MBKY II-7 Proteinlerin ve Aminoasitlerin Analizi
advertisement
MOLEKÜLER BİYOLOJİDE KULLANILAN YÖNTEMLER II • Proteinlerin Analizi ve Karakterizasyonu • Aminoaasit Analizi ve Karakterizasyonu 1 Protein Analizleri Neden protein analizi yapıyoruz? • Proteinler; bütün biyolojik proseslerde önemli rol oynarlar. Ancak proteinlerin fonksiyonlarını gerçekleştirebilmeleri için 3 boyutlu yapılarını kazanmaları gereklidir. • Protein analizleri; proteinlerin yapıları ve proteinlerin temel bileşeni olan aminoasitlerin dizilişlerinin nasıl olduğunu; proteinlerin fonksiyonlarını ve fonksiyonlarını gerçekleştirebilmek için substratlarıyla ve diğer moleküllerle nasıl bağlandığını açıklar. • Protein analizleri; proteinin yapısına bağlı olarak proteinin fonksiyonunu anlamamıza yardımcı olur. 2 Protein Analizinin Temel Adımları 1. Protein Ekstraksiyonu 2. Protein Purifikasyonu 3. Proteinlerin Karakterizasyonu (Yapısal Analizleri) 3 1. Proteinlerin Ekstraksiyonu Proteinlerin ekstraksiyonu için; Proteolitik inhibatörler (EDTA, Pepstatin) içeren fizyolojik buffer (0.05M NaPO4, PH 7.4) içinde örnek homojenize edilir. Hayvan dokuları proteolitik enzimlerle (tripsin, kolllajen); Bitki dokuları pektinaz ile muamele edilir. Peptidlerin Ekstraksiyonu; : 5 dk. 1M Asetik Asid içerisinde dokular kaynatılır ve 0°C’de Etanol / 0.1MHCl (ratio 3:1) içinde doku homojenize edilir. (doku içinde 4 peptidlerin serbest hale geçişi için) 2. Proteinlerin Pürifikasyonu PROTEİN ÖZELLİĞİ TEKNİK Çözünürlüğüne göre Farklılaştırıcı Çökelme Teknikleri Moleküler büyüklüğüne göre Jel Filtrasyon Kromotografisi Moleküler yüküne göre İyon değişim kromotografisi Hidrofobisitesine göre Ters Faz HPLC Biyolojik aktivitesine göre Afinite Kromotografisi 5 2. Proteinlerin Pürifikasyonu A. Farklılaştırıcı Çökelme (Differential Precipitation) 6 2. Proteinlerin Pürifikasyonu B. Jel Filtrasyon Kromatografisi Moleküler büyüklüğüne göre 7 2. Proteinlerin Pürifikasyonu C. İyon Değişim Kromatografisi Moleküler yüküne göre 8 2. Proteinlerin Pürifikasyonu D. HPLC Hewlett-­‐Packard Series 1100 HPLC Proteinlere çok daha kuvvetli bağlanan yüzeye yüksek basınç uygulanarak proteinlerin yüzeyden çok daha hızlı geçmesi sağlanır. Çözücüler Pompa Enjektör Kolon Dedektör HPLC 2. Proteinlerin Pürifikasyonu E. Afinite Kromatogrofisi Biyolojik aktivitesine göre Specific interactions 3. Proteinlerin Karakterizasyonu 1. Amino asit kompozisyonunu belirlemek Proteinleri oluşturan sayılarının tespiti aminoasitleri ve onların 2. Amino asit dizilişini belirlemek Amino asit sekansını -­‐ sırasını tespit etmek 3. Proteinlerin moleküler kütlesini belirlemek 4. ELİSA, Protein Parmak İzi Analizi, Protein Mikrarray 12 3. Proteinlerin Karakterizasyonu Amino Asit Analizi – Proteinlerin amino asit kompozisyonunu belirlemek için yapılır. – Bir protein örneğini amino asitlerine ayırmak için ilk önce hidroliz (6M HCl ile 110oC’de 24 saat) edilir. Daha sonra kromotografik metotlar ile a.a’ler ayrılır. 3. Proteinlerin Karakterizasyonu Amino Asit Analizi 3. Proteinlerin Karakterizasyonu Amino asit kompozisyonu 1. Peptid hidroliz edilir. 2. Aa’ler HPLC ile ayrılır. 3. Ninhidrin ile reaksiyon sonucu ölçüm yapılır. Alfa aa.’ler yoğun mavi renk, imino asitler (proline, hydroproline) sarı renk oluşturur. 4. Ninhidrin eklendikten sonra tek aminoasitin konsantrasyonu alınabilir. 5. Elüsyon yıkanarak diğerlerinden ayrılması sağlanır. 6. Amino asitin miktarı elüsyon hacmi (kolondan a.a uzaklaştırmak için ihtiyaç duyulan bufferın hacmi) ile tespit edilebilir. 1. AŞAMA: İLERİ DERCEDE SAFLAŞTIRMA 2. AŞAMA: OLİGOMERİK PROTEİNLER İÇİN: MONOMERİK PROTEİNLER İÇİN: ASİT HİDROLİZ DENATÜRASYON ve ILIMLI HİDROLİZ ile alt birimlerin ayrılması ve SAFLAŞTIRILMASI 3. AŞAMA: 4. HPLC ile ayırma Proteinlerin Karakterizasyonu Amino Asit Analizi 2. AŞAMA ASİT HİDROLİZ 24 saat, 110 oC’da 6 N HCl ile işleme sokulur. Böylece peptit bağları kopar ve amino asitler serbest kalır. ~DİKKAT: Bu işlem 3 amino asidi olumsuz etkiler: Triptofan Glutamin Asparagin Triptofan _Glutamik asit + NH3 _Aspartik asit + NH3 _parçalanır Hidrolizattaki NH3 miktarından bu iki amino asidin toplamı bulunur. Triptofanı belirlemek için ayrı bir örnek NaOH ile hidrolizlenir (BAZİK HİDROLİZ). Bu işlem triptofan dışında kalan amino asitleri etkiler. 3. (4.) AŞAMA KROMATOGRAFİ (KATYON DEĞİŞİMİ KROMATOGRAFİSİ: AMİNO ASİT ANALİZÖRÜ) İyon değiştirici reçine (-­‐) yüklüdür. Amino asitler asit ortamda (+) oldukları için önce bu kolona bağlanırlar. Sonra yavaş yavaş pH artırılır. Amino asitler önce α-­‐ COOH gruplarından bir H iyonu kaybederek nötr, sonra da (-­‐) yüklü hale geçerek kolonu terk ederler. AMİNO ASİT ANALİZÖRÜ SON AŞAMA: KANTİTATİF ANALİZ Amino asit + Ninhidrin reaktifi Mor renkli bileşikler (Prolin amino asidi ile sarı renkli bileşik) Bu maddelerin absorpladığı ışık miktarı spektral yöntemle ölçülür. Bilgisayar aracılığıyla kantitatif analiz yapılır Pikler bir kaydedicide sürekli olarak kaydedilir. Her pik bir amino aside karşılık gelir. Mor renkli bileşik Kolonu belli bir sıraya göre terkeden amino asitler elüsyon hacmi denilen (kolondan ayrılmaları için gereken tampon hacmi) bir parametreye göre farklandırılırlar. Önce standart amino asit karışımı kolondan geçirilir ve bir elüsyon profili çıkartılır. Sonra hidrolizat kolondan geçirilir ve elüsyon profili hazırlanır. Bu profil standart karışımın elüsyon profili ile karşılaştırılır. Elüsyon Profillerinin Karşılaştırılması Not: Proteinlerdeki amino asit sayısının hesap yoluyla bulunması • Proteinin molekül bulunabiliyorsa: A.A. Sayısı = ağırlığı biliniyor ya da Proteinin Ma 110 Doğada bulunan amino asitlerin ortalama molekül ağırlığı 138. Peptit bağı oluşumu ile 1 mol su ayrıldığından amino asit kalıntısının ağırlığı 138-­‐18=120; Proteinlerde düşük molekül ağırlıklı amino asitler ağırlıkta olduğu için bu değer (1 amino asit kalıntısının ort. Ağırlığı) 110 olarak kabul edilir. 