Klorür Etkileşimi ile Kompetant E. coli Hücrelerinin Hazırlanması
E. coli hücrelerinin JM105 soyunun -80 oC’deki stok kültürden alınarak 2x YT agara ekim
yapılır ve bir gece 37 oC’ de inkübe edilir. Gelişen bakteri hücrelerinden kürdan yardımıyla
tek koloniye dokunularak 5 ml 2x YT buyyona bırakılır ve 37 oC, 120 rpm’de bir gece
inkübasyona bırakılır. Bir gecelik kültürden 500 μl alınarak 50 ml 2x YT buyyona aktarılır ve
37 oC, 120 rpm’de OD6oo'deki hücre yoğunluğu 0,3–0,4 arasında bir değere ulaşıncaya kadar
inkübe edilir. 50 ml’lik kültür 2 adet Oakridge tüpüne, her birine 25 ml olmak üzere eşit
oranda bölünür. 25 ml’lik iki tüp 5000 rpm’de 5 dakkika +4 oC’de santrifüjlenerek hücrelerin
çökmesi sağlanır. Üstte kalan sıvı faz dökülür (Süpernatant), altta kalan çökelti (pelet) üzerine
25 ml CaCl2 solüsyonu ilave edilir ve hücreler iyice çözülür. 30 dakika boyunca buzda
bekletilir ve ardından 5000 rpm’de 5 dakkika +4 oC’de santrifüj edilir. Üstte kalan sıvı kısım
dökülüp her bir tüpteki pelet 1ml CaCl2 solüsyonunda çözülür. Tüpler 2 saat buzda
bekletilir. Bu aşamadan sonra hücreler ya hemen transformasyonda kullanılır ya da daha
sonra kullanılmak üzere sıvı nitrojen içerisinde gliserol stoğu hazırlanarak -80°C'de saklanır
(Sambrook, 2001).
2.2.9 Transformasyon
Ligasyonu yapılmış örnek üzerine kompetenet E. coli hücrelerinden 200 μl ilave edilir ve
karıştırılır. 30 dakika buzun içerisinde bekletilir ve bu aşamadan sonra 42 oC’deki su
banyosunda 90 saniye boyunca sıcak şok uygulanır. Ardından örnek üzerine 100 µl/ml
ampisilin içeren 2x YT buyyondan 300 μl ilave edilir. Ters-düz edilerek karıştırılır ve 37 oC
de 30 dakika etüvde bekletilir. İnkübasyon sonrası 100 µl/ml ampisilin içeren 2 x YT agara
ekim yapılır ve 37 oC’deki etüvde bir gece beklemeye alınır (Sambrook, 2001).
2.2.10 Koloni PCR
Transformasyon sonrası agar üzerinde gelişen kolonilere kürdan yardımıyla dokunulur ve 50
µl steril dH20 bulunan mikrosantrifüj tüpüne alınır. Kürdan iyice karıştırılarak bakterilerin
suya geçmesi sağlanır ve 20 µl alınarak 100 µl/ml ampisilin içeren 5 ml 2x YT buyyona
aktarılır. Mikrosantrifüj tüpündeki geri kalan bakteri çözeltisi 10 dakika kaynatılıp sonrasında
13.000 rpm’de 15 dakika santrifüj edilir. Santrifüj sonrası üstte kalan süpernatantın 10 µl’si
PCR’ da kalıp olarak kullanılır. Reaksiyon şartları aşağıdaki gibidir:
35
Taq tamponu
5 µl (enzim ile beraber verilmiştir)
MgCl2
3 µl (stok; 25 mM)
dNTP’ler
5 µl (stok; herbiri 10mM olan dNTP’lerden I0’ar µ1 ve 10 µ1 dH2O)
Pv7 primeri
2.5 µl (stok; 20 pmol/µ1)
Pv15 primeri
2,5 µl (stok; 20 pmol/µ1)
KaIıp DNA
10 µl
Taq DNA Polimeraz 0.5 µl (stok; 5 u/µ1)
dH2O
21,5 µl (son hacim 50 µ1 olacak şekilde)
Amplifikasyon, 94oC’de 1.5 dakika, , 50oC’de 2 dakika, 72oC’de 2 dakika ve 30 döngü olarak
gerçekleştirilir.
Koloni PCR’dan pozitif sonuç alındığı takdirde inkübasyona bırakılan kültürden plazmid
izolasyonu yapılır ve stok kültür hazırlanır.
2.2.11 Sodyum Dodesil Sülfat Poliakrilamid Jel Elektroforezi (SDS-PAGE)
SDS-PAGE yapımında BIO-RAD Mini-PROTEAN® 3 CelI jel elektroforez sistemi
kullanılmıştır. Sodyum Dodesil Sülfat Poliakrilamid Jel Elektroforezi için kullanılan jel
aşağıdaki gibi hazırlanmıştır (Laemmli, 1970):
Ayırma jeli (% 12)
dH2O
3,35 ml
1,5 M Tris HCI (pH:8.8)
2,5 ml
% 10 SDS
100 µl
% 30 Akrilamid/ Bis
4 ml
% 10 Amonyum persülfat
75 µl
TEMED
15 µl
Yükleme jeli (% 4)
dH2O
6,1 ml
0.5 M Tris HCI (pH:6.8)
2,5 ml
%10 SDS
100 µl
%30 Akrilamid/ Bis
1,3 ml
36
% 10 Amonyum persülfat
60 µl
TEMED
12 µl
Örnekler jele yüklenmeden önce eşit miktarda SDS-PAGE SAB boyası ilave edilerek 5
dakika kaynatılır. Elektroforez için lx Tank tamponu kullanılır. Bromfenol mavisi jelin
sonuna gelinceye kadar 20 mA’da yürütülür. Elektroforez yapılmasından sonra protein
boyama solüsyonu kullanılarak jel, 37°C’de 1 saat süreyle boyanır ve sonrasında protein
bantları görünür hale gelinceye kadar boya uzaklaştırıcı (Destaining) solüsyon ile yıkanır.
Jeller, fotoğrafları alındıktan sonra jel kurutma sistemi ile kurutularak saklanır (Laemmli,
1970).
2.2.12 PvLDH Enziminin Saflaştırılması
2.2.12.1 Yöntem 1: QIAGEN Ni-NTA ile PvLDH Enziminin Saflaştırılması
Bu yöntem, bu çalışma gibi yine 104 T 215 nolu Tübitak projesi kapsamında yürütülmekte
olan bir diğer doktora tez çalışması ile bu tez arasında proje gereği ortak olarak
yürütülmüştür. PvLDH içeren E. coli hücreleri ekspresyon kültürü hazırlamak, E. coli bakteri
soyları –80 ºC’ deki stok kültüründen 100 μg/ml ampisilin içeren çift kuvvetli (2x) YT agar
besiyerine sürme ekim yapılır ve 37 ºC’de bir gece inkübe edilerek geliştirilir. Besi yerinde
gelişen bakterilerden tek koloni alınarak 5ml 100 μg /ml ampisilin içeren 2 xYT buyyon
içerisinde 37ºC’de çalkalamalı etüvde 120 rpm’de bir gece inkübasyona bırakılır. Bir gecelik
kültürün 833 μl’si 1:60 oranında (30ml 2 xYT buyyon için 500 μl kültür) 100 μg/ml amfisilin
içeren 6 adet 50 ml 2 x YT buyyon içerisine pipet yardımıyla bırakılır. Hücre yoğunluğu
37ºC’de ve 120 rpm çalkalamalı etüvde OD600: 0,6’ya ulaşıncaya kadar inkübe edilir. Hücre
yoğunluğu 0,6’ya ulaşınca her bir 50 ml’lik besi yerine 1 mM IPTG ilave edilir ve çalkalamalı
etüvde aynı şartlar altında bir gece inkübe edilir.
İndüklemesi yapılan 50 ml bir gecelik kültürlerin her biri 2 adet Oakridge tüpüne 25 ml
olacak şekilde ikiye bölünür ve 4000 g’de 15 dakika santrifüjlenir. Süpernatant dökülerek
pelet, uygun lysis tamponun (50 mM NaH2PO4, 1500 mM NaCl, 50 mM imidazol, 20 mM βmercaptoethanol; pH. 8.0) 2 ml’si içerisinde çözülür. İki tüpe ayrılan 50 ml’lik kültürlerden
her biri tek tüpte birleştirilerek toplam 4 ml kültür çözeltisi elde eldir. 4 ml’lik çözeltiler buz
içerisinde bekletilerek sonikasyon işlemi gerçekleştirilir. Sonikasyon işlemi amplitude: %
20’de 10 saniye aralıklarla 6x10 saniye olarak yapılır. Sonikasyon sonrası 14.000 g’de 20
dakika, +4 ºC’de santrifüj edilir ve süpernatantlar ayrı bir yerde biriktirilir. Saflaştırma işlemi
için kolon olarak 20 ml’lik şırınga kullanılır. Şırınganın alt ucunun içerisine aynı çapta bir kat
37
süzgeç kağıdı yerleştirilerek, şırınganın uç kısmına yaklaşık 10cm uzunluğunda infüzyon
setlerinde kullanılan hortum geçirilir. Hortum uç kısmı kapatıldıktan sonra şırınga dik
pozisyonda düz bir yüzeye sabitlenir.
Saflaştırma için resin olarak Ni-NTA Agaroz kullanılmıştır. 6 ml Ni-NTA agaroz ve 24 ml
supernatant (1:4 oranında) karıştırılarak, karışım +4 ºC’de ara sıra yavaşça karıştırılıp 60
dakika bekletilir. Karışım sert bir yüzeye sabitlenen 20 ml’lik bir şırıngaya pipet yardımıyla
yavaşça aktarılır. Ni-NTA Agaroz resininin çökmesi için 30 dakika beklenir. Daha sonra
şırınga ucundaki hortumun ağzı açılır ve şırıngadan damla damla akan süzüntüden (Flow
through, FT) 1.5 ml’lik santrifüj tüpüne SDS-PAGE analizi için örnek alınır. Kolonda sıvı
kısım aktıktan sonra yıkama solüsyonlarıyla sırasıyla W1 (50 mM NaH2PO4, 1500 mM NaCl,
70 mM İmidazol; pH. 8.0 ), W2 (50 mM NaH2PO4, 1500 mM NaCl, 80 mM İmidazol; pH.
8.0) ve W3 (50 mM NaH2PO4, 1500 mM NaCl, 90 mM İmidazol; pH. 8.0 ) ile her birinden
13.5 ml kullanılarak yıkanır ve her yıkama sırasında 1.5 ml’lik santrifüj tüpüne SDS-PAGE
analizi için örnek alınır. Yıkama sonrasında kolon 9 defa 3.375 ml elüsyon tamponu (50 mM
NaH2PO4, 700 mM NaCl, 200 mM İmidazol; pH. 8.0) ile yıkanır ve süzüntüler deney
tüplerinde biriktirilir (Tablo 2.1). Her deney tüpünden SDS-PAGE analizi için 50 μl ayrılır.
Saflaştırılan proteinler SDS analizi tamamlanıncaya kadar çok kısa süreli olarak +4 ºC’de,
uzun süreli ise proteine 0.5 g/ml amonyum sülfat eklenerek çöktürme yapılır ve örnekler
buzdolabında saklanır.
Çizelge 2.1 Yöntem 1’in uygulama koşulları
Column
Ni-NTA Agaroz:
Hücre Lizatı
Karışımı
Lysis
1. Yıkama
W1
solüsyonu
2. Yıkama
W2
solüsyonu
3. Yıkama
W3
solüsyonu
Elution
20 ml’lik
şırınga
6 ml: 24 ml (1:4
oranı)
24 ml
LT4
13,5 ml WT6
13,5 ml
WT7
13,5 ml
WT8
9x 3,375
ml ET2
2.2.12.2 Yöntem 2: QIAGEN Ni-NTA ile PvLDH Enziminin Saflaştırılması
Mutant PvLDH genini içeren E.coli hücreleri 100 µg/ml ampisilin içeren 2xYT buyyon
içerisinde 37 ˚C’de ve 180 rpm’de bir gece inkübe edilir. 100 μg/ml ampisilin içeren 500 ml
2xYT buyyon içerisine bir gecelik kültürden 2 ml inoküle edilir. OD600’deki hücre yoğunluğu
0,6’ya ulaşıncaya kadar inkübe edilir. Kültür belirtilen hücre yoğunluğuna ulaşınca final
konsantrasyonu 1 mM olacak şekilde IPTG ilave edilir. IPTG ile indüklenmiş kültür 37 ˚C’de
38
ve 180 rpm’de bir gece inkübe edilir. Bir gecelik indüklenmiş kültür örnekleri 5000 rpm’de
15 dakika santrifüj edilir. Süpernatant dökülür. Pelet, 6 ml hücre lizisi ve kolon yıkama
tamponunda çözülür. Hücreler, sonikatör (Bandelin Sonopuls, Almanya) ile güç % 60’da 30
saniye aralıklarla dokuz defa 10’ar saniye parçalanır. 14.000 rpm’de 1 saat 4 ˚C’de santrifüj
edilir. Süpernatant (CL; cell lysate) alınır ve SDS-PAGE analizi için bir miktar ayrılır.
Pistonu çıkarılmış 5 ml’lik bir şırıngaya cam yünü yerleştirilir ve uç kısmına bir tubing
geçirilir. Bu şekilde hazırlanan kolon sert bir yüzeye sabitlenir. Kolona 4 ml Ni-NTA agaroz
resin bırakılır. Kolon, 10 kat resin hacmi (40 ml) kadar hücre lizisi ve kolon yıkama tamponu
ile dengelenir. Süpernatant kolona yüklenir. Kolondan akan süzüntü fraksiyonlarından (FT1,
flow-through 1; FT2, flow-through 2; FT3, flow-through 3) SDS-PAGE analizi için örnek
alınır. Kolon, 10 kat resin hacmi (40 ml) kadar hücre lizisi ve kolon yıkama tamponu ile
yıkanır. Yıkama fraksiyonları (W1, wash 1; W2, wash 2; W3, wash 3) SDS-PAGE analizi için
saklanır. Yıkama sonrası 11 defa 1’er ml protein elüsyon tamponu ile saf protein örneği
kolondan toplanır (Shoemark, 2000).
2.2.13 Protein Saklama Koşullarının PvLDH Enzimi Üzerindeki Etkisi
İlk önce, saf olarak elde edilen PvLDH’ın 340 nm’deki aktivitesi tanımlandığı şekilde ölçülüp
absorbans değeri kaydedilmiştir. Saflaştırmayı takiben koruyucu madde olarak 4 ayrı tüpe
alınan örneklerden ilkine saklama öncesinde 5 mM EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) +
10 mM DTT (dithiothreitol), ikincisine sadece 5 mM EDTA, üçüncüsüne sadece 10 mM
DTT ilave edilmiş ve dördüncü tüpe hiçbir ilave yapılmaksızın örnekler hazırlanmıştır. Her
bir örnek üçe bölünmüş ve her bir örnekten birer tüp +4 oC, -20 oC ve -80oC olmak üzere üç
farklı sıcaklıkta saklanmışlardır. -80 oC’de saklanacak olan proteinler sıvı nitrojen ile
muamele edildikten sonra dondurucuya transfer edilmiştir. 25 günlük bir saklamanın
sonucunda enzim aktivitesi tekrar kontrol edilmiş ve sonuçlar sunulmuştur.
2.2.14 Enzim Aktivitesinin Spektrofotometre İle Tayini
PvLDH enzimlerinin aktivitelerinin ölçülmesi, UNICAM UV-Visible spektrofotometre
kullanılarak NADH’ın NAD+’a çevrilmesi ile 340 nm’deki (Δ A340/dakika) absorbans
değişim oranı takip edilerek yapılmıştır. Bütün reaksiyonlar 50 mM KCl içeren 20 mM BisTris solüsyonu, pH:6.0 ile 25°C’de gerçekleştirilmiştir. Reaksiyon için 500 mM pirüvat ve 50
mM NADH kullanılır. 1 ml’lik küvete pirüvat ve NADH solüsyonları bırakılır ve en son
enzim ilavesi ile reaksiyon başlatılır. Aktivite, 10 mM ve 1 mM pirüvat konsantrasyonlarında
39
ölçülür (Turgut-Balik, 2001). LDH aktivite ölçümleri 3 defa tekrar edilmiştir.
2.2.15 Enzimlerin Molekül Ağırlıklarının ve Ekstinksiyon Katsayılarının Hesaplanması
Saflaştırılan
mutant
ağırlıklarının
ve
proteinlerin
ekstinksiyon
konsantrasyonlarının
katsayılarının
(ε,
hesaplanması
Extinction
için
Coefficient)
molekül
bilinmesi
gerekmektedir. Bunun için bu iki değerin hesaplaması yapılmıştır. Yabanıl PvLDH ve mutant
PvLDH proteinlerinin molekül ağırlıklarının ve ekstinksiyon katsayılarının (Molar
Absorpsiyon Katsayısı, Molar Absorption Coefficient) hesaplanması için web tabanlı
“Peptide Property Calculator” isimli program kullanılmıştır. Hesaplama, programa veri olarak
girilen aminoasit dizisine dayanılarak yapılmıştır.
2.2.16 Saflaştırılmış Mutant PvLDH Proteinlerinin Konsantrasyonlarının Hesaplanması
Saflaştırılmış olan mutant proteinlerin konsantrasyon hesaplamalarında Beer-Lambert Kanunu
kullanılmıştır. Buna gore ilk önce yabanıl PvLDH ve mutant enzimlerinin ekstinksiyon
katsayısı (ε, Extinction Coefficient) yukarıda anlatıldığı gibi belirlenmiş ve deneysel aşamada
1 cm genişlinde kristal küvet ile A280’de spektroskobik ölçüm alınmıştır. Elde edilen veriler
aşağıdaki fomül kullanılarak enzimin molar konsantrasyonu (mol/l) hesaplanmış ardından
moleküler ağırlığı ile çarpılarak ml’de kaç mg enzim olduğu hesaplanmıştır.
Beer-Lambert Kanunu; c (mol/l) = A/ (ε x ℓ)
Formülde c protein konsantrasyonu, A, 280 nm’de ölçülen absorbans değerini, ε, enzimin
ekstiksiyon katsayısını ve ℓ de küvetin enini temsil etmektedir. Kullanılan küvvet 1 cm eninde
olduğu için formül kısaca aşağıdaki gibidir (Grimsley ve Pace, 2004)
c (mol/l)=A/ε
40
2.2.17 Kinetik Analiz
Bu bölümde ilk önce enzim kinetiği hakkında genel bir bilgi verilmiş ve ardından da
saflaştırılan enzimlerin kinetiğinin ölçümünde kullanılan yöntem açıklanmıştır
2.2.17.1 Enzim Kinetiği
Enzimler, canlı organizmalardaki kimyasal reaksiyonları hızlandıran ve hiç bir yan ürün
olmasına izin vermeden % 100’lük bir ürün verimi sağlayan biyolojik katalizörlerdir (Keha ve
Küfrevioğlu, 2004).
Enzim kinetiği, enzimler tarafından katalizlenen reaksiyonların hızlarını incelemektedir.
Kimyasal reaksiyonların kinetiğinden farklı olarak enzimatik reaksiyonlarda, enzimlerin
substrata “doyma” durumu bulunmaktadır. Düşük substrat konsantrasyonlarında, reaksiyon
hızı substrat konsantrasyonuyla orantılı olarak artmaktadır. Substrat konsantrasyonu daha da
artırıldığı zaman, reaksiyon hızı artışında azalma olmakta ve substrat miktarının daha da
artmasıyla hız sabitlenmektedir (Şekil 1.4). Bu durumda reaksiyona katılan bütün enzimler
substratla doymuş haldedir. Bu anda enzim hızı maksimumdadır ve bu Vmax olarak ifade
edilmektedir. Enzimin maksimum hızında (Vmax), tüm enzim aktif merkezleri substrat
tarafından bağlı durumdadır ve ES kompleksinin miktarı toplam enzim (ET) miktarına eşit
olmaktadır. Reaksiyon hızı (v) birim zamanda ürüne dönüştürülen substrat miktarını, KM ise
Michaelis-Menten sabitini göstermekte olup, maksimum hızın yarısına erişildiği zamanki
substrat konsantrasyonu olarak ifade edilmektedir (Keha ve Küfrevioğlu, 2004).
