Bolum 7 MON810 misir, Bt-176 misir ve Roundup Ready® Soyanin

Gıda Örneklerinde
Genetiği Değiştirilmiş Organizma Analizleri
Bölüm 7
MON810 mısır, Bt-176 mısır ve Roundup Ready®
Soyanın Özellikleri
M.Querci, M.Mazzara
WORLD HEALTH ORGANIZATION
REGIONAL OFFICE FOR EUROPE
WELTGESUNDHEITSORGANISATION
REGIONALBÜRO FÜR EUROPA
ORGANISATION MONDIALE DE LA SANTE
BUREAU REGIONAL DE L'EUROPE
ВСЕМИРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ ЗДРАВООХРАНЕНИЯ
ЕВРОПЕЙСКОЕ РЕГИОНАЛЬНОЕ БЮРО
MON810 Mısır, Bt-176 Mısır ve Roundup Ready® Soyanın Özellikleri
2
İçindekiler
Bölüm 7
MON810 Mısır, Bt-176 Mısır ve Roundup Ready® Soyanın Özellikleri
Roundup Ready ® Soyanın Özellikleri
3 MON810 Mısırın Özellikleri
7 Bt-176 Mısırın Özellikleri
11 Kaynaklar
16 Gıda Örneklerinde Genetiği Değiştirilmiş Organizma Analizleri
Bölüm 7
MON810 Mısır, Bt-176 Mısır ve Roundup Ready® Soyanın Özellikleri
Roundup Ready ® Soyanın Özellikleri
3
1
Kısa Tanımlama
İsim
GTS 40-3-2
Başvuran
Monsanto Canada Şirketi
Bitki Türü
Glycine max L. (Soya Fasülyesi)
Yeni Özellikler
Roundup ready® herbisitinin aktif içeriği Glufosat
toleransı
Genetik Modifikasyon Metodu
Partikül bombardımanı (biyolistik)
Önerilen Kullanım
Hayvan besini (çoğunlukla yağdan arındırılmış olarak
sıkıştırılmış gevrek ve yemek) ve insan tüketimi
(çoğunlukla yağ, protein ve diyet liflerinde) için soya
üretimi
Temel Bilgi
Soya hattı GTS 40-3-2 Monsanto Canada Şti. tarafından soya üretiminde zararlı
bitkilerle mücadelede alternatif bir sistem olarak glufosatın kullanımına olanak
sağlamak
için
geliştirilmiştir.
GTS
40-3-2
nin
geliştirilmesi,
Agrobacterium
tumefaciens suşu CP4’den izole edilen glufosat dirençli 5-enolpurivil-şikimat-3-fosfat
sentaz (EPSPS) enzimini kodlayan genin, ticari soya çeşidi (Asgrow Tohum Şirketi)
A5403’e aktarılması yolu ile olmuştur.
Yeni Karakterin Tanımı
Glufosat toleransı
Roundup®’ın aktif molekülü olan Glufosat, sistemik, seçici olmayan zararlı ot kontrol
maddesi olarak dünya çapında kullanılan bir herbisittir. Glufosat 5-enolpurivil-şikimat3-fosfat sentaz (EPSPS) enziminin kompetitif inhibitörü olarak görev yapar. EPSPS
fenilalanin, tirosin ve triptofan aromatik aminoasitlerinin üretiminde yer alan şikimat
biyokimyasal yolunda zorunlu bir enzimdir (Şekil 1). EPSPS’in engellenmesi
büyümenin durdurulması ve bitki ölümüne yol açar.
Aktarılan Glufosat tolerans geni bu enzimin bakteri kökenli (Agrobacterium
tumefaciens CP4 suşundan) versiyonudur. Bitki, mantar ve mikroorganizmalarda
1
Kanada Besin Teftiş Ajansı, Karar DD95-05’den alınmıştır.
Gıda Örneklerinde Genetiği Değiştirilmiş Organizma Analizleri
Bölüm 7
MON810 Mısır, Bt-176 Mısır ve Roundup Ready® Soyanın Özellikleri
4
bulunan bu enzim glufosata yüksek derecede dirençlidir. Bu nedenle inhibisyona
uğramaz ve bitkinin aromatik amino asit metabolik ihtiyaçlarını karşılayabilir.
