KANSER TANISINDA YENİLİKLER Hande Canpınar Hacettepe Üniversitesi Kanser Enstitüsü Temel Onkoloji Anabilim Dalı KANSER Hücredeki genetik ve epigenetik değişimlerin birikimi sonucunda malign transformasyon ile oluşur Kontrolsuz büyüme İnvazyon Metastaz Kanser Kanser hastalarında tümör hücrelerinin erken tanınması prognozu ve yaşam süresini etkiler Kanser hücrelerinin tanımlanması ve denetim yöntemler; -USG -Mamografi -Magnetic resonance imaging (MR) -Bilgisayarlı tomografi -Positron Emission Tomography (PET) Kanser Tanısında Kullanılan Laboratuvar Yöntemleri 1. Sitolojik ve Patolojik Yöntemler 2. İmmünhistokimyasal İnceleme 3. Tümör Markerlerin İncelenmesi 4. Flow Cytometry 5. Moleküler Yöntemler - PCR - Mikroarray - Mutasyon Analizleri - Gen Ekspresyon Analizleri - Fluorescence In Situ Hybridization (Fish) Technique - Kanserin Moleküler Sınıflandırılması - Doku Arrayleri 6. Mikroakışkan Teknolojisi Dolaşımda bulunan tümör hücrelerin (CTCs)tanımlanması 1. SİTOKİMYASAL VE PATOLOJİK İNCELEME 2. İMMÜNHİSTOKİMYASAL BOYAMA Lenf nodu CD20+ B hücreleri -Sitokeratin -Lökosit common antigen -S-100 -HMB-45 -Desmin, Vimentin -ER,PR,Her-2 Cyclin D1, 3. TÜMÖR BELİRLEYİCİERİ Tümör dokusu tarafından yapılan ve kana karışan ve kan veya diğer vücut sıvılarında seviyeleri/varlığı bakılabilen biyokimyasal göstergeler TÜMÖR BELİRLEYİCİLERİ Enzim –PSA - prostate specific antigen (serine protease) NSE (neurospecific isoenzyme of enolase) LDH (lactat dehydrogenase) Hormon GH, prolactin, calcitonin, parathormon (PTH), gastrin, hCG Immünoglobulinler – IgG, IgM, IgA, IgD, IgE, 2-microglobulin Glikoproteinler, glikolipidler AFP, hCG, SCC,CA 19-9, CA 125 , CA 15-3 C, CEA Serolojik ve İmmünolojik Yöntemler ile Tümör Markerlarının Belirlenmesi -Enzim Assay -ELISA -RIA Eritrosit Lenfosit Fitoplankton Bakteri Nötrofil Blastosit Monosit FLOW CYTOMETRY (AKIM SİTOMETRİ) Hücrelerin büyüklük ve granülaritesine bağlı olarak tek hücre düzeyinde analizini sağlayan teknoloji FLOWCYTOMETRY FACS (Flourescence-Activating Cell Sorter) Onkoloji’de Akım Sitometri -Kısa sürede hızlı ve güvenilir sonuç -Kolay kullanım -Anormal hücrelerin tanınmasına yardımcı -Tümör hücrelerinin biyolojisi hakkında bilgi Onkolojide Kullanım Alanları -Lösemi ve lenfomaların immünfenotiplendirilmesi -Hücre siklusu ve DNA içeriğinin analizi -Hücre canlılığının tesbiti, Apoptozisinin araştırılması -Çoklu İlaç Direncinin tesbiti -Hücre sinyal iletiminindeki proteinlerin belirlenmesi -Tümör belirleyicilerin tesbiti -Tümör hücrelerinin saf olarak ayırt edilmesinde FLOW CYTOMETRY Nature Immunology 11;11 2010 Çok Renkli Analiz Tek hücre düzeyinde birden fazla monoklonal antikor kullanımı • Hücre büyüklüğü ve granülaritesi • CD antijenleri • Sitokin reseptörleri • Adezyon molekülleri • Hücre siklusu, G0, G1, S, G2 İMMÜNFENOTİPİK ANALİZ Hücrelerin yüzeylerinde taşıdıkları antijenlere karşı spesifik moAb kullanılarak tanımlaması -Anormal,malign potansiyeli olan hücrelerin normalden ayrılması -Anormal hücrelerdeki antijen prolifilinin belirlenmesi Hematolojik malignansilerin laboratuvar tanısında; -Tanı -Prognostik sınıflama -Tedavinin etkinliğinin değerlendirilmesi Flow Sitometri yöntemiyle İMMÜNFENOTİPİK ANALİZ Akut Lösemide Kullanılan Temel Monoklonal Antikorlar Hücre Serisi Matürasyon Belirleyicisi Diğer Belirleyicler B-Hücre cCD79a cCD22 CD19 T-Hücre cCD3 CD3 CD7 Myeloid Hücre cMPO CD13 CD33 CD34 TdT CD34 TdT CD34, CD117 CD15,CD11a,b