Agrobacterium tumefaciens Aracılığı ile Gen Aktarımı Gizem Hacımuto Yıldız Teknik Üniversitesi En genel anlamıyla bitkilere gen aktarımı; fonksiyonel olarak belirlenmiş doğal ya da sentetik nukleik asit dizilerinin bitki hücrelerine genetik mühendisliği teknikleri kullanılarak aktarılmasıdır. Genetik transformasyon olarak adlandırılan bu süreç: yabancı nukleik asit molekülünün hücreye girişi (insersiyon ) genoma bağlanması (entegrasyon) , genin anlatımın yapması (ekspresyon; ifade) yavru döllere aktarımı aşamalarından oluşur. Gen Aktarımı a) Doğrudan : Agrobacterium tumefaciens Agrobacterium rhizogenes b) Dolaylı : Makroenjeksiyon Biyolistik Mikroenjeksiyon Elektroporasyon Polen transformasyonu Zigotik embriyoya DNA emdirilmesi Fiberler aracılığıyla DNA aktarımı Sonikasyon Desikasyon Agrobacterium ,toprakta doğal olarak yaşayan , gram negatif , spor oluşturmayan , hareketli , çubuk şekilli (Basil ) bir bakteri olup , yaralanmış dokulardan organizmaya girerek tümör benzeri dokular oluşturur. Başta böğürtlen, ahududu, tüm meyve ağaçları , pek çok çalı formu ve asmalarda , özellikle hanımeli ve gülgiller gibi odunsular , papatya ,yıldız çiçekleri , krizantem gibi otsular ve sebzeler olmak üzere yaklaşık 10 000 dikotilde ve otlar ve tahıllar gibi monokotillerde taç tümör (crown gall) oluşumuna neden olur. A.tumefaciens ‘in taç tümör oluşurmasının nedeni sahip olduğu Ti (Tumour İnducing= tümör oluşumunu teşvik eden) plazmid ‘in T-DNA bölgesini bitki genomuna entegre etmesidir. Ti plazmid 4 bölgeden oluşmuştur. Vir bölgesi T-DNA aktarımı için gerekli Ori bölgesi replikasyon orijin noktası Opin bölgesi bakteri metabolizması için gerekli olan proteinlerin ,octopin ve nopalinin katabolizmasından sorumlu gen bölgesi. T-DNA bölgesi 24 bp’lık sağ ve sol sonlanma bölgeleriyle sınırlandırılmış , bitki büyüme düzenleyici ve opin genlerini taşıyan , bitkilerde tümör oluşumdan sorumlu bölge. T-DNA AKTARIMINDA GEREKLİ OLAN ÖĞELER 1) T-DNA bölgesi 2) Vir genleri 3) Kromozomal genler T-DNA’nın bir bitki hücresine aktarımı 4 aşamada gerçekleşir: 1.Agrobacterium’un bitki hücrelerine tutunması ve koloni oluşturması 2.Virulens genlerin uyarılması 3.T-DNA transferi 4.T-DNA’nın bitki genomuna entegrasyonu Tİ PLAZMİDİN BİTKİLERE GEN AKTARIMINDA KULLANILMASI Vektör sistemleri Ko-entegratif Vektörler İkili (binari/trans) Vektörler