Fosfoenolpiruvat
+
Eritroz-4-fosfat
Şikimat-3-fosfat
Fosfoenolpiruvat (PEP)
Glifosat (Roundup®)
N-(fosfonometil) glisin
5-enolpiruvil-şikimat-3-fosfat (EPSP)
Fenilalanin
Tirosin
Triptofan
Şekil 1. EPSPS enzimi şikimat-3-fosfat ve fosfoenolpiruvat (PEP) arasındaki
reaksiyonu katalize eder. 5-enolpiruvil-şikimat-3-fosfat (EPSP) ile fosfat bu
reaksiyonun ürünleridir. EPSP, aromatik aminoasit sentezinde gerekli bir ara
moleküldür. Bu biyokimyasal yolun glufosat tarafından engellenmesi, protein
sentezini engelleyerek bitki ölümüne yol açar. EPSPS, glufosatın bitkideki tek hedef
enzimidir ve PEP kullanan diğer enzimler glufosattan etkilenmezler
EPSPS geni kuvvetli bir konstitütif promotör olan karnıbahar mozaik virüsü (PCaMVE35S) ve A. tumefaciens kaynaklı nopalin sentaz terminatörü (T-nos) ile
kontrol edilmektedir (Şekil 2). Bitki kökenli, kloroplast transit peptidi (Petunia
hibrida’dan CTP4) kodlayan DNA sekansı glufosat tolerans geninin 5’ ucuna
klonlanmıştır. EPSPS genine birleştirilen sinyal peptidi yeni sentezlenen enzimin
şikimat yolunun bulunduğu ve glufosatın etkisini gösterdiği kloroplastlara geçişini
Gıda Örneklerinde Genetiği Değiştirilmiş Organizma Analizleri
Bölüm 7
MON810 Mısır, Bt-176 Mısır ve Roundup Ready® Soyanın Özellikleri
5
sağlar. Geçiş gerçekleştikten sonra, transit peptidi özel bir proteaz ile enzimden
ayrılır ve hızlı bir şekilde parçalanır.
EPSPS sentaz doğada yaygın olarak bulunur ve toksik ve allerjik olması beklenmez.
Toksik ve allerjik polipeptidlerin sekans databazlarında karşılaştırma analizleri
yapıldığında bilinen herhangi bir toksin yada allerjenin aminoasit sekansı ile önemli
bir homoloji göstermemiştir.
P-E35S
CTP4
CP4 EPSPS
T-nos
Şekil 2. Roundup Ready® soya gen kasetinin şematik gösterimi (Padgette ve ark.
1995’ten uyarlamam).
Geliştirme Metodu
Ticari soya çeşidi A5403 (Asgrow Tohum Şirketi) altın partikül bombardıman yoluyla,
E.coli’ den elde edilen plasmid vektörü PV-GMGT04 ile transforme edilmiştir (bakınız
Şekil 3). PV-GMGT04, glufosat toleransı kodlayan CP4 EPSPS genini, seçici markör
olarak β-glukoronidaz üretimi için gus genini, ve antibiyotik direnci için nptII genini
(kanamisin direnci) içermektedir. Seçilen ilk transformantta biri gus seçici markörü,
diğeri glufosat tolerans geni ile olmak üzere iki integrasyon bölgesi görülmüştür. Bu
iki bölge, izleyen eşeyli üreme jenerasyonlarında bağımsız olarak ayrışmış ve
analizler sonucu, hat GTS 40-3-2’de sadece glufosat tolerans geninı içeren tekil bir
bir integrasyon bölgesi bulunduğu görülmüştür.
Bitki Genomuna Sabit İntegrasyon
İlk verilere göre (Padgette ve ark. 1995, 1996) GTS 40-3-2, nos poliadenilasyon
sinyali, CP4 EPSPS sekansı, kloroplast sinyal peptidi ve CaMV 35S promötörü
içeren CP4 EPSPS gen kasetinin tek bir fonksiyonel kopyasını içermektedir. Orjinal
plasmid vektörden bitkiye bu füsyon gen dışında başka bir kodlama bölgesinden
geçiş
bulunmamıştır.
İzleyen
nesillerde
bu
birleşik
genin
ayrışması
gözlenmediğinden, GTS 40-3-2 hattının birleşik gen için homozigot olduğu kabul
Gıda Örneklerinde Genetiği Değiştirilmiş Organizma Analizleri
Bölüm 7
MON810 Mısır, Bt-176 Mısır ve Roundup Ready® Soyanın Özellikleri
6
edilmiştir.6 nesil boyunca yapılan DNA analizleri, gen entegrasyonunun sabit
kaldığını göstermiştir.
