(2009) Endokrinoji ve Metabolizma

advertisement
Clinical Chemistry 55:9, 1672–1679 (2009)
Endokrinoji ve Metabolizma
Prokalsitoninin Amino Terminal Variyantlarının Selektif Ölçüm Yöntemi
Method for the Selective Measurement of Amino-Terminal Variants of Procalcitonin
Joachim Struck,1* Martina Strebelow,2 Sonja Tietz,2 Christine Alonso,1 Nils G. Morgenthaler,1 Johannes G. van der
Hoeven,3 Peter Pickkers3 ve Andreas Bergmann1
GĠRĠġ: Prokalsitonin (PCT) bakteriyel enfeksiyonların
tanısı ve izleminde kullanılan klasik bir belirteçtir. Total
PCT [116 amino asitten oluşan Prokalsitonin (PCT1116)] kesilerek des-Ala-Pro-PCT (des-Alanin-ProlinProkalsitonin; PCT3-116) oluşturulabilinir. Güncel PCT
immün analizleri (“total PCT”) içsel epitoplara
yönlendirilmiş antikorları kullanmakta olup PCT‟nin
amino terminal variyantlarını ayırt edemez. Burada
PCT1-116 ve PCT3-116‟nın amino terminallerini tanıyan
monoklonal antikorların geliştirilmesi ve bu PCT
türlerinin selektif ölçümlerindeki kullanımlarından söz
edeceğiz.
YÖNTEMLER: PCT1-116 ve
PCT3-116 amino
terminallerine karşı yeni geliştirilen monoklonal
antikorlar ve PCT‟nin katakalsin bileşenine karşı antikoru
kullanarak 2 PCT peptidi için immünoluminometrik
analizler geliştirdik ve tanımladık. Bir insan endotoksemi
modelinde karşılaştırmalı olarak PCT variyantlarının
kinetiğini değerlendirdik.
BULGULAR : PCT1-116 ve PCT3-116 amino terminal
bölgelerine karşı oluşan monoklonal antikorlar diğer
PCT ile ilişkili peptitlerle % 1‟den düşük çaprazreaksiyon göstermiştir. PCT1-116 ve PCT3-116 için
sandviç ölçümlerin fonksiyonel ölçüm duyarlılıkları
sırasıyla 5 ve 1,2 pmol/L olup beklenen değerlerin %20‟si
kapsamında geri kazanımlar sergilemiştir. Plazma PCT1116 22oC‟de 6 saat ve 4oC‟de 24 saat stabildi. PCT3-116
ise her iki ısı derecesinde en az 24 saat stabildi. Sağlıklı
kişilerde deneysel endotoksemi sırasında hem PCT1-116
hem de PCT3-116 erken dönemde total PCT ile birlikte
artmış, daha sonra PCT1-116‟daki artışlar PCT3-116 (P =
0.0049) ve total PCT‟ye (P = 0.0024) göre anlamlı
derecede yavaşlamıştır.
SONUÇLAR: Yeni analizler selektif olarak PCT1-116
1
Research Department, BRAHMS Aktiengesellschaft, Hennigsdorf/
Berlin, Germany; 2 Unicus Karlsburg
OHG, Karlsburg, Germany;
3
Department of Intensive Care Medicine, Radboud University Nijmegen
Medical Centre, Nijmegen, The Netherlands.
* Address correspondence to this author at: Research Department,
BRAHMS AG,Neuendorfstraβe 25, D-16761 Hennigsdorf bei Berlin,
Germany. Fax +49- (0)3302-883-621; e-mail j.struck@brahms.de.
Received December 22, 2008; accepted June 4, 2009.
ve PCT3-116‟yı ölçmektedir. Her 2 PCT türü de
endotokseminin erken evresinde artmasına karşın daha
sonra kinetikleri farklılaşmaktadır. Farklı in vivo
kinetikli PCT türlerinin selektif ölçümü PCT-kılavuzlu
tedavileri iyileştirmede yararlı olabilir.
© 2009 American Association for Clinical Chemistry
Birkaç yıldan beri prokalsitoninin (PCT)4 sepsis gibi
lokal ve sistemik bakteriyel enfeksiyonların varlığı ve
şiddet derecesini yansıtan bir biyolojik belirteç olduğu
bilinmektedir (1–10). Var olan analiz teknolojileriyle (4,
11,12), PCT‟nin bakteriyel enfeksiyonlarla ilişkili
olmayan majör cerrahi ve travma gibi durumlarda da
arttığı bulunmuş ve bu nonspesifikliğin analiz sonuçlarının tanısal yararlılığını kısıtlamış olduğu saptanmıştır.
İmmün nötralizasyon deneylerinden elde edilen kanıtlar
PCT‟nin bir proinflamatuar hormokin olarak işlev
gördüğünü düşündürmektedir (13–15). Etki mekanizmasının temeli olarak son zamanlarda PCT‟nin bir CGRP
(kalsitonin geniyle ilişkili peptit) reseptör antagonisti
olduğu ileri sürülmüştür (16) . PCT, septik koşullar altında pek çok dokudan eksprese edilen CALCA geninden
türemiştir (17,18). CALCA‟ nın birincil çevrim ürünü
olan preprokalsitonin başlangıçta sinyal peptidazıyla
bölünerek prokalsitonini (PCT1–116) oluşturan 116
amino asidi meydana getirir. İleride, PCT1-116‟nın ilk
iki N-terminal amino asidi dipeptidil peptidaz IV
(DPPIV) tarafından bölünerek des-Ala-Pro-PCT (ilk iki
amino terminal amino asitlerden yoksun (des-AlaninProlin-Prokalsitonin; PCT3–116) oluşumuna yol açar
(19, 20). PCT1–116 ve PCT3–116, in vivo olarak farklı
fonksiyonel özelliklere ve farklı yarılanma ömürlerine
sahip olabilirler. Bu da halihazır PCT analizlerine göre
daha üstün tanısal uygulamaların oluşmasını sağlayabilir.
