tc hacettepe üniversitesi tıp fakültesi genel cerrahi ana bilim dalı

T.C.
HACETTEPE ÜNİVERSİTESİ
TIP FAKÜLTESİ
GENEL CERRAHİ ANA BİLİM DALI
DENEYSEL MEME KANSERİ MODELİNDE
SPLENEKTOMİNİN İMMÜNOLOJİK
ETKİSİ
Dr.Murat SEVMİŞ
UZMANLIK TEZİ
TEZ DANIŞMANI
Doç.Dr.Derya Karakoç
ANKARA 2015
i
TEŞEKKÜR
Bu çalışmanın ortaya çıkmasında gösterdiği destek ve yardımlarından dolayı
tez danışmanım Doç.Dr.Derya Karakoç’a, çalışmanın her aşamasında bilgi ve
tecrübelerini esirgemeyen Doç.Dr.Güneş Esendağlı’ya, çalışmanın sürdürülmesinde
ve takibinde özverili çalışan Dr.Didem Yöyen Ermiş’e, patolojik kısmında
destekleyen Dr. Çisel Aydın’a, cerrahi kısmında yardımlarından dolayı Dr. Coşkun
Özer ve Dr. Emil Guseinova; her zaman varlıklarını ve desteklerini hissettiğim
aileme ve genel cerrahi hocalarım, asistan arkadaşlarıma en içten teşekkürlerimi
sunarım.
Dr. Murat SEVMİŞ
ii
ÖZET
Sevmiş M. Deneysel meme kanseri modelinde splenektominin immünolojik
etkisi. Hacettepe Üniversitesi Tıp Fakültesi, Genel Cerrahi Uzmanlık Tezi,
ANKARA 2015.
Kanser hücrelerinin oluşum, yayılım ya da yok olması sürecinde immün
sistem belirgin rol oynar. Tümör dokusuna yerleşen miyeloid kökenli hücreler
(MKH) kanser gelişimine, yayılım ve damarlanmasına katkıda bulunabilir. Dalak
MKH’nin asıl yerleşim alanını oluşturur. Bu çalışmanın amacı deneysel meme
kanseri modelinde splenektominin MKH hücre düzeyleri ve kanser gelişimi üzerine
etkilerini araştırmaktır. Çalışmaya toplam 38 adet, altı haftalık Balb-c cinsi fare dahil
edildi. Fareler kontrol, meme kanseri, splenektomi, meme kanseri öncesi
splenektomi, meme kanseri sonrası splenektomi grubu olarak beş gruba ayrıldı.
Farelerde haftada iki kez tümör çapı, vücut ağırlıkları ve genel sağlık durumları takip
edildi. Tümör inokülasyonundan üç hafta sonra deneyler sonlandırıldı. Toplanan kan,
karaciğer
ve
dalak
örneklerinde
MKH
düzeyleri
akım
sitometrik
immünfenotiplendirme ile analiz edildi. Daha sonra organlar histopatolojik olarak
değerlendirildi. Operasyon sonrasında hayvan ağırlıklarında kısa süreli düşüş
gözlendi. Kanser gelişen gruplarda bu düşüş daha belirgindi. Splenektomi yapılan
farelerde lökositoz izlendi. Splenektomize farelerde primer tümör büyümesinde
yavaşlama, ancak karaciğer ve akciğer metastazlarında artış görüldü. Splenektomize
edilmeyen
tümörlü
hayvanlarda
splenomegali
vardı.
Yapılan
immünolojik
analizlerde, dalakta ve karaciğerde yüksek düzeyde MKH ve immatür granülositik
hücre birikimi olduğu görüldü. Splenektomi sonrasında ise, periferik kanda ve
karaciğerde hem immatür granülositik hücrelerin hem de immatür monositik
hücrelerin belirgin şekilde arttığı saptandı. Meme kanserinin direkt dalak metastazı
yapmadığı durumlarda bile splenektomi, MKH ve tümör hücre dağılımını
etkilemektedir.
Anahtar kelimeler: miyeloid kökenli hücre, splenektomi, meme kanseri.
iii
ABSRACT
Sevmiş M. Immunologic effects of splenectomy in experimental breast
carcinoma model. Hacettepe University School of Medicine, General Surgery
Residency Thesis, ANKARA 2015.
Immune system plays an important role in the formation, distribution and
destruction of cancer cells. Myeloid derived cell located into the tumor tissue may
contribute to development of malignancy, invasion and vascularization. Spleen is the
primary location of myeloid derived cells. The aim of this study is to investigate the
effect of splenectomy on myeloid derived cells and cancer development in
experimental breast carcinoma model. Totally 38 Balb-c 6 week-old mice were
included in the study. Mice were separated into 5 groups: control, breast carcinoma,
splenectomy, splenectomy before breast carcinoma and splenectomy after breast
carcinoma. Tumor size, body weight and general condition of mice were checked
twice a week. Experiments were terminated three weeks after tumor implantation.
Myeloid derived cells in blood, liver and spleen samples were analyzed by flow
cytometric immunophenotyping. Later the organs were histopathologically evaluated.
A short-term weight loss was observed postoperatively. This weight loss was more
prominent in cancer groups. Leucocytosis was observed in splenectomized mice.
Primer tumor was decreased in splenectomized mice but liver and lung metastasis
were increased. Splenectomy was observed in non-splenectomized tumorous mice.
Immunologic analysis revealed high loads of myeloid derived cells and immature
granulocytic cells in liver and spleen. Both immature granulocytic cells and
immature
monocytic
cells
were
increased
in
blood
and
liver
after
splenectomy. Splenectomy affects the distribution of myeloid and tumor cells
directly, even when breast carcinoma does not methastasize to the spleen directly.
Splenectomy increases hepatic and pulmonary methastasis and also increases body
weight, parallel to myeloid derived cell distribution.
Key words: Myeloid derived cells, splenectomy, breast carcinoma.
iv
İÇİNDEKİLER
TEŞEKKÜR
i
ÖZET
ii
ABSTRACT
iii
İÇİNDEKİLER
iv
KISALTMALAR ve SİMGELER DİZİNİ
vi
TABLOLAR DİZİNİ
vii
RESİMLER DİZİNİ
viii
GRAFİKLER DİZİNİ
ix
1. GİRİŞ ve AMAÇ
1
2. GENEL BİLGİLER
2
2.1.
Kanser
2.2.
Kanser İmmünolojisi
2.2.1. Kanser Antijenleri
2.2.2. Effektör Mekanizmalar ve Effektor Hücreler
2.2.2.1. Humoral Mekanizmalar
2.2.2.2. Tümör Bağışıklığında Effektör Hücreler
2.2.2.2.1. Sitotoksik T lenfositler (CTL):
2.2.2.2.2. Makrofajlar
2.2.2.2.3. Naturel Killer Hücreleri (NK):
2.2.2.2.4. Lak Hücreleri
2.2.2.3. Antikora Bağımlı Hücresel Sitotoksisite
2.2.3. Kanserin İmmün Sistemden Kaçış Mekanizmaları
2.3.
Meme Kanseri İmmünolojisi
2.3.1. Meme Kanseri
2.3.2. Meme Kanseri ve Mikroçevre
2.3.2.1. Hücre Dışı Matriks
2.3.2.2. Fibroblastlar
2.3.2.3. Vasküler Sistem
2.3.2.4. İmmün Hücreler
2.3.3. Miyeloid Kökenli Hücreler
2.3.4. Meme Kanserinde T Hücre Yanıtları
2.4.
Deneysel Meme Kanseri Oluşturulması
2.5.
Dalak
2.5.1. Dalağın Fonksiyonları ve İmmünolojik Etkileri
2
2
3
3
3
4
4
4
5
5
5
5
6
6
7
7
8
8
9
10
11
15
16
16
v
2.5.2. Splenektomi Endikasyonları
2.5.3. Splenektomi Komplikasyonları
2.6.
Splenektomi İmmünolojisi
3. MATERYAL METOD
3.1.
3.2.
3.3.
3.4.
3.5.
3.6.
Deney Hayvanları ve Protokolü
Çalışma Gupları
Anestezi
Cerrahi Teknik
Değerlendirme Parametreleri
İstatistiksel Analizler
4. BULGULAR
4.1.
Ağırlık
4.2.
Dalak, Karaciğer Akciğer Boyut ve Ağırlıkları
4.3.
Tümör Ağırlık ve Çapları
4.4.
Miyeloid kökenli hücre sayı ve dağılımları
4.4.1 . Periferik kanda miyeloid kökenli hücreler:
4.4.1.1 Periferik Kanda Lökositoz
4.4.2. Dalakta miyeloid kökenli hücreler:
4.4.3. Karaciğerde miyeloid kökenli hücreler
4.5. Histopatolojik Bulgular
17
18
19
21
21
21
23
23
26
28
29
29
30
33
35
35
36
36
37
38
39
5. TARTIŞMA
47
6. SONUÇ
51
7. KAYNAKLAR
52
vi
KISALTMALAR ve SİMGELER DİZİNİ
MDSC
Miyeloid kökenli baskılayıcı hücreler( myeloid depended stem cell)
MKH
Miyeloid kökenli hücreler
CTL
Sitotoksik T lenfositler
NK
Doğal öldürücü hücreler (naturel killer )
TİM
Tümör ilişkili makrofajlar
TAN
Tümör ilişkili nötrofiller
TAA
Tümör bağlantılı antijenler
TSA
Tümör spesifik antijenler
TSTA
Tümör spesifik transplantasyon antijenleri
MHC
Major histocompatibility kompleks
TNF
Tümör nekroz faktör
PG
Prostoglandinler
HDM
Hücre dışı matriks
MMP
Matriks metalloproteaz
TGF-B
Transforming growth faktör-beta
VEGF
Vasküler endotelyal growth faktör
DC
Dentritik hücreler
NO
Nitrik oksit
GM-CSF
Granülosit-makrofaj koloni stimüle edici faktör
IFN
Interferon
STAT 6
Phosho-signal transducer and activator of trancription 6
İNOS
İndüklenebilir nitrik oksit sentaz
c AMP
Siklik adenozin mono fosfat
RES
Retiküloendotelyal sistem
vii
TABLOLAR DİZİNİ
Tablo 4.1. Ortalama hayvan ağırlıkları
29
Tablo 4.2. Ortalama organ ağırlıkları
32
Tablo 4.3. Ortalama tümör ağırlıkları
33
viii
RESİMLER DİZİNİ
Resim 3.1: Farede orta hat cilt ve periton kesisi ........................................................ 24
Resim 3.2:Dalak disseke edildikten sonra pensetle tutulmuş, splenik damar
görünümü ................................................................................................. 24
Resim 3.3: Splenik damarın bağlanıp, dalağın çıkarılması ........................................ 25
Resim 3.4: Orta hat cilt ve peritonun kapatılması ...................................................... 25
Resim 3.5: Deney sonlandırıldıktan sonra, dekapitasyon sonrası peritoneal yüzeyde
tümör implantları ..................................................................................... 26
Resim 4.1. Laparatomide splenik loja doğru büyüme gösteren tümör implantı
(grup 5)..................................................................................................... 37
Resim 4.2. Grup 2’de splenomegali (meme ca grubu)............................................... 38
Resim 4.3. Grup 5’te en sağdaki spesmenlerde karaciğer metastazı ve splenomegali
.................................................................................................................. 38
Resim 4.4. Akciğerde plevral implant odağı (grup 4: meme kanseri öncesi
splenektomi grubu) .................................................................................. 38
Resim 4.5. Karaciğerde kapsüler yüzeyden parankime doğru ilerleyen metastatik
odak (grup 4) ............................................................................................ 39
Resim 4.6. Metastatik bir karaciğer parankiminde izlenen artmış sayıda (100'ün
üzeri) myeloid kökenli supresör hücre kümeleri (grup 4) ....................... 39
Resim 4.7. Büyük büyütmede myeloid kökenli süpresör hücre kümeleri (grup 4) ... 40
Resim 4.8. İntratümöral segmentli lökositler (grup 5) ............................................... 40
Resim 4.9. Akciğerde izlenen parankimal metastatik odak( grup 5 :meme kanseri
sonrası splenektomi grubu) ...................................................................... 41
Resim 4.10. Pankreasa invaze malign neoplazm (grup 5) ......................................... 41
Resim 4.11. Karaciğer parankiminde izlenen artmış sayıda (100'ün üzeri) myeloid
kökenli supresör hücre kümeler (grup 5) ................................................. 42
Resim 4.12. Laparotomi alanında izlenen cilt-cilt altı metastaz (grup 4: meme kanseri
öncesi splenektomi grubu) ....................................................................... 42
Resim 4.13. Laparotomi alanındaki epidermal-dermal inflamatuar hücre yanıtı (grup
5: meme kanseri sonrası splenektomi grubu)........................................... 43
ix
GRAFİKLER DİZİNİ
Grafik 4.1. Gruplarda hayvan ağırlıkları
31
Grafik 4.2.1: Dalak boyut ve ağırlıkları
32
Grafik 4.2.2: Karaciğer boyut ve ağırlıkları
32
Grafik 4.2.3: Akciğer boyut ve ağırlıkları
33
Grafik 4.3: Tümör Ağırlık ve Çapları
33
Grafik 4.4.1: Periferik Kanda Miyeloid kökenli hücre sayı ve dağılımları
34
Grafik 4.4.2: Dalakta Miyeloid kökenli hücre sayı ve dağılımları
35
Grafik 4.4.3: Karaciğerdeki miyeloid kökenli hücreler
36
Grafik 4.5: Periferik Kanda Lökositoz
36
1
1. GİRİŞ ve AMAÇ
Meme kanseri dahil pek çok kanser tipinde immün sistemin işleyişinde
bozukluklar görülür. İlk etapta kanser hücrelerinin yok edilmesi için savaşan immün
sistem hücreleri kanser gelişimi ile başa çıkamazsa fonksiyonel değişime uğrarlar.