Güncel karakterizasyon çalışmaları, DNA entegrasyonu sırasında farklı düzenlemeler
meydana geldiğini göstermiştir. Roundup Ready® soya 40-3-2, işlevsel olan birincil
gen entegrasyonu bölgesi haricinde 250 bp ve 72 bp’lik iki küçük, fonksiyonel
olmayan DNA dizisi daha içermektedir (Mansanto 2000, Windels ve ark. 2001).
Şekil 3. Roundup Ready® soya vaka 40-3-2 geliştirmek için kullanılan PV-GMGT04
plazmid (Monsanto, 2000)
Düzenleme Kararı
Roundup Ready® (RR) soya şu anda Avrupa Birliğinde pazara sunum için onaylanan
tek transgenik soya hattıdır. 1994’de ABD’de onay almasından sonra Avrupa Birliğine
ithaline 96/281/EC Komisyon kararı ile 3 Nisan 1996’da onay verilmiştir. Bu karar
yanlızca tohumun Avrupa Birliğine ithaline, kısmi olarak soya içeren besin, hayvan
gıdası gibi canlı olmayan ürünlerin endüstriyel işlenmesi amacı ile üretimi için izin
verir.
Gıda Örneklerinde Genetiği Değiştirilmiş Organizma Analizleri
Bölüm 7
MON810 Mısır, Bt-176 Mısır ve Roundup Ready® Soyanın Özellikleri
7
MON810 Mısırın Özellikleri 2
Kısa Tanımlama
İsim
Vaka MON810 mısır (ticari ismi Yieldgard®)
Başvuran
Monsanto Canada Şirketi
Bitki Türü
Zea mays L. (mısır)
Yeni Özellikler
Avrupa Mısır kurduna direnç (Ostrinia nubilalis)
Genetik Modifikasyon Metodu
Partikül bombardımanı (biyolistik)
Önerilen Kullanım
İnsan tüketimi için Z. mays üretimi (tohum yağı ve yaş
veya kuru öğütme) ve çiftlik hayvanları besini olarak
Temel Bilgi
Mısır MON810 (YieldGard®) Avrupa Mısır kurduna (ECB, Ostrinia nubilalis) dirençli
olarak Monsanto Canada Şirketi tarafından geliştirilmiştir. Geleneksel pestisitler
kullanılmadan ECB’nin larval dönemlerinde sebep olduğu ürün kayıplarını önlemek
için bir yöntem sağlamıştır.
MON810 bitki hücrelerine mikroprojektil bombardıman ve rekombinant DNA
teknolojisi yolu ile, doğada bulunan insektisidal (böcek öldürücü) proteini (Bacillus
thuringiensis ssp. Kurstaki’den) kodlayan genin aktarılması ile geliştirilmiştir. Bu
protein ECB’nin de dahil olduğu kelebek ve güveleri içeren bazı Lepidoptera türlerine
karşı aktiftir. MON810’da ifade edilen insektisidal protein CRYIA(b) δ-endotoksinin
kısaltılmış bir gen versiyonu ile ifade edilir ve mısır bitkilerini ECB larvaları tarafından
verilen yaprak ve bitki sapı zararından korur.
Yeni Karakterin Tanımı
Avrupa Mısır kurduna direnç
Bacillus thuringiensis ssp. Kurstaki endospor oluşturan, gram pozitif, toprakta
yaşayan bir bakteridir. Sporogenik döneminde endospora ek olarak Avrupa mısır
kurdu (ECB), Ladin tomurcuk kurdu, Çingene güvesi, Diamondback güvesi, Tütün
tomurcuk kurdu, Lahana kurdu gibi bazı lepidoptera böceklere karşı, aralarında aktif
2
Kanada Besin Teftiş Ajansı, Karar 97-19’dan alınmıştır.
Gıda Örneklerinde Genetiği Değiştirilmiş Organizma Analizleri
Bölüm 7
MON810 Mısır, Bt-176 Mısır ve Roundup Ready® Soyanın Özellikleri
8
CRYIA(b) δ-endotoksin aktif proteini de olmak üzere bir çok insektisidal protein
kristali üretmektedir.
Bu proteinin insanlara, diğer omurgalılara ve yararlı böceklere toksik olmadığı
defalarca gösterilmiştir (Lee ve ark. 1995). MON810, konstitütif CaMV 35S promotörü
ve HSP70 intron lider sekansının kontrolünde olan tek kopya cryIA(b) geninin
aktarılması yoluyla geliştirilmiştir (Şekil 4).