3. Proteinlerin Karakterizasyonu Amino Asit Analizi • Bir proteinin saflaştırılması, yapı ve fonksiyon araştırmaları için ilk basamağı teşkil eder. • Bir proteinin primer yapısı o protein hakkında önemli bilgiler taşır. Primer yapı bir proteinin kendisine özgü üç boyutlu yapıya nasıl katlanacağının bilgisini taşır ve bu üç boyutlu yapı proteinin fonksiyonunu belirler. • Farklı fonksiyonlara sahip olan proteinler farklı amino asit dizilimlerine sahiptir. • İnsanlarda görülen binlerce genetik rahatsızlık hatalı proteinlerin oluşmasıyla etkilerini gösterir. Bu hatalı proteinlerin üçte birinde amino asit diziliminde sadece tek bir değişiklik vardır. 3. Proteinlerin Karakterizasyonu Amino Asit Analizi • Farklı türlerdeki benzer görevli proteinlerin yapıları incelendiğinde bu proteinlerin benzer amino asit dizilimlerine sahip oldukları görülür. • Bununla birlikte amino asit dizilimi her protein için sabit değildir. İnsanlardaki proteinlerin %20 ila %30’unun polimorfik olduğu tahmin edilmektedir. • Polimorfik proteinler insandan insana farklı amino asit dizilimlerine sahip olabilirler. Polimorfik proteinlerde görülen sekans farklılıkları genellikle proteinin görevini yerine getirmesinde bir sorun teşkil etmezler. • Protein yapısında bazı bölgeler o proteinin üç boyutlu yapıya katlanmasında çok önemli görevler aldıklarından korunmuşlardır. 3. Proteinlerin Karakterizasyonu Amino Asit Analizi •Bir proteinin amino asit dizilimi kimyasal olarak tayin edilebildiği gibi kendisine karşılık gelen genin nükleotid dizilimi kullanılarak da aydınlatılabilir. •Günümüzde pek çok türe ait binlerce proteinin amino asit dizilimi aydınlatılmıştır. •Amino terminal amino asidini tanımlanması için 1-­‐floro-­‐2,4-­‐dinitrobenzen (dinitroflorobenzen, DNFB, Sanger Reaktifi), dansilklorür ve dabsilklorür gibi farklı reaktifler geliştirilmiştir. 3. Proteinlerin Karakterizasyonu Amino Asit Analizi • Amino terminali reaktif ile işaretlendikten sonra peptit hidrolizlenir ve işaretli olan amino asit tanımlanır. • Ancak bu yöntemlerle sekans tayini yapılamaz çünkü hidroliz basamağı peptidi parçalar. 3. Proteinlerin Karakterizasyonu Amino Asit Analizi • Tüm bir polipeptidin dizi analizinin yapılması için Edman degradasyonu metodu kullanılır. • Edman yönteminde sadece N-­‐terminal amino asidi koparılır ve analiz edilir. Peptidin geri kalanı ise aynen korunur. • Peptit bir polimere tutturularak Edman sekans analizinin tamamen otomatik bir şekilde yapılması sağlanabilir. • Ancak yapısında 50’dan fazla amino asit içeren peptitlerin bu yöntemle tayin edilmesi mümkün değildir. • Bu nedenle daha büyük proteinlerin yapısı aydınlatılmak isteniyorsa, Edman degradasyonundan önce protein özel yöntemlerle daha küçük parçalara ayrılır. Proteinlerin Karakterizasyonu Amino Asit Analizi • Bu amaçla öncelikle disülfit bağları kırılır, daha sonra spesifik proteazlarla protein parçalanır. • Polipeptitler kuvvetli asitlerle ısıtılmak suretiyle tamamen kendilerini oluşturan amino asitlere hidrolizlenebilirler. • Her bir polipeptit için elde edilen amino asitlerin bileşimi karakteristiktir. • Ancak hidroliz tek başına yeterli değildir, bazı yan reaksiyonlar nedeniyle bazı amino asitlerin tayini zordur. • Asparajin ve glutamin işlem sırasında aspartat ve glutamata dönüşürken, triptofanın yan zinciri tamamen degrade olur. Serin, treonin ve tirozinin küçük bir kısmı ise parçalanır. 3. Proteinlerin Karakterizasyonu Amino Asit Analizi • Proteazlar arasında sindirim sistemi enzimi tripsin polipeptit bağlarını lizin ve arjinin amino asitlerinden keser. • Bu sebeple tripsin ile muamele edilmiş olan polipeptitten oluşmuş olan parçalar tahmin edilebilirler. • Tripsin veya başka ajanlarca oluşmuş olan peptit parçaları kromatografik veya elektroforetik yöntemlerle tayin edilebilirler. • İlk olarak tripsinle parçalama yapıldıysa farklı bir proteaz kullanılarak ayrı bir parçalama denemesi gerçekleştirilerek peptit parçalarının nasıl birleştikleri bulunur. • Eğer primer yapıda disülfit bağları içeren bir peptit söz konusu ise bu disülfit bağlarının yerlerinin bulunabilmesi için disülfit bağları kırılmadan tripsin ile muamele edilir. 3. Proteinlerin Karakterizasyonu Amino Asit Analizi • Bir polipeptitin dizilimini bulmak için farklı yöntemler de kullanılabilir. • Kütle spektrometreleri kullanılarak 20-­‐30 amino asitten oluşan peptitler 20-­‐30 saniye gibi bir sürede analiz edilebilirler. • Hızlı DNA sekans analizörlerinin gelişimi ile söz konusu proteinin sentezlendiği genin analizi ile de protein dizilimi belirlenebilir. • Ancak bu yöntemlerin uygulanabilir olması için ilgili proteinin veya genin dizi analizinin daha önceden yapılmış olması gereklidir. • Bu sebeple yeni keşfedilmiş bir proteinin analizinde doğrudan analiz metotları kullanılmalıdır. • Belirli bir organizmanın belirli bir zamanda sentezlediği proteinlerin tamamına proteom adı verilir. Proteom analizi genom analizine göre çok büyük zorluklar taşır ancak bir organizmanın proteomunun aydınlatılması ile çok önemli bilgiler elde edilebilir. • Pek çok peptit farmakolojik olarak önem taşır ve üretimleri ticari bir öneme sahiptir. Bu amaçla 3 farklı yöntem kullanılabilir. *Dokulardan peptitler izole edilebilir, *Genetik mühendisliği kullanılarak çeşitli bakterilere ürettirilebilir veya, **doğrudan kimyasal sentezleri gerçekleştirilebilir. • Her yöntemin kendine göre avantaj ve dezavantajları vardır ancak günümüzde kullanılan güçlü teknikler nedeniyle doğrudan kimyasal sentez yöntemi önem kazanmaktadır. 