Ancak, bu PCT türlerini seçicilikle ölçen hiçbir analiz
Previously published online at DOI:10.1373/clinchem 2008.123018
4
Nonstandard abbreviations: PCT, procalcitonin; CGRP, calcitonin
gene–related peptide; PCT 1–116, 116 amino acids that make up
procalcitonin; DPPIV, dipeptidyl peptidase IV; PCT 3–116, des-AlaPro-PCT (des-Alanin-Prolin-Procalcitonin), which lacks the first 2
amino-terminal amino acids; MBS, m-maleimidobenzoyl-Nhydroxysuccinimid ester; NHS, N-hydroxysuccimimide; RLU, relative
light units;TNF-, tumor necrosis factor-; ICU, intensive care unit;
SIRS,
systemic
inflammatory
response
syndrome.
Clinical Chemistry 55:9 (2009) 1672
Prokalsitoninin Amino Terminal Varyantları
mevcut değildir. Burada böyle selektif ölçümleri
sağlayan sandviç tipi immün analizlerin gelişiminden
söz etmekteyiz. Yeni testler sırasıyla PCT1-116 ve
PCT3-116‟nin amino terminallerini yüksek bir
özgüllük derecesiyle tanıyan yeni monoklonal
antikorlardan yararlanmaktadır. Burada deneysel
insan endotoksemileri sırasında kullanımlarını
göstermekteyiz.
Gereçler ve Yöntemler
PEPTĠTLER
PCT ile ilişkili 9 peptit kimyasal yöntemle JPT
GmbH kullanılarak sentez edilmiş ve saflaştırılmıştır
(% 95) (peptidin adı, dizini, PCT‟nin konumları):
PAS10, APFRSALES + C-terminal sistein, 1-9;
PFP10, FRSALESSP + C-terminal sistein, 3-11;
PAD20, APFRSALESSPADPATLSED, 1-20; PPD19,
PFRSALESSPADPATLSED, 2-20; PFD18, FRSALE
SSPADPATLSED, 3-20; PRD17, RSALESSPADPA
TLSED, 4-20; PSD16, SALESSPADPATLSED, 5-20;
PAN40, APFRSALESSPADPATLSEDMSSDLERDHR
PHVSMPQNAN, 1-19 artı 96-116 ve PFN38,
FRSALESSPADPATLSEDMSSDLERDHRPHVSMPQ
NAN, 3-19 artı 96-116. In Vivo GmbH‟den
rekombinan PCT2-116 elde ettik, kalsitonin ve
katakalsini Bachem‟den satın aldık.
ANTĠKORLAR
PAS10 ve PFP10 peptitlerinin N terminallerine
yönlendirilmiş monoklonal antikorlar standart
prosedürler kullanılarak üretilmiştir (21, 22). Kısaca,
peptitler, sulfo-MBS (m-maleimido-benzoil-N-hidroksi
süksinimit ester) kullanılarak BSA‟a konjüge edilmiştir.
Balb/c fareleri bu konjügatlarla bağışıklandırılmış ve
pekiştirilmiştir. Dalak hücreleri SP2/0 miyelom
hücreleriyle kombine edilip hibridoma hücre dizileri
oluşturulmuştur. Hücre dizilerini hareketsizleştirilmiş
peptit PAD20‟ye tam fakat PPD19‟a ihmal edilebilir
düzeyde (immünojen olarak PAS10), ve PFD18‟e tam
fakat PPD19 ya da PRD17‟e (immünojen olarak
PFP10) ihmal edilebilir düzeyde bağlanacak antikorları
salgılama yetilerine göre taradık. Bu yaklaşımla 295/3H12
(PCT1-116‟nin N-terminaline karşı ) ve 282/2E3
(PCT3-116‟nın N-terminaline karşı) monoklonal
antikorları salgılayan hücre dizileri oluşturduk.
Antikorların çapraz reaksiyonlarını aşağıdaki gibi kantitatif
olarak değerlendirdik. Saflaştırılmış antikorlar (1g/L), oda
sıcaklığında 30 dakika 1:5 mol/L oranında MACNakridinium-NHS(N-hidroksisüksimimit)-ester (1 g/L;
InVent GmbH) ile inkübe edilerek işaretlenmiştir. Oda
sıcaklığında 10 dakika 1/10 hacim oranında 1 mol/L
Tris ilave edilerek reaksiyonlar sonlandırılmıştır.
İşaretlenmiş antikorları işaretlenmemiş olanlardan,
HPLC‟de, boyut dışlama kromatografisi ile bir NAP-5
kolonu (GE Healthcare) üzerinde ve bir Bio-Silect®
SEC 400-5 (Bio-Rad) kolonu üzerinde ayırdık.
Polistiren tüpler (Greiner) PAD20, PPD19, PFD18,
PRD17, PSD16, PFN38, PAN40, kalsitonin ve katakalsin
peptitleri ile aşağıdaki gibi kaplanmıştır. Peptitler 20
mmol/L Na-fosfat, pH 7.4, 50 mmol/L NaCl içinde
nihai 7 mg/L konsantrasyona kadar seyreltilmiş ve 300
µg/L‟si pipetle tüplere dağıtılmıştır. Dört santigrat
derecede 20 saat inkübasyondan sonra çözeltiler aspire
edilmiş ve 300 µL 10 mmol/L Na-phosphate, 3% Karion
FP, %0,5 BSA, pH 6,5 eklenip 22oC‟de 2 saat daha
bekletilmiştir.
Çözelti
aspire
edilmiştir.
Kemilüminesansla işaretlenmiş 295/3H12 ve 282/2E3
antikorları analizin tampon çözeltisi (100 mmol/L Nafosfat , 150 mmol/L NaCl, %0,5 BSA, 1 g/L spesifik
olmayan fare ve sığır IgG‟si, %0,1 Na-azit, pH 7,4)
içinde 0,9 X 106 bağıl ışık ünitesi (RLU)/200 juL
konsantrasyona kadar seyreltilmiştir.. Her bir peptit
tübünde bu işaretlenmiş çözeltilerden 200 µL ilave
edilmiş, 22oC‟de 2 saat inkübe edilmiştir. Daha sonra
tüpleri 4 kez 1 ml BRAHMS yıkama çözeltisiyle
(BRAHMS AG) yıkadık, bir LB952T luminometresiyle
(Berthold).her
tüp
için
1
saniyede
bağlı
kemilüminesansı ölçtük.