Bacillus thuringiensis ssp.HD-1’den alınan cryIA(b) genini kodlayan sekans,
CRYIA(b) δ-endotoksin proteinin bitkilerde ifadesini en iyi şekilde arttırmak için
modifiye edilmiştir. Protein kırılma sonrası tripsin dirençli bio-aktif bir moleküle
dönüşür ve lepidopteran larvalarına toksik hale gelir. İnsektisidal aktivitenin, bu aktif
proteinin hassas böceklerin orta bağırsak epitel hücrelerindeki özel alıcılara
tutunmasına bağlı olduğu düşünülmektedir. Bunu izleyen gözenek oluşumu ozmotik
dengeyi bozarak hücrenin patlamasına yol açar. Bu proteine hassas olan mısırın
lepidoptera zararlıları ECB ve mısır kulakkurdu’dur.
Değiştirilmiş mısırda ifade edilen toksinin aminoasit sekansının doğada bulunan
proteinle aynı ve organik besin endüstrisi tarafından biopestisit olarak yaygın biçimde
kullanılan protein ile eşdeğer olduğu tespit edilmiştir.
P-E35S
hsp70
cryIA(b)
T-nos
Şekil 4. MON810 mısırda kullanılan PV-ZMBK07 plasmidinde yer alan cryIA(b) gen
kasetinin ve hsp70 intron 1’in şematik gösterimi (BATS, 2003).
P-E35S: geliştirilmiş CaMV 35S promotör
hsp70: mısır hsp70 intron 1 sekansı
sentetik cry1A(b)geni
T-nos terminasyon sekansı
Gıda Örneklerinde Genetiği Değiştirilmiş Organizma Analizleri
Bölüm 7
MON810 Mısır, Bt-176 Mısır ve Roundup Ready® Soyanın Özellikleri
9
Geliştirme Metodu
MON810 PV-ZMBK07 ve PV-ZMGT10 plazmidlerinin biyolistik yöntemi ile birlikte
mısır genotipi Hi-II’ye aktarılması ile elde edilmiştir. PV-ZMBK07 plazmidi cryIA(b)
genini (Şekil 5) PV-ZMGT10 plazmidi ise CP4 EPSPS ve gox genlerini taşımaktadır.
Her iki plazmid de E. coli’de replikasyon için gerekli olan pUC plasmidi replikasyon
orijin sekansını(ori-pUC) ve bakteri promotör kontrolu altında nptII genini (bakteri
seçimi için) taşımaktadır. Her iki vektör de bitki kültürü hücrelerine mikroprojektil
bombardımanı ile aktarılmıştır. Aktarılan hücrelerden Glufosat dirençli olanlar
seçilmiş ve bitki rejenerasyonu için gerekli doku kültürü ortamlarına alınmıştır
(Amstrong ve ark. 1991)
Yazarlar
tarafından
sağlanan
moleküler
analizlerde,
sadece
PV-ZMBK07
plazmidindeki genetik elementlerin MON810 genomuna tek bir kopya olarak yerleştiği
görülmüştür. Geliştirilmiş CaMV 35S promotörü, hsp70 ön sekansı ve kısaltılmış
cryIA(b) gen sekansları tam iken, gen kasedinin 3’ ucunun kopması sebebi ile PVZMBK07’de bulunan nos 3’ terminasyon sinyalinin kaybolduğu, bu nedenle alıcı
genomuna yerleşmediği tespit edilmiştir (BATS 2003).
Şekil 5. MON810 mısırda kullanılan PV-ZMBK07 plasmidinin şematik gösterimi
(Agbios Database, Essential Biosafety)
Gıda Örneklerinde Genetiği Değiştirilmiş Organizma Analizleri
Bölüm 7
MON810 Mısır, Bt-176 Mısır ve Roundup Ready® Soyanın Özellikleri
10
Bitki Genomuna Sabit İntegrasyon
Yazarlar tarafından sağlanan veriler, segregasyon ve stabilitenin, cryIA(b) geninin
MON810 genomuna tek bir bölgeden entegre olmuş olması ile uyum gösterdiğini
ortaya koymaktadır. Entegrasyon stabilitesi birçok nesil boyunca çaprazlama ile
gösterilmiştir.
Bu
mısır
hattı
farklı
mısır
genotipleri
ile
4
nesil
boyunca
çaprazlandığında ECB’ye karşı direnç devam etmiştir. MON810 hattı üçüncü
nesilden geri çaprazlama yolu ile elde edilmiştir. Üç nesil boyunca bu tekli
yerleşmenin sabit integrasyonu Southern Blot analizleri ile gösterilmiştir.
