Slayt 1

Pratik Laboratuvarına
 föyünüz
 önlüğünüz
 lab defteriniz
ile gelmeyi UNUTMAYIN !
Mikrobiyoloji dersi-3
İmmuno (Vestern Blotlama) ve
Moleküler Teknikler
2016-2017, Bahar, Trakya Üniv Tıp Fak 6. Kurul, 23.03.2017
Neşe Akış, PhD, Tıbbi Mikrobiyoloji Anabilim Dalı
akisn@trakya.edu.tr http://personel.trakya.edu.tr/akisn/#.WKr6DyjC7WU
1
Poliklonal-Monoklonal Antikor
Hibridoma teknolojisi
ile her bir klon ve
antikoru izole
edilebilir
2
Vestern Blotlama
(Western Blotting)
Vestern Blotlama Testinde Amaç ve Prosedür
• Bir katı faz seroloji yöntemidir. Tıbbi mikrobiyolojide genellikle hasta
serumunda ELISA ile saptanan özgül antikor varlığını epitop
düzeyinde doğrulamak için kullanılır (anti-HIV antikorun varlığını
doğrulamak gibi..)
• Parmak genişliğinde kağıt gibi ince polimer tabakalar katı faz olarak
kullanılır. Hücreden elde edilen ve her biri farklı epitop içeren
antijenler tabakaya aralıklarla bağlanır ve üzerinde ELISA işlemi
uygulanır.
• Her biri farklı epitop içeren antijenleri tabakaya aralıklarla dizmenin
yolu antijen karışımını jel üzerinde elektroforezle boy sırasına
dizmektir. Böylece büyükten küçüğe dizilen antijenler kolaylıkla
jelden tabakaya aktarılabilir.
Antijenlerin Sıraya Dizilmesi ve
Tabakaya Aktarılması
Antijen karışımı çukura doldurulur
1
2
3
4
Jel
çukur
Anotdan jele elektrik akımı uygulanır
Antijenler akım boyunca büyükten küçüğe sırayla jele dizilir
Sıralı antijenler jelden tabakaya nakledilir (üstüste koyarak)
3
Polimeraz Zincir Reaksiyonu
(PCR)
PZR Testinde Amaç
• Varlığı DNA’da (genom veya parçası) sorgulanmak istenen bir
dizinin (gen, provirüs, mutasyon) aranması testlerinden biri
PZR’dir.
• Aramanın esasını varsa DNA’daki ilgili dizinin gözle
görülebilecek sayıya suni olarak çoğaltılabileceği beklentisi
oluşturur.
• Test en fazla 1000 nükleotidlik kısmı saptayabildiğinden
sorgulanmak istenen dizinin genellikle kısa bir parçası tüpte
çoğaltılarak aranır. Önce çoğaltma yapılır, sonra tüpteki
karışım içinde aranan boyutta parça var mı incelenir. Varsa,
dizinin tamamının DNA’da var olduğu düşünülür.
PZR Testinde Prosedür
25-40 döngüden oluşan çoğaltma işleminin her döngüsü;
– sorgulanan çift iplikli (çi) parçanın varsa her 3’ ucuna
eşlenik tasarlanan primerlerin yapışmasıyla reaksiyon
başlatılır.
– Tüpteki polimeraz eşlenmiş primerleri gördüğünde
eşleneği sentezleyerek ilk döngüyü tamamlar. Sayı, 2 uzun
DNA’dan 4 uzun DNA’ya çıkar.
– Reaksiyonun ikinci ve sonraki döngülerinin aynı biçimde
tekrarlaması sağlanır. İlk parçasal çiDNA 3’ncü döngüde 4
adet olarak elde edilir.
– 25’inci döngüde parçasal çiDNA sayısı 33 milyon 550 bine
çıkar. Böylece görülebilir hale gelir.