Bu değişim sonucunda tümör dokusuna yerleşen immün hücreler tümör gelişimine,
yayılmasına ve damarlanmasına katkıda bulununmaya başlarlar. Hatta kansere karşı
gelişebilecek yeni immün aktiviteyi de baskılama kapasitesi kazanırlar. Tümör
dokusuna veya etraf dokuya yerleşen en önemli hücre grubu miyeloid(kemik iliği
kökenli) hücrelerdir. Özellikle tümör-ilişkili makrofajlar(TİM) ve bu hücrelerin
köken aldığı miyeloid-kökenli baskılayıcı(MKB) hücreler kanserin ilerlemesine
katkıda bulunur. Kanserin uyardığı kronik inflamatuar süreç kemik iliğinde miyeloid
hücre yapımını artırır ve olgunlaşmamış MKB hücrelerinin dolaşıma çıkmasına
sebep olur. Bu hücrelerin özellikle dalak ve karaciğerde biriktiği, buralarda immün
baskılama yaptığı; buralardan çıkarak da tümöre yerleşip kanseri destekleyen TİM
hücrelerine dönüştüğü bilinmektedir.
Dalak MKB hücreleri için esas yerleşim bölgesini oluşturmaktadır. Travma,
bazı hematolojik hastalıklar, splenik maligniteler gibi nedenlerle splenektomi
yapılmaktaysa da, splenektominin tümör gelişimi, metastazları ve MKB hücrelerinin
dağılımı üzerine olan etkileri bilinmemektedir. Bu çalışmanın amacı deneysel meme
kanseri modelinde splenektominin immünolojik etkilerinin araştırılmasıdır.
2
2. GENEL BİLGİLER
2.1.
Kanser
Kanser bir tek hücreden gelişen tümörün klonal progresyonu ve tümörün
giderek artan agresif davranışlar kazanmasına neden olan mutasyonların birikimi ile
seyreden bir hastalıktır. Kanserlerin çoğunun benign bir lezyondan in situ kanserlere
ve invaziv kanserlere dönüştüğüne inanılmaktadır. Kanser, hücre büyümesinde farklı
büyüme paterni gösteren onkogenler ve fonksiyon kaybı gelişen tümör süpresör
genler arasındaki denge sonucu oluşmaktadır (1-2).
Normal hücrelerde, hücre büyümesi ve çoğalması sıkı kontrol altındadır.
Kanser hücrelerinde, hücre normal büyüme kontrol mekanizmasına karşı
duyarsızlaşır ve kontrolsüz olarak büyümeye ve çoğalmaya başlar.
Kanser gelişiminin üç evresi bulunmaktadır. Başlangıç (initiation), ilerleme
(promotion) ve gelişme (progression).
Kanser gelişmesi esnasında hücre siklusu süresince kanser hücreleri,
apopitozise(programlı hücre ölümü) girmezler. Böylece tümör kitlesinin büyümesi
devam eder. Daha sonra çeşitli büyüme faktörleri, sitokinler ve onkogenlerle kanser
hücrelerinde invazyon, metastaz(yayılma) ve anjiyogenezis(tümörün büyüme ve
metastaz yapabilmesi için damarlanması) gelişmektedir (3).
2.2.
Kanser İmmünolojisi
Kanser immünolojisi 3 ana başlık altında incelenebilir.
1- Kanser antijenleri
2- Effektör mekanizmalar ve efektör hücreler: humoral ve hücresel yanıt
mekanizmaları
3
3- Kanserin immüniteden kaçış mekanizmaları
2.2.1. Kanser Antijenleri
Antijen humoral ve hücresel immün yanıt oluşturabilen kimyasal yapıdır.
2.2.1.1. Tümör bağlantılı antijenler (TBA)
Kanser hücrelerinde olduğu gibi normal hücrelerde de olabilen antijenlerdir.
Onkofetal antijenler, CEA, AFP, MHC Class 1 ve Class 2 antijenler bu
gruptandır.
2.2.1.2.Tümör spesifik antijenler (TSA)
Kanser hücrelerine özgüdür. Normal hücrelerde görülmez. Belli bir virüse ait
kanser oluşturan antijenler örnek verilebilir.
2.2.1.3. Tümör spesifik transplantasyon antijenleri( TSTA)
Konakta immün cevabı uyaran, tümör büyümesine karşı direncin ve tümör
rejeksiyonu ile sonuçlanan bir dizi reaksiyonun oluşmasına sebep olan antijenlerdir.
2.2.2. Effektör Mekanizmalar ve Effektor Hücreler
2.2.2.1. Humoral Mekanizmalar
2.2.2.1.1. Opsonizasyon ve fagositoz: Bakteri veya antijenlerin makrofaj ve
nötrofiller tarafından fagositozunu kolaylaştırmak için antikor veya kompleman gibi
opsonin maddelerle bağlanmasına opsonizasyon denilir. Fagositoz ise yabancı cisim,
antijenlerin ve maddelerin hücre içine alınması ve sindirilmesidir. Invitro olarak
makrofajların tümör hücrelerini tahrip ettikleri gösterilmiştir.
4
2.2.2.1.2.
Kompleman
ile
lizis:
Tümör
hücrelerindeki
antijenlerin
antikorlarla birleşmesi sonucu kompleman sistemi aktive olur. İnvitro çalışmalar bu
mekanizmanın daha çok süspansiyon halindeki tümörlere etkili olduğunu solid
tümörlerde lizis yapmadığını göstermiştir
2.2.2.1.3. Hücre adezyonunun kaybı: Antikorların yüzey antijenlerine
bağlanması tümör hücresinin adezyon kaybı ile sonuçlanabilir. Böylece adezyon
kaybı hücrenin malign klonlar oluşturmasını engeller. Hücre adezyonu metastaz
oluşumunda da etkilidir. Çünkü uzak organa metastaz yapabilmesi için önce o
organın endotelinin altındaki bazal membrana tutunması gerekir. Hücre yüzeyinin
antikorlarla kaplı olması bu yapışmayı engeller.
2.2.2.2. Tümör Bağışıklığında Effektör Hücreler
2.2.2.2.1. Sitotoksik T lenfositler (CTL):
Tümör immün sistem etkileşiminde ilk adım tümör hücre antijeninin CTL
tarafından tanınmasıdır. Bundan sonra sitolitik etkinin oluşabilmesi için tümör
antijeninin tümör hücresinin MHC -1 ile algılanması gerekmektedir. Aynı olay T
helper için MHC -2 ile gerçekleşmektedir. Hedef hücreyle temasa geçen CTL
polarizasyon gösterir. CTL stoplazmasında bulunan sitolitik granüller olay yerinde
toplanır. Hedef hücre tamamen granüllerle kaplanır ve membranda oluşan deliklerle
lizise uğratılır. CTL granülleri aynı zamanda hedef hücre DNA sınıda tahrip edebilir
(4).
2.2.2.2.2. Makrofajlar
Antijen sunma rolü: Ortamdaki tümör antijenlerini kendi MHC- 2 ile birleştirerek
T helper hücrelerini bu antijene karşı uyarır. T helper hücreleri de antikor üretebilen
B hücrelerini klonal çoğaltarak ve çeşitli faktörler salgılayarak tümöre karşı
savunmada katkıda bulunur.
5
Makrofajlar IL-1 salgılarlar. IL-1 bazı tümör hücrelerine direkt sitotoksik etki
gösterirken, monosit NK ve CTL’ lerin tümörosidal etkisini artırarak indirekt etki
yapar.
Lizis: Aktive olmuş makrofajlar tümör hücrelerine bağlanarak onları lizise uğratır.
Sitolitik proteazlar, hidrojen peroksit, TNF, arjinaz ve timidin başlıca lizisten
sorumlu elemanlardır.
2.2.2.2.3. Naturel Killer Hücreleri (NK):
Makrofaj ve PMNL dışında kalan immünize edilmemiş bireylerde ve spesifik
antikorun yokluğunda da sitotoksik etki gösterebilen hücrelerdir. NK hücrelerinin
sitotoksik etkisi tümör hücrelerine bağlanma, aktif oksijen ürünleri ve proteinazlar
salgılama yoluyla olur (5).
2.2.2.2.4. Lak Hücreleri
IL-2 adlı lenfokinle aktive edilen lenfositler tümör hücrelerinin lizise
uğratabilme yeteneği kazanırlar. Bunlara lenfokinle aktive edilmiş öldürücü hücreler
anlamına gelen LAK denilir.
2.2.2.3. Antikora Bağımlı Hücresel Sitotoksisite
IgG ile kaplanan tümör hedef hücreleri bu antikorların Fc parçalarına uyan
reseptörleri taşıyan hücrelerle etkileşerek 4-6 saat içinde hasara uğratabilirler. .
Granülositler, makrofajlar ve killer cell bu gruptandırlar.
2.2.3. Kanserin İmmün Sistemden Kaçış Mekanizmaları
2.2.3.1. Tümör hücresi yüzeyindeki antijenik değişimler: Tümör hücresi
antijenleri immün sistemi uyaracak kadar sentez edilemez veya kısa sürede
modülasyon göstererek immün sistemden kaçar. Özellikle yüzeylerindeki siyalik asit
tümör yüzey antijenlerini maskeler.
6
2.2.3.2.Antijen – Antikor kompleksleri: Dolaşımdaki antijenler antikorlarla
birleşerek immün yanıtın ortaya çıkmasını engellyebilir. Bu antijen- antikor
kompleksleri K hücrelerinin Fc parçasına bağlanarak onları bloke eder. Böylece
antikora bağımlı hücresel sitotoksisite engellenir.
2.2.3.3.Spesifik ve non spesifik süpresör hücreler: TAA ların bazıları
spesifik süpresör T lenfositlerinin oluşmasına yol açmaktadır. Ayrıca aktive olmuş
makrofajların bir kısmı T lenfositlerini baskılayabilir.
2.2.3.4.Tümör
tarafından
oluşturulan
süpresyon:
Bazı
tümörler
salgıladıkları PG’ler ile immün yanıtı baskılayabilir. Bazen tümör hücrelerince
lenfoid dokunun istila edilmesi immün yanıtı gerçekleştirecek hücrelerin azalması
sonucunu doğurur.
2.2.3.5.Diğer faktörler: İmmün sistemi etkileyen genetik ve edinsel bazı
hastalıklar sonucu maligniteye eğilim artmaktadır. Örneğin T helper hücrelerinde
azalmaya yol açan Acquired immunodeficiency syndrome (AIDS) gösterilebilir.
2.3.
Meme Kanseri İmmünolojisi
2.3.1. Meme Kanseri
Meme dokusu, apokrin ter bezi gruplarından oluşan epidermal kökenli bir
dokudur. Kadınlarda ergenlik döneminde hormonal sistemin uyarısıyla kanal sistemi
prolifere olur ve alt segmental kanallardan lobüller tomurcuklanarak, işlevsel
terminal dukto-lobuler üniteyi oluşturur. Kanal ve kanalcıklar çift tabakalı bir
epitelyum ile örtülüdür. Lümene bakan iç kısmı kübik yada silindirik hücreler
kaplarken dış kısımda aralıklı kontraktil miyoepitelyal hücreler bulunmaktadır.
Epitelyum bir bazal membran ile sarılıdır, kanal sistemini de lenfatiklerce zengin bağ
dokusu sarar (6).
Meme kanseri kadınlarda en sık görülen malignitedir (7). Meme kanserinde
tanı ve tedavide önemli gelişmeler kaydedilmesine rağmen, önemli sayıda hasta
7
tedaviye direnç geliştirdiği için yeni tedavi stratejileri geliştirilmesi önem arz
etmektedir. Meme kanserinin hemen hemen tamamı terminal dukto-lobüler ünite
kaynaklıdır. Meme kanserinde patolojik ayrımda in-situ karsinomda bazal membran
bütünlüğü korunurken, invaziv karsinomda bazal membran ve stroma tutulumu
görülür (8-9).
Meme kanserinin ilk ortaya çıktığı bölgeden, yerel, lenfatik ve kan aracılığı
ile yayılması (metastaz) söz konusudur. Yerel olarak deriyi, derin fasyayı ve göğüs
duvarını tutar. Lenfatik olarak aksiler ve intermamarian lenf nodları tutulumu olur.
Kan yoluyla ise uzak metastazlar oluşmakta en sık akciğer, kemik ve karaciğeri
tutmaktadır(10-11).
Meme kanseri moleküler olarak taşıdıkları östrojen reseptörü (ER) ve
epitelyum büyüme hormonu (HER2) reseptörlerine göre sınıflandırılır. İnsan meme
kanserinde %75 ER pozitiftir. Tedavi yaklaşımlarında ER+ ve HER2+ önem arz
etmektedir.
2.3.2. Meme Kanseri ve Mikroçevre
Meme kanseri çok basamaklı bir gelişim sergiler. Bu gelişimin inisiasyon ve
promosyon aşamalarında somatik hücrelerde genetik mutasyonlar oluşmaktadır (12).
Ancak pek çok kanserde kronik bir inflamasyonun eşlik ettiği de gösterilmiştir (13).
Meme kanserinin stromal elemanlarla etkileşiminde de meme yağ dokusunun
adipozitleri, fibroblast, miyofibroblastlar, lökositler, lenfositler ve miyoepitelyal
hücreler önemli rol oynarlar. Bu hücrelerin meme kanserinin büyümesi, farklılaşması,
invaziv karakter kazanması ve polariteleri üzerine etkileri gösterilmiştir (14,15).
Bir tümörü çevreleyen stroma örgüsü, tümör dokusunun bağ doku iskeletini
oluşturur. Bu iskelet, hücre dışı matriks(HDM), fibroblastlar, immün sistem hücreleri
ve kan damarları gibi dört eleman içerir.
8
2.3.2.1. Hücre Dışı Matriks: Hücrelerin arasındaki makromoleküler protein
iplikleri ve fibröz dışı proteoglikanlardan oluşan ve tüm dokuların stromasında
bulunan üç boyutlu ağ yapısıdır. HDM bileşenleri olan fibronektin, tip 4 kollajen ve
trombospondin-1 yapısal bütünlük ve birliklerine göre pro ve anti anjiyojenik
sinyaller oluştururlar (16). Daha da önemlisi, integrin aracılı HDM sinyalleri
karsinomalarda
malign
dönüşüme
neden
olur
(17,18).
