MGMT PROMOTER METİLASYONU OLAN GLİOBLASTOMALI

MGMT PROMOTER
METİLASYONU OLAN
GLİOBLASTOMALI OLGULARDA
CpG 1, 2, 3 ve 4
METİLASYONUNUN
TEDAVİ CEVABINA ETKİSİ
Dicle Aslan, Oğuz Yıldız, Hilal Akalın,
Yagut Akberova, Özlem Canöz,
Munis Dündar, Mete Gündoğ, Serdar Soyuer

Glioblastoma, WHO grade IV, en sık
görülen ve en agresif seyreden primer
beyin tümörüdür.

Güncel çalışmalardan elde edilen
sonuçlar, cerrahinin ardından uygulanan
radyoterapi (RT) ile birlikte
temozolamide (TMZ) uygulanmasını
standart hale getirdi.*
* Stupp ve ark 2005 ve 2009

TMZ DNA’yı pek çok bölgesinden
modifiye
eden
bir
metilasyon
ajanıdır.

Özellikle tüm metilasyon olaylarının
yaklaşık %90’dan sorumlu olan N7metilguanin
ve
N3-metiladenini
modifiye eder.

Bu yapılar temel eksizyon onarım
yolağıyla onarılır ve düşük sitotoksik
potansiyele sahiptir.

TMZ’in O6-metil guanine
mekanizma
tüm
olaylarının
sadece
oluşturur.
bağlandığı
metilasyon
%5-10’nu

Eğer hücre bölünmesinden önce
metil
grubu
kaldırılamazsa,
bu
yapılar DNA yanlış-eşleşme onarım
(MMR) yolağını tetiklemektedir ki bu
oldukça sitotoksik bir olaydır.
MGMT
hücresel DNA onarım proteini
olup, bu yolla TMZ gibi alkilleyici
ajanların sitotoksik etkilerini nötrolize
eder.
 Tümör hücrelerinde MGMT aktivitesinin
yüksekliği alkilleyici ajanlara direnç ile
ilişkilidir.
 Buna
karşın
tümör
hücrelerinde
promoter metilasyonu sonucu MGMT
geninin epigenetik sessizliği düşük
MGMT expresyonu ile sonuçlanır.


MGMT aracılı onarım mekanizması
tektir
ve
diğer
DNA
onarım
yollarından farklıdır. MGMT onarım
kompleksinin bir parçası değildir ve
yalnız hareket eder.

Guanin O6 pozisyonundaki metil
grubunu özel olarak ayırır, böylece
DNA ipliğinde kırığa neden olmadan
nükleotidi doğal şekline göre onarır
ve intihar enzimi olarak adlandırılır.

Pek çok olguda MGMT geninin sessizliği
gen promoter bölgesindeki sitozinguanin dinükleotilerdeki (CpG adaları)
sitozin nükleotidlerinin metilasyonu ile
ilişkilidir.

10. kromozomda lokalize MGMT’ nin
CpG 1, CpG 2, CpG 3 ve CpG 4
adalarının
metilasyon
durumunun,
sağkalımla
ilgili
tahmine
olanak
sağladığı düşünülmektedir.
MGMT promoter metilasyonu değişik
metodlarla ölçülebilir.
 Kalitatif metil-spesifik PCR (MSP)
 Semi kantitatif metil-spesifik PCR
(SQ-PCR)
 Pyrosequencing
 RNA’
dan
MGMT
ekspresyonu;
kalitatif gerçek zamanlı PCR
 Protein seviyesi; immünohistokimya
 Enzim aktivitesi; HPLC ile ölçülebilir.


MSP ve pyrosequencing gende
metilasyon durumunu gösterir.

CpG
adasındaki
metilasyonu
yüksek sensivite / spesifiteyle
gösterir.