PZR için dizinin parçasını belirleme, primer
bağlanması ve polimerazın eşlenek sentezlemesi
DNA
Sorgulanmak istenen dizi
Çoğaltmak için seçilen parça
1’inci döngünün başlangıcı
Primer bağlanması
Eşlenek sentezlenmesi
PZR’da döngüler
devam
Parçasal
çiDNA’lar
Birinci döngü
İkinci döngü.. .
Üçüncü döngü
4
Ters transkriptaz PZR
(RT PCR)
TT PZR Testinde Amaç ve Prosedür
• Varlığı hücrede sorgulanmak istenen RNA dizisinin
(mRNA, rRNA, miRNA, lncRNA) hücre lizatında aranması
testlerinden biri TT PZR’dir.
• Aramanın esasında ilk basamağı, varsa ilgili RNA’nın 3’
eşlenik primer ve ters transkriptaz enzimi yardımıyla tek
iplikli (ti) kopyasal DNA’ya (cDNA) çevrilmesi oluşturur.
Sonra, cDNA’nın PZR testi ile çiDNA’ya çevrilmesi,
çoğaltılması ve görüntülenmesi yapılır.
TT PZR için mRNA’ya primer bağlanması, cDNA
sentezlemesi ve PZR’ye geçilmesi
Ters transkriptaz
cDNA’nın serbestleşmesi
……PZR
çiDNA
PZR devam …
5
Gerçek zamanlı PZR
(real time PCR)
GZ PZR Uygulamasında Amaç ve Prosedür
• GZ PZR, PZR veya TT PZR testi ile aranan DNA veya RNA
dizisinin hücredeki miktarını belirlemek için uygulanır.
• Belirleme işlemi, sadece çiDNA ile karşılaştığında aktiflenerek
renk yayan bir maddenin PZR reaksiyon tüpüne eklenmesi ile
yapılır. Hücrede aranan diziden tüpte ne kadar çok varsa her
PZR döngüsünde o kadar daha çok çiDNA gelişir ve
renklenme aynı oranda artar.
• Döngüler boyunca renklenmedeki artışlar takip edilerek
PZR’ye başlamadan önce tüpte kaç adet DNA veya RNA
vardı hesaplanabilir.
GZ PZR uygulamasında yaygın kullanılan renk yayıcılardan biri
SYBR yeşilidir ve çiDNA’ya bağlanarak renk yayar
DNA
Renklenme zayıf
Isıtılan çiDNA’dan
tiDNA’lar serbestleşiyor
PZR döngüsü başlıyor
PZR döngüsü bitiyor
Renklenme iki
katına artmış
LABORATUVAR GÜVENLİĞİ KURALLARI
1
•
Avrupa bilim alanı içindeki fenni ve tıbbi laboratuvarlar kimyasal, fiziksel ve
biyolojik güvenlik kurallarına tabidir. Laboratuvar yöneticisi kuralları
uygulamak sorumluluğunda ve yetkisindendir.
•
Çalışma esnasında ortaya çıkabilecek ve personel veya çevreye
verilebilecek zararlar açısından laboratuvarlar 1 ile 4 arasında bir risk
seviyesindedir. Risk seviye-1: Öğrenci labları; Risk seviye-2: Kan, kan
ürünü ve patojenlerle çalışan tıbbi laboratuvarlar; Risk seviye-3: Salgın
oluşturan etkenlerle çalışan laboratuvarlar; Risk seviye-4: Kitle imhasına yol
açan etkenlerle çalışan laboratuvarlar. 3. ve 4. risk seviyesindeki çalışmalar
kabin altında yapılır.
•
Kan ile çalışabilmek için kan kaynaklı enfeksiyon ajanlarına karşı aşılanmak
gerekir.
•
Laboratuvar işlem ve bulgularının çalışan tarafından kaydedilmesi
zorunludur ve gizlilik taşır.
•
Laboratuvarda beyaz, önü kapalı, dize kadar uzanan önlük veya üst-alt
takım lab kıyafeti giyilir, ekstremitelerin korunması gözetilir.
LABORATUVAR GÜVENLİĞİ KURALLARI
2
•
Lab önlüğü ile laboratuvar dışına çıkılmaz, yemekhaneye gidilmez, önlük
çıkışta askıya asılır.