Kanser
hücreleri
sentezledikleri proteolitik enzimlerle kendilerine invaziv bir ortam sağlarlar (19). En
önemlisi matriks metalloproteaz (MMP), hücre yüzeyi ve HDM’ye bağlı büyüme
faktörlerini keserek aktive eder (20). MMP’lerin ekspresyon seviyeleri kanser
invazivliğinin önemli bir belirleyicisidir (21).
2.3.2.2. Fibroblastlar: İnsan meme tümörü xenograftlarının farelerde
geliştirilebilmesi, insan tümör ilişkili stromal fibroblastların varlığına bağlıdır ve bu
fibroblastların kanser gelişimindeki önemini gösterir (22-23). Fibroblastlardaki
tümör büyüme faktörü beta(TGF-B) sitokini, fibroblastlar üzerinden karsinogeneze
etkilidir. Ayrıca TGF –B metastatik progresyona neden olarak tümörlerde çift yönlü
etkisini göterir (24). Tümör stromasında bulunan miyofibroblastlar karsinoma ilişkili
fibroblastlar(CAF) olarak adlandırılır ve vasküler endotelyal büyüme faktörü
(VEGF) ve proteaz üreterek HDM modellenmesi ve anjiogeneze katkı yaparlar (26).
Ancak HDM modellenmesi ve anjiogenez, fibroblastların bahsedilen karsinojenik
etkisini
açıklamaya
yeterli
değildir.
Ayrıca
oksidatif
stres
durumlarında
fibroblastlardan oluşan miyofibroblastlar hidrojen peroksit(H2O2) üretmeye başlarlar
(25). Ortamdaki hidrojen peroksit inflamasyona, metabolizma değişiklerine ve DNA
hasarına yol açar. Adipozitlerde salgıladıkları kollajen 6 ile tümör gelişimini
artırmaktadır (27).
2.3.2.3. Vasküler Sistem: Anjiogenezis olarak bilinen durum tümör
büyümesi ile paralel olarak, tümörü beslemek için yeni kan ve lenf damarlarının
oluşumunu içerir (28). Anjiogenezis üzerinde en önemli hormon vasküler endotelyal
büyüme hormonudur (VEGF) (29). Anjiogenezisin malign tümörlerde kalıcılığı
tümör
stromasındaki
endotel
hücrelerinde
düzenlenen
VEGF
reseptör
2
ekspresyonuna bağlıdır (30). Anjiogenezis VEGFR2 blokajı ile durdurulmakta ve bu
9
uygulama sonrası düşen MMP’ler sayesinde tümör-stroma sınırının belirginleşerek
HDM yapısının tekrar organize olduğu gösterilmiştir (31).
2.3.2.4. İmmün Hücreler: Immün hücreler normal meme stromasının önemli
bileşenleri arasında değildir. Ancak edinsel ve doğal immün sistem hücreleri meme
tümörü dokusunda belirgin düzeyde artış gösterir. İmmün hücre infiltrasyonu hem in
situ hem de invaziv karsinomlarda gözlenmektedir. İmmün hücre artışı, memede
tümörogenezisin ilerlemesi ile paralellik gösterir. Tümör mikroçevresinde hem doğal
bağışıklık hücreleri, doğal öldürücü(natural killer, NK) hücreler, doğal öldürücü T
(natural killer T) hücreleri, makrofajlar ve dendritik hücreler (DC), hem de edinsel
bağışıklık hücreleri, yardımcı T hücreleri, sitotoksik T hücreleri ve B hücreleri
bulunur.
Doğal bağışıklık hücreleri dokunun tamirinde ve yeniden şekillendirilmesinde
görev alır. Bu hücreler tarafından salgılanan faktörler genellikle tümör büyümesini
destekler. Makrofajlar salgılanan proinflamatuar sitokinlerin ana kaynağıdır.
Neredeyse bütün tümörlerin mikroçevresinde makrofajlar bulunmaktadır. Klinik
araştırmalarda meme kanserindeki makrofaj birikiminin kötü prognoza işaret ettiği
gösterilmiştir (32). Ayrıca tümör mikroçevresindeki makrofajların tümör hücrelerinin
invazyonunu ve metastazları artırdığı gösterilmiştir. Ayrıca makofajlar ürettikleri
VEGF-A aracılığıyla tümörün invaziv ucunda anjiogeneze de yol açmaktadır (33).
Bu hücreler genellikle tip 1 (M1) veya tip 2(M2) fenotipinde bulunurlar. M1; TNF-a,
IL-6 gibi proinflamatuar sitokinler üretirken M2; IL-4, IL-10, IL-13 gibi anti
inflamatuar sitokinleri salgılar. M1’lerden salgılanan IL-12, yardımcı T hücre-1
(Th1) gelişimine ve anti-tümör sitotoksik etkisine yardımcı olur. M2’ler immün
baskılayıcı sitokinler salgılar ve tümör hücrelerinin büyümesini destekler. Tümör
ilişkili makrofajlar (TIM) genellikle M2 fenotipindedir. Bu hücrelerin infiltrasyonu
pek çok kanserde kötü prognoz belirtecidir. TIM’ lar invazyon ve metastazı artıran
pek çok proteaz salgılar. Salgıladıkları sitokinler tümöre özgül edinsel immün
yanıtları inhibe eder ve anjiojenik faktörler de neovaskülarizasyonu artırır (34).
Nötrofiller de TGF-B varlığına göre tümörün destekleyicisi veya tümöre karşı
olabilirler. Makrofajlar gibi N1 ve N2 gibi fenotiplerle sınıflandırılmıştır. N2 veya
10
tümör ilişkili nötrofil (TIN) olarak adlandırılan fenotipe geçişte TGF-B rolü büyüktür
(35).
TGF-B’nın,
ayrıca
nötrofillerin
tümöre
infiltrasyonlarına
ve
tümör
sitotoksisitesine engel olduğu düşünülmektedir. N2 tipindeki nötrofillerin meme
kanseri kaynaklı GM-CSF uyarımı ile IL-6 benzeri bir sitokin olan oncostatin M
ürettikleri, bu sitokinin de meme kanseri hücrelerinden VEGF salınımını arttırarak
anjiogenez ve invazivliği artırdığı gösterilmiştir (36). Ayrıca nötrofiller MMP
üreterek hücre dışı matriks bileşenlerini parçalar ve tümör invazyonunu kolaylaştırır.
Dentritik hücreler immün cevap düzenleyicisi ve antijen sunucu hücreler
olarak görev yapar. Antijeni lenfoid dokulara taşıyarak hücresel immün yanıta
önemli katkıda bulunurlar. Meme kanseri hastalarında yapılan kesitsel çalışmalarda
bu hücrelerin antijen sunum ve aktivasyon fonksiyonunu yitirdiği ayrıca tümör
mikroçevresinde immün baskılayıcı sitokin salınımının arttığı bildirilmiştir (37).
Özetle kanserden salınan çeşitli faktörler ve inflamasyon, miyeloid kökenli
hücre gruplarının tümör mikroçevresine toplanmasına ve burada doku yenilenmesi ve
immün toleransı destekleyen fenotiplere dönüşmesine yol açmaktadır. Tümör
mikroçevresindeki miyeloid hücreler başlıca tümör anjiogenezine ve metastazına
katkıda bulunur. Ayrıca tümörden salınan VEGF ve çeşitli büyüme hormonları
kemik
iliğinde
üretilen
miyeloid
hücre
miktarlarını
arttırarak
onların
matürasyonlarını engellemektedir. Bu hücrelerin başında ise nötrofil, monosit ve
dentritik hücrelerin öncülleri olan ve tam olgunluğa ulaşamamış miyeloid kökenli
baskılayıcı hücreler (MDSC ler) gelmektedir (38).
2.3.3. Miyeloid Kökenli Hücreler
Miyeloid kökenli baskılayıcı hücreler (myeloid derived suppressor cells,
MDSC’ler) kanser büyümesine destek olan başka bir grup doğal immün sistem
hücreleridir. Seksenli yılların sonunda kronik graft versus host disease (GVHD) ve
tümörlü farelerde kemik iliği ve dalakta artan sayılarda granüllü hücrelere rastlanmış
ve farklı lenfoid cevapları baskıladıkları için bu hücreler doğal baskılayıcı hücreler
(NS) olarak tanımlanmışlardır (39,40). Doksanlı yıllarda doğal baskılayıcı hücrelerin
baskılama fonksiyonlarını nitrik oksit (NO) ve TGF-B aracılığıyla yaptıkları ve
11
gelişimlerinde tümörden salgılanan Granülosit-Makrofaj Koloni Stimüle edici
hormonun (GM-CSF) rol oynadığı tespit edilmiştir (41,42). Fare meme kanseri
modelleri ile yapılan çalışmalarda tümör gelişimine paralel olarak, uç farklılaşmasını
tamamlamamış myeloid kökenli hücre gruplarında büyük bir artış tespit edilmiştir.
Doksanlı yılların sonlarına doğru tümörlü farelerin dalaklarındaki CD11b+ Gr-1 +
monositlerin kontak bağımlı T hücre baskılamasından sorumlu olduğu tespit
edilmiştir (43). İmmatür miyeloid hücrelerin MHC-II barındırmadıklarından bu yolla
sunulan antijenlere karşı olan cevapları baskılamadıkları ama MHC-I ile sunulan
antijenlere karşı güçlü bir baskılamaya yol açtıkları gösterilmiştir (44). MDSC’ler
myeloid öncüllerden matür miyeloid hücre oluşumunun engellendiği kronik
inflamasyon sırasında oluşurlar. Bakteriyel ve parazitik enfeksiyonlar ile akut-kronik
inflamasyon ve travmatik streste de sayıları artan MDSC’ler kanserde başlıca
periferik kan, lenf nodları ve dalakta bulunmaktadır (45-46). Bu hücreler edinsel
immün yanıtları çeşitli mekanizmalarla inhibe ederler. Salgıladıkları faktörlerle
düzenleyici T hücreleri (T reg) uyarırlar. Ayrıca, MDSC’lerin anti-tümör immüniteyi
yardımcı T hücre 2(Th2) yanıtlarına dönüştürmede rol oynadığı da gösterilmiştir (47).
Pek çok tümör modelinde ve insan kanserlerinde MDSC popülasyonunda
artış gözlenirken MDSC’lerin ortadan kaldırılması hastalık ilerlemesinde dramatik
bir iyileşme ve bazen direk anti-tümör etki ile sonuçlanmaktadır. MDSC’ler aynı
zamanda anjiogenez, tümör hücresi invazyonu ve metastazlarda artışlara da katkıda
bulunurlar (48).
Diğer immün sistem hücreleri; nötrofiller, mast hücreleri ve eozinofiller de
proliferatif özellikteki tümör mikroçevresinin oluşumuna katkıda bulunur (21).
Ayrıca, dendritik hücreler (DC), etkin anti-tümör immün yanıtların uyarılmasında
kritik öneme sahiptir. Tümör mikroçevresinde yer alan DC’ler ve diğer profesyonel
antijen sonucu hücreler, T hücreleri uyarmakta başarısız olarak tümörün immün
sistemden kaçışına yardımcı olabilirler. B hücrelerinin de doğal immün sistem
hücrelerinin tümöre yönelmesinde önemli rol oynayabildiği gösterilmiştir (25).
12
2.3.4. Meme Kanserinde T Hücre Yanıtları
Tümöre özgül immün yanıtlar, matür antijen sonucu hücreler ve
proinflamatuar çevre arasındaki etkileşimler tarafından yönetilir (49). CD4 yardımcı
T hücreler, inflamatuar süreçlerde anahtar rol üstlenir. Yardımcı T hücrelerin alt
grupları; Th1, Th2, Th9, Treg, Th 17 ve Th 22, farklı inflamasyon tiplerini
desteklemek üzerine özelleşmişlerdir. Salgıladıkları sitokinler özgül immün
yanıtların oluşmasına olanak sağlar. Tümör gelişimi sırasında tüm yardımcı T hücre
alt tiplerinin farklı şekillerde fonksiyon gördüğü bilinmektedir.
Th1
alt
tipindeki
CD4
sitotoksik
T
lenfosit
(CTL)
aktivasyonu,
İmmünglobülin (Ig)G2A ve IgG3 üretimini destekler (50). Bu sayede hücre içi
patojenler dahil, pek çok enfeksiyöz mikroorganizmanın yok edilmesinde önemli rol
oynar. Kanser gelişiminde IFN aracılı anti-tümör immünite, Th1 yanıtlarını düzenler
(51). Th1 polarizasyonu, T hücre reseptör(TCR) aktivasyonunun STAT-1 sinyal
yolağı aracılığıyla gerçekleşmesi ile oluşur. Bu yolağı uyaran sinyaller IL-12
reseptörü IL-12RB2 zincirinin ekspresyonunu artırır (52). Böylece Th1 farklılaşması
için gerekli olan IL-12 daha yüksek düzeyde algılanır. Bu durum IFN-gama ve IL18R-alfa ekspresyonunu da uyarır. Matür Th1 efektör hücreler TCR-bağımlı
yolaklarda IFN-gama üretir. Ancak IL-12 ve IL-18 ile aktive edilirse antijen
uyarımından bağımsız olarak da sitokin üretebilmektedir (53). Th1 hücreleri
dendritik hücrelerin uyarımıyla akut inflamasyonu indükler ve CTL oluşumunu
destekler. IL-12, IFN-gama, TNF-alfa ve IL-2 gibi sitokinler ve tümör hücrelerinden
eksprese edilen pek çok tümöre özgül antijenler (mutant veya aberan eksprese edilen
P53,
IFGBP-2,
HER2
ve HTERT
gibi)
CTL’lerin çoğalmasını,
tümöre
infiltrasyonunu ve tümör hücrelerin öldürülmesini sağlar.
Th2 hücrelerinin tümörü ilerletme kapasiteleri iyi bilinmektedir. Meme
kanseri, yüksek seviyede IL-4, IL-13 ve TNF-alfa ekprese eden Th2 hücrelerini
inflitre edebilir (54). Bu hücreler, dendritik hücrelerin tümörden salgılanan timik
stromal lenfopoietin (TSLP)’ye yanıt olarak eksprese ettikleri OX40 ligand (OX40L)
tarafından yönlendirilirler. Th2 hücrelerinin IL-13 üretimi açısından insan özellikleri
taşıyan farelerde meme kanserinin büyümesini artırdığı gösterilmiştir (55). IL-13,
13
miyeloid hücrelerin TGF-beta üretimini uyarır. Bu durum Treg hücrelerinin
gelişimini tetikler ve sitotoksik T lenfositleri baskılar (56).