ĠMMÜN ANALĠZLER
Kaplanmış tüp formatında aşağıdaki gibi 2
kemilüminesans sandviç immün analiz gerçekleştirdik.
Saflaştırılmış 295/3H12 ve 282/2E3 (1 g/L) antikorları
yukarıdaki gibi işaretledik. İşaretlenmiş antikorlar analiz
tampon çözeltisi ([300 mmol/L K-fosfat; 100 mmol/L
NaCl; 10 mmol/L sodyum EDTA; %0,5 Triton X-100; 5
g/L proteazdan yoksun BSA (Sigma); her bir nonspesifik
koyun, sığır ve fare IgG‟sinden 1 g/L; 0,9 g/L Na-azit;
pH 7,0].) içinde seyreltilerek işaretliyici maddeler
oluşturulmuştur. Polistiren tüpler (Greiner) bir gece
22oC‟de bekletilerek bir monoklonal anti-katakalsin
antikorla (her tüp için 300 µL of 10 mmol/L Tris, 10
mmol/L NaCl, pH 7,8 içinde 2 µg antikor) (23)
kaplanmıştır. Tüpler daha sonra %3 Karion FP (Merck)
ve %0,5 proteazdan yoksun ve liyofilize BSA içeren 10
mmol/L Na-fosfat (pH 6,5) ile bloke edilmiştir. Normal
at serumu (Sigma) içinde peptit PAN40 dilüsyonları
PCT1–116 ve yine normal at serumu içinde peptit
PFN38 dilüsyonları da PCT 3-116.için birer kalibratör
görevi üstlenmiştir. Kaplanmış tüpler içinde 100 µL
numuneler/kalibratörler ve 200 µl izleyici çözeltiyi
inkübe ederek 22oC‟de 3 saat boyunca çalkalayıp immün
analizleri gerçekleştirilir. Tüpleri 4 kez 1 mL BRAHMS
yıkama çözeltisiyle yıkayıp bir LB952T luminometreyle
(Berthold) her tüp için 1 saniye bağlı kemolüminesansı
ölçtük. Analiz tasarımları Şekil 1‟de şematize edilmiştir.
BRAHMS PCT-duyarlı lüminesans immün analiz ile
(BRAHMS AG) (23) total PCT ölçülmüş ve analiz
üreticinin kullanma talimatına göre yürütülmüştür.
Yöntemlerin karşılaştırmaları için kullanma talimatına
göre BRAHMS PCT-duyarlı Kryptoru kullandık.
Tanımlandığı gibi tümör nekroz faktör-alfa‟yı (TNF-α)
ölçtük (24).
Clinical Chemistry 55:9 (2009) 1673
)
terkip edildikten sonra vorteksle en azından 5 dakika
kaırştırılmıştır. Bir dakika boyunca 2ng/kg dozda tek bir
intravenöz bolus enjeksiyonu şeklinde endotoksin
çözeltisi verdik. Bu Ec-5 endotoksin dozu pirojenik olup
önceki çalışmalarda sağlıklı, tolere edemeyen erkek
gönüllülerde sübjektif yan etkilere neden olmuştu.
Başlangıçta (t=0)ve endotoksin testinden 15, 30 dakika,
1,2,3,4,6 ve 22 saat sonra plazma numuneleri aldık ve
ilerde kullanana kadar – 80oC‟de muhafaza ettik.
ĠSTATĠSTĠKSEL ANALĠZ
İstatistiksel analizler için GraphPad Prism 5,00 programı
kulandık. Parametrik olmayan Friedman testiyle
eşleştirilmiş veri setlerini karşılaştırdık. P <0,05‟in
anlamlı olduğu düşünülmüştür.
Bulgular
ġekil 1. PCT1-116 ve PCT3-116 analizlerinin ilkesi
(A) PCT şematize edilmiş ve ilgilenilen bölgeler
işaretlenmiştir. Sayılar PCT1-116‟daki amino asit
pozisyonlarını
göstermektedir.
Üst:
PAN40
kalibratörünün PCT1-116‟sına karşıt gelen amino asit
dizileri ve pozisyonları. Alt: İşaretçi antikor ve katı faz
antikoru. (B) PCT şematize edilmiş ve ilgilenilen
bölgeler işaretlenmiştir. Sayılar PCT3-116‟daki amino
asit pozisyonlarını göstermektedir. Üst: PFN38
kalibratörünün PCT3-116‟sına karşıt gelen amino asit
dizileri ve pozisyonları Alt: İşaretçi antikor ve katı faz
antikoru
HASTALARDAN ALINAN NUMUNELER
Etik yönergelere uyarak yoğun bakım ünitelerinden
(YBÜ) ve sağlıklı gönüllülerden analizlerin teknik
tanımlanması için kullanılan serum ve EDTA plazma
numuneleri alınmış, daha sonra kullanılmak üzere 80oC‟de muhafaza edilmiştir. Sağlıklı gönüllülere
aşağıda belirtildiği gibi endotoksin verdik. Çalışmanın
protokolü Radboud Üniversitesi Njmegen Tıp Merkezi
Etik Kurulu tarafından onaylanmış olup güncel
revizyonlar dahil Helsinki Bildirgesi ve Avrupa İyi
Klinik Uygulama kılavuzlarıyla uyumludur Çalışma
katılımcılarını hepsinden yazılı bilgilendirilmiş onamları
alınmıştır. Deneye başlamadan önce gönüllülerin fizik
muayeneleri, elektrokardiyografileri ve rutin laboratuvar
test sonuçları normaldi. Gönüllüler herhangi bir reçeteye
tabi ilaç almadığı gibi hepatit B yüzey antijeni negatif
olup HIV enfeksiyonu saptanmamıştı. Bu çalışmada
ABD referansı E.coli endotoksini (lot Ec-5, Center for
Biologics Evaluation and Research, Food and Drug
Administration [Biyolojik Maddeler Değerlendirme ve
Araştırma Merkezi, Besin ve İlaç Dairesi], Bethesda,
MD) kullandık Ec-5 endotoksini liyofilize toz şeklinde
tedarik edilmiş, 5 mL % 0,9‟luk enjeksiyonluk salinle
MONOKLONAL ANTĠKORLAR
Birkaç PCT ile ilişkili peptide afinitelerinin kantitatif
analizleri yoluyla yeni geliştirilmiş iki monoklonal
antikorun (her ikisi de IgG1κ türünde 295/3H12 ve
282/2E3) epitop için özgüllük derecesini inceledik (Tablo
1). Antikorlardan biri (295/3H12) aynen PCT1-116‟nin
N- ucunu temsil eden
peptide maksimal afinite
göstermiştir. İlk N- terminal amino asidi eksik olduğunda
bağlanma oranı
maksimal bağlanmanın % 1‟inden
aşağısına düşmüştü. Bu tespit daha sonra PCT3-116
analizinde kullanılacak kalibratör peptit PFN38 için de
geçerliydi. PCT3-116‟nın N-terminal bölgesini temsil
eden peptide, 82/2E3 antikorunun bağlanması son derece
spesifik bir olguydu. Ancak ilk N-terminal amino asidi
eksikse veya peptit ilaveten 1 veya 2 amino asit daha
içeriyorsa bağlanma, maksimal bağlanma oranının %
1‟inden aşağı düşmüştü. Daha sonra PCT1-116 analizinde
kullanılmış olan PAN40 kalibratör peptidi için de bu tespit
geçerliydi. Her iki antikorun kalsitonin ve katakalsine
bağlanması maksimal bağlanma oranının % 1‟inden daha
düşüktü (gösterilmemiş veriler).