•
Biyolojik materyal ile çalışırken eldiven, lab gözlüğü ve bone giyilmesi tercih
edilir. Eldiven ile yüze, burna ve göze dokunulmaz.
•
Kimyasallar, (a) uçucu ve yanıcılar, (b) asit ve bazlar, (c) karsinojen ve
zehirliler, (d) diğerleri olarak sınıflanarak ve birbirinden izole edilerek
depolanır.
•
Radyoaktif maddelerle çalışmalar, sıvı kaynatma veya gazlı şişe kapağı
açma gibi püskürme oluşturan uygulamalar kenarları kapalı çekerocak
davlumbazı altında yapılır.
•
Lens, makyaj malzemesi ve açık saça kimyasallar absorbe olur, bunlar
labda kullanılmaz.
•
Yiyecek, içecek, şeker tableti veya çiklet kontamine olabilir, bunlar labda
depolanmaz.
•
Laboratuvarda ağıza pipet veya benzeri sokulmaz, materyaller koklanmaz.
LABORATUVAR GÜVENLİĞİ KURALLARI
3
•
Herhangi bir bulaşıcı hastalık geçiren personel tam iyileşene kadar
laboratuvarda bulunmaz.
•
Laboratuvar atıkları evsel, radyoaktif, biyolojik, farklı kimyasal atıklar olarak
ayrı çöp kovalarına toplanır ve ayrı imha edilir.
•
Sivri, kesici, batıcı atıklar ve cam kırıkları özel sert ve kapaklı çöp kaplarına
atılır ve ayrı toplanır.
•
Laboratuvar tezgahı çalışanı tarafından temiz ve düzenli tutulur, temizlikte
etil alkolün su içinde %70’lik eriyiği kullanılır.
•
Radyoaktif madde, deney hayvanı veya insan ile ancak sertifikalı
laboratuvarcı çalışabilir, ayrıca çalışama ilgili etik kurulca onaylanmalıdır.
•
Radyoaktif maddelerle yapılan çalışmalar bittiğinde tezgah ve çevre özel
temizleyicilerle ve Geiger sayacında sinyal kaybolana dek temizlenir. Atıklar
kurşun kap veya kalkan arkasında depolanır. Beta emisyonu yapan
ayıraçlar günde 50 miliküri seviyesinde lavaboya dökülebilir. Diğer atıklar
ayda bir resmi toplayıcılar tarafından toplanarak 2 mt yeraltına gömülür.
•
LABORATUVAR GÜVENLİĞİ KURALLARI
4
•
Deney hayvanı çalışmaları deney hayvanlığındaki laboratuvar veya hayvan
geri dönmeyecekse olağan laboratuvarda çeker ocak altında yapılır. Bir
deney hayvanına eziyet edildiğini gören laboratuvarcı, aynı insan
çalışmalarında olduğu gibi, durumu doğrudan en üst sorumluya bildirir.
•
Hastadan alınan rutin tetkik materyalleri sonuçlar elde edildikten sonra
tahrip edilir. Epidemiyolojik maksatlı toplu hasta sonucu isim gizlenerek
epidemiyolojik maksatlı rapor edilebilir. İnsan vücuduna ait bir materyal veya
bilginin tıbbi tanı ve tedavi dışında diğer kullanımı, üçüncü şahıs bir sağlık
çalışanı bile olsa, ancak hasta rızası ile mümkün olur. Ayrıca, materyalin
araştırma maksatlı kullanımı etik kurul izni gerektirir. Hastanın sağlık
sigortası olanağı araştırma maksatlı harcanamaz.
•
Laboratuvar ekibinin, bilim camiasının ve meslek örgütünün üyeleri
birbirlerine karşı meslektaşlık saygı ve sorumluluğu gereği aralarında diğer
bilgi ve materyalin paylaşımını yapar.
•
Biyolojik materyal nakliyatı ilgili mevzuat ve kurallara göre yapılır.