Meme kanseri hücreleri IL-13 uyarımına yanıt olarak STAT6 (phospho-signal
tranceducer and activator of transcription 6) eksprese eder. Böylece kanser
hücrelerinde anti-apoptotik yolaklar aktive olur. Ayrıca bu durumun sitotoksik CD8+
T hücrelere ve sitotoksik ilaçlara dirençle de ilgisi olabilir (59). Transgenik meme
kanseri modelinde IL-4’ün ise TIM’ların M2 fenotipine geçişini sağladığı
gösterilmiştir. Th2’ler tümör mikroçevresinde IL-4 ve IL-13 salgılayarak doğrudan
veya makrofajlar aracılığı ile dolaylı olarak tümör gelişimini destekler. Doğrudan
etkileri, epitelyum kanser hücreleri üzerinde anti-apoptotik yolakları veya steroid
metabolizmasını çalıştırmasıdır. Dolaylı etkileri ise, TIM’ ların EGF ve proanjiojenik VEGF ekspresyonunu artırmaktadır. Ayrıca TAM’ lar indüklenebilen
nitrik oksit sentaz (İNOS) ve arjinaz eksprese ederek CD8+ T hücre prolifarasyonunu
baskılar. Klinik olarak, Th2 hücreleri ve transkripsiyon faktörü GATA-3’ün meme
kanseri hastalarının lenf düğümlerinde arttığı gözlenmiştir. Bu artış hastalığın
ilerlemesini hızlandırır ve sağkalım oranlarını düşürür (60).
CD4+ hücrelerin bir diğer sınıfı düzenleyici T (Treg) hücreleridir. Treg’ler
transkripsiyon faktörü FoxP3’ü yüksek düzeyde taşır ve özgül immün yanıtları ve
inflamasyonu baskılar (57).
T hücre reseptörünün antijenle uyarımı, IL-2 salınımı ve transforme edici
büyüme faktörü B (TGF- beta) varlığında FoxP3 indüklenir (57). Treg’ler sitotoksik
T lenfositlerin efektör etkilerini baskılar ve otoimmün hastalıklardan korunmada
önemli rolleri vardır. Treg hücrelerinin timusta bulunan doğal T reg hücreleri ve
periferal dokularda farklılaşan adaptif Treg hücreleri olarak tanımlanan iki alt grubu
bulunmaktadır. Doğal T reg hücreleri CD4+ CD25+ FoxP3+ hücrelerdir ve timusta
biçimlendirilirler (58). Doğal T reg’ler hücre yüzey molekülleri olan CTLA-4
membran bağımlı TGF- beta ile immün yanıtları baskılarlar. Adaptif T reg hücreleri
CD4+
CD25+ FoxP3+ hücrelerdir ve IL-10, TGF-beta varlığında periferal
dokularda biçimlenirler. Adaptif T reg hücreleri IL-10 ve TGF –beta salgılayarak
immün yanıtları baskılar.
14
T reg’lerin aktivasyonu için TCR uyarımı gereklidir. Ancak T reg hücresi bir
kez aktive oldu mu körü körüne diğer T hücreleri baskılar (59). T reg hücrelerinin
dört temel baskılama mekanizması; inhibitör sitokinler IL-10, IL-35, TGF-beta
aracılı baskılama, sitoliz (granzim-A, granzim-B ve perforin bağımlı) ile baskılama,
metabolik bozulma ve DC’lerin matürasyonunu veya fonksiyonunu değiştirerek
baskılama olarak sıralanabilir. Metabolik bozulmada Treg hücresi IL-2’ye yüksek
afinite gösteren CD 25 molekülünü eksprese eder. CD 25 IL -2R2 alfa alt birimidir
ve ortamdaki IL2’yi bağlayarak uzaklaştırır. Ayrıca siklik AMP (cAMP) aracılı
baskılama veya CD 39- CD 73 adenozin reseptör 2A aracılı baskılama da metabolik
düzeyde gerçekleşir.
DC hedeflendiğinde ise, lenfosit aktive edici gen 3 (LAG3) MHC-sınıf 2
aracılı baskılama yapar ve CTLA-4-CD80/CD86 etkileşimi ise immünsüpresif bir
molekül olan indolamine 2,3-dioxygenase (IDO)’ nun eksprese edilmesini sağlar.
Meme kanserinde Treg hücreleri FoxP3 pozitifliği gösterir ve tümörün
agresifleşmesine paralel olarak artış gösterir. İnvaziv meme kanserinde bulunan
yüksek sayıdaki FoxP3 T hücreleri hastaların sağ kalımındaki düşüşle korelasyon
gösterir (61).
Naif T hücrelerden Th17 gelişimi TGF-beta ve IL-6 varlığında meydana gelir
(62). IL-1, IL-18 ve IL-23 varlığında Th17 hücrelerinde sitokin üretimi daha da
güçlenir. CD 4+ Th17 hücreleri hücre dışı bakterilerin yok edilmesine, otoimmün
hastalıklarda granülositlerin göçünü ve IgM, IgG, IgA ekspresyonunu sağlayarak
katkıda bulunur (60). Tümöre infiltre Th17 hücreleri düşük düzeyde anti-inflamatuar
sitokin olan IL-10 da eksprese ederler ancak bu hücrelerin çok büyük bir bölümü
efektör sitokinler olan IL-2, Granülosit-makrofaj koloni-stimüle edici faktör (GMCSF), IFN gama ve tümör nekroz faktör (TNF) üretirler (62). IL-17 ve IFN-gama,
tümör hücrelerinden CXCL9 ve CXCL10 kemokinlerin ekspresyonunu uyarır. Bu
durum sitotoksik CD8+ T hücrelerinin tümöre yönelmesine yol açar. Bu hücrelerin
esas protümöral etkileri anjiogenezle ilgilidir.
Miyeloid hücrelerin tümör
mikroçevresine göçüne ve nötrofillerin elastaz salgılamasına yol açarlar.
15
2.4. Deneysel Meme Kanseri Oluşturulması
Deneysel
meme
kanseri
oluşturulmasında
kimyasal
karsinojenlerle
oluşturulan meme kanseri ve 4T1 meme kanseri hücresi enjekte edilerek oluşturulan
yöntem olmak üzere iki farklı yöntem vardır.
Kimyasal olarak tetiklenen deneysel karsinogenez modelleri in vivo kanser
çalışmalarında daha önceleri sıklıkla kullanılmıştır. Örnek olarak güçlü kanser
oluşturma özelliğine sahip olduğu bildirilen N-nitroz-N-metilüre (NMU) SpragueDawley cinsi dişi sıçanlarda meme adenokarsinomu için uygulanmıştır (46).
Kimyasal yolla oluşturulan meme kanseri modellerinde kemoterapitik
ajanların sistemik toksisitesi nedeni ile başka modeller araştırılmıştır.
4T1 meme kanseri ilk kez Fred Miller ve arkadaşları tarafından 1992 yılında
tanımlanmış, transplante edilebilen kanser hücreleridir (49). 4T1 meme kanseri
hücreleri BALB/c farelerde ve doku kültüründe yaşayabilir. Bu hücreler yüksek
derecede invazif özellik gösterirler. Meme dokusundaki primer lokalizasyonundan
lenf düğümü, kan, karaciğer, akciğer, beyin ve kemik başta olmak üzere diğer
dokulara metastaz yaparlar.
4T1 meme kanseri hücrelerinin deneysel çalışmalarda tercih edilme
nedenlerini şöyle sıralayabiliriz. Öncelikle meme dokusuna kolayca ekiminin
yapılabilmesi sayesinde bu hücreler anatomik olarak doğru bölgede tümör oluşmasını
sağlarlar. İkincisi, primer tümörden metastaz gelişimi spontan olarak insan meme
kanserine benzer olarak gelişir. Metastaz bölgeleri insan meme kanseriyle benzerlik
gösterir. Diğer bir avantajı, primer tümör cerrahi olarak eksize edildikten sonra
metastaz gelişen bölgelerde çalışmaların devamı sağlanabilir. Bu hücrelerin in vivo
ve in vitro deneylerde kullanımlarının uygun olması, son zamanlarda yapılan CD4+
ve CD8+ T lenfositlerin aktivasyonunu hedefleyen immünoterapi çalışmalarında
kullanımlarını mümkün kılmıştır (5).
4T1 meme kanseri hücre hattı %10 fötal dana serumu, %1 L-glutamin ve %1
penisilin/streptomisin içeren, RPMI1640 medyum içerisinde büyütüldü. Çoğaltılan
16
4T1 hücreleri (5x104 hücre/100 μl) dişi BALB/c farelerin meme dokusuna subkutan
(s.c.) enjekte edildi ve tümör gelişimi izlendi.
Deneyin sonlandırılması ile tümör dokusu, akciğer, karaciğer ve dalak
dokuları incelenmek üzere toplandı.
2.5. Dalak
Dalak, damar ve lenf dokusundan oluşan vücuttaki en büyük RES organıdır.
Primitif mezodermden köken alan dalak sol üst karın bölgesinde 9-10-11. kostalar
altında lokalizedir. İnsanlarda 7-11 cm uzunluğunda ve 150 gr (70-250 gr) ortalama
ağırlıktadır. Dalak parankimi kırmızı pulpa, beyaz pulpa ve ikisi arasında yer alan
marjinal zondan oluşmaktadır.
Kırmızı pulpa; makrofajların mikroorganizmaları, hücresel artıkları, antijenantikor komplekslerini ve patolojik eritrositleri dolaşımdan uzaklaştırmasını sağlayan
dinamik bir filtrasyon sistemi olarak çalışır. Beyaz pulpa; antijenik bir uyarı
varlığında lenfosit proliferasyonun merkezi olan germinal merkezleri oluşturan T
lenfosit, B lenfosit ve lenfoid foliküllerin oluştuğu yerdir. Marjinal zon lenfositlerin
ve lokal olarak oluşturulmuş immünglobülinlerin sistemik dolaşıma katıldığı kırmızı
pulpaya geçiş bölgesidir.
2.5.1. Dalağın Fonksiyonları ve İmmünolojik Etkileri
Dalağın dört ana fonksiyonu vardır:
1- Filtrasyon
2- Konakçı defansı
3- Depolama
4- Sitopoez
17
Dalak haraplanmış yada yaşlanmış kırmızı kan hücrelerini, anormal beyaz
kan hücrelerini ve plateletleri kandan uzaklaştırır. Dalak hem humoral hem de
hücresel immüniteye katkıda bulunarak konakçı defans mekanizmasında önemli rol
tutar. Antijenler beyaz pulpa içerisinde filtre edilerek lenfoid foliküller içerisinde
immünokompedan merkezlere sunulmaktadır. Bu immünglobulinlerin (başlıca Ig M)
oluşumunda artışa yol açar. Sonra dalak beyaz pulpasından opsonize antikor salınımı
olur. Daha sonra antijenler splenik ve hepatik RES’te temizlenir. Dalaktaki
opsoninler tuftsin ve properdindir. Tuftsin konakçıda genel fagositik fonksiyon
üzerine stimülan etkili olup bakteri temizlenmesine yol açan makrofajları etkiler.
Properdin ise kompleman aktivasyonunda alternatif yolun başlangıcında önemli olan
bir proteindir.
Splenik RES yetersiz opsonize edilen bakterilerin sirkülasyonundan
temizlenmesini hepatik RES’ten daha iyi yapar. Kapsüllü bakteriler (pnömokok,
h.influenza) asplenik bir hasta için risk oluşturur.
İnsan vücudunda kan hücrelerinin yarı ömrü nötrofil 6 saat, trombosit 10 gün
ve eritrosit 120 gündür. Normal koşullarda trombosit havuzunun 1/3’ü dalakta
sekstre edilir. Splenomegali ve hipersplenizmde hücresel sekestrasyon ve yıkım artışı
olur. Fetüsün 4. ayından başlayıp kemik iliği aktif hale geçene kadar eritropoeze
katkısı vardır.
2.5.2. Splenektomi Endikasyonları
Tarihçe
1678 Nicholas Matthias travma sonrası splenektomiyi
1919 Morris ve Bullock dalaksız kobaylarda enfeksiyonların arttığını
1928 William Mayo 500 splenektomi serisinde mortalitenin % 10 olduğunu
18
1953 King ve Schumacker herediter sferositoz nedeni ile splenektomi olan
çocuklarda sepsis nedeni ile ölümler bildirmiştir.
Endikasyonlar
Splenektomi için en yaygın endikasyon, iatrojenik veya başka bir nedenle
dalağa olan travmadır. Tarihsel olarak elektif splenektominin en yaygın endikasyonu
Hodgkin hastalığı evrelemesi, günümüzde en sık splenektomi endikasyon İTP’dir.
1-Kırmızı hücre bozuklukları(Herediter sferositoz, orak hücreli anemi,
talasemi, enzim defektleri, otoimmün hemolitik anemi)
2-Trombosit bozukları(İdiopatik trombositopenik purpura )
3-Beyaz hücre bozuklukları(lösemi, lenfomalar)
4-Kemik iliği bozuklukları(miyelofibrozis, KML, AML, Polisitemi vera)
5-Splenik tümörler
6-Depo hastalıkları(Gaucher, Nieman pick hastalığı, Amiloidoz )
7-Splenik enfeksiyonlar ve apseler başlıca splenektomi endikasyonlarıdır.
2.5.3. Splenektomi Komplikasyonları
1) Hemotolojik Komplikasyonlar: Lökositoz ve trombositoz, Siderosit ve
Howel-Jolly Cisimcikleri gibi periferik yaymada değişikliklerdir.
2) Pulmoner Komplikasyonlar: Sol Alt Lob Atelektazisi, Plevral Efüzyon
ve Pnömonidir.
