DOMUZ YETĠġTĠRME ÇĠFTLĠĞĠNĠN ÇEVRESĠNDE

advertisement
T.C.
GAZĠ ÜNĠVERSĠTESĠ
SAĞLIK BĠLĠMLERĠ ENSTĠTÜSÜ
MĠKROBĠYOLOJĠ ANA BĠLĠM DALI
DOMUZ YETĠġTĠRME ÇĠFTLĠĞĠNĠN ÇEVRESĠNDE BULUNAN
TOPRAK ÖRNEKLERĠNDEN ĠZOLE EDĠLEN ANTĠBĠYOTĠK
DĠRENÇLĠ BAKTERĠLERĠN FENOTĠPĠK VE GENOTĠPĠK
ÖZELLĠKLERĠ
DOKTORA TEZĠ
MELĠKE EKĠZOĞLU
Tez DanıĢmanı
Prof.Dr. Nedim Sultan
ANKARA
Temmuz 2007
i
ĠÇĠNDEKĠLER
Kabul ve Onay
i
Ġçindekiler
ii
Resimler
v
ġekiller
vi
Tablolar
vii
Grafikler
viii
Semboller, Kısaltmalar
ix
1. GĠRĠġ
1
2. GENEL BĠLGĠLER
4
2.1.Antibiyotik Direnci ve Önemi
4
2.2.Hayvancılıkta Antibiyotik Kullanımı ve Direnç GeliĢimine 6
Olan Etkisi
2.3.Antibiyotik Kullanımını Sınırlamaya Yönelik Politikalar ve 12
Uygulamalar
2.3.1.Ülkemizdeki Durum
12
2.3.2.Avrupa Birliğine Üye Ülkelerdeki Durum
13
2.3.3.Amerika BirleĢik Devletleri‟ndeki Durum
13
2.4.Antibiyotik Direncinin Transferi
14
2.4.1.Horizontal Gen Transfer Mekanizmaları
14
2.4.1.1.Transformasyon
15
2.4.1.2.Transdüksiyon
16
2.4.1.3.Konjugasyon
17
2.4.2.Yer DeğiĢtirebilen Genetik Elementler
18
2.4.2.1.Plazmidler
20
2.4.2.2.Transpozonlar (Tn)
20
2.4.2.3.Ġntegronlar
22
2.5.Direnç Mekanizmaları
23
2.6.Tez ÇalıĢmasında Kullanılan Antibiyotikler Hakkında 25
ii
Genel Bilgiler
2.6.1.Tetrasiklinler
27
2.6.2.Eritromisin
27
2.7. Çevresel Ġzolatlarda Antimikrobik Direncin Ölçülmesi
28
3. GEREÇ ve YÖNTEM
30
3.1.Toprak Örneklerinin Toplanması
30
3.2.Tezde Kullanılan Antibiyotikler
32
3.3.Bakterilerin Topraktan Ġzolasyonu
32
3.4.Bakterilerin Antibiyotik Direnç Fenotiplerinin Belirlenmesi 35
3.4.1.Agar Dilüsyon Yöntemi ile Antibiyotik Duyarlılık Tayini
35
3.4.2.E-Test Yöntemi ile Antibiyotik Duyarlılık Tayini
36
3.5.Genomik DNA‟nın Ġzolasyonu
36
3.6.Bakterilerin Tanımlanması
38
3.6.1.Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PZR) ile 16S rRNA 38
Geninin Amplifikasyonu
3.6.2.Dizi Analizi ÇalıĢmaları
41
3.6.3.BLAST Programı
41
3.7.Antibiyotik
Direnç
Determinantlarının
Genotipik 42
3.7.1.Tetrasiklin Direnç Genlerinin Saptanması
42
3.7.2.Eritromisin Direnç Genlerinin Saptanması
45
Özellikleri
4. BULGULAR
4.1.Bakterilerin Topraktan Ġzolasyonu
47
47
4.2.Bakterilerin Antibiyotik Direnç Fenotiplerinin Belirlenmesi 49
4.3.Genomik DNA‟nın Ġzolasyonu
53
4.4.Bakterilerin Tanımlanması
54
4.4.1.Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PZR) ile 16S rRNA
54
Geninin Amplifikasyonu
4.4.2.Dizi Analizi ÇalıĢmaları
55
4.4.3.BLAST Programı
55
4.5.Antibiyotik Direnç Determinantlarının Genotipik
58
iii
Özellikleri
4.5.1.Tetrasiklin Direnç Genlerinin Saptanması
58
4.5.2.Eritromisin Direnç Genlerinin Saptanması
59
5.TARTIġMA
61
6.SONUÇ
71
7.ÖZET
73
8.SUMMARY
75
9.KAYNAKLAR
77
10.EKLER
90
11.TEġEKKÜR
94
12.ÖZGEÇMĠġ
95
iv
RESĠMLER
Resim
Sayfa no.
1: E-test yöntemiyle antibiyotik duyarlılığı ölçülmüĢ iki bakteri
49
2: Genomik DNA‟nın agaroz jel elektroforezinde görülen bantları
54
3: 16S rRNA geninin V3 fragmanının PZR ile amplifikasyonu
55
4: Ġki farklı izolatta tet(Q) gen bölgelerinin agaroz jel elektroforezi
58
görüntüleri
v
ġEKĠLLER
ġekil
Sayfa no.
1: Seçici baskı altında mikropların antimikromikrobiyal
8
maddelere direnç geliĢtirmesinin ve bu direncin yayılımının
Ģematik olarak gösterilmesi.
2: Antimikrobik direncin çevrede yayılımı
12
3: Direnç genlerinin aktarım mekanizmaları:
15
A: Transdüksiyon B: Konjugasyon C: Transformasyon
4: Bakteri hücreleri arasında DNA transferi
19
5: Bakteriyel kompozit transpozonların yapısı
21
6: Ġnsersiyon sekanslarının yapısı
21
7: Doğada konjugatif transpozonlar yoluyla aktarılan genler
22
ve geniĢ konak hücre spektrumları
8: Kare biçimindeki tarladan örneklerin toplandığı noktalar
31
9: Dirençli bakterilerin topraktan izolasyonu aĢamaları
34
10:Bakterilerin tanımlanması deneyleri akıĢ Ģeması
42
vi
TABLOLAR
Tablo
Sayfa no.
1: Antibiyotik kullanımında kilometre taĢları
5
2: Antibiyotikler ve kullanıldıkları alanlar
11
3: Tetrasiklin (tet) ve oksitetrasiklin direnç (otr) genleri ve ilgili
27
oldukları direnç mekanizmaları
4: Toprak örneklerinin alındığı günler
31
5: tet genlerinin PZR ile amplifikasyonu için kullanılan primerler ve
44
özellikleri
6: erm genlerinin PZR ile amplifikasyonu için kullanılan primerler ve
46
özellikleri
7: Toprak ve gübre örneklerinden izole edilen antibiyotik dirençli
48
bakterilerin elde edildikleri bölge ve zaman bakımından dağılımı
8: Topraktan ve gübreden izole edilen bakterilerin filogenetik
57
özellikleri
9: Tetrasiklin direnç genlerinin bakteri suĢlarına ve örneklerin alınma
60
zamanına göre dağılımı
10: Tanımlanan tüm izolatların antibiyotik duyarlılıkları ve filogenetik
89
özellikleri
vii
GRAFĠKLER
Grafik
Sayfa no.
1: Topraktan izole edilen bakterilerin antibiyotik direnç profilleri
50
2: Gübreden izole edilen bakterilerin antibiyotik direnç profilleri
51
viii
SEMBOLLER, KISALTMALAR
BLAST
Basic local alignment search tool
Bp:
Baz çifti
CLSI
Clinical and laboratory standards institute
DNA:
Deoksiribonükleik asit
DNBA
Dilüe nutrient broth agar
dNTP:
Deoksiribonükleotittrifosfat
ddNTP:
Dideoksiribonükleotittrifosfat
EDTA:
Etilendiamin tetra asetik asit
FDA:
Food and drug administration
GPS:
Global positioning system
Ha:
Hektar
Kb:
Kilobaz
LC-MS
Liquid chromatography-mass spectroscopy
MĠK:
Minimum inhibisyon konsantrasyonu
NCCLS:
National committee for clinical laboratory standards
PZR:
Polimeraz zincir reaksiyonu
rRNA
Ribozomal ribonükleik asit
TAE:
Trisasetat EDTA
TBE:
Trisborat EDTA
Tris:
Trihidroksietanolamin
VRE:
Vankomisin dirençli enterokok
ix
1. GĠRĠġ
Antibiyotiklerin keĢfinin ardından enfeksiyon hastalıklarının tedavisinde
yeni bir dönemin baĢladığı ve bulaĢıcı hastalıklar çağının sona erdiği
düĢünülmüĢ olsa da piyasaya sürüldükten sadece 4 yıl sonra penisilin
dirençli enfeksiyonlar klinikte önem kazanmaya baĢlamıĢtır. Günümüzde
pek çok bakteri, birden fazla antibiyotiğe dirençli olabilmekte ve tedavi
edilemeyen enfeksiyonlara yol açabilmektedir.
Antibiyotik direnci antibiyotik kullanımının doğal sonucudur. Bu nedenle
antibiyotikler sadece gerektiği durumlarda, uygun konsantrasyonda ve
sürede kullanılmalıdırlar1.
Antibiyotiklerin yaygın olarak kullanıldığı alanlardan biri de hayvancılık
sektörüdür. Antibiyotikler hayvancılıkta tedavi, profilaksi ve büyümeyi
hızlandırma amacıyla kullanılmaktadır1,2,3. Dünyada üretilen antibiyotiklerin
yaklaĢık
olarak
edilmektedir.
yarısının
ABD‟de
besi
üretilen
hayvanlarında
antibiyotiklerin
kullanıldığı
ise
%70‟inin
tahmin
besi
4
hayvanlarında ve tavuklarda kullanıldığı bildirilmektedir .
Bu yaygın kullanım ile insanlarda görülen antibiyotiğe dirençli
enfeksiyonların artıĢı arasında bir bağ olduğu öne sürülmektedir1-7.
Direncin, antibiyotiğe maruz kalan hayvanlardan elde edilen gıdaların
iĢlenmesi ve tüketilmesi ile ve toprak ve yeraltı suları gibi çevresel ortamlar
aracılığıyla insanlara geçtiği belirtilmektedir7. Tavukçulukta florokinolonlar
kullanılmaya baĢlandıktan sonra Hollanda, Ġngiltere ve ABD‟de tavuk,
tavuk eti ve insanlardan izole edilen florokinolon dirençli Campylobacter
jejuni suĢlarının sayısında belirgin bir artıĢ görülmüĢtür8,9.
1
Hayvancılıkta kullanılan antimikrobik maddelerin dirençli non-tifoidal
Salmonella serotiplerinin seçimine neden olduğu birçok araĢtırmacı
tarafından bildirilmiĢtir10,11. Florokinolonların hayvanlarda kullanılmaya
baĢlanmasının ardından insanlardan bu ilaçlara düĢük duyarlılığa sahip
Salmonella serotipleri izole edilmeye baĢlanmıĢtır12. Bunun yanında
vankomisin dirençli enterokokların (VRE) sayısındaki artıĢ, vankomisinin
tarımda kullanılmasının sorgulanmasına neden olmaktadır. VRE suĢları
hayvanlar, hayvansal gıdalar ve daha önce vankomisin tedavisi almamıĢ
olan gönüllü insanlardan izole edilmiĢtir13.
Terapötik dozun altındaki konsantrasyonlarda antibiyotik kullanımının
direncin seçimine ve yayılımına olan etkisini aydınlatmak üzere pek çok
çalıĢma yapılmaktadır14.
Gübre içinde bulunan patojen ve/veya kommensal bakterilerin taĢıdığı
direnç genlerinin ve bunların yanı sıra serbest halde bulunan direnç
genlerinin toprak ve yeraltı suları gibi çevresel ortamlarda bakteriler
arasında aktarımı halen araĢtırılan önemli bir diğer konudur15,16.
Bu çalıĢmada yaygın antibiyotik kullanımının toprak ve gübrede
bulunan bakterilerin fenotipik direnç paternlerine etkisi ve dirençten
sorumlu genetik elemanların belirlenmesi amaçlanmıĢtır. Bu amaçla bir
domuz yetiĢtirme çiftliği çevresinde bulunan tarlaya hayvan dıĢkısının
uygulanmasının toprakta bulunan bakterilerin fenotipik ve genotipik
dirençlerine olan etkisi araĢtırılmıĢtır. Topraktan izole edilen eritromisin ve
tetrasiklin dirençli bakterilerin MĠK (minimum inhibitor konsantrasyon)
değerleri belirlenmiĢ, 16S rRNA geninin V3 bölgesi (Escherichia coli‟ de
341-534 nükleotidler arası) polimeraz zincir reaksiyonu (PZR) yöntemi ile
amplifiye edilerek cins ve hatta tür düzeyinde tayin yapılmıĢtır. Genotipik
direncin belirlenebilmesi için tetrasiklin efluks direnç mekanizmasından
[tet(C), tet(H), tet(Z)] ve ribozomal korunma mekanizmasından sorumlu
2
genlerin [tet(M), tet(O), tet(Q), tet(W)] ve eritromisin direncinden sorumlu
rRNA metilaz genlerinin [erm(A), erm(B), erm(C), erm(F), erm(G), erm(Q)]
varlığı araĢtırılmıĢtır.
Elde edilecek sonuçların antibiyotik direnci ile çevresel ortam
arasındaki iliĢkinin açıklanması bakımından tarımsal endüstride son
derece önemli olacağı, konu hakkında daha fazla bilgi edinilmesinin kanun
koyucular
ve
üreticilere
tarımsal
endüstride
antibiyotiklerin
bilinçli
kullanılması konusunda rehberlik edecegi açıktır. Ayrıca elde edilecek
bilgilerin klinikte karĢılaĢılan direnç mekanizmalarına ıĢık tutabileceği
düĢünülmektedir.
3
2. GENEL BĠLGĠLER
2. 1. Antibiyotik Direnci ve Önemi
Antibiyotikler,
belli
mikroorganizmalar
tarafından
üretilen,
diğer
mikroorganizmaları öldüren veya üremesini durduran doğal bileĢenlerdir.
Antibiyotiklerin doğal yapısında oluĢturulan değiĢikliklerle yarı-sentetik ve
tam-sentetik türevleri geliĢtirilmektedir ve bunlar kemoterapötik maddeler
olarak adlandırılmaktadırlar17.
Antibiyotik direnci, daha önce duyarlı olduğu bilinen bir bakterinin aynı
dozda ve aynı süre boyunca uygulandığı halde bu antibiyotikten
etkilenmemesidir17.
1940‟lı
yıllarda
klinikte
kullanılmaya
baĢlanmasının
ardından
antibiyotikler tedavide yeni bir çığır açmıĢ ve enfeksiyon hastalıklarının
tedavisinde baĢarıyla kullanılmıĢtır. Ancak klinik kullanıma girmelerinden
kısa bir süre sonra dirençli bakterilerin ortaya çıkmasıyla tedavide tekrar
sorunlar yaĢanmaya baĢlanmıĢtır. Günümüzde antibiyotik direnci tüm
dünyada yaygın olarak görülen ve hastalıkların tedavisinde karĢılaĢılan
çok ciddi bir sorun olarak karĢımıza çıkmaktadır. Antibiyotik kullanımıyla
ilgili önemli tarihler ve olaylar Tablo 1’de gösterilmiĢtir18.
Dirençli bakteriler tedavisi çok daha zor olan, daha pahalı ve toksik
antibiyotiklerin kullanımını gerektiren enfeksiyonlara neden olmaktadırlar.
Bazı vakalarda dirençli bakteri suĢları mevcut tüm antibiyotiklere karĢı
dirençli
olabilmektedir.
Bu
enfeksiyonları
durdurmak
için
güvenilir
antibiyotikler olmazsa enfeksiyonlar hastanelere ve topluma yayılacak ve
4
kontrolü çok zor olan epidemilere neden olacaktır. Afrika‟da görülen
dizanteri, Güney Amerika‟daki kolera ve Amerika BirleĢik Devletleri‟ndeki
(ABD) enterokok salgınları dirençli bakterilerin neden olduğu bu tip
salgınlara örnek olarak gösterilebilir1.
Tablo 1: Antibiyotik kullanımında kilometre taĢları
18
Önemli geliĢmeler
Sülfonamitler
sığırlarda
mastitis
tedavisinde
kullanılmaya
baĢlandı.
Penisilin klinik
olarak bulunur
hale geldi
Klortetrasiklin
ilk defa
yemlerde
büyümeyi
artırıcı olarak
kullanıldı
Ġnsanlarda
penisilin
dirençli
enfeksiyonlar
klinik olarak
önem kazandı
Ġngiltere penisilin ve
tetrasiklinin
hayvanlarda
büyüme artırıcı
olarak kullanımını
yasakladı
Antibiyotiklerin
büyümeyi
artırıcı olarak
kullanılmaya
baĢlaması
Ġngiltere'de Swann
Raporu,
hayvanlarda insan
antibiyotiklerinin
kullanılmaması
gerektiğini belirtti
1930
1930
1940
1950
1960
Penisilin
Ġlk sulfonamid
Basitrasin
Eritromisin, ilk
makrolid
Sefalotin, ilk
sefalosporin
Kloramfenikol
Vankomisin
Nalidiksik asit, ilk
kinolon
Klortetrasiklin
Streptomisin,
ilk
aminoglikosid
ABD'de Tıp
Enstitüsünün
büyüme artırıcı
olarak
tetrasiklinler ve
penisilin
hakkındaki
raporu
5
antimikrobiyale
dirençli
Salmonella
Typhimurium
DT104'ün ortaya
çıkıĢı
1970
1980
Florokinolon
dirençli
Campylobacter
kümes
hayvanlarında ve
insanlarda görüldü
Florokinolonların
kümes
hayvanlarında
kullanımı
onaylandı
Danimarka bütün
hayvanlarda
antimikrobiyal
kullanımını
durdurdu
FDA
insanlarda
görülen
hastalıklara
dayanarak
tavuklarda
florokinolon
kullanımını
yasakladı.
1990
2000
Amoksisilinklavulanik asit
(beta-laktamaz
inhibitor)
Siprofloksasin,
ilk florokinolon
KeĢfedilen antibiyotikler
Trimetoprim
Antibiyotik direnci, çok ciddi bir sağlık sorunu olmasının yanında
ekonomik açıdan da önemli bir problemdir1. Bir çalıĢmada ABD‟deki
hastanelerde antibiyotik direncinden kaynaklanan tedavi masraflarının 100
milyon ile 10 milyar dolar arasında olduğu bildirilmiĢtir18. US Office of
Technology Assessment tarafından 1995 yılında yayınlanan bir rapora
göre ABD‟deki hastanelerde antibiyotik dirençli 6 bakterinin oluĢturduğu
enfeksiyonların ek maliyeti her yıl 1,3 milyar doları bulmaktadır19. Dünya
5
çapında bu enfeksiyonların tedavi maliyetinin ise her yıl milyarlarca dolar
olduğu tahmin edilmektedir.
Antibiyotik direncinin üstesinden gelmek için araĢtırmacılar iki yol
olduğunu belirtmektedirler6.
Yeni veya değiĢik yapıda ilaçlar geliĢtirmek: 1990‟lı yıllardan bu
yana
yeni
bir
antibiyotik
sınıfı
geliĢtirilmemekte,
mevcut
olan
antibiyotiklerin kimyasal yapıları değiĢtirilmektedir.
Direnç geliĢimini yavaĢlatmak için antibiyotiği sınırlı kullanmak
(Bilinçli antibiyotik kullanımı): Antiyotik direnci antibiyotik kullanımına bağlı
olarak görülen doğal bir sonuçtur. Bu nedenle antibiyotiklerin bilinçli
kullanımı direncin geliĢimini önlemede veya yavaĢlatmada çok önemlidir.
Ülkemiz de dahil olmak üzere dünyada hem hastanelerde hem de
hayvancılık alanında antibiyotiklerin bilinçsizce kullanıldığı bilinmektedir.
Pek çok ülkede antibiyotiklerin kullanımını sınırlamak amacıyla politikalar
oluĢturulmaktadır.
2.2. Hayvancılıkta Antibiyotik Kullanımı ve Direnç GeliĢimine Olan
Etkisi
Antimikrobik maddelerin kullanımı son 50 yılda hızla artmıĢtır.
Antibiyotikler
profilaksisinden
insanlarda
akne
enfeksiyon
tedavisine
hastalıklarının
kadar
çeĢitli
tedavisi
ve
endikasyonlarda
1
kullanılmaktadırlar .
Hayvancılıkta ise antibiyotikler enfeksiyonları tedavi etmek, besi
hayvanlarında büyümeyi hızlandırmak ve profilaktik amaçlarla yaygın
olarak kullanılmaktadır20. ABD‟de üretilen tüm antibiyotiklerin %70‟inin besi
6
hayvanlarında ve tavukçulukta, dünyada üretilen antibiyotiklerin ise
yaklaĢık yarısının besi hayvanlarında kullanıldığı tahmin edilmektedir 4.
1997 yılında Avrupa Birliği ülkelerinde 10.493 ton aktif antimikrobik ilaç
kullanıldığı; bu miktarın %52‟sinin insanlar, %33‟ünün terapötik amaçlarla
hayvanlar için ve %15‟inin de hayvanlarda büyümeyi hızlandırmak
amacıyla kulllanıldığı bilidirilmiĢtir1. ABD‟de 1990‟lı yılların ortalarında çiftlik
hayvanlarında sadece tetrasiklin 3.5x 106 kg/yıl düzeyinde kullanılmıĢtır21.
Antibiyotikler genellikle hayvanların yemine ve içme suyuna terapötik
dozlarının altında bir düzeyde hergün eklenmektedir. Herhangi bir denetim
olmaması nedeniyle neredeyse her çiftliğin kendi dozunu belirlediği
düĢünülmektedir ancak büyümeyi hızlandırmak amacıyla kullanılan dozun
teorik olarak 10-100 ppm/kg olduğu belirtilmektedir1.