Şekil 2.1 Bir enzim tepkimesinde substrat (S) konsatrasyonu ile hız (v) arasındaki ilişkiyi
gösteren doyma eğrisi
41
Leonor Michaelis ve Maund Menten, enzimli reaksiyonların ilk basamağında bir ES
oluşmasından ve enzimlerin doygunluk özelliğinden yola çıkarak yukarıdaki eğriyi verecek
bir model geliştirmişlerdir. Bu model birçok enzimin kinetik özelliğini açıklamaktadır (Şekil
1.5).
Şekil 2.2 Enzimatik reaksiyon ile substratın (S) ürüne (Ü) dönüşmesinin gösterimi. E: enzim;
k1, k2 ve k3: hız sabitleri
Şekil 1.5 daki denkleme göre E enzimi ve S substratı k1 hız sabiti ile ES enzim-substrat
kompleksini oluşturmaktadır. Oluşan ES enzim-substrat kompleksi ya k2 sabiti ile E ve S’ye
ayrışmakta ya da dönüşü olmayan bir yola giderek k3 hız sabiti ile ürünü oluşturmaktadır. Bu
denklemden yola çıkılarak düşük substrat konsantrasyonlarında (KM>>[S]) belirli bir
zamandaki katalitik enzim hızı, Michaelis- Menten eşitliği açıklanmaktadır.
Vmax
Vo =
[S]
KM
Yüksek substrat konsantrasyonlarında ise KM ihmal edilir ve Vo=Vmax şeklinde ifade
edilmektedir. Bu durumda bütün enzimler substratla doymuş halde olup artan substrat
konsantrasyonu ile hız değişmeyen sabit bir maksimum hıza ulaşmaktadır.
Eğer hızın Vmax /2 olduğu durumu ele alırsak Michaelis-Menten eşitliğinden [S]=KM sonucu
çıkmaktadır. Buna göre, Maksimum hızın yarısında ortamda bulunan enzimlerinde yarısı
substrada doymuş haldedir. KM en yüksek hız değerinin yarısına erişmek için gerekli olan
substrat miktarını ifade etmektedir ve birimi mol/L’dir.
KM, değeri bir enzime ve substrat özgü olup ve enzimin substrata olan ilgisini ifade
etmektedir. Bu değer enzim konsantrasyonuna bağlı değildir. Substratın yapısına, pH, sıcaklık
ve iyonik şidetle değişmektedir. Birden fazla substrata sahip enzimlerde, her substrat için ayrı
42
bir KM değeri bulunmaktadır. KM‘i düşük olan bir enzim, substrata yüksek ilgi
göstermektedir. Kısaca yüksek KM zayıf bağlanmayı, düşük bir KM ise kuvvetli bağlanmayı
ifade etmektedir.
Enzimlerin Vmax değerleri de birbirinden farklılık göstermektedir. Aynı zamanda substratın
yapısı, pH, sıcaklık ve iyonik şiddetle de değişmektedir. Vmax enzimin katalitik aktivitesinin
bir ifadesidir. Çünkü Vmax = k3 [ET] ile verilen maksimum hıza, belirli konsantrasyonlardaki
enzimin substratıyla doygunluk durumunda erişilmektedir.
Bir diğer sabit sayı da kcat'dır, bu birim zamanda bir mol enzim tarafından ürüne dönüştürülen
substratın mol cinsinden ifadesidir. Bu sabit sayı aynı zamanda “turnover sayısı” olarak ta
ifade edilmekte olup k3 sabitine eşittir. Bir enzimin kcat değeri ne kadar yüksekse enzimin,
katalitik mekanizmasının o kadar yüksek olduğu sonucu çıkmaktadır (Keha ve Küfrevioğlu,
2004).
2.2.17.2 Saflaştırılan Proteinin Kinetik Analizi
Aktivitesi tespit edilen mutant PvLDH enzimlerin Steady-State kinetik ölçümleri 340 nm’de
UNICAM UV-Visible spektrofotometre kullanılarak NADH’ın NAD+’a çevrilmesi ile 340
nm’deki (ΔA340/dakika) absorbans değişim oranı takip edilerek yapılmıştır. Bütün
reaksiyonlar 50 mM Trizma Base ve 50 mM KCl içeren kinetik ölçüm tamponu, pH: 7.5 ile
25 ˚C’de gerçekleştirilmiştir. Reaksiyon için farklı pirüvat konsantrasyonları (20 µM, 60 µM,
180 µM, 340 µM, 1.6 mM, 4.8 mM, 14.48 mM, 20.4 mM, 29 mM) ve 200 µM NADH
kullanılmıştır. 1 ml’lik küvete pirüvat ve NADH solüsyonları bırakılmış ve en son enzim
ilavesi ile reaksiyon başlatılmıştır. Bütün kinetik ölçümler 3 defa tekrar edilmiştir. Elde edilen
veriler kullanılarak Grafit 3.0 (Leatherbarrow, 1992) isimli program ile kcat, Km, ve Vmax
değerleri elde edilmiştir.
43
3. BULGULAR VE TARTIŞMA
Bu çalışmanın amacı, PvLDH enzimi üzerinde yapılan araştırmaların bir sonucu olarak,
PvLDH aktivitesine engel olacak, sıtma parazitinin yaşamını sonlandıracak ve aynı zamanda
insan LDH enzimini engellemeyecek bir inhibitör araştırılmalarına yardımcı olmak üzere
PvLDH’ın bazı kinetik analizlerinin yapılmasıdır.
Bu tez çalışmasında ilk olarak 104 T 215 nolu proje kapsamında önceden C-terminaline his
tag eklenerek saflaştırılmış olan PvLDH proteinini (Aslan, 2006), bu tez çalışmasında ve yine
aynı proje kapsamında daha saf ve daha bol olarak elde etmek için optimizasyon çalışmaları
yapılmıştır. İkinci aşamada PvLDH’ın aktif bölge halkasında bulunan ve önceden
yönlendirilmiş mutagenez ile her defasında bir amino asit çıkarma yolu ile kısaltılmış olan
(Turgut-Balık vd., 2006) mutanat LDH’lardan aktif protein üreten PvDLDH ve PvKLDH
mutant proteinlerinin C-terminaline his tag ekleme yolu ile proteinler saflaştırılmış ve kinetik
analizleri yapılmıştır. Son aşamada ise önceden yönlendirilmiş mutagenez ile Toxoplasma
gondii I (PvLM3Tg1) ve II LDH’ları (PvLM2Tg2), Eimeria acervulina LDH’ı (PvLM2Ea) ve
Eimeria tenella LDH’ına (PvLM3Et) benzetilmiş olan (Atmış, 2007) Plasmodium vivax
LDH’ının aktif bölgesinin amino terminal ucu mutanat LDH’larının yine C-terminaline his
tag eklenmesi yolu ile proteinler saflaştırılmış ve kinetik analizleri yapılmıştır. Elde edilen
bütün sonuçlar yabanıl tip PvLDH enziminin kinetik sonuçlarıyla kıyaslanarak aktif bölge
halkasının (DKEWN) ve aktif bölge halkasının amino terminal ucunun (FTKA-PGKS)
geliştirilecek olan pLDH inhibitörleri için önemi ortaya konulmuştur.
3.1. PvLDH’ın Analizi
3.1.1 PvLDH Proteininin C Terminaline 6 Histidin Amino Asidinin İlave Edilmesi İçin
PvLDH Geninin Yeniden Alt Klonlamasının Yapılması ve Proteinin İfade Edilmesi
Proteinin nikel kolonları kullanılarak saflaştırılması amacı ile PvLDH’ın C terminaline 6
histidin aminoasidi ilave edilmiştir. Bunun için Pv7 (5' GCC GAC CCG GAA TTC ATG
ACG CCG AAA CCC AAA ATT GTG C 3') ve üzerinde 6 adet histidin taşıyan Pv15 (5'
TTT TCT GCA GTT AGT GAT GGT GAT GGT GAT GAA TGA GCG CCT TCA
TCC 3') primerleri kullanılarak PCR yapılmış ve bu reaksiyon sonrasında PvLDH geninin 3'
ucuna 6 histidin amino asitini kodlayacak olan DNA dizisi ilave edilmiştir (Şekil 3.2). 6
histidin amino asitinin ilavesi, PvLDH geninin ekspresyonu sonrasında üretilecek olan
PvLDH
proteininin
Ni-NTA
Agaroz
ile
saflaştırılmasını
mümkün
kılmak
için
gerçekleştirilmiştir. İlave edilen bu histidin dizisi, nikel iyonları ile bir reaksiyon sonucu
44
sıkıca bağlanarak PvLDH proteininin kolona tutunmasını sağlayacak ve proteinin
saflaştırılmasını kolaylaştırmış olacaktır. İlave edilmiş olan bu His Tag’ın protein ifadesini
etkilemediği bilinmektedir (Berwal vd., 2008).
PCR sonrası, kristal viyole boyalı agaroz jelde (Şekil 3.1), koşturulan örneklerden DNA
saflaştırması yapılarak C terminalinde 6 histidin içeren mutant LDH genleri geri
kazanılmıştır. Bunun yanında PCR örnekleri etidyum bromür (EtBr) boyalı agaroz jelde
(Şekil 3.2), marker ile birlikte koşturularak hedef LDH geninin doğru büyüklükte amplifiye
edildiği görülmüştür. Hem PvLDH geni hem de genin aktarılacağı pKK223-3 vektörü EcoRI
ve PstI restriksiyon endonükleaz enzimleri (RE) ile kesilmiş, yapışkan uçlar oluşturularak
ligasyona hazır duruma getirilmiştir.
Şekil 3.1 Pv7 ve Pv15 primerleri kullanılarak kristal boyalı agaroz jelde yürütülen PCR
örnekleri. 1, 2, 3 ve 4: PvLDH.
Şekil 3.2 Pv7 ve Pv15 primerleri kullanılarak EtBr boyalı agaroz jelde yürütülen PCR örneği.
1: Marker; 2: His-Tag ekli PvLDH geni
45
PCR sonrası agaroz jelde koşturulan örneklerden DNA saflaştırması yapılarak C terminalinde
6 histidin içeren PvLDH geni geri kazanılmıştır. Hem PvLDH geni hem de genin aktarılacağı
pKK223-3 vektörü EcoRI ve PstI restriksiyon endonükleaz enzimleri (RE) ile kesilmiş
yapışkan uçlar oluşturularak ligasyona hazır duruma getirilmiştir. Ligasyon, 4 °C’de bir
gecelik inkübasyon ile sağlanmıştır.
Ligasyon sonrası elde edilen rekombinant DNA (pKK223-3 vektörü + PvLDH geni) ve
pozitif kontrol için hiç bir gen içermeyen pKK223-3 vektörü E. coli JM105 hücrelerine
aktarılmıştır. Transformasyon sonrasında seçilen bazı kolonilerin PvLDH genini taşıyıp
taşımadıklarını belirlemek için koloni PCR yapılmıştır. Koloni PCR sonrası örnekler %1’lik
agaroz jel’de yürütülmüş ve seçilen kolonilerin beklenen büyüklükteki bir DNA’yı taşıdığı
göstermiştir (Şekil 3.3). Doğru genin klonlandığı dizi analizi ile de ispatlanmıştır.
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
Şekil 3.3 Koloni PCR sonrası DNA bantlarının jelde görüntülenmesi. Hatlar: (1) Marker
(100bp DNA ladder, Promega); (2, 4, 7, 10) Negatif koloni PCR bantları; (3, 5, 6, 8, 9, 11, 12,
13, 14) pozitif koloni PCR bantları
3.1.2 PvLDH Proteininin Saflaştırılması
Çalışmanın bu bölümünde yapılmış olan çok yoğun optimizasyon çalışmaları sonucunda
PvLDH ve mutant PvLDH proteinleri istenilen miktarda ve saflıkta üretilmiştir. Optimizasyon
çalışmalarında iki farklı yöntem izlenmiş ve birinci yöntemin içinde çeşitli protokoller
uygulanarak saflaştırma optimize edilmeye çalışılırken ikinci yöntem tek bir protokol
üzerinden yürütülmüştür. İlk olarak kullanılan yöntem sonucunda yeterli saflıkta protein elde
edilmesine rağmen ileri aşamadaki kinetik analizleri gerçekleştirebilecek miktarlarda elde
46
edilememişlerdir. Bu yüzden bu yöntem terk edilerek ikinci yöntem ile saflaştırma
çalışmalarına devam edilmiştir. Bu yöntem ile yeterli saflıkta ve miktarda mutant proteinler
elde edilerek kinetik analizler için kullanılmışlardır. Yöntem 1 yine 104 T 215 nolu proje
kapsamında yürütülmekte olan bir diğer doktora tez çalışması ile bu tez arasında ortak olarak
yürütülmüştür.
1.6.1.1
Yöntem 1
Saflaştırma optimizasyon çalışması ilk önce yabanıl PvLDH proteini üzerinden gidilerek
yapılmaya çalışılmıştır. 5 ml buyyonda geliştirilen mutant PvLDH proteini içeren E.coli
kültürü, 300 ml’lik 2xYT sıvı besi yerine aşılanarak, hücre yoğunluğu 37 ºC’de ve 120 rpm
çalkalamalı etüvde OD600: 0,6’ya ulaşıncaya kadar inkübe edilmiştir. Bu aşamada 1mM IPTG
indüklemesi yapılmış ve aynı şartlar altında bir gece çalkalamalı etüvde inkübe edilmiştir.
İndüklemesi yapılan kültür Ni-NTA agaroz kullanılarak denatüre edici olmayan şartlar altında
saflaştırılmıştır. Saflaştırmada 1:4 oranında Ni-NTA agaroz - hücre lizatı karışımı ve farklı
içerikte ve miktarlarda lizis, yıkama ve elüsyon çözeltileri kullanılmıştır (Çizelge 3.1 ve
Çizelge 3.2).
Çizelge 3.1 Optimizasyon çalışmalarında kullanılan çözeltiler ve içerikleri
Tamponlar
NaH2PO4
NaCl
İmidazol
pH
Lysis Tampon 1 (LT1): 50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 20 mM İmidazol; pH. 8.0
Lysis Tampon 2 (LT2): 50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 10 mM İmidazol; pH. 8.0
Lysis Tampon 3 (LT3): 50 mM NaH2PO4, 700 mM NaCl, 30 mM İmidazol; pH. 8.0
Lysis Tampon 4 (LT4): 50 mM NaH2PO4, 1500 mM NaCl, 50 mM İmidazol, 20 mM βmercaptoethanol; pH. 8.0
Wash Tampon 1 (WT1): 50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 20 mM İmidazol; pH. 8.0
Wash Tampon 2 (WT2): 50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 15 mM İmidazol; pH. 8.0
Wash Tampon 3 (WT3): 50 mM NaH2PO4, 700 mM NaCl, 40 mM İmidazol; pH. 8.0
Wash Tampon 4 (WT4): 50 mM NaH2PO4, 700 mM NaCl, 45 mM İmidazol; pH. 8.0
Wash Tampon 5 (WT5): 50 mM NaH2PO4, 700 mM NaCl, 50 mM İmidazol; pH. 8.0
Wash Tampon 6 (WT6): 50 mM NaH2PO4, 1500 mM NaCl, 70 mM İmidazol; pH. 8.0
Wash Tampon 7 (WT7): 50 mM NaH2PO4, 1500 mM NaCl, 80 mM İmidazol; pH. 8.0
Wash Tampon 8 (WT8): 50 mM NaH2PO4, 1500 mM NaCl, 90 mM İmidazol; pH. 8.0
Elution Tampon 1 (ET1): 50 mM NaH2PO4, 300 mM NaCl, 250 mM İmidazol; pH. 8.0
Elution Tampon 2 (ET2): 50 mM NaH2PO4, 700 mM NaCl, 200 mM İmidazol; pH. 8.0
47
Çizelge 3.2 PvLDH proteininin Ni-NTA agaroz ile saflaştırılması çalışmalarının optimizasyon
denemeleri.
Protokol
Kolon
Lysis
1
5 ml’lik
şırınga
10
ml’lik
şırınga
10
ml’lik
şırınga
10
ml’lik
şırınga
20
ml’lik
şırınga
2
3
4
5
4 ml LT1
1.
Yıkama
4 ml WT1
2.
Yıkama
4 ml WT1
3.
Yıkama
4 ml WT1
4 ml LT2
4 ml WT2
4 ml WT2
4 ml WT2
4.
Yıkama
2 ml
WT1
---------
4 ml LT1
4 ml WT1
4 ml WT1
---------
---------
9x 0,5 ml
ET1
4 ml LT3
2 ml WT3
2 ml WT4
2 ml WT5
---------
9x 0,5 ml
ET2
24 ml LT4
13.5 ml
WT6
---------
9x 0,3.375
ml ET2
13.5
WT7
ml 13.5
WT8
ml
Elution
9x 0,5 ml
ET1
9x 0,5 ml
ET1
Protokol 1’de 5 ml’lik şırınga kolon olarak kullanılmıştır. Toplam 16 ml yıkama tamponu ile
yıkanmış ve ardından elüsyon tambonu ile protein kolondan uzaklaştırılarak toplanmıştır.
SDS-PAGE analizinde bakteriyel kökenli diğer enzimlerinde hedef enzimle birlikte
saflaştırıldığı için LDH saf bir şekilde elde edilememiştir. Ayrıca bu protokolde kullanılan 5
ml’lik şırınganın dar olan çapının kolona bırakılan resinin (Ni-NTA Agaroz) yüksekliğini
artırdığı için etkili bir yıkama yapılamadığından proteinin tam olarak saf olmadığı
düşünülmüş ve daha sonraki denemelerde daha geniş çaptaki 10 ml’lik şırınga kolon olarak
kullanılmıştır.
Protokol 2’de ise lysis ve yıkama aşamalarında kullanılan tampondaki imidazol oranı
düşürülerek daha az oranda bakteriyel kökenli proteinin, saf olarak elde etmek istediğimiz
LDH ile karışması engellenmeye çalışılmıştır. Ancak bu protokolde de saf bantlar elde
edilememiştir ve düşürülen imidazol oranının yabancı proteinlerin resine bağlanmasını
engellemek için yeterli konsantrasyonda olmadığı anlaşılmıştır. Hücrelerin sonikasyonu
sonrası elde edilen lizat, kolondan alınan ilk süzüntü, yıkama sırasında alınan süzüntüler ve
elüsyon örnekleri SDS-PAGE jelde koşturularak elde edilen örneklerin saflığı ve miktarı
kontrol edilmeye çalışılmıştır. Jelde görüldüğü gibi (Şeki 3.4) hücre lizatında bulunan 6HisTag ekli LDH enzimi, Ni-NTA agarozuna bağlandığı için alınan ilk kolon süzüntüsünde
görülmemiştir. Fakat 3 yıkama sonrasında, elüsyon aşamasında LDH’ın yanında Ni’e
affinitesi bulunan diğer yabancı proteinlerde elüsyonlarda gözlenmiştir.
48
Şekil 3.4 Protokol 2’nin SDS-PAGE görüntüsü.1: Markır, 2: Hücre lizatı, 3: Kolon süzüntüsü,
4: 1. Yıkama, 5: 2. yıkama, 6: 3. Yıkama, 7: Elüsyon 1, 8: Elüsyon 2, 9: Elüsyon 3, 10:
Elüsyon 4.
Sadece elüsyonların tamamı aynı jelde koşturularak hem yabancı proteinlerin hangi aşamadan
itibaren saf proteinden uzaklaştırıldığı hem de saf proteinin her aşamadaki kayıp oranı takip
edilmeye çalışılmıştır. Şekil 3.5’de görüldüğü gibi ilk elüsyonda kolondan ilk çalışılan protein
ayrılmıştır. Ancak daha sonraki elüsyon aşamalarında bu protein ile birlikte yabancı
proteinlerde kolondan ayrılmıştır. En sonda elde edilen elüsyonlarda yabancı protein çok fazla
şekilde gözlenmemesine rağman, LDH miktarı belirgin bir şekilde düşmüştür. Bir sonraki
protokolde yabancı proteinlerin elüsyon aşamasına gelmeden yıkama aşamalarında yıkanıp
kolondan uzaklaştırılabilmesi için yıkama aşamasında kullanılan wash tamponun imidazol
oranı 15 mM’dan tekrar 20 mM’a çıkarılmıştır.
Şekil 3.5 Protokol 2’nin elüsyonlarının tamamının SDS-PAGE görüntüsü. 1: Markır, 2:
Elüsyon1, 3: Elüsyon 2, 4: Elüsyon 3, 5: Elüsyon 4, 6: Elüsyon 5, 7: Elüsyon 6, 8: Elüsyon 7,
9: Elüsyon 8, 10: Elüsyon 9.