3. Proteinlerin Karakterizasyonu 2. Proteinlerdeki Amino Asit Sekansının Belirlenmesi N-­‐terminal kalıntıların belirlenmesi SANGER YÖNTEMİ DABSİL KLORÜR KULLANIMI EDMAN YÖNTEMİ SANGER YÖNTEMİ • N-­‐terminal amino asidin serbest α-­‐ amino grubu “2,4-­‐ dinitrofluorobenzen” (fluorodinitrobenzen, FDNB) ile reaksiyona girer. DABSİL KLORÜR KULLANIMI • Sanger yöntemindeki FDNB yerine bu madde kullanılır. Daha koyu renkli türevler ortaya koyar, dolayısıyla duyarlılık artar. EDMAN YÖNTEMİ • N-­‐terminal amino asit fenilizotiyosiyanat ile işleme sokulur. Böylece bu amino asidin bir feniltiohidantion türevi oluşur. • Bu yöntemde N-­‐terminal kalıntı ayrıldıktan sonra peptit zinciri sağlam kalır. Bu zincir de işleme sokulur. Böylece 2. amino asit belirlenir. İşlem devam ettirilerek amino asit dizisi ortaya konulmuş olur. Proteinlerdeki Amino Asit SIRASININ Belirlenmesi C-­‐terminal kalıntıların belirlenmesi • Serbest karboksil grubunun hidroksile redüklenmesi R α-­‐Amino alkol C H OH NH2 Bu maddenin kromatografik analizi gerçekleştirilir. Spesifik enzimlerin kullanımı NH2 J K J L COOH ENZİMATİK KESİM (ör. Karboksipeptidazlarla) POLİPEPTİDİN KISA PARÇALARA AYRILMASI • Birçok polipeptit 100’den fazla amino asit içerir. Bu durumda amino asit dizisini bir uçtan başlayarak saptamak mümkün değildir. • Dolayısıyla polipeptit önce kısa peptit parçalarına ayrılır. Bu işlem 2 yolla yapılabilir: KİMYASAL YOLLA SİYANOJEN BROMÜR Polipeptit zincirini metionin kalıntısının karbonil tarafından keser. NH2 Met COOH NH2 ENZİMLER ARACILIĞIYLA SELEKTİF KESİM TRİPSİN ENZİMİ Pankreatik bir enzim olan tripsin, lizin ve arjinin kalıntılarının karbonil tarafındaki peptit bağlarının hidrolizini katalizler. COOH Lys Arg TRİPTİK PEPTİTLER Uzun polipeptid zincirlerini spesifik noktalarda ayıran enzimler Enzim Trypsin Chymotrypsin Pepsin Cyanogen bromide Cleavage Point Lys, Arg (C) Phe,Trp, Typ (C) Phe, Trp, Tyr (N) Met (C) KİMOTRİPSİN • Kimotripsin, fenilalanin, tirozin ve triptofan kalıntılarının karbonil tarafındaki peptit bağlarının hidrolizini katalizler. SONRA: • Kısa peptit parçaları Edman yöntemiyle analiz edilir. • Farklı kesim yöntemleriyle oluşan fragmentlerin dizi analizleri yapıldıktan sonra OVERLAP eden (ÇAKIŞAN) parçalar aracılığıyla kesin sıra saptanır. İlk kesimde oluşan fragmentler: T-­‐U D-­‐E-­‐F L-­‐M-­‐N PQRS A-­‐B-­‐C O G-­‐H-­‐I-­‐J-­‐K L-­‐M-­‐N İkinci kesimde oluşan fragmentler: E-­‐F-­‐G U H-­‐I N-­‐O-­‐P-­‐Q A-­‐B-­‐C-­‐D R-­‐S-­‐T J-­‐K-­‐L-­‐M OVERLAP EDİLEREK OLUŞTURULAN DİZİ: A-­‐B-­‐C-­‐D-­‐E-­‐F-­‐G-­‐H-­‐I-­‐J-­‐K-­‐L-­‐M-­‐N-­‐O-­‐P-­‐Q-­‐R-­‐S-­‐T-­‐U 57 Overlapping identical regions of the individual fragments Günümüzde üç boyutlu yapıların aydınlatılmasında bilgisayar kullanımı çok yaygındır. Protein Tanımlanmasındaki Yaklaşımlar Bu protein nedir? • Moleküler ağırlık • İzoelektrik noktası • Aminoasit kompozisyonu • Diğer fiziksel/kimyasal özellikler • Kısmi ya da tam aminoasit sekansı * Edman (N-­‐terminal sekansı) -­‐ N-­‐term. bloklanmamışsa * C-­‐terminal sekansı – genellikle uygulanmaz * Kütle spektrometresi-­‐ ölçülen bilgi 3. Proteinlerin Karakterizasyonu 3. Kütle Spektroskopisi İle Moleküler Kütlesinin Belirlenmesi Jel Elektroforezi Protein Tanımlanmasında Ne Kadar Yeterlidir? • 1D ve 2D jel elektroforezinden elde edilen bilgi, proteinleri tanımlamada yeterli değildir. • Proteinlerin moleküler ağırlıkları ve izoelektrik noktaları hakkında fikir sahibi olmamızı sağlar. • Posttranslasyon modifikasyonlar ve kesikler proteinlerin moleküler ağırlıklarını ve izoelektrik noktalarını etkileyebilir. Blot kullanımı • Protein tanımlanmasında blot kullanımı 1990’ların ortalarında tercih edilen bir teknikti. • Jel üzerinde dikey doğrultuda elektrik alanı oluşturulur. • Proteinler jel içinde anoda doğru göç eder. • Nitroselüloz gibi bir bağlanma membranına aktarılır. • Coomassie ya da gümüş boyama yapılır. • Başlangıçta edman degradasyonuyla birlikte proteinlerin tanımlanmasında kullanılırken şu an MS analizi için gerekli protein prosesinin seçimini sağlayan bir metod olmuştur. • Metod blotta bulunan proteinin enzimatik parçalanmasına izin verecek şekilde modifiye edilmiştir. • Blottaki noktalar kesip alınır ve Polyvinglpyrrolidone-­‐40 (PVP-­‐40) adlı bir ajanla muamele edilir. PVP-­‐40 membranı kaplar ve enzimin blotlanmış proteine ulaşmasına imkan sağlar. • Enzim mekanizması iki reaksiyonun kombinasyonuyla etkin olur: • Katı faz reaksiyonu: Enzim tutunmuş proteini parçalar. • Solusyon reaksiyonu: Fragmentlerin ileri düzey parçalanmasıdır. Blotlanmış proteinden peptid solusyonu oluşur. Bu peptid solusyonu MS analizi için kullanılır. Proteinlerin Jelde Parçalanması • 1990’ların başlarında geliştirilmiştir. • Jel fikse edilir, proteinler boyanır, fark edilen noktalar jelden kesilerek alınır, uygun şekilde yıkanır ve jel parçalarına enzim solusyonu eklenir. • Enzimle jeli buluşturmak için jel parçaları iyice küçültülür. • Peptidleri elde etmek için bir kaç basamağa daha ihtiyaç vardır. Edman Degradasyonu • 1967 yılında Edman ve Begg adlı araştırmacılar tarafından “Protein Sequenator” adında bir teknik • Proteinlerin N-­‐terminal ucunu kullanarak aminoasitleri tek tek elde etmeye olanak • Daha sonra tekrarlayan kimyasal degradasyon döngüsüyle 20 a.a sekansı yapmak (50’ye kadar) Kütle Spektrometresiyle Protein Tanımlanması • Başlarda sıkıcı, yavaş ve çok fazla örneğe ihtiyaç duyan yöntem • Yıllar sonra teknolojik gelişmeler ve genomik veritabanlarındaki değişiklikler bu tekniğin kullanım fikrinin gelişmesine yol açtı. • Matriks destekli lazer desorpsiyon iyonizasyonu (MALDI) • Time-­‐of-­‐flight (TOF) • Elektrosprey iyonizasyonu (ESI) bu alanda devrim yaratmıştır. Kütle Spektroskopisi (MS) • Bir proteini tanımlamakta kullanılan en temel parametre kütlesidir. Bir proteinin kütlesinin bilinme hassasiyeti arttıkça, onun muhtelif etkileşimlerde aldığı rolü bilme imkânı da artar. • Kütlesindeki değişmelere bağlı olarak, bağlı kofaktör veya metal iyonlarının varlığından, kovalent modifikasyonlara kadar pek çok konuda bilgi