Düzenleme Kararı
Mısır hattı MON810’un Birleşik Devletlerde ekilmesi Temmuz 1996’da Çevre Koruma
Ajansı tarafından onaylanmıştır. Bu mısır hattının Avrupa Birliğinde ticarileşmesi 22
Nisan 1998 tarih 98/294/EC nolu Komisyon kararı ile teyit edilmiştir
(Komisyon
Kararı 98/294/EC).
Kanada Besin Teftiş Ajansı, bu mısır hattının besin ve yem olarak onayını Karar
Dokümanı 97-101 ile yayınlamıştır. MON810 hattı Arjantin, Avustralya, Japonya,
Güney Afrika ve İsviçre’de onaylanmıştır. Bu mısır hattı insan tüketimi için (yaş ve
kuru öğütme ve tohum yağı) ve çiftlik hayvanlarının yemi olarak tasarlanmıştır.
Gıda Örneklerinde Genetiği Değiştirilmiş Organizma Analizleri
Bölüm 7
MON810 Mısır, Bt-176 Mısır ve Roundup Ready® Soyanın Özellikleri
11
Bt-176 Mısırın Özellikleri 3
Kısa Tanımlama
İsim
Vaka 176 Bt mısır
Başvuran
Ciba-Geigy Ciba Tohumculuk ve Mycogen Şirketi
Bitki Türü
Zea mays L. (mısır)
Yeni Özellikler
Avrupa mısır kurduna direnç (Ostrinia nubilalis),
glufosinat amonyum herbisitine tolerans
Genetik Modifikasyon Metodu
Olgunlaşmamış embryolarda partikül bombardımanı
(biyolistik)
Önerilen Kullanım
Hibrid tane mısır olarak tarım (yetiştirme)
Temel Bilgi
Ciba Tohumculuk ve Mycogen Anonim Şirketi Avrupa Mısır kurduna (ECB) dirençli
bir mısır hattı geliştirmişlerdir. Vaka Bt-176 olarak tanımlanan bu mısır hattı,
embriyolara mikroprojektil bombardıman ve rekombinant DNA teknolojisi yolu ile
doğada bulunan, insektisidal bir proteini (Bacillus thuringiensis ssp. Kurstaki’den)
kodlayan genin aktarılması ile geliştirilmiştir. Bu protein Lepidoptera takımına ait,
ECB’nin de dahil olduğu bazı kelebek ve güve türlerine karşı aktiftir. Bu protein
doğadaki CRYIA(b) δ-endotoksinin en sekansı kısaltılmış bir versiyonudur şeklidir ve
mısır bitkilerini ECB larvaları tarafından verilen zararlardan korur. Buna ek olarak bu
hat mısıra, genetik olarak değişikliğe uğratılmış bitkileri
çok erken gelişme
dönemlerinde seçip ayrıştırabilmek için herbisit glufosinat amonyum herbisitine
direnç sağlayan bir başka gen de aktarılmıştır.
Yeni Karakterlerin Tanımlanması
Avrupa mısır kurduna (ECB) direnç
Bacillus thuringiensis ssp. Kurstaki endospor oluşturan, gram pozitif, toprakta
yaşayan bir bakteridir. Sporogenik döneminde endospora ek olarak Avrupa mısır
kurdu (ECB), Ladin tomurcuk kurdu, Çingene güvesi, Diamondback güvesi, Tütün
tomurcuk kurdu, Lahana kurdu gibi bazı lepidoptera böceklere karşı, aralarında aktif
3
Kanada Besin Teftiş Ajansı, Karar 96-09’dan alınmıştır.
Gıda Örneklerinde Genetiği Değiştirilmiş Organizma Analizleri
Bölüm 7
MON810 Mısır, Bt-176 Mısır ve Roundup Ready® Soyanın Özellikleri
12
CRYIA(b) δ-endotoksin aktif proteini de olmak üzere bir çok insektisidal protein
kristali üretmektedir.
Bu proteinin insanlara, diğer omurgalılara ve yararlı böceklere toksik olmadığı
defalarca gösterilmiştir (Lee ve ark. 1995).