Protokol 3’te imidazol oranı 20 mM’a tekrar yükseltilerek 10 ml’lik şırınga kolon olarak
kullanılmıştır. SDS-PAGE jelinde görüldüğü gibi (Şekil 3.6) yıkama aşamasında Ni affinitesi
49
olan yabancı proteinlerin daha etkin bir şekilde uzaklaştırılmasına karşın yinede elüsyon
bantlarında yabancı proteinler gözlemlenmiş ve LDH enziminin yeterince saf olarak elde
edilemediği görülmüştür. Ancak bir önceki protokole göre yabancı proteinlerin elüsyon
aşamasında azaltılmış olduğu görülmüştür.
Şekil 3.6 Protokol 3’ün SDS-PAGE görüntüsü. 1: Markır, 2: Hücre lizatı, 3: Kolon süzüntüsü,
4: 1. Yıkama, 5: 2. yıkama, 6: Elüsyon 1, 7: Elüsyon 2, 8: Elüsyon 3, 9: Elüsyon 4, 10:
Elüsyon 5.
Şekil 3.7’de görüldüğü gibi ilk elüsyondan sonraki aşamada çalışılan protein kolondan
ayrılmıştır. Protein saf olmamakla birlikte yabancı protein bantları bir önceki protokole göre
elüsyon aşamasında daha az bulunmaktadır.
Şekil 3.7.Protokol 3’ün elüsyonlarının tamamının SDS-PAGE görüntüsü. 1: Markır, 2:
Elüsyon 1, 3: Elüsyon 2, 4: Elüsyon 3, 5: Elüsyon 4, 6: Elüsyon 5, 7: Elüsyon 6, 8: Elüsyon 7,
9: Elüsyon 8, 10: Elüsyon 9.
Bir sonraki protokolde (Protokol 4) lysis tampondaki imidazol oranı daha da artırılarak 30
mM’a çıkarılmıştır. Ayrıca yabancı proteinlerin resine bağlanmasını engellemek amacıyla
yeterince iyonik kuvvet oluşturmak için NaCl oranı da artırılarak 700 mM’a çıkarılmıştır.
50
Yıkama aşamasında da aynı tuz konsantrasyonu kullanılmıştır. Buna ilave olarak sırasıyla 40,
45 ve 50 mM imidazol konsantrasyonuna sahip tamponlar kullanılarak bir gradient
oluşturulmuştur. Elüsyon aşamasında ise diğer yabancı bantların saflaştırmak istenilen
proteinle birlikte elüe edilmemesi için imidazol oranı 200 mM’a düşürülmüştür. Şekil 3.8 ve
Şekil 3.9’da görüldüğü LDH proteini yüksek oranda saf olarak elde edilmiştir.
Şekil 3.8’de protokolün tamamında (ilk süzüntü, yıkama ve elüsyon aşamaları) alınan
örneklerle proteinin saflaştırma işlemi aşama aşama takip edilmiştir. 1. ve 2. yıkamalarda
yabancı proteinler önceki protokollerle göre büyük oranda kolondan uzaklaştırılmıştır.
Şekil 3.8. Protokol 4’ün SDS-PAGE görüntüsü. 1: Markır, 2: Hücre lizatı, 3: Kolon süzüntüsü, 4:
1. Yıkama, 5: 2. yıkama, 6: 3. Yıkama, 7: Elüsyon 1, 8: Elüsyon 2, 9: Elüsyon 3, 10: Elüsyon 4.
Şekil 3.9. Protokol 4’ün elüsyonlarının tamamının SDS-PAGE görüntüsü. 1: Markır, 2: Elüsyon
1, 3: Elüsyon 2, 4: Elüsyon 3, 5: Elüsyon 4, 6: Elüsyon 5, 7: Elüsyon 6, 8: Elüsyon 7, 9: Elüsyon
8, 10: Elüsyon 9.
Protokol 5’de tuz oranı biraz daha yükseltilerek 1500 mM’a çıkarılmıştır. Bunun yanında
daha fazla kültürle çalışılmış ve başlangıç kültürü 300 ml olarak ayarlanmıştır. 10 ml’lik
şırınga yerine 20 ml’lik şırınga kolon haline getirilerek daha fazla yükleme yapılması
sağlanmıştır. Kültür hacminin artırılmasıyla birlikte aynı zamanda lizis, yıkama ve elüsyon
51
tamponlarının da hacmi arttırılmıştır. Lysis tamponundaki imidazol oranı 50 mM’a
yükseltilmiştir. Ayrıca yıkama tamponlarındaki imidazol oranı yine gradient oluşturacak
şekilde 70, 80 ve 90 mM’a çıkarılmıştır. Elüsyon tamponundaki tuz oranı da artırılarak
700mM’a getirilmiş fakat imidazol oranı değiştirilmemiştir.
Şekil 3.10 ve Şekil 3.11’de görüldüğü gibi protein diğer bakteriyel kökenli bantlardan
uzaklaştırılarak saf olarak elde edilmiştir. Yıkama aşamasındaki protein kaybına bağlı olarak
saf proteindeki konsantrasyon oranının biraz düştüğü görülmüştür. Bunun sebebi de üçlü
yıkama aşamasında kullanılan imidazol miktarının yüksek olmasıdır.
Şekil 3.10 Protokol 5 proteininin saflaştırılması sonucu elde edilen saf proteinlerin SDSPAGE görüntüsü. 1: Markır, 2: Hücre lizatı, 3: Kolumn süzüntüsü, 4: 1. Yıkama, 5: 2.
yıkama, 6: 3. Yıkama, 7: Elüsyon 1, 8: Elüsyon 2, 9: Elüsyon 3, 10: Elüsyon 4.
Şekil 3.11. Protokol 5 proteininin saflaştırılması sonucu elde edilen saf proteinlerin
elüsyonlarının tamamının SDS-PAGE görüntüsü. 1: Markır, 2: Elüsyon 1, 3: Elüsyon 2, 4:
Elüsyon 3, 5: Elüsyon 4, 6: Elüsyon 5, 7: Elüsyon 6, 8: Elüsyon 7, 9: Elüsyon 8, 10: Elüsyon
9.
Saflaştırma sonrası yapılan SDS-PAGE jel analizlerinde proteinin iyi bir şekilde saflaştırıldığı
(Şekil 3.10 ve Şekil 3.11) fakat miktarının saflaştırma sonrası düşük olduğu yapılan
spektrofotometrik analizden anlaşılmıştır. Elüsyon örnekleri birleştirilerek amonyum sülfat
çöktürmesi 1 gece 4 ºC olmak üzere gerçekleştirilmiştir. Çöktürme sonrası santrifüj
52
işleminden geçen protein Bis-Tris/KCI, pH 6.0 çözeltisinde çözülerek Bis-Tris/KCI, pH 6.0
tamponuna karşı diyaliz yapılmıştır. 1 gece diyaliz ardından bu yöntem ile elde edilen protein
miktarı
yaklaşık
0.09-0.9
mg/ml
olmuştur.
Protein
miktarındaki
kaybın
yıkama
basamaklarının fazla olmasından kaynaklandığı düşünülmüştür. Ayrıca bu protein ve mutant
proteinlerden birisi (LM2Tg1) ile yapılan kinetik analizin tekrarı sonucunda enzim
etkinliğinin düşük bulunması proteinin saflaştırma sırasında yapılmış olan birçok işlemden
olumsuz etkilenmiş olabileceği fikrini oluşturmuş ve yeni protokol uygulanarak çalışılan
mutant PvLDH proteinleri için sonuçlar tekrar edilmiştir. Amonyum sülfat çöktürmesinin de
sebeplerden biri olabileceği düşünülmektedir. Elde edilen proteinin yeterince saf olmasına
rağmen elde edilen enzim miktarının birçok mutant proteinin analizi için düşük olarak elde
edilmesi ve proteini saflaştırmak için çok basamaklı bir işlem dizisinin uygulanması nedeni
ile bu yöntemin yerine yeni bir saflaştırma yönteminin uygulanmasına karar verilmiştir.
3.1.2.2 Yöntem 2
Rekombinant olarak üretilen LDH enziminin Ni-NTA agaroz kullanılarak 2. yöntem ile
saflaştırılmasında, 1. yöntemde kullanılan yıkama ve elüsyon çözeltileri yerine Çizelge 3.4’te
verilen çözeltiler kullanılmış ve Çizelge 3.3’te verildiği gibi kullanılmıştır (Shoemark 2000).
Yıkama ve lizis çözeltileri aynı olup bakteriyel proteinlerin yıkamada atılması için 20 mM
imidazol ve 300 mM NaCl kullanılmıştır. Saf fakat aynı zamanda düşük miktarda proteinin
elde edildiği protokol 5’e kıyasla LDH’ın yıkama aşamasında kaybedilmesini önlemek için
imidazol miktarı düşük tutulmuştur. Elüsyon aşamasında ise yüksek oranda protein elde
etmek amacıyla toplamda 250 mM imidazol kullanılmıştır. Önceki protokollerde kullanılan
pH 8.0 yerine proteinin doğal şartlar altında bulunduğu pH 7.5 kullanılarak proteinin
aktivitesin olumsuz olarak etkilenmemesi sağlanmıştır. Bu yöntemde 500 ml’lik E. coli
kültürü kullanılmış elde edilen hücre lizatı diğer yöntemden farklı olarak 1:2 oranında NiNTA agaroz ile birleştirilmiştir. Bu da yüksek miktarda His-Tag ekli proteinin matrikse
bağlanmasını sağlamıştır. Ni-NTA makriksi içindeki alkolün uzaklaştırılması için saflaştırma
işleminden önce 40 ml yıkama çözeltisiyle yıkanmış ve ardından hücre lizatı eklenerek
saflaştırma işlemi başlatılmıştır.
Çizelge 3.3 Optimizasyon çalışmalarında kullanılan çözeltiler ve içerikleri.
Yöntem
Kolon
Liziz
Ön Yıkama
Yıkama
Elution
2
5 ml’lik şırınga
6 ml LT
40 ml WT
40 ml WT
11x 1 ml ET
53
Çizelge 3.4 PvLDH proteininin Ni-NTA agaroz ile saflaştırılmasında kullanılan kolon ve
tampon miktarları
Şekil 3.12 görüldüğü gibi hücre lizatında gözlenen LDH proteini kolon matriksine
tutunmuştur. Fakat süzüntü sırasında (FT1, FT2 ve FT3) matrikse tutunamayan belli bir
miktar LDH’da, bakteriyel kökenli proteinlerin yanında kolondan kaybedilmiştir. Yıkama
sırasında kolona tutunamayan diğer proteinlerde atılmıştır. LDH kaybına rağmen elüsyonlarda
yüksek miktarda LDH’ın olduğu jel sonuçlarında görülmektedir (Şekil 3.13).
Şekil 3.12 PvLDH proteininin Yöntem 3 ile saflaştırılması sonucu elde edilen saf proteinlerin
SDS-PAGE görüntüsü. 1: Markır, 2: Hücre lizatı, 3: 1. Kolon süzüntüsü (FT1), 4: 2. Kolon
süzüntüsü (FT2), 5: 3. Kolon süzüntüsü (FT3), 6: 1. yıkama (W1), 7: 2. Yıkama (W2), 8: 3
Yıkama (W3), 9: 1. Elüsyon (E1), 10: 2. Elüsyon (E2).
Şekil 3.13. PvLDH proteininin saflaştırılması sonucu elde edilen saf proteinlerin
elüsyonlarının tamamının SDS-PAGE görüntüsü. 1: Markır, 2: 3. Elüsyon (E3), 3: 4. Elüsyon
(E4), 4: 5. Elüsyon (E5), 5: 6. Elüsyon (E6), 6: 7. Elüsyon (E7), 7: 8. Elüsyon (E8), 8: 9.
Elüsyon (E9), 9: 10.Elüsyon (E10), 10: 11. Elüsyon (E11).
54
Şekil 3.13’de elde edilen elüsyonların tamamının SDS-PAGE analizi görülmektedir. LDH
proteinin yanında Ni affinitesi olan başka bir proteinde elüsyonlarda görülmektedir. Fakat 7.
elüsyon sonrası bu yabancı proteinin kaybolduğu ve sadece saf PvLDH’ın elde edildiği
görülmektedir. Yapılan spektrofotometrik ölçümler sonunda yeterli miktarda protein içeren ve
spektrofotometre ile ölçümde tek pik veren elüsyonlardan elde edilen proteinler kinetik
analizler için kullanılmıştır. Bunun yanı sıra saflaştırma sonrası yapılan enzim aktivesi
ölçümünde diğer elüsyonlarda da yüksek miktarda aktif proteinin varlığı tespit edilmiştir. Bu
metod ile elde edilen protein miktarı yaklaşık 6 mg/ml olmuştur. Enzim varlığı, SDS-PAGE
jel görüntüleri yanında, 340 nm’de yapılan enzim aktivite ölçümlerinde de SDS-PAGE jel
analizlerini doğrular paralellikte gösterilmiştir (Çizelge 3.5).
Çizelge 3.5 PvLDH’ın Hücre lizatı, süzüntüler (FT1, FT2 ve FT3), yıkamalar (W1, W2 ve
W3) ve elde edilen elüsyonalardaki (E1-E11) enzim aktivitesinin tespiti.
FT2 ve FT3 süzüntüleri sırasında jelde gözlenen enzim kaybı, aktivite ölçümlerinde yüksek
LDH aktivitesi ölçümü yapılarak doğrulanmıştır. 1. yıkamada yine jeli doğrular nitelikte
yüksek enzim aktivitesi alınmış diğer yıkamalarda (W2 ve W3) enzim aktivitesi oldukça
düşmüştür. Elüsyonların tamamında yüksek enzim aktivitesi alınmış fakat son elüsyonlardaki
enzim miktarının düşük olması sebebiyle enzim aktivitesi de buna paralel olarak düşmüştür.
Yöntem 2 ile yapılan LDH saflaştırma işleminde kinetik analizlerin gerçekleştirilebilmesi için
yeterli saflıkta ve miktarda enzim elde edildiği için mutant LDH proteinleri bu yönteme göre
saflaştırılmış ve kinetik analizlerde kullanılmıştır.
55
3.1.3 Protein Saklama Koşullarının PvLDH Enzimi Üzerindeki Etkisi
Çeşitli yöntemlerle saflaştırılan ve değişik süreçlerde kullanılan proteinlerin saklama
koşulları, enzimin aktivitesi ve yapısının korunması açısından önem taşımaktadır. Bu yüzden
kinetik çalışmalarımızda kullandığımız LDH enziminin saflaştırmadan sonra aktivite kaybını
engellemek için uygun ve güvenilir yöntemlerle saklanması gerekmektedir. Bu doğrultuda
yöntem 2 ile saflaştırdığımız PvLDH ve mutant PvLDH enzimlerinin saklama koşullarının
optimize edilme çalışması yapılmıştır.
İlk önce, saf olarak elde edilen PvLDH’ın 340 nm’deki aktivitesi ölçülmüş ve absorbans
1.327
olarak
kaydedilmiştir.
Koruyucu
madde
olarak
5
mM
EDTA
(ethylenediaminetetraacetic acid) ve 10 mM DTT (dithiothreitol) kullanılmıştır (Shoemark
2000). EDTA, Ca2+ ve Fe3+ gibi metal iyonlarına bağlanarak kompleks oluşturur. Bu sayede
enzimdeki –SH gruplarının metaller tarafından oksidasyonu engellenerek enzimin stabilitesini
sağlar (Janson ve Ryden, 1998). DTT ise proteinlerin sistein aminoasitleri arasında meydana
gelen intermoleküler ve intramoleküler disülfid bağlanmalarını engelleyerek oksidasyonu
engeller (Zahler ve Cleland, 1964, Janson ve Ryden, 1998).
Protein +4 oC, -20 oC ve -80 oC olmak üzere üç sıcaklıkta saklanmışlardır. -80 oC’de
saklanacak olan proteinler sıvı nitrojen ile muamele edildikten sonra dondurucuya transfer
edilmiştir. Saflaştırılan PvLDH enzim solüsyonu 500 ml olarak 12 adet eppendorf tüpe
ayrılıp, 3 adet tüpe 5 mM EDTA + 10 mM DTT, 3 tanesine sadece 5 mM EDTA ve diğer 3
tanesine sadece 10 mM DTT ve en son 3 adetine de EDTA ve DTT gibi koruyucu maddeler
konulmamıştır. Proteinler filtre ile sterilize edilmiştir. Her bir EDTA+DTT, EDTA, DTT ve
hiçbir koruyucu madde içermeyen tüpler +4 oC, -20 oC ve –80 oC’de 25 gün boyunca
muhafaza edilmiş ve ardından yukarıda belirtilen koşullarda enzim aktivitesi ölçülerek ilk
alınan absorbans (1.327) değeri ile kıyaslanmak koşuluyla saklama koşullarının enzim
aktivitesi üzerindeki etkisi test edilerek en uygun saklama koşulları belirlenmiştir.
Enzim aktivitesinden alınan sonuçlara göre, hem EDTA hem de DTT içeren enzimlerin
aktivitesi sadece EDTA, sadece DTT ve hiçbir koruyucu içermeyen enzimlere kıyasla daha
yüksek çıkmıştır (Çizelge 3.6 ve Şekil 3.14 ).
56
Çizelge 3.6 25 günlük saklama süresi sonunda alınan aktivite sonuçları
Saklama Çözeltileri
5 mM EDTA + 10 mM DTT
5 mM EDTA
10 mM DTT
---Dondurma İşlemi Öncesi Aktivite
+4oC
1.307
0.762
0.413
0.079
- 20oC
1.311
1.266
1.053
0.421
1.327
- 80oC
1.294
1.181
0.939
0.417
Şekil 3.14 Enzim aktivitesinin, kullanılan koruyucu madde ve saklama sıcaklığına göre
değişimini gösteren grafik.
En fazla fark ise +4 oC’de saklanan enzimlerde görülmektedir. -20 oC ve – 80 oC saklanan
enzimlerde ise EDTA+DTT, sadece EDTA ve sadece DTT’ de saklanan enzim aktivitesi
arasında çok fazla fark yoktur. Hiçbir koruyucu madde içermeyen enzim aktivitesindeki en
büyük düşüş ise +4 oC’ de görülmektedir. –20oC ve -80oC’ deki enzim aktivitesi ise daha
yüksektir. –20oC ve –80oC’ de her dört ortamda saklanan enzim aktivitesi birbirine yakındır.
+4oC’ de ise enzim aktivitesi hiçbir koruyucu içermeyen örnekte neredeyse yoktur. Sonuç
olarak, proteini daha uzun süre saklayabilmek için, proteinler EDTA+DTT’nin bulunduğu
ortamda, –80oC’de, defalarca dondurup-çözmeden sakınmak için küçük miktralara bölünerek
gerektiğinde kullanılmak üzere depolanmıştır.
57
3.1.4 PvLDH’ın Kinetik Analizi
3.1.4.1 PvLDH Proteininin Molekül Ağırlığı ve Extinction Coefficient Hesaplamasının
Yapılması
Bu hesaplamanın yapılabilmesi için öncelikle uygun program tespit edilmiştir. Bunun için
yapılan
tarama
sonucunda
http://www.basic.northwestern.edu/biotools/proteincalc.html
adresinde serbest kullanımda olan “Peptide Property Calculator” isimli program
kullanılmıştır. İşlem aşağıdaki şekilde yapılmıştır:
ƒ PvLDH’ın 316 aminoasitlik dizisi veri olarak istenilen şekilde programa girilmiştir.
ƒ Program tarafından proteinin Extinction Coefficient (Molar absorbtion coefficient) ve
moleküler ağırlığı hesaplanmıştır. Aynı işlem bütün mutant proteinler için, üzerinde
yapılması hedeflenen aminoasit değişiklikleri ve delesyonları yapıldıktan sonra program ile
hesaplamalar yapılmıştır.
PvLDH’ın molekül ağırlığı 34221 g/mol, Extinction Coefficient’i ise 16410 cm-1M-1 olarak
hesaplanmıştır.
ƒ Buna göre hesaplamalar aşağıdaki şekilde optimize edilmiştir:
280 nm’de 1 M PvLDH: 16410 cm-1M-1
34221g/lt PvLDH: 16410 cm-1M-1’dir.
Enzim konsantrasyonu ve protein miktar tayinleri bu bilgiler kullanılarak hesaplanmıştır. Bu
değerler her bir mutant protein için ayrı ayrı hesaplanarak kullanılmıştır. Tespit edilen stok
enzim miktarı esas alınarak her bir analizde kullanılan enzim miktarı nM ve M olarak
hesaplanmış ve bu değerler kcat değerinin hesaplanmasında kullanılmıştır.
