13. Klonlama

Hazırlayan: Meltem ÖZCAN
Konu : Klonlama
KLONLAMA
•
•
•
•
DNA rekombinasyonu
Transformasyon
Selektif çoğaltım (Selective amplification)
DNA klonlarının izolasyonu (Isolation of
Desired DNA Clones) aşamalarıyla
klonlama gerçekleşir.
Klonlama DNA fragmentlerini kopyalamak
için kullanılan bir tekniktir.
 Klonlamada 2 farklı teknik kullanılabilir;
1-Hücreye dayalı teknik
2-PCR(Polymerase chain reaction)

Hücreye dayalı teknikteki yaklaşıma göre;
konukçu hücreyle ilgili DNA fragmentini
taşımak için bir vektör kullanılır.
 Şekil vektör olarak kullanılan plazmitlerin
tipik prosedürünü göstermektedir.

a)DNA Rekombinasyonu: DNA fragmenti bir vektör içinde koyularak
klonlanır.Rekombinant vektör antibiyotiye dayanıklı gen içermek
zorundadır.
b)Transformasyon: Rekombinant DNA konukçu hücre içine girerek
hızla çoğalır.Transformasyon olarak adlandırılmasının sebebi
konukçu hücreyi değiştirebilme fonksiyonunun olmasıdır.
E.coli hücrelerini plasmid DNA ile ortamdan izole etmek zordur.CaCl2
ilavesiyle bu izolasyon sağlanabilir.
c)Selektif Çoğaltım: Bu aşamada herhangi bir koruması olmayan ölü
E.coli hücresine spesifik bir antibiyotik eklendi. Transforme olmuş
E.coli antibiyotiğe dayanıklı gen tarafından korundu.Bu gen spesifik
antibiyotiği inaktif hale getirdi.Önceki sayfadaki şekilde bulunan
E.coli hücrelerinin çoğu birbirinden farklıdır.Çünkü her biri
birbirinden bağımsız olarak çoğalmıştır.
d)DNA Klonlarının İzolasyonu
Klonlama Vektörleri
(Cloning Vectors)




Vektör; DNA fragmentini konukçu hücreye
taşıma aracı olarak kullanılır.
Eğer vektör DNA fragmentini kopyalamak için
kullanılırsa “cloning vector” olarak adlandırılır.
Eğer DNA fragmentinde gen ifadesi için
kullanılırsa “expression vector” olarak
adlandırılır.
Yaygın olarak kullanılan vektörler; plazmid,
lambda phage, cosmid, yeast artificial
chromosome (YAC)
Cloning Vectors

Plasmid: Dairesel
yapıdadırlar. Konukçu
hücreden bağımsız
olarak kopyalama
işlemini
gerçekleştirebilirler.Pl
azmid dizisinin
büyüklüğü 1kb-100kb
arasında değişiklik
gösterir.
Cloning Vectors
Şekildeki plazmid vektör;
birçok farklı restriksiyon enzimini
tanıyabilen bir polylinker (çoklu tanıyıcı),
selektif çoğaltım için ampicillin-dayanıklı
gen(amp) ve konukçu hücrede üreme için
replikasyon orjinini(ORI) içerir.

Cloning Vector



Gereksiz parçaları çıkararak ve gerekli diziler
(sequence) ekleyerek doğal plazmidlerden
plazmid vektör yapılır.
Bir DNA örneğini klonlamak için vektörde ve
DNA örneğinde aynı restriksiyon enzimi
kullanılmalıdır.
Sonuç olarak; bir vektör genellikle birçok
restriksiyon enzimini tanıyan bir zincir
(polylinker) içerir.Böylece vektör, DNA’nın çeşitli
örneklerini klonlamada kullanılabilir.
Cloning Vector

Lambda Phage:
Bakterilere
bulaşabilen
virüslerdir.En büyük
avantajı yüksek
transformasyon
etkinliği
sağlamasıdır.Plasmid
vektörden 1000 kat
daha etkilidir.
Cloning Vector



Şekil DNA klonlamada vektör olarak alpha
phage kullanımını göstermektedir.
Şekilde alpha phage virüsü DNA içine koyularak
gereksiz bölgenin yerine geçer ve DNA
klonlanır.Daha sonra in vitro assembly system ile
alpha virion(nükleik asit ve kapsitten oluşan
virüs) taşınarak Rekombinant DNA oluşturulur.
Alpha genom 49 kb uzunluğundadır ve 25 kb
yabancı DNA taşıyabilir.
Cloning Vector






Figure; The assembly process
of the alpha virion
Alpha DNA; COS bögeleri
olarak bilinir.
12 nükleotid uzunluğunda ve
her biri tek iplikçiklidir.
Dizilimleri birbirlerinin
komplementi olduğu için; bir
alpha DNA farklı bir alpha DNA
ile baz çifti olabilir.
İki alpha DNA böylelikle
birbirine bağlanır ve dairesel
bir DNA oluşur.
Konukçu hücrede, ligaz COS
bölgelerini bağlayabildiği için
alpha DNA dairesel yapıdadır.
Cloning Vector
Şekildeki proseste, Nu1 ve A proteinleri
COS bölgesini tanır, alpha DNA ile
proteinler boş bir kafa içinde biraraya gelir.
 Kafa dolduğunda kuyruk eklenir ve alpha
virion oluşumu tamamlanır.
 Proteinler alpha genom’da genler
tarafından kodlanır.

Cloning Vektor
Cosmid:Cosmid vektör plasmid vektörün
kombinasyonudur.alpha kafaya sokulan
hedef DNA’ya COS bölgesi izin verir.
 Cosmid’in avantajları;
 Yüksek transformasyon etkisi sağlar.
 Plasmid ve alpha phage vektörlerinin sınırı
25 kb iken cosmid vektör 45 kb yabancı
DNA taşıyabilir.

Cloning by Using Cosmid Vector
Cloning by Using Cosmid Vector
a)
b)
Plazmid vektöre benzer şekilde cosmid
vektörde amp, ORI ve polylinker
bulunur.Ayrıca bir COS bölgesi içerir.
Cosmid vektörler restriksiyon enzimiyle
bölündükten sonra DNA fragmentleriyle
bağlanır.Sonraki “assembly ve
transformation” aşamaları alpha phage
ile klonlamayla aynıdır.
Cloning by The Yeast Artificial
Chromosome Vector
YAC: Maya yapay
kromozom vektörü
(The yeast artificial
chromosome) büyük
DNA parçalarını tşıma
kabiliyetindedir.(2 Mb
üzerinde)Fakat
transformasyon etkisi
çok düşüktür.
YAC
YAC vektörünün parçaları;
 Sentromerler(CEN), telomerler(TEL),
konukçu hücrede çoğalma için
automonous replicating sequence(ARS)
 Selektif çoğaltım için amp ve YAC vektörü
içeren hücrelerin belirlenmesi için TRP1 ve
URA3 gibi markerlar.
 Restriksiyon enziminin tanıdığı bölgeler (
EcoRI ve BamHI gibi)

Cloning by YAC
Prosedür;
1- Hedef DNA EcoRI tarafından kısmen
sindirilir ve YAC vektör EcoRI ve BamHI
tarafından bölünür.
2- Bir yapay kromozomdan sindirilen DNA
parçalarıyla bölünen vektör segmentleri
bağlanır.
3- Transforme maya hücreleri çok sayıda
kopya yapar.