3) Enfeksiyöz Komplikasyonlar: Subfrenik Abse, Yara Yeri Enfeksiyonu
19
4) Pankreatik Komplikasyonlar: Pankreatit, Psödokist, Pankreatik Fistül
5) Tromboembolik Komplikasyonlar: Derin Ven Trombozu
6) Ciddi Postsplenektomik Enfeksiyon (CPSE)
CPSE %1-5 oranında görülür. Mortalite çocuklarda daha fazladır. İnsidans ve
mortalite talasemi major gibi altta yatan hemorajisi olan durumlarda daha yüksektir.
Aşı ile insidansı belirgin azalmıştır. En sık enfeksiyöz ajanlar S.pnomoni,
H.influenza Tip B, meningokok, Babesia Microti ve Malary.
CPSE pnomoni ve menenjitlerle beraber olur. Genellikle kriptik bir
nazofaringeal kaynaktan şüphelenilir. CPSE hafif görünümlü ateş, miyalji, baş ağrısı,
diyare, kusma, karın ağrısı ile başlar. Sonra hipotansiyon, anüri, DIK, fulminan
bakteriyel sepsisle gider. Ölen hastaların yarısından fazlası ilk 48 saatte olur.
Hematolojik nedenli splenektomi yapılanlarda travma nedenli yapılanlardan
daha sık görülür. Hodgkin hastalığında immün sistem baskılanmasından dolayı,
kemoterapi ve radyoterapi alanlarda daha sık görülür. Çocuklukta ilk iki yılda
postsplenektomi sonrası çıkar. Koruyucu amaçlı her üç etkenin içerdiği (pnömokok,
meningokok, hib) aşılar ameliyattan en az 7-14 gün önce veya hemen sonrasında en
kısa sürede yapılır. Pnömokok açısından destekleyici dozlar 5-6 yılda bir
yapılmalıdır. Yıllık influenza immünizasyonu önemlidir. Antibiyotik proflaksisi
günlük tek doz penisilin veya amoksisilin iki yıl boyunca asplenik çocuklar için
önerilir.
2.6. Splenektomi İmmünolojisi
Dalak hem humoral hem de hücresel bağışıklıkta görev alan bir organdır. Kan
dolaşımındaki bakterilere karşı spesifik antikor yapılması, T ve B lenfositlerinin
olgunlaştırılması, antikorla işaretli hücrelerin fagositozu, tuftsin ve properdin yapımı
gibi immünolojik fonksiyonları vardır. Bununla birlikte dalaktaki makrofaj ve
histiyositler, antikor ya da opsonik proteinle işaretli bakterileri fagosite ederek
20
ortadan kaldırırlar. Dolayısıyla dalağın, organizmayı enfeksiyonlara karşı korumada
önemli bir fonksiyonu vardır (63-64).
Splenektomili
hastalarda
gelişen
septik
komplikasyonların,
dalak
fonksiyonlarının kaybı ile gelişen çok sayıda immünolojik değişikliklerden
kaynaklandığı gösterilmiştir. Bu değişiklikler arasında, immünoglobulin düzeylerinin
değişmesi, komplemanın alternatif yolda aktivasyonunda azalma, serum opsonize
edici proteinlerin kaybı ve hücresel immünitede ortaya çıkan değişiklikler sayılabilir
(65-66).
Splenektomi sonrası gelişen enfeksiyon, gribal bir hastalık gibi başlayıp
hızlıca septik şok veya dissemine intravasküler koagülasyonun eşlik ettiği sepsis
veya menenjit tablosuna ilerleyebilir (67).
Bir çok çalışmada splenektomi yapılan hastalarda, splenektomi yapılmayanlar
ile karşılaştırıldığında serum IgG, IgA düzeylerinde artış ve IgM düzeylerinde
azalma olduğu gösterilmiştir (68-69). Dalak B hücrelerinin sekestrasyonu ve
diferansiasyonu için önemli organdır. Splenektomili hastalarda periferik dolaşımda
CD 19 düzeylerinde artış olduğu görülmüştür (70).
Amaç
Dalak MKB hücreleri için esas yerleşim bölgesini oluşturmaktadır.
Splenektominin tümör gelişimi, metastazları ve MKB hücrelerinin dağılımı üzerine
olan etkileri bilinmemektedir. Bu çalışmanın amacı deneysel meme kanseri
modelinde splenektominin immünolojik etkilerinin araştırılmasıdır.
21
3. MATERYAL METOD
3.1. Deney Hayvanları ve Protokolü
Çalışma için Hacettepe Üniversitesi Deney Hayvanları Etik Kurulu’nun
28.08.2014 tarih, 2014/48 kayıt ve 2014/48 – 05 karar numaralı izni alındı.
Bu çalışma HÜTF Bilimsel Araştırma Birimi tarafından 25.11.2014 başlangıç
tarihli finansal destek ile hazırlandı (proje numarası: 014 D11 101 007 ).
Deneyler Hacettepe Üniversitesi Tıp Fakültesi Temel Onkoloji İmmünoloji
Ünitesi Laboratuvarı’nda gerçekleştirildi. Helsinki deklerasyonu hayvan deneyleri ile
ilgili etik yasa uyarınca; deney hayvanları laboratuvarında yetiştirilen, ağırlıkları 1822 gr arasında değişen, standart laboratuar yemi ile beslenen ve normal musluk suyu
verilen, 38 adet altı haftalık Balb-c cinsi dişi fare kullanılmıştır. Deney hayvanları
oda sıcaklığında tutulmuş ve kafeslerde takip edilmiştir.
Çalışmaya toplam 38 adet, altı haftalık Balb-c cinsi dişi fare dahil edildi.
Hayvanlar; kontrol grubu, meme kanseri grubu, splenektomi grubu, meme kanseri
öncesi splenektomi grubu , meme kanseri sonrası splenektomi grubu olmak üzere beş
gruba ayrıldı.
3.2. Çalışma Gupları
Çalışmaya toplam 5 grup dahil edildi.
1-Kontrol grubu: (5 adet Balb-c fare) Splenektomi yapılmayan kontrol
grubunda cerrahi işlemin etkisini yaratmak üzere orta hat kesisi ile cilt, cilt altı ve
periton açılarak iç organlara dokunulmaksızın hayvanlar yeniden kapatıldı. Ameliyat
sonrası komplikasyon gözlenmeyen farelere 1 hafta sonra meme yağ dokusuna sc.
PBS(fosfat tamponlanmış çözelti) verildi.
22
2-Meme kanseri grubu: (6 adet Balb-c fare) Splenektomi yapılmayan
hayvanlarda orta hat kesi ile cilt, cilt altı ve periton açılarak iç organlara
dokunulmaksızın hayvanların 5-0 vikril ile peritonu ve cilt kapatılarak laparotomisi
yapıldı. 1 hafta sonra meme yağ dokusuna sc. 5*10e4 4T1 meme kanseri hücresi
enjekte edildi.
3-Splenektomi grubu: (8 adet Balb/C fareye) Cilt, cilt altı.periton kesilerek
laparotomi yapıldı. Sonrasında dalak eksplore edildi. Mide ve barsaklardan disseke
edildikten sonra splenik damarlar 5-0 vikril ile bağlanıp, dalak çıkarıldı. Katlar 5-0
vikril ile anatomik kapatılarak işleme son verildi. 1 hafta sonra subcutan meme yağ
dokusuna PBS enjekte edildi.
4-Splenektomi+ meme kanseri grubu: (9 adet Balb-c fare) Orta hat kesi ile
cilt, cilt altı ve periton açılıp splenektomi uygulanan gruba işlemden 7 gün sonra sol
abdominal bölge meme yağ dokusuna sc.5*10e4 meme kanseri hücresi enjekte edildi.
5-Meme kanseri+splenektomi grubu: (10 adet Balb-c fare) Sol abdominal
bölge meme yağ dokusuna sc.5*10e4 meme kanseri enjekte edilen gruba 7 gün sonra
splenektomi yapıldı.
Haftada 2 kez inokülasyon bölgesi palpe edilerek tümör gelişimi ve tümör
çapı ölçüldü. Tüm gruplarda vücut ağırlığı kaydedildi. Hayvanların genel sağlık
durumları, su ve besin alımları göz önünde bulunduruldu.
Tümör çapının en çok 2 cm’ye ve en az 0.5 cm’ye ulaşması ile deneyler
sonlandırıldı. Her hayvandan serum toplandı ve çıkarılan organların bir kısmı
23
patolojik inceleme için formol içerisine, diğer kısımlar ise immünolojik analizler için
PBS içerisine alındı.
3.3. Anestezi
Tüm gruplar için genel anestezi, 5 mg/kg xylasine (Alfazyne- %2 ) ve 150
mg/kg ketamin hidroklorür ( Ketalar- %5 ) karışımı intraperitoneal verilerek
sağlanmıştır.
3.4. Cerrahi Teknik
Balb/C türü deney hayvanlarına anestezik olarak 150 mg/kg’dan ketamin ve 5
mg/kg’dan xsilazin dilüe edilerek sağ karın bölgesine sc.enjekte edildi. Daha sonra
supin pozisyonda sabitlenen hayvanların ameliyat yerleri batikon ile temizlendikten
sonra, 11 numara bistürü ile orta kat kesi ile cilt, cilt altı ve periton kesilerek
laparotomi yapıldı. Penset ile dalak hafifçe tutulup mide, pankreas ve barsaklardan
künt olarak disseke edildikten sonra splenik damar 5-0 vikril ile bağlanıp
splenektomi gerçekleştirildi. Kanama kontrolü takiben periton ve cilt 5-0 vikril ile
continue kapatılarak ameliyat sonlandırıldı.
Tümör oluşturulduktan sonra deney sonlandırılan hayvanlarda, eter ile
sedasyon yapılıp dekapitasyon sonrası kan örneği alındı. Sonrasında cilt cilt altı
kesilen hayvanlarda peritoneal tümör implantları çıkarıldı. Ardından karın ve göğüs
bölgeleri açılan hayvanlarda tüm organlar, tümör odakları eksplore edildi.
Karaciğer lobları; üstte diyafragmadan ve inferior vena kavadan, solda
mideden, inferiorda duodenumdan hepatoduodenal ligament kesisi ile ve sağ
böbrekten ayrılarak disseke edilip çıkarıldı.
Akciğerler altta diyafragma ve pulmuner ligamentten serbestlendi. İki akciğer
lobu arasından kalp vasküler pedikülleri ile çıkarıldı. Daha sonra üstte akciğerler
trakea gözlenip kesildikten sonra serbestlenip çıkarıldı. Özellikle bazı splenektomi
loju tarafını dolduran tümör implanları keskin disseksiyonlar ile çıkarıldı.
24
Meme kanseri oluşturulması
Bu çalışmada 4T1 meme kanseri hücrelerinin tercih edilme nedenlerini şöyle
sıralayabiliriz. Öncelikle meme dokusuna kolayca ekiminin yapılabilmesi sayesinde
bu hücreler anatomik olarak doğru bölgede tümör oluşmasını sağlarlar. İkincisi,
primer tümörden metastaz gelişimi spontan olarak insan meme kanserine benzer
olarak gelişir. Metastaz bölgeleri insan meme kanseriyle benzerlik gösterir. Diğer bir
avantajı, primer tümör cerrahi olarak eksize edildikten sonra metastaz gelişen
bölgelerde çalışmaların devamı sağlanabilir. Bu hücrelerin in vivo ve in vitro
deneylerde kullanımlarının uygun olması, son zamanlarda yapılan CD4+ ve CD8+ T
lenfositlerin aktivasyonunu hedefleyen immünoterapi çalışmalarında kullanımlarını
mümkün kılmıştır (5).
4T1 meme kanseri hücre hattı %10 fötal dana serumu, %1 L-glutamin ve %1
penisilin/streptomisin içeren, RPMI1640 medyum içerisinde büyütüldü. Çoğaltılan
4T1 hücreleri (5x104 hücre/100 μl) dişi BALB/c farelerin meme dokusuna subkütan
(s.c.) enjekte edildi ve tümör gelişimi izlendi.
Deneyin sonlandırılması ile tümör dokusu, akciğer, karaciğer ve dalak
dokuları incelenmek üzere toplandı.
Resim 3.1: Farede orta hat cilt ve periton kesisi
25
Resim 3.2:Dalak disseke edildikten sonra pensetle tutulmuş, splenik damar
görünümü
Resim 3.3: Splenik damarın bağlanıp, dalağın çıkarılması
26
Resim 3.4: Orta hat cilt ve peritonun kapatılması
Resim 3.5: Deney sonlandırıldıktan sonra, dekapitasyon sonrası peritoneal
yüzeyde tümör implantları
3.5.
Değerlendirme Parametreleri
1-Hayvan ağırlıkları: Tüm gruplarda hayvanlar haftada 2 kez olmak üzere
toplam 7 kez tartılarak 3 hafta boyunca takip edildi.
2-Dalak, karaciğer, akciğer boyut ve ağırlıkları: tüm gruplarda deneyler
sonlandırıldıktan sonra organlar ağırlık ve boyutları ölçülerek değerlendirildi.
27
3-Tümör ağırlık ve çapları: Tümör oluşturulmuş gruplarda ( grup 2, 4 ,5)
haftada 2 kez tümör çapları ölçüldü. Deneyler sonlandırıldıktan sonra tüm tümör
implantları tek tek ağırlık ve boyut olarak ölçülüp değerlendirildi.
4-Miyeloid kökenli hücre sayıları ve dağılımları: Tüm gruplarda deney
sonlandırıldıktan sonra alınan kan örnekleri akım sitometri cihazı ile miyeloid hücre
sayı ve dağılımları açısından analiz edildi.
5-Periferik kanda lökositoz: Tüm gruplarda deneyler sonlandırıldıktan sonra
alınan kan örneğinde akım sitometri cihazı ile lökosit sayısı( monositik ve
granülositik) analiz edildi.
Akım sitometri: Hayvanlar sakrifiye edildikten sonra elde edilen tümör,
karaciğer ve dalak dokuları PBS tamponu bulunan steril bir petri kabına alınarak
mekanik işlemlerle süspansiyon haline getirildi ve 70 μm açıklığı bulunan
filtrelerden süzüldü. Süzüntü, Ficoll yoğunluk gradienti ile fraksiyonlarına ayrıldı ve
mononükleer immün hücrece zengin olan faz toplanarak ilgili antikorlarla işaretlendi.