3.1.4.2 Kinetik Tampon Çözeltisinin Hazırlanması ve Ölçümlerin Yapılması
Kinetik
ölçümlerin
yapılması
için
9
farklı
pürivat
konsantrasyonunda
ölçüm
gerçekleştirilmiştir. Her bir pürivat konsantrasyonunda 3 ölçüm yapılmıştır. Bunun için 50 ml
lik enzim ve NADH karışımı Tris/KCl pH: 7.5 bufferi içerisinde hazırlanmıştır. Hazırlanan
karışımdaki son NADH konsantrasyonu 200 μM olacak şekilde hesaplamalar yapılmıştır.
Kullanılan enzim miktarı PvLDH ve mutant PvLDH proteinlerine göre değişkenlik göstermiş
58
olup kullanılan farklı enzim miktarları PvLDH ve her bir mutant protein için, protein
konsantrasyonunun hesaplanmasında anlatıldığı gibi hesaplamalarda kullanılmıştır.
Her bir farklı pürivat konsantrasyonunda ölçüm yapmak için enzim ve NADH içeren uygun
miktarda tampon çözelti 1 ml lik küvete konmuş ve reaksiyon pürivat ilavesi ile başlatılmıştır.
Çalışmalar PvLDH ve bütün mutant proteinler için 3 defa tekrar edilmiştir.
PvLDH
enziminin
aktivitesinin
ölçülmesi,
UNICAM
UV-Visible
spektrofotometre
kullanılarak NADH’ın NAD+’a çevrilmesi ile 340 nm’deki (Δ A340/dakika) absorbans
değişim oranı takip edilerek yapılmış ve Çizelge 3.7’da verilen değerler elde edilmiştir. Her
bir pürivat konsantrasyonunda üç ölçüm yapılıp ortalaması alınmış ve bütün çalışma üç defa
tekrar edilerek yine ortalamalar verilmiştir. Aynı işlem bütün PvLDH mutant proteinleri için
gerçekleştirilmiştir.
Çizelge 3.7 PvLDH enziminin aktivitesinin NADH’ın NAD+’a çevrilmesi ile 340 nm’deki (Δ
A340/dakika) absorbans değişim oranının takip edilerek ölçülmesi.
Pürivat (mM)
Oran
(Δ A340/dakika)
0,02
0,048
0,06
0,089
0,18
0,102
0,54
0,127
1,6
0,141
4,86
0,158
14,58
0,143
20,4
0,135
29
0,129
3.1.4.3 Sonuçların Grafit ile Analizi ve Yorumlanması
Çizelge 3.7’de sunulan veriler programa girilmiş ve kullanma klavuzuna göre enzim kinetiği
hesaplamaları gerçekleştirilmiştir. PvLDH için elde edilen sonuçlar Şekil 3.15 ve Çizelge
3.8’de sunulmuştur.
59
Çizelge 3.8 PvLDH’ın Grafit ile analizi sonucunda elde edilen sonuçlar. PvLDH için Reduced
Chi squared değeri 7.796e-005 olarak tespit edilmiştir.
Değişken
Vmax
Km (mM)
Değer
0.1413
0.0378
Standart hata
0.0038
0.0068
Analiz sonucunda tespit edilen Vmax değerinden ve başlangıçta hesaplanan enzim miktarından
yola çıkılarak kcat, değeri hesaplanmış ve yorumlamalarda kullanılmıştır.
Şekil 3.15 PvLDH’ın Steady-State kinetik davranışı
Bütün bu analizlere göre PvLDH için elde edilen veriler Çizelge 3.9 da sunulmuştur.
Çizelge 3.9 PvLDH’ın Steady State kinetik parametreleri
PvLDH
Km (mM)
kcat (s-1)
0.0378
3.17
PvLDH kullanılarak elde edilen bu sonuçlar bütün mutant proteinler için elde edilen
sonuçların karşılaştırmalı yorumunda kullanılacaktır.
60
Görüldüğü gibi PvLDH için tepsi edilen ve NADH’ın kofaktör olarak kullanıldığı Km pürivat
değeri 0.0378 mM veya yaklaşık olarak 0.038mM (38 µM)’dır. Enzimin kcat (s-1) değeri ise
3.17’dir. Bu değer literatür bilgisi ile karşılaştırıldığı zaman Brown vd., 2004 PvLDH için Km
pürivat değerini 17 µM olarak bulmuştur. İdeal olan bu değerlerin yabanıl tip enzim için elde
edilip daha sonra elde edilen bütün verilerin diğer proteinlerin analizi ve sonuçlarının
yorumunda kullanılmasıdır. PvLDH Km pürivat değeri Brown vd., 2004 tarafından 17 µM,
Chaukiad, vd., 2005 tarafından 52 µM ve Yıldız Teknik Üniversitesi Moleküler Genetik
Laboratuarında yaptığımız çalışmalarda ise 38 µM olarak tespit edilmiştir. Aynı farklılık
PfLDH’ın analizinde de görülmüştür. Farklı grupların elde etmiş olduğu PfLDH Km pürivat
değeri, gruplara göre 30-55 µM arasında değişkenlik göstermiştir (Brown vd., 2004; Chaukiad
vd., 2005; Shoemark, 2007). Enzimin kcat değerinin belirlenmesinde de benzer durum
sözkonusudur (Brown vd., 2004 ve bu çalışma). Çalışmamızda konsantrasyon bağımlı bir
değer olan kcat değerinin düşük bulunmuş olması protein miktarının daha düşük olarak elde
edilmiş olmasından kaynaklanabilir ve bu durum farklı protokoller ile elde ettiğimiz protein
miktarınındaki farklılıkları ve saflaştırmanın yapmış olduğumuz çok yoğun çalışmaların
neden optimize edildiğini de açıklamaktadır Bu nedenle Çizelge 3.9’da sunulan veriler bütün
mutant proteinler için elde edilen sonuçların yorumunda kullanılacaktır. Bu kullanımın
doğruluğu ileride açıklanacak olan biri diğerinin devamı niteliğinde olan tutarlı mutagenez
sonuçları ile özellikle görülecektir
3.1.5 PvLDH’ın Aktif Bölge Halkasının Analizi
Bu tez çalışmasının genel amacı PvLDH’i engelleyecek ve insan LDH’ini engellenmeden
bırakacak bir inhibitör bulunma çalışmalarına destek olacak şekilde P. vivax LDH’ının
üretilerek analiz edilmesidir. Bu amaçla aktif bölge halkasında tespit edilmiş olunan ilave 5
aminoasidin (Aspartik asit, Lisin, Glutamik asit, Triptofan, Asparagin) (Çizelge 3.10),
sıtmaya karşı etkin olacak yeni ilaç tasarım çalışmalarına sağlayacağı katkıyı test edebilmek
için, bu dizinin proteine kazandırdığı kinetik özelliklerin araştırılması hedeflenmektedir.
Yapılacak olan bu çalışmada mutant P. vivax LDH enzimleri kinetik analiz yöntemleri ile test
edilerek, bu bölgenin P. vivax’a karşı geliştirilecek olan yeni bir antimalarial ilacın tasarımı
çalışmalarına olabilecek katkılarının belirlenmesi amaçlanmıştır.
Çalışmanın bu bölümünde, önceki çalışmalarda PvLDH’ın aktif bölge halkasındaki ilave 5
aminoasidin delesyonu yapılarak elde edilen PvDLDH ve PvKLDH mutant LDH enzimleri
(Turgut-Balık vd., 2006), bu çalışmada bu mutant proteinlerin C terminaline his tag eklenip
yeniden klonlanması ile rekombinant olarak üretilerek kinetik analizleri gerçekleştirilmiştir.
61
PvWLDH, PvNLDH, ve PvELDH mutant enzimlerinin ise aktivitelerinin olmamasından
dolayı enzim kinetik çalışmaları yapılmamıştır (Turgut-Balık vd., 2006).
Çizelge 3.10 PvLDH’ın aktif bölge halkasındaki ilave 5 amino asidin delesyonunun
gösterilmesi (104. amino asit tanımlanmamıştır)
PvLDH
PvD
PvK
PvE
PvW
PvN
98
A
A
A
A
A
A
G
G
G
G
G
G
F
F
F
F
F
F
T
T
T
T
T
T
K
K
K
K
K
K
A
A
A
A
A
A
-
P
P
P
P
P
P
G
G
G
G
G
G
108
K S
K S
K S
K S
K S
K S
D
-
K
K
-
E
E
E
-
W
W
W
W
-
109
N R
N R
N R
N R
N R
- R
3.1.5.1 PvLDH Aktif Bölge Halkasındaki Aspartik Asit108A Aminoasidinin Delesyonunun
(PvDLDH) Analizi
3.1.5.1.1 PvDLDH Proteininin C Terminaline 6 Histidin Amino Asidinin İlave Edilmesi
ve Proteinin İfade Edilmesi
PvLDH’ın aktif bölge halkasındaki 5 aminoasit serin-108 ile arjinin-l09 arasında olup birinci
aminoasid aspartik asittir (D108A). PvDLDH mutasyonu, P. vivax LDH’ının aktif bölge
halkasındaki (DKEWN) asparik asit (D) aminoasidinin yönlendirilmiş mutasyon ile
silinmesiyle elde edilmiş mutant LDH’tır.
Proteinin nikel kolonları kullanılarak saflaştırılması amacı ile PvDLDH’ın C terminaline 6
histidin aminoasidi ilave edilmiştir. Bunun için Pv7 ve üzerinde 6 adet histidin taşıyan Pv15
primerleri kullanılarak PCR yapılmış ve bu reaksiyon sonrasında PvDLDH geninin 3' ucuna 6
histidin aminoasidini kodlayacak olan DNA dizisi ilave edilmiştir. 6 histidin aminoasidinin
ilavesi, PvLDH geninin ekspresyonu sonrasında üretilecek olan PvLDH proteininin QIAGEN
Ni-NTA Agaroz ile saflaştırılmasını mümkün kılmak için gerçekleştirilmiştir.
PCR sonrası agaroz jelde koşturulan örneklerden DNA saflaştırması yapılarak C terminalinde
6 histidin içeren PvDLDH geni geri kazanılmıştır. Hem PvLDH geni hem de genin
aktarılacağı pKK223-3 vektörü EcoRI ve PstI restriksiyon endonükleaz enzimleri (RE) ile
kesilmiş yapışkan uçlar oluşturularak ligasyona hazır duruma getirilmiştir. Ligasyon, 4 °C’de
bir gecelik inkübasyon ile sağlanmıştır.
Ligasyon sonrası elde edilen rekombinant DNA (pKK223-3 vektörü + PvLDH geni) ve
pozitif kontrol için hiç bir gen içermeyen pKK223-3 vektörü E. coli JM105 hücrelerine
aktarılmıştır. Transformasyon sonrasında seçilen bazı kolonilerin PvDLDH genini taşıyıp
62
taşımadıklarını belirlemek için koloni PCR yapılmıştır. Koloni PCR sonrası örnekler %1’lik
agaroz jel’de yürütülmüş ve klonlanan genin büyüklüğünde bir bant jelde görülmüştür. Doğru
delesyonun yapıldığı (Şekil 3.16) ve proteinin C terminal ucuna 6 adet histidin’in ilave
edildiği dizi analizi ile de ispatlanmıştır (Şekil 3.17).
Şekil 3.16 Aktif bölge halkasından D amino asitinin uzaklaştırıldığının gösterildiği PvDLDH
dizileme sonucu.
Şekil 3.17 PvDLDH mutant LDH enziminin, Ni-NTA agroz ile saflaştırılabilmesi için
eklenen ve 6 histidin kodalyan nükleik asitlerin mutant gendeki yerinin gösterilmesi
3.1.5.1.2 PvDLDH Proteininin Saflaştırılması
PvDLDH proteini Yöntem 2’ye göre saflaştırılmış ve UV-Vis spektrofotometre ile A280 ve
A260’ da ölçümler yapılmış olup, saf olan ve spektrofotometre ile ölçümlerde tek bir pikin
görüldüğü elüsyonlar (Şekil 3.18 ve Şekil 3.19) enzim kinetiği deneylerinde kullanılmıştır.
63
Şekil 3.18 PvDLDH proteininin saflaştırılması sonucu elde edilen saf proteinlerin SDSPAGE görüntüsü. 1: Markır, 2: Hücre lizatı, 3: 1. Kolon süzüntüsü (FT1), 4: 2. Kolon
süzüntüsü (FT2), 5: 3. Kolon süzüntüsü (FT3), 6: 1. yıkama (W1), 7: 2. Yıkama (W2), 8: 3
Yıkama (W3), 9: 1. Elüsyon (E1), 10: 2. Elüsyon (E2)
Şekil 3.19 PvDLDH proteininin saflaştırılması sonucu elde edilen saf proteinlerin
elüsyonlarının tamamının SDS-PAGE görüntüsü. 1: Markır, 2: 3. Elüsyon (E3), 3: 4. Elüsyon
(E4), 4: 5. Elüsyon (E5), 5: 6. Elüsyon (E6), 6: 7. Elüsyon (E7), 7: 8. Elüsyon (E8), 8: 9.
Elüsyon (E9), 9: 10.Elüsyon (E10), 10: 11. Elüsyon (E11).
Çizelge 3.11’de yöntemin uygulanması sırasında alınmış olan örneklerin A340 nm’de kontrol
amaçlı yapılan aktivite ölçüm sonuçları verilmiştir.
Çizelge 3.11 PvDLDH’ın Hücre lizatı, süzüntüler (FT1, FT2 ve FT3), yıkamalar (W1, W2 ve
W3) ve elde edilen elüsyonalardaki (E1-E11) enzim aktivitesinin tespiti.
64
3.1.5.1.3 PvDLDH Proteininin Kinetik Analizi
PvDLDH enziminin aktivitesinin ölçülmesi, UNICAM UV-Visible spektrofotometre
kullanılarak NADH’ın NAD+’a çevrilmesi ile 340 nm’deki (Δ A340/dakika) absorbans değişim
oranı takip edilerek yapılmış ve Çizelge 3.12’de verilen değerler elde edilmiştir.
Çizelge 3.12 PvDLDH enziminin aktivitesinin NADH’ın NAD+’a çevrilmesi ile 340 nm’deki
(Δ A340/dakika) absorbans değişim oranının takip edilerek ölçülmesi.
Pürivat (mM)
Oran
(Δ A340/dakika)
0,02
0,028
0,06
0,058
0,18
0,110
0,54
0,130
1,6
0,154
4,86
0,165
14,58
0,156
20,4
0,149
29
0,142
Yukarıda sunulan veriler programa girilmiş ve kullanma klavuzuna göre enzim kinetiği
hesaplamaları gerçekleştirilmiştir. PvDLDH için elde edilen sonuçlar Şekil 3.20 ve Çizelge
3.13’te sunulmuştur.
Çizelge 3.13 PvDLDH’ın Grafit ile analizi sonucunda elde edilen sonuçlar.
Değişken
Değer
Standart hata
Vmax
0.1554
0.0037
Km (mM)
0.0881
0.0137
65
Şekil 3.20 PvDLDH’ın Steady-State kinetik davranışı
Analiz sonucunda tespit edilen Vmax değerinden ve başlangıçta hesaplanan enzim miktarından
yola çıkılarak kcat, değeri hesaplanmıştır. Bütün bu analizlere göre PvDLDH için elde edilen
veriler Çizelge3.14’te sunulmuştur.
Çizelge 3.14 PvDLDH’ın Steady State kinetik parametreleri.
Km (mM)
kcat (s-1)
PvLDH
0.0378
3.17
PvDLDH
0.0881
2.75
Çizelge 3.14’de görüldüğü gibi Km pürivat değeri 38 µM’dan D amino asitinin katalitik
halkadan uzaklaştırılması ile beraber 88 µM’a yükselmiştir. Yine kcat değeri de 3.17 s-1’den
2.75 s-1’e düşmüştür. Beş amino asitin ilavesi ile oluşmuş olan ve enzim yüzeyinde bir yarık
oluşturan aktif bölge halkası (Dunn vd.,1996) D amino asitinin proteinden uzaklaştırılması ile
beraber Km değeri yaklaşık iki kat yükselmiştirki bu durum bağlanmanın zayıfladığını ve
66
bağlanma bölgesinin yabanıl tip enzimde (PvLDH) olduğu gibi iyi bağlanamadığını gösterir.
Enzimin kataliz mekanizması olumsuz etkilenmiş ve katalitik halka olması gerektiği gibi
kapanamadığı için Km değeri yükselmiş ve zayıf bir bağlanma gerçekleşmiştir. Katalitik
halkanın iyi kapanmadığının bir diğer göstergesi de PvDLDH’ın kcat değerinin PvLDH’ın aynı
değerine göre % 13 düşüş göstermesidir. Hem Km hem de kcat değerlerinin etkilenmiş olması
hem bağlanma hem de katalizin ikisininde etkilendiğini göstermektedir. Aktif bölgedeki beş
ilave amino asitin bir amino asit daha kısalması bu yorumların doğrulanmasında önemli bir
kriterdir.
3.1.5.2 PvLDH Aktif Bölge Halkasındaki Aspartik Asit108A Lisin108B Amino Asitlerinin
Delesyonunun (PvKLDH) Analizi
PvK mutasyonu, P. vivax LDH’ının aktif bölge halkasındaki (DKEWN) asparik asit (D) ve
lizin (K) aminoasidinin birlikte yönlendirilmiş mutasyon ile silinmesiyle elde edilmiş mutant
LDH’tır (Turgut Balık vd., 2006). Bu bölümün amacı, iki amino asit kısalmasının proteinin
aktivitesi üzerinde nasıl bir değişim meydana getireceğini araştırmaktır.
PvKLDH mutant genine 6 histidin eklenmesi ve ardından JM105 E.coli soylarında ifade
edilerek mutant ptoteinin saflaştırılmasında daha önce kullanılan deneysel yöntemlerin aynısı
uygulanmıştır. Bütün preparatif amaçlı jel elektroforezi için kristal viyole ile boyanan agaroz
jel kullanılmıştır. Doğru delesyonun yapıldığı (Şekil 3.21) ve 3’ ucuna 6 adet histidin’in ilave
edildiği dizi analizi ile de ispatlanmıştır ve (Şekil 3.22). Sürekli tekrarlardan kaçınmak
amacıyla deneysel işlemlere ayrıntılı olarak girilmemiş sadece sonuçlar verilmiştir
Şekil 3.21 Aktif bölge halkasından D ve K amino asitlerinin uzaklaştırıldığının gösterildiği
PvKLDH dizileme sonucu.
67
Şekil 3.22 PvKLDH mutant LDH enziminin, Ni-NTA agroz ile saflaştırılabilmesi için
eklenen ve 6 histidin kodalyan nükleik asitlerin mutant gendeki yerinin gösterilmesi
PvKLDH proteini saflaştırılmış ve spektrofotometre ile A280 ve A260’ da ölçümler yapılmış
olup, saf olan (Şekil 3.23 Şekil 3.24) ve spektrofotometre ile ölçümlerde tek bir pikin
görüldüğü elüsyonlar enzim kinetiği deneylerinde kullanılmıştır.
Şekil 3.23 PvKLDH proteininin saflaştırılması sonucu elde edilen saf proteinlerin SDSPAGE görüntüsü. 1: Markır, 2: Hücre lizatı, 3: 1. Kolon süzüntüsü (FT1), 4: 2. Kolon
süzüntüsü (FT2), 5: 3. Kolon süzüntüsü (FT3), 6: 1. yıkama (W1), 7: 2. Yıkama (W2), 8: 3
Yıkama (W3), 9: 1. Elüsyon (E1), 10: 2. Elüsyon (E2)
Şekil 3.24 PvKLDH proteininin saflaştırılması sonucu elde edilen saf proteinlerin
elüsyonlarının tamamının SDS-PAGE görüntüsü. 1: Markır, 2: 3. Elüsyon (E3), 3: 4. Elüsyon
(E4), 4: 5. Elüsyon (E5), 5: 6. Elüsyon (E6), 6: 7. Elüsyon (E7), 7: 8. Elüsyon (E8), 8: 9.
Elüsyon (E9), 9: 10.Elüsyon (E10), 10: 11. Elüsyon (E11).
68
Çizelge 3.15’te saflaştırma işleminin uygulanması sırasında alınmış olan örneklerin A340
nm’de kontrol amaçlı yapılan aktivite ölçüm sonuçları verilmiştir.