Bacillus thuringiensis ssp. Kurstaki HD-1 suşundan alınan sentetıik cryIA(b) geni,
CRYIA(b) δ-endotoksin proteinin daha kısa bir versiyonunu kodlar. Bu gen mısırdaki
ifadesini arttırmak için sentetik olarak geliştirilmiştir ve nükleotid dizini düzeyinde
doğal genle %65’lik bir homoloji göstermektedir (Koziel ve ark. 1993). Kısaltılmış
cryIA(b) geni doğal CRYIA(b) proteinin insektisidal aktivite gösteren bölgesini
içermektedir. İnsektisidal aktivitenin, bu aktif proteinin hassas böceklerin orta
bağırsak
epitel
hücrelerindeki
özel
alıcılara
tutunmasına
bağlı
olduğu
düşünülmektedir. Bunu izleyen gözenek oluşumu ozmotik dengeyi bozarak hücrenin
patlamasına ve böceğin ölümüne yol açar
Vaka Bt-176 iki ayrı sentetik cryIA(b) gen konstrüksiyonu taşıyan bir vektörün
transformasyonu ile elde edilmiştir. Konstrüksiyonların birinde cryIA(b) geni mısır
fosfoenolpiruvat-karboksilaz
(P-PEPC)
promotörünün
transkripsiyonel
kontrolü
altındadır ve sadece yeşil dokularda ifade edilir. İkinci konstrüksiyonda aynı gen mısır
kalsiyuma bağlı protein kinaz promotörü (P-CDPK) kontrolü altındadır ve özellikle
polende ifade edilir. Her iki konstrüksiyonda da gen kaseti Karnıbahar Mozaik Virüs
kökenli terminatör ile durdurulur. Gen kasetleri ayrıca mısır fosfoenolpiruvatkarboksilaz geninin intron 9 parçasını içermektedir (bakınız Şekil 6 ve Şekil 7).
CRYIA(b) proteinin yeşil dokularda ifadesi ilk nesil yapraklar üzerinde beslenen ECB
larvalarına karşı direnç kazandırmak için tasarlanmıştır. Polendeki ifade ise polen
üzerinde beslenen ikinci nesil ECB larvalarını hedef alarak tasarlanmıştır. Bt-176
yapraklarından elde edilen CRYIA(b) proteini, memeli mide koşulları taklit edilerek in
vitro sindirim denemelerine maruz bırakılmış ve geleneksel besin proteinleri gibi
parçalandığı gösterilmiştir.
P-CDPK
cryIA(b)
T-35S
PEPC Intr # 9
Şekil 6. CDPK promotör kontrolü altında sentetik cryIA(b) gen kaseti şematik
gösterimi (Matsuoka ve ark., 2000).
Gıda Örneklerinde Genetiği Değiştirilmiş Organizma Analizleri
Bölüm 7
MON810 Mısır, Bt-176 Mısır ve Roundup Ready® Soyanın Özellikleri
13
PEPC Intr # 9
T-35S
cryIA(b)
P-PEPC
Şekil 7. PEPC promotör kontrolü altında sentetik cryIA(b) gen kaseti şematik
gösterimi (Matsuoka ve ark., 2000).
Glufosinat amonyum herbist toleransı
Glufosinat amonyum tolerans geni (bar geni) toprak bakterisi Streptomyces
hygroscopicus’dan elde edilmiştir. Bu gen CaMV35S konstitütif promotörünün
transkripsiyonel kontrolü altında fosfinotrisin asetiltransferaz (PAT) enzimini kodlar
ve polen dışında bütün bitki dokularında aktiftir. Fosfinotrisin, glutamin sentetaz
inhibitörüdür ve glufosinat amonyum’un aktif içeriğidir. Fosfinotrisinin herbisidal
aktivitesi glutamin sentetaz enziöiminin inhibe edilmesi ile bitkide öldürücü
miktarlarda amonyum akümülasyonu ile sonuçlanır. PAT fosfinotrisin asetilasyonunu
katalize eder ve herbisidal aktivitesini ortadan kaldırır.
Fosfinotrisin’in L-izomeri (L-PPT) yaygın olarak yabani ot kontrolünde kullanılır. LPPT glufosinat amonyumun herbisitinin aktif maddesidir. Hoechst tarafından
geliştirilmiştir ve BASTA ticari ismi ile anılır. Bu izomer glutamin sentetazın substratı
olan glutamatın yapısal analoğudur (L-PPT ve glutamatın karşılaştırılması için
bakınız Şekil 8).