PCT1-116 VE PCT3-116 ANALĠZLERĠNĠN
TEKNĠK ÖZELLĠKLERĠ
Kesinlik ve değer aralıklarının ölçümü. Kalibratörler olarak
analizlerde kullanılan antikorların epitoplarını örten kimyasal
olarak sentezlenmiş peptitlerden yararlandık. Tipik standart
eğriler Şekil 2‟de gösterilmiştir. At serumu kullanılarak
saptanan alt belirleme sınırı (10 kez ölçümün ortalama
bağıl alt sınırı artı 2 SS) 2 pmol/L , PCT1-116 ve PCT3116 analizleri için sırasıyla 2 pmol/L ve 1,16 pmol/L
şeklindeydi. Her iki analiz için analitin 20.000 pmol/L üstü
konsantrasyonlarında bir yüksek doz kanca etkisi
gözlenmiştir (gösterilmemiş veriler ). Her iki analizde
doğal PCT peptitleri içeren 12 eşleştirilmiş insan örneğinde
analizin toplam belirsizlik derecesini tespit ettik.
Clinical Chemistry 55:9 (2009) 1674
Prokalsitoninin Amino Terminal Varyantları
Tablo 1. Monoklonal antikorların epitop özgüllüğü (mAbs).a
PCT1–116’deki
pozisyonu
(B – NSB)/Bmax, %
mAb
mAb
295/3H12
282/2
E3
APFRSALESSPADPATLSED
PAD20
1–20
100
0,58
PFRSALESSPADPATLSED
PPD19
2–20
0,33
0,06
FRSALESSPADPATLSED
PFD18
3–20
0,10
100
RSALESSPADPATLSED
PRD17
4–20
0,01
0,00
SALESSPADPATLSED
PSD16
5–20
0,01
0,01
a
İşaretli antikorların belirtilen peptitlerle kaplanmış tüplere bağlanması (B) incelenmiştir. Bir peptitle
kaplanmamış kontrol tüpleri üzerine nonspesifik bağlanma (NSB) değerlendirilmiştir.
Peptit
Amino asit dizisi
CLSI‟nın önerdiği EP-5A2 protokolüne göre 1 lot
ve 2 luminometreyle 8 farklı uygulayıcı 12 analiz
gerçekleştirerek bu veriler oluşturulmuştur. PCT1 116 konsantrasyonu 5 pmol/L (Şekil 2C) ve PT3116 konsantrasyonu 5 pmol/L‟den (Şekil 2C)
yüksek olan numuneler için değişkenlik katsayısı %
20‟den d, PCT1-116 konsantrasyonu 9 pmol/L
(Şekil 2C) ve PCT3-116 konsantrasyonu 3,5
pmol/L‟den yüksek olan numuneler için %10‟dan
düşüktü (Şekil 2D).
DOĞRULUK DERECESĠ
Yoğun bakım ünitesi hastalarından elde edilen ve
PCT içeren 6 plazma numunesi, saptanabilir
miktarda PCT içermeyen normal EDTA‟lı plazma
ile 1:32 dilüsyona kadar seri halinde seyreltilmiştir
(Şekil 3).
ġekil 2. Analizlerin ölçüm aralığı ve kesinliği
PCT1–116 (A) ve PCT3–116 (B) analizlerinin temsili kalibrasyon eğrileri gösterilmiştir. Bağlı izleyicinin sinyalleri
bağıl ışık birimleri (RLU) cinsinden ifade edilmiştir. PCT1–116 (C) ve PCT3–116 (D) analizlerinin kesinlik profilleri
gösterilmiştir. On iki analizde, doğal PCT analitleri içeren ve 12 insandan elde edilen benzer ikişer numunenin 8 farklı
kişi tarafından incelenmesiyle analizin toplam belirsizlik oranı tespit edilmiştir.
Clinical Chemistry 55:9 (2009) 1675
)
ġekil 3. PCT1–116 (A) ve PCT3–116 (B) analizlerinin doğrusalllık ve doğruluk dereceleri
Altı doğal PCT içeren numunenin 1:32 dilüsyona kadar seri halinde seyreltilmesiyle elde edilen sonuçlar
gösterilmiştir
Ölçülen konsantrasyonlar dilüsyon faktörüyle
çarpılmış ve seyreltilmemiş numunelerden elde
edilen değerlerle karşılaştırılmıştır. Test edilen tüm
dilüsyonlarda 6 numunenin hiçbiri ilk değere göre
% 20‟yi aşkın sapma göstermemiştir.PCT1-116
konsantrasyonları (0-157 pmol/L) düşük 8 farklı
plazma numunesiyle, PCT1-116 konsantrasyonları
yüksek
(76-735 pmol/L) 8 farklı plazma
numunesinin
eşit volümlerinin bir araya
toplanması sonucu ölçülen ortalama konsantrasyon,
beklenen konsantrasyon aralığının (% 87,3-105,5)
% 97,4 (SS: % 6,7) ‟üne ulaşmıştır (gösterilmemiş
veriler).. PCT3-116 konsantrasyonları (2,95-270
pmol/L) düşük 8 farklı plazma numunesiyle,
PCT3-116 konsantrasyonları yüksek
(99-725
pmol/L) 6 farklı plazma numunesinin
eşit
volümlerinin bir araya toplanması sonucu ölçülen
ortalama konsantrasyon, beklenen konsantrasyon
aralığının (% 94,0-108,2) % 100,6 (SS: % 5,4)
‟sına ulaşmıştır (gösterilmemiş veriler).