Çizelge 3.15 PvKLDH’ın hücre lizatı, süzüntüler (FT1, FT2 ve FT3), yıkamalar (W1, W2 ve
W3) ve elde edilen elüsyonalardaki (E1-E11) enzim aktivitesinin tespiti.
PvKLDH enziminin aktivitesinin ölçülmesi, UNICAM UV-Visible spektrofotometre
kullanılarak NADH’ın NAD+’a çevrilmesi ile 340 nm’deki (Δ A340/dakika) absorbans değişim
oranı takip edilerek yapılmış ve Çizelge 3.16’da verilen değerler elde edilmiştir.
Çizelge 3.16 PvKLDH enziminin aktivitesinin NADH’ın NAD+’a çevrilmesi ile 340 nm’deki
(Δ A340/dakika) absorbans değişim oranının takip edilerek ölçülmesi.
Pürivat (mM)
Oran
(Δ A340/dakika)
0,02
0,027
0,06
0,065
0,18
0,117
0,54
0,149
1,6
0,170
4,86
0,191
14,58
0,177
20,4
0,167
29
0,150
Çizelge 3.16’da sunulan veriler programa girilmiş ve kullanma klavuzuna göre enzim kinetiği
hesaplamaları gerçekleştirilmiştir. PvKLDH için elde edilen sonuçlar Şekil 3.25 ve Çizelge
3.17’de sunulmuştur.
69
Şekil 3.25 PvKLDH’ın Steady-State kinetik davranışı
Çizelge 3.17 PvKLDH’ın Grafit ile analizi sonucunda elde edilen sonuçlar.
Değişken
Değer
Standart hata
Vmax
0.1741
0.0057
Km (mM)
0.0937
0.0193
Analiz sonucunda tespit edilen Vmax değerinden ve başlangıçta hesaplanan enzim miktarından
yola çıkılarak kcat, değeri hesaplanmış ve yorumlamalarda kullanılmıştır. Bütün bu analizlere
göre PvKLDH için elde edilen veriler Çizelge 3.18’de sunulmuştur.
Çizelge 3.18 PvKLDH’ın Steady State kinetik parametreleri.
PvLDH
PvKLDH
Km (mM)
kcat (s-1)
0.0378
0.0937
3.17
1.823
Aktif bölge halkasından ilk iki amino asitin kısaltıldığı mutant protein olan PvKLDH
mutagenezinin sonuçlarını gösteren Çizelge 3.18 incelendiği zaman PvKLDH’ın Km pürivat
70
değeri, PvLDH’ın aynı değerine göre iki kattan daha fazla yükselmiş ve ve yine kcat pürivat
değeri çok çarpıcı bir şekilde % 42’lik bir düşüş göstererek 1.823 s-1 olmuştur. Bu durum
tamamen PvDLDH’ın analizi sonucunda elde edilen sonuçları desteklemektedir. Kısalma ile
beraber Km pürivat değerinin bir önceki mutanta proteine göre daha yüksek olması enzimin
substratına daha zayıf bağlandığını ve daha düşük kcat ise enzimin bu kısalma ile beraber daha
zayıf katalizlediğini göstermektedir. kcat’in düşük olması gittikçe proteinin azaldığını ve bunun
doğal bir sonucu olarak NADH’ı NAD+’ya kataliz edemediğini gösterebilir. Bunun anlamı
aktif bölgenin pürivata ulaşma kapasitesinin azaldığı ve ancak pürivata bağlanmasına rağmen
turn over kapasitesinin düşük olduğu anlamında olabilir. Ancak enzimin hala daha aktif oluşu
β saç tokasının iki amino asit kısaltılmasına rağmen substrat bağlanma kavitesinin tam olarak
rahatsız edilmediğini gösterir. Yüksek Km ve düşük kcat değerlerinin açıklamasını bu şekilde
yapmak mümkündür. Elde edilen bu veriler geriye kalan üç amino asitin çıkarılması ile
proteinin inaktif hale gelmiş olmasını da açıklamaktadır.
Bu çalışma ile insan LDH dizisi ile karşılaştırıldığı zaman PvLDH’da ilave olarak bulunan 5
amino asidin protein için ne kadar önem arzetmekte olduğu kinetik olarak da gösterilmiştir.
Dolayısıyla bu çalışma ile 5 amino asidin oluşturduğu yarığa konacak bir enzim inhibitörünün
bu bölgede yapacağı bir değişiklik sonucunda enzimin kolaylıkla inaktif hale gelebileceği
yönünde ispat sunulmuştur. LDH aktivitesi engellenince ideal olarak kandaki parazitin yok
olacağı bilinmektedir (Royer, 1986; Cameron, 2004).
3.1.6 PvLDH Aktif Bölge Amino Terminal Ucunun Analizi
Plasmodium’larla aynı apikompleksan ailesi içinde yer alan Toxoplasma gondii I, II, Eimeria
acervulina ve Eimeria tenella LDH’ları ile Plasmodium vivax LDH’ının aktif bölgelerinin
amino terminal ucu karşılaştırıldığı zaman (Çizelge 3.19) bazı önemli amino asitlerin sadece
Plasmodial LDH’a özgü olduğu bazı önemli amino asitlerin ise Apicomplexan’lar arasında
korunduğu gözlemlenmiştir. Yapısal olarak önemli olan bu amino asitlerin rollerini daha iyi
anlayabilmek ve yeni bir antimalarial tasarım çalışmasında kullanabilmek için yönlendirilmiş
mutagenez çalışmaları yapılmış ve Plasmodium vivax LDH aktif bölge amino terminal ucu
yapılan mutagenez çalışmaları ile Toxoplasma gondii I (PvLM3Tg1) ve II (PvLM2Tg2),
Eimeria acervulina (PvLM2Ea) ve Eimeria tenella (PvLM3Et) LDH’larına benzetilmiştir
(Atmış, 2007).
Bu tez çalışmasında, aktif bölge halkasındaki 5 amino asit ilavesinden önceki bölgenin diğer
Apicomplexan LDH’larına (Toxoplasma gondii 1 ve 2, Eimeria tenella, Eimeria acervulina,)
71
benzetilmiş olan mutant proteinler, saflaştırma amacı ile C terminallerine his tag eklenerek
yeniden klonlanmış ve mutant proteinler saflaştırılarak kinetik analizleri yapılmış ve yabanıl
tip PvLDH ile karşılaştırılarak bu bölgenin önemini vurgulamak amaçlanmıştır
Çizelge 3. 19 Plasmodium vivax ve diğer bazı Apicomplexan LDH’larının aktif bölgesindeki
amino asit dizisi (104. amino asit tanımlanmamıştır.) (pvivax: Plasmodium vivax; toxgo1:
Toxoplasma gondii LDH1; toxgo2: Toxoplasma gondii LDH2; etenella: Eimeria tenella;
eacervulina: Eimeria acervulina)
pvivax
V T A G F T K A P G K S D K E W N R
toxgo1
V T A G L T K V P G K P D S E W S R
toxgo2
I T A G L T K V P G K S D K E W S R
etenella
I T A G I T K A A G K S D Q E W S R
eacervulina
I T A G I T K I P G K S D K E W S R
3.1.6.1 PvLM3Tg1 Mutant LDH Enziminin Analizi
Bu bölümde ilk önce, daha önce PvLDH’ ın aktif bölge halkasındaki 5 amino asit ilavesinden
önceki bölgede F100, A103, S108 amino asitleri mutagenez çalışması yapılarak Toxoplasma
gondii LDH-1’e benzetilmiş ve L100, V103, P108 mutasyonları yapılmış olan PvLM3Tg1 (Atmış
2007), bu çalışmada His-tag eklenerek yeniden klonlanıp ilgili protein üretilip kinetik olarak
analiz edilmiştir.
Bu mutant LDH enziminin kinetik analizinin yapılmasında PvLM3Tg1 mutant genine 6
histidin eklenmesi ve ardından JM105 E.coli soylarında ifade edilerek mutant proteinin NiNTA agaroz ile saflaştıırlmasında daha önce kullanılan deneysel yöntemlerin aynısı
uygulanmıştır. Koloni PCR sonucunun pozitif görülmesinden sonra PvLM3Tg1 geninin
JM105 bakteri hücresine aktarılan genin doğru mutasyonu taşıdığı (Şekil 3.26) ve 3’ ucuna 6
adet histidinin ilave edildiği dizi analizi ile de ispatlanmıştır ve (Şekil 3.27).
Şekil 3.26 Plasmodium vivax LDH’ ının Toxoplasma gondii LDH-1’e benzetilmesi ile elde
edilen mutant genin dizi analizi sonuçları.
72
Şekil 3.27 PvLM3Tg1 enziminin, Ni-NTA agroz ile saflaştırılabilmesi için eklenen ve 6
histidin kodalyan nükleik asitlerin mutant gendeki yerinin gösterilmesi
PvLM3Tg1 proteini saflaştırılmış ve spektrofotometre ile A280 ve A260’ da ölçümler yapılmış
olup, saf olan (Şekil 3.28 ve Şekil 3.29) ve spektrofotometre ile ölçümlerde tek bir pikin
görüldüğü elüsyonlar enzim kinetiği deneylerinde kullanılmıştır.
Şekil 3.28 PvLM3Tg1 proteininin saflaştırılması sonucu elde edilen saf proteinlerin SDSPAGE görüntüsü. 1: Markır, 2: Hücre lizatı, 3: 1. Kolon süzüntüsü (FT1), 4: 2. Kolon
süzüntüsü (FT2), 5: 3. Kolon süzüntüsü (FT3), 6: 1. yıkama (W1), 7: 2. Yıkama (W2), 8: 3
Yıkama (W3), 9: 1. Elüsyon (E1), 10: 2. Elüsyon (E2)
Şekil 3.29 PvLM3Tg1 proteininin saflaştırılması sonucu elde edilen saf proteinlerin
elüsyonlarının tamamının SDS-PAGE görüntüsü. 1: Markır, 2: 3. Elüsyon (E3), 3: 4. Elüsyon
(E4), 4: 5. Elüsyon (E5), 5: 6. Elüsyon (E6), 6: 7. Elüsyon (E7), 7: 8. Elüsyon (E8), 8: 9.
Elüsyon (E9), 9: 10.Elüsyon (E10), 10: 11. Elüsyon (E11).
73
Çizelge 3.20 saflaştırma işleminin uygulanması sırasında alınmış olan örneklerin A340 nm’de
kontrol amaçlı yapılan aktivite ölçüm sonuçları verilmiştir.
Çizelge 3.20 PvLM3Tg1’in hücre lizatı, süzüntüler (FT1, FT2 ve FT3), yıkamalar (W1, W2
ve W3) ve elde edilen elüsyonalardaki (E1-E11) enzim aktivitesinin tespiti.
PvLM3Tg1 enziminin aktivitesinin ölçülmesi, UNICAM UV-Visible spektrofotometre
kullanılarak NADH’ın NAD+’a çevrilmesi ile 340 nm’deki (Δ A340/dakika) absorbans değişim
oranı takip edilerek yapılmış ve Çizelge 3.21’de verilen değerler elde edilmiştir.
Çizelge 3.21 PvLM3Tg1 enziminin aktivitesinin NADH’ın NAD+’a çevrilmesi ile 340
nm’deki (Δ A340/dakika) absorbans değişim oranının takip edilerek ölçülmesi.
Pürivat (mM)
Oran
(Δ A340/dakika)
0,02
0,024
0,06
0,053
0,18
0,082
0,54
0,118
1,6
0,138
4,86
0,163
14,58
0,156
20,4
0,149
29
0,133
Çizelge 3.21’de sunulan veriler programa girilmiş ve kullanma klavuzuna göre enzim kinetiği
hesaplamaları gerçekleştirilmiştir. PvLM3Tg1 için elde edilen sonuçlar Şekil 3.30 ve Çizelge
3.22’de sunulmuştur.
74
Şekil 3.30 PvLM3Tg1’ın Steady-State kinetik davranışı
Çizelge 3.22 PvLM3Tg1’ın Grafit ile analizi sonucunda elde edilen sonuçlar.
Değişken
Vmax
Km (mM)
Değer
0.1506
0.1294
Standart hata
0.0047
0.0249
Analiz sonucunda tespit edilen Vmax değerinden ve başlangıçta hesaplanan enzim miktarından
yola çıkılarak kcat, değeri hesaplanmış ve yorumlamalarda kullanılmıştır. Bütün bu analizlere
göre PvLM3Tg1 için elde edilen veriler Çizelge 3.23’de sunulmuştur.
Çizelge 3.23 PvLM3Tg1’ın Steady State kinetik parametreleri.
Km (mM)
kcat (s-1)
PvLDH
0.0378
3.17
PvLM3Tg1
1.294
3.06
75
PvLM3Tg1, PvLDH’ın aktif bölge halkasındaki 5 amino asit ilavesinden önceki bölgede F100,
A103, S108 amino asitleri sırasıyla L100, V103, P108 ile değiştirilerek Toxoplasma gondii LDH1’e benzetilmesiyle elde edilmiş olduğu mutanttır. Çizelge 3.23’de görüleceği gibi bu
değişiklik yapılıp ilgili bölgeye benzetilmesi ile beraber PvLM3Tg1 Km pürivat değeri 38
µM’dan 129 µM artmıştır. kcat pürivat değeri ise değişmeden kalmıştır. Km pürivat
değerindeki %242 oranındaki bu çarpıcı artış enzimin kataliz görevini yaptığı halde
substratına olan ilgisini yüksek bir oranda kaybettiğini göstermektedir. Bu yönü ile önem
arzeden bir mutasyondur. Yapılan üç amino asitten hangisi veya hangilerinin bu değişikliğe
sebep olduğunun araştırılması bu bölge için önemli olabilecek bir rezidünün tespitini açığa
çıkaracaktır.
3.1.6.2 PvLM2Tg2 Mutant LDH Enziminin Analizi
İkinci kinetik analiz çalışması, PvLDH’ ın aktif bölge amino terminal ucunda bulunan F100 ve
A103, mutagenez çalışması yapılarak Toxoplasma gondii LDH-2’ye benzetilmiş ve L100 ve
V103 mutasyonları yapılmış olan PvLM2Tg2 mutant LDH’dır.
Bu mutant LDH enziminin kinetik analizinin yapılmasında PvLM2Tg2 mutant genine 6
histidin eklenmesi ve ardından JM105 E.coli soylarında ifade edilerek mutant proteinin NiNTA agaroz ile saflaştıırlmasında daha önce kullanılan deneysel yöntemlerin aynısı
uygulanmıştır. Koloni PCR sonucunun pozitif görülmesinden sonra PvLM2Tg2 geninin
JM105 bakteri hücresine aktarılan genin doğru mutasyonu taşıdığı (Şekil 3.31) ve C terminal
ucuna 6 adet histidin’in ilave edildiği DNA dizi analizi ile doğrulanmıştır (Şekil 3.32).
Şekil 3.31 Plasmodium vivax LDH’ ının Toxoplasma gondii LDH-2’ye benzetilmesi ile elde
edilen mutant genin dizi analizi sonuçları.
76
Şekil 3.32 PvLM2Tg2 enziminin, Ni-NTA agroz ile saflaştırılabilmesi için eklenen ve 6
histidin kodalyan nükleik asitlerin mutant gendeki yerinin gösterilmesi
PvLM2Tg2 proteini saflaştırılmış ve spektrofotometre ile A280 ve A260’ da ölçümler yapılmış
olup, saf olan (Şekil 3.33 Şekil 3.34) ve spektrofotometre ile ölçümlerde tek bir pikin
görüldüğü elüsyonlar enzim kinetiği deneylerinde kullanılmıştır.
Şekil 3.33 PvLM2Tg2 proteininin saflaştırılması sonucu elde edilen saf proteinlerin SDSPAGE görüntüsü. 1: Markır, 2: Hücre lizatı, 3: 1. Kolon süzüntüsü (FT1), 4: 2. Kolon
süzüntüsü (FT2), 5: 3. Kolon süzüntüsü (FT3), 6: 1. yıkama (W1), 7: 2. Yıkama (W2), 8: 3
Yıkama (W3), 9: 1. Elüsyon (E1), 10: 2. Elüsyon (E2)
Şekil 3.34 PvLM2Tg2 proteininin saflaştırılması sonucu elde edilen saf proteinlerin
elüsyonlarının tamamının SDS-PAGE görüntüsü. 1: Markır, 2: 3. Elüsyon (E3), 3: 4. Elüsyon
(E4), 4: 5. Elüsyon (E5), 5: 6. Elüsyon (E6), 6: 7. Elüsyon (E7), 7: 8. Elüsyon (E8), 8: 9.
Elüsyon (E9), 9: 10.Elüsyon (E10), 10: 11. Elüsyon (E11).
77
Çizelge 3.24 saflaştırma işleminin uygulanması sırasında alınmış olan örneklerin A340 nm’de
kontrol amaçlı yapılan aktivite ölçüm sonuçları verilmiştir.
Çizelge 3.24 PvLM2Tg2’nin hücre lizatı, süzüntüler (FT1, FT2 ve FT3), yıkamalar (W1, W2
ve W3) ve elde edilen elüsyonalardaki (E1-E11) enzim aktivitesinin tespiti.
PvLM2Tg2 enziminin aktivitesinin ölçülmesi, UNICAM UV-Visible spektrofotometre
kullanılarak NADH’ın NAD+’a çevrilmesi ile 340 nm’deki (Δ A340/dakika) absorbans değişim
oranı takip edilerek yapılmış ve Çizelge 3.25’de verilen değerler elde edilmiştir.
Çizelge 3.25 PvLM2Tg2 enziminin aktivitesinin NADH’ın NAD+’a çevrilmesi ile 340
nm’deki (Δ A340/dakika) absorbans değişim oranının takip edilerek ölçülmesi.
Pürivat (mM)
Oran
(Δ A340/dakika)
0,02
0,038
0,06
0,075
0,18
0,110
0,54
0,135
1,6
0,167
4,86
0,175
14,58
0,167
20,4
0,164
29
0,160
Çizelge 3.25’de sunulan veriler programa girilmiş ve kullanma klavuzuna göre enzim kinetiği
hesaplamaları gerçekleştirilmiştir. PvLM2Tg2 için elde edilen sonuçlar Şekil 3.35 ve Çizelge
3.26’da sunulmuştur.
78
Şekil 3.35 PvLM2Tg2’nin Steady-State kinetik davranışı
Çizelge 3.26 PvLM2Tg2’nin Grafit ile analizi sonucunda elde edilen sonuçlar.
Değişken
Değer
Standart hata
Vmax
0.1671
0.0034
Km (mM)
0.0811
0.0108
Analiz sonucunda tespit edilen Vmax değerinden ve başlangıçta hesaplanan enzim miktarından
yola çıkılarak kcat, değeri hesaplanmış ve yorumlamalarda kullanılmıştır. Bütün bu analizlere
göre PvLM2Tg2 için elde edilen veriler Çizelge 3.27’de sunulmuştur.
Çizelge 3.27 PvLM2Tg2’nin Steady State kinetik parametreleri.
Km (mM)
kcat (s-1)
PvLDH
0.0378
3.17
PvLM2Tg2
0.811
2.98
79
PvLM2Tg2 mutasyonu ile PvLDH’ın aktif bölge halkasındaki 5 aminoasit ilavesinden önceki
bölgede F100 ve A103 aminoasitleri sırasıyla L100 ve V103 ile değiştirilerek Toxoplasma gondii
LDH-2’ye benzetilmesiyle oluşturulmuş mutanttır. Çizelge 3.27’de görüleceği gibi
PvLM2Tg2 proteininin Km pürivat değeri PvLDH’ın aynı değerine göre yaklaşık iki kat
artmıştır. Ancak kcat pürivat değeri belirgin bir değişiklik göstermemiştir.
3.1.6.3 PvLM2Ea Mutant LDH Enziminin Analizi
Üçüncü kinetik çalışması, PvLDH’ın aktif bölge halkasındaki ilave 5 amino asit ilavesinden
önceki bölgede bulunan F100, A103 amino asitleri, mutagenez çalışması yapılarak I100, I103
amino asitlerine dönüştürülmüş ve PvLDH’ın sözkonusu bölgesi Eimeria acervulina
LDH’ının aynı bölgesine benzetilmiş olan PvLM2Ea üzerinedir .
PvLM2Ea mutant LDH enziminin kinetik analizinin yapılmasında mutant genine 6 histidin
eklenmesi ve ardından JM105 E.coli soylarında ifade edilerek mutant proteinin Ni-NTA
agaroz ile saflaştıırlmasında daha önce kullanılan deneysel yöntemlerin aynısı uygulanmıştır.