edinilebilir. İşte bu nedenle protein kütle spektrometrisi (mass spectrometry – MS), proteomik çalışmalarının temel analitik yöntemidir. • Bu teknik ile proteinlerin kütlelerinin belirlenmesi çok büyük bir hassasiyetle yapılabilmekte ve dizi analizleri, kısa zamanda, yüksek bir doğrulukla ve proteinlerin yapısından kaynaklanan pek çok sınırlamadan (çözünürlük, post-­‐translasyonel modifikasyonlar, serbest N-­‐terminalinin olup olmaması v.b.) etkilenmeksizin yapılabilmektedir. Kütle Spektroskopisi (MS) • İster de novo dizileme adıyla anılan ve doğrudan doğruya kütle spektrometresinden alınan veri üzerinden dizi tespiti yapan teknik için olsun, isterse de daha sonra geliştirilmiş olan, geniş çaplı proteom taramaları için kullanılan ve spektrometreden elde edilen spektrumu geniş veri tabanlarıyla karşılaştırarak dizi ve işlev bilgisine ulaşmaya çalışan sistemler için olsun, geliştirilen dizileri betimlemekte biyoinformatik yöntemleri ve ilişkili tek harfli amino asit kodları kullanılır. Kütle Spektroskopisi (MS) • Kütle spektrometrisi sadece kütle ve dizi analizi yapmaya yarayan bir yöntem olmaktan öte, aynı zamanda çok değerli protein etkileşimleri bilgisine ulaşmamıza imkân verecek bir tekniktir. Protein etkileşimleri zamanımızın ve yakın geleceğin muhtemel en güçlü süper bilgisayarları için bile devre yaktıracak zorlukta birer sorun kaynağıdır. • Küçük sayılacak boyutlardaki proteinler için bile 1030’lar düzeyinde olan muhtemel konformasyonların tüm proteinler için bilgisayarlarca hesaplanmasını hayal etmek bile zorken, bunlar arasındaki tüm etkileşimleri yine bilgisayarlarla ve salt primer dizilere bakarak bulmayı hedeflemek çok zordur. İşte bu konuda da MS analizi ciddi olanaklar sunmaktadır. Kütle Spektroskopisi (MS) • Proteinlerin tanımlanması ve dizisi • Post-­‐translasyonel modifikasyonlarını (Fosforilasyon, N-­‐ veya C-­‐ terminal modifikasyonları, Glikolizasyon vb.) • Proteinlerin kütlelerinin belirlenmesi • Proteinlerin işlevleri ve birbirleri ile olan ilişkilerini (etkileşimleri) gibi pek çok çalışma ile proteomik için temel bir yöntemdir. * 1960’lardan beri pek çok basit yapılı bileşiğin yapısal analizi için kullanılan bu teknik, uzunca bir zaman karmaşık organik moleküller için kullanılamamıştır. Nedeni uygulamada ilgili bileşiğin buharlaştırılması ve iyonize edilip vakum ortamında ivmelendirilmesinin zor olmasıydı... Proteinler çok kuvvetli moleküller arası etkileşimler içerdiğinden pek çok organik bileşik gibi proteinlerin teorik ve pratikteki buhar basınçları sıfırdır. Bu tür bileşikleri buharlaştırmada ciddi yapısal degredasyonlar oluşmakta ve aynı şekilde iyonizasyon süreçleri de muhtelif zorluklar taşımaktadır. Bu nedenle uygulama, uzunca bir süre mümkün olamamıştır. Bu gidişatı değiştiren şey ise proteinleri tahrip etmeden buharlaştırıp, iyonize etmeyi başaran biri Nobel ödüllü iki tekniğin geliştirilmiş olmasıdır. • Bu aşamada buharlaşmış ve iyonize olmuş protein ve/veya peptit molekülleri spektrometrik analize hazır durumdadır. Bir kütle spektrometresinin algılayıcısı tıpkı bir fotomultiplikatör gibi çalışır. • Detektörün çalışma biçimi, iyonun hedefe çarpmasının yarattığı güçle oluşturulan ve hedeflendirildiği zıt yüklü plakalar ile gücü artırılan bir elektron sağanağının oluşturulması üzerine kuruludur. Sonuçta en küçük yük için bile hissedilir bir sinyal oluşturulur. • Cihaz, moleküllerin kütlelerini değil yük kütle oranlarını ölçebilir. Zira temel olarak bilinenler, moleküllerin kaynaktan çıktıktan sonra hedefe varıncaya kadar geçirdikleri süre ve buna bağlı olarak da hızları ile detektöre ulaşan belirli bir türün orada bıraktığı elektriksel yüktür. Hedefte bırakılan yük hem moleküllerin taşıdığı yük ile hem de miktarları ile doğru orantılıdır. Aynı şekilde kaynaktan aynı anda çıkan moleküllerden hangisinin hedefe daha önce çarpacağını da hızı belirler. Kütle Spektroskopisi (MS) •Kütle spektrometrisi “Mass spectrometry” MS, bir örnekteki iyonik maddeleri kütle farklılıklarına göre ayırır. •Moleküler ağırlığın iyon yüküne oranını ölçer (m/z). •Esas temeli; *Peptidleri buharlaştırmak (Elektro-­‐sprey-­‐Lazer uygulaması) *İyonların miktarını belirlemek (İyon kapanı (Ion trap), TOF) • Kütle spektrometresi 3 kısımdan oluşur. •İyon kaynağı •Kütle analizörü •Detektör sistem Kütle Spektroskopisi (MS) • Aşamalar: – Örneklerden iyonların elde edilmesi – Farklı kütlelerdeki iyonların ayrışımı – Kütle spektrumunun oluşması için verilerin biriktirilmesi Tandem Mass-­‐Spectrometry 2D Elektroforez Proteinlerin Peptidlere Ayırımı MPSERGTDIMRPAKID...... protein GTDIMR PAKID MPSER …… …… peptides HPLC To MS/MS Mass Spectrometry Matrix-­Assisted Laser Desorption/Ionization (MALDI) From lectures by Vineet Bafna (UCSD) Tandem Mass Spectrometry S#: 1707 RT: 54.44 AV: 1 NL: 2.41E7 F: + c Full m s [ 300.00 -­ 2000.00] RT: 0.01 -­ 8 0.02 90 Relative Abundance 80 LC NL: 1.52E8 Base Peak F: + c Full ms [ 300.00 -­ 2000.00] 1991 1409 2149 1615 1621 1411 2147 1611 70 1387 60 1593 1995 1655 1435 50 1987 1445 1661 40 1937 1779 30 1095 2205 2135 2017 1307 1313 20 2155 2001 2177 90 85 80 75 70 65 60 55 801.0 50 45 40 35 Scan 1707 638.9 30 25 2207 1105 MS 95 Relative Abundance 100 638.0 100 1389 1707 2329 872.3 1275.3 15 687.6 10 2331 10 1173.8 20 944.7 783.3 1048.3 5 1212.0 1413.9 1617.7 1400 1600 1742.1 1884.5 0 200 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 Time (min) 50 55 60 65 70 75 400 600 800 1000 m/z 1200 1800 2000 80 S#: 1708 RT: 54.47 AV: 1 NL: 5.27E6 T: + c d Full m s2 638.00 [ 165.00 -­ 1925.00] 850.3 100 95 687.3 90 Ion Source 588.1 80 75 MS/MS 70 65 Relative Abundance collision MS-­2 MS-­1 cell 85 60 55 851.4 425.0 50 45 949.4 40 326.0 35 524.9 30 25 20 589.2 226.9 1048.6 1049.6 397.1 489.1 15 10 629.0 5 0 200 400 600 800 1000 m/z 1200 Scan 1708 1400 1600 1800 2000 Tandem Mass Spektrometri ile Protein Tanılanması MS/MS instrument S#: 1708 RT: 54.47 AV: 1 NL: 5.27E6 T: + c d Full m s2 638.00 [ 165.00 -­ 1925.00] 850.3 100 95 687.3 90 85 588.1 80 75 70 65 Relative Abundance S e q u e n c e 60 55 851.4 425.0 50 45 949.4 40 326.0 35 Database search •Sequest de Novo interpretation •Sherenga 524.9 30 25 20 589.2 226.9 1048.6 1049.6 397.1 489.1 15 10 629.0 5 0 200 400 600 800 1000 m/z 1200 1400 1600 1800 2000 Kütle Spektrometrisi işlem sırası; 1. Protein örneklerinin ilgili kaynaktan izolasyonu. 