Şekil 8. L-PPT (sol) ve glutamatın (sağ) karşılaştırılması
Gıda Örneklerinde Genetiği Değiştirilmiş Organizma Analizleri
Bölüm 7
MON810 Mısır, Bt-176 Mısır ve Roundup Ready® Soyanın Özellikleri
14
L-PPT ilk olarak Streptomyces viridochromogenes’den izole edilmiştir. Bu organzima
yanlızca fosfinotrisin L-izomerini sentezler. Sentetik glufosinat amonyum PPT’nin Dve L- izomerlerinin eşit mollarda rasemik bir karışımıdır (D-PPT herbisidal aktivite
göstermez). PAT enzimi fosfinotrisin üzerinde etki gösterir,piruvat, kolin ve serin
içeren diğer yaygın asetiltransferaz substratları üzerinde etkisi gözlenmemiştir.
Memeli mide koşullarının taklit edildiği, E.coli tarafından ifade edilen PAT enzimi
varlığında gerçekleştirilen in vitro sindirim çalışmalarında bu proteinin geleneksel
besin proteini gibi sindirildiği görülmüştür.
Glufosinat amonyum tolerans geni, bitki ıslahı sırasında transfer edilen
genlerin
izlenebilmesi ve transforme olan embryoların seçici ortamda tanımlanabilmesi için
markör olarak bitkiye aktarılmıştır. Rapor edilen (FSANZ 2000), moleküler veriler, BT176 vakasının karnıbahar mozaik virüsü 35S promotörü ve 35S terminatörü (sırasıyla
P-CaMV-35S ve T-35S) kontrolünde tek kopya bar geni taşıdığını işaret
etmektedir(bakınız şekil 9).
P-35S
bar T-35S
Şekil 9. bar genine ait şematik gösterim (Matsuoka ve ark., 2000)
Geliştirilme Metodu
Bt-176 vakası iki plazmidin biyolistik transformasyon yolu ile kendilenmiş mısır hattı
CG00526 (Zea mays L.) ‘ya aktarılması sonucu elde edilmiştir. İki sentetik cryIA(b)
geni tek bir plazmide (pCIB4431) birlikte klonlanmıştır. Aktarılan ikinci plazmid
vektörü (pCIB3064), toprak bakterisi Streptomyces hygroscopicus’dan izole edilen
herbisit tolerans geni (bar) taşımaktadır. İki vektör, mısır hattı CG00526’ın
olgunlaşmamış embriyolarına partikül bombardıman yoluyla aktarılmıştır. Gen
aktarılan bitkilerde yapılan moleküler analizler bu mısır vakasının genomuna her
plazmid vektörün iki ya da daha fazla kopyasının yerleştiğini göstermiştir. Testler ve
Northern Blot analizleri, bakteri geriplanında vektörleri seçmek amavı ile aktarılmış
olan bakteri promotörü tarafından kontrol edilen ampisilin direnç geninin (bla geni)
Gıda Örneklerinde Genetiği Değiştirilmiş Organizma Analizleri
Bölüm 7
MON810 Mısır, Bt-176 Mısır ve Roundup Ready® Soyanın Özellikleri
15
yaprak dokusu ya da polende ifade edilmediğini göstermektedir. İki bağımsız
transgenik mısır bitkisi daha sonraki çaprazlama ve karakterizasyon için seçilmiştir:
Vaka 171 ve Vaka 176 (Koziel ve ark. 1993).
Buna ek olarak yapılan karakterizasyon çalışmaları Bt-176 mısırda cry1A(b) (Koziel
ve ark 1993), bar ve bla genleri (Privalle 1994) bulunduğunu ispatlamıştır. Yeni
Zelanda gıda standartları (FSANZ 2000) tarafından rapor edilen verilere göre Bt-176
mısır DNA Southern Blot analizleri ile görüldüğü üzere, bu vakada 6 kopyaya kadar
cry1A(b)
ve bla geni ve en az iki kopya bar geni (35S promotörü ile birlikte)
bulunabilir (Privalle 1994).
Karakterlerin Yerleşmesindeki Sabitlik
Rapor edildiği üzere (FSANZ 2000), serada büyüyen bitkilerin polen ve yeşil
yapraklarında CRY1A(b) ve PAT protein üretimi 4 başarılı geri çaprazlama nesli
boyunca sabit kalmıştır. Segregasyon analizleri ECB’ye direnç ve herbisit toleransı
özelliklerinin Mendel karakterleri gibi ko-segrege olduğunu göstermiştir. 3240 bitki
üzerinde yapılan bir çalışmada yalnızca 5 bitki (%0,15) glufosinat amonyuma dirençli
fakat ECB larvalarının zararlarına karşın hassas bulunmuştur.