ÇAPRAZ REAKTĠVĠTE
Her bir analizde tanınması gerekmeyen 2 peptidin
geri kazanımlarını ölçtük. Biri rekombinan PCT2116, diğeri karşıt analizin kabratör peptidiydi
Başka bir deyişle PFN38, PCT1-116, PAN40 ise
PCT3-116 analizinde test edilmişti. Normal
plazmadaki peptitlerin değişik dilüsyonları test
edilmiştir. PCT1-116 analizinde PFN38 ve PCT2116‟nin çapraz reaktiviteleri sırasıyla %0,5 ve
%0,8 iken PCT3-116 analizinde PAN40 ve PCT2116‟nın çapraz-reaktivite oranları sırasıyla %0,9 ve
%0,4 idi (gösterilmemiş veriler).
ANALĠTLERĠN STABĠLĠTESĠ
On yoğun bakım ünitesi hastası/kritik hastadan yeni
elde ettiğimiz EDTA plazma numuneleri içindeki
doğal
PCT1-116
ve
PCT3-116
„nın
immünoreaktivitesininin 22 °C ve 4 °C‟de ex vivo
stabilitesini inceledik (Şekil 4).
PCT1-116, 6 saat boyunca 22 °C‟de stabildi
(immünoreaktivitede <10% kayıp) ve ortalama geri
kazanım 24 saat sonra % 69,3‟e düşmüştü. PCT1116‟nın serum içindeki stabilitesi daha düşüktü
(22oC‟de 6 saat sonra immünoreaktivitede ortalama
kayıp % 12,7, SS % 11,6). Aksine, plazma PCT3116‟sı 24 saatlik gözlem boyunca hem 4oC hem de
22oC‟de stabildi.
Yinelenen EDTA plazma numunelerinin (n=25)
dondurma/ergitme döngülerinin doğal analitler
üzerindeki etkisini araştırdık. PCT1-116 için geri
kazanımlar 2, 3 ve 4 döngü sonrasında [ortalama
(SS); erim] %100,3 (%5,2); %92,8–111,5; %97,1
(%4,3); %88,9-105 olup sırasıyla başlangıç
değerlerin
%94,7 (%4,6); %88,5-106,8‟sı
düzeyindeydi. PCT3-116 için geri kazanımlar 2,3 ve
4 döngü sonrasında %98,4 (%8,1); %92,0-108,3;
%98,3 (%10,5); %87,8-105,6 olup
başlangıç
değerlerin sırasıyla %97,8 (%13); %84,4-112,0‟si
düzeyindeydi.
DENEYSEL ENDOTOKSEMĠ SIRASINDA PCT
VE TNF-a KINETĠKLERĠ
Yirmi iki sağlıklı bireye bolus endotoksin
enjeksiyonları yaparak akut sistemik enfeksiyonu
tetikledik. Başlangıçta ve endotoksin infüzyonundan
sonra değişik zaman noktalarında elde edilen plazma
numunelerinde TNF-a, PCT1-116, PCT3-116 ve
total PCT‟yi ölçtük. TNF-alfa‟nın enjeksiyondan 90
dakika sonra pik yapması [ortanca (aralık) 492 (1471718) pg/mL] beklendiği gibi sistemik enfeksiyonun
varlığını göstermiştir. Enjeksiyondan sonraki 2.
Clinical Chemistry 55:9 (2009) 1676
Prokalsitoninin Amino Terminal Varyantları
ġekil 4. Ex vivo stabilite
On EDTA‟lı plazma numunesinde 22oC ve 4oC‟de doğal PCT1-116 (A) ve PCT3-116 (B)‟nın stabilitesi.
Başlangıç değerlere göre PCT 1-116 ve PCT 3-116 ortalama konsantrasyonları gösterilmiştir.
saate kadar PCT türlerinin hiçbiri saptanabilir
düzeylerde değildi. Daha sonra tüm PCT türleri
gözlem döneminin sonuna (22. saat) kadar
yükselmiştir. (Şekil 5). Uyarıdan 4, 6. ve 22 saat
sonra PCT1-116 / PCT3-116 ve PCT1-116 /total
PCT oranlarını hesapladık (Şekil 5). Dördüncü ila 6.
saat arasında PCT1-116 konsantrasyonu PCT3-116
ve total PCT‟ye benzer oranlarda artmış, 6. ila 22.
saat arasında ise PCT1-116 „daki ortalama artış
PCT3-116 ve total PCT‟ye göre sırasıyla % 16 ve %
15,6 daha düşük orandaydı. Bu son 3 zaman noktası
boyunca PCT1-116‟deki artış oranı PCT3-116 (P =
0,004) ve total PCT‟deki (P = 0,0024).artış
oranlarından anlamlı derecede farklıydı.
KLĠNĠK ÖRNEKLERĠN ANALĠZĠ
PCT1-116 ve PCT3-116 testleriyle 100 sağlıklı
bireyin plazma örneklerini analiz ettik. Her iki
analizde dört PCT3 -116 ölçümü (erim: 1,35– 5,7
pmol/L). dışında ölçülen konsantrasyonların tümü
analizlerin fonksiyonel duyarlılık derecelerinden
daha düşüktü (örn: PCT1-116 için <5 pmol/L;
PCT3-116 için <1,3 pmol/L) Şimdilerde rutin
olarak kullanılan ve sağlıklı deneklerde PCT
analizlerinde ölçülen konsantrasyonlar da analizin
fonksiyonel duyarlılık derecesinden düşüktü (25,
26).