Miyeloid kökenli hücrelerin dağılımı anti-Gr 1 , anti- 4/7 , anti CD 11b antikorları ile
belirlendi. Analizler FACSAria-II akım sitometri cihazıyla (Becton-Dickinson,
ABD) ile yapıldı. Pozitif hücre yüzdesi uygun izotip kontrol antikoru ile
karşılaştırılarak değerlendirildi.
6- Histopatolojik analiz: Karaciğer, akciğer, dalak ve peritoneal spesmenlerin
metastaz ve patolojik değerlendirilmesi incelenmiştir.
Deney gruplarından toplanan dokuların bir kısmı histopatolojik inceleme
amacıyla %10 formol içerisine alındı. Tüm farelere öncelikle intraabdominal ve
intratorasik inspeksiyon yapıldı. Kontrol grubu farelerde eşlik eden olası başka
patoloji varlığı araştırıldı, beklenmedik patoloji içeren fareler kontrol grubu ve deney
grupları dışına bırakıldı.
Meme tümörü içeren gruplarda tümör dokusunun makroskopik özellikleri ve
karın duvarı periton invazyonu gözle değerlendirildi. Makroskopik olarak
28
intraabdominal ve intratorasik yaygın tümör varlığı, gözle görülen büyüklükte meme
tümörü metastazı varlığı değerlendirildi. Ayrıca deney sonlandırıldıktan sonra alınan
dalak, karaciğer, akciğer, periton ve tümör odakları mikroskopik olarak
hematoksilen-eozin boyama işlemleri sonrası ışık mikroskopu ile değerlendirildi.
Tümör içi izlenen nötrofilleri değerlendirilirken 40x büyütmede görülüyorsa
+1/2, 20x büyütmede görülüyorsa +1, 10x büyütmede görülüyorsa +2, 4x büyütmede
bile fark edilecek kadar çoksa +3 olarak belirlendi.
Ciltte inflamasyon genellikle nötrofil lökositlerden oluşmakta burada da
yoğunluklarına göre skorlandı; şiddetli ise +3, orta şiddette ise +2, hafif şiddette ise
+1 olarak belirlendi.
3.6. İstatistiksel Analizler
Deneysel gruplardan elde edilen veriler için Excell Office programı 2013
versiyonu kullanıldı. Elde edilen verilerin normal dağılıp dağılmadığı Anova testi ile
değerlendirildi. Tüm gruplarda normal dağılım görüldükten sonra karşılaştırma için
Student’s t testleri kullanıldı. P<0.05 istatiksel olarak anlamlı kabul edildi.
29
4. BULGULAR
Hayvanlarda değerlendirilme parametreleri olarak hayvan ağırlıkları, tümör
çapları, organ boyut ve ağırlıkları, lökositoz, MKH düzeyleri ve dağılımları, genel
sağlık durumları ve patolojik analiz yapıldı.
4.1.Ağırlık
Tablo 4.1. Ortalama hayvan ağırlıkları
Grup
1.hafta
2.hafta
3.hafta
Ortalama(gr)
Grup 1
18.4
19.8
20.4
19.6
Grup 2
17.9
18.1
18.6
18.2 *
Grup 3
18.4
19.5
19.3
19.1
Grup 4
18.3
19.1
19.2
18.9
Grup 5
19.6
18.4
18.9
19.0
Ortalama hayvan ağırlık değerlendirilmesinde; üç haftalık izlemde, meme kanseri
grubunda (grup 2) ağırlık azalması istatistiksel olarak anlamlı bulunmuştur (p<0.05).
30
Grafik 4.1. Gruplarda hayvan ağırlıkları
Gruplara göre işlemlerin gerçekleştirildiği ve hayvanların takip edildiği 3 hafta
süresince hayvan vücut ağırlıkları incelendiğinde hayvanlarda ilk hafta vücut
ağırlıklarında azalma, sonrasında tekrar ağırlık artışı izlenmiştir.
Ağırlık-ölçüm grafiğine göre; hayvan ağırlıkları ameliyat sonrası azalmış olup,
bu azalma dalağın korunduğu meme kanseri grubunda diğer gruplardan istatistiksel
olarak anlamlı bulunmuştur.(grup 2)
4.2.Dalak, Karaciğer Akciğer Boyut ve Ağırlıkları
DALAK
Grup 1
2
3
5-1 hft
Grup 1
2
3 5-1 hft
31
Grafik 4.2.1: Dalak boyut ve ağırlıkları
Grup 1: kontrol grubu (sham kesisi) , grup 2: meme kanseri grubu, grup 3:
splenektomi grubu, grup 5-1 hft: meme kanseri sonrası 1. hafta splenektomi grubunu
göstermektedir.
Dalak boyut ve ağırlık grafiğinde miyeloid kökenli hücrelerin kanser sonrası
dalakta birikimine bağlı olarak, grup 2’ de dalak boyut ve ağırlığı diğer gruplardan
istatistiksel olarak yüksek bulunmuştur (p<0.05)
KARACİĞER
Grafik 4.2.2: Karaciğer boyut ve ağırlıkları
Karaciğer boyut ve ağırlığı grafiğinde; gruplar arasında karaciğerin boyut ve
ağırlığında anlamlı fark saptanmamıştır.
32
AKCİĞER
Grafik 4.2.3: Akciğer boyut ve ağırlıkları
Akciğer boyut ve ağırlığı grafiğinde; gruplar arasında akciğer boyut ve
ağırlığında anlamlı fark saptanmamıştır.
Tablo 4.2. Ortalama organ ağırlıkları
Grup
karaciğer(gr)
akciğer(gr)
dalak(gr)
Grup 1
1.05
0.15
0.09
Grup 2
0.86
0.13
0.15 *
Grup 3
0.89
0.13
0.08
Grup 4
1.03
0.15
0.09
Grup 5
1.01
0.16
0.08
Ortalama organ ağırlıkları tablosunda; meme kanseri grubunda (grup 2) dalak boyut
ve ağırlığında istatistiksel olarak anlamlı artış gözlenmiştir (p<0.05).
33
Ortalama organ ağırlıkları tablosunda; karaciğer, akciğer boyut ve ağırlıklarında
istatistiksel olarak gruplar arasında anlamlı fark saptanmamıştır.
4.3.Tümör Ağırlık ve Çapları
Tablo 4.3. Ortalama tümör ağırlıkları
Grup
Tümör ağırlığı (gr)
Grup 2
0.21 **
Grup 4
0.14 *
Grup 5
0.07
Ortalama tümör ağırlıkları tablosunda; meme kanseri grubunda (grup 2) tümör
ağırlığı diğer gruplardan istatistiksel olarak anlamlı yüksek bulunmuştur (p<0.01).
Splenektomi eklenen gruplarda tümör ağırlıkları belirgin olarak azalmıştır ve fark
istatistiksel olarak anlamlıdır. Tümör ağırlığındaki azalma meme kanseri sonrası
splenektomi uygulanan grupta en belirgindir (p<0.05) .
34
Grafik 4.2: Tümör Ağırlık ve Çapları
Meme kanseri sonrası splenektomi yapılan grupta (grup 5) 4 kez tümör
boyutu ölçülmüş, grup 2 ve grup 4’te tümör boyutu 3 kez ölçülmüştür.
Gruplara göre işlemlerin gerçekleştirildiği ve tümörlerin takip edildidiği 3
hafta süresince ;
Tümör oluşturulmuş grup 2, 4, 5’te tümör çapları grafiklerinde:
Tümör çaplarının her üç grupta zamanla arttığı ancak splenektomi eklenen
gruplarda büyümenin daha yavaş olduğu izlenmiştir (p< 0.01 ) .
35
4.4. Miyeloid kökenli hücre sayı ve dağılımları
4.4.1. Periferik kanda miyeloid kökenli hücreler:
Grafik 4.4.1: Periferik Kanda Miyeloid kökenli hücre sayı ve dağılımları
(*p<0,05
**p<0,01)
MDSC’lerin tümör oluşturulmuş grup 2,4,5(meme kanseri grubu, meme
kanseri öncesi splenektomi grubu ve meme kanseri sonrası splenektomi grubu) de
periferik kanda yüksek oranda olduğu izlenmiştir (p<0.01).
MDSC’ler
kendi
içlerinde
ayrılarak
incelendiklerinde
(Ly6CdüşükLy6G+)
hücrelerde
belirgin
(Ly6CyüksekLy6G-)
hücrelerde
splenektomi
görülmektedir (p<0.05).
fark
Granülositik
izlenmezken,
eklenen
gruplarda
monositik
azalma
36
4.4.1.1. Periferik Kanda Lökositoz
Grafik 4.4.1.1: Periferik Kanda Lökositoz
(* p<0,05
**p<0,01)
Splenektomi yapılmış gruplarda periferik kanda istatistiksel olarak anlamlı
lökositoz görülmüştür (p<0.05). Ayrıca MDSC’lerin de splenektomi yapılmış
yapılmış gruplarda (gup 3, grup 4, grup 5) periferik kana yöneldiği görülmektedir.
Özellikle tümör oluşturulmuş splenektomi gruplarında (grup 4 ve grup 5 ) periferik
kanda istatistiksel olarak anlamlı MDSC artışı görülmüştür (p<0,01).
Dalak
4.4.2. Dalakta miyeloid kökenli hücreler:
Miyeloid- kökenli baskılayıcı hücre
öranı
*
+
CD11b Gr1 %
**
1
2
+
Grup:
3
5-1 hft
**
Grup: 1
2
3
5-1 hft
Grafik 4.4.2: Dalakta Miyeloid
Grup:
1
2
3
kökenli hücre sayı ve dağılımları
5-1 hft
37
(Grup 1: kontrol grubu , grup 2: meme kanseri grubu , grup 3: splenektomi grubu,
grup 5-1 hafta: meme kanseri sonrası 1.hafta splenektomi grubu)
(* p<0,05
**p<0,01)
Dalakta miyeloid kökenli baskılayıcı hücre (MDSC) birikimini gösteren
grafiklerde özellikle meme kanseri grubunda (grup:2 ) MDSC’lerin daha fazla
biriktiği izlenmiştir. (p< 0.01).
MDSC’ler kendi içlerinde ayrıldıklarında ise grup 2’de immatür granülositik
hücrelerin istatistiksel olarak anlamlı yüksek, immatür monositik hücrelerin ise
anlamlı düşük olduğu görülmüştür (p<0.01).
4.4.3. Karaciğerde miyeloid kökenli hücreler
Grafik 4.4.3: Karaciğerdeki miyeloid kökenli hücreler
(* p<0,05
**p<0,01)
MDSC’lerin tümör oluşturulmuş gruplarda dalağın olmadığı grup 4 ve grup
5’te karaciğerde toplandığı görülmüştür. Yine immatür granülositik ve immatür
monositik hücrelerin karaciğerde arttığı izlenmiştir. Dalağın korunduğu grup 2 meme
ca grubunda karaciğerde MDSC birikiminin, grup 4 ve grup 5’ten daha az olduğu
38
görülmüştür. Dalak olmadığı zaman MDSC’ ler anlamlı olarak karaciğere
yönelmektedir (p< 0.01).
4.5. Histopatolojik Bulgular
Resim 4.1. Laparatomide splenik loja doğru büyüme gösteren tümör
implantı (grup 5)
Resim 4.2. Grup 2’de splenomegali (meme ca grubu)
39
Resim 4.3. Grup 5’te en sağdaki spesmenlerde karaciğer metastazı ve
splenomegali
Resim 4.4. Akciğerde plevral implant odağı (grup 4: meme kanseri öncesi
splenektomi grubu)
40
Resim 4.5. Karaciğerde kapsüler yüzeyden parankime doğru
ilerleyen metastatik odak (grup 4)
Resim 4.6. Metastatik bir karaciğer parankiminde izlenen artmış sayıda (100'ün
üzeri) myeloid kökenli supresör hücre kümeleri (grup 4)
41
Resim 4.7. Büyük büyütmede myeloid kökenli süpresör hücre kümeleri (grup 4)
Resim 4.8. İntratümöral segmentli lökositler (grup 5)
42
Resim 4.9. Akciğerde izlenen parankimal metastatik odak( grup 5 :meme
kanseri sonrası splenektomi grubu)
Resim 4.10. Pankreasa invaze malign neoplazm (grup 5)
43
Resim 4.11. Karaciğer parankiminde izlenen artmış sayıda (100'ün üzeri)
myeloid kökenli supresör hücre kümeler (grup 5)
Resim 4.12. Laparotomi alanında izlenen cilt-cilt altı metastaz (grup 4: meme
kanseri öncesi splenektomi grubu)
44
Resim 4.13. Laparotomi alanındaki epidermal-dermal
inflamatuar hücre yanıtı (grup 5: meme kanseri sonrası splenektomi grubu)
Grup 1’de alınan farelerden yapılan akciğer diseksiyon örneklerinde metastaz
saptanmamıştır. Sadece bir fare akciğerinde hafif şiddette konjesyon mevcuttur.
Çıkartılan dalak örneklerinde H&E boyamasında granülositik/monositik hücre
yoğunluk farkı mevcut değildir. Karaciğerden hazırlanan örneklerde metastaz
saptanmamıştır. Karaciğer örneklerinin tümü incelenmiş olup bu grupta ortalama 3-4
adet genellikle matür-banded nötrofillerden oluşan kümelenmiş segmentli lökosit
odakları sayılmıştır.
Grup 2’de alınan farelerden yapılan akciğer diseksiyon örneklerinde metastaz
saptanmamıştır,
fare
akciğerlerinde
izlenmektedir.
Çıkartılan
dalak
hafif
şiddette
örneklerinde
atelektazik
değşiklikler
H&E
boyamasında
granülositik/monositik hücre yoğunluk farkı mevcut değildir.
Karaciğerden
hazırlanan örneklerde metastaz saptanmamıştır. Karaciğer örneklerinin tümü
incelenmiş olup bu grupta ortalama 2 adet genellikle matür-banded nötrofillerden
oluşan kümelenmiş segmentli lökosit odakları sayılmıştır. Ancak 3 no’lu farede diğer
fare örneklerinden farklı olarak artmış sayıda (50’den az) nötrofil odakları
45
saptanmıştır. Örneklenen tümör odaklarında izlenen intratümöral nötrofil lökosit
oranı +1 (20x büyütmede saptanan) olarak değerlendirilmiştir.