Koloni PCR sonucunun pozitif görülmesinden sonra PvLM2Ea geninin JM105 bakteri
hücresine aktarılan genin doğru mutasyonu taşıdığı (Şekil 3.36), ayrıca enzimin saflaştırılması
için eklenen 6-Histidin’in doğru bir şekilde gene eklendiği DNA dizi analizi ile
doğrulanmıştır (Şekil 3.37).
Şekil 3.36 Plasmodium vivax LDH’ ının Eimeria acervulina LDH ’ına benzetilmesi ile elde
edilen mutant genin dizi analizi sonuçları.
80
Şekil 3.37 PvLM2Ea enziminin, Ni-NTA agroz ile saflaştırılabilmesi için eklenen ve 6
histidin kodalyan nükleik asitlerin mutant gendeki yerinin gösterilmesi
PvLM2Ea proteini saflaştırılmış ve spektrofotometre ile A280 ve A260’ da ölçümler yapılmış
olup, saf olan (Şekil 3.38 Şekil 3.39) ve spektrofotometre ile ölçümlerde tek bir pikin
görüldüğü elüsyonlar enzim kinetiği deneylerinde kullanılmıştır.
Şekil 3.38 PvLM2Ea proteininin saflaştırılması sonucu elde edilen saf proteinlerin SDSPAGE görüntüsü. 1: Markır, 2: Hücre lizatı, 3: 1. Kolon süzüntüsü (FT1), 4: 2. Kolon
süzüntüsü (FT2), 5: 3. Kolon süzüntüsü (FT3), 6: 1. yıkama (W1), 7: 2. Yıkama (W2), 8: 3
Yıkama (W3), 9: 1. Elüsyon (E1), 10: 2. Elüsyon (E2)
Şekil 3.39 PvLM2Ea proteininin saflaştırılması sonucu elde edilen saf proteinlerin
elüsyonlarının tamamının SDS-PAGE görüntüsü. 1: Markır, 2: 3. Elüsyon (E3), 3: 4. Elüsyon
(E4), 4: 5. Elüsyon (E5), 5: 6. Elüsyon (E6), 6: 7. Elüsyon (E7), 7: 8. Elüsyon (E8), 8: 9.
Elüsyon (E9), 9: 10.Elüsyon (E10), 10: 11. Elüsyon (E11).
81
Çizelge 3.28’de saflaştırma işleminin uygulanması sırasında alınmış olan örneklerin A340
nm’de kontrol amaçlı yapılan aktivite ölçüm sonuçları verilmiştir.
Çizelge 3.28 PvLM2Ea’ın hücre lizatı, süzüntüler (FT1, FT2 ve FT3), yıkamalar (W1, W2 ve
W3) ve elde edilen elüsyonalardaki (E1-E11) enzim aktivitesinin tespiti.
PvLM2Ea enziminin aktivitesinin ölçülmesi, UNICAM UV-Visible spektrofotometre
kullanılarak NADH’ın NAD+’a çevrilmesi ile 340 nm’deki (Δ A340/dakika) absorbans değişim
oranı takip edilerek yapılmış ve Çizelge 3.29’de verilen değerler elde edilmiştir.
Çizelge 3.29 PvLM2Ea enziminin aktivitesinin NADH’ın NAD+’a çevrilmesi ile 340 nm’deki
(Δ A340/dakika) absorbans değişim oranının takip edilerek ölçülmesi.
Pürivat (mM)
Oran
(Δ A340/dakika)
0,02
0,025
0,06
0,041
0,18
0,085
0,54
0,116
1,6
0,136
4,86
0,174
14,58
0,168
20,4
0,164
29
0,158
Çizelge 3.29’de sunulan veriler programa girilmiş ve kullanma klavuzuna göre enzim kinetiği
hesaplamaları gerçekleştirilmiştir. PvLM2Ea için elde edilen sonuçlar Şekil 3.40 ve Çizelge
3.30’da sunulmuştur.
82
Şekil 3.40 PvLM2Ea’nın Steady-State kinetik davranışı
Çizelge 3.30 PvLM2Ea’nın Grafit ile analizi sonucunda elde edilen sonuçlar.
Değişken
Değer
Standart hata
Vmax
0.1653
0.0044
Km (mM)
0.1865
0.0302
Analiz sonucunda tespit edilen Vmax değerinden ve başlangıçta hesaplanan enzim miktarından
yola çıkılarak kcat, değeri hesaplanmış ve yorumlamalarda kullanılmıştır. Bütün bu analizlere
göre PvLM2Ea için elde edilen veriler Çizelge 3.31’de sunulmuştur.
Çizelge 3.31 PvLM2Ea’nın Steady State kinetik parametreleri.
Km (mM)
kcat (s-1)
PvLDH
0.0378
3.17
PvLM2Ea
1.865
4.064
83
PvLM2Ea, PvLDH’ın aktif bölge halkasındaki 5 aminoasit ilavesinden önceki bölgede F100,
A103 aminoasitleri sırasıyla I100 ve I103 ile değiştirilerek Eimeria acervulina LDH’ına
benzetilerek elde edilen mutanttır. Bu çalışmada önceki iki mutasyonun sonucuna benzer
sonuçlar elde edilmiş ve Km pürivat değerinde PvLDH’a göre % 393 oranında bir artış
göstermiştir. kcat pürivat değerinde yine belirgin bir farklılık gözlemlenmemiştir. Bu mutant
protein de aktif bölgenin amino terminal ucunun pürivatın bağlanması açısından
tanımlanmasının önemini göstermektedir.
3.1.6.4 PvLM3Et Mutant LDH Enziminin Analizi
Son olarak kinetik çalışması yapılan mutant protein, PvLDH’ın aktif bölge halkasındaki ilave
5 amino asit ilavesinden önceki bölgede bulunan F100, P105 amino asitleri, mutagenez çalışması
yapılarak I100, A105 amino asitlerine dönüştürülmüş ve PvLDH’ın sözkonusu bölgesi Eimeria
tenella LDH’ının aynı bölgesine benzetilmiş olan PvLM3Et’dir
PvLM3Et mutant LDH enziminin kinetik analizinin yapılmasında mutant gene 6 histidin
eklenmesi ve ardından JM105 E.coli soylarında ifade edilerek mutant proteinin Ni-NTA
agaroz ile saflaştıırlmasında daha önce kullanılan deneysel yöntemlerin aynısı uygulanmıştır.
Koloni PCR sonucunun pozitif görülmesinden sonra PvLM3Et geninin JM105 bakteri
hücresine aktarılan genin doğru mutasyonu taşıdığı (Şekil 3.41) 6 HisTaq eklenip eklenmediği
DNA dizi analizi ile doğrulanmıştır (Şekil 3.42).
Şekil 3.41 Plasmodium vivax LDH’ ının Eimeria tenella LDH ’ına benzetilmesi ile elde
edilen mutant genin dizi analizi sonuçları.
84
Şekil 3.42 PvLM3Et enziminin, Ni-NTA agoz ile saflaştırılabilmesi için eklenen ve 6 histidin
kodalyan nükleik asitlerin mutant gendeki yerinin gösterilmesi
PvLM3Et proteini saflaştırılmış ve spektrofotometre ile A280 ve A260’ da ölçümler yapılmış
olup, saf olan (Şekil 3.43 Şekil 3.44) ve spektrofotometre ile ölçümlerde tek bir pikin
görüldüğü elüsyonlar enzim kinetiği deneylerinde kullanılmıştır.
Şekil 3.43 PvLM3Et proteininin saflaştırılması sonucu elde edilen saf proteinlerin SDSPAGE görüntüsü. 1: Markır, 2: Hücre lizatı, 3: 1. Kolon süzüntüsü (FT1), 4: 2. Kolon
süzüntüsü (FT2), 5: 3. Kolon süzüntüsü (FT3), 6: 1. yıkama (W1), 7: 2. Yıkama (W2), 8: 3
Yıkama (W3), 9: 1. Elüsyon (E1), 10: 2. Elüsyon (E2)
Şekil 3.44 PvLM3Et proteininin saflaştırılması sonucu elde edilen saf proteinlerin
elüsyonlarının tamamının SDS-PAGE görüntüsü. 1: Markır, 2: 3. Elüsyon (E3), 3: 4. Elüsyon
(E4), 4: 5. Elüsyon (E5), 5: 6. Elüsyon (E6), 6: 7. Elüsyon (E7), 7: 8. Elüsyon (E8), 8: 9.
Elüsyon (E9), 9: 10.Elüsyon (E10), 10: 11. Elüsyon (E11).
85
Çizelge 3.32’de saflaştırma işleminin uygulanması sırasında alınmış olan örneklerin A340
nm’de kontrol amaçlı yapılan aktivite ölçüm sonuçları verilmiştir.
Çizelge 3.32 PvLM3Et’nin hücre lizatı, süzüntüler (FT1, FT2 ve FT3), yıkamalar (W1, W2
ve W3) ve elde edilen elüsyonalardaki (E1-E11) enzim aktivitesinin tespiti.
PvLM3Et enziminin aktivitesinin ölçülmesi, UNICAM UV-Visible spektrofotometre
kullanılarak NADH’ın NAD+’a çevrilmesi ile 340 nm’deki (Δ A340/dakika) absorbans değişim
oranı takip edilerek yapılmış ve Çizelge 3.33’te verilen değerler elde edilmiştir.
Çizelge 3.33 PvLM3Et enziminin aktivitesinin NADH’ın NAD+’a çevrilmesi ile 340 nm’deki
(Δ A340/dakika) absorbans değişim oranının takip edilerek ölçülmesi.
Pürivat (mM)
Oran
(Δ A340/dakika)
0,02
0,023
0,06
0,046
0,18
0,072
0,54
0,094
1,6
0,131
4,86
0,152
14,58
0,146
20,4
0,137
29
0,132
Çizelge 3.33’te sunulan veriler programa girilmiş ve kullanma klavuzuna göre enzim kinetiği
hesaplamaları gerçekleştirilmiştir. PvLM3Et için elde edilen sonuçlar Şekil 3.45 ve Çizelge
3.34’te sunulmuştur.
86
Şekil 3.45 PvLM3Et’nın Steady-State kinetik davranışı
Çizelge 3.34 PvLM3Et’nın Grafit ile analizi sonucunda elde edilen sonuçlar.
Değişken
Değer
Standart hata
Vmax
0.1420
0.0049
Km (mM)
0.1665
0.0345
Analiz sonucunda tespit edilen Vmax değerinden ve başlangıçta hesaplanan enzim miktarından
yola çıkılarak kcat, değeri hesaplanmış ve yorumlamalarda kullanılmıştır. Bütün bu analizlere
göre PvLM3Et için elde edilen veriler Çizelge 3.35’te sunulmuştur.
Çizelge 3.35 PvLM3Et’nin Steady State kinetik parametreleri.
Km (mM)
kcat (s-1)
PvLDH
0.0378
3.17
PvLM3Et
1.665
3.815
87
PvLM3Et mutagenezi PvLDH’ın aktif bölge halkasındaki 5 aminoasit ilavesinden önceki
bölgede F100, P105 aminoasitleri sırasıyla I100 ve A105 ile değiştirilerek Eimeria tenella LDH’ına
benzetilmiş halidir. Görüleceği gibi aynı bölgenin TgLDH’ına benzetilmesinde (PvLM2Tg2)
olduğu gibi Km pürivat değerinde artış ile sonuçlanmıştır. Ancak artış daha fazla gerçekleşmiş
olup, oran %340’dır. kcat pürivat değeri ise yine TgLDH’da olduğu gibi çok belirgin bir
değişiklik göstermemiştir. Bu durum da hem TgLDH hem de Eimeria tenella LDH larının
aktif bölge halkasının amino terminalindeki bu değişikliklerin enzimin substratı ile olan
ilgisini değiştirmesi konusu ileri bir çalışma olarak gerçekleştirilebilir.
.
88
4. SONUÇLAR
Sıtma, dişi anofel cinsi sivrisineklerin kan emerken konukçu canlıya bulaştırdıkları
Plasmodium parazitlerinin sebep olduğu bir tropikal parazit hastalığıdır (Kayser, 2005).
Sıtma, günümüzde dünya genelinde 1 milyona yakın kişinin ölümünden sorumlu olarak,
solunum yolu enfeksiyonları (4.2 milyon), ishal enfeksiyonları (2.2 milyon), AIDS (2 milyon)
ve tüberkoloz’dan (1.5 milyon) sonra en çok ölümlere neden olan enfeksiyon hastalığıdır
(WHO, 2008a). Çoğunluğu Orta ve Güney Afrika, Asya, Okyanusya, Orta ve Güney Amerika
ve Kafkasya’da olmak üzere 109 ülke’de endemiktir. Dünya nüfusunun yaklaşık yarısı (3,3
milyar) sıtma hastalığının bulaşma riskinin olduğu bölgelerde yaşarken, beşte biri (1,2 milyar)
sıtma riskinin yüksek olduğu bölgelerde yaşamaktadır. 2006 yılında, dünya genelinde 250
milyon kişi sıtmaya yakalanırken bunlardan yaklaşık 1 milyonunun hayatını kaybettiği rapor
edilmiştir (WHO, 2008b).
Günümüzde, sıtma tedavisinde kullanılan ilaçlara karşı geniş çaplı bir ilaç direncinin
gelişmesi yeni antimalarial ilaçların keşfedilmesini gerekli hale getirmektedir (Olliaro ve
Yuthavong, 1999; Chiyaka, 2009). Antimalarial ilaç geliştirilmesinde ki ilk adım parazitin
yaşam döneminde hayati rolleri bulunan enzim hedeflerinin belirlenmesini içermektedir
(Turgut, 1998). Bir glikolitik enzim olan laktat dehidrogenaz’ın (LDH) hedef enzim olarak
seçilmesi yeni bir antimalarial ilacın geliştirilmesinde alternatif bir yoldur. LDH parazit için
yaşamasal önemi olan bir enzimdir. Parazit, kırmızı kan hücrelerinin içinde LDH enzimini
kullanarak glikozu laktata çevirip enerji elde ederek yaşamını sürdürmektedir. Plasmodium
LDH’ını engelleyen fakat insan LDH’ı ile etkileşmeyen bir enzim inhibitörünün bulunması
parazitin yaşamını sonlandırabilecektir (Royer vd., 1986).
Plasmodium’ların LDH enzimi insan LDH’ı ile karşılaştırıldığı zaman, Plasmodium’ların
tamamının aktif bölge halkasında (serin-108 ve arjinin-109 arasında) aynı diziden oluşan bir
pentapeptid insersiyonunun olduğu görülmektedir (D108AK108BE108CW108DN108E) (Turgut-Balik
ve Holbrook, 2001). Bu 5 amino asit ilavesi enzimin aktif bölge halkasına yakın yüzeyinde bir
yarık oluşturmakta fakat insan LDH’da ise aynı bölgede hiçbir ilave amino asit olmadığı için
herhangi bir yarık bulunmamaktadır (Dunn vd., 1996). Aynı zamanda diğer Apicomplexan
LDH’larda aynı bölgede 5 aminoasit insersiyonu bulunmaktadır. Bu yapıya dayandırılarak
yapılan moleküler modelleme çalışmaları gossipol türevi olan gossilik nitril-1,1´ diasetat’ın
(GNDA) malarial LDH’ın belirlenen bu açıklığında barındırılabileceğini fakat memeli
LDH’larında bu açıklık bulunmadığı için bu inhibitörün LDH’ın yapısına kabul
edilmeyeceğini göstermiştir (Sessions vd., 1997).
89
Plasmodial LDH’ların aktif bölgesindeki ilave 5 amino asidin enzim aktivitesi için ne kadar
önemli olduğu yapılan yönlendirilmiş mutasyon çalışmalarıyla da belirlenmiştir. Yalnızca
D108A ve D108AK108B delesyonu enzim aktivitesinin kaybolmadığını göstermiştir. Fakat ikiden
daha fazla delesyon yapılması enzim aktivitesinin kaybolmasına neden olmuştur. Bu sonuçlar
bu bölgenin enzim için ne kadar vazgeçilmez olduğunu kanıtlamaktadır (Turgut-Balık vd.,
2006).
Bu tez çalışmasında ilk olarak PvLDH proteininin C terminaline 6 adet histidin eklenerek,
proteini daha saf ve daha bol olarak elde etmek için optimizasyon çalışmaları yapılmıştır.
İkinci aşamada PvLDH’ın aktif bölge halkasında bulunan ve önceden yönlendirilmiş
mutagenezle her defasında bir amino asit çıkarma yolu ile kısaltılmış olan (Turgut-Balık vd.,
2006) mutanat LDH’lardan aktif protein üreten PvDLDH ve PvKLDH mutant proteinlerinin
C-terminaline his tag ekleme yolu ile proteinler saflaştırılmış ve kinetik analizleri yapılmıştır.
Son aşamada ise önceden yönlendirilmiş mutagenez ile Toxoplasma gondii I (PvLM3Tg1) ve
II LDH’ları (PvLM2Tg2), Eimeria acervulina LDH’ı (PvLM2Ea) ve Eimeria tenella
LDH’ına (PvLM3Et) benzetilmiş olan (Atmış, 2007) Plasmodium vivax LDH’ının aktif
bölgesinin amino terminal ucu mutanat LDH’larının yine C-terminaline his tag eklenmesi
yolu ile proteinler saflaştırılmış ve kinetik analizleri yapılmıştır. Elde edilen bütün sonuçlar
yabanıl tip PvLDH enziminin kinetik sonuçlarıyla kıyaslanarak aktif bölge halkasının
(DKEWN) ve aktif bölge halkasının amino terminal ucunun (FTKA-PGKS) geliştirilecek
olan pLDH inhibitörleri için önemi ortaya konulmuştur.
Bir enzimin aktif ve saf olarak elde edilmesi kinetik çalışmalarının merkezini oluşturmakta
olup saf ve aktif protein olmaksızın bu ileri çalışmaların yapılması mümkün değildir. Ni-NTA
agaroz ile saflaştırılması için LDH enziminin C- terminaline 6-HisTag eklenmesi, 6 histidin
ifade eden Pv15 primeri ile gerçekleştirilmiştir. Yabanıl tip PvLDH ve diğer bütün mutant
proteinler pKK223-3 vektörü ile birleştirilerek rekombinant olarak JM105 E.coli soylarında
üretilmiştir. Doğru klonlamanın yapıldığı ve 3’ ucuna 6 adet histidinin ilave edildiği dizi
analizi ile de ispatlanmıştır. 6-HisTag ekli enzimler, yapılmış olan çok yoğun çalışmalar ile
aktif ve saf olarak elde edilmiştir. Saflaştırmalar sonrası alınan aktivite sonuçları aktif enzim
varlığını desteklemiş ve UV-Visible spektrofotometre ile yapılan protein miktar tayinlerinde
elde edilen protein miktarı yaklaşık 6 mg/ml olmuştur.
Çeşitli yöntemlerle saflaştırılan ve değişik süreçlerde kullanılan proteinlerin saklama
koşulları, enzimin aktivitesi ve yapısının korunması açısından önem taşımaktadır. Bu yüzden
kinetik çalışmalarımızda kullandığımız LDH enziminin saflaştırmadan sonra aktivite kaybını
90
engellemek için uygun ve güvenilir yöntemlerle saklanması gerekmektedir. Enzimlerin
saklanmasında koruyucu madde olarak 5 mM EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid) ve 10
mM DTT (dithiothreitol) kullanılmıştır (Shoemark, 2000). Yapılan optimizasyon çalışmaları
sonucunda rekombinant enzimlerimiz için en iyi saklama koşullarının 5 mM EDTA ve 10
mM DTT içeren çözeltide – 20 oC ve sıvı azot ile muameleden sonra - 80 oC’de olduğu
bulunmuş ve uzun süreli saklamada- 80 oC tercih edilerek uygulanmıştır.
Bu tez çalışmasının ilk bölümünde PvLDH’ın aktif bölge halkasındaki ilave 5 aminoasidin
delesyonu yapılarak elde edilen PvDLDH ve PvKLDH mutant LDH enzimleri C terminalinde
6 histidin taşıyacak şekilde rekombinant olarak üretilip kinetik analizleri gerçekleştirilmiştir.