HLA-DR CD10 CD1, CD2 CD20, CD22 CD3, CD5 cIgM, Kappa/Lambda CD4, CD8 CD14 CD68,CD41 CD61, CD235a Flowchart diagram of the EuroFlow strategy immunophenotypic characterization of hematological malignancies for Leukemia (2012) 26, 1908–1975 Leukemia (2012) 26, 1908–1975 Pre B ALL Leukemia (2012) 26, 1908–1975 BLASTİK VE NORMAL HÜCRE POPULASYONUNUN AYRILMASI Leukemia (2012) 26, 1908–1975 KANSER: HÜCRE NORMAL İLETİŞİMİNİN BOZULMASI Kolon Retinoblastoma,Kemik, Mesane, Akciğer, Meme Çeşitli Kanserler Genler mRNA Sarkomlar Lösemi, Beyin Meme Mide Akciğer Lösemi Nöronal Tümörler DEĞİŞEN MOLEKÜLLERİN TAYİNİ Protein Gen mRNA MOLEKÜLER TESTLER A Hasta Örneği Patoloji Proteinler B Proteomiks Mass Spektrometri Proteomiks Görüntü Genomiks Hasta Örneği DNA Gen chip Mikroarray Görüntü MİKROARRAY =Biochip =DNA chip =DNA microarray =Gene array Fizyolojik veya patolojik süreçlerde gen ekspresyon paternlerindeki değişimi izlemek için kullanılırlar Bir array, nükleik asit örneklerinin düzgün bir şekilde sıralanması ile oluşur Bilinen ve bilinmeyen DNA örneklerinin baz eşleşmesi özelliğine göre hibridizasyonu için uygun bir ortam sağlayarak bilinmeyen DNA’ ların tanımlanabilmesi MİKROARRAY -Cam yüzeyler üzerine DNA dizisi bilinen problar dizilir -Array üzerinde bulunan binlerce DNA dizisi üzerine cDNA’lar uygulanır - cDNA komplementerini bulduğu noktada hibridize olur ve florasan sayesinde bu nokta görünür MİKROARRAY Meme Kanserinde Mikroarray Meme Kanserinde Mikroarray MOLEKÜLER TANININ FAYDALARI Tümör hücrelerinin gen profilinin tanımlanması Yeni tedavi protokollerinin oluşturulmasında bilgi sağlaması Tedavinin etkinliğinin değerlendirilmesinde Metastatik kanserler nedeniyle kanserden ölüm %90 Yeni hassas metodların geliştirilmesi ile büyük metastatik odakların, primer tümörden farklı olarak gelişen tümör heterojenitesinin tesbiti mümkün olmaktadır Circulating Tumor Cells(CTCs) Tümör dokusundan dökülen hücreler Periferik dolaşıma giren hücreler Uzak organlara yerleşerek METASTAZ Circulating Tumor Cells (CTCs) Circulating Tumor Cells (CTCs) CTCs ve Metastaz Süreci The Journal of Molecular Diagnostics, 15;2, March 2013 - Primer tümörden günde 1x106 hücre periferik kana geçer çok azı yaşar - % 0.01 CTC dolaşımda bulunur - 5 litre total kan volümu içinde <200 CTC/ml Periferik Kandan CTL’s İzolasyon ve Karakterizasyon Yöntemleri Dansite Yoğunluğuna göre CTC’lerin İzolasyonu CTC’lerin Antikor Esaslı Magnetik İzolsyonu The Journal of Molecular Diagnostics, 15;2, March 2013 Am J Cancer Res 2011;1(6):740-751 Am J Cancer Res 2011;1(6):740-751 Monoklonal Antikorlar ile Hücrelerin Tanımlanması CellSearch Sistem ile CTC’lerin tanımlanması Cytockeratin-PE pozitif DAPI pozitif ve CD45 negatif Methods 50 (2010) 289–297 7.5 ml periferik kanda < 5 CTC varlığında PFS,OS 7.5 ml periferik kanda < 3 CTC varlığında PFS,OS Novel Biyomarker CTC Clin Chem Lab Med 2011;49(10): TRENDS in Molecular Medicine CTC’lerin Belirlenmesinin Avantajları 1. Solid tümörlerin metastazlarının tanımlanmasında, tümörün heterojenitesinin belirlenmesinde ve uyku halindeki tümörlerin belirlenmesinde “liquid biopsy” olarak kullanılabilecek bir biyolojik belirteç 2. CTC’lerin belirlenmesi hastalığın gösterebilecek bir araç prognozunu 3. Tedavi etkinliğinin değerlendirilmesinde 4. Metastatik tümörleri hedefleyecek yeni ilaçların kullanımı ile hastalıksız sağ kalım süresinin uzatılması 5. Kişiye özel tedavi protokollerinin kullanılması