Bir ön analizde her iki testin performansını farklı
hasta gruplarından [sepsis n = 35, sistemik
inflamatuar yanıt sendromu (SIRS) n = 35, kalp
cerrahisi n = 39] gelen örnekleri kullanarak modern
PCT testiyle (BRAHMS PCT-duyarlı Kryptor)
karşılaştırdık.. BRAHMS PCT-duyarlı Kryptor
testiyle PCT1-116 testinin karşılaştırması sonucu
grupların hepsinde Spearman korelasyon katsayıları
(sepsis, r = 0,89; SIRS, r = 0,81; kalp cerrahisi, r =
0,88), PCT3-116 testiyle karşılaştırma sonuçlarına
(sepsis, r = 0,98; SIRS, r = 0,97; kalp cerrahisi, r =
0,97).göre daha düşüktü.
TartıĢma
Bu çalışmada ilk kez PCT „nin amino
terminallerindeki variyantlar (PCT1-116 ve PCT3-
116) için selektif, doğru duyarlı 2 yani sandviç
immün analiz prosedürü tanımladık. Birkaç çok
yakından ilişkili PCT türevli peptit için analizlerin
çapraz reaktivitesi % 1‟den düşük, başka bir deyişle
pratik olarak ihmal edilebilir düzeydeydi. Yüksek
bir seçicilik derecesinin gerçekleştirilmesinde
anahtar öğe spesifik epitopları hedefleyen yeni
monoklonal antikorların geliştirilmesi ve seçilmesi
olmuştur. Analizlerin kesinlik ve tekrarlanabilirlik
derecesi diğer PCT analizlerine denk düzeydedir
(23,25,26). Yeni PCT testlerinin analitik
duyarlılığının klinik kullanım için yeterli olup
olmadığı sorusu ancak geniş örneklem kohortlarında
yapılan ölçümlerden sonra tam olarak yanıtlanabilir.
Ancak
insanlarda
yürütülen
endotoksemi
deneylerinde PCT1-116 ve PCT3-116 „nin
belirlenebilirliğine ilişkin erken dönem verileri
güncel modern PCT analizleriyle değerlendirilebilen
endikasyonların tümü olmasa bile çoğu için bu
testlerin duyarlılık derecesinin tatminkâr olduğunu
göstermektedir
Bakteri enfeksiyonların bir belirteci olarak PCT
giderek artan oranda kullanılmasına rağmen
bakteriyel enfeksiyona reaksiyon olarak kan
dolaşımıyla dolanan PCT ve PCT türevli fragmanlar
hakkında pek bilgimiz yoktur. Boyut dışlama
kromatografisi kullanılarak gerçekleştirilen ilk
analizler sepsis hastalarında dolanımdaki PCT‟nin
teorik olarak beklendiği gibi 116 amino asitten ibaret
olduğunu göstermiş (1) olmasına karşın parçalanma
ürünlerinin varlığına ilişkin göstergeler de mevcuttur.
Sepsis hastalarının serum PCT‟lerinin saflaştırılmış
formlarına afinitenin daha ayrıntılı bilgi veren kütle
spektrometrisiyle analizi, dolanımdaki başlıca PCT
türü (19) olarak N ucu kesik bir molekülü tanımlamış,
DPPIV‟nin PCT1-116‟yi PCT3-116 dönüştüren bir
proteaz olduğunu saptamıştır (20). Şimdiye kadar bu
analizin kompleks prosedürü örneklerin geniş ölçekli
ve rutin ölçümünü engellemiştir. Bu nedenle PCT‟nin
biyokimyasal yolağını, fonksiyonel önemini ve
belirli zaman noktalarında tanısal amaçlı PCT
uygulamalarını
anlamamıza yarayacak sorular
yanıtsız kalmıştır..
Clinical Chemistry 55:9 (2009) 1677
)
ġekil 5. Endotoksinle uyarı sonrası PCT kinetiği
Yirmi iki sağlıklı ve gönüllü insana bir E.coli endotoksin enjeksiyonu yapıldıktan sonra belirtilen zamanlarda
plazma numuneleri alınmıştır. Burada total PCT (A), PCT1–116 (B) ve PCT3–116 (C) ölçümlerinin ortanca
değerleri (box-whisker noktaları) gösterilmiştir. PCT1–116/PCT3–116 (D) ve PCT1–116/total PCT (E) oranları
hesaplanmış ve ortanca oranları gösterilmiştir. NS, anlamlı değil
PCT1-116 hızla “budanarak” PCT3-116‟ya
dönüştüğüne göre belli ortamlarda PCT1-116‟nın
spesifik ölçümleri klinik açıdan bir avantaj
sağlayacak mı? Yeni geliştirilmiş testlerle artık bu
sorular yanıtlanabilmektedir. İlk adım olarak
bakteriyel uyarıya cevaben farklı PCT türlerinin
plazma kinetiklerini, değerlendirme amacıyla
tanımlanmış bir model sistemini seçtik (27). İlkönce
özellikle uyarı sonrası PCT3–116 „nin dolaşımdaki
PCT‟nin başlıca formu olduğunu doğrulayabildik.
Açıkça, bu ortamda hatırı sayılır konsantrasyonda
PCT1–116 „da saptadık. PCT3–116 veya toplam
ölçümlenebilir
PCT‟ye
göre
PCT1-116
konsantrasyonları endotoksin uyarısından sonra
erken evrede en yüksek düzeye ulaşmıştı. PCT‟nin
saptanabildiği en erken zaman noktasında (tüm PCT
türleri için uyarıdan 4 saat sonra) başlangıçta
sentezlenmiş PCT1-116‟nın kısmen PCT3-116‟ya
dönüşmüş olması PCT1-116‟nın sentezinden hemen
sonra N-terminalinin “budandığını” göstermektedir.