2. Protein örneğinin bir ön eleme oluşturmak maksadıyla SDS-­‐ PAGE veya 2D-­‐PAGE ile ayrıştırılması. 3. Jelden kazanılan proteinlerin dizi özgül proteazlarla peptitlere parçalanması. 4. Peptitlerin HPLC veya Ion-­‐Exchange kromatografisi yöntemlerle ayrıştırılıp mümkün mertebe saflaştırılması. 5. Oluşan her bir örneğin buharlaştırılıp iyonize edilmesi. 6. İyonize buhar üzerinde spektrometrik analiz yapılması. 7. Verilerin incelenmesi. gibi Kütle Spektroskopisi (MS) 1. İzolasyon • Proteinlerin kaynaktan izolasyonu pek çok standart prosedür ile gerçekleştirilebilir. Bu işlemde kullanılacak prosedür hedeflenen analize göre belirlenir. • Eğer kaynağın proteom analizi yapılacaksa tam protein izolasyonu yapılır. • Ancak özel bir protein veya protein grubu çalışılacaksa bunların izolasyonuna yönelik prosedürler uygulanır. MS 2. PAGE • Ön eleme basamağıdır. Zira PAGE ile ayrıştırılan proteinlerin aynı kütlede olanları aynı bantta toplanır (denatüre koşullarda!). 2D (iki boyutlu) PAGE uygulamasında bile jel üzerindeki tek bir lekenin sadece bir proteine ait olduğu kesin değildir. • Yine post-­‐translasyonel modifikasyonlar pek çok sorunlara neden olur. Bu nedenle genelde PAGE sonrası oluşan bantları kesip her bir banttan kazanılan proteinlerin kütle spektrometrik analizinin ayrı ayrı yapılması gerekir. • Pek çok klasik yöntemle belirlenemeyecek kadar düşük miktardaki proteinler bile MS ile saptanabilirler. Bu nedenle özellikle aranılanın bilinmediği durumlarda ön eleme basamakları işlemin karmaşıklığını azaltma ve ön bilgi edinme aşaması olarak görülmeli, izolatın tamamı için MS analizi yapılmalıdır. MS 3. Dizi Özgül Proteazlarla Muamele • Kütle spektrometrisi, uzun zincirli polipeptitlerin yüksek bir etkinlikle iyonize buhar haline getirilememesi ve son derece karışık bir spektrum üretmesi nedeniyle genellikle en yüksek etkinlikle 500 – 3000 Dalton aralığındaki polipeptitler için sonuç üretir. • Tek bir proteinin çalışılacağı ve iyi ayarlanmış koşullarda bu basamak atlanabilir. Ancak geniş ölçekli proteom analizlerinde temel basamaklardan biridir. Veri tabanlarının birbiri ile tutarlılığını sağlamak ve böylece karşılaştırma kolaylığı yaratmak amacıyla genellikle tripsin kullanılır. Tripsin kullanımının bir diğer nedeni de karboksi terminalinde bazik amino asitler bırakarak aşağıda açıklandığı gibi analizi daha kolay ‘y’ türü iyonlar oluşturmasıdır. Tripsin iki farklı bölgeye özgüldür (Arg-­‐C ve Lys-­‐C). Yani polipeptit zincirinde her arjinin ve lizin amino asidinin C-­‐ terminalindeki a.a. ile arasındaki bağı hidroliz eder. Ayrıca fiziksel dayanımı olup kolay bir kullanım sağlar. MS 3. Dizi Özgül Proteazlarla Muamele • Yaygın kullanılan bir diğer dizi özgül proteaz ise Endopeptidaz Lys-­‐C ’dir. Bu enzim 8M üre gibi gerçekten zorlayıcı koşullar altında bile etkindir. Özellikle çözünür hale getirilmesi zor olan veya diğer proteinlerle güçlü etkileşimleri olan proteinlerle çalışılırken kaçınılmaz olan denatüre edici koşullarda kullanımı, olumlu sonuçlar verir. Seçilen enzimin dizi özgüllüğün sebebi ise mümkün mertebe birbiri üzerine çakışmayan ve kısmen de olsa öngörülebilir parçaların oluşmasının sağlanmasıdır. MS 4. Peptitlerin Ayrıştırılması: • Oluşturulan polipeptitler HPLC veya Iyon Değişim kromatografisi gibi yöntemlerle saflaştırılarak ayrı ayrı (MALDI tekniğinde) veya doğrudan doğruya kolon çıkışının analize yönlendirilmesi ile (ESI tekniğinde) incelemeye alınabilir. Bu basamağın temel amacı spektrumun zaman ölçeğinde genişliğini artırmak ve incelenmesini kolaylaştırmaktır. • Molekülleri önce yük/kütle oranına göre ayrıştıran ve çarpışma hücresine sırayla aktaran cihazlar ve teknoloji mevcutsa da bu ön ayrıştırmanın en azından iki önemli faydası olacaktır. 1. spektrum aralıklarını mili saniyelerden dakikalara çıkacak olması, 2. aynı yük/kütle oranına sahip olabilecek muhtemel moleküllerin daha önceden hidrofobisite veya izoelektrik nokta pH’sı gibi özelliklerine göre ayrıştırılarak iç içe geçmiş spektrumların oluşumunun engellenecek olmasıdır. MS 5. Buharlaştırma ve İyonizasyon: • Yukarıda belirtilen nedenlerden dolayı en sorunlu aşama buharlaştırma ve iyonizasyon basamağıdır. Bu iş için geliştirilmiş iki farklı teknik vardır. Bunlar; ESI ve MALDI’dir. a. ESI (Electrospray Ionization, 2002 Nobel Kimya ödülü): •İlk olarak 1988/1989 yıllarında Münster Üniv. Deneysel fizik grubundan Prof. Dr. M. W. Benninghoven tarafından uygulanmıştır. Bu teknik doğrudan HPLC kolonunun çıkışında uygulanır. Kolonun ucuna çapı, kolon çapından çok daha küçük (~8μm) bir iğne yerleştirilir. Bu iğnenin çıkışı çok daha dar olup nm ölçeğindedir ancak uygulamanın ardından basınç ve sürtünme etkileri nedeniyle 1–2 μm’ye kadar genişler. •İğne ile çıkış yönündeki levha arasına yüksek bir potansiyel fark uygulanır (~birkaç kV kadar). Oluşan püskürme sonucu son derece küçük damlacıklar oluşur. Akış hızının 20nl/dak veya daha az olduğu koşullarda damlacık çapı ~200nm veya daha azdır. Eğer analit konsantrasyonu 1pmol/μl düzeyinde tutulmuşsa o zaman her damlacık başına yaklaşık 1 polipeptit molekülü düşer. Damlacığın uçuşu sırasında taşıyıcı faz hızla buharlaşır (oda koşullarında) ve yüksek potansiyel fark nedeniyle damlacığın üzerinde oluşan yük, polipeptide aktarılır. • Polipeptit molekülleri iyonlaşan su ve