Çizelge 4.1’de görüldüğü gibi Km pürivat değeri 38 µM’dan D amino asitinin katalitik
halkadan uzaklaştırılması ile beraber 88 µM’a yükselmiştir. Yine kcat değeri de 3.17 s-1’den
2.75 s-1’e düşmüştür. Beş amino asitin ilavesi ile oluşmuş olan ve enzim yüzeyinde bir yarık
oluşturan aktif bölge halkası (Dunn vd., 1996) D amino asitinin proteinden uzaklaştırılması ile
beraber Km değeri yaklaşık iki kat yükselmiştir ki bu durum bağlanmanın zayıfladığını ve
bağlanma bölgesinin yabanıl tip enzimde (PvLDH) olduğu gibi iyi bağlanamadığını gösterir.
Enzimin kataliz mekanizması olumsuz etkilenmiş ve katalitik halka olması gerektiği gibi
kapanamadığı için Km değeri yükselmiş ve zayıf bir bağlanma gerçekleşmiştir. Katalitik
halkanın iyi kapanmadığının bir diğer göstergesi de PvDLDH’ın kcat değerinin PvLDH’ın aynı
değerine göre % 13 düşüş göstermesidir. Hem Km hem de kcat değerlerinin etkilenmiş olması
hem bağlanma hem de katalizin ikisininde etkilendiğini göstermektedir. Aktif bölgedeki beş
ilave amino asitin bir amino asit daha kısalması bu yorumların doğrulanmasında önemli bir
kriter olmuştur.
Çizelge 4.1 Plasmodium vivax’ın LDH Geninin Aktif Bölge halkasının kısaltılmasının
toplu sonuçları
PvLDH
PvD
PvK
Km (mM)
kcat (s-1)
0.0378
0.0881
0.0937
3.17
2.75
1.82
Aktif bölge halkasından ilk iki amino asitin kısaltıldığı mutant protein olan PvKLDH
mutagenezinin sonuçlarını gösteren Çizelge 4.1 incelendiği zaman PvKLDH’ın Km pürivat
değeri, PvLDH’ın aynı değerine göre iki kattan daha fazla yükselmiş ve ve yine kcat pürivat
değeri çok çarpıcı bir şekilde % 42’lik bir düşüş göstererek 1.823 s-1 olmuştur. Bu durum
tamamen PvDLDH’ın analizi sonucunda elde edilen sonuçları desteklemektedir. Kısalma ile
91
beraber Km pürivat değerinin bir önceki mutant proteine göre daha yüksek olması enzimin
substratına daha zayıf bağlandığını ve daha düşük kcat ise enzimin bu kısalma ile beraber daha
zayıf katalizlediğini göstermektedir. kcat ‚in düşük olması gittikçe proteinin azaldığını ve ve
bunun doğal bir sonucu olarak NADH’ı NAD+’ya kataliz edemediğini gösterebilir. Bunun
anlamı aktif bölgenin pürivata ulaşma kapasitesinin azaldığı ve ancak pürivata bağlanmasına
rağmen turn over kapasitesinin düşük olduğu anlamında olabilir. Ancak enzimin hala daha
aktif oluşu β saç tokasının iki amino asit kısaltılmasına rağmen substrat bağlanma kavitesinin
tam olarak rahatsız edilmediğini gösterir. Yüksek Km ve düşük kcat değerlerinin açıklamasını
bu şekilde yapmak mümkündür. İki kısalma biribiribiri ile kıyaslandığı zaman da PvKLDH’ın
Km pürivat değeri PvDLDH’a göre % 6 artış göstermiş ve PvKLDH’ın kcat pürivat değeri
PvDLDH’a göre % 34 düşüş göstermiştir (Çizelge 4.1). Bu sonuç kısalmayı son derece
anlamlı hale getirmekte ve kademe kademe kısalma gerçekleştirildiği zaman ilave beş amino
asitten üçünün bir arada uzaklaştırılmış olduğu değişiklikten itibaren proteinin inaktif hale
geldiği görülmüştür.
Sonuçlar bu halkanın mevcut uzunluğunun katalizleme için gerekli olduğunu göstermektedir.
Kinetik çalışmaları X ışını kristalografisi çalışmaları ile birleştirildiği zaman (Dunn vd., 1996;
Chakuiad vd., 2005) kavitenin oluşumunda ve katalitik arjinin 109 aminoasidinin
pozisyonunda aynı zamanda W aminoasidinin önemli bir rolü olduğu düşünülmektedir. Bu
yüzden diğer LDH’lar için tipik halka uzunluğunu veren D’den N’ye kadar aminoasit
uzunluğunun çıkarıldığı PvN mutantı inaktif protein vermiştir (Turgut-Balık vd., 2006). Yapı
analizi ile beraber kinetik karakterizasyonun yapılması biribirini destekleyen çok önemli
çalışmalar olmuş ve elde edilen sonuçlar PfLDH ile yapılan çalışmaları (Dunn, vd., 1996;
Turgut-Balik vd., 2001) da desteklediği için bu bölgeyi hedefleyen ortak bir inhibitör tespit
edip enzimi inhibe etme yolundaki çalışmaları da desteklenmiştir.
Tez çalışmasının son bölümünde önceden yönlendirilmiş mutagenez ile Toxoplasma gondii I
(PvLM3Tg1) ve II LDH’ları (PvLM2Tg2), Eimeria acervulina LDH’ı (PvLM2Ea) ve
Eimeria tenella LDH’ına (PvLM3Et) benzetilmiş olan (Atmış, 2007) Plasmodium vivax
LDH’ının aktif bölgesinin amino terminal ucu mutanat LDH’larının yine C-terminaline his
tag eklenmesi yolu ile proteinler saflaştırılmış ve kinetik analizleri yapılmış ve yabanıl tip
PvLDH enziminin kinetik sonuçlarıyla kıyaslanarak apikompleksanlar arasında bu bölgede
sahip olunan az sayıdaki amino asit değişimlerinin önemleri tespit edilmiştir. Bu
çalışmaların tamamında üretilen proteinler aktif protein ile sonuçlanmıştır.
92
Çizelge 4.2 Plasmodium vivax’ın LDH geninin aktif bölgesinin amino terminal uç bölgesi
ve aktif bölge halkasındaki yönlendirilmiş mutagenez toplu sonuçları
Km (mM)
kcat (s-1)
PvLDH
0.0378
3.17
PvLM3Tg1
0.1294
3.06
PvLM2Tg2
0.0811
2.98
PvLM3Et
0.1665
3.815
PvLM2Ea
0.1865
4.064
Bu bölümün ilk grup mutagenezi enzimin aktif bölgesinin penta peptid insersiyonuna
dokunmaksızın sadece aktif bölgenin amino terminal ucunda bulunan amino asitlerin
mutagenez yolu ile değiştirilerek diğer Apicomplexan’ların aynı bölgesine benzetilmesini ve
analizini kapsamaktadır.
PvLM3Tg1, PvLDH’ın aktif bölge halkasındaki 5 amino asit ilavesinden önceki bölgede F100,
A103, S108 amino asitleri sırasıyla L100, V103, P108 ile değiştirilerek Toxoplasma gondii LDH1’e benzetilmesiyle elde edilmiş olduğu mutanttır. Çizelge 4.2’de görüleceği gibi bu
değişiklik yapılıp ilgili bölgeye benzetilmesi ile beraber PvLM3Tg1 Km pürivat değeri 38
µM’dan 129 µM artmıştır. kcat pürivat değeri ise değişmeden kalmıştır. Km pürivat
değerindeki %242 oranındaki bu çarpıcı artış enzimin kataliz görevini yaptığı halde
substratına olan ilgisini yüksek bir oranda kaybettiğini göstermektedir. Bu yönü ile önem
arzeden bir mutasyondur. Yapılan üç amino asitten hangisi veya hangilerinin bu değişikliğe
sebep olduğunun araştırılması bu bölge için önemli olabilecek bir rezidünün tespitini açığa
çıkaracaktır.
PvLM2Tg2 mutasyonu ile PvLDH’ın aktif bölge halkasındaki 5 aminoasit ilavesinden önceki
bölgede F100 ve A103 aminoasitleri sırasıyla L100 ve V103 ile değiştirilerek Toxoplasma gondii
LDH-2’ye benzetilmesiyle oluşturulmuş mutanttır. Çizelge 4.2’de görüleceği gibi PvLM2Tg2
proteininin Km pürivat değeri PvLDH’ın aynı değerine göre yaklaşık iki kat artmıştır. Ancak
kcat pürivat değeri belirgin bir değişiklik göstermemiştir.
PvLM2Ea, PvLDH’ın aktif bölge halkasındaki 5 aminoasit ilavesinden önceki bölgede F100,
A103 aminoasitleri sırasıyla I100 ve I103 ile değiştirilerek Eimeria acervulina LDH’ına
benzetilerek elde edilen mutanttır. Bu çalışmada önceki iki mutasyonun sonucuna benzer
93
sonuçlar elde edilmiş ve Km pürivat değerinde PvLDH’a göre % 393 oranında bir artış
göstermiştir. kcat pürivat değerinde yine belirgin bir farklılık gözlemlenmemiştir. Bu mutant
protein de aktif bölgenin amino terminal ucunun pürivatın bağlanması açısından
tanımlanmasının önemini göstermektedir.
Bu grubun son mutasyonu olan PvLM3Et mutagenezi, PvLDH’ın aktif bölge halkasındaki 5
aminoasit ilavesinden önceki bölgede F100, P105 aminoasitleri sırasıyla I100 ve A105 ile
değiştirilerek Eimeria tenella LDH’ına benzetilmiş halidir. Görüleceği gibi aynı bölgenin
TgLDH’ına benzetilmesinde (PvLM2Tg2) olduğu gibi Km pürivat değerinde artış ile
sonuçlanmıştır. Ancak artış daha fazla gerçekleşmiş olup, oran %340’dır. kcat pürivat değeri
ise yine TgLDH’da olduğu gibi çok belirgin bir değişiklik göstermemiştir. Bu durum da hem
TgLDH hem de Eimeria tenella LDH larının aktif bölge halkasının amino terminalindeki bu
değişikliklerin enzimin substratı ile olan ilgisini değiştirmesi konusu ileri bir çalışma olarak
gerçekleştirilebilir
Bu grup mutagenez çalışmalarının sonucu olarak; Çizelge 4.2’de de görüleceği gibi PvLDH’a
göre mutant enzimlerin Km pürivat değerlerinde önemli bir artış gözlemlenmiş ve bu bölgede
yapılan değişikliklerin enzimin substratına olan ilgisini belirgin bir şekilde düşürmesine neden
olmuştur. kcat pürivat değerinin bu grupta analizi yapılan bütün proteinlerde hemen hemen
aynı kalması, enzimin kataliz görevini yürütmesine rağmen yapılan değişiklikler ile
substratına ilgisini azalttığını gösterebilir. Bu bulgu yapılacak ileriki çalışmalar ile sözkonusu
bölgede mutagenezler tek tek yapılarak test edilmelidir.
Sonuç olarak, PvLDH enziminin aktif bölge halkasındaki birinci amino asidin silinmesi (D),
enzimin substrata olan ilgisini azaltmış ve katalitik mekanizmasını olumsuz yönde
etkilemiştir. Ilk iki amino asidin (D ve K) silinmesi ise bu olumsuz etkileri daha da artırmıştır.
Bu sonuçlar 5 amino asitlik ilave bölgenin enzimin aktivitesi açısından önemli olduğunu ve
burayı hedef alan bir inhibitörün enzimin çalışmasını engelleyebileceği sonucunu ortaya
koymaktadır. Yine proteinin aktif bölgesinin amino terminalinde yapılan mutagenezler
sonunda enzimin substratına olan ilgisini azalttığının gösterilmesi önemli bir bulgudur. Ayrıca
bu bulgular, sıtma parazitlerinin LDH’ı üzerinde yapmış olduğumuz çalışmaların benzerinin,
diğer Apicomplexan’lar için de uygulanabileceği görüşünü oluşturmuş ve yeni çalışmalara yol
açmıştır.
94
KAYNAKLAR
Abdi, Y.A., Gustafsson, L. L., Ericsson, O. ve Hellgren, U., (1995), Handbook of Drugs for
Tropical Parasitic Infections, Taylor & Francis, U.K.
Akdur, R., (1997), Sıtma Eğitim Notları, Sağlık Bakanlığı Sağlık Projesi Genel
Koordinatörlüğü, Ankara.
Atmış, B., (2007), Plasmodium vivax’ın LDH Enziminin Aktif Bölge Halkasının Amino
Terminal Ucunun Analizi, Yüksek lisans Tezi, Fırat Üniversitesi, Elazığ.
Aslan, A., (2006), “Plasmodium vivax’ın Laktat Dehidrogenaz Enzimini Kodlayan Genin
İfade Edilerek İlgili Proteinin Saflaştırılması ve Analizlerinin Yapılması”, Yüksek lisans
Tezi, Fırat Üniversitesi, Elazığ.
Baker, J.R. ve Muller, R., (1990), Advances in Parasitology, Academic Press Inc, England.
Basco, L.K., Marquet, F., Makler, M.M. ve Le Bras, J., (1995), “Plasmodium falciparum and
Plasmodium vivax: Lactate Dehydrogenase Activity and its Application for In Vitro Drug
Susceptibility Assay”, Exp. Parasitology, 80: 260-71.
Berwal, R., Gopalan, N., Chandel, K., Prasad, G.B.K.S. ve Prakash, S., (20089, “Plasmodium
falciparum: Enhanced Soluble Expression, Purification and Biochemical Characterization of
lactate
Dehydrogenase”,
Experimental
Parasitology,
120(2):
135-141.
Bloland P.B., (2001), Drug resistance in malaria, WHO.
Borst, P., Overdlve, J.P., Weijers, P.J., Fase-Fowler, F. ve Berg, M.V.D., (1984), “DNA
Circles with Cruciforms from Isospora (Toxoplasma) gondii”, Biochimica Biophysics Acta,
781: 100-111.
Bowman, S, vd., (1999), “The Complete Nucleotide Sequence of Chromosome 3 of
Plasmodium falciparum”, Nature, 400: 532-538.
Brown, W.M., Yowell, C.A., Hoard, A., Vander Jagt, T.A., Hunsaker, L.A., Deck, L.M.,
Royer, R.E., Piper, R.C., Dame, J.B., Makler, M.T. ve Vander Jagt, D.L., (2004),
“Comparative Structural Analysis and Kinetic Properties of Lactate Dehydrogenases from the
Four Species of Human Malarial Parasites”, Biochemistry, 43: 6219- 6229.
Bur, D., Clarke, T., Friesen J.D., Gold, M., Hart, K.W., Holbrook, J.J., Jones, J.B., Luyten,
M.A. ve Wilks, H.M., (1989), “On the Effect on Spesificity of Thr246→Gly Mutation in LLactate Dehydrogenase of Bacillus stearothermophilus”, Biochemical and Biopyhsical
Research Communications, 161 (1): 59-63.
Bzik D.J., Fox, B.A. ve Gonyer, K., (1993), “Expression of Plasmodium falciparum Lactate
Dehydrogenase in Escherichia coli”, Molecular and Biochemical Parasitology, 59:155-166.
Chatterjee, T.K., (2004), Chemotherapy of Tropical Parasitic Infections, Prentice-Hall of
India Pvt.Ltd, New Delhi.
Cameron, A., Read, J., Tranter, R., Winter, W.J., Sessions, R.B., Brady, R.L., Vivas, L.,
95
Easton, A., Kendrick, H., Croft, S.L., Barros, D., Lavandera, J.L., Martin, J.J., Risco, F.,
García-Ochoa, S., Gamo, F.J., Sanz, L., Leon, L., Ruiz, j.R., Gabarró, R., Mallo, A. ve Gómez
de Las Heras, F., (2004), “Identification and Activity of a Series of Azole-based Compounds
with Lactate dehydrogenase-directed Anti-malarial Activity”, The Journal of Biological
Chemistry, 279(30): 31429- 31439.
Carlton, J.M., Angiuoli, S.V., Suh, B.B., Kooij, T.W., Pertea, M., Silva, J.C., Ermolaeva,
M.D., Allen, J.E., Selengut, J.D., Koo, H.L, Peterson, J.D., Pop, M., Kosack, D.S., Shumway,
M.F., Bidwell, S.L., Shallom, S.J., Van, Aken, S.E., Riedmuller, S.B., Feldblyum, T.V., Cho,
J.K., Quackenbush, J., Sedegah, M., Shoaibi, A., Cummings, L.M., Florens, L., Yates, J.R.,
Raine, J.D., Sinden, R.E., Harris, M.A., Cunningham, D.A., Preiser, P.R., Bergman, L.W.,
Vaidya, A.B., Van, Lin, L.H., Janse, C.J., Waters, A.P., Smith, H.O., White, O.R., Salzberg,
S.L., Venter, J.C., Fraser, C.M., Hoffman, S.L., Gardner, M.J. ve Carucci, D.J., (2002),
”Genome Sequence and Comparative Analysis of the Model Rodent Malaria Parasite
Plasmodium yoelii yoellii”, 419 (6906): 512-519.
Carlton, J.M., Adams, J.H., Silva, J.C., Bidwell, S.L., Lorenzi, H., Caler, E., Crabtree, J.,
Angiuoli, S.V., Merino, E.F., Amedeo, P., Cheng, Q., Coulson, R.M.R., Crabb, B.S., del
Portillo, H.A., Essien, K., Feldblyum, T.V., Fernandez-Becerra, C., Gilson, P.R., Gueye,
A.H., Guo, X., Kang'a, S., Kooij, T.W.A., Korsinczky, M., Meyer, E.V.S., Nene, V., Paulsen,
I., White, O., Ralph, S.A., Ren, Q.H., Sargeant, T.J., Salzberg, S.L., Stoeckert, C.J., Sullivan,
S.A., Yamamoto, M.M., Hoffman, S.L., Wortman, J.R., Gardner, M.J., Galinski, M.R.,
Barnwell, J.W. ve Fraser-Liggett, C.M., (2008) “Comparative Genomics of the Neglected
Human Malaria Parasite Plasmodium vivax”, Nature, 455 (7214): 757-763.
Chaikuad, A., Fairweather, V., Conners, R., Josep- Horne, T., Turgut-Balik, D. ve Brady,
R.L., (2005), “Structure of Lactate Dehydrogenase from Plasmodium vivax: Complexes with
NADH and APADH”, Biochemistry.
Chiyaka, C., Garira, W. ve Dube, S., (2009), “Effects of Treatment and Drug Resistance on
the Transmission Dynamics of Malaria in Endemic Areas”, Theoretical Population Biology
75:14-29.
Clarke, A.R., Wigley, D.B., Chia, W.N., Barstow, D., Atkinson, T. ve Holbrook, J.J., (1986),
“Site-Directed Mutagenesis Reveals Role of Mobile Arginine Residue in Lactate
Dehydrogenase Catalysis”, Nature, 324, No. 18/25, 699-702.
Clarke, A.R., Wilks, H.M., Barstow, D.A., Atkinson, T., Chia, W.N. ve Holbrook, J.J.,
(1988), “An Investigation of the Contribution Made by the Carboxylate Group of an Active
Site Histidine-Aspartate Couple to Binding and Catalysis in Lactate Dehydrogenase”,
Biochemistry, 27: 1617-1622.
Cox-Singh, J., Davis, T.M.E., Lee, Kim-Sung, Shamsul, S.S.G., Matusop, A., Ratnam, S.,
Rahman, H.A., Conway, D.J. ve Singh, B., (2008), “Plasmodium knowlesi Malaria in
Humans is Widely Distributed and Potentially Life Threatening”, Clinical Infectious
Diseases, 46: 165–171.
Cortes, A., Emery, D.C., Halsall, D.J., Jackson, R.M., Clarke, A.R. ve Holbrook, J.J., (1992),
“Charge Balance in the α-Hydroxyacid Dehydrogenase Vacuole: An Acid Test”, Protein
Science, 1: 892-901.
96
Deng, H., Zheng, J., Clarke, A., Holbrook, J.J., Callender, R. ve Burgner II, J.W., (1994),
“Source of Catalysis in the Lactate Dehydrogenase System. Ground-State Interactions in the
Enzyme-Substrate Complex”, Biochemistry, 33: 2297-2305.
Dore, E., Frontali, C., Forte, T. ve Fratarcangeli, S., (1983), “Further Studies and Electron
Microscopic Characterization of Plasmodium berghei DNA”, Molecular and Biochemical
Parasitology, 8: 339-352.
Dunn, C.R., Banfield, M.J., Barker, J.J., Higham, C.W., Moreton, K.M., Turgut-Balik, D.,
Brady, R.L. ve Holbrook, J.J., (1996), “The Structure of Lactate Dehydrogenase from
Plasmodium falciparum Reveals a New Target for Anti-malarial Design”, Nature Structural
Biology, 3 (11): 912-915.