Az miktar DNA yeterlidir ve
parafinlenen bloklardan çalışılabilir.
GEREÇ VE YÖNTEM

Bu çalışmada ERÜ Tıp Fakültesi
R. Onkolojisi AD.da 2000-2010 arası
GBM tanısı alıp RT+TMZ ve yalnız RT
alan 100 olgunun parafinle bloklanmış
doku örneğinden pyrosequencing
yöntemi ile MGMT promoterdeki CpG 1,
2, 3, 4 adalarının metilasyonu
retrospektif incelendi.

55 olguya RT (60 Gy) + TMZ

45 olguya yalnız RT (60 Gy) uygulandı.
MGMT promoterdeki CpG 1, 2, 3, 4
adalarının metilasyonu incelendi.
 MGMT promoter metilasyonu görülen
olgularda CpG 1, CpG 2, CpG 3 ve
CpG 4 metilasyonunun genel sağkalım
(GS) ve hastalıksız sağkalıma (HS)’a
katkısı tek değişkenli-çok değişkenli
analizlerle incelendi.
 CpG
adalarının birinde % 10’un
üzerinde sitozin piki olması metilasyon
pozitif olarak değerlendirildi.

MGMT metilasyonu pozitif olgu (CpG 2
adasında % 60 pozitiflik saptandı)
MGMT metilasyonu pozitif olgu (CpG 1 adasında % 40, CpG 2
adasında % 36, CpG 3 adasında % 47 ve CpG 4 adasında % 59 pozitiflik
saptandı.)
MGMT metilasyonu negatif olgu (CpG 1 adasında % 3,
CpG 2 adasında % 2, CpG 3 adasında % 4 ve CpG 4
adasında % 4 metilasyon saptandı ve olgu MGMT
metilasyonu negatif olarak değerlendi.)
BULGULAR
TEDAVİ
n
GS
%95GA
RT + TMZ
(METİLE)
23(%44.2)
27
16.91-37.08
RT
(METİLE)
29(%55.8)
9
6.75-11.25
P
HS
%95GA
13
3.99-22.07
<0.001
6
5.19-6.81
P
< 0.001
TEDAVİ
n
GS
%95GA
RT + TMZ
(UNMETİLE)
32 (% 66.7)
10
7.40-12.59
RT
(UNMETİLE)
16 (% 33.3)
P
0.81
HS
%95GA
6
3.86-8.13
P
0.71
7
1.12-12.88
6
4.57-7.42

Ayrıca
mMGMT+RT+TMZ,
mMGMT+RT,
um
MGMT+RT+TMZ ve umMGMT+RT uygulanan gruplar
GS
ve
HS
açısından
karşılaştırıldığında
mMGMT+RT+TMZ uygulanan grupla diğer gruplar
arsında istatistiksel fark saptanırken (GS’ da p<0.001
ve HS’ da p<0.001 ) diğer grupların birbirlerine
üstünlüğü istatistiksel olarak saptanmadı.

RT+TMZ
GRUBU
CpG 1
METİLE
CpG 1
UNMETİLE
GS
HS
%95GA
%95GA
p
P
27±5.19
16.80-37.19
13±5.73
1.76-24.23
0.2
0.02
10±4
2.16-17.84
5±3.5
0-11.86
RT GRUBU
GS
HS
%95GA
%95GA
p
P
CpG 1
METİLE
8±1.31
CpG 1
UNMETİLE
10±5.65
5.42-10.57
4±1.11
1.80-6.19
0.02
0.06
0-21.087
6±0.29
5.41-6.58



RT+TMZ uygulanan grupta ;CpG 2 ve
CpG 3 adalarının herhangi birinin metileunmetile olmasının GS’ a etkisi karşılaştırıldı
ve istatistiksel olarak anlamlılık saptanmadı
(CpG 2’ de p=0.1; CpG 3’ de p=0.1).
CpG 4 adası ise olguların tamamında metile
olduğundan
istatistiksel
değerlendirme
yapılamadı.
CpG 2, CpG 3 ve CpG 4 adalarının herhangi
birinin metile-unmetile olmasının HS’ a etkisi
karşılaştırıldı ve istatistiksel olarak anlamlılık
saptanmadı ( CpG 2’ de p=0.3; CpG 3’ de
p=0.9; CpG 4’ te p=değerlendirilemedi ).