amonyak gibi taşıyıcı faz moleküllerinden aldıkları protonlar nedeniyle pozitif yüklenirler. • Taşıyıcı faz, pozitif yüklü iyonların oluşumunun kolaylaştırılması için çoğu zaman asidik pH’da tutulur. Birden fazla analit içeren damlacıklar aynı yüklü analit moleküllerinin birbirlerini itmesi nedeniyle parçacık yarılması denilen bir süreçle ayrışırlar. • Sonuçta buhar fazında ve iyonize olmuş polipeptit ve/veya protein molekülleri oluşturulmuş olur. Dikkat edilirse istenilen sonucun elde edilebilmesi tamamen kalibrasyona bağlıdır. Molekülün başka moleküllerle etkileşime girmemesi ve istenilen düzeyde elektrikle yüklenmesi hep koşulların ayarlanması ile sağlanır. • İdeal düzeyde iyonlaşmış buhar, iğne çıkışı istikametinde bulunan ve negatif yüklü olan bir levhanın ortasındaki küçük açıklıktan vakum ortamına girer (Şekil.17). Artık MS analizi başlamış olur. b. MALDI (Matrix-­‐Assisted Laser Desorption/Ionization): • Bu teknikte analit (polipeptit karışımı) kendisine kıyasla aşırı miktarda olan ve morötesi soğurucu karakterde olan bir matriks içine gömülü olacak şekilde hazırlanır. Matriks malzemesi genelde düşük molekül ağırlıklı aromatik yapılı organik asitlerden seçilir (gliserol, tiyogliserol veya nitrobenzil alkol gibi bileşikler de kullanılır). • Bu yapıya uygun dalga boyunda lazer ışını gönderilmesi ile matriks molekülleri süblimleşir ve bunlara göreli olarak çok düşük miktarda olmaları nedeniyle birbirleri ile temas halinde olmayan polipeptit molekülleri kendilerini gaz fazında bulurlar. Bu ortamda meydana gelen çok sayıda çarpışma sonucunda çeşitli miktarlarda artı ve eksi yüklenmiş polipeptit molekülleri oluşur. • Artı yüklü moleküller bir elektrik alan yardımıyla buharlaşma yüzeyinden uzaklaştırılıp spektrometreye yönlendirilirler. Bu yönlendirme elektrikle yüklü bir ekstraksiyon ızgarası ile yapılır. MALDI (Matrix-­‐Assisted Laser Desorption/Ionization) • Aslında böylece birbirlerinden gelişi güzel uzaklıklarda bulunan iyonların mümkün mertebe aynı düzlemde toplanması da sağlanmaya çalışılır. Bu sayede sırf daha geriden geldiği için daha büyük kütleli bir molekülle aynı anda detektöre varan küçük kütleli moleküllerin varlığı gibi sorunlar engellenir. Ayrıca kullanılan organik asitler ve lazerin dalga boyu, matriks moleküllerinin iyonlaşmaları ve böylece polipeptitleri de iyonlaştırmaları için özel olarak seçilir. • Aslında MALDI, temel kavramı itibariyle Protein Kütle Spektrometrisi çalışmalarını başlatan yöntemdir. Eskiden “Hızlı Atom Bombardımanı” (“FAB-­‐MS / Fast Atom Bombardment – MS”) gibi tekniklerle bu temel mantık uygulama alanı bulmuştur (bu amaçla genel olarak yüksek hızlı Sezyum iyonları [Cs+] kullanılmış). MALDI (Matrix-­‐Assisted Laser Desorption/Ionization) • Ayrıca teknik sadece proteinler için değil pek çok başka biyolojik ve organik molekül için de kullanılmış ve hala da kullanılmaktadır. Eskiden MS uygulaması için proteinlerin polariteleri de kimyasal olarak düşürülürdü. Bu amaçla özellikle arjinin amino asitlerinin guanido grupları hidrazinoliz ile uzaklaştırılır ve bütün amino grupları asetik anhidrit ile asetile edilirdi. Ardından bütün karboksil, hidroksil ve NH grupları kuvvetli bir baz ile permetile edilip, ardından metil iyodat ile muamele edilip metilenmiş halde bırakılırlardı. MALDI ve özellikle ESI’nin gelişmesi bu uygulamaları gereksizleştirmiştir. • Tanaka (Japonya) ve Hillenkamp/Karas (Almanya) tarafından geliştirildi • Peptid analizi MALDI plağında uygun matriks içinde kristalizasyona uğrar. • Plaka bir nitrojen (N2) lazer tarafından 337 nm U.V. ışına maruz bırakılır. -­‐Matriks lazer enerjisini absorbe eder. -­‐Enerji yüzeyden analite transfer olur. Analit proton transferiyle iyonize hale geçer. -­‐İyonlar kütle analiz birimine aktarılır (TOF). MALDI MALDI • Enerjiyi pompalamanın en iyi yolu lazer ışınlaması yapmaktır. • Bu nedenle lazer dalgaboyunu güçlü şekilde absorblayacak bir madde matriks olarak seçilir. • En uygun matriks maddesi aromatik moleküllerdir. MALDİ Matriksleri MS 6. MS Analizi • Pek çok farklı çeşit kütle spektrometresi vardır. Farklı zamanlarda alınan farklı güçlerdeki sinyallere göre m/z oranının tespitinde kullanılan yöntemler cihazdan cihaza farklılık gösterir. • TOF (Time of Flight) türü cihazlarda ölçüm, cihazın içindeki yol boyunca kaydedilen zamanın türevidir. Doğaldır ki farklı kütle ve aynı yüke sahip moleküller, sabit bir elektrik alanda, aynı anda ivmelendirilirse; üzerlerine etkiyen kuvvet aynı olacağından, belirli bir zaman sonundaki hızları kütleleri ile ters orantılı olur. Bu nedenle MALDI gibi moleküllerin çıkış zamanının aynı olduğu bir sisteme eklenen TOF türü bir kütle spektrometresi aynı yükü taşıyan moleküller için, zamana karşı, en düşük kütleliden en yüksek kütleliye doğru olmak kaydı ile bir spektrum verir. Bu spektrumda her bir pikin şiddeti ilgili türün göreli miktarı ile doğru orantılıdır. “ Time-­of-­flight ” (TOF) analizöründe iyonları hızlandırmak için elektrik alan kullanılır ve sonra iyonların dedektöre ulaşmasıyla ölçüm alınır. İyonların dedektörde toplanma süreleri (“Time-­of-­ flight”) iyonik yükleri ile doğru;; molekül ağırlıkları ile ters orantılıdır. Yani daha hafif iyonlar dedektöre daha hızlı ulaşır. 102 Time of Flight (TOF) • • • • TOF’da Reflektron Bir grup halkasal lensten oluşur ve bunlar bir yığın halinde bulunurlar. Sürekli artan bir yüksek potansiyel halkalara uygulanır. Reflektron biriminde iyonlar yüksek kinetik enerjiyle ivmelendirilir. İyonlar flight tüpü boyunca hız farklılıklarına göre ayrılır. Detektöre çarpan iyonlar kuvvetlendirilerek sayılır. • Hareket anında her peptid bir paket iyonla temsil edilir. Bu iyonlar dar bir aralıktaki kinetik enerjiye yani hıza sahip olarak hareket ederler. • Hızlı hareket eden iyonlar reflektrona ilk ulaşanlardır. Sahip oldukları yüksek kinetik enerjiden dolayı reflektronda daha fazla ilerlerler. Kinetik enerjileri sıfır oluncaya kadar bu hareket devam eder. • Bu arada diğer iyonlar da reflektrona giriş yaparlar. Bu iyonlar yönleri değiştirilmeden önce reflektron içinde daha az mesafe katederler (kinetik enerjileri daha az daha çabuk sıfır noktasına ulaşırlar). Bunun sonucunda yavaş hareket eden iyonlar iyon paketinin önündeyken hızlı hareket edenler arkasında kalır. MALDİ-­‐TOF • Moleküller aynı yüke sahip olduklarında kütleleriyle orantılı bir hıza sahip olacaklardır. • Genel olarak MALDI’de peptidler +1 yüklüdür. • Peptidler kütlelerine göre flight tüpün içinden geçerler ve farklı zaman aralıklarında detektöre çarparlar. • Kütle spektrometresi verileri kolayca m/z oranına dönüştürür. MALDI-­‐TOF Kütle Spektrometresi Kütle Spektrometrik Verilerle Proteinlerin Tanımlanmasında Kullanılabilecek Veritabanları; Mascot (Matrix Science) for peptide mass fingerprints Mascot (Matrix Science) for peptide mass fingerprints Mascot (Matrix Science) for peptide mass fingerprints Protein analizinde “top-­‐down” stratejisi: • Kütle spektrometresinde proteinlerin iyonizasyonu için kullanılan iki yöntem vardır. – Elektrospray iyonizasyonu (ESI) – “Matrix-­‐assisted laser desorption/ionization” (MALDI) • Proteinler öncelikle bu yöntemlerden biriyle iyonize edilir ve daha sonra bir kütle analizörüne girer. MALDI-­‐TOF Timed ion selector Laser Sample plate Accelerating field + + + + Reflector + + + Flight tube Detectors Protein analizinde “bottom-­‐up” stratejisi: • Proteinler elektroforetik ayrışımdan sonra enzimatik olarak kesilir (tripsin veya pepsin) ve daha küçük peptidler oluşur. • Biriken peptid ürünleri daha sonra kütle analizörüne girer. • Bu yönteme peptid kütle parmakizi (PMF) denir. Bilinmeyen Proteinleri Tanılamada en hassas metod MS Proteinlerin Üç Boyutlu Yapısının Belirlenmesi Bir proteinin amino asit dizilişinin belirlemesi sadece proteinin birincil yapısını aydınlatır ve tam yapısını (ikincil, üçüncül ve dördüncül yapılarını) belirlemek için yeterli değildir. Burada moleküller ve bağlar sisteminin uzaydaki konumları ve proteinin üç boyutlu yapısı belirlenir. Bunun için çok daha ileri teknoloji gerektiren ileri fiziksel yöntemler kullanılır. Bunlar: • X-­‐ışını difraksiyonu • NMR • Elektron mikroskobisi gibi yöntemlerdir. Proteinlerin Üç Boyutlu Yapısının Belirlenmesi • Ancak bir proteinin ikincil ve üçüncül yapısının belirlenmesi hiç de kolay değildir. Bu yüzden amino asit dizilişi bilinen proteinlerin sayısı ile üç boyutlu yapıları aydınlatılmış olan proteinlerin sayısı arasında büyük fark vardır. • Bir proteinin amino asit dizilişinden o proteinin üç boyutlu yapısı hakkında bir fikir edinmek için bilinen proteinlere göre hazırlanmış istatistiksel yöntemlerden veya fizikokimyasal kriterlerden yararlanılır, ancak bu yöntemlerin doğruluk oranı da %50-­‐70 arasında değişir. • Şimdilik genellikle bir proteinin üç boyutlu yapısı, çeşitli polipeptidlerin amino asid dizilişleri ile üç boyutlu yapıları ile hazırlanan bilgisayar programlarından yararlanılarak olasılık hesapları yapılarak aydınlatılmaya çalışılmaktadır. Günümüzde üç boyutlu yapıların aydınlatılmasında bilgisayar kullanımı çok yaygındır. X-­‐ray ile proteinin yapı analizi X-­‐Işını Kristalografisi • proteinlerin üç boyutlu araştırmada kullanılır. yapısını • X-­‐ışınlarının dalga boyları küçük olduğundan moleküllerdeki atomlar arası boşlukları araştırmada kullanılabilir. • Bir solüsyon içinde hazırlanan kristaller aynı maddenin düzenli tekrarıyla oluşurlar. Kristallere gönderilen X-­‐ışını kırınımlarının filme yansımasıyla pek çok molekülün yapısı tayin edilebilir. • Filme yansıyan noktaların şekli kristal içindeki molekül yapısını gösterir. X-­‐Işını Kristalografisi • Buna göre proteinin içerebileceği α sarmal ve β tabaka motifleri belirlenebilir. • Protein içi kimyasal bağlar hakkında bilgi edinilebilir. • Tüm verilerin toplanmasıyla proteinin üç boyutlu yapısı anlaşılabilir. • Bazı proteinlerin kristalize olmaması bu yöntemin kullanımını kısıtlar. Maurice Wilkins ve Rosalind Franklin tarafından incelenen DNA X-­‐ışını Kristalografisi ve DNA modeli NMR Spektroskopisi • • • • Proteinlerin üç boyutlu yapısını araştırmada kullanılır. NMR için yüksek saflıkta protein örneği kullanılır. Doğal veya rekombinant proteinler için uygulanabilir. Küçük proteinlerin (35kDa) yapı analizi için uygundur. Yüksek manyetik alana (800MHz) sahip bir NMR spektrometresi NMR Spektroskopisi • Elektromanyetik bir alana konulan yüklü bir çekirdek α (düşük enerjili pozisyon) ve β olmak üzere iki şekilde hareket edebilir. • NMR spektrometresi çekirdeğin α dönüşünden β dönüşüne (düşük enerji seviyesinden yüksek enerji seviyesine ) geçmesi için gereken elektromanyetik radyasyonun frekansını ölçer. • Bu değer kullanılan çekirdek tipine (1H, 13C, 15N) göre değişir. • Deney sonucunda alınan değer ile teoride olması gereken değer arasında fark vardır ve bu fark bize çekirdeğin çevresindeki elektron yoğunluğu hakkında bilgi verir. • Böylece çekirdeğin ilişkide olduğu veya çevresindeki atomlar belirlenebilir. Dengedeki Örnek uyarılma gevşeme Uyarılma durumu Gözlem Spektrum NMR ile protein yapı analizi NMR Spektroskopisi • Kimyasal olarak indüklenmiş dinamik nuklear polarizasyon (CIDNP): Proteinlerin gerçek zamanlı katlanmalarıyla yapılarındaki değişimleri takip etmeyi sağlayan bir NMR yöntemidir. Olumlu ve Olumsuz Yönleri • NMR kristal oluşumu gerektirmediği için kimi durumlarda üstünlük sağlayabilir. Ancak büyük proteinlerde NMR yöntemi verimli sonuç vermez. • Büyük moleküllerin NMR spektroskopisinde piklerin çakışması sorunu isotopik etiketleme ve çok boyutlu deneyler ile aşılmıştır. • Büyük moleküllerin analizi ile ilgili diğer bir sorun ise mıknatıslanmanın daha hızlı gevşemesidir. • Pikler daha geniş, güçsüz ve sonuçta görünmez olur. • Bu durum daha kısa sürede sinyal yakalanmasını gerektirir. • Bu gevşemeyi azaltmak için “ Transverse relaxation optimized spektroscopy (TROSY)” yöntemi geliştirilmiştir. Proteinlerin Tanımlanmasında iki temel yaklaşım kullanılmaktadır: • 2D-­‐jel temelli yaklaşım • Jel temelli olmayan yaklaşım Proteomik Araştırmalardaki Genel Strateji: • Örneklerin Hazırlanması (Saflaştırma, çözünürleştirme, yüksek miktarda bulunan proteinlerin uzaklaştırılması) • Protein ve Peptidlerin ayrılması (2D-­‐elektroforez; 2D-­‐sıvı kromatografisi) • Ayrılan proteinlerin ve peptitlerin değerlendirilmesi (Kütle Spektrometrik Teknikler: MALDI-­‐TOF, ESI-­‐TOF, LC-­‐MS/MS ve peptit kütle parmak izi) Protein Karışımı Ayırım 2D-­PAGE MALDI-­TOF Spot Proteinler Kesimi Peptitler Tripsin ile muamele Peptit kütle parmakizi Veritabanı Araştırmaları ESI-­MS/MS Tandem MS Spektrumu Proteinlerin Tanımlanması ve post translasyonal modifikasyonlar 2D-­Jel Temelli Yaklaşım Kesim Protein karışımı Peptit Karışımı Ayırım Peptitler MS-­MS μHPLC, 2D-­LC, AffiniteKromatografisi Ayırım 2D-­ HPLC LC-­MS/MS Peptit fraksiyonları Protein Tripsin uygulaması fraksiyonları Jel Temelli Olmayan Yaklaşım Veritabanı araştırmaları Tandem MS spektrum Proteinlerin Tanımlanma sı Protein Parmakizi Yöntemi • Protein yapısı bozularak çeşitli boylarda peptidler oluşturulur (Tripsin + siyanojen bromür). •Jel elektroforezi veya kromatografik yöntemlerle protein parmakizi çıkarılır. Protein Mikroarray • Protein moleküllerinin, belli bir düzende cam bir yüzeye bağlanmalarıyla oluşturulur. • Kullanım alanları – – – – proteinlerin varlığının ve miktarının belirlenmesi protein-­‐protein etkileşimi protein-­‐nükleik asit etkileşimi enzimlerin substratlarının bulunması • Protein analizleri, fen bilimleri araştırmaları ve farmosötik endüstrisinde önemli bir araç olarak karşımıza çıkar. Protein Analizinin Amaçları: *Hastalıkların Kesin Tanısının Konmasında -­‐ kalıtım tipinin belirlenmesi (X’e bağlı, dominant) -­‐ Gendeki mutasyonların araştırılmasında nereden başlanması gerektiğinin belirlenmesi *Bazı durumlarda prognosis için yardımcı –Mutasyon tipinin belirlenmesi (ör: çerçeve kayması) –Gen terapi için hayvan modellerinin geliştirilmesi • Mutasyonları içeren işlevsel olarak önemli bölgelerin yerleşimlerinin belirlenmesi • Birbirleriyle etkileşim içinde olan proteinlerin tanımlanması En çok karşımıza çıkan çalışma alanları ELISA (Enzyme linked Immuno-­‐Sorbent Assays) ve Kütle Spektrometrisi (MS)’dir. ELİSA ELİSA • ELISA: hedef bir molekülü spesifik olarak tanıyan ve bağlanan antikorlar, enzimler ile kombine kullanılarak bağlanma olayı sonrasında hedef molekülün pikogram düzeyine kadar saptanmasında kullanılır. •Kullanım Alanları: -­‐ Potansiyel ilaç adaylarının optimizasyonu ve sınıflandırılması -­‐ Klinik öncesinde hayvansal çalışmalarda ve klinikte insan kaynaklı örneklerin araştırılması -­‐ Endüstride ürünlerin test edilmesi (kalite kontrol) -­‐ Mikroorganizmların tanı ve teşhisinde Enzyme-­‐linked immunosorbent assay (ELISA) • Antijen-­‐antikor ilişkisini, antikora bağlanmış bir enzimin aktivitesini araştırmak temeline dayanan kantitatif ölçüm yöntemidir. • Antijene karşı antikor ya da antikora karşı antijen aramak mümkündür. • Virüs ve parazit enfeksiyonlarında kullanılan bir tanı yöntemidir. ELISA Yöntemi •“ELISA plate” antikor ile kaplanır. Antijen miktarı belirlenecek olan örnek kuyulara yüklenir. Antijen ile antikorun bağlanması beklenir. •Bağlanmamış veya özgün olmayan proteinler yıkama ile uzaklaştırılır. •Enzim bağlı ikincil antikorlar eklenir ve bunlarda antijen-­‐antikor yapısına bağlanır (sandviç yapısı). •Enzimle etkileşecek substrat eklenerek oluşan ışıma ile protein miktarı spektrofotometrik olarak ölçülür. Sandviç ELISA Sandviç ELISA Son.. KURAL: Protein analizinden önce PÜRİFİKASYON (SAFLAŞTIRMA) Pürifikasyon;; Proteini diğer protein ve hücresel bileşenlerden ayırmaktır. Ayırma Stratejileri H2O’dan Tuz ve küçük iyonlardan Diğer proteinlerden H2O’dan ayırma (Konsantrasyon) Çökelme Salting out (Amonyum sülfat) Organik çözücüler (etanol, aseton) Ağır metaller ve tuz (Trikloroasetik asit) Protein çözeltisinde protein-­‐protein etkileşiminde; Dehidrasyon Liyofilizasyon Osmoz Tuz ve küçük iyonlardan Büyüklüğe bağlı difüzyon Start Diyaliz Jel filtrasyon End Diyaliz Jel filtrasyon Jel filtrasyonun Temeli Penetrating the beads slows the migration rate of the smaller particles Proteinden Protein KURAL: Protein-­‐Protein ayırımları proteinlerin fiziksel özelliklerindeki farklılıklara dayanır. Major: Büyüklük ya da moleküler ağırlık pH noktalarına göre (izoeletrik nokta) Yapısal özelliklerine, biyolojik aktivitelerine göre Minor: Suda çözünme, Tuz solüsyonu ya da organik çözücüler Proteinlerin ayırımı için en etkili metod; KROMATOGROFİ Kromatogrofi: (lit., renk ile ayırma) Hareket gücü (Moving force) Mobile –hareketli-­‐faz Karşıt güç (Opposing force) Durağan faz Ayırım tipleri Kolon Kr. – çekim yada pompa Elektroforez-­‐ elektrik alan Osmotik hareket Medium: JEL YÜKLÜ REZİNE GAZ-­‐LİKİD AFİNİTE REZİNE KAĞIT (boyutuna ) (yük afinitesine) (hidrofobik etkileşimine) (ilgisine) (-­‐) Proteinlerin Özelliklerine Göre Proteinlerin Tayini 280 nm’de Absorbans (UV) Trikloroasetik asid çöktürmesi Proteinlerin Nicel Özelliklerine Göre Tayini Nitrojen İçeriği(16%) Kjeldahl test Kolorimetrik Testler Bradford Analizi vb. 280 nm’de Absorbans E 1% = 10 (10 mg/ml) Proteinlerin Yapısal Analiz Kompozisyonu Asit Hidrolizi 6 N HCl, 105 oC, 18-­‐24h Peptid bağlarının kırılması Sekans Analizi Edman Degragasyonu N-­‐terminal ucun uzaklaştırılması Proteinlerin Karakterizasyonu MOLEKÜLER KÜTLESİ Kilodaltons MOLEKÜLER AĞIRLIĞI No Units Doğrudan Moleküler Ağırlık Sedimantasyon Analizleri Göreceli Moleküler Ağırlık SDS Elektroforez Jel Filtrasyonu (MR)