Fersht, A., (1985), Structures and Mechanisms of Selected Enzymes, W.H. Freeman and
Company, New York.
Fischer, R.S., Martin, G.C., Rao, P. ve Jansen, R.A., (1994), “Neisseria gonorrhoeae
Possesses Two Nicotinamide Adenine Dinucleotide-Independent Lactate Dehydrogenases”.
FEMS Microbiol Lett., 1;115(1): 39–44.
Gardner, M.J., Hall, N., Fung, E., White, O., Berriman, M., Hymani R.W., Carlton, J.M.,
Pain, A., Nelson, K.E., Bowman, S., Paulsen, I.T., James, K., Eisen, J.A., Rutherford, K.,
Salzberg, S.L., Craig, A., Kyes, S., Chan, M.S., Nene, V., Shallom, S.J., Suh, B., Peterson, J.,
Angiuoli, S., Pertea, M., Allen, J., Selengut, J., Haft, D., Mather, M.W., Vaidya, A.B., Martin,
D.M.A., Fairlamb, A.H., Fraunholz, M.J., Roos, D.S., Holbrook, J.J., Liljas, A., Steindel, S.J.
ve Rossmann, M.G., (1975), Lactate Dehydrogenase, The Enzymes 11, Academic Press,
Newyork.
Gardner, M.J., Tettelin, H., Carucci, D.J., Cummings, L.M., Aravind, L., Koonin, E.V.,
Shallom, S., Mason, T., Yu, K., Fujii, C., Pederson, J., Shen, K., Jing, J.P., Aston, C., Lai,
Z.W., Schwartz, D.C., Pertea, M., Salzberg, S., Zhou, L.X., Sutton, G.G., Clayton, R., White,
O., Smith, H.O., Fraser, C.M., Adams, M.D., Venter, J.C. ve Hoffman, S.L., (1998)
“Chromosome 2 Sequence of the Human Malaria Parasite Plasmodium falciparum”. Science,
282 (5391): 1126-1132.
Gardner, M.J., Hall, N., Fung, E., White, O., Berriman, M., Hyman, R.W., Carlton, J.M.,
Pain, A., Nelson, K.E., Bowman, S., Paulsen, I.T., James, K., Eisen, J.A., Rutherford. K.,
Salzberg. S.L., Craig, A., Kyes, S., Chan. M.S., Nene, V., Shallom, S.J., Suh, B., Peterson, J.,
Angiuoli, S., Pertea, M., Allen, J., Selengut, J., Haft, D., Mather, M.W., Vaidya, A.B., Martin,
D.M.A., Fairlamb, A.H., Fraunholz, M.J., Roos, D.S., Ralph, S.A., McFadden, G.I.,
Cummings, L.M., Subramanian, G.M., Mungall, C., Venter, J.C., Carucci, D.J., Hoffman,
S.L., Newbold, C., Davis, R.W., Fraser, C.M. ve Barrell, B., (2002), “Genome Sequence of
the Human Halaria Parasite Plasmodiu falciparum”, Nature , 419(6906): 498-511.
Garvie, E.I., (1980), “Bacterial lactate dehydrogenases”, Microbiol Rev., 44(1): 106–139.
Gomez, M.S., Piper, R.C., Hunsaker, L.A., Royer, R.E., Deck, L.M., Makler, M.T. ve Vander
Jagt, D.L., (1997), “Substrate and Cofactor Specificity and Selective İnhibition of Lactate
dehydrogenase from The Malarial Parasite P. falciparum”, Molecular and Biochemical
Parasitology, 90: 235-246.
97
Gomez, M.S., Piper, R.C., Hunsaker, L.A., Royer, R.E., Deck, L.M., Makler, M.T. ve Vander
Jagt, D.L., (1997), “Substrate and Cofactor Specificity and Selective İnhibition of Lactate
Dehydrogenase from The Malarial Parasite P. falciparum”, Molecular and Biochemical
Parasitology, 90: 235-246.
Grau, U.M., Trommer, W.E. ve Rossman, M.G., (1981), “Structure of the Active Ternary
Complex of Pig Heart Lactate Dehydrogenase with S-lac-NAD at 2,7 Resolution”, Journal of
Molecular Biology, 151: 289-307.
Greenwood, B. ve Mutabinga, T., (2002) “Malaria in 2002”, Nature, 415: 670-672.
Grimsley, G.R ve C. N. Pace, (2004), “Spectrophotometric Determination of Protein
Concentration”, Current Protocols in Protein Science, Chapter 3, Unit 3.1.
Hall, N., Pain, A., Berriman, M., Churcher, C., Harris, B., Harris, D., Mungall, K., Bowman,
S., Atkin, R., Baker, S. ve vd., (2002), “Sequence of Plasmodium falciparum Chromosomes
1, 3-9 and 13”, Nature, 419: 527-531.
Hart, K.W., Clarke, A.R., Wigley, D.B., Waldman, A.D.B., Chia, W.N., Barstow, D.A.,
Atkinson, T., Jones, J.B. ve Holbrook, J.J., (1987), “A Strong Carboxylate-Arginine
İnteraction is Important in Substrate Orientation and Recognition in Lactate Dehydrogenase”,
Biochimica et Biophysica Acta, 914: 294-298.
Holbrook, J.J. ve Stinson, R.A., (1973), “The Use of Ternary Complexes to Study Ionizations
and Isomerizations During Catalysis by Lactate Dehydrogenase”, Biochemical Journal, 131:
739-748.
Holbrook, J.J., Liljas, A., Steindel, S.J. ve Rossman, M.G., (1975), Lactate Dehydrogenase,
In: Boyer, D. P. (Ed.), The Enzymes, Vol. XI, Academic Press, New York, 292p.
Hyman, R.W., Fung, E., Conway, A., Kurdi, O., Mao, J., Miranda, M., Nakao, B., Rowley,
D., Tamaki, T., Wang, F. ve Davis, R.W., 2002, “Sequence of Plasmodium falciparum
Chromosome 12”, Nature, 419: 534-537.
Janson, J-C. ve Ryden, L., (1998), Protein Purifiactions: Principles, High-Resolution
Methods, and Applications, Wiley-VCH, Canada.
Katzung, B.G., (1995), Basic & Clinical Pharmacology, McGraw-Hill Professional, USA.
Kavanagh, K.L., Elling, R.A. ve Wilson, D.K., (2004), “Structure of Toxoplasma gondii
LDH1: Active-Site Differences from Human Lactate dehydrogenases and the Structural Basis
For Efficient APAD+ Use”, Biochemistry US, 43 (4): 879-889.
Kayser., F.H., (2005), Medical Microbiology, Thieme, Stuttgart-New York.
Keha, E.E. ve Küfrevioğlu, İ., (2004), Biyokimya, Aktif Yayın Evi, İstanbul
Kilejian, A., (1975), “Circular Mitochondrial DNA from the Avian Malarial Parasite
Plasmodium lophurae”. Biochimica Biophysics Acta, 390: 276-284.
Klenerman, P. ve Dickson, H., (1992), “Plasma Lactate Dehydrogenase Estimation in the
Diagnosis of Malaria”, Annals of Tropical Medicine and Parasitology, 86:563-565.
98
Knell, A.J., (1991), Malaria, Oxford University Press, Oxford.
Köhler, S., Delwiche, C.F., Denny, P.W., Tilney, L.G., Webster, P., Wilson, R.J.M., Palmer,
J.D. ve Roos, D.S., (1997), “A Plastid of Probable Green Algal Origin in Apicomplexan
Parasites”, Science, 275:1485-1488.
Laemmli, U.K., (1970), “Cleavage of Structural Proteins During the Assembly of the Head of
Bacteriophage T4”, Nature, 227, 5259: 680-685.
Lau, A.O.T., (2009), “An overview of the Babesia, Plasmodium and Theileria genomes: a
Comparative Perspective”, Molecular and Biochemical Parasitology. 164 (1): 1-8.
Leatherbarrow, R.J., (19929, (Grafit, Version 3.0.): Staines, UK: Erithracus Software Ltd
Makler, M.T. ve Hinrichs, D.J., (1993), “Measurement of the Lactate Dehydrogenase Activity
of Plasmodium falciparum as an Assessment of Parasitemia”, Journal of Tropical Medicine
and Hygiene, 48(2): 205–210.
Mascaretti, O,A., (2003), Bacteria Versus Antibacterial Agents: An Integrated Approach,
ASM Pres, USA.
McFadden, G.I., Reith, M., Munholland. J. ve Lang-Unnasch, (1996), “N: Plastid in Human
Parasites”, Nature, 381:482-483.
Mu, J., Awadalla P., JunhuI D., Mcgee K.M., Keebler J., Seydel K., Mcvean G.A.T. ve Su
Z., (2007), “Genome-Wide Variation and Identification of Vaccine Targets in the
Plasmodium falciparum Genome”, Nature Genetics, 39: 126-130.
Malaria Vaccine Technology Roadmap (MVTR), 2006, Global Strategy Aims For Effective
Malaria Vaccine By 2025, Global Vaccine Research Forum, Bankok.
Ohlson, I., Nordström, B. ve Brändén, C.I., (1974), “Structural and Functional Similarities
within The Coenzyme Binding Domains of Dehydrogenases”, J. Mol. Biol., 89: 339-354.
Olliaro, P.L. ve Yuthavong Y., (1999), “An Overview of Chemotherapeutic Targets for
Antimalarial Drug Discovery”, Pharmacol. Ther., 81(2): 91–110.
Özcel, M.A., (1999), Sıtma, Ege Üniversitesi Basımevi, İzmir.
Pain, A., Bohme, U., Berry, A.E., Mungall, K., Finn, R.D., Jackson, A.P., Mourier, T.,
Mistry, J., Pasini, E.M., Aslett, M.A., Balasubrammaniam, S., Borgwardt, K., Brooks, K.,
Carret, C., Carver, T.J., Cherevach, I., Chillingworth, T., Clark, T.G., Galinski, M.R., Hall,
N., Harper, D., Harris, D., Hauser, H., Ivens, A., Janssen, C.S., Keane, T., Larke, N., Lapp, S.,
Marti, M., Moule, S., Meyer, I.M., Ormond, D., Peters, N., Sanders, M., Sanders, S.,
Sargeant, T.J., Simmonds, M., Smith, F., Squares, R., Thurston, S., Tivey, A.R., Walker, D.,
White, B., Zuiderwijk, E., Churcher, C., Quail, M.A., Cowman, A.F., Turner, C.M.R.,
Rajandream, M.A., Kocken, C.H.M., Thomas, A.W., Newbold, C.I., Barrell, B.G. ve
Berriman, M., (2008), “The Genome of the Simian and Human Malaria Parasite Plasmodium
knowlesii”, Nature, 455 (7214): 799-U7.
99
Perkins, S.L. ve Austin, C., (2009), "Four New Species of Plasmodium from New Guinea
Lizards: Integrating Morphology and Molecules". J. Parasitology 95(2): 424-433.
Qiu vd., (2007), Biopyhsical Journal, 93: 1677- 1686.
Ralph, S.A., McFadden, G.I., Cummings, L.M., Subramanian, G.M., Mungall, C., Venter,
J.C., Carucci, D.J., Hoffman, S.L., Newbold, C., Davis, R. W., Fraser, C.M. ve Barrell, B.,
(2002), “Genome sequence of the human malaria parasite Plasmodium falciparum”, Nature,
419 (6906): 498-511.
Rao, S.T. ve Rossmann, M.G., (1973), “Comparision of Super-Secondary Structures in
Proteins”, J. Mol. Biol., 76: 241-256.
Roth, E.F. JR, Calvin, M.C., Max-Audit, I., Rosa, J. ve Rosa, R., (1988), “The Enzymes of
the Glycolytic Pathway in Erythrocytes Infected with Plasmodium falciparum Malaria
Parasites”, Blood 72, 6:1922-1925.
Royer, R.E., Deck, L.M., Campos, N.M., Hunsaker, L.A. ve Vander Jagt, D.L., (1986),
“Biologically Active Derivatives of Gossypol: Synthesis and Antimalarial Activities of PeriAcylated Gossylic Nitriles”, Journal of Medicinal Chemistry, 29: 1799-1801.
Sambrook, J. ve Russell, D.W., (2001), Molecular Cloning a Laboratory Manual I-II-III,
Third Edit., CSHL Press, New York.
Schaap, D., Arts, G., Kroze, J., Nıessen, R., Roosmalen-Vos, S.V., Spreeuwenberg, K.,
Kuiper, C.M., Beek-Verhoeven, N.V.D., Kok, J.J., Knegtel, R.M.A. ve Vermeulen, A.N.,
(2004), “An Eimeria Vaccine Candidate Appears to be Lactate Dehydrogenase;
Characterization and Comparative Analysis”, Parasitology, 128: 603-616
Scholar, E.M. ve Pratt W.B., (2000), The Antimicrobial Drugs, Oxford Uni. Pres, US.
Sessions, R.B., Dewar, V., Clarke, A.R. ve Holbrook J.J., (1997), “A Model Of Plasmodium
falciparum Lactate Dehydrogenase and Its Implications for the Design of Improved
Antimalarials and Enhanced Detection of Parasitaemia”, Protein Engineering, 10(4): 301-306.
Shoemark, D.K., (2000), “The Kinetic Characterization of the Lactate Dehydrogenase
Enzyme from Plasmodium Falciparum, Doctor of Philosophy Thesis, Department of
Biochemistry University of Bristol, UK, 57 ve 196p.
Shoemark, D.K., Cliff, M.J., Sessions, R.B.ve Clarke, A.R., (2007), “Enzymatic Properties of
the Lactate Dehydrogenase Enzyme from Plasmodium falciparum”, The FEBS Journals, 274:
2738-2748.
Taguchi, H. ve Ohta, T., (1991), “D-Lactate Dehydrogenase is a Member of the D-IsomerSpecific 2-Hydroxyacid Dehydrogenase Family. Cloning, Sequencing, and Expression In
Escherichia coli of the D-Lactate Dehydrogenase Gene of Lactobacillus plantarum”, J. Biol.
Chem., 5;266 (19) :12588-94.
Turgut, D., (1998), Over-Production of the Active Lactate Dehydrogenase from Plasmodium
falciparum Opens Route to Obtain New Antimalarials, Doctor of Philosophy Thesis,
University of Bristol, UK.
100
Turgut-Balik, D. ve Holbrook, J. J., (2001a), “Determination of the DNA and Amino Acid
Sequences of the Lactate Dehydrogenase Gene from Plasmodium falciparum Strains K1 and
PF FCBR: A Route to the Design of New Antimalarials”, Turkish Journal of Biology, 25:
241-250.
Turgut-Balik, D., Shoemark, D.K., Sessions, R.B., Moreton, K.M. ve Holbrook, J.J., (2001b),
“Mutagenic Exploration of the Active Site of Lactate Dehydrogenase from Plasmodium
falciparum”, Biotechnology Letters, 23, 923-927.
Turgut-Balık, D., Akbulut, E., Shoemark, D., Celik, V., Sessions, R., Moreton, K. ve Brady
R. L., (2004), “Molecular Cloning, Sequence Analysis and Expression of the Lactate
Dehydrogenase Gene from Human Malaria Parasite Plasmodium vivax”, Biotechnology
Letters, 26:1051-1055.
Turgut-Balık, D., Çelik, V., Moreton, K. ve Brady, R.L., (2005), “Overcoming Cloning
Problems by Staining Agarose Gels with Crystal Violet Instead of Ethidium Bromide in
Lactate Dehydrogenase Gene from Plasmadium vivax and Plasmodium falciparum”, Acta
Biologica Hungarica, 56 (3-4): 389-397.
Turgut-Balık, D., Sadak, D. ve Çelik, V., (2006), “ Analaysis of Active Site Loop Amino
Acids of Lactate Dehydrogenasae From Plasmodium vivax by Site-Directed Mutagenesis
Studies”, Drug Dev. Res., 67:175-180.
Unat, E.K., Yücel, A., Altaş, K. ve Samastı, M., (1995), Unat’ın Tıp Parazitolojisi - İnsanın
Ökaryonlu Parazitleri ve Bunlarla Oluşan Hastalıkları, İstanbul Üniversitesi Cerrahpaşa Tıp
Fakültesi Yayınları:15 , İstanbul.
Vaidya, A.B., Akella, R. ve Suplick, K., (1989), “Sequences Similarity to Genes for Two
Mitochondrial Proteins and Portions of Ribosomal RNA In Tandemly Arrayed 6 Kilobase
Pair DNA of Malarial Parasite”, Molecular and Biochemical Parasitology, 35(2): 97-107.
Vander-Jagt, D.L., Hunsaker, L.A. ve Heidrich, J.E., (1981), “Partial Purification and
Characterization of Lactate Dehydrogenase from Plasmodium falciparum”, Molecular and
Biochemical Parasitology, 4: 255-264.
Waller, R.F. ve McFadden, G.I., (2005), “The Apicoplast: A Review of the Derived Plastid of
Apicomplexan Parasites”, Current Issues in Molecular Biology , 7: 57-80.
Wigley, D.B., Gamblin, S.J., Turkenburg, J.P., Dodson, E.J., Piontek, K., Muirhead ve H.,
Holbrook, J.J., (1992), “Structure of a Ternary Complex of an Allosteric Lactate
Dehydrogenase from Bacillus stearothemophilus at 2,5 A° Resolution”, Journal of Molecular
Biology, 223: 317-335.
Winter, V.J., Cameron, A., Tranter,R., Sessions, R.B. ve Brady, R.L., (2003), “Crystal
Structure of Plasmodium berghei Lactate Dehydrogenase İndicates The Unique Structural
Differences of These Enzymes Are Shared Across The Plasmodium Genus”, Molecular and
Biochemical Parasitology, 131(1): 1-10.
Winzeler, E.A., (2008), “Malaria Research in the post-Genomic Era”, Nature 455: 751-756.
101
Woenckhaus, V.C., Berghauser, J. ve Pfleiderer, G., (1969), “Markierung Essentieller
Aminosäurereste der Lactat-Dehydrogenase aus Schweineherz mit (Carbonyl-14C)3-(2Brom-acetyl)-pyridin”, Hoppe Seylers Z Physiol Chem., 350(4): 473–483.
Wongsrichanalai, C., Pickard, A.L., Wernsdorfer, W.H. ve Meshnick, S.R., (2002),
“Epidemiology of Drug-Resistant Malaria”, Lancet Infect Dis., 2: 209-18.
World helath Organization (WHO)., (2008a), World Malaria Report 2008, WHO Pres,
Switzerland.
World helath Organization (WHO)., (2008b), The Global Burden of Disease: 2004Update ,
WHO Pres, Switzerland.
Yotoko, K.S.C. ve Elisei, C., (2006), "Malaria Parasites (Apicomplexa, Haematozoea) and
Their Relationships with Their Hosts: Is There an Evolutionary Cost for the Specialization?”,
J. Zoo. Syst. Evol. Res., 44(4): 265.
Yang, S. ve Parmley, S.F., (1997), “Toxoplasma Gondii Expresses Two Distinct Lactate
Dehydrogenase Homologous Genes During Its Life Cycle In Intermediate Hosts”, Gene, 184:
1-12.
Zahler, W.L. ve Cleland, W.W., (1964), “Dithiothreitol, a New Protective Reagent for SH
Groups”, Biochemistry, 3: 480-482.
Zarifah R., (2005), Portfolio of Candidate Malaria Vaccines Currently in Development, WHO
Documents.
Zhu, G. ve Keithly, J.S., (2002), “ -Proteobacterial Relationships of Apicomplexan Lactate
and Malate Dehydrogenases”, J. Eukaryot. Microbiol., 49: 255-261.
İNTERNET KAYNAKLARI
[1] www.saglik.gov.tr
[2] www.malariasite.com
[3] www.wikipedia.com
[4] www.ncbi.nlm.nih.gov
102
ÖZGEÇMİŞ
Doğum tarihi
01.07.1982
Doğum yeri
Tolbuhin/Bulgaristan
Lise
1997-2001
Süleyman Nazif Lisesi/Avcılar
Lisans
2002-2007
Abant İzzet Baysal Üni. Fen-Ed. Fakültesi
Biyoloji (İng.) Bölümü
Yüksek Lisans
2007-2009
Yıldız Teknik Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü
Biyomühendislik Anabilim Dalı
Çalıştığı kurumlar
2009- Devam ediyor
Marmara Üniversitesi Biyoloji Bölümü
Araştırma Görevlisi
103