Uyarıdan 4 ila 6 saat sonra yeniden PCT sentezi ve
proteolitik serokonversiyonü açıkça denk oranlarda
gerçekleşmekte PCT1–116/PCT3– 116. orantısının
değişmemesine yol açmaktadır. Ancak sistemik
inflamasyon azaldıkça serokonversiyon hızı
sentezlenme
hızını
aşmakta
PCT1–116
konsantrasyonları PCT3–116 veya total PCT
konsantrasyonlarına
göre
daha
yavaş
yükselmektedir. Pek mümkün olmamakla birlikte
PCT1–116‟nin serokonversiyon dışında başka
spesifik ek mekanizmayla ortamdan uzaklaştırılma
olasılığı da ekarte edilemez. Sonuçlarımız bir
bakteriyel enfeksiyonun seyri sırasında şimdiye
kadar ticari kitlerin tümüyle ölçülen PCT1–116‟nın
total PCT‟ye göre daha dinamik bir kinetik profile
sahip olduğunu göstermektedir. Aynı şekilde çeşitli
klinik örneklerde PCT1–116 total PCT ile
mükemmel olmasa bile iyi bir korelasyon
göstermiştir. Açıkça N-terminalinin “budanma”
oranını etkileyen değişkenleri ayrıntılı tanımlamak
ve klinik anlamını göstermek için için ileri
çalışmalara gerek duyulacaktır. Her halde
hastalarda bu serokonversiyon hatırı sayılır oranda
oluştuğunda, yalnız başına veya PCT3–116 ya da
total PCT ile birlikte PCT1–116 ölçümünün
yalnızca total PCT ölçümüne göre daha
bilgilendirici olacağı sayısız durumlar göz önünde
canlandırılabilir. Örneğin, PCT‟de hızlı bir düşüş
antibiyotik tedavisi başarısının erken bir göstergesi
olabilir (6, 9) Benzer şekilde majör cerrahi veya
travmadan sonra sıklıkla görüldüğü gibi artmış
PCT konsantrasyonlarında göreceli olarak daha
hızlı bir düşüş (11, 12) komplike edici bakteri
enfeksiyonların erkenden tanınması/dışlanmasına
Clinical Chemistry 55:9 (2009) 1678
Prokalsitoninin Amino Terminal Varyantları
olanak tanıyabilir. Her iki durumda da bu yeni testler
tedavi rejimlerinin daha fazla iyileşmesine yardımcı
olabilmektedir.
Sonuçta,
PCT‟nin
amino
terminallerinin selektif ölçümü için geliştirilen
analizler çeşitli klinik durumlarda kinetiklerinin daha
ileri
araştırılmasını
sağlamaktadır.
Bu
araştırmalardan elde edilen bilgiler bakteriyel
enfeksiyonlardan rahatsız veya bu enfeksiyonları
olduğundan kuşkulanılan hastalarda PCT kılavuzlu
tedavi kararları verme sürecini daha çok iyileştiren
yeni olanaklara fırsat tanıyabilir.
Yazarların Katkıları: Yazarların hepsi bu makalenin
düşünsel içeriğine katkıda bulundukları ve şu üç
gerekliliği karşıladıklarını doğrulamıştır: (a) verilerin
kavram, tasarım, elde edilmesi, analiz ve
yorumlanmasına önemli katkılar; (b) düşünsel içeriği
için makalenin yazılması veya gözden geçirilmesi ve
(c) yayınlanmış makalenin nihai onaylanması
Yazarların Çıkar Çatışması Beyanları: yazının
sunulmasıyla birlikte yazarların tümü Potansiyel
Çıkar Çatışması formunu doldurmuştur. Potansiyel
çıkar çatışmaları:
Ġstihdam ve BaĢkanlık : J. Struck, BRAHMS AG;
N.G. Morgenthaler, BRAHMS AG; A. Bergmann
BRAHMS AG
DanıĢman veya
edilmemiştir
ĠstiĢari
Görev:
Beyan
Stok Mülkiyeti: A. Bergmann, BRAHMS AG.
ÇalıĢma bursu : Beyan edilmemiştir
AraĢtırma Fonu: Beyan edilmemiştir
Uzman Tanıklığı : Beyan edilmemiştir
Sponsorun Rolü: Fon sağlayan kuruluşlar
çalışmanın tasarımı, çağrılan hastaların seçimi,
verilerin gözden geçirilmesi ve yorumlanması,
metnin hazırlanması veya onaylanmasında hiçbir
rol oynamamıştır.
TeĢekkürler: Yazarlar endotoksemi deneylerinde
yardımları için hemşire Tijn Bouw‟a, teknik
yardımları için Christina Fischer-Schulz, Detlef
Hintzen, Dajana Tandler, Uwe Zingler, Marita
Willnich ve Anne Schmiedel‟e istatistiklere ilişkin
öneriler için Oliver Hartmann‟a teşekkür eder.
Kaynaklar
1.Assicot M, Gendrel D, Carsin H, Raymond J,
Guilbaud J, Bohuon C. High serum procalcitonin
concentrations in patients with sepsis and infection.
Lancet 1993;341:515– 8.
2.Muller B, Becker KL, Schachinger H, Rickenbacher
PR,
Huber
PR,
Zimmerli
W,
Ritz
R.
Calcitoninprecursors are reliable markers of sepsis in a
medical intensive care unit. Crit Care Med 2000;
28:977– 83.
3.Harbarth S, Holeckova K, Froidevaux C, Pittet D,
Ricou B, Grau GE, et al. Diagnostic value of
procalcitonin, interleukin-6, and interleukin-8 in
critically ill patients admitted with suspected sepsis.
Am J
Respir Crit Care Med 2001;164:396–402.
4.Becker KL, Snider R, Nylen ES. Procalcitonin assay
in systemic inflammation, infection, and sepsis:
clinical utility and limitations. Crit Care Med
2008;36:941–52.
5.Becker KL, Nylen ES, White JC, Muller B, Snider
RH Jr. Clinical review 167: Procalcitonin and the
calcitonin gene family of peptides in inflammation,
infection, and sepsis: a journey from calcitonin back to
its precursors. J Clin Endocrinol Metab 2004;89:1512–
25.
6.Nobre V, Harbarth S, Graf JD, Rohner P, Pugin J.
Use of procalcitonin to shorten antibiotic
treatmentduration in septic patients: a randomized trial.
Am J Respir Crit Care Med 2008;177:498– 505.
7.Christ-Crain M,Jaccard-Stolz D, Bingisser R, Gencay
MM, Huber PR, Tamm M,Muller B.Effect of
procalcitonin-guidedtreatment on antibiotic use and
outcome in lower respiratory tract infections: clusterrandomised,single
blinded
interventiontrial.Lancet2004;363:600 –7.