Düzenleme Kararları
Ağustos 1995’de, ABD Çevre Koruma Birimi 2000 yılına kadar Vaka 176’dan gelen
tarla mısırının ticarileştirilmesini koşullu olarak onaylamıştır.
Bu mısır hattının Avrupa Birliğinde ticarileşmesi için gerekli komisyon kararı
(97/98/EC) 23 Ocak 1997’de yasallaşmıştır. Bu mısır hattı ziraai, endüstriyel
işlemlerde tohum olarak ve hayvan besini olarak üretimi ve tohum üretimi amacıyla
ekilmek üzere tasarlanmıştır (Komisyon Kararı 97/98/EC).
Gıda Örneklerinde Genetiği Değiştirilmiş Organizma Analizleri
Bölüm 7
MON810 Mısır, Bt-176 Mısır ve Roundup Ready® Soyanın Özellikleri
16
Kaynaklar
Agbios database on Essential Biosafety. Molecular Characterization of MON810
inserted DNA. http://www.agbios.com/main.php (accessed January 2010)
Armstrong, C.L., Green, C.E. and Phillips, R.L. (1991). Development and avaibility of
germplasm with high type II culture formation response. Maize Genetics
Cooperation Newsletter 65, 92-95.
BATS (2003). Genetically Modified (GM) Crops: molecular and regulatory details.
http://www.bats.ch/gmo-watch/index.php (accessed January 2010)
Canadian Food Inspection Agency, Plant Products Directorate. Plant Biosafety
Office. Decision Document DD96-09: Determination of Environmental Safety of
Event 176 Bt Corn (Zea mays L.) Developed by Ciba Seeds and Mycogen
Corporation.
http://www.inspection.gc.ca/english/plaveg/bio/dd/dd9609e.shtml
(accessed January 2010)
Canadian Food Inspection Agency, Plant Products Directorate. Plant Biosafety
Office. Decision Document DD95-05: Determination of Environmental Safety of
Monsanto Canada Inc.s Glyphosate Tolerant Soybean (Glycine max. L.) Line
GTS
40-3-2.
http://www.inspection.gc.ca/english/plaveg/bio/dd/dd9505e.shtml
(accessed January 2010)
Canadian Food Inspection Agency, Plant Products Directorate. Plant Biosafety.
Decision Document 97-19: Determination of the safety of Monsanto Canada
Inc.’s
Yieldgard
TM
Insect
Resistant
Corn
(Zea
mays
http://www.inspection.gc.ca/english/plaveg/bio/dd/dd9719e.shtml
L.)
MON810.
(accessed
January 2010)
Commision Decision 97/98/EC of 23 January 1997 concerning the placing on the
market of genetically modified maize (Zea mays L.) with the combined
modification for insecticidal properties conferred by the t-endotoxin gene and
increased tolerance to the herbicide glufosinate ammonium, pursuant to Council
Directive 90/220/EEC.(OJ L 31,1.2.1997, p.69)
Gıda Örneklerinde Genetiği Değiştirilmiş Organizma Analizleri
Bölüm 7
MON810 Mısır, Bt-176 Mısır ve Roundup Ready® Soyanın Özellikleri
17
Commision Decision 96/281/EC of 3 April 1996 concerning the placing on the market
of genetically modified soyabeans (Glycine max L.) with increased tolerance to
the herbicide glyphosate, pursuant to Council Directive 90/220/EEC. (OJ L 107,
30.4.1996), p. 10)
Commision Decision 96/294/EC of 22 April 1998 concerning the placing on the
market of genetically modified maize (Zea ays L. line MON810) pursuant to
Council Directive 90/220/EEC. (OJ L 131, 5.5.1998, p. 33).
Foods Standarts Australia New Zealand-FSANZ (formerly Australia New Zeland
Food Authority-ANZFA) (2000). Draft risk analysis report. Food produced from
insect-protected
Bt-176
corn.
Application
385,
http://www.foodstandards.gov.au/_srcfiles/A385%20FA.pdf (accessed January
2010)
Koziel, M. G.et al. (1993). Field performance of elite transgenic maize plants
expressing
an
insecticidal
protein
derived
from
Bacillus
thrungiensis
BIO/Technology 11, 194-200.
Lee, T.C., Zeng, J., Bailey, M., Sims, S.R., Sanders, P.R. and Fuchs, R.L. (1995).
Assessment of equivalence of insect protected corn- and E-coli –produced B.t.k.
HD-