Grup 3’te alınan farelerden akciğer ve karaciğer örneklenmiştir. Akciğer
diseksiyon örneklerinde metastaz saptanmamıştır, Karaciğer örneklerinin tümü
incelenmiş olup bu grupta ortalama 9-10 adet genellikle metamyelosit-banded
nötrofillerden oluşan kümelenmiş segmentli lökosit odakları sayılmıştır.
Grup 4’te alınan farelerden yapılan akciğer diseksiyon örneklerinde
parankimde metastaz saptanmamıştır. Ancak 5 no’lu farede parankimal metastatik
odak saptanmamışken lenfatik içerisinde tümör odağı saptanmıştır (Resim 4.4).
Örneklenen karaciğer dokularından 7 tanesinde metastaz saptanmamıştır, metastaz
saptanmayan bu örneklerde ortalama 15 adet matür-banded nötrofillerden oluşan
kümelenmiş segmentli lökosit odakları mevcuttur. Bu odaklar özellikle portal alanda
dağılım göstermektedir. Bu gruptaki bir farede karaciğerde parankimal ve kapsül
üzeri implant şeklinde metastaz saptanmıştır (Resim 4.5) ve 100’ün üzerinde matürbanded nötrofillerden oluşan kümelenmiş segmentli lökosit odakları mevcuttur
(Resim 4.6). Bu gruptaki farelerden alınan tümör odaklarında izlenen intratümöral
nötrofil lökosit oranı +2 (10x büyütmede saptanan) olarak değerlendirilmiştir (Resim
4.7 ).
Grup 5’te alınan farelerden yapılan akciğer diseksiyon örneklerinde bir farede
metastatik odak saptanmıştır (Resim 4.9). 9 adet farenin 6 tanesinde karaciğerde
intraparankimal ve kapsüler yaygın metastatik odaklar saptanmıştır. Ayrıca bir
kısmınında pankreas da çıkarılmış olup bu alanlarda da yaygın metastaz görülmüştür
(Resim
4.10).
Karaciğerlerinde
metastaz
saptanan
farelerin
karaciğer
parankimlerinde 100’ün üzerinde matür-banded nötrofillerden oluşan kümelenmiş
segmentli lökosit odakları mevcuttur (Resim 4.11 ). Metastaz saptanmayan diğer üç
farenin karaciğerinde ise ortalama 6 adet segmentli lökosit odağı izlenmektedir. Bu
gruptaki farelerden alınan tümör odaklarında izlenen intratümöral nötrofil lökosit
oranı +2 (10x büyütmede saptanan) olarak değerlendirilmiştir.
46
Laparatomi alanlarından alınan cilt örneklerinde 2. grupta ciltte metastatik
odak saptanmamıştır ve bu örneklerde belirgin inflamatuar reaksiyon mevcut değildir.
Dördüncü gruptaki farelerden sadece bir tanesinde metastatik odak (Resim 4.12 )
izlenmektedir. Ancak bu gruptaki farelerde +1 (hafif şiddette) lenfomononükleer
hücre reaksiyonu saptanmıştır. Beşinci gruptaki farelerin de bir tanesinde ciltte
metastaz saptanmıştır. Bu gruptaki farelerde ise ciltte izlenen inflamatuar hücre
yanıtı ortalama +2 (orta şiddette) olup yer yer şiddetli inflamasyonun da izlendiği
(Resim 4.13 ) alanlar mevcuttur. Beşinci grupta intraabdominal yaygın pankreas
metastazı ve metastatik mezenterik lenf nodülleri saptanmıştır.
47
5.TARTIŞMA
Meme kanseri kadınlarda en sık görülen kanserdir. Son yıllarda meme
kanserinin tanı ve tedavisinde gelişmeler görülse de önemli sayıda hasta tedaviye
direnç göstermektedir. Bu nedenle meme kanserinde yeni tedavi stratejileri
geliştirilmesi önem arz etmektedir. Meme kanserinin ilk ortaya çıktığı bölgeden,
yerel, lenfatik ve kan aracılığı ile metastaz yapması söz konusudur. Kan yoluyla uzak
metastazlar oluşmakta ve en sık akciğer, kemik ve karaciğeri tutmaktadır (11). Son
yıllarda fareler üzerinde yapılan çalışmalar, immün sistemin kansere karşı konağı
koruyucu etkisinin yanı sıra immünojenitesi düşük tümörlerin oluşumuna da yardım
ettiğini göstermiştir (41).
Neredeyse bütün kanserlerin mikroçevresinde makrofajlar bulunmaktadır.
Özellikle meme kanserlerinde, makrofajlar tümör kitlesinin yarısından fazlasını
oluşturabilirler. Klinik çalışmalar meme kanserindeki makrofaj birikiminin kötü
prognoza işaret ettiğini göstermiştir (42). Ayrıca tümör mikroçevresindeki
makrofajların tümör hücrelerinin invazyonunu ve metastazları arttırdığı gösterilmiştir
(42).
Bakteriyel ve parazitik enfeksiyonlar ile akut ve kronik inflamasyon ve
travmatik streste de sayıları artan MDSC’ ler kanserde başlıca periferik kan, lenf
nodları ve dalakta bulunmaktadır. MDSC’ler myeloid hücrelerin tam olarak
tanımlanmış bir alt grubu olmaktan ziyade matür hücrelere farklılaşmaları
engellenmiş aktive immatür hücrelerin oluşturduğu heterojen bir topluluktur. Pek çok
tümör modelinde ve insan kanserinde MDSC popülasyonunda artış gözlenirken
MDSC’lerin ortadan kaldırılması hastalık ilerlemesinde dramatik bir iyileşme ve
bazen direk anti-tümör etki ile sonuçlanmaktadır. MDSC’ler aynı zamanda
anjiogenez, tümör hücresi invazyonu ve metastazlardaki artışlara da katkıda
bulunurlar (46).
Deneysel meme kanseri modelinde splenektominin immünolojik etkisi ile
ilgili olarak çalışmamızda, haftada iki kez yapılan hayvan ağırlık ölçümlerinde
cerrahi işlem sonrasında azalma saptanmıştır. Grup 5’te ilk önce meme kanseri
oluşturulup bir hafta sonrası splenektomi yapıldığı için, ilk iki ölçümde ağırlığının
diğer gruplar kadar düşmediği izlenmiştir. Ayrıca dalağı olan grup 2 meme kanseri
48
grubunda ise ağırlık düşüşünün daha belirgin olduğu izlenmiştir. Dalağın kendi
ağırlığı olmasına rağmen dalağın korunduğu grupta hayvan ağırlıklarının daha düşük
izlenmesi,dalakta biriken miyeloid kökenli hücrelerin olumsuz etkisinden olabilir.
Bir hafta sonrasında hayvanlarda tekrar ağırlık artışları olmakta ve en son
ölçümde bile grup 2 meme kanseri grubunda diğer gruplardaki hayvan ağırlıklarına
ulaşamamaktadır. Meme kanseri oluşturulmamış ve dalağı korunmuş grup 1’de
ağırlığın diğer gruplardan daha çok toparlandığı izlenmiştir. Bu da muhtemelen grup
3’te kanser oluşturulmamış ama dalağı alınmış hayvanlarda, dalağın immün sistem
etkisinden olabilir.
Gruplarda deneyler sonlandırıldıktan sonra bakılan karaciğer, akciğer
boyutları ve ağırlıkları açısından belirgin anlamlı fark izlenmemiştir. Fakat dalağın
korunduğu grup 2 meme kanseri grubunda MKH’lerin dalakta birikimine bağlı
belirgin splenomegali olduğu izlenmiştir. Tümör oluşturulmuş grup 2,4,5’ te tümör
çaplarının her üç grupta zamanla arttığı ancak grup 2’ de bu artışın daha fazla olduğu
izlenmiştir. Tümör ağırlıklarında ise splenektomi yapılmış gruplarda tümör
büyümesinde yavaşlama görüldüğü özellikle splenektominin tümör oluştuktan sonra
yapıldığı grup 5’te bu yavaşlamanın daha belirgin olduğu izlenmiştir. Grup 5’te
dalağın sonradan alınması primer tümör gelişimini grup 4’ten daha iyimser bir
şekilde etkilemiş olmasına rağmen karaciğer metastazı açısından, MKH hücrelerin
karaciğere daha fazla geçişi nedeni ile grup 5’te tümör progresyonu daha fazla
izlenmiştir. Ayrıca grup 5’te mezenterik metastatik LAP ve pankreasta metastaz
saptanmıştır. Bir farede ise akciğerde lenfatik metastatik odak saptanmıştır. Bütün
bunlar dalağın meme kanseri sonrası splenektomi yapılan Grup 5’te MKH’lerin
periferik kan ve karaciğere yönelmesinin metastazlardaki etkisine bağlı olabilir. Grup
2’de primer tümör boyutu, ağırlığı ve splenomegali anlamlı olarak fazla iken grup
5’te de metastatik progresyon fazla olarak saptanmıştır.
Dalağın alındığı grup 3,4,5’te(splenektomi grubu, meme kanseri öncesi
splenektomi ve meme kanseri sonrası splenektomi
grubu )lökositoz izlenmiştir.
Grup 4’te muhtemelen dalak yokluğu ve meme kanserinin beraber olması nedeni ile
aditif etki sonucu lökositozun daha fazla olduğu izlenmiştir. Grup 5’te önce tümör
49
oluşturulmasına bağlı artan lökositler, dalak ilk etapta alınmadığı için grup 4 kadar
belirgin yükselememektedir. Buradan da dalağın lökosit yıkımında etkisi olduğu ve
kanserin de lökositozu arttırdığı sonucuna varılabilir.
Kanserle splenomegali arasında ilişkide metastaz olmadan da splenomegali
olabileceği literatürde bildirilmiştir (10).
Farelerde CD11b+ Gr1+ MDSC hücrelerinin yüksek düzeyde T hücrelerinin
aktivitelerini azalttığı, sitotoksik T lenfositlerin aktivitesini azaltarak hepatik
metastazları arttırdığı gösterilmiştir (46).
Meme kanserinde ve diğer solid tümörlerde Sun Yat-Sen Üniversitesinde
Kanser Merkezinde 2000-2009 yılları arasında 3180 hastada yapılan çalışma
sonucunda %4-26 arasında lökositoz olduğu görülmüştür.
Meme kanserinde dalak metastazı ve hipersplenizm olabileceği, ayrıca
splenektomi sonrası pansitopenin düzeldiği bildirilmiştir. Bizim çalışmamızda grup 2
meme kanseri grubunda lökositoz olmaması splenemegali sonucu hipersplenizme
bağlı olabilir. Splenektomi yapılmış grup 3,4,5’te lökositoz, lökosit yıkım yeri olan
dalağın ortadan kaldırılmasına bağlanabilir.
Literatürde meme kanseri, akciğer kanseri, serviks kanseri ve başka
malignitelerde de lökositoz ve lökomoid reaksiyon olduğu bildirilmiştir (71).
MDSC’ler çeşitli tümör türevi sitokinlere karşı cevap olarak üretilen bir grup
olgunlaşmamış CD11b +GR1+ hücreleridir(makrofaj, granülosit, dendritik ve
myeloid hücrelerinin prekürsörlerini kapsarlar). Bu hücreler tümörle ilişkili CD8+ T
hücrelerinde tolerans indükleyici olarak gösterilmiştir. MDSC’lerin infeksiyon,
inflamatuar hastalıklar, sepsis, travmatik şok ve kanser gibi birçok olguda T hücre
aktivitelerini inhibe ederek etki ettiği bilinmektedir. Anti-tümör immüniteyi suprese
etkisi nedeni ile tümör anjiogenezis ve progresyonunda rol oynadığı pankreas
kanserinde gösterilmiştir (46) .
50
6. SONUÇ
ÇIKARIMLAR
1- Meme kanseri varlığında MKH dalakta birikmektedir ve bu durum
splenomegali nedeni olabilir.
2- Splenektomi
uygulanan
gruplarda
hayvan
ağırlıkları,
splenektomi
uygulanmayan gruplardaki ( meme kanseri grubu) daha yüksektir.
3- Splenektomi uygulanan gruplarda
primer tümör çapları , splenektomi
uygulanmayan gruplara göre daha küçüktür.
4- Splenektomi uygulanan gruplarda MKH; periferik kan, karaciğer ve
akciğerde daha yüksektir.
5- Vücut ağırlıkları daha yüksek olmasına rağmen, splenektomi uygulanan
gruplarda akciğer ve karaciğer metatstazları daha belirgin hale gelmektedir.
SONUÇ
Meme kanserinin direkt dalak metastazı yapmadığı durumlarda bile
splenektomi, MKH ve tümör hücre dağılımını etkilemektedir.
MKH dağılımına paralel olarak splenektomi, karaciğer ve akciğer
metastazlarını arttırırken, vücut ağırlığında da artışa neden olmaktadır.
51
7.KAYNAKLAR
1.
Levinson, D.A. , Reid, R.,Burt, A.D. (2008). Muir’s Textbook of
Pathology: Hodder Arnold
2.
Cheng, F., Gabrilovich, D., Sotomayor, E.M.(2004) Immune tolerance in
breast cancer. Breast Dis,20,93-103.
3.
Siegel, R., Naishadham, D., Jemal, A.(2012). CA: A Cancer Journal for
Clinicians, 62(1),10-29
4.
Romond, E.H., Perez, E.A., Bryant, J., Suman, V.J.,Geyer, C.E.,
Davidson, N.E. ve diğerleri. (2005) Transtuzumab plus Adjuvant
Chemotherapy for Operable HER2- Positive Breast Cancer. New England
Journal of Medicine, 353(16), 1673-1684
5.
Desmend, C., Haibe-Kains, B., Wirapati, P., Buyse, M., Larsimont, D.,
Bontempi, G. Ve diğerleri. (2008) Biological processes associated with
breast cancer clinical outcome depend on the molecular subtypes. Clin
Cancer Res, 14(16), 5158-5165
6.