RT alan grupta ; CpG 2, CpG 3 ve CpG 4
adalarının herhangi birinin metile-unmetile
olmasının GS’ a etkisi karşılaştırıldı ve
istatistiksel olarak anlamlılık saptanmadı (
CpG 2’ de p=0.3; CpG 3’ de p=0.1; CpG 4’
te p=0.2 ).
CpG 2, CpG 3 ve CpG 4 adalarının herhangi
birinin metile-unmetile olmasının HS’ a
etkisi karşılaştırıldı ve istatistiksel anlamlılık
değerlendirilemedi (CpG 2’ de p=0.1; CpG
3’ de p=0.2; CpG 4’ te p= 0.8 )
Karayan ve ark. tarafından yapılan çok
merkezli çalışmada;
 81
olgunun
MGMT
metilasyon
durumu 5 yöntemle incelendi ve
yöntemlerin birbirine karşı üstünlüğü
incelendi.
 Olguların 55 (%67.9)’ inde MGMT
metilasyonu saptandı.
Promoter metilasyonu çalışılan tüm
yöntemlerde
MGMT
metilasyon
varlığında GS’da uzama görüldü.
 Ancak pyrosequencing yöntemi ile
MGMT promoter metilasyonu görülen
olgularda uzamış GS ve HS ile
metilasyon arasında güçlü bir bağ
saptandı.
 MGMT
metilasyonunun
(özellikle
CpG4’ te) GS’ı uzattığı saptandı
(p < 0.001).


çok merkezli
EORTC/NCIC 26981 – 22981*
çalışmada (n:206) MGMT promoter metilasyonu
görülen olguların değerlendirilmesinde RT + TMZ
uygulanan grupta GS ve HS yalnız RT uygulanan
gruba göre anlamlı şekilde uzadığı saptandı.
21.7 vs 15.3 ay, p = 0.007, 10.3 vs 5.9 ay, p = 0.001 .

MGMT promoter metilasyonu olmayan olgularda ise
RT+ TMZ uygulanan grup ve yalnız RT alan grup
arasında GS açısından istatistiksel olarak fark
saptanmazken HS açısından istatistiksel fark
saptandı
12.7 vs 11.8 ay, p = 0.06, 5.3 vs 4.4 ay, p = 0.02 .

Karayan ve ark. yaptığı çalışmanın önemi
ise; asıl incelenen konunun CpG adaları ve
çalışılan yöntem olmasıydı.

MGMT metilasyon durumu MSP, SQ-MSP ve
pyrosequencing
ile
incelendiğinde
ise
metilasyon durumu ile GS arasında net bir
ilişki saptandı.

Çalışmada
SQ-MSP
ve
pyrosequencing
yöntemlerinin daha önce Hegi ve ark. ile
Esteller ve ark. nın çalışmalarında kullandığı
klasik jel bazlı MSP’ den daha güvenilir
olduğu saptandı.

Bizim çalışmamızda da formalinle fikse
parafine gömülü doku örnekleri mevcuttu
ve pyrosequencing yöntemi kullanıldı.
SONUÇ
MGMT promoter metilasyonu olan
olgularda CpG 1 adası metilasyonu
sağkalımı etkileyen güçlü prediktif bir
faktör olabilir.
 Metilasyon görülmeyen olgularda TMZ
tedavisine direnci azaltmak için moleküler
yolaklara ait çalışmalar hedeflenmelidir.
 Klinik sonucu iyileştirmek için alternatif
tedavi rejimleri uygulamaları ve tedavi
yanıtı belirlenmesi için de prospektif geniş
olgu sayısı olan çalışmalara ihtiyaç vardır

TEŞEKKÜR EDERİM