8.Stolz D, Christ-Crain M, Bingisser R, Leuppi J,
Miedinger D, Muller C, et al. Antibiotic treatment
of exacerbations of COPD: a randomized,
controlled trial comparing procalcitonin-guidance
with standard therapy. Chest 2007;131:9 –19.
9.Christ-Crain M, Stolz D, Bingisser R, Muller C,
Miedinger D, Huber PR, et al. Procalcitonin
guidance of antibiotic therapy in community-
acquired pneumonia: a randomized trial. Am J
Respir Crit Care Med 2006;174:84 –93.
10.Briel M, Schuetz P, Mueller B, Young J, Schild
U, Nusbaumer C, et al. Procalcitonin-guided
antibiotic
use vs a standard approach for acute respiratory
tract infections in primary care. Arch Intern Med
2008;168:2000 –7, discussion 2007–8.
11.Sponholz C, Sakr Y, Reinhart K, Brunkhorst F.
Diagnostic value and prognostic implications of
serum procalcitonin after cardiac surgery: a
systematic review of the literature. Crit Care 2006;
10:R145.
12.Uzzan B, Cohen R, Nicolas P, Cucherat M,
Perret GY. Procalcitonin as a diagnostic test for
sepsis in
critically ill adults and after surgery or trauma: a
systematic review and meta-analysis. Crit Care Med
2006;34:1996 –2003.
13.Wagner KE, Martinez JM, Vath SD, Snider RH,
Nylen ES,
Becker KL,
et al.
Early
immunoneutralization of calcitonin precursors
attenuates the
adverse physiologic response to sepsis in pigs. Crit
Care Med 2002;30:2313–21.
14.Nylen ES, Whang KT, Snider RH Jr, Steinwald
PM, White JC, Becker KL. Mortality is increased
by procalcitonin and decreased by an antiserum
reactive to procalcitonin in experimental sepsis [see
Comments]. Crit Care Med 1998;26: 1001– 6.
15.Becker KL, Nylen ES, Snider RH, Muller B,
White JC. Immunoneutralization of procalcitonin as
therapy of sepsis. J Endotoxin Res 2003;9: 367–74.
16.Sexton PM, Christopoulos G, Christopoulos
A,Nylen ES, Snider RH, Jr., Becker KL.
Procalcitonin has bioactivity at calcitonin receptor
family complexes: potential mediator implications
in sepsis. Crit Care Med 2008;36:1637– 40.
17.Muller B, White JC, Nylen ES, Snider RH,
Becker KL, Habener JF. Ubiquitous expression of
the calcitonin-I gene in multiple tissues in response
to sepsis. J Clin Endocrinol Metab 2001;86:396–
404.
18.Morgenthaler NG, Struck J, Chancerelle Y,
Weglohner W, Agay D, Bohuon C, et al. Production
of procalcitonin (PCT) in non-thyroidal tissue after
LPS injection. Horm Metab Res 2003;35:290 –5.
19.Weglohner W, Struck J, Fischer-Schulz C,
Morgenthaler NG, Otto A, Bohuon C, Bergmann A.
Isolation
and
characterization
of
serum
procalcitonin from patients with sepsis. Peptides
2001; 22:2099 –103.
20. Wrenger S, Kahne T, Bohuon C, Weglohner W,
Ansorge S, Reinhold D. Amino-terminal truncation
of procalcitonin, a marker for systemic bacterial
infections, by dipeptidyl peptidase IV (DP IV).
FEBS Lett 2000;466:155–9.
21.Harlow E, Lane D. Antibodies: a laboratory
manual.
Cold Spring Harbor (NY): Cold Spring Harbor
Laboratory; 1988.
22.Lane RD. A short-duration polyethylene glycol
fusion technique for increasing production of
monoclonal antibody-secreting hybridomas. J
ImmunolMethods 1985;81:223– 8.
23.Morgenthaler NG, Struck J, Fischer-Schulz C,
Bergmann A. Sensitive immunoluminometric assay
for the detection of procalcitonin. Clin Chem
2002;48:788 –90.
24. Ramakers BP, de Goeij M, van der Hoeven JG,
Peters WH, Pickkers P. Inflammation-induced
hepatotoxicity in humans. Shock 2009;31: 151– 6.
25. Steinbach G, Rau B, Debard AL, Javourez JF,
Bienvenu J, Ponzio A, et al. Multicenter evaluation
of a new immunoassay for procalcitonin
measurement on the Kryptor system. Clin Chem
Lab Med 2004;42:440 –9.
26. de Wolf HK, Gunnewiek JK, Berk Y, van den
Ouweland J, de Metz M. Comparison of a new
procalcitonin assay from Roche with the established
method on the Brahms Kryptor. Clin Chem 2009;
55:1043–4.
27. Dandona P, Nix D, Wilson MF, Aljada A, Love
J, Assicot M, Bohuon C.Procalcitonin increase after
endotoxin
injection
in
normal
subjects.
J.Clin.Endocrinol.Metab 1994;79:1605– 8.
Notice:
This article has been translated with the permission of AACC. AACC is not responsible for the accuracy of the translation. Th e views presented are those of the authors and not
necessarily those of the AACC or the Journal. Reprinted from Clin Chem, 2009;55:9 :1672-1679, by permission of the publisher. Original copyright © 2009 American
Association for Clinical Chemistry, Inc. When citing this article, please refer to the original publication source in the journal, Clinical Chemistry.
Not:
Bu makale AACC(American Association for Clinical Chemistry)‟nin izni alınarak tercüme edilmiştir. Çevirinin doğruluğundan AACC sorumlu değildir. Sunulmuş görüntüler
dergi veya AACC‟nın olmayıp tamamen tamamen yazarlara aitdir. Bu makale; yayımcının izni alınarak Clinical Chemistry dergisinin 2009;55:9 :1672-1679 no‟lu sayısından
alınmıştır. Orjinal kopya © 2009 American Association for Clinical Chemistry, Inc‟aitdir. Bu makaleye atıf yapılacağı zaman lütfen Clinical Chemistry dergisindeki orijinal
basım kaynağı gösterilmelidir
Clinical Chemistry 55:9 (2009) 1679
Clinical Chemistry 55:9 (2009) 1685
Download