Teschendorff, A.R., Miremadi, A., Pinder, S.E., Ellis, I.O., Caldas,
C.(2007) An immune response gene expression moduler identifies a good
prognosis subtype in estrogen receptor negative breast cancer. Genome
Biol, 8(8), R157
7.
Hanahan, D., Weinberg, R.A. (2000) The hallmarks of cancer. Cell,
100(1), 57-70
8.
Balkwill, F., Mantovani, A. (2001) Inflammation and cancer: back to
Virchow? Lancet, 357(9255), 539-545.
9.
Coussens, L.M., Werb, Z.(2002) Inflammation and cancer . Nature , 420
(6917), 860-867.
52
10.
Paget, S. (1889) The distribution of secondary growths in cancer of the
breast. The Lancet, 133(3421),571-573.
11.
Hart,I. (1982) ‘Seed and soil’ revisited: mechanisms of site-spesific
metastasis. Cancer and Metastasis Rewiews, 1(1),5-16.
12.
DeCosse, J.J., Gossens, C., Kuzma, J.F., Unsworth, B.R. (1975)
Embriyonic inductive tissues that cause histologic differentiation of
murine mammary carcinoma in vitro J Natl Cancer Inst, 54(4), 913-922
13.
Tisty, T.D. (2001) Stromal cells can contribute oncogenic signals. Semin
Cancer Biol, 11 (2), 97-104.
14.
Maffini ,M.V., Soto, A.M., Calabro, J.M., Ucci, A.A., Sonnenschein,
C.(2004) The stroma as a crucial target in rat mammary gland
carcinogenesis. J Cell Sci, 117(Pt 8), 1495-1502.
15.
Guc, D.(2005) Tümör İmmünolojisi. XVIII. Ulusal İmmünoloji Kongresi
Program ve Özel Kitabı, 166-171.
16.
Kalluri, R. (2003) Basement membranes: structure, assembly and role in
tumour angiogenesis. Nat Rev Cancer, 3(6), 422-433.
17.
Andriani, F., Garfield, J., Fusenig, N.E., Garlick, J.A. (2004) Basement
membrane proteins promote progression of intraepithelial neoplasia in 3dimensional models of human stratified epithelium. Int J Cancer , 108(3),
348-357.
18.
Roskelley,
C.D.,Bissell,M.J.(2002)
The
dominance
of
the
microenvironment in breast and ovarian cancer. Semin Cancer Biol,
12(2),97-104.
19.
Stetler –Stevenson, W.G.,Yu, A.E.(2001) Proteases in invasion: matrix
metalloproteinases. Semin Cancer Biol, 11(2),143-152.
53
20.
Egeblad,
M.,
Werb,
Z.(2002)
New
functions
fort
he
matrix
metalloproteinases in cancer progression. Nat Rev Cancer, 2(3),161-174.
21.
Mueller, M.M., Fusenig,N.E.(2004) Friends or foes- bipolar effects of the
tumour stroma in cancer. Nat Rev Cancer, 4(11), 839-849.
22.
Kuperwasser, C., Chavarria, T., Wu,M., Magrane , G., Gray, J.W., Carey,
L. Ve diğerleri.(2004)
23.
Bhowmick, N.A., Chytil, A., Plieth, D., Gorska, A.E., Dumont, N.,
Shappell, S. ve diğerleri. (2004) TGF-beta signaling in fibroblasts
modulates the oncogenic potential of adjacent epithelia. Science, 303
(5659), 848-851.
24.
Weeks, B.H., He, W., Olson, K.L.,Wang, X.J. (2001) Inducible expression
of transforming growth factor beta I in papillomas causes rapid metastasis.
Cancer Res, 61(20), 7435-7443.
25.
Shao, Z.M., Nguyen, M.,Barsky, S.H. (2000) Human breast carcinoma
desmoplasia is PDGF initiated. Oncogene, 19 (38), 4337-4345.
26.
Lewis, M.P., Lygoe, K.A., Nystrom, M.L., Anderson, W.P. Speight, P.M.,
Marshall, J.F. ve digerleri. (2004) Tumour-derived TGF-betal modulates
myofibroblast differentiation and promotes HGF/SF-dependent invasion of
squamous carcinoma cells. Br J Cancer, 90 (4), 822-832.
27.
Ronnov-Jessen, L., Petersen, O.W., Koteliansky, V.E.,Bissell, M.J. (1995)
The origin of the myofibroblasts in breast cancer. Recapitulation of tumor
environment in culture unravels diversity and implicates converted
fibroblasts and recruited smooth muscle cells. J Clin Invest, 95 (2), 859873.
28.
Ishii, G., Sangai, T., Oda, T., Aoyagi, Y., Hasebe, T., Kanomata, N. ve
diğerleri. (2003) Bone-marrow-derived myofibroblasts contribute to the
cancer-induced stromal reaction. Biochem Biophys Res Commun, 309 (1),
232-240.
54
29.
Goldmann, E. (1908) The Growth of Malignant Disease in Man and the
Lower Animals, with special reference to the Vascular System. Proc R Soc
Med. 1 (Surg Seet), 1-13.
30.
Folkman, J. (2003) Fundamental concepts of the angiogenic process. Curr
Mol Med' 3 (7), 643-651.
31.
Bergers,G,Benjamin
L.E.(2003)Tumorogenesis
and
the
angiogenic
switch.Nat Rev Cancer,3(6),401-410
32.
Skobe,M,Rockwell,P,Goldestein,N,Vosseler,S,Fusenig,N.E.(1997).Halting
angiogenesis supresses carcinoma cell invasion.Nat Med,3(11)1122-1227
33.
Ehrlich,P.(1908).Über den jetzigen Stand der Karzinomforschung.
34.
Naito,Y,Saito,K.,Shiiba,K.,Ohuchi,A.,Saigenji,K.,Nagura,H.
ve
diğerleri.(1998)CD8+ T cells infiltrated with,n cancer cell nests as a
prognostic factor in human colorectal cancer.Cancer Res,58(16)3491-3494
35.
Kim,R.,Emi,M.,Tanabe,K.(2007)Cancer
immunoediting
from
immün
surveillance to immün escape.Immunology,121(1),1-14.
36.
Pham,S.M.,Kornos,R.L.,Landreneau,R.J.,Kawai,A.,Gonzalez-Cancel,
Hardesty,
R.L.
ve
diğerleri.
(1995)Solid
tumors
after
I.,
heart
transplantation;lethality of lung cancer.Ann Thorac Surg,60(6),1623-1626.
37.
Shankaran, V., Ikeda, H., Bruce, A. T., White, J. M., Swanson, P.E., Old,
I.J. ve diğerleri. (2001) IFN (gamma) and lymphocytes prevent primary
tumour
development
and
shape
tumour
immunogenicity.
Nature,410(6832),1107-1111.
38.
Dunn, G.P., Old, I, J., Schreiber, R. D. (2004) The immunobiology of
cancer immunosurveillance and immunoediting.Immunity, 21(2)137-148.
39.
Pollard, J.W.(2008)Macrophages define the invasive microenvironment in
breast cancer. J Leukoc Biol,84(3),623-630.
55
40.
Fridlender, Z. G., Sun, J., Kim, S., Kapoor, V., Cheng, G., Ling ve
diğerleri. (2009) Polarization of tumor-associated neutrophil phenotype by
TGF-beta ,Cancer Cell,16(3),183-194.
41.
Gabrilovich, D. I., Corak, J., Ciemik, I. F., Kavanaugh, D., Carbone, D. P.
(1997). Decreased antigen presentation by dentritic cells in patients with
breast cancer.Clin Cancer Res,3(3),483-490.
42.
Yang, L., Debusk, L. M., Fukuda, K., Fingleton, B., Gren-Jarvis, B., Shyr,
Y. ve diğerleri. (2004). Expantion of myeloid immune supressor
Gr+CD11b+
cells in tumor-bearing host directly promotes tumor
angiogenesis.Cancer Cell,6(4),409-421.
43.
Holda,J.H.,Maier,T.,Claman,H.N.(1985)Murine graft-versus-host-disease
across minor barriers:immunosupressive aspects of natural supressor
cells.Immunol Rev.88,87-105.
44.
Young,M.R.,Newby,M.,Wepsic,H.T.(1987)Hematopoesis and supressor
bone marrow cells in mice bearing large metastatic Lewis lung carcinoma
tumors.Cancer res,47(1),100-105.
45.
Angulo,I.,Rodriguez,R.,Garcia,B.,Medina,M.,Navarro,J.,Subiza,J.L.(1995)
.Involvement of nitric oxide in bone marrow-derived natual suppressor
activity.Its dependence on IFN-gamma.J ımmunol,155(1),15-26.
46.
Young,M.R.,Wright,M.A.,Pandit,R.(1997)Myeloiddiferantiation treatment
to diminish the presence of immune-suppressive CD34+ cells within
human head and neck squamous cell carcinomas.J Immunol,159(2),990996.
47.
Jaffe, M. L., Arai, H., Nabel, G. J. (1996). Mechanisms of tumor-induced
immunosuppression: evidence for contact-dependent T cell suppression by
monocytes.Mol Med,2(6),692-701.
56
48.
Gabrilovich,D.I.,Velders,M.P.,Sotomayor,E.M.,Kast,W.M.(2001).Mechani
sm of immune dysfunction in cancer mediated by immature Gr-1+ myeloid
cells.J Immunol,166(9),5398-5406.
49.
Gabrilovich, D. I., Bronte, V., Chen, S. H., Colombo, M. P., Ochoa, A.,
Ostrand-Rosenberg, S.ve diğerleri.(2007)The terminology issue for
myeloid-derived suppressor cells.Cancer Res,67(1),425.
50.
Kan,J.,Ko,E.C.,Einstein,S.,Sikora,A.G.,Fu,S.,Chen,S.H.(2011).Targeting
immune suppressing myeloid-derived suppressor cells in oncology.Crit
Rev Oncol Hematol,77(1),12-19.
51.
Youn,J.I.,Gabrilovich,D.I.(2010)The
biology
of
myeloid-derived
suppressor cells:the blessing and the curse of morphological and functional
heterogeneity.Ew J Immunol,40(11),2969-2975.
52.
Johansson,M.,D.G.Denardo,and
responses
differantially
L.M.Coessens,Polarized
regulate
cancer
immune
development.Immunol
Rev,2008.222:p. 145-54
53.
Weaver,C.T.,ve ark.,Th17:an effector CD4 T cell lineage with regulatory
T cell ties.Immunity,2006.24(6):p . 677-88
54.
Dunn ,G.P.,ve ark.,A critical function for type I interferons in cancer
immunoediting.Nat Immunol,2005.6(7):p. 722-9
55.
Disis, M. L., Immune regulation of cancer .J Clin Oncol, 2010. 28 (29):p.
4531-8.
56.
Aspord,C. ve ark., Breast cancer instructs dendritic cells to prime
interleukin 13-secreting CD4+ T cells that facilitate tumor development. J
Exp Med, 2007.204 (5):p.1037-47.
57.
Hanahan, D.and L. M. Coussens, Accessories to the crime:functions of
cells recruited to the tumor microenvironment.Cancer cell, 2012. 21 (3):p.
309-22.
57
58.
DeNardo,D.G.,ve ark.,CD4+ T cells regulate pulmonary metastasis of
mammary
carcinomas
by
enhancing
protumor
properties
of
macrophages.Cancer Cell,2009.16(2):p.91-102.
59.
Curotto de Lafaille, M.A.and J.J.Lafaille ,Natural and adaptive
foxp3+regulatory T cells:more of the same or a division of
labor?Immunity,2009.30(5):p.626-35.
60.
Betelli,E.,ve ark.,Reciprocal developmental pathways fort he generation of
pathogenic
effector
TH17
and
regulatory
T
cells.Nature,2006.441(7090):p.235-8.
61.
Kryczek, I. ve ark., Phenotype,distribution,generation,and functional and
clinical relevance of Th17 cells in the human tumor environments. Blood,
2009. 114 (6): p. 1141-9.
62.
Schwartz, J. C. ve ark., Structural mechanism of costimulation.Nat
Immunol, 2002.3 (5):p.427-34.
63.
Ergüven S. Dalağın enfeksiyon ve bağışıklıktaki rolü. Türk Hij Den Biyol
Derg 1984; 1: 311-4.
64.
Girgin S. Gedik E., Baç B, Taçyıldız Hİ. Benign hematolojik hastalıklarda
splenektomi sonuçlarımız. Akademik Acil Tıp Derg 2008; 7: 42-5.
65.
Akçay MN, Polat KY, Yıldırgan MI ve ark. Splenektoi sonrası gelişen
enfeksiyonlar. Ulus Travma Acil Cerrahi Derg 1995; 1: 67-70.
66.
Arda B, Demirağ K, Işıkgöz Taşbakan M, Yamazhan T, Serter D.
Splenektomiden 46 yıl sonra sepsis gelişen bir olgu nedeni ile splenektomi
sonrası sepsis: Korunma ve öneriler. AKEM Derg 2004; 18: 180-3.
67.
Özkören Çalık Ş, Pullukçu H, Işıkgöz Taşbakan M ve ark. Splenektomili
hastaların pnömokok aşısı ile bağışıklanma oranları ve diğer aşılar
konusundaki bildüzeyleri. İnfeksiyon Derg 2007; 21: 71-4.
58
68.
Constantoulakis M, Trichopoulos D, avgoustaki O, Economidou J. Serum
immunoglobülin concentrations before and after splenectomy in patients
with homozygous beta-thalassemia. J Clin Pathol 1978; 31: 546-50.
69.
Tovo PA, Miniero R, Barbera C, Sacchetti L, Saitta M. Serum
immunoglobulins in homozygous beta-thalasemia. Acta Haematol 1981;
65: 21-5.
70.
Grady RW, Akbar AN, Giardina PJ, Hilgartner MW, de Sousa M.
Disproportionate lymphoid cell subsets in thalassaema major: the relative
contributions of transfusion and splenectomy. Br J Haematol 1985;59:
713-24.
71 . M.Y. Lee and C. Rosse, Depletion of Lymphocyte Subpopulations in
primary and secondary Lymphoid organs of mice by a Transplated
Granulocytosisİncluding Mammary Carcioma, Cancer research , vol 42, no.4 ,1982 , pp.
1255-1260.