Çevresel ortamlarda yaĢayan bakterilerdeki antibiyotik direncinin
artmasına neden olan asıl etkenin hayvancılıkta aĢırı antibiyotik kullanımı
olduğu
belirtilmektedir22.
Bu
etkinin
değerlendirilmesi
için
yapılan
çalıĢmalar daha çok hayvan dıĢkısının gübreleme yoluyla toprağa
uygulanmasının sonuçlarını değerlendirmeye yöneliktir23-34. Gübre içindeki
antibiyotik konsantrasyonunun eser miktarlardan litrede 200 mg/L
düzeyine kadar ulaĢabildiği gösterilmiĢtir35. Antibiyotiklerin %75‟inin
hayvanlar tarafından absorblanmayıp idrar ve feçesle atılmaları çevrenin
antimikrobik
maddelerle
kontaminasyonuna
yol
açan
önemli
faktörlerdendir36,37. Antibiyotikler gübreleme yoluyla toprağa ve doğal
kaynak sularına geçmektedirler15,16,38. Toprağa bağlandıktan sonra
tetrasiklin, taylosin, sülfonamidler ve kinolonların bakterilere karĢı
aktivitelerini, toprak partiküllerine sıkıca bağlanmıĢ olsalar da, korudukları
yapılan çalıĢmalarla gösterilmiĢtir39,40. Ayrıca virginyamisin, sarafloksasin,
oksitetrasiklin, klortetrasiklin ve siklosporin A gibi antibiyotiklerin de
toprakta çok yavaĢ parçalandıkları gösterilmiĢtir39. Hamscher ve ark.ları
sıvı gübreleme iĢleminden 6 ay sonra toprağın 30 cm altında tetrasiklinin
170
µg/kg
düzeyinde
bulunduğunu
göstermiĢlerdir41.
BaĢka
bir
7
araĢtırmada toprakta bulunan tetrasiklin konsantrasyonu 0,3 mg/kg olarak
bulunmuĢtur41.
Gübreleme yoluyla çiftliklere yakın bölgelerde toprak ve çevreye
yayılmalarının yanında antimikrobik maddeler, hastaneler ve üretildikleri
fabrikaların çevresinde de yoğun olarak bulunmaktadırlar. Bu maddelerin
çoğu toprakta birikebilmekte ve minimum inhibisyon konsantrasyonu (MĠK)
değerlerine ulaĢabilmektedir1,39.
Bu
Ģekilde
antimikrobik
maddelere
terapötik
dozun
altındaki
konsantrasyonlarda uzun süre maruz kalan patojen ve/veya kommensal
bakteriler seçici etki nedeniyle zamanla direnç geliĢtirebilmektedirler33,42 ,43.
Bu etki ġekil 1’ de Ģematik olarak gösterilmektedir44.
Ġki farklı bakteri popülasyonu.
A ve B aynı fiziksel koĢullarda çoğalıyor.
B suĢu X antimikrobiyal maddesine
dirençlidir.
A ve B suĢları arasinda mobil genetik
elementlerin alıĢ veriĢi
Seçici baskı
X maddesi varlığında direnç genine
sahip A suĢları yaĢarken diğerleri ölür
ġekil
1:
Seçici
baskı
altında
Antimikrobik X
maddesine maruziyet
mikropların
A suĢu X maddesine dirençten sorumlu
gen olan a genini mobil genetik
elementler yoluyla b suĢundan alır
antimikrobik
maddelere
direnç
44
geliĢtirmesinin ve bu direncin yayılımının Ģematik olarak gösterilmesi .
8
Bilinçsiz ve aĢırı antibiyotik kullanımı sonucu domuzların intestinal
kanalındaki kommensal veya patojen pek çok bakterinin dirençli hale
geldiği ve bu hayvanların dıĢkılarının toprağa gübre olarak uygulanmasıyla
direnç genlerinin ve/veya direnç geni taĢıyan bu bakterilerin çevreye
yayıldığı düĢünülmektedir11,45-47.
Sengelov ve ark.ları kısa bir süre için de olsa (3-5 gün) domuz dıĢkısı
uygulanan
topraktaki
tetrasiklin
dirençli
bakteri
sayısının
arttığını
23
göstermiĢlerdir . AraĢtırmacılar yine domuz dıĢkısı uygulanmıĢ bir
toprakta antibiyotik dirençli Pseudomonas türleri ve Bacillus cereus
izolatlarının arttığını ortaya koymuĢlardır24. Onan ve LaPara ise gübre
uygulanmıĢ toprakta uygulanmayana göre yüksek oranda taylosin dirençli
bakteri olduğunu göstermiĢtir25. Ayrıca gübrenin ve sülfadiyazinin toprak
bakterileri üzerine etkisinin araĢtırıldığı bir çalıĢmada gübrenin bakteriler
arasında antibiyotik direncinin yayılımına neden olduğu ve sülfadiyazinin
bu etkiyi iki ay boyunca arttırdığı gösterilmiĢtir32.
Bunun yanında direnç genleri veya dirençli bakterilerle kontamine
hayvansal
gıdalar
düĢünülmektedir.
yoluyla
Hayvansal
direnç
genlerinin
gıdalar,
insanlara
non-tifoidal
bulaĢtığı
salmonella,
kampilobakter, Yersinia, E. coli 0157 ve diğer patojenlerin neden olduğu
sindirim yoluyla bulaĢan bakteriyel enfeksiyonların ana kaynağıdır.
Bakteriler
ekosistemler,
hayvanlar
ve
insanlar
arasında
hareket
edebilmektedirler. Bu nedenle bu bakteriler patojen ise veya direnç
genlerinin patojen bakterilere taĢınmasında rol oynuyorlarsa önemli sağlık
sorunları ortaya çıkmaktadır1. Bu bakteriler insanlara gıda ve direkt temas
yoluyla geçmektedirler. Bazı non-tifoidal Salmonella enfeksiyonu vakaları
antibiyotik tedavisi gerektirmektedir ve direnç tedavi olanaklarını büyük
ölçüde sınırlamaktadır. Hayvancılıkta kullanılan antimikrobik maddelerin
dirençli non-tifoidal Salmonella serotiplerinin seçimine neden olduğu birçok
9
araĢtırmacı tarafından bildirilmiĢtir37. Ġnsanlarda ve hayvanlarda bulunan
S.Typhimurium DT 104 klonu ampisilin, streptomisin, kloramfenikol ve
sülfonamidlere dirençlidir ve birçok ülkede görülmektedir1. Hayvancılıkta
florokinolonların kullanılmaya baĢlanması ile insanlardan bu ilaçlara düĢük
duyarlılığa sahip Salmonella serotiplerinin izole edilmesi arasında açık bir
iliĢki vardır. Tavukçulukta florokinolonlar kullanılmaya baĢlandıktan sonra
Hollanda, Ġngiltere ve ABD‟de tavuk, tavuk eti ve insanlardan izole edilen
florokinolon dirençli Campylobacter jejuni suĢlarının sayısında belirgin bir
artıĢ görülmüĢtür. Bunun yanında vankomisin dirençli enterokokların
(VRE)
sayısındaki
artıĢ,
vankomisinin
tarımda
kullanılmasının
sorgulanmasına neden olmaktadır. VRE suĢları hayvanlar, çeĢitli gıdalar
ve daha önce vankomisin tedavisi almamıĢ gönüllü insanlardan izole
edilmiĢlerdir6.
Önemli
diğer
antibiyotiklerin,
bir
aynı
faktör
zamanda
de
hayvancılık
insanlarda
da
alanında
kullanılan
kullanılan
ve
bazı
enfeksiyonların tedavisinde klinikte son çare olarak görülen antibiyotiklerle
aynı olmasıdır. Tablo 2’de bu antibiyotikler ve kullanım alanları
gösterilmektedir48.
10
Tablo 2: Antibiyotikler ve kullanıldıkları alanlar
48
Hayvancılıkta kullanım
Antibiyotik sınıfı
Hayvanın cinsi
Aminoglikozidler
sığır, kümes h.,koyun,
(gentamisin, neomisin,
domuz
Tedavi
Profilaksi
✓
✓
Büyümeyi
Ġnsanda
Bakteriyal
Arttırıcı
Kullanım
Direnç
✓
✓
✓
✓
✓
✓
streptomisin)
Beta-Laktamlar
sığır, kümes h.,koyun,
Penisilinler
domuz
✓
✓
Sefalosporinler
sığır, kümes h., koyun,
✓
✓
(3. jenerasyon)
domuz
Iyonoforlar
sığır, kümes h., koyun
Makrolidler
sığır, kümes h. Domuz
✓
(amoksisilin, ampisilin)
✓
✓
✓
✓
✓
kümes h. Domuz
✓
✓
✓
sığır, kümes h.,
✓
✓
Sülfonamidler
sığır, kümes h. Domuz
✓
Tetrasiklinler
sığır, kümes h., koyun,
✓
(eritromisin,
✓
✓
✓
✓
✓
✓
✓
✓
✓
✓
✓
✓
✓
tilmikosin, taylosin)
Polipeptidler
(basitrasin)
Florokinolonlar
(enrofloxacin)
✓
domuz
Bu nedenle antibiyotik direnç mekanizmalarının anlaĢılmasında ekolojik
ve global bakıĢ açıları çok önemlidir. Mikroorganizmalar rüzgar ve suyla
kolayca yerkürede yer değiĢtirebildikleri gibi ekosistemler arasında da
kolayca hareket ederler. Bu hareket insanlar ve hayvanlardan toprağa ve
suya veya tersi yönde sürekli gerçekleĢmektedir49. Bu nedenle antibiyotik
direncine sadece klinik açıdan yaklaĢmak hatalı olur. Çünkü sadece
enfeksiyon tedavisi alan hastalar değil hasta olmayan, antibiyotik almayan
kiĢiler de çeĢitli çevresel bölgelerden antibiyotiklere, dirençli genlere ve
dirençli bakterilere maruz kalmaktadırlar49,50. Bu nedenle direncin
değerlendirilmesinde çevresel faktörlerin önemi büyüktür. Antibiyotik
11
direncinin çevresel kompartımanlar arasında yayılımı Ģematik olarak ġekil
2’de gösterilmektedir51.
ġekil 2: Antimikrobik Direncin Çevrede Yayılımı
51
Ġçme suyu
Ġçme suyu
Çöp
Gübreleme
Çiftlik atıkları
Çiftlik artığı
Temas
Hazırlama
Tüketim
Besi hayvanlarının
iĢlenmesi
Et
Hayvan Yemi
Temas
2.3. Antibiyotik Kullanımını Sınırlamaya Yönelik Politikalar ve
Uygulamalar
2.3.1.Ülkemizdeki Durum
Tarım ve KöyiĢleri Bakanlığı 9.7.1999 tarih ve 14428 sayılı yazısı ile
30.6.1999 tarihinden itibaren söz konusu antibiyotiklerden avoparsin,
spiramisin, virginyamisin, taylosin fosfat, karbadoks, olakuindoks ve çinko
basitrasinin ülkemizde yem katkı maddesi olarak kullanımını yasaklamıĢtır.
12
2.3.2. Avrupa Birliğine Üye Ülkelerdeki Durum
Bu konuyla ilgili olarak hazırlanmıĢ bilinen en eski rapor Ġngiltere‟de
1969 yılında yayınlanmıĢtır. Bu raporda, profilaksi ve büyümeyi arttırma
amacıyla antibiyotik kullanımında o günün koĢullarında yürürlükte olan
yönetmeliklere bağlı kalınması konusunun üzerinde önemle durulmuĢtur5.
Avrupa Birliği‟ne üye ülkelerde 1995 yılında vankomisin, 1997‟de
avoparsin, 1999‟da taylosin, spiramisin, basitrasin ve virginyamisin aynı yıl
toksik etkileri nedeniyle olakuindoks ve karbadoks, 2006 yılında ise bu
amaçla kullanılan tüm antibiyotikler yasaklanmıĢtır11.
2.3.3. Amerika BirleĢik Devletleri‟ndeki Durum
ABD‟de tarım ve hayvancılıkta antibiyotik kullanımını sınırlayan yasa
taslağı Amerikan Kongresi‟nde halen görüĢülmektedir.
FDA
(Food
and
Drug
Administration)
tavukçulukta
kullanılan
florokinolon yapıda iki antibiyotiğin onayını geri almıĢtır. Çünkü florokinolon
dirençli tavuk etleri insanda görülen florokinolon dirençli Campylobacter
enfeksiyonlarının esas sebebi olarak görülmektedir20.
Ayrıca
Dünya
Sağlık
Örgütü
(WHO)
insanlar
için
kullanılan
antibiyotiklerin hayvanlarda büyümeyi arttırmak amacıyla kullanılmaması
gerektiğini bildirmiĢtir52.
13
2.4. Antibiyotik Direncinin Transferi
Antibiyotiklere dirençli bakteri suĢları duyarlı olanlardan, ürettikleri
spesifik proteinlerle ayrılırlar. Bu proteinler direnç genleri tarafından
eksprese edilirler. Direnç genleri mutasyonlar sonucu oluĢur veya bakteri
bu genleri dirençli diğer bir bakteriden alır53. Eğer direnç geni aynı veya
farklı türlerden bakteri suĢları arasında paylaĢılıyorsa buna horizontal gen
transferi adı verilir54.
Gübre bakteriler için oldukça besleyici bir ortam olduğundan ve çok
sayıda bakteriyi barındırdığından direnç genlerinin horizontal gen transferi
yoluyla aktarılmasını kolaylaĢtırmaktadır26.
Belirli bir bakterinin bir antimikrobik maddeye direnç geliĢtirmesi Ģu
faktörlere bağlıdır1:
Bakterinin fizyolojisi
OluĢan genetik mutasyonların özelliği
Kazanılacak direnç geninin prevalansı
Antimikrobik maddeye maruz kalma süresi ve düzeyi
2.4.1. Horizontal Gen Transfer Mekanizmaları
Bakteriler hücreler arası genetik bilgi transferini transformasyon,
transdüksiyon ve konjugasyon olarak adlandırılan 3 farklı mekanizma ile
gerçekleĢtirirler. Bu mekanizmalar ġekil 3’te gösterilmektedir55.
14
A
B
C
55
ġekil 3: Direnç genlerinin aktarım mekanizmaları :
A: Transdüksiyon B: Konjugasyon C: Transformasyon
2.4.1.1. Transformasyon
Bilinen en eski mekanizma olan transformasyon verici (donör)
hücreden DNA‟nın salınması ile baĢlar. DNA çevrede bulunan baĢka bir
bakteri tarafından gıda olarak alınabilir, eğer iki bakteri çok yakınsa
homolog rekombinasyon ile DNA, alıcı hücrenin kromozomuna integre olur
(ġekil 3). Transformasyonun gerçekleĢmesi için her iki bakteri hücresinin
(alıcı ve verici) homolog genlere sahip olması gerekmektedir, çünkü
heterolog genler alıcı hücrenin nükleazları tarafından parçalanır. Penisilin
direncinden sorumlu kromozamal mutasyonların transformasyon yoluyla
pnömokoklar arasında yayıldığı bilinmektedir 44,49,54-56.
15
Nükleaz enzimine duyarlı olmasına rağmen DNA neredeyse tüm
çevresel kompartımanlarda yaygın olarak bulunur ve canlı bakteriler
tarafından çevreye bırakılır veya bakterinin otolizisi sonucu açığa çıkar.
DNA kum ve kil partiküllerine adsorbe olarak stabilize olabilir. Böylece
DNase enzimine 100-1000 kat daha dirençli hale gelir. Adsorbe olan DNA
transforme olabilme özelliğini haftalar hatta aylar boyunca koruyabilir 56,57.
Transformasyon farklı ekosistemlerde çok çeĢitli bakteriler için
gösterilmiĢtir. Acinetobacter calcoaceticus‟ un tranformasyonunu etkileyen
faktörler farklı toprak tiplerinde araĢtırılmıĢ ve besleyici madde içeriği
yüksek topraklarda transformasyon sıklığının arttığı görülmüĢtür56,58.
Cooper ve ark. ları yaptıkları bir çalıĢmada, Bacillus sphaericus‟ta bulunan
ermG geni ile Bacteroides‟ten izole edilen konjugatif transpozonlar
arasında benzerlik olduğunu saptamıĢlar ve bunun toprak bakterileri ile
insan gastrointestinal sistem bakterileri arasında direnç genlerinin transfer
edildiği yönünde bir kanıt olduğunu belirtmiĢlerdir59. Bunun yanında
konjugal ve mobilize plazmidlerin çevreden izole edilen bakterilerde
yüksek sıklıkta bulunduğu bildirilmiĢtir.
2.4.1.2. Transdüksiyon
Transdüksiyonda bakteriyofaj adı verilen bakteri virusları rol oynar
(ġekil 3). Bakteriyofajlar aracılığı ile verici bakteriden alıcı bakteriye
genetik materyal veya bir DNA segmenti aktarılır. Transdüksiyon baĢlıca
iki Ģekilde görülmektedir (ġekil 4)44,56,60:
1. Lokalize
(kısıtlı)
transdüksiyon:
Bakteriyofaj
girdiği
bakterinin
kromozomunun hep aynı bölgesine entegre olduğu için, yeni bakteriye
daima aynı DNA segmentini aktarır.
16
2. Jeneralize (kısıtlanmamış) transdüksiyon: Konak bakterinin tüm genleri
alıcı bakteriye eĢit Ģansla aktarılır.
Transdüksiyon yoluyla genellikle toksin yapımı ve virülansla ile ilgili
diğer genler aktarılmakta iken antibiyotik direnç genlerinin aktarımı daha
az sıklıkta görülmektedir54.
Bakteriyofajlar sınırlı konak çeĢitliliğine sahiptir, bazı bakteriyofajlar tek
bir bakteri türüne spesifiktir. Bununla beraber fajların çevrede yaygın
olarak bulunduğu, protein mantosu ile korunduğu ve nispeten stabil olduğu
da bilinmektedir56. Fajlar kompakt yapıdadır ve çıplak DNA‟ya oranla
difüzyon yetenekleri daha fazladır. Ancak toprak bakterileri arasındaki gen
transferinde transdüksiyonun rolü henüz tam olarak bilinmemektedir44,56.
2.4.1.3. Konjugasyon
Konjugasyon doğada ve normal insan florasında görülen baĢlıca direnç
geni aktarım mekanizmalarından biridir. Transformasyon ve faj aracılı
transdüksiyon homolog rekombinasyona gereksinim duyması nedeniyle
daha dar konak bakteri aralığında görülmekte iken konjugasyonun konak
hücre aralığı çok daha geniĢtir54.
Konjugasyon büyük (> 30 kb), çift iplikli DNA plazmidleri (çembersel
veya lineer) ve konjugatif transpozonlar tarafından gerçekleĢtirilir.
Konjugasyonun gerçekleĢmesi için verici ve alıcı hücre arasında fiziksel
temas gerekmektedir (ġekil 3 ve 4)54,62.
Büyüklükleri 18-150 kb arasında değiĢen DNA segmentleri olan
konjugatif transpozonlar genellikle bakteri genomuna integre olurlar.
Konjugatif transpozonlar, konvansiyonel transpozonlardan çembersel
17
yapılar oluĢturabilme, konjugasyonla aktarılabilme ve integrasyonları
sırasında hedef bölge duplikasyonu yapmama özellikleri ile ayrılırlar 62.
Konjugatif transpozonların özellikle Bacteroides türleri ve gram pozitif
bakteriler arasında direnç genlerinin yayılmasında önemli bir rol
oynadıkları düĢünülmektedir48,56. Tn916 ailesinin üyeleri 24 farklı cinsten
50 türden fazla bakterinin gen aktarımından sorumludur45.
Konjugatif plazmidler (RP4 gibi) konjugatif transpozonlar gibi çok geniĢ
konak hücre çeĢitliliğine sahiptir. Toprak bakterileri arasında plazmidlerin
konjugasyon yoluyla aktarıldığını gösteren pek çok çalıĢma bulunmaktadır.
Bunun yanında konjugatif plazmidler daha küçük ve konjugatif olmayan
plazmidlerin aktarımında
da rol oynayabilirler. Buna mobilizasyon
denir54,56,60.
Bu hücreler arası gen aktarımı mekanizmaları dıĢında hücre içi gen
hareketini
sağlayan
transpozisyon
ve
kaset
integrasyonu
olarak
adlandırılan iki farklı mekanizmanın daha varlığından söz edilmektedir.
Transpozisyon bir genin kromozom veya plazmid üzerinde bir yerden
baĢka bir yere hareketidir. Gen kasetleri konak hücre DNA‟sına veya
integrona integre olabilen gen topluluklarıdır. Kaset integrasyonu ise
antibiyotik direncinden sorumlu her bir genin ard arda dizilerek biraraya
gelmesi ve ekspresyonu ile görülür54 (ġekil 4).
2.4.2.Yer DeğiĢtirebilen Genetik Elementler
Antibiyotik direncinin insan ve hayvanlarda önem arzeden bazı bakteri
cinsleri arasında hızla yayılmasından sorumludurlar. Bu elementler,
kromozomlar arasında, aynı kromozom üzerindeki farklı bölgeler arasında,
kromozomdan plazmide veya iki plazmid arasında yer değiĢtirebilen, kendi
18
transferlerini
gerçekleĢtirebilen,
küçük,
lineer,
çift
iplikli
DNA
sekanslarıdır60,62.
Verici
hücre
Alıcı hücre
Kromozom
Kromozom
Lokalize
Profaj
Transdüksiyon
Mobilize
plazmid
Jenaralize
Konjugatif
plazmid
Mobil
gen
kasetleri
ġekil 4: Bakteri hücreleri arasında DNA transferi. Transdüksiyon (1). Faj DNA’sı (sarı) bakteri
kromozomuna (koyu mavi) integre olur. Daha sonra jeneralize transdüksiyon ile sadece
verici hücre DNA’sıyla veya faj DNA’sıyla beraber alıcı hücre kromozomuna (kırmızı)
rekombine olur. Konjugasyon (2). DüĢük kopya sayısına sahip büyük konjugatif transpozon
(turuncu) ve integrated konjugatif elementler (ICE, gösterilmiyor) pilusu kullanarak alıcı
hücreyle bağlantı sağlar ve kendi transferini gerçekleĢtirir. Plazmidin bir kopyası, genomik
adalar veya bakteriyel kromozomun tamamının kopyası naif hücreye aktarılabilir. Bu genetik
elementler kromozom içine yerleĢebilir veya naif hücrenin plazmidi (açık yeĢil) ile geçimli ise
bağımsız olarak replike olabilir. Gram pozitif bakterilerin konjugatif transpozonları ve
plazmidleri
piliye
ihtiyaç
duymazlar.
Transpozisyon
(3).
Transpozonlar
(pembe),
kromozomlar veya plazmidler üzerindeki yeni sahalara non-homolog rekombinasyon ile
integre olurlar. Ġntegronlar (koyu yeĢil) gen kaseti (kahverengi) alıĢ-veriĢinde aynı
60
mekanizmayı kullanırlar .
19
2.4.2.1.Plazmidler
Hücrenin
kromozomundan
bağımsız
olarak
replike
olabilen
ekstrakromozomal DNA segmentleridir. ÇeĢitli bakteriler arasında seks
pilusları aracılığıyla taĢınabilirler. Plazmidler replikasyon yöntemleri ve
bakteri hücresindeki kalıcılıklarına göre geçimlilik (inkompatibilite,Inc)
gruplarına ayrılırlar. Plazmidlerin bakteri için yaĢamsal önemi yoktur ancak
taĢıdıkları virulans determinantları ve antimikrobik direnç genleri ile
bakteriye avantaj sağlarlar. Direnç genlerini taĢıyan plazmidler R
plazmidler
veya
R
faktör
olarak
adlandırılır.
1950
yılında
keĢfedilmelerinden bu yana giderek artan oranda patojen veya kommensal
gram negatif ve gram pozitif bakterilerin direncinden sorumludurlar.
Plazmidlerin
taĢıdığı
direnç genleri klinikte
kullanılan
antimikrobik
maddelere direncin baĢlıca sorumlusudur49,54,60.
Direnç genlerini taĢımalarının yanı sıra plazmidler, transpozon ve
integronlar gibi diğer mobil genetik elementlerin taĢınmasında da rol
oynarlar49.
2.4.2.2.Transpozonlar (Tn)
Transpozonlar, kromozom üzerindeki bir bölgeden baĢka bir bölgeye
veya kromozom üzerinden plazmidlere atlayabilen gen sekanslarıdır.
Transpozonlar insersiyon sekanslarından (ĠS) ve transposase adı verilen
transpozisyondan sorumlu genden oluĢur. Bunun yanında transpozonlar
çok daha kompleks yapıda da olabilirler. Bu tip komleks yapıdaki
transpozonlara kompozit transpozonlar denir61. Bu transpozonların iki
20
ucunda ĠS-sekansı bulunur (ġekil 5 ve 6). Farklı bakteri türleri arasında
pek çok direnç determinantının kompozit transpozonlar ile taĢındığı
bilinmektedir. Bu transpozonlar konjugatif bir plazmide veya kongujatif bir
transpozona integre olarak bir hücreden diğerine geçerler 49. Konjugatif
transpozonlar, transpozonlar ve plazmidler arasındaki hibrid yapılardır ve
gram negatif bakterilerde olduğu kadar gram pozitif bakterilerde de
bulunurlar49,54,62.
Transpozisyon genleri
Tersine
tekrarlanan
sekanslar
Yapısal genler
Tersine tekrarlanan
insersiyon sekansları
ġekil 5: Bakteriyel kompozit transpozonların yapısı
63
Transpozisyon
genleri
Tersine
tekrarlanan
sekanlar
64
ġekil 6: Ġnsersiyon sekanslarının yapısı
Pek çok direnç geni (tetM, tetQ, ermF, ermG) konjugatif transpozonlar
tarafından taĢınırlar. ġekil 7’de konjugatif transpozonlar yoluyla aktarılan
genler ve bakteri cinsleri Ģematik olarak gösterilmiĢtir45.
21
Bacillus türleri
Clostridium türleri
Staphylococcus türleri
Enterococcus türleri
Streptococcus türleri
Staphylococcus türleri
Clostridia türleri
Enterococcus türleri
Streptococcus türleri
Staphylococcus türleri
Clostridia türleri
Actinomyces türleri
Bifidobacterium türleri
ermG
Bacteroides türleri
ermB
Bacteroides türleri
Campylobacter türleri
Fusobacterium nucleatum
Gardenella vaginalis
Haemophilus türleri
Neisseria türleri
Veillonella türleri
tetM
Firmicute
Eubacterium
tetQ
ermF
Bacteroides türleri
Prevotella türleri
Porphorymonas türleri
ġekil 7: Doğada konjugatif transpozonlar yoluyla aktarılan genler ve geniĢ konak
hücre spektrumları
45
2.4.2.3.Ġntegronlar
Ġntegronlar, antibiyotik direnç gen kasetlerinin integre olabileceği,
merkezinde spesifik yapıda 2 korunmuĢ segment taĢıyan hareketli DNA
segmentleridir.
Ġntegronlar
ve
transpozonlar
özelleĢmiĢ
2
tip
rekombinasyondan sorumlu genleri kodlayan DNA parçalarıdır. Her iki
element de kendi kendine replike olamaz, fajlar ve plazmidlerde olduğu
gibi hücreler arası aktarımlarını sağlayacak genleri kodlayamazlar49,54,65.
Süper integronlar dıĢında integronlar 3 sınıfa ayrılırlar. Sınıf 1
integronlar gen kasetleri içermezler, bununla birlikte int-attl yapısını
taĢırlar. İnt integron üzerinde bulunan ve integraz enzimini kodlayan
gendir. Attl ise int genine komĢu rekombinasyon bölgesidir. Sınıf 2
22
integronlar
Tn7‟nin
bir
parçası
olup
trimetoprim
ve
streptomisin
direncinden sorumludur. Sınıf 3 integronlar konusunda eldeki bilgiler
sınırlıdır65.
Ġntegronlar genellikle besi hayvanlarından ve insanlardan izole edilen
streptomisin
ve
trimetoprim-sülfametaksazol
dirençli
bakterilerde
bulunmaktadır66. Ġntegron aracılığı ile antimikrobik direncin hızla yayılımına
örnek olarak Salmonella Thyhimurium faj tip DT104 (R-tip ACSSuT olarak
da bilinir) verilebilir. Bu faj tipi halk sağlığını olumsuz yönde etkilemiĢ ve
global bir problem halini almıĢtır49.
BaĢlangıçta sadece enterobakterilerle sınırlı oldukları düĢünülen
integronlar
bugün
Salmonella,
Camphylobacter,
Enterococcus
ve
Staphylococcus gibi pek çok türden izole edilmiĢtir65.
2.5. Direnç Mekanizmaları
Bakteriler 3 temel direnç fenotipinden birine sahip olabilirler67:
1. Duyarlı
2. Doğal dirençli
3. KazanılmıĢ dirençli
Doğal direnç, bir türün tüm üyelerinde görülen, bu türün fizyolojik veya
biyokimyasal özelliklerini belirleyen bir fonksiyondur. Enterokokların
penisilin bağlayan proteinlere düĢük afinitesi nedeniyle sefalosporinlere
dirençli olması gibi67.
KazanılmıĢ direnç, düzenleyici veya yapısal genlerin mutasyonu,
yabancı direnç genlerinin kazanılması veya bu iki mekanizmanın
23
kombinasyonu
yoluyla
ortaya
çıkabilir.
Türe
ait
tüm
bireylerde
gözlenmez67.
Nokta mutasyonlar sonucu ortaya çıkan direnç fenotipleri genellikle
antibiyotiğin hedefinin değiĢtirilerek bağlanma kapasitesinin düĢürülmesi
yoluyla ortaya çıkar. Örneğin DNA girazı kodlayan gendeki nokta
mutasyonu kinolonların bakteriye bağlanma afinitesini azaltarak dirence
neden olur67.
Mutasyondan
baĢka
direnç,
antimikrobik
maddenin
enzimatik
modifikasyonu, ilacın bakteri içinde birikmesinin önlenmesi, ilacın hedefi
olan yapıların değiĢtirilmesi veya korunması gibi baĢlıca 3 yolla ortaya
çıkabilir.
Antimikrobik
maddenin
yapısının
değiĢtirilmesi
veya
degradasyonu yoluyla oluĢan direnç çok yaygın olarak görülmektedir. Bu
Ģekilde antimikrobik maddenin etkinliği azalır veya tamamen durur.
Bakterilerin ürettiği β-laktamaz enziminin enzimatik yolla β-laktam
halkasını parçalaması bu direnç mekanizmasına örnek verilebilir. Son
yıllarda saptanan bir diğer direnç mekanizması da florokinolonları
asetilleyerek aktivitesinin azalmasına yol açan aminoglikozit asetil
transferaz (AAC(6‟)-Ib) enzimi ile oluĢan plazmid aracılı dirençtir. Bu
varyant enzimlerin bazı kinolonları etkilemesi ve aminoglikozitlere karĢı
direnç geliĢiminde rol oynaması bu enzimleri yapan genlerin de çoklu
direnç için seçime uğradığını göstermektedir68. Ayrıca makrolidler ve
streptograminlerde de enzimatik inaktivasyon yoluyla oluĢan dirençten söz
etmek mümkündür. Aminoglikozit asetil transferaz antimikrobik maddelere
asetil gruplar ekleyerek inaktive etmesinin yanı sıra, ribozomun A
bölgesine bağlanarak translasyonu ve kodon anti-kodon translasyon
mekanizmasını etkiler67.
24
Bir diğer direnç mekanizması da porin değiĢikliği aracılığı ile gram
negatif bakterilerde hücrenin geçirgenliğinin azaltılmasıdır. DıĢ zar
proteinleri (omp) antibiyotikler de dahil olmak üzere pek çok molekülün
yük, büyüklük ve yapısına bağlı olarak hücre içine alınmasını sağlarlar. Bu
porinlerin herhangi birinde mutasyon yoluyla görülen fonksiyon bozukluğu
sonucu çok çeĢitli antimikrobik maddeye karĢı direnç geliĢimi gözlenir.
Ayrıca dıĢ zar lipoproteinlerini kodlayan genlerde görülen mutasyonlar
sonucu da direnç geliĢebilmektedir. Lipopolisakkaritin O antijen yan
zincirinde
görülen
değiĢtirebilmekte
ve
değiĢiklikler
molekülün
katyonik
antibiyotiklerin
yapısını
ve
bağlanma
yükünü
yeteneğini
azaltmaktadır69.
Hücre içinde biriken antibiyotiğin enerji bağımlı bir mekanizma olan
aktif pompa sistemi ile hücre dıĢına atılması da diğer bir direnç
mekanizmasıdır. BoĢaltım (efluks) pompaları dirençli olsun olmasın
bakterilerde bulunan doğal bir mekanizmadır. Efluks pompaları belirli bir
antimikrobik maddeye, sınıfa veya pek çok antimikrobik maddeye karĢı
çoklu direnç oluĢumundan sorumlu olabilir. Efluks pompaları çoğunlukla
bakteri kromozomunda kodlanan, genetik elementler üzerinde taĢınan
veya çeĢitli çevresel uyaranlar yoluyla tetiklenebilen mekanizmalardır67.
2.6. Tez ÇalıĢmasında Kullanılan Antibiyotikler Hakkında Genel
Bilgiler
2.6.1.Tetrasiklinler
1950 yılında kullanıma girmelerinin ardından tetrasiklinler insanlarda ve
hayvanlarda tedavi amacıyla, büyüme faktörü olarak hayvancılıkta ve
profilaksi amacıyla bitkilerde kullanılmaktadır. Tetrasiklinler gram negatif
ve
gram
pozitif
bakteri
enfeksiyonlarında,
intrasellüler
bakteriyel
25
enfeksiyonlarda ve protozoon enfeksiyonlarında olduğu kadar enfeksiyon
dıĢı durumlarda da kullanılan geniĢ spektrumlu antibiyotiklerdir. Bunun
yanında tetrasiklinler hayvancılıkta en sık kullanılan antibiyotiklerdir.
Günümüzde
görülmesinin
tüm
bu
bakteri
cinslerinde
yaygın
tetrasiklinlere
kullanımdan
karĢı
direnç
kaynaklanabileceği
düĢünülmektedir21.
Tetrasiklin grubu antibiyotikler tetrasiklin, oksitetrasiklin, klortetrasiklin
ve minosiklinden oluĢur ve bu antibiyotikler geniĢ spektrumludurlar. Gram
pozitif ve gram negatif bakterilerde aminoaçil tRNA‟nın 30S ribozomal alt
üniteye bağlanmasını engelleyerek protein sentezinin inhibisyonuna neden
olurlar. Tetrasiklinlere karĢı baĢlıca iki mekanizma ile direnç oluĢmaktadır:
Ribozomların büyük sitoplazmik proteinlerce korunması ve enerji aracılı
efluks pompaları ile ilacın hücre dıĢına atılması. Üçüncü bir mekanizma
olarak tetrasiklinlerin enzimatik inaktivasyonundan bahsedilebilir. Tablo
3’te bu mekanizmalardan sorumlu genler gösterilmektedir21.
Fırsatçı patojen ve patojen bakterilerde olduğu gibi kommensal
bakteriler de aynı plazmidler, transpozonlar ve integronlarla taĢınan
tetrasiklin direnç (tet) genlerine sahiptirler. Tet genleri insan, hayvan ve
çevreden izole edilen pek çok bakteride bulunmaktadır. Tet genlerinin
çoğunun konjugatif ve mobil elementler yoluyla taĢınması çok çeĢitli
bakteriler arasındaki yayılımı açıklamaktadır70.
Bir domuz çiftliğinde gübre toplama bölgesindeki ve çevresindeki
yeraltı sularında tetrasiklin direnç genlerinin varlığını, dağılımını ve
miktarını uzun dönemde belirlemek üzere yapılan bir çalıĢmada bu
genlerin yeraltı suyuna kadar ulaĢtıkları gösterilmiĢtir16.
26
Bir baĢka çalıĢmada tet(M), tet(O), tet(W) ve tet(Q) genleri yeraltı
sularından ve gübreden en sık elde edilen ribozomal koruma genleri olarak
bulunmuĢtur15.
Tablo 3: Tetrasiklin (tet) ve oksitetrasiklin (otr) direnç genleri ve ilgili oldukları
direnç mekanizmaları
70
Genler
Efluks
tet(A), tet(B), tet(C), tet(D), tet(E), tet(G), tet(H), tet(I), tet(J), tet(Z), tet(30), tet(31)
tet(K), tet(L), Otr(B), tcr3, tetP(A), tet(V), tet(Y), otr(C), tet(33), tet(35) tet(38), tet(39)
Ribozomal korunma
tet(M), tet(O), tet(S), tet(W), tet(Q), tet(T), otr(A), tetP(B), tet(32), tet(36)
Enzimatik
tet(X), tet(34), tet(37)
Bilinmeyen
tet(U)
2.6.2.Eritromisin
Eritromisin, pek çok gram negatif ve gram pozitif bakterilere,
mikoplazma ve klamidya‟lara etki gösteren genellikle bakteriyostatik etkili
bir antibiyotiktir.
Makrolid-linkozamid-streptogramin
B
grubunda
bulunan
antibiyotiklerden olan eritromisin ve taylosinin etki mekanizmaları ve
karĢılaĢılan direnç mekanizmaları aynıdır. 50S alt ünitenin 23S ribozomal
RNA‟sına bağlanır. Translasyonun elongasyon fazını, translokasyonun
veya peptid transferinin inhibisyonu sonucu, durdurarak etki eder.
27
Bugüne
kadar
eritromisin
için
üç
farklı
direnç
mekanizması
saptanmıĢtır: Hedef bölgede N-metiltransferaz enziminin oluĢturduğu
modifikasyonlar; fosforilaz, glikosilaz ve esteraz enzimleri ile eritromisinin
yapısında oluĢturulan değiĢiklikler ve antibiyotiğin taĢınmasında görülen
degiĢiklikler sonucu direnç oluĢur. Hedef bölgedeki değiĢiklik, stafilokok ve
streptokoklarda metilaz enzimini kodlayan erm (eritromisin ribozomal
metilaz) genini taĢıyan bir plazmidin kazanılmasıyla ya da S. pneumoniae’
de olduğu gibi kromozom üzerindeki bir transpozon aracılığı ile olur71,72.
Eritromisin hayvancılık alanında kullanılmasa da baĢka bir makrolid
antibiyotik olan taylosin sıklıkla kullanılmaktadır. Taylosin ve eritromisinin
etki ve direnç mekanizmaları aynıdır. Bu nedenle pek çok çevresel izolatta
erm geninin de saptanmasının nedeninin bu olabileceği düĢünülmektedir.
En yaygın görülen erm geni olan erm(B) taylosin ve diğer makrolid
antibiyotiklere de direnç geliĢiminden sorumludur72-74.
Yapılan bir çalıĢmada taylosin kullanılan bir çiftlikte eritromisin dirençli
streptokok ve stafilokoklar hem hayvanlardan hem de üreticilerden izole
edilmiĢtir12.
Topraktan
izole
edilen
bakteriler
arasında,
antibiyotik
üreten
Streptomyces ve Bacillus türleri de dahil olmak üzere, eritromisin direncine
yüksek
oranda
rastlanmaktadır75.
Yakın
zamanda
yayınlanan
bir
çalıĢmada toprak örneklerinde efluks tip tetrasiklin direnç genlerinden
sonra en sık erm(V) ve erm(E) genlerinin izole edildiği bildirilmiĢtir74.
2.7. Çevresel Ġzolatlarda Antimikrobik Direncin Ölçülmesi
Patojenler ve kommensal mikroplar çerçevesinde antimikrobik direnci
ölçmek üzere kullanılabilecek yöntemler ve bunların hangisinin daha doğru
28
sonuç verdiği üzerinde uzun süredir tartıĢmalar yapılmaktadır. Bu
kapsamda fenotipik veya genotipik antibiyotik direncini tespit etmeye
yönelik yöntemler kullanılabilmektedir. Patojen bakterilerde antibiyotik
direncinin ölçülmesi amacıyla disk difüzyon veya sıvı dilüsyon gibi
inhibisyona dayalı testleri kullanarak fenotipik direncin belirlenmesi
konusunda bir mutabakat vardır. Ancak CLSI (Clinical and Laboratory
Standards Institute, eski adıyla NCCLS)‟nın 2002 dökümanı bir çok
hayvan patojeni bakterinin antibiyotik direncinin belirlenmesi için gereken
standartları içermemektedir2,39.
Bazı antibiyotik direnç fenotiplerinin belirli antibiyotik direnç genlerinin
taĢınması
yoluyla
değil,
bakterideki
fizyolojik
değiĢiklikler
sonucu
görüldüğü anlaĢılmıĢtır. Gen rezervuarları olarak iĢlev yapabilecek olan
kommensal
organizmalarda
geninin
direnç
bulunması
önemli
görülmemektedir. Önemli olan hususun, gen ve bu genin diğer bakterilere
aktarılıp aktarılmadığı olduğu düsünülmektedir. Bu nedenle, kommensal
mikroorganizmalarda, fenotipik ölçümden çok, belirli gen(ler)i taĢıma
yeteneğinin olup olmamasının saptanması önemlidir. Bu bakımdan,
“antibiyotik direnci” kavramı kısmen mikroorganizmanın kendisi tarafından
belirlenmekte ve fenotipik direnç ölçümü, yalnızca bir patojenle ilgili
tedavinin sonucuyla bağlantılı ise klinik önem arz etmektedir2.
Bu
tez
çalıĢmasının
antibiyotiklerin
yaygın
amacı,
direnç
kullanıldığı
bir
geni
domuz
taĢıyan
bakterilerin
çiftliğinden
çevreye
yayılımının belirlenmesidir. Elde edilecek sonuçlar antibiyotik direnci ile
çevresel ortam arasındaki iliĢkinin açıklanması bakımından tarımsal
endüstride son derece önemli olacaktır. Potansiyel antibiyotik direnci
rezervleri ve çevreye geçiĢ yolları hakkında daha fazla bilgi elde
edinilmesinin
kanun
koyucular
ve
üreticilere
tarımsal
endüstride
antibiyotiklerin bilinçli kullanılması hususunda rehberlik edecegi açıktır2.
29
3. GEREÇ VE YÖNTEM
3.1. Toprak Örneklerinin Toplanması
Toprak örnekleri, hayvancılık yapılan bir çiftliğin yakınında bulunan
soya fasulyesi tarlasından alınmıĢtır. Söz konusu çiftlikte hayvanların
yemlerine sürekli eklenmek suretiyle klortetrasiklin; tedavi ve profilaksi
amacıyla gerektiğinde penisilin ve taylosin kullanılmaktadır. Ortaya çıkan
gübre de adı geçen tarlada zenginleĢtirici olarak kullanılmaktadır. Tarla
örneklerin toplanması için kuzey ve güney olmak üzere iki parsele
ayrılmıĢtır. Tarla sürüldükten sonra toprağa yayılan gübre yaklaĢık 20 cm
derinliğe ulaĢmaktadır. Tarlanın güney parçasına uygulanan gübre (57000
litre/hektar) domuzların bulunduğu yapının altında bulunan gübrelerin
toplandığı çukurdan, kuzey kısmına uygulanan (114000 litre/hektar) ise
lagün‟den alınmıĢtır. Lagün bu binanın dıĢında yer alan, çukurda biriken
gübrenin 6 haftada bir boĢaltıldığı gölete verilen isimdir. Parsellerin
yaklaĢık 40‟ar hektarlık kısımlarından örnekler toplanmıĢtır. Her iki
parselde de belirlenen bu alanlar için 4x4‟lük Ģablonlar hazırlanmıĢtır
(ġekil 8). Dolayısı ile her Ģablon 16 örnek alma noktasını kapsamaktadır.
Her bir örnek alma noktasının en fazla 1 m uzağından ve 0-20 cm
derinlikten 4‟er örnek toplanmıĢtır. Bu 4 örnek plastik torbada birleĢtirilmiĢ
tek bir örnek halinde buzdolabında saklanmıĢtır. Laboratuvara ulaĢan
örnekler torbalardan alınıp steril koĢullarda vidalı kapaklı steril plastik
deney tüplerine alınmıĢtır. Bu tüplerin bir bölümü toprak bakterilerinin
kültürlerinin hazırlanması için 4 ºC‟de, kalan tüpler de daha sonra
yapılacak iĢlemler için -20 ºC‟de saklanmıĢtır.
30
Her bir örnek alma gününde tarlanın kuzey parselinden 16, güney
parselinden 15 adet toprak örneği alınmıĢtır. Her iki parsel için de 3‟er
temsili nokta belirlenmiĢ ve çalıĢmalarda bu örnekler kullanılmıĢtır. Çünkü
bu 3‟er noktadan alınan toprak örnekleri aynı zamanda kimyasal bileĢenler
(antibiyotik, Cl, NH4, K, Na) yönünden de analiz edilmektedir.
K
82 m
82 m
ġekil 8: Kare biçimindeki tarladan örneklerin toplandığı noktalar
Belirli aralıklarla toplanan örneklerin her seferinde aynı noktalardan
alınabilmesi
amacıyla
GPS
(global
positioning
system)
cihazı
kullanılmıĢtır. Örnek alma tarihleri Tablo 4‟te gösterilmektedir.
Tablo 4: Toprak örneklerinin alındığı günler
Örneğin Adı
Örnek alma tarihleri
Alım* (Gübre uygulanmasından bir gün önce)
5/10/05
Alım1 (Gübre uygulanmasından bir gün sonra)
6/10/05
Alım2(Gübre uygulanmasından üç hafta sonra)
27/10/05
Alım3 (Gübre uygulanmasından üç ay sonra)
11/1/06
*Tarlanın güney kısmına ait alım örnekleri bulunmamaktadır.
31
Ayrıca 5 Ekim 2005 tarihinde tarlaya uygulanmadan hemen önce hem
gübrelerin toplandığı çukurdan hem de lagün‟den gübre örnekleri
alınmıĢtır.
3.2. Tezde Kullanılan Antibiyotikler
ÇalıĢmada kullanılan tetrasiklin ve eritromisin Sigma-Aldrich (S. Lois,
MO-ABD)
firmasından,
besiyerlerindeki
mantar
kontaminasyonunu
önlemek için kullanılan pimarisin (natamisin) ise Calbiochem (San Diego,
CA -ABD) firmasından elde edilmiĢtir. Tetrasiklin ve eritromisin için stok
çözeltiler hazırlanmıĢtır. Tetrasiklinin distile su ile hazırlanan stok çözeltisi
-20 ºC‟de, eritromisinin etanol içinde hazırlanan stok çözeltisi 2-8 ºC‟de
saklanmıĢtır.
3.3. Bakterilerin Topraktan Ġzolasyonu
Toprak örneklerini süspansiyon haline getirmek için Winogradsky Tuz
Çözeltisi kullanılmıĢtır. Bu çözelti aĢağıda belirtildiği gibi hazırlanmıĢtır76:
Winogradsky Tuz Çözeltisi (pH 6,8-7,0)
K2HPO4
MgSO4. 7H2O
NaCl
MnSO4.H20
NH4NO3
Distile su
0,4 g
0,13 g
0,13g
1,52 mg
0,5 g
1000 ml‟ye tamamlanır.
Bu çözelti membran filtreden süzülerek sterilize edilmiĢ ve 4 ºC‟de
saklanmıĢtır. 1:20 oranında seyreltildikten sonra soğuk halde kullanılmıĢtır.
32
Bakteri suĢlarının izolasyonu Ģu Ģekilde yapılmıĢtır77: Her bir toprak
örneğinden 1 g alınmıĢ ve 100 ml Winogradsky Tuz Çözeltesi içinde
süspansiyonu hazırlanmıĢtır. Daha sonra magnetik karıĢtırıcı kullanılarak
200 rpm hızda yarım saat süreyle karıĢtırılmıĢtır. Aynı çözelti içinde 10 kat
azalan seri dilüsyonlar hazırlanmıĢ ve 10-5-10-8 dilüsyonlardan 100‟ er µl
alınarak R2A ve Dilue nutrient broth agar (DNBA) besiyerlerine steril cam
boncuk yardımıyla inoküle edilmiĢtir. Toprak koĢullarını taklit etmek
amacıyla plaklar 24ºC‟de karanlıkta inkübe edilmiĢtir. Ġnkübasyon 2 hafta
sürmüĢ ve bu süre zarfında elde edilen koloniler 20 µg/ml tetrasiklin ve
aynı miktarda eritromisin içeren besiyerlerine ayrı ayrı ekilmiĢtir. Bu
besiyerlerinde üreyen bakteriler ilgili antibiyotiklere dirençli bakteriler
olarak değerlendirilmiĢtir. Besiyerlerinin hazırlanması aĢamasında mantar
kontaminasyonunu
önlemek
için
pimarisin
(natamisin)
final
konsantrasyonu 25 µg/ml olacak Ģekilde tüm besiyerlerine eklenmiĢtir78.
Bakterilerin gübreden izolasyonu için toprak bakterileri için kullanılan
yöntem uygulanmıĢ ancak farklı olarak R2A besiyeri yanında zengin besin
içeriği olan triptik soy agar (TSA) da kullanılmıĢtır. Triptik soy agar plakları
37 ºC‟de 24-48 saat inkübe edilmiĢtir.
Son olarak, elde edilen bakteri kolonileri subkültürler yapılarak
saflaĢtırılmıĢ ve %25 gliserol içeren çözeltilerde -80 ºC‟de saklanmıĢtır.
Kullanılan katı besiyerlerinin formülleri aĢağıda belirtilmiĢtir:
Dilüe nutrient broth agar77
Nutrient broth
CaCl2.2H2O
Agar
Distile su
0,08 g
0,6 mmol
15 g
1000 ml‟ye tamamlanır.
R2A agar besiyeri (Becton-Dickinson, NJ- ABD)
33
Maya ekstraktı
0,5 g
Proteoz pepton No. 3
0,5 g
Kazoamino asitler
0,5 g
Dekstroz
0,5 g
Çözünebilir niĢasta
0,5 g
Di sodyum pirüvat
0,3 g
Di potasyum fosfat
0,3 g
Magnezyum sülfat
0,05 g
Agar
15 g
Distile su
1000 ml‟ye tamamlanır.
R2A ve dilüe nutrient sıvı ve katı besiyerleri otoklavda steril edilmiĢ ve
4 ºC‟de saklanmıĢtır. Besin değeri düĢük olan bu iki besiyerinin topraktan
daha fazla sayıda ve daha çeĢitli bakterinin izolasyonuna olanak sağladığı
bilinmektedir77,79,80.
Bakterilerin topraktan izole edilip saflaĢtırılarak stoklanmalarına dek
uygulanan bu iĢlemler ġekil 9’da Ģematize edilerek özetlenmiĢtir.
R2A veya DNBA
Antibiyotik içermeyen besiyeri
% 25 gliserol stok
Stoklama
500 µl sıvı besiyeri
Direncin ilk tespiti aşaması
Saflaştırma
Antibiyotik içeren besiyeri
250 µl % 50 gliserol
ġekil 9: Dirençli bakterilerin topraktan izolasyonu aĢamaları
34
III.4. Bakterilerin Antibiyotik Direnç Fenotiplerinin Belirlenmesi
Bakterilerin antibiyotik duyarlılıklarının belirlenmesinde agar dilüsyon
ve E-test yöntemleri kullanılmıĢtır.
3.4.1.Agar Dilüsyon Yöntemi ile Antibiyotik Duyarlılık Tayini
Agar
dilüsyon
testinde
test
edilecek
antimikrobik
ilacı
farklı
konsantrasyonlarda içerecek Ģekilde hazırlanmıĢ besiyerleri kullanılır 81. Bu
yöntem,
test
edilecek
antibiyotik
sayısı
az,
antibiyotik
duyarlılığı
belirlenecek mikroorganizma sayısı fazla olduğunda tercih edilebilecek bir
testtir.
Besiyerlerinin Hazırlanması
Antibiyotik duyarlılığının belirlenmesinde bakterilerin izolasyonunda
kullanılan besiyerleri olan R2A agar ve DNBA besiyerleri kullanılmıĢtır.
Besiyeri içinde son konsantrasyonu 8, 16, 32, 64, 128, 256 µg/ml olacak
Ģekilde
antibiyotikler
sıcaklığı
45-50
ºC‟ye
getirilmiĢ
besiyerlerine
eklenmiĢtir. Besiyerleri kullanılıncaya dek 4 ºC‟de saklanmıĢtır.
Ġnokülümün hazırlanması
35
Ġnokülum
süspansiyonu,
saf
olarak
elde
edilen
bakteri
kültür
hücrelerinden tek koloni alınarak sıvı besiyerinde (R2A sıvı besiyeri ve
DNB) hazırlanan bakteri kültürleri kullanılmak suretiyle hazırlanmıĢtır.
Kültürlerin bulanıklığı 0.5 McFarland standardına ayarlanmıĢ ve daha
sonra kuru besiyerlerinin üzerine her bir örnekten 2 µl damlatılmıĢtır (son
inokülum 105 CFU/ µl).
Ġnokülum noktaları agara absorbe olduktan sonra plaklar ters çevrilerek
oda sıcaklığında 2-3 gün inkübe edilmiĢtir. Üremeyi inhibe eden en düĢük
antimikrobik ilaç konsantrasyonu MĠK olarak belirlenmiĢtir.
Kontrol suĢları olarak S. aureus ATCC 25923 ve P. aeruginosa ATCC
27853 kullanılmıĢtır. Ayrıca bakteri süspansiyonları antibiyotik içermeyen
besiyerlerine ekilerek üreme kontrolleri yapılmıĢtır.
3.4.2.E-Test Yöntemi ile Antibiyotik Duyarlılık Tayini
E-test, difüzyon temeline dayanan ancak diskler yerine belirli ve sürekli
bir konsantrasyon değiĢimi olacak Ģekilde antibiyotik içeren plastik
Ģeritlerin kullanıldığı bir yöntemdir. Ġnkübasyon süresi sonunda, elips
Ģeklindeki inhibisyon alanının Ģeriti kestiği konsantrasyon MĠK (minimum
inhibitor konsantrasyon) olarak belirlenir.
Ġnokülümün hazırlanması
Her bir bakteri için alınan tek koloni 5 ml R2A ve 5 ml DNBA sıvı
besiyerine ekilmiĢ ve McFarland 0,5 bulanıklığına ulaĢan bakteri
süspansiyonu katı besiyerine steril eküvyon yardımıyla inoküle edilmiĢtir.
Bir süre besiyeri yüzeyinin kuruması beklendikten sonra ticari olarak
hazırlanmıĢ eritromisin ve tetrasiklin E-test® Ģeritleri (AB Biodisc, Solna,
36
Ġsveç) besiyerine yerleĢtirilmiĢ ve 24 ºC‟de 48 saat inkübe edildikten sonra
MĠK değerleri belirlenmiĢtir (Resim 1).
III.5. Genomik DNA’nın Ġzolasyonu
Tüm genomik DNA‟nın bakteri hücresinden izolasyonu, bu amaç için
hazırlanmıĢ ticari kit (MoBio PowerSoil™ DNA Isolation Kit, MoBio
Laboratories, CA-ABD) kullanılarak yapılmıĢtır. Bu kitin çalıĢma prensibi
sırasıyla Ģu basamaklardan oluĢur:
Örneğin homojenizasyonu
Mekanik ve kimyasal yöntemlerle hücrenin lizisi
Tüm genomik DNA‟nın silika membran tarafından tutulması
DNA‟nın yıkanarak membrandan elüsyonu
Üretici firmanın önerdiği protokol doğrultusunda kullanılan ticari kit ile
DNA izolasyonu Ģu Ģekilde gerçekleĢtirilmiĢtir: Sıvı besiyerinde kültürü
yapılan bakteriler santrifüj yardımıyla çöktürülerek konsantre edilmiĢ ve
besiyerinin tamamen uzaklaĢması sağlanmıĢtır. DNA‟yı stabilize ve
disperse eden tuzlardan oluĢan tampon çözeltisi ile DNA pelleti yeniden
süspansiyon haline getirilmiĢtir. Daha sonra hücrelerin lizisi için, SDS
(sodyum dodesil sülfat) içeren çözelti bakteri süspansiyonuna eklenmiĢtir.
Etkin bir lizis için bu karıĢım 65 ºC‟lik su banyosunda 10 dakika (3
dakikada bir vortekslenerek) tutulmuĢtur. Böylece mikrobiyal hücreden
nükleik asitlerin lizisi için kimyasal ve mekanik yöntemler birlikte
kullanılmıĢtır. Santrifüj sonrası süpernatan toplanmıĢ ve DNA dıĢı organik
ve inorganik materyallerin presipite edilerek uzaklaĢtırılması için yeni bir
çözelti eklenmiĢtir. Vortekslendikten sonra karıĢım 5 dakika boyunca 4
ºC‟de bekletilmiĢtir. Santrifüj sonrası süpernatan toplanmıĢtır. Yüksek
konsantrasyonda tuz çözeltisi ile tekrar vortekslenen çözelti filtre içeren
özel tüplere aktarılmıĢtır. Santrifüj iĢlemi ile DNA, filtre içindeki silika
37
membrana tutturulmuĢtur. Etanol içeren bir çözelti ile filtre yıkanmıĢtır.
Daha sonra filtreye elüsyon tamponu damlatılmıĢ ve santrifüj ile DNA
filtreden uzaklaĢtırılmıĢtır. Elde edilen genomik DNA örnekleri daha
sonraki iĢlemlerde kullanılmak üzere -20 ºC‟de saklanmıĢtır.
Her bir örnek, daha sonraki amplifikasyon iĢlemlerinde kullanılmadan
önce, jel elektroforez yöntemine tabi tutulmuĢ ve jel üzerinde uygun
büyüklükte tek bir bandın görülmesiyle izolasyon iĢleminin uygunluğu teyit
edilmiĢtir (Resim 2).
3.6. Bakterilerin Tanımlanması
Bakteriler 16S rRNA gen fragmanlarına ait nükleotid sekanslarının
belirlenmesi yoluyla tanımlanmıĢtır. Her bakteri türü yüksek değiĢkenlik ve
korunurlukta nükleik asit sekansı içeren en az bir 16S rRNA gen kopyası
içerir97. Bu yüksek değiĢkenlikteki bölge hedeflenerek bakteriler tür
düzeyinde tanımlanabilmektedir. ÇalıĢmalar göstermektedir ki bu kısa
rRNA
gen
sekanslarının
kullanılması
bakterinin
tanımlanmasında
genellikle baĢarılı olmaktadır25,82.
Bakterilerin sıvı besiyerinde kültürü hazırlandıktan ve genomik
DNA‟ları izole edildikten sonra tanımlanmaları için 16S rRNA geninin V3
bölgesi (Escherichia coli’de 341-534 nükleotidler arası) PZR yöntemi
kullanılarak amplifiye edilmiĢtir82.
3.6.1.Polimeraz
Zincir
Reaksiyonu
(PZR)
ile
16S
rRNA
Geninin
Amplifikasyonu
16S rRNA geninin V3 bölgesinin amplifikasyonu için LaPara ve ark.
larının tanımladığı primerler kullanılmıĢtır82. Primer dizileri Ģu Ģekildedir:
38
V3-341F:5‟-CCT ACG GGA GGC AGC AG-3‟ (E. coli pozisyonu 341-358)
V3-534R: 5‟-ATT ACC GCG GCT GCT GG-3‟ (E. coli pozisyonu 534-517)
PZR son reaksiyon karıĢımı 25 µl olacak Ģekilde kullanılan reaktifler
aĢağıda gösterildiği Ģekilde hazırlanmıĢtır:
PZR tamponu (10X)
dNTP mix (herbiri 2,5 mM)
Primer -1 (25 pmol/µl)
Primer - 2 (25 pmol/µl)
Ex Taq polimeraz (TaKaRa Bio)
Kalıp DNA
Apirojen distile su
2,5 µl
2,0 µl
0,5 µl
0,5 µl
0,1 µl
1 µl
18, 40 µl
PZR protokolü, 94 ºC‟de 10 dakika baĢlangıç denatürasyon fazından
sonra, 94 ºC‟de 30 saniye, 62 ºC‟de 30 saniye, 72 ºC‟de 2 dakika 28
döngü, son basamakta da 72 ºC‟de 8 dakika ve 4 ºC‟de saklama
basamaklarından oluĢmaktadır.
PZR, GeneAmp 9600 termal cycler (Applied Biosystems, Forster City,
CA-ABD) ile gerçekleĢtirilmiĢtir.
PZR ürünleri agaroz jel elektroforezi iĢlemine tabi tutulmuĢtur. Bu
amaçla %2 (a/h)‟lik agaroz jel hazırlanmıĢtır. Jelin hazırlanması sırasında
kullanılan 1X Tris-Borik asit-EDTA (TBE) tamponu aĢağıda formülü verilen
50X TBE tamponu dilüe edilerek hazırlanmıĢtır. 50X TBE tamponu Ģu
Ģekilde hazırlanmıĢtır83:
50X Tris-Borik asit-EDTA (TBE) Tamponu83
Tris baz
Borik asit (Sigma)
0,5 M EDTA (pH 8,0)
Steril distile su
54 g
27,5 g
20 ml
1000 ml‟ ye tamamlanır.
39
0,5 M EDTA (pH 8,0) Tamponu83
EDTA (Sigma)
Steril distile su
186,1 g
1000 ml‟ ye tamamlanır.
Uygun miktarlarda karıĢtırılan agaroz ve 1X TBE tamponu mikrodalga
fırında çözelti haline getirilmiĢ ve polimerleĢmesi için elektroforez tepsisine
dökülmüĢtür. Yüklemenin yapılacağı çukurların oluĢması için tarak jel içine
yerleĢtirilmiĢtir. Polimerizasyon tamamlanınca tarak çıkarılmıĢ ve tepsi 1X
TBE çözeltisi içeren elektroforez tankına alınmıĢtır. Üçer µl PZR ürünü ve
yükleme tamponu (Orange G) karıĢtırılarak her bir çukura konmuĢ ve 130
V akım uygulanarak elektroforez gerçekleĢtirilmiĢtir.
DNA‟nın boyanıp görüntülenebilmesi için jel etidyum bromür çözeltisi
içinde 20 dakika tutulmuĢtur. Daha sonra ultraviyole ıĢığı altında bilgisayar
ortamında görüntülenmiĢtir.
Elde edilen PZR ürünleri QIAquick PCR Purification Kit (QIAGEN, CAABD) kullanılarak saflaĢtırılmıĢtır. Bu kit ile 100 bp–10 kb büyüklüğünde
tek/çift zincirli DNA fragmanları içeren PZR ürünleri saflaĢtırılabilmektedir.
Üretici firmanın önerdiği protokol doğrultusunda PZR ürünleri aĢağıda
anlatıldığı Ģekilde saflaĢtırılmıĢtır: PZR ürününe guanidin hidroklorür ve
izopropanol içeren bir tampon eklenmiĢ ve çözeltinin renginin sarı olup
olmadığı kontrol edilmiĢtir (Sarı renk çözeltinin pH‟sının ≤7,5 olduğunu
göstermektedir. pH değeri metodun verimli çalıĢabilmesi açısından
önemlidir. Çözeltinin rengi sarı değil ise 3 M sodyum asetat çözeltisi, pH
5.0, ile ayarlanmalıdır.). Daha sonra PZR ürünü üretici tarafından sağlanan
kolona eklenmiĢ ve DNA‟nın kolona bağlanması sağlanmıĢtır. Yıkama
tamponu eklenmiĢ, santrifüjlenmiĢ ve süpernatan atılmıĢtır. Kolon temiz
baĢka bir ependorf tübüne aktarılmıĢtır. Kolondan DNA‟yı elüe etmek için
elüsyon tamponu (10mM Tris-Cl, pH 7.0- 8.5) eklenmiĢtir. Santrifüj sonrası
40
saf DNA elde edilmiĢtir. Bu örnekler kullanılıncaya kadar -20 ºC‟de
saklanmıĢtır.
Dizi analizi yapılmadan önce her bir örnekteki DNA konsantrasyonu
DU7500
spektrofotometresi
(Beckman,
CA-ABD)
kullanılarak
belirlenmiĢtir.
3.6.2. Dizi Analizi ÇalıĢmaları
SaflaĢtırılan PZR ürünlerinin dizi analizi tek zincir için (primer V3-341
Forward)
Illinois
Üniversitesi
Biyoteknoloji
Merkezi
tarafından
gerçekleĢtirilmiĢtir.
Bu merkezde dizi analizleri Sanger'in dideoksi enzimatik yöntemi ile
gerçekleĢtirilmektedir. ĠĢlem dizi analizi yapılacak DNA'nın hazırlanması,
reaksiyonlar ve yüksek voltaj jel elektroforezi olmak üzere üç ana
aĢamadan oluĢmaktadır. Bu yöntemde asimetrik amplifikasyon ile elde
edilen
tek
iplikçikli
DNA,
DNA
polimeraz
enzimi,
2',3'Dideoksinükleozidtrifosfat (ddNTP) ve radyoaktif olarak iĢaretlenmiĢ
dinükleozidtrifosfat
(dNTP)
kullanılır.
2',3'Dideoksinükleozidtrifosfat
(ddTTP, ddCTP, ddGTP, ddATP), klasik dNTP'lerden farklı olarak
deoksiriboz'un 3' noktasında hidroksil grubu taĢımamaktadır. 3' hidroksil
grubunun
olmaması
ardından
gelen
dNTP'lerin
fosfodiester
bağı
oluĢturmasını engeller. Doğal olarak DNA zincirinin daha fazla uzaması
engellenir. Bir ddNTP ile klasik dört dNTP aynı reaksiyon karıĢımının içine
konulduğunda, DNA zincir uzaması için aralarında bir yarıĢma olur ve
ddNTP‟nin bağlanması ile reaksiyon sonlanır. Bu reaksiyon sonucunda,
uzunluğu primer sonundan sonlanmaların olduğu bölgeye kadar olan DNA
parçaları ortaya çıkar. Her bir reaksiyon için bir
ddNTP kullanılarak
(A,C,G,T için) dört farklı enzimatik reaksiyon elde edilir84-86 .
41
3.6.3. BLAST Programı
Elde edilen diziler gen bilgi bankasında bulunan ilgili en yakın
sekanslarla
nükleotid-nükleotid
Blast
programı
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST) kullanılarak karĢılaĢtırılmıĢtır87,99
ġekil 10’da bakteri suĢlarının tanımlanması amacıyla yapılan iĢlemler
Ģematik olarak gösterilmiĢtir.
DNA‟nın
ekstraksiyonu
Bakteri
kültürü
PZR
341F VS 534R
Dizi analizi
BLAST programına
aktarma
Bakteri suĢunun
tanımlanması
ġekil 10: Bakterilerin tanımlanması deneyleri akıĢ Ģeması.
3.7. Antibiyotik Direnç Determinantlarının Genotipik Özellikleri
3.7.1. Tetrasiklin Direnç Genlerinin Saptanması
42
Ġzole edilen bakterilerden 46 tanesi temsili olarak seçilmiĢtir. Seçim
yapılırken, bilinen bakterilerle benzerlik oranı düĢük ve aynı zamanda MĠK
değerleri yüksek olan izolatlara öncelik verilmiĢtir. Bu izolatlarda tetrasiklin
direncinden sorumlu efluks genlerinden olan tet(C), tet(H), tet(Z) ve
ribozomal korunma mekanizmasından sorumlu tet(W), tet(M), tet(O),
tet(Q) genlerinin varlığı araĢtırılmıĢtır.
PZR-inhibe edici maddelerin negatif etkisini kontrol etmek amacıyla
16S rRNA da diğer örneklerle birlikte amplifiye edilmiĢtir.
PZR son reaksiyon karıĢımı 25 µl olacak Ģekilde kullanılan reaktifler
aĢağıda gösterildiği Ģekilde hazırlanmıĢtır15:
PZR tamponu (10X)
dNTP mix (herbiri 2,5 mM)
MgCl2
Primer-1 (25 pmol/µl)
Primer-2 (25 pmol/µl)
Amplitaq
gold
polimeraz
Biosystems)
Kalıp DNA
Apirojen distile su
(Applied
2,5 µl
2,0 µl
2,0 µl
0,5 µl
0,5 µl
0,25 µl
1 µl
16, 25 µl
Kullanılan PZR döngü programı Ģu Ģekildedir (tet(Z) ve tet (H) hariç)15:
1. 94 ºC‟de
10 dakika
2. 94 ºC‟de
30 saniye
3. Bağlanma sıcaklığı (Tablo 5)
30 saniye
4. 72 ºC‟de
2 dakika
5. 2-4. basamakların 40 kez tekrarlanması
6. 72 ºC‟de
10 dakikadan oluĢmaktadır.
7. 4 ºC‟de saklama
Tet(Z) ve tet (H) geni için kullanılan PZR döngü programı Ģu
Ģekildedir15:
1. 94 ºC‟de
2. 94 ºC‟de
3. 68 ºC‟de
10 dakika
30 saniye
30 saniye
43
4. 72 ºC‟de
30 saniye
5. 2-4. basamakların 35 kez tekrarlanması
6. 94 ºC‟de
30 saniye
7. 63 ºC‟de
30 saniye
8. 72 ºC‟de
30 saniye
9. 6 -8. basamakların 15 kez tekrarlanması
10. 72 ºC‟de
30 saniye
11. 4 ºC‟de saklama
PZR, GeneAmp 9600 termal cycler (Applied Biosystems, Forster City,
CA-ABD) ile gerçekleĢtirilmiĢtir.
Elektroforez ve DNA‟nın boyanıp görüntülenmesi iĢlemleri III.6.1.
bölümünde anlatıldığı gibi gerçekleĢtirilmiĢtir.
Hedeflenen her bir tetrasiklin direnç geni için kullanılan primerler ve
özellikleri Tablo 5’de gösterilmiĢtir.
Tablo 5: Tet genlerinin PZR ile amplifikasyonunda kullanılan primerler ve
88
özellikleri
44
Primer
Hedef gen
Dizilim (5´-3´)
Bağlanma (annealing) Amplikon
sıcaklığı (ºC)
büyüklüğü
(bp)
tetC-FW
tet(C)
tetC-RV
tetH-FW
tet(H)
tet(M)
tet(O)
tet(Q)
tetW-RV
185
ACAGAAAGCTTATTATATAAC
55
171
ACGGARAGTTTATTGTATACC
60
170
AGAATCTGCTGTTTGCCAGTG
63
166
60
203
64
167
CGGAGTGTCAATGATATTGCA
tet(Z)
tetZ-RV
tetW-FW
66
TGGCGTATCTATAATGTTGAC
tetQ-RV
tetZ-FW
CAGTGAAAATTCACTGGCAAC
TGGCGTGTCTATGATGTTCAC
tetO-RV
tetQ-FW
206
ATCCAAAGTGTGGTTGAGAAT
tetM-RV
tetO-FW
70
GCGTAGAGGATCCACAGGACG
tetH-RV
tetM-FW
GCGGGATATCGTCCATTCCG
CCTTCTCGACCAGGTCGG
ACCCACAGCGTGTCCGTC
tet(W)
GAGAGCCTGCTATATGCCAGC
GGGCGTATCCACAATGTTAAC
3.7.2. Eritromisin Direnç Genlerinin Saptanması
On sekiz örnekte primerler 6 farklı eritromisin rRNA metilaz direnç
genini (erm A,B,C,F,G,Q) amplifiye etmek için kullanılmıĢtır. Eritromisin
direnç genlerinin belirlenmesi için multipleks PZR yöntemi kullanılmıĢtır.
PZR son reaksiyon karıĢımı 25 µl olacak Ģekilde kullanılan reaktifler
aĢağıda gösterildiği Ģekilde hazırlanmıĢtır:
2X qiagen multipleks PZR master mix
10X primer karıĢımı (2µM herbir primerden)
Kalıp DNA
12,5 µl
2,5 µl
1 µl
45
9 µl
Apirojen distile su (RNase free)
Kullanılan PZR döngü programı Ģu Ģekildedir :
1. 95 ºC‟de
15 dakika
2. 94 ºC‟de
30 saniye
3. 60 ºC‟de
90 saniye
4. 72 ºC‟de
90 saniye
5. 2-4. basamakların 27 kez tekrarlanması
6. 72 ºC‟de
10 dakika
7. 4 ºC‟de saklama
PZR, GeneAmp 9600 termal cycler (Applied Biosystems, Forster
City, CA-ABD) ile gerçekleĢtirilmiĢtir.
Elektroforez ve DNA‟nın boyanıp görüntülenmesi iĢlemleri 3.6.1.
bölümünde anlatıldığı gibi gerçekleĢtirilmiĢtir. Farklı olarak %4 (a/h)‟lük
agaroz jel hazırlanmıĢtır ve elektroforez tamponu olarak kullanılan 1X TAE
tamponu kullanılmıĢtır. 1X TAE tamponu 50X stok çözeltiden dilüe edilerek
hazırlanmaktadır. 50X Tris-Asetat-EDTA (TAE) tamponu Ģu Ģekilde
hazırlanmaktadır83:
50X Tris-Asetat-EDTA (TAE) Tamponu83
Tris baz
Glasiyal asetik asit
0,5 M EDTA (pH 8,0)
Steril distile su
242 g
51,1 ml
100 ml
1000 ml‟ ye tamamlanır.
Hedeflenen her bir eritromisin direnç geni için kullanılan primerler
ve özellikleri Tablo 6‟da gösterilmiĢtir.
Tablo 6: Erm genlerinin PZR ile amplifikasyonunda kullanılan primerler ve
89
özellikleri
46
Primer
Hedef gen
Dizilim (5´-3´)
Bağlanma (annealing) Amplikon
sıcaklığı (ºC)
büyüklüğü
(bp)
ermA-FW
erm(A)
ermA-RV
ermB-FW
erm(B)
Erm(C)
Erm(F)
ermQ-RV
65
191
AATCGTGGAATACGGGTTTGC
63
293
TCTGGGAGGTTCCATTGTCC
65
424
63
255
68,60
154
TTCAGGGACAACTTCCAGC
Erm(G)
ermG-RV
ermQ-FW
GGTTGCTCTTGCACACTCAAG
CGTCAATTCCTGCATGTTTTAAGG
ermF-RV
ermG-FW
157
CAGTTGACGATATTCTCGATTG
ermC-RV
ermF-FW
63
CAAGAACAATCAATACAGAGTCTAC
ermB-RV
ermC-FW
AGTCAGGCTAAATATAGCTATC
GTGAGGTAACTCGTAATAAGCTG
CCTCTGCCATTAACAGCAATG
erm(Q)
CACCAACTGATATGTGGCTAG
CTAGGCATGGGATGGAAGTC
4. BULGULAR
4.1. Bakterilerin Topraktan Ġzolasyonu
Tarlanın her iki parselinden (kuzey ve güney) Tablo 4„te belirtilen
tarihlerde alınan toprak örneklerinden izole edilen ve subkültürleri
yapılarak saf olarak elde edilen bakterilerin gliserol stokları hazırlanmıĢ ve
-80 ºC‟de saklanmıĢtır (ġekil 9).
47
Bakterilerin topraktan izolasyonunun ilk aĢamasında dilüsyon çözeltisi
olarak Winogradsky tuz çözeltisi kullanılmıĢtır. Tetrasiklin ve eritromisin
dirençli bakterilerin seçilebilmesi için bu antibiyotikleri içeren (20 µg/ml)
R2A agar ve dilüe nutrient broth agar besiyerleri kullanılmıĢtır. Ayrıca
besiyerlerine 25 µg/ml natamisin (primarisin) mantar kontaminasyonunu
önlemek üzere eklenmiĢtir. Bu besiyerlerinde görülen üreme bakterilerin
ilgili antibiyotiğe dirençli olduğunun ilk göstergesi olarak kabul edilmiĢ ve
daha sonra MĠK profilleri antimikrobik duyarlılık testleriyle belirlenmiĢtir.
Tarlaya gübre uygulamasından bir gün önce (Alım), uygulamadan bir
gün sonra (Alım1) , 3 hafta sonra (Alım2) ve 3 ay sonra (Alım3) tarlanın
her iki parselinden alınan toprak örneklerinden izole edilen bakterilerin
sayısı Tablo 7‟de verilmiĢtir.
Tablodan da anlaĢıldığı gibi gübre ve topraktan toplam 325 örnek izole
edilmiĢtir. Bu izolatların %65‟i tanımlanmıĢtır.
Tablo 7: Toprak ve gübre örneklerinden izole edilen antibiyotik dirençli bakterilerin
elde edildikleri bölge ve zaman bakımından dağılımı
A. Toplam izolat sayısı
GÜNEY
PARSEL
*X
KUZEY
PARSEL
20
ALIM1 (1 GÜN SONRA)
38
34
72
ALIM2 (3 HAFTASONRA)
ALIM3 (3 AY SONRA)
54
74
23
41
76
115
TOPLAM
166
118
284
TOPRAK
ALIM
TOPLAM
20
48
GÜBRE
Çukur gübresi
Lagün gübresi
TOPLAM
26
15
41
GÜNEY
PARSEL
KUZEY
PARSEL
ALIM
X
20
20
ALIM1 (1 GÜN SONRA)
22
32
59
ALIM2 (3 HAFTA SONRA)
36
16
55
ALIM3 (3 AY SONRA)
21
33
53
TOPLAM
79
101
180
GÜBRE
Çukur gübresi
Lagün gübresi
22
11
B. TanımlanmıĢ izolatların sayısı
TOPRAK
TOPLAM
TOPLAM
33
*: Güney parseline ait Alım örnekleri bulunmamaktadır.
4.2. Bakterilerin Antibiyotik Direnç Fenotiplerinin Belirlenmesi
Dirençli bakterilerin seçimi bakterilerin antibiyotik içeren plaklara (20
µg/ml) ekilmesi yoluyla izolasyon aĢamasında yapılmıĢtır. Ancak hem
kontrol hem de direncin minimum inhibisyon konsantrasyonu (MĠK)
düzeyinde belirlenmesi amacıyla agar dilüsyon ve E-test antibiyotik
duyarlılık testleri uygulanmıĢtır. Resim 1‟de duyarlı ve dirençli iki farklı
izolata ait E-test plakları görülmektedir. Elips Ģeklindeki inhibisyon alanının
Ģeriti kestiği bölgede okunan değer MĠK değeri olarak belirlenmiĢtir.
49
Resim 1: E-test yöntemiyle antibiyotik duyarlılığı ölçülmüĢ iki bakteri
TanımlanmıĢ
tanımlanmamıĢ
izolatlar
4
izolatın
içinden
seçilen
antibiyotik
124
duyarlılığı
izolatın
(%58)
ve
belirlenmiĢtir.
Bu
örneklerden 101‟i topraktan 27‟si gübreden izole edilen örneklerdir. CLSI‟
nın dökümanları referans alınarak tetrasiklin için yorumlama kriteri
(breakpoint değeri) ≥16 µg/ml kabul edilmiĢtir. Toprak örneklerinin %68‟i
ve gübre örneklerinin %70‟i tetrasikline dirençli bulunmuĢtur. Ayrıca çukur
gübresinden alınan örneklerde direnç oranı %74‟tür ve lagünden alınan
örneklerin
direnç
oranından
(%62.5)
daha
yüksektir.
Bununla beraber toprak örneklerinin %42‟sinin MĠK değeri ≥256 µg/ml
olarak bulunmuĢtur.
w
Eritromisin için yorumlama kriteri CLSI‟nın dökümanları referans kabul
edilerek ≥8 µg/ml olarak alınmıĢ ve toprak örneklerinin %97‟sinin ve gübre
örneklerinin %67‟sinin eritromisine dirençli olduğu bulunmuĢtur. Toprak
örneklerinin %88‟inin MĠK değeri ≥256 µg/ml olarak bulunmuĢtur.
Toprak örneklerinin %69‟u, gübre örneklerinin ise %44‟ ü eritromisin ve
tetrasiklinin her ikisine birden dirençlidir.
50
Grafik 1 ve 2‟de bakterilerin eritromisin ve tetrasiklin duyarlılık profilleri
görülmektedir.
100
Bakteri Sayısı (%)
80
60
40
20
0
≤8
9-16
% tet direncli bakteri
% erm direncli bakteri
17-32
33-64
MĠK Değerleri (µg/ml)
65128
129≥256
Grafik 1: Topraktan izole edilen bakterilerin antibiyotik direnç profilleri
Bakteri sayısı (%)
100
80
60
40
20
0
≤8
9-16
17-32
33-64
% tet direncli bakteri
% erm direncli bakteri
65128
129≥256
MİK Değerleri (µg/ml)
Grafik 2: Gübreden izole edilen bakterilerin antibiyotik direnç profilleri
Sonuçlar türler açısından değerlendirilmiĢ ve Ģu bulgulara ulaĢılmıĢtır:
Antibiyotik duyarlılığı belirlenmiĢ 22 gram pozitif bakterinin 20‟si (%90‟ı),
51
102 gram negatif bakterinin ise %94‟ü eritromisine karĢı dirençlidir. Bu
gram negatif bakterilerden 10 tanesi gübreden izole edilmiĢtir.
Topraktan ve gübreden izole edilen bakteriler eritromisin direnci
yönünden cins düzeyinde değerlendirildiğinde, tüm cinslerde (Haloenella
hariç) dirençli suĢların bulunduğu görülmektedir. AĢağıda sayılan cinslere
ait tüm izolatlar eritromisine dirençlidir: Stenotrophomonas, Lysobacter,
Cellvibrio,
Variovorax,
Bradyrhizobium,
Phenylobacterium,
Rhodocista,
Caulobacterium,
Chryseobacterium,
Burkholderia,
Sphingomonas, Ahrensia, Flavobacterium, Bacteroidetes, Empedobacter,
Corynebacterium,
Flexibacteriaceae,
Mycobacterium,
Enterococcus, Salinibacterium, Agrococcus ve
Streptomyces,
Staphylococcus. Bunun
yanında Pseudomonas suĢlarının %93‟ü, Dyella ve Acinetobacter
suĢlarının %83‟ü, Microbacterium suşlarının %75’i ve Bacillus suĢlarının
%50‟si eritromisine dirençlidir.
Sonuçlar tetrasiklin için değerlendirildiğinde antibiyotik duyarlılığı
belirlenmiĢ 22 gram pozitif bakterinin 18‟i (%82), 102 gram negatif
bakterinin ise %66‟sı tetrasikline dirençli bulunmuĢtur.
Topraktan ve gübreden izole edilen bakteriler tetrasiklin direnci
yönünden cins düzeyinde değerlendirildiğinde, tüm cinslerde dirençli
izolatların bulunduğu görülmektedir.
tetrasikline
dirençli
olduğu
Stenotrophomonas,
Hatta bazı cinslerde tüm suĢların
görülmektedir.
Lysobacter,
Phenylobacterium,
Caulobacterium,
Chryseobacterium,
Haloanella,
Flexibacteriaceae,
Mycobacterium,
Bu
Ģunlardır:
cinsler
Acinetobacter,
Variovorax,
Bradyrhizobium,
Rhodocista,
Cellvibrio,
Bacteroidetes,
Streptomyces,
Salinibacterium,
Agrococcus, Bacillus ve Staphylococcus‟u kapsamaktadır. Bunun yanında
Burkholderia
suĢlarının
Microbacterium
%88‟i,
suĢlarının
Flavobacterium
%75‟i,
Enterococcus
suĢlarının
suĢlarının
%66‟sı,
%60‟ı,
52
Corynebacterium ve Dyella suĢlarının %50‟si ve Pseudomonas suĢlarının
%35‟i tetrasikline dirençli bulunmuĢtur.
Sonuçlar
tarlanın
parseli
ve
örnek
alınma
zamanı
açısından
değerlendirildiğinde tetrasiklin direnci ile ilgili olarak Ģu değerlendirmeler
yapılabilir: Toprağa gübre uygulanmasından önce ve sonra izole edilen
bakteri suĢlarında tetrasiklin direnç oranı değerlendirildiğinde, gübre
uygulanmadan önce (Alım) bu oran %87,5 iken uygulamadan bir gün
sonra (Alım1) %94,4; 3 hafta sonra (Alım2) %67 ve 3 ay sonra (Alım3) ise
%56 olduğu görülmektedir. Gübre örneklerinden izole edilen bakterilerde
direnç oranı %68‟dir.
En fazla sayıda dirençli izolat sırasıyla güney parselinden alınan Alım2
(%20), kuzey parselinden alınan Alım3 (%18) ve kuzey Alım1 (%16)
toprak örneklerinde saptanmıĢtır.
Toprağa gübre uygulamasından önce ve sonra izole edilen bakteri
suĢlarında
eritromisin
direnç
oranı
değerlendirildiğinde,
gübre
uygulanmadan önce (Alım) eritromisine direnç %100 iken uygulamadan bir
gün sonra (Alım1) %94; 3 hafta sonra (Alım2) %97 ve 3 ay sonra (Alım3)
ise %100‟e çıktığı görülmektedir. Gübre örneklerinden izole edilen
bakterilerde direnç oranı %71‟dir.
En fazla sayıda dirençli izolat kuzey parselinden alınan Alım3 (%30),
güney parselinden alınan Alım2 (%23) ve kuzey parselinden alınan Alım1
(%16) toprak örneklerinde saptanmıĢtır.
4.3. Genomik DNA’nin Ġzolasyonu
Genomik DNA izolasyonu ticari bir kit (MoBio PowerSoil™ DNA
Isolation Kit, MoBio Laboratories, CA-ABD) ile gerçekleĢtirilmiĢtir. Daha
53
sonra agaroz jel elektroforezine tabi tutularak DNA‟nın kalitesi kontrol
edilmiĢtir.
Resim 2‟de izole edildikten sonra genomik DNA‟nın
agaroz jel
elektroforezinde verdiği bantlar görülmektedir.
1
18
A
Genomik DNA
B
Sıra 1 ve 18: 1 kb DNA marker
(A)
(B)
Sıra 2 : E16
T11
Sıra 3 : E15
ET16
Sıra 4: E14
ET10
Sıra 5: E13
ET9
Sıra 6: E12
ET8
Sıra 7: E11
ET7
Sıra 8: E10
ET2
Sıra 9: E9
E12
Sıra 10: E8
E24
Sıra 11: E7
E23
Sıra12: E6
E22
Sıra 13: E5
E21
Sıra 14: E4
E20
Sıra 15;E3
E19
Sıra 16:E2
E18
Sira 17:E1
E17
Resim 2: Genomik DNA’nin agaroz jel elektroforezinde görülen bantları
4.4. Bakterilerin Tanımlanması
Bakteriler 16S rRNA gen fragmanlarına ait nükleotid sekanslarının
belirlenmesi yoluyla tanımlanmıĢtır.
4.4.1. Polimeraz Zincir Reaksiyonu (PZR) ile 16S rRNA Geninin
Amplifikasyonu
16S rRNA geninin V3 bölgesi (Escherichia coli’ de 341-534 nükleotidler
arası) PZR yöntemi kullanılarak amplifiye edilmiĢtir. PZR ürünlerinin uygun
büyüklükte olup olmadığı agaroz jel elektroforezi yöntemi ile örnekler ve
marker karĢılaĢtırılarak saptanmıĢtır. Uygun yerde band vermeyen veya
54
zayıf band veren örnekler için PZR tekrarlanmıĢtır. Elde edilen PZR
ürünleri QIAquick PCR Purification Kit (QIAGEN, CA-ABD) kullanılarak
saflaĢtırılmıĢtır.
Resim 3‟ te PZR yöntemi ile amplifikasyonu yapılmıĢ bazı örneklerin bir
agaroz jel elektroforezi fotoğrafı görülmektedir.
1
14
1636 bp
506 bp
V3 Fragmanı
220 bp
Sıra 14: 1 kb DNA marker
Sıra 1 : Pozitif kontrol
Sıra 2 : Negatif kontrol
Sıra 3 : T2
Sıra 4: T1
Sıra 5: E31
Sıra 6: E29
Sıra 7: E19
Sıra 8: ET16
Sıra 9: ET10
Sıra 10: ET6
Sıra 11: ET4
Sıra12: ET2
Sıra 13: ET1
Resim 3: 16S rRNA geninin V3 fragmanının PZR ile amplifikasyonu
4.4.2. Dizi Analizi ÇalıĢmaları
SaflaĢtırılan
PZR
ürünlerinin
dizi
analizleri
Illinois
Üniversitesi
Biyoteknoloji Merkezi (https://unicorn.biotec.uiuc.edu) tarafından Sanger'in
dideoksi enzimatik yöntemi kullanılarak gerçekleĢtirilmiĢtir.
4.4.3. BLAST Programı
Elde edilen diziler, GenBank bilgi bankasında bulunan bilinen en yakın
dizilerle nükleotid-nükleotid Blast (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST)
programı kullanılarak karĢılaĢtırılmıĢtır.
Proteobacteria, Bacteroidetes, Actinobacteria, Firmicutes olmak üzere
4 farklı Ģubeden toplam 213 bakteri tanımlanmıĢtır.
55
Topraktan izole edilen tüm bakterilerin % 69‟ u Proteobacteria Ģubesine
ait olup bu Ģubenin 4 takımına (alpha-proteobacteria, beta-proteobacteria,
gamma-proteobacteria,
epsilon
delta-proteobacteria)
ait
bakteriler
bulunmaktadır. Ġzole edilen diğer gram negatif bakteriler Bacteroidetes
Ģubesine ait olup bu Ģubeden 2 aileye ait bakteriler izole edilmiĢtir. Gram
pozitif bakteriler Actinobacteria ve Firmicutes olmak üzere iki farklı Ģubeye
aittir. Actinobacteria Ģubesinden 5 aileye ait izolatlar elde edilmiĢtir.
Firmicutes Ģubesi Lactobacillales ve Bacillales takımlarına ait bakterilerden
oluĢmaktadır.
Gram negatif bakteriler toplam 180 toprak örneğinin % 84‟ünü, çukur
ve lagün olmak üzere toplam 33 gübre örneğinin % 41‟ini oluĢturmaktadır.
Bu
dağılım
toprak
bakterilerinin
normal
dağılımı
ile
parelellik
göstermektedir90.
Tablo 8„de 16S rRNA geninin amplifikasyonu ile tanımlanan izolatların
dağılımı verilmektedir.
56
Tablo 8: Topraktan ve gübreden izole edilen bakterilerin filogenetik özellikleri
ġube
Takım
Ġzolat
sayısı
Aile grupları
31
Bradyrhizobiaceae
Phyllobacteriaceae
Caulobacteraceae
Sphingomonadaceae
Rhodospirillaceae
Rhodobacteraceae
Rhizobiaceae
Beijerinckiaceae
Methylobacteriaceae
Brucellaceae
Aile
gruplarının
izolat sayısı
8
6
4
1
1
1
1
1
1
1
Betaproteobacteria
37
Burkholderiaceae
Comamonadaceae
Rhodocyclaceae
29
3
1
Gammaproteobacteria
80
Pseudomonadaceae
Xanthomonadaceae
Moraxellaceae
42
25
8
Bacteroidetes
Epsilonproteobacteria
Sphingobacteria
1
8
Campylobacteraceae
Flexibacteraceae
Sphingobacteriaceae
1
4
4
Actinobacteria
Flavobacteria
Actinobacteridae
8
32
Lactobacillales
Bacillales
16
Flavobacteriaceae
Microbacteriaceae
Mycobacteriaceae
Corynebacteriaceae
Nocardioidaceae
Streptomycetaceae
Enterococcaceae
Staphylococcaceae
Bacillaceae
8
10
7
5
5
4
6
4
4
Proteobacteria Alphaproteobacteria
Firmicutes
57
Paenibacillaceae
2
4.5. Antibiyotik Direnç Determinantlarının Genotipik Özellikleri
4.5.1.Tetrasiklin Direnç Genlerinin Saptanması
Seçilen 46 izolatta tetrasiklin direncinden sorumlu efluks genlerinden
olan tet(C), tet(H), tet(Z) ve ribozomal korunma mekanizmasından sorumlu
tet(M), tet(O), tet(Q), tet(W) genlerinin varlığı araĢtırılmıĢtır. tet(H) ve tet(Z)
genleri için farklı PZR programı ve reaksiyon karıĢımları hazırlanmıĢtır.
PZR-inhibe edici maddelerin negatif etkisini kontrol etmek amacıyla
16S rRNA diğer örneklerle birlikte tüm reaksiyonlara eklenmiĢtir.
Tetrasiklin direnç fenotipleri belirlenmek üzere seçilen 46 örnekte 6
farklı direnç geni araĢtırılmıĢ ve 24 suĢta direnç genine rastlanmıĢtır.
Resim
4‟te
PZR
sonrası
elde
edilen
ürünlerin
agaroz
jel
elektroforezinde tet(Q) geni için verdiği bantlar görülmektedir.
58
Pozitif kontrol
CN14G-2
Negatif
kontrol
CN3G-11
Pozitif kontrol
Resim 4: Ġki farklı izolatta tet(Q) gen bölgelerinin agaroz jel elektroforez
görüntüleri
Tablo 9‟da tetrasiklin direnç genlerinin bakteri suĢlarına ve örneklerin
alınma zamanına göre dağılımı görülmektedir.
Tabloda da görüldüğü gibi tet(C), tet(O) altıĢar izolattan olmak üzere
en sık saptanan tetrasiklin direnç genleridir. tet(Z) 4 farklı izolatta; tet(H),
tet(W) ve tet(Q) 2 ayrı izolatta ve tet(M) de 1 izolatta saptanmıĢtır. Gübre
izolatlarından biri (PM-1) tet(C), tet(H), tet(O) genlerini, bir diğeri de (PMae) tet(M), tet(O), tet(W) genlerini birlikte taĢımaktadır.
Toprak ve gübre örnekleri taĢıdıkları direnç genleri yönünden
karĢılaĢtırıldıklarında; tet(Q) direnç geni sadece toprak izolatlarında ve
tet(W) ve tet(M) direnç genleri ise sadece gübre izolatlarında bulunmakta
iken diğer tüm tetrasiklin direnç genlerinin hem toprak hem gübre
izolatlarında saptandığı görülmüĢtür.
59
Tetrasiklin direnç genleri, gübrenin toprağa uygulanması öncesi (alım),
bir gün sonra (Alım1), 3 hafta sonra (Alım2) ve 3 ay sonra (Alım3) alınan
örneklerden izole edilen dirençli suĢlarda bulunmuĢtur.
Gübre
izolatlarında
tetrasiklin
direnç
genlerini
β-proteobacteria
takımına ait bakteriler ve gram pozitif bakteriler taĢımaktadır.
4.5.2.Eritromisin Direnç Genlerinin Saptanması
Toplam 18 izolat eritromisin direnç genleri yönünden değerlendirilmiĢ
ve her ikisi de gübreden izole edilmiĢ olan 2 izolatta erm(Q) genine
rastlanmıĢtır.
Tablo 9: Tetrasiklin direnç genlerinin bakteri suĢlarına ve örneklerin alınma
zamanına göre dağılımı
Gen
Tet(C)
Tet(H)
Tet(Z)
Pseudomonas sp
Toprak
Örnek alım
zamanı
alım3
Pseudomonas sp
Toprak
alım1
Burkholderia pyrrocinia
Toprak
alım1
Beta proteobacteria
Gübre
Acinetobacter baumannii
Toprak
alım1
Lysobacter
Toprak
alım
Agrococcus
Toprak
alım1
Burkholderia pyrrocinia
Toprak
alım 1
Beta proteobacteria
Gübre
Burkholderia pyrrocinia
Toprak
Streptomyces spp.
Gübre
Streptomyces atrovirens
Toprak
Microbacterium
Gübre
Bakteriler
Örnek
alım 1
alım 2
60
Tet(M)
Staphylococcus simulans
Gübre
Tet(O)
Burkholderia stabilis
Toprak
Beta proteobacteria
Gübre
Dyella japonica
Toprak
alım
Flavobacterium
Toprak
alım3
Staphylococcus simulans
Gübre
Bradyzobium elkanii
Toprak
alım3
Burkholderia pyrrocinia
Toprak
alım
Chryseobacterium joostei
Toprak
alım
Staphylococcus simulans
Gübre
Enterococcus sp
Gübre
Tet(Q)
Tet(W)
alım3
5. TARTIġMA
Antibiyotik direnci tüm dünyada yaygın olarak görülen ve hastalıkların
tedavisinde karĢılaĢılan çok ciddi bir sorundur. Antibiyotiklerin bilinçli
kullanımı direncin geliĢimini önlemede veya yavaĢlatmada son derece
önemlidir. Ülkemiz de dahil olmak üzere tüm dünyada antibiyotik
tüketiminde
akılcı
yaklaĢımlara
kullanımını
antibiyotiklerin
ihtiyaç
sınırlamak
vardır.
Pek
çok
amacıyla
ülkede
politikalar
oluĢturulmaktadır.
Avrupa Birliği‟ne üye ülkelerde antibiyotiklerin hayvancılık alanında
terapötik amaçlar dıĢında kullanımı yasaklanmıĢ iken Amerika BirleĢik
Devletleri‟nde tarım ve hayvancılıkta antibiyotik kullanımını sınırlayan yasa
taslağı Amerikan Kongresi‟nde halen görüĢülmektedir. Ülkemizde de
Tarım ve KöyiĢleri Bakanlığı‟nca yem katkı maddesi olarak bazı
antibiyotiklerin
kullanımını
yasaklanmıĢtır.
Hayvancılıkta
antibiyotik
61
kullanımının antibiyotik direncine olan direkt etkisinin gösterilmesinde
çeĢitli zorluklar vardır. Bu nedenle bu konu dünyada halen tartıĢılmaktadır
ve çok sayıda çalıĢmalar yürütülmektedir.
Antibiyotikler hayvancılıkta tedavi, profilaksi ve büyümeyi hızlandırmak
amacıyla kullanılmaktadır1-7. Bu antibiyotiklerin %75‟lere varan oranda
hayvanlar
tarafından
absorblanmayıp
idrar
ve
feçesle
atıldığı
bilinmektedir36,95. Bu nedenle ahır gübrelerinin, toprak ve yer altı sularının
antibiyotik ile kontaminasyonuna yol açtığı düĢünülmektedir15,16,27. Bu
kontaminasyonun çevresel ortamlarda yaĢayan mikroorganizmaların
antibiyotik direnci geliĢtirmelerine yönelik seçici etkisi araĢtırmacıların
üzerinde önemle durdukları konulardan biridir 33,42,43.
Hayvanların yemine ve içme suyuna terapötik dozlarının altında belli bir
düzeyde hergün eklenen antibiyotiklerin özellikle hayvanların sindirim
sisteminde bulunan bakteriler arasında direncin seçimine ve yayılımına
olan etkisini aydınlatmak üzere pek çok çalıĢma yapılmaktadır11,45-47,96.
Önemli bir diğer konu da, gübre içinde bulunan patojen ve/veya
kommensal bakterilerin taĢıdığı direnç genleri ve bunların yanı sıra serbest
halde bulunan direnç genlerinin toprak ve yeraltı suları gibi çevresel
ortamlarda bakteriler arasında aktarımıdır67.
Tüm bu etkenlerin değerlendirilmesi amacıyla yapılan çalıĢmaların
büyük bir kısmı da hayvan dıĢkısının gübreleme yoluyla toprağa
uygulanmasının sonuçlarını değerlendirmeye yöneliktir23-26,75,91.
Bu çalıĢmada domuz yetiĢtirme çiftliği çevresinde bulunan bir tarlaya
gübre uygulanmasının toprakta bulunan bakterilerin fenotipik ve genotipik
direnç durumlarına olan etkisi araĢtırılmıĢtır. Sonuçlar yukarıda sayılan bu
iki faktör ıĢığında değerlendirilmiĢtir.
62
Toprak örnekleri, hayvancılık yapılan bir çiftliğin yakınında bulunan
soya fasülyesi tarlasından alınmıĢtır. Bu çiftlikte hayvanların yemlerine
sürekli eklenmek suretiyle klortetrasiklin; tedavi ve profilaksi amacıyla
gerektiğinde penisilin ve taylosin kullanılmaktadır. Hayvanlardan elde
edilen gübre tarlaya uygulanmaktadır. Tarla, örneklerin toplanması için
kuzey ve güney olmak üzere iki parsele ayrılmıĢtır. Toprak örnekleri, 20052006 yıllarında gübre tarlaya uygulanmadan bir gün önce, bir gün sonra, 3
hafta sonra ve 3 ay sonra alınmıĢtır. Ayrıca toprağa uygulanmadan önce
gübre örnekleri de alınmıĢtır.
Bakteriler
topraktan
seçici
(selektif)
olmayan,
besin
maddeleri
yönünden zayıf R2A ve dilüe nutrient broth agar (DNBA) kullanılarak izole
edilmiĢtir. Reasoner ve Geldreich tarafından geliĢtirilen R2A agarın, uzun
inkübasyon koĢullarında ve düĢük inkübasyon sıcaklığında üreyen
heterotrof bakterilerin izolasyonunda kullanımı tavsiye edilmektedir79.
DNBA besiyeri belli oranda sulandırılmıĢ nutrient sıvı besiyerine agar
eklenerek hazırlanan bir besiyeridir. Janssen ve ark.ları yaptıkları bir
çalıĢmada bu besiyerinin topraktan nadiren izole edilebilen bakterilerin
kültüre edilebilme özelliğini arttırdığını söylemiĢlerdir77. Gübre örnekleri
için ek olarak triptik soy agar (TSA) besiyeri gübrenin zengin besin
içeriğine benzer bir ortam sağlaması için izolasyon çalıĢmalarına
eklenmiĢtir.
Topraktan ve gübreden sırasıyla 284 ve 41 bakteri izole edilmiĢ,
saflaĢtırılarak stok çözeltileri hazırlanmıĢtır.
Tetrasiklin hayvancılıkta en sık kullanılan antibiyotiklerin baĢında
gelmektedir. Bir makrolid antibiyotik olan taylosinin de bu alanda kullanımı
çok yaygındır. Bu nedenle bu çalıĢmada tetrasiklin ve taylosin ile etki ve
direnç mekanizmaları aynı olan eritromisin kullanılmıĢtır. Tetrasiklin ve
63
eritromisine dirençli bakterilerin seçimi öncelikle son konsantrasyonu 20
µg/ml olacak Ģekilde antibiyotik eklenmiĢ besiyerlerine ekim yapılarak
gerçekleĢtirilmiĢtir. Daha sonra agar dilüsyon ve E-test duyarlılık testleri
yapılarak minimum inhibisyon konsantrasyonları (MĠK) belirlenmiĢtir. Bu
Ģekilde tanımlanan
bakterilerin %58‟inin antibiyotik direnç fenotipi
belirlenmiĢtir.
Örnekler
toprak
ve
gübre
olarak
ayrılıp
bakterilerin
direnci
değerlendirildiğinde hem toprak hem de gübre izolatlarında eritromisin ve
tetrasikline karĢı yüksek oranda direnç tespit edilmiĢtir. Gübreden izole
edilen bakterilerde saptanan eritromisin ve tetrasikline direnç oranı
birbirine yakındır (sırasıyla %67 ve %70); ancak toprak örneklerinde %97
düzeyinde bulunan eritromisin direnci tetrasiklin direncinin çok üzerindedir.
CLSI‟nın dökümanları referans alınarak tetrasiklin için yorumlama kriteri
(breakpoint değeri) ≥16 µg/ml ve eritromisin için ≥8 µg/ml olarak kabul
edilmiĢtir.
Toprak izolatlarının %69‟u, gübre izolatlarının ise %44‟ ü eritromisin ve
tetrasiklinin ikisine birden dirençlidir.
Patojenler ve kommensal mikroorganizmalar çerçevesinde antimikrobik
direnci ölçmek üzere kullanılabilecek yöntemler ve bunların hangisinin
daha doğru sonuç verdiği üzerinde uzun süredir tartıĢmalar yapılmaktadır.
Bu kapsamda fenotipik veya genotipik antibiyotik direncini tespit etmeye
yönelik yöntemler kullanılabilmektedir2,39. Bu çalıĢmada fenotipik direncin
ölçümünde CLSI standartlarına uygun olarak agar dilüsyon testi ve üretici
firmanın önerileri doğrultusunda E test yöntemleri uygulanmıĢtır. Ancak
topraktan izole edilen kommensal bakteriler için test standartlarının ve bu
bakteriler için belirlenmiĢ yorumlama kriteri değerlerinin olmaması
deneylerin yapılmasında ve sonuçların değerlendirilmesinde zorluklara
neden olmuĢtur. Antibiyotik içeren besiyerinde üremelerine rağmen bazı
64
bakterilerin MĠK değerlerinin duyarlılık düzeyinde bulunmasında bu
faktörlerin rol oynadığı düĢünülmektedir.
Yapılan bir çalıĢmada klinik ve çevresel örneklerden izole edilen bazı
Bacillus türlerinin çeĢitli antibiyotiklere direnci araĢtırılmıĢ ve E test
yönteminin agar dilüsyon testi ile karĢılaĢtırıldığında daha uygun olduğu
belirtilmiĢtir92. Bu çalıĢmanın amacı antimikrobik duyarlılık testlerini
karĢılaĢtırmak değildir. Ancak her iki yöntemin de uygulanması sırasında
bakterilerin
inkübasyon
sürelerinin
uzunluğu
nedeniyle
sonuçların
okunmasında zorluklar yaĢanmıĢtır.
Gübre içindeki antibiyotik miktarının eser miktarlardan litrede 200 mg/L
düzeyine kadar bulunabildiği gösterilmiĢtir35. Bu antibiyotiklerin gübreleme
sırasında toprağa ve doğal kaynak sularına geçtiğini gösteren çalıĢmalar
bulunmaktadır. Toprağa bağlandıktan sonra tetrasiklin ve taylosinin
bakterilere karĢı aktivitelerini, toprak partiküllerine sıkıca bağlanmıĢ olsalar
da korudukları yapılan çalıĢmalarla gösterilmiĢtir40. Hamscher ve ark.ları
sıvı gübreleme iĢleminden 6 ay sonra toprağın 30 cm altında tetrasiklinin
170 µg/kg düzeyinde bulunduğunu göstermiĢlerdir41. Bu durumda çevrede
bulunan antibiyotik
kalıntılarının dirençli bakteriler üzerinde seçici
etkilerinin olması olasıdır.
Bu çalıĢmada tarla örneklerin toplanması için kuzey ve güney olmak
üzere iki parsele ayrılmıĢtır. Her örnek alma gününde kuzey parselinden
15 ve güney parselinden 16 örnek toplanmıĢtır. Her bir parselden 3‟er
örnek alım noktası saptanmıĢ ve buradan alınan örneklerde antibiyotik
konsantrasyonlarının ölçümü yapılmıĢtır. Bu çalıĢmada herbir parselde
belirlenmiĢ olan bu 3 bölgeden alınan toprak örnekleri kullanılmıĢtır. Bu
ölçümler LC-MS (liquid chromotography-mass spectroscopy) yöntemi
kullanılarak yapılmıĢtır. Bu yöntem ile ilgili ayrıntılar Krapac ve ark. ları
tarafından detaylı bir Ģekilde açıklanmıĢtır29. Elde edilen sonuçlara göre
65
güney parseline uygulanan gübrede 37.5 g/ha tetrasiklin grubu antibiyotik
(tetrasiklin, klortetrasiklin ve oksitetrasiklin) bulunmuĢtur. Bu toprakta 13.7
ng/g‟a tekabül etmektedir. Gübre uygulandıktan 1 gün sonra (Alım1) ve 3
hafta sonra (Alım2) kuzey parselinden alınan toprakta saptanan tetrasiklin
konsantrasyonu sırasıyla 3.8-12.7 ve 1.3-8.9 ng/g‟dır.
Kuzey parseline uygulanan gübrede ise 2 g/ha tetrasiklin grubu
antibiyotik (tetrasiklin, klortetrasiklin) bulunmuĢtur. Bu miktar toprağa
uygulandığında 0.7 ng/g olmaktadır. Gübre uygulandıktan 1 gün sonra
(Alım1) ve 3 hafta sonra (Alım2) kuzey parselinden alınan toprakta
saptanan klortetrasiklin konsantrasyonu sırasıyla 1.5-3.1 ve 1.9-5.3
ng/g‟dır.
Topraktaki antibiyotik miktarının bakterilqerin tetrasiklin direnç oranına
etkisini araĢtırmak üzere gübre uygulaması sonrası bu iki parselden
izole edilen bakterilerin tetrasiklin MĠK değerleri karĢılaĢtırılmıĢtır.
Güney parselinden izole edilen antibiyotik duyarlılığı belirlenmiĢ
bakterilerin %61‟inin ve kuzey parseli izolatlarının da %73‟ünün
tetrasikline dirençli olduğu bulunmuĢtur. Ancak MĠK50 değerleri
sırasıyla güney parseli için >256 µg/ml ve kuzey parseli için 160
µg/ml‟dir. Kuzey tarlasından gübre uygulanmadan önce (Alım) alınan
örneklerde direnç oranı %86‟dır. Bu bulgular ıĢığında toprakta bulunan
antibiyotik konsantrasyonu ile dirençli bakteri sayısı arasında bir
paralellik bulunamamıĢtır. Sengelov ve ark.ları domuz gübresi
uygulanmadan önce ve uygulandıktan sonra topraktan izole ettikleri
bakterilerdeki antibiyotik direnç düzeyini belirlemeye yönelik yaptıkları
çalıĢmalarında benzer sonuçlarla karĢılaĢmıĢlardır23. BaĢlangıçta kısa
süreli (3-5 gün) bir artıĢ görülse de zaman içinde bu oranın gübre
uygulanmamıĢ toprakla aynı seviyeye geldiğini belirtmiĢlerdir. Sonuç
olarak gübre ve toprakta bulunan antibiyotik kalıntılarının toprak içinde
66
antimikrobiyal direncin seçiminde rol oynadığı söylenmemektedir.
Gübre uygulamasının topraktan izole edilen bakterilerin tetrasiklin
direnç oranına etkisi değerlendirildiğinde genel olarak toprağa gübre
uygulanması sonrası kısa bir süre için de olsa direnç oranının
%87.5‟dan
çıktığı
%94.4‟e
görülmüĢtür.
Genlerin
saptanması
konusunda da benzer bir durum gözlenmiĢtir. Alım-1 örneklerinden
diğerlerine oranla daha fazla sayıda tet geni saptanmıĢtır. Uygulanan
gübre
miktarının
bakterilerin
tetrasiklin
direnç
oranına
etkisi
değerlendirildiğinde ise gübre miktarının dirençli bakteri düzeyini
arttırdığı belirtilmektedir. Bu çalıĢmada daha fazla miktarda gübre
uygulanan kuzey parselinde daha yüksek oranda dirençli bakteri
saptanması Sengelov ve ark.larının23 yaptıkları çalıĢmanın sonuçlarını
destekler niteliktedir.
Her bakteri türü yüksek değiĢkenlikte ve korunurlukta nükleik asit
sekansı içeren en az bir 16S rRNA gen kopyası içerir97. Bu bölge
hedeflenerek
bakteriler
tür
düzeyinde
tanımlanabilmektedir25,82.
Bu
çalıĢmada da genomik DNA izolasyonu yapıldıktan sonra tüm bakteriler
16S rRNA geninin V3 bölgesine (Escherichia coli’ de 341-534 nükleotidler
arası) ait nükleotid dizilerinin polimeraz zincir reaksiyonu ile amplifiye
edilmesi yoluyla tanımlanmıĢtır. Amplifikasyon ürünleri QIAquick PCR
Purification
Kit
(QIAGEN,
CA-ABD)
kullanılarak
saflaĢtırılmıĢtır.
SaflaĢtırılan ürünlerin dizi analizleri Illinois Üniversitesi Biyoteknoloji
Merkezi tarafından Sanger'in dideoksi enzimatik yöntemi kullanılarak
gerçekleĢtirilmiĢtir. Elde edilen diziler gen bilgi bankasında bulunan ilgili en
yakın
sekanslarla
nükleotid-nükleotid
Blast
programı
(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST) kullanılarak karĢılaĢtırılmıĢtır87,93.
Ġzolatların
dağılımına
bakıldığında,
Proteobacteria
(n=149),
Bacteroidetes (n=16), Actinobacteria (n=32), Firmicutes (n=16) olmak
67
üzere 4 farklı Ģubeden toplam 213 bakteri izole edildiği görülmektedir. Bu
dağılım toprakta yaĢayan bakterilerin dağılımıyla paralellik göstermektedir.
Ġzole
edilen
bakterilerin
nükleotid
dizileri
bilinen
bakterilerle
karĢılaĢtırıldığında %91-100 aralığında değiĢen benzerlik oranı elde
edilmiĢtir.
Antibiyotik duyarlılığı belirlenmiĢ 22 gram pozitif bakterinin 18‟i
(%82‟si); 102 gram negatif bakterinin ise %66‟sı tetrasikline karĢı
dirençlidir. Eritromisin için bu değerler sırasıyla %90 ve %94‟tür. Bu
sonuçlar eritromisin direncinin her iki grupta da daha yüksek olduğunu
göstermektedir.
Topraktan ve gübreden izole edilen bakterilerin antibiyotik direnci cins
düzeyinde değerlendirildiğinde, tüm cinslerde dirençli suĢların bulunduğu
görülmektedir.
Gübre içinde bulunan patojen veya kommensal bakterilerin taĢıdığı
direnç genlerini ve bu genlerin toprak bakterileri arasında aktarımını
incelemek amacıyla gübreden ve topraktan izole edilen 46 örnekte 7 farklı
tetrasiklin direnç geni (efluks genlerinden tet(C), tet(H), tet(Z) ve ribozomal
korunma mekanizmasından sorumlu tet(M), tet(O), tet(Q), tet(W)) ve 18
izolatta eritromisin direnç genleri [erm(A), erm(B), erm(C), erm(F), erm(G),
erm(Q)] araĢtırılmıĢtır. Toplam 24 suĢta tetrasiklin direnç genlerinden en
az birine rastlanmıĢtır. Bunlar arasında 13 tanesi efluks direnç genleri iken
11‟i ribozomal koruma genleridir. Tet(Q) direnç geni sadece toprak
izolatlarında ve tet(W) ve tet(M) direnç genleri ise sadece gübre
izolatlarında bulunmakta iken diğer tüm tetrasiklin direnç genleri hem
toprak hem gübre izolatlarında saptanmıĢtır. Ayrıca her ikisi de gübreden
izole edilmiĢ olan 2 izolatta (enterokok türleri ve S. simulans) erm(Q)
genine
rastlanmıĢtır.
Sonuçlar
direnç
mekanizmaları
yönünden
68
değerlendirildiğinde gübre izolatlarında her iki direnç mekanizması eĢit
oranda belirlenmiĢtir. Toprak izolatlarında ise efluks pompası genleri daha
yüksek oranda saptanmıĢtır. Her iki direnç mekanizması gübreden, gübre
uygulandıktan önce ve sonra topraktan izole edilen bakterilerde mevcuttur.
Çevresel ortamlarda antibiyotik direnç genlerinin nasıl aktarıldığını
aydınlatmak amacıyla bu genleri taĢıyan bakteri türlerini saptamaya
yönelik olarak birçok çalıĢma yapılmaktadır30,74,94. Bu çalıĢmada elde
edilen sonuçlar, tet(Z) genini taĢıyan streptomiçes suĢunun hem gübrede
hem de toprakta bulunmasının bu bakteri türünün tet(Z) geni için taĢıyıcı
bakteri görevi yapabileceğini düĢündürmektedir.
Diğer taraftan toprağa gübre uygulanmasının horizontal gen transferine
yol açıp açmadığı konusu en çok araĢtırılan konulardandır. Gübreden izole
edilen intestinal bir bakteride ve kommensal toprak bakterilerinde aynı
genin
bulunması
horizontal
gen
trasferinin
bir
göstergesi
olarak
değerlendirilmektedir. Sonuçlar bu çerçevede değerlendirildiğinde tet(C),
tet(O) ve tet(Z) genlerinde bu Ģekilde bir yayılım olduğu görülmektedir.
Gübre uygulandıktan sonra Acinetobacter ve Pseudomanas gibi barsak
bakterilerinde bulunan tet(C) geninin toprakta yaĢayan bakterilere
aktarılması olasıdır. Tet(O) geni gübrede stafilokok cinsi bakterilerde
bulunurken toprakta yaĢayan Burkholderia stabilis türü bakterilerin de bu
geni taĢıdığı saptanmıĢtır. Aynı Ģekilde tet(Z) geninin de gübredeki
Streptomyces ve Microbacteria‟lardan toprakta bulunan Burkholderia cinsi
bakterilere aktarılması muhtemeldir. Bu konuda kesin yargıya varmak için
toprak ve gübrede saptanan bu genlerin aynı olduğunun gösterilmesi
gerekmektedir.
Tetrasiklin
direnç
genlerini
taĢıyan
bakterilerin
çeĢitliliği
hızla
artmaktadır. 2001 yılında 39 cins bu genleri taĢırken, 2005 yılında bu sayı
115‟e çıkmıĢtır70. 2007 yılında yayınlanan bir çalıĢmaya göre topraktan
69
izole edilen Burkholderia, Flexibacter, Dyella ve Lysobacter cinsi
bakterilerde
tetrasiklin
direnç
genlerinin
ilk
kez
gösterildiği
belirtilmektedir30. Bu tez çalıĢmasında, yüksek düzeyde tetrasiklin direnci
toprak izolatı olan bu 4 cins bakteride saptanmıĢtır.
Tetrasiklin direnç genleri, gübrenin toprağa uygulanması öncesi (alım),
bir gün sonra (alım1), 3 hafta sonra (alım2) ve 3 ay sonra (alım3) alınan
örneklerden izole edilen dirençli suĢlarda bulunmuĢtur.
Eritromisin ve tetrasiklin direnç genlerinin, gübreden ve topraktan
alınan örneklerde gösterilmesi, bu antibiyotiklerin kullanımı ile direncin
çevreye yayılımı arasındaki iliĢkinin gösterilmesinde ilk önemli basamaktır.
Ġleri çalıĢmalarla bu direnç genlerinin aynı olup olmadığının gösterilmesi ile
bu bulgu daha da güçlenecektir.
Mikrobiyal ekosistemler arasındaki gen transferini ve transfer hızını
olduğu kadar burada rol oynayan genlerin ve bakterilerin de saptanması
amacıyla çevresel genetik metodlara olan ihtiyaç çok büyüktür98. Bu
nedenle antibiyotik direnci araĢtırmalarında moleküler ekolojik yöntemlerin
kullanımı
önem
kazanmıĢtır.
Ġleri
çalıĢmalarda
bu
yöntemler
de
kullanılarak antibiyotik direnci ve çevre etkileĢimleri aydınlatılmaya
çalıĢılacaktır.
70
6. SONUÇ
Antibiyotiklere dirençli bakteriyel patojenlerin sayısındaki artıĢ hem
insan hem de hayvanlarda gelecekte enfeksiyon hastalıklarından korunma
ve bu hastalıkları tedavi etmede giderek baĢarısız olunacağının bir
göstergesidir.
Antibiyotik direnci konusunda bilimsel pek çok bilgi olsa da direncin
geliĢimi
ve
yayılımı
hakkındaki
ekolojik
yaklaĢımlar
hala
netlik
kazanmamıĢtır. Bilinen Ģudur ki; bakteriyel antimikrobiyal direncin ortaya
çıkıĢı ve yayılımı antimikrobiyal maddeler, mikroorganizmalar ve onları
kuĢatan çevre arasındaki çok çeĢitli etkileĢimlerin sonucudur.
Bu nedenle antimikrobiyal maddelerin hayvancılıkta kullanımının
doğurduğu sonuçlara dair bilimsel tabanlı verilere ihtiyaç vardır.
Bu çalıĢmada tetrasiklin ve eritromisin antibiyotiklerine dirençli toprak
ve gübre örnekleri incelenmiĢtir.
71
Topraktan ve gübreden izole edilen toplam 213 izolat cins ve tür
düzeyinde belirlenmiĢ ve 128 tanesinin antibiyotik duyarlılığı belirlenmiĢtir.
Antibiyotik
olarak
hayvancılıkta
yoğun
olarak
kullanılan
tetrasiklin
seçilmiĢtir. Ayrıca eritromisin de yaygın kullanılan ve eritromisin ile aynı
etki ve direnç mekanizmalarına sahip taylosinin etkilerini incelemek
amacıyla çalıĢmada kullanılmıĢtır.
Her iki antibiyotik için izole edilen bakteriler arasında yüksek düzeyde
direnç saptanmıĢtır. Bununla beraber hem gübre hem de toprak
izolatlarında eritromisin direnç düzeyinin daha yüksek olduğu görülmüĢtür.
Gübre
içinde
konsantrasyonları
bulunan
ile
ve
bakterilerin
toprağa
uygulanan
antibiyotik
direnç
antibiyotik
düzeyleri
karĢılaĢtırıldığında bu iki faktör arasında bir bağlantı bulunamamıĢtır.
Gübrenin uygulanmasının antibiyotik direnç genlerinin dağılımına ve
yayılımına olan etkisi değerlendirildiğinde streptokok türlerinin tet(Z) geni
için taĢıyıcı bakteri rolü oynayabileceği düĢünülmektedir. Ayrıca tet(C),
tet(O) ve tet(Z) genlerinin hem gübreden izole edilen intestinal bakterilerde
hem de kommensal toprak bakterilerinde bulunması bu genlerin horizontal
gen transferi yoluyla aktarılmıĢ olabileceğini düĢündürmektedir.
Bu çalıĢmada antibiyotik direncinin ekolojik etkileri araĢtırılmıĢtır. Elde
edilen sonuçlar antibiyotiklerin kullanımı ile direncin çevreye yayılımı
arasındaki iliĢkinin gösterilmesinde önemli bir basamaktır.
72
7. ÖZET
Domuz
YetiĢtirme
Çiftliğinin
Çevresinde
Bulunan
Toprak
Örneklerinden Ġzole Edilen Antibiyotik Dirençli Bakterilerin Fenotipik
ve Genotipik Özellikleri
Antibiyotiklerin tarımda kullanımı ile antibiyotiğe dirençli enfeksiyonların
artıĢı arasında bir bağ olup olmadığı son zamanlarda antibiyotik direnci ile
ilgili olarak en çok tartıĢılan konulardan biridir. Bu çalıĢmada antibiyotik
direncinin artıĢında çevresel faktörlerin rolü değerlendirilmiĢtir. Bu amaçla
bir domuz yetiĢtirme çiftliği çevresinde bulunan tarlaya hayvan dıĢkısının
uygulanmasının toprakta bulunan bakterilerin fenotipik ve genotipik
dirençlerine olan etkisi araĢtırılmıĢtır.
Gübreden, gübre uygulanmadan önce ve uygulandıktan sonra
topraktan izole edilen bakterilerin tetrasiklin ve eritromisin minimum
inhibisyon konsantrasyonları agar dilüsyon ve E test yöntemleriyle
belirlenmiĢtir. Toprak izolatlarının %68‟i tetrasikline, %97‟si eritromisine
dirençli bulunmuĢtur. Gübre izolarında ise bu oran sırasıyla %70 ve
73
%67‟dir. Topraktan ve gübreden izole edilen suĢların sırasıyla %69‟u ve
%44‟ü her iki antibiyotiğe de dirençlidir.
Polimeraz zincir reaksiyonuyla 16S rRNA geninin V3 bölgesi amplifiye
edilmiĢ ve bu bölgenin dizi analizleri Sanger'in dideoksi yöntemi
kullanılarak Illinois Üniversitesi‟nde gerçekleĢtirilmiĢtir. Diziler bilinen en
yakın dizilerle nükleotid blast programı kullanılarak karĢılaĢtırılmıĢtır.
Proteobacteria, Bacteroidetes, Actinobacteria, Firmicutes olmak üzere 4
farklı Ģubeden 213 bakteri izole edilmiĢtir. Kırkaltı izolatta efluks direnç
genlerinden
olan
mekanizmasından
tet(C),
sorumlu
tet(H),
tet(Z)
tet(M),
tet(O),
ve
ribozomal
tet(Q)
ile
18
korunma
izolatta
erm(A,B,C,F,G,Q) genlerinin varlığı araĢtırılmıĢtır. Tet(Q) sadece toprak
izolatlarında, tet(W) ve tet(M) ise sadece gübre izolatlarında bulunmakta
iken diğer tüm tetrasiklin direnç genleri hem toprak hem gübre izolatlarında
saptanmıĢtır. Ayrıca 2 gübre izolatında erm(Q) genine rastlanmıĢtır. Sonuç
olarak eritromisin ve tetrasiklin direnç genlerinin, gübreden ve topraktan
alınan örneklerde gösterilmesi, bu antibiyotiklerin kullanımı ile direncin
çevreye yayılımı arasındaki iliĢkinin gösterilmesinde ilk önemli basamaktır.
74
8. SUMMARY
Phenotypic and Genotypic Characterization of Antibiotic Resistant
Soil Bacteria Adjacent to Swine Production Facilities
The question of possible correlation between the agricultural antibiotic
use and the increase in the rate of antibiotic resistant infections has been
debated. In this study, the environmental factors in the increase of
antibiotic resistance were investigated. Especially, the effect of manure
application from swine confinement facility to the fields was evaluated.
Samples have been collected from manure and soil, before and after
manure application. Erythromycin and tetracycline susceptibility was
determined by agar dilution and E-test methods. 68 per cent of the soil
isolates was detected as resistant to tetracycline and 97 per cent to
erythromycin. This ratios were found to be 70 per cent and 67 per cent in
manure isolates respectively. The 69 per cent of the strains isolated from
soil and 44 per cent of that from manure were double resistant to both
antibiotics.
75
Polymerase chain reaction was used to amplify the V3 region of the
16S rRNA gene fragment and sequence analysis was performed at the
University of Illinois. The phylogenic positions of the isolates were
determined by searching the GenBank database. 213 bacteria were
isolated
from
4
different
phylum,
Proteobacteria,
Bacteroidetes,
Actinobacteria, Firmicutes.
Class-specific primers were used to amplify each of the six
erythromycin resistance genes erm(A,B,C,F,G,Q) and 4 tetracycline
resistance genes encoding efflux pumps tet(C), tet(H), tet(Z), tet(W) and 3
genes encoding ribosomal protection proteins tet(M), tet(O), tet(Q).
Whereas tet(Q) gene was detected in only soil isolates, tet(W) and tet(M)
were solely in manure isolates. Other tet genes were identified in soil and
manure isolates. Furthermore, erm(Q) gene was found in only two manure
isolates. In conclusion, the demonstration of the resistance genes in soil
and manure isolates, constitutes the initial phase of linking the antibiotic
use with the spread of resistance to the environment.
76
9. KAYNAKLAR
1.American Academy of Microbiology. Antimicrobial resistance an
ecological perspective. Washington: American Society for Microbiology;
1999.
2.American Academy of Microbiology. The role of antibiotics in agriculture;
Washington: American Society for Microbiology; 2002.
3.Antibiotic resistance: a societal problem [online]. 2004 [cited 2006 Jul 8].
Available from: URL: http://www.tufts.edu/med/apua/Q&A/Q&A_soc.html
4.Mellon M, Benbrook C, Benbrook K. Hogging it: Estimates of antibiotic
abuse in livestock. Union of Concerned Scientist (UCS) Publications.
Cambridge, MA, [online]. 2001. [cited 2006 March 3]. Available from: URL:
http://www.ucsusa.org/food_and_environment/antibiotics_and_food/marga
ret-mellon-on-hogging-it.html
5.Swan MM. Report of the joint committee on the use of antibiotics in
animal husbandry and veterinary medicine. Her Majesty‟s Stationary
Office, London; 1969.
77
6.McEwen SA. Antibiotic use in animal agriculture: what have learned and
where are we going? Anim Biotechnol 2006; 17: 239-50.
7.Witte W. Medical cosequences of antibiotic use in agriculture. Science
1998; 279: 996-7.
8.Gaunt PN, Piddock LJV. Ciprofloxacin resistant Campylobacter spp. in
humans: an epidemiological and laboratory study. J Antimicrob Chemother
1996; 37: 747-57.
9.Lipsitch M, Singer RS, Levin BR. Antibiotics in agriculture: when is it time
to close the barn door? PNAS 2002; 99: 5752-4.
10.Threlfall EJ, Ward LR, Rowe B. Multiresistant Salmonella Typhimurium
DT 104 and salmonella bacteraemia. Lancet 1998; 352(9124): 287-8.
11.Collignon P. A review-the use of antibiotics in food production animalsdoes this cause problems in human health [online]. 2003 [cited 2007 Feb
15]. Available from: URL:
http://www.keepantibioticsworking.com/new/resources_library.cfm?RefID=
36469
12.Feinmen SE. Antibiotics in animal feed: drug resistance revisited. Am
Soc Microbiol News 1998; 64: 24-30.
13.Singer RS, Finch R, Wegener HC, Bywater R, Walters J, Lipsitch M.
Antibiotic resistance-the interplay between antibiotic use in animal and
human beings. The Lancet Infectious Diseases 2003; 3: 47-51.
14.Witte W. Selective pressure by antibiotic use in livestock. Int J
Antimicrob Agents 2000; 16(Suppl 1): 10-24.
15.Koike S, Krapac IG, Oliver HD, Yannarell AC, Chee-Sanford JC,
Aminov RI, Mackie RI. Monitoring and source tracking of tetracycline
resistance genes in lagoons and groundwater adjacent to swine
78
production facilities over a three-year period. Appl Environ Microbiol 2007
Jun 1.
16.Chee-Sanford JC, Aminov RI, Krapac IJ, Garrigues-Jeanjean N,
Mackie RI. Occurrence and diversity of tetracycline resistance genes in
lagoons and groundwater underlying two swine production facilities.
Appl Environ Microbiol 2001; 67(4):1494-502.
17.Russell AD. Types of antibiotics and synthetic antimicrobial agents. In:
Hugo WB, Russel AD, editors. Pharmaceutical Microbiology, 6th ed,
London: Blackwell Science; 1998. s. 91-129.
18.Get Smart: Know When Antibiotics Work on the Farm: Educational
Activities to Promote Appropriate Use of Antimicrobial Agents in Animals
:Landmarks in antibiotic use [online]. 2004 [cited 2006 May 15]. Available
from: URL :http://www.cdc.gov/narms/get_smart.htm
19.US Office of Technology Assessment. Impacts of antimicrobial resistant
bacteria. Washington: US Government Printing Office, 1995.
20.Updated information on FDA's proposed withdrawal of approval of
poultry fluoroquinolones [online]. 2003 [18 May 2007]. Available from:
URLhttp://www.fda.gov/cvm/NOOHB.htm
21.Chopra I, Roberts M. Tetracycline antibiotics: Mode of action,
applications, molecular biology, and epidemiology of bacterial resistance.
Microbiol Mol Biol Rev 2001; 65: 232-60.
22.Jorgensen SE, Halling-Sorensen B. Editorial, Drugs in the environment.
Chemosphere 2000; 40: 691-699.
23.Sengelov G, Agerso Y, Halling-Sorensen B, Baloda SB, Andersen JS,
Jensen LB. Bacterial antibiotic resistance levels in Danish farmland as a
79
result of treatment with pig manure slurry. Environ International 2003; 28:
587-595.
24.Jensen LB, Baloda S, Boye M, Aaestrup FM. Antimicrobial resistance
among Pseudomonas spp. and the Bacillus cereus group isolated from
Danish agricultural soil. Environ International 2001; 26: 581-587.
25.Onan LJ, LaPara TM. Tylosin-resistant bacteria cultivated from
agricultural soil. FEMS Microbiol Lett 2003; 220: 15-20.
26.Götz A, Smalla K. Manure enhances plasmid mobilization and survival
of Pseudomonas putida introduced into field soil. Appl Environ Microbiol
1997; 63: 1980-86.
27.Mackie RI, Koike S, Krapac I, Chee-Sanford J, Maxwell S, Aminov RI.
Tetracycline residues and tetracycline resistance genes in groundwater
impacted by swine production facilities. Anim Biotechnol 2006;17(2):15776.
28.Jindal A, Kocherginskaya S, Mehboob A, Robert M, Mackie RI, Raskin
L, Zilles JL. Antimicrobial use and resistance in swine waste treatment
systems. Appl Environ Microbiol 2006;72(12):7813-20.
29.Krapac IG, Koike S, Meyer MT, Snow DD, Chou S-FJ, Mackie RI, Roy
WR, Chee-Sanford JC. Long term monitoring of the occurrence of
antibiotic resistance genes in groundwater near swine confinement
facilities.
Proceeding
of
the
4th
International
Conference
of
Pharmaceuticals and Endocrine Disrupting Chemicals in Water; 2004
Minneapolis, MN; National Groundwater Association: 158-72.
30.Kobashi Y, Hasebe A, Nishio M, Uchiyama H. Diversity of tetracycline
resistance
genes
in
bacteria
isolated
from
various
agricultural
environments. Microbes Environ 2007;22:44-51.
80
31.Agersø Y, Sandvang D. Class 1 integrons and tetracycline resistance
genes in Alcaligenes, Arthrobacter, and Pseudomonas spp. isolated from
pigsties and manured soil. Appl Environ Microbiol 2005; 71: 7941-7.
32.Heuer H, Smalla K. Manure and sulfadiazine synergistically increased
bacterial antibiotic resistance in soil over at least two months.
Environ Microbiol. 2007; 9(3): 657-66.
33.Ghosh S, LaPara TM. The effects of subtherapeutic antibiotic use in
farm animals on the proliferation and persistence of antibiotic resistance
among soil bacteria. The ISME Journal 2007; 1: 191–203.
34.Schmitt H, Stoob K, Hamscher G, Smit E, Seinen W. Tetracycline and
tetracycline resistance in agricultural soils: microcosm and field studies.
Microbiol Ecology 2006; 51: 267-76.
35.Kumar K, Thompson A, Singh AK, Chander Y, Gupta SC. Enzyme
linked immunosorbent assay for ultratrace determination of antibiotics in
aqueous samples. J Environ Qual 2004; 33: 250-256.
36.Elmund GK, Morrison SM, Grant DW, Nevins SM. Role of excreted
chlortetracycline in modifying the decomposition process in feedlot waste
Bull Environ Contam Toxicol 1971; 6(2):129-32.
37.Mølbak K, Baggesen DL, Aarestrup FM, Ebbesen JM, Engberg J,
Frydendahl K, Gerner-Smidt P, Petersen AM, Wegener HC. An outbreak
of multidrug-resistant, quinolone-resistant Salmonella enterica serotype
Typhimurium DT104. N Engl J Med 1999(4); 341(19): 1420-5.
38.Peak N, Knapp CW, Yang RK, Hanfelt MM, Smith MS, Aga DS,
Graham DW. Abundance of six tetracycline resistance genes in
wastewater lagoons at cattle feedlots with antibiotic use strategies.
Environ Microbiol 2007; 9(1): 143-51.
81
39.Kümmerer K. Resistance in environment. J Antimicrob Chemother
2004; 54: 311-20.
40.Chander Y, Kumar K, Goyal SM, Gupta SC. Antibacterial activity of
soil-bound antibiotics. J Environ Qual 2005; 34: 1952-7.
41.Hamscher G, Sczesny S, Höper H, Nau H. Determination of persistent
tetracycline residues in soil fertilized with liquid manure by highperformance liquid chromatography with electrospray ionization tandem
mass spectrometry. Anal Chem 2002; 74: 1509-18.
42.Rysz M, Alvarez PJJ. Amplification and attenuation of tetracycline
resistance in soil bacteria: aquifer column experiments. Water Res 2004;
38: 3705-12.
43.Brønstad K, Drønen K, Øvreås L, Torsvik V. Phenotypic diversity and
antibiotic resistance in soil bacterial communities. J Ind Microbiol 1996; 17:
253-9.
44.Veterinary surveillance: Surveillance for antimicrobial resistance Figure 1 [online]. 2005 [18 Apr 2007]. Available from : URL :
http://www.defra.gov.uk/animalh/diseases/vetsurveillance/antimicrobialres-fig.htm
45.Salyers A, Shoemaker NB. Reservoirs of antibiotic resistance genes.
Anim Biotechnol 2006; 17: 137-46.
46.Aaerestrup FM. Veterinary drug usage and antimicrobial resistance in
bacteria of animal origin. Basic Clin Pharmacol Toxicol 2005; 96: 271-81.
82
47.Summers AO. Generally overlooked fundamentals of bacterial genetics
and ecology. Clin Infect Dis 2002; 34(Suppl 3): S85-92.
48.McEwen SA, Fedorka-Cray PJ. Antimicrobial use and resistance in
animals. Clin Infection Dis 2002; 34(Suppl 3): S93-106.
49.Nwosu WC. Antibiotic resistance with particular reference to soil
microorganisms. Res Microbiol 2001; 152: 421-30.
50.van den Bogaard AE, Willems R, London N, Top J, Stobberingh EE.
Antibiotic resistance of faecal enterococci in poultry, poultry farmers and
poultry slaughterers. J Antimicrob Chemother 2002; 49(3): 497-505.
51.Harbottle H, McDermott PF, Zhao S, Walker RD, White DG,
Mechanisms of antimicrobial resistance. Pork Industry Conference on
Antibiotic Use in Animal Agriculture 2006 April 27-28; Urbana, Illinois-USA.
1-8
52.World Health Organization. WHO global principles for the containment
of antimicrobial resistance in animals intended for food. Geneva: World
Health Organization; 2000.
53.O‟Brien TF. Emergence, spread, and environmental effect of
antimicrobial resistance: how use of an antimicrobial anywhere can
increase resistance to any antimicrobial anywhere else. Clin Infect Dis
2002; 34(Suppl 3): S78-84.
54.Summers AO. Genetic linkage and horizontal gene transfer, the roots
of the antibiotic multi-resistance problem. Anim Biotechnol 2006; 17: 125135.
83
55.Khachatourians GG. Agricultural use of antibiotics and the evoluation
and transfer of antibiotic- resistant bacteria. CMAJ 1998; 159: 1129-36.
56.Davison J. Genetic exchange between bacteria in the environment.
Plasmid; 42: 73-91.
57.Lorenz MG, Wackernagel W. Bacterial gene transfer by natural genetic
transformation in the environment. Microbiol Rev; 58: 563-602.
58.Nielsen KM, van Weerelt MD, Berg TN, Bones AM, Hagler AN, van
Elsas JD. Natural transformation and availability of transforming DNA to
Acinetobacter calcoaceticus in soil microcosms. Appl Environ Microbiol
1997; 63: 1945-52.
59.Cooper AJ, Shoemaker NB, Salyers AA. The erythromycin resistance
gene from the Bacteroides conjugative transposon TcrEmr 7853 is nearly
identical to ermG from Bacillus sphaericus. Antimicrob Agents Chemother
1996; 40: 506-8.
60.Frost LS. Leplae R, Summers AO, Toussaint A. Mobile genetic
elements: the agents of open source evaluation. Nature Reviews
Microbiology. 2005; 722-32.
61.Arda M. Temel Mikrobiyoloji. Ġkinci baskı. Ankara: Medisan Yayın
Serisi; 2000.
62.Salyers AA, Amabile-Cuevas CF. Why are antibiotic resistance genes
so resistant to elimination. Antimicrob Agent Chemother 1997; 41: 232125.
63.Insertion sequence [online]. 2007 [1 June 2006]. Available from : URL :
http://commons.wikimedia.org/wiki/Image:Insertion_sequence.jpg
84
64.Composite_transposon [online]. 2007 [1 June 2006]. Available from :
URL :
http://commons.wikimedia.org/wiki/Image:Composite_transposon.jpg
65.Bennett
PM,
Genome
plasticity
Insertion
sequence
elements
transposons and integrons, and DNA rearrangement. In: Woodford N,
Johnson AP, editors. Genomics, Proteomics, and Clinical Bacteriology. 1st
ed, Totowa New Jersey: Humana Press Inc; 2004. s. 71-112.
66.Zhao S, Qaiyumi S, Friedman S, Singh R, Foley SL, White DG,
McDermott PF, Donkar T, Bolin C, Munro S, Baron EJ, Walker RD.
Characterization of Salmonella enterica serotype newport isolated from
humans and food animals. J Clin Microbiol 2003; 41: 5366-71.
67.Harbottle H, McDermott PF, Zhao S, Walker RD, White DG. Genetics
of antimicrobial resistance. Anim Biotechnol 2006; 27-28.
68.Robicsek A, Strahilevitz J, Jacoby GA, Macielag M, Abbanat D, Park
CH, Bush K, Hooper DC.Fluoroquinolone-modifying enzyme: a new
adaptation of a common aminoglycosideacetyltransferase.Nat Med
2006;12(1):83-8.
69.Gootz
TD.
The
forgotten
gram-negative
bacilli:
what
genetic
determinants are telling us about the spread of antibiotic resistance.
Biochem Pharmacol 2006; 71: 1073-84.
70.Roberts MC. Update on aquired tetracycline resistance genes. FEMS
Microbiology Letters 2005; 245: 195-203.
85
71.Weisblum B. Erythromycin resistance by ribosome modification.
Antimicrob Agents Chemother 1995; 39(3):577-85.
72.Roberts
MC
streptogramin,
Resistance
trimethoprim,
to
tetracycline,
and
sulfonamide
macrolide-lincosamidedrug
classes.
Mol
Biotechnol 2002; 20(3):261-83.
73.Jost BH, Trinh HT, Songer JG, Billington SJ. A second tylosin
resistance determinant, Erm B, in Arcanobacterium pyogenes. Antimicrob
Agents Chemother 2004; 48(3):721-7.
74.Patterson AJ, Colangeli R, Spigaglia P. Scott P. Distribution of specific
tetracycline and erythromycin resistance genes in environmental samples
assessed by macroarray detection. Environ Microbiol 2007; 9: 703-15.
75.Jensen LB, Agerso Y, Sengelov G. Presence of erm genes among
macrolide resistant Gram-positive bacteria isolated from Danish farm soil.
Environ Int 2000; 28: 487-91.
76.Winding A, Binnerup JS, Sørensen J. Viability of Indigenous soil
bacteria assayed by respiratory activity and growth. Appl Environ Microbiol
1994; 60(8): 2869–75.
77.Janssen PH, Yates PS, Grinton BE, Taylor PM, Sait M. Improved
culturability of soil bacteria and isolation in pure culture of novel members
of the divisions Acidobacteria, Actinobacteria, Proteobacteria, and
Verrucomicrobia. Appl Environ Microbiol 2002; 68(5): 2391-6.
78.Pedersen JC. Natamycin as a fungicide in agar media. Appl Environ
Microbiol 1992; 58: 1064-6.
86
79.Reasoner DJ, Geldreich EE. A new medium for enumeration and
subculture of bacteria from potable water. Appl Environ Microbiol 1985;
49:1-7.
80.Davis KER, Joseph SJ, Janssen PH. Effects of Growth medium,
inoculum size, and incubation time on culturability and isolation of soil
bacteria. Appl Environ Microbiol 2005; 71: 826-34.
81.Wayne PA. National Committee for Clinical Laboratory Standards
(NCCLS), 4th Ed.: Approved Standard. M7-A4,. (1997).
82.LaPara TM, Nakatsu CH, Pantea L, Alleman JE. Phylogenetic analysis
of bacterial communities in mesophilic and thermophilic bioreactors
treating pharmaceutical wastewater. Appl Environ Microbiol 2000; 66:
3951-9.
83.Sambrook J, Russell DW. Molecular cloning: a laboratory manual. 2nd
ed. Cold Spring Harbor, N.Y: Cold Spring Harbor Laboratory Press; 2001.
s. 5.1-5.90.
84.Brown TA.Gene Cloning & DNA Analysis An Introduction. 5 th
ed.Malden, MA: Blackwell Publishing; 2006. s.181-195.
85.Lodish H, Berk A, Zipursky SL, Matsudaira P, Baltimore D, Darnell J.
Molecular Cell Biology. 4th ed. New York: WH Freeman and Company,
2000. s. 207-253.
86.Sambrook J, Russell DW. Molecular cloning: a laboratory manual. 2 nd
ed. Cold Spring Harbor, N.Y: Cold Spring Harbor Laboratory Press; 2001.
s. 12.10-12.114.
87
87.Altschul, S. F., W. Gish, W. Miller, E. W. Myers, and D. J. Lipman.
1990. Basic local alignment search tool. J Mol Biol 215: 403-10.
88.Aminov GI, Garrigues-Jeanjean, Mackie R. Molecular ecology of
tetracycline resistance: development and validation of primers for
detection of tetracycline resistance genes encoding ribosomal protection
proteins. Appl Environ Microbiol 2001; 67(1): 22-32.
89.Oliver HD, Koike S, Krapac IG, Chee-Sanford JC, Aminov RI, Mackie
RI. Molecular monitoring of tylosin-and erythromycin-resistance genes in
lagoons and groundwater of two swine production facilities. (yazım
aĢamasında).
90.Janssen PH. Identifying the Dominant Soil Bacterial Taxa in Libraries of
16S rRNA and 16S rRNA Genes. Appl Environ Microbiol 2006; 72: 171928.
91.Aminov RI, Chee-Sanford JC, Garrigues N, Teferedegne B, Krapac IJ,
White BA, Mackie RI Development, validation, and application of primers
for detection of tetracycline resistance genes encoding tetracycline efflux
pumps in gram-negative bacteria. Appl Environ Microbiol 2002; 68: 178693.
92.Turnbull PC, Sirianni NM, LeBron CI, Samaan MN, Sutton FN, Reyes
AE, Peruski LF.MICs of selected antibiotics for Bacillus anthracis, Bacillus
cereus, Bacillus thuringiensis, and Bacillus mycoides from a range of
clinical and environmental sources as determined by the Etest. J Clin
Microbiol 2004;42(8):3626-34.
88
93.Madden TL, Tatusov RL, Zhang J. Application of network BLAST
server. Methods Enzymol 1996; 266: 131-41.
94.Heuer OE, Hammerum AM, Collignon P, Wegener HC. Human health
hazard from antimicrobial-resistant enterococci in animals and food. Clin
Infect Dis 2006; 43: 911-6.
95.Thiele-Bruhn S. Pharmaceutical antibiotic compounds in soil: A review.
J Plant Nutr Soil Sci 2003; 166: 145-167.
96.van den Bogaard AE, Stobberingh EE. Epidemiology of resistance to
antibiotics links between animals and humans. Int J Antimicrob Agents
2000; 14(4): 327-35.
97. Woese CR. Bacterial evoluation. Microbiol Rev 1987; 51: 221-71.
98.Aminov RI, Mackie RI. Evolution and ecology of antibiotic resistance
genes.FEMS Microbiol Lett 2007; 271(2):147-61.
99.Woodford N, Public databases retrieving and manipulating sequences
for beginners. In: Woodford N, Johnson AP, editors. Genomics,
Proteomics, and Clinical Bacteriology. 1st ed, Totowa New Jersey:
Humana Press Inc; 2004. s. 17-28.
89
10. EKLER
Tablo 10. Tanımlanan tüm izolatların antibiyotik duyarlılıkları ve filogenetik
özellikleri
90
91
92
93
-: Yapılmadı, A: Alım, K:Kuzey, G:Güney, ÇG:Çukur gübresi, LG:Lagün gübresi
94
11. TEġEKKÜR
Tez çalıĢmalarım sırasında bilimsel katkıları ile bana yardımcı olan, eğitimim
ve yetiĢmemde emek veren, bu tezin gerçekleĢmesini sağlayan tez danıĢmanım
ve hocam G.Ü. Tıp Fak. Mikrobiyoloji Anabilim Dalı BaĢkanı sayın Prof. Dr.
Nedim Sultan‟a,
Akademik hayatım boyunca ve tez çalıĢmalarım sırasında her zaman bana
önder ve yol gösterici olan, yetiĢmemde çok emeği olan H.Ü. Ecz. Fak.
Farmasötik Mikrobiyoloji Anabilim Dalı BaĢkanı sayın Doç. Dr. Meral Özalp‟e,
AraĢtırmalarım
süresince
büyük
yardımlarını
gördüğüm,
bilgi
ve
deneyimlerinden yararlandığım ve ilham aldığım Illinois Üniversitesi Hayvan
Bilimleri Laboratuvarı Mikrobiyoloji Bölümü hocalarından sayın Prof. Dr. Roderick
I Mackie‟ye,
Tezin her aĢamasında yardımlarını benden esirgemeyen tez komitesindeki
değerli hocalarım sayın Prof. Dr. Sevgi Türet ve sayın Prof. Dr. Aysel
Arıcıoğlu‟na,
Eğitimim ve yetiĢmemde katkıları olan sayın hocalarım Prof. Dr. Turgut Ġmir,
sayın Prof. Dr. Semra KuĢtimur ve sayın Prof. Dr. Seyyal Rota‟ya ve ayrıca
anabilim dalında öğretim üyesi olan diğer değerli hocalarıma ve asistan
arkadaĢlarıma,
Birlikte çalıĢıyor olmaktan çok mutlu olduğum sevgili arkadaĢlarım Uzm. Ecz.
Ekrem Kılıç‟a ve Bio. Didem Öztürk‟e,
Ve
maddi-manevi
her
konuda
beni
sabırla
destekleyen,
yardımını
esirgemeyen çok kıymetli eĢim Mehmet Ekizoğlu baĢta olmak üzere kızım ve tüm
aileme,
En içten teĢekkürlerimi sunmayı bir borç bilirim.
95
12. ÖZGEÇMĠġ
Melike Ekizoğlu
AYDIN, 1975
Adres:
Hacettepe Üniversitesi,
Eczacılık Fakültesi,
Farmasötik Mikrobiyoloji Anabilim Dalı
06100 Sıhhiye/ANKARA-TÜRKĠYE
Telefon : 0 312 305 14 99
Faks : 0 312 311 47 77
e-posta: melike@hacettepe.edu.tr
Eğitim:
2000
2000
1998
1996
Doktora
Gazi Üniversitesi, Tıp Fakültesi, Mikrobiyoloji Anabilim Dalı, Ankara
Yüksek Lisans
Gazi Üniversitesi, Tıp Fakültesi, Mikrobiyoloji Anabilim Dalı, Ankara
Hacettepe Üniversitesi, Eczacılık Fakültesi, Farmasötik Teknoloji
Anabilim Dalı, Ankara
Lisans
Hacettepe Üniversitesi, Eczacılık Fakültesi, Ankara
Mesleki Deneyim:
2005-2006 Misafir AraĢtırmacı
Illinois Üniversitesi, Tarım-Tüketici ve Çevre Bilimleri Koleji, Hayvan
Bilimleri Bölümü, Mikrobiyoloji Laboratuvarı, Urbana-Illinois, USA
1997-
AraĢtırma Görevlisi
Hacettepe Üniversitesi, Eczacılık Fakültesi, Farmasötik Mikrobiyoloji
Anabilim Dalı, Ankara
Yabanci Dili: Ġngilizce
Üye Olduğu Bilimsel KuruluĢlar:
Türk Mikrobiyoloji Cemiyeti
Farmasötik Bilimler Ankara Derneği (FABAD)
Türk Farmasötik Teknoloji AraĢtırmacıları Derneği (TÜFTAD)
Yapılan ÇalıĢmalarla Ulusal ve Uluslararası Düzeyde Alınan Ödüller
1. 1998-1999 Hacettepe Üniversitesi AraĢtırma Grubu BaĢarı Ödülü
Yeni ilaç dağıtım Sistemi Mikropartiküler AraĢtırma Grubu:
96
Romatoid artrit tedavisinde kullanılan antiinflamatuvar ilaç içeren mikropartiküler
sistemler üzerine araĢtırma
2.Kılıç, E., Ekizoğlu, M., Özalp, M., Hasçelik, G., “Hastanede Yatan Hastalardan
Ġzole Edilen ÇeĢitli Gram Negatif Bakterilerin Klorhekzidine Duyarlılıkları.
III.Sterilizasyon Dezenfeksiyon Kongresi, Samsun, 2003. (Poster ödülü)
Projeler
Bazı dezenfektanların
hastane kaynaklı ve antibiyotiklere dirençli/duyarlı
bakteriler üzerindeki etkinliklerinin araĢtırılması, Yardımcı araĢtırmacı. Hacettepe
Üniversitesi AraĢtırma Fonu Projesi. 0:01023010008. 2001. (Rapor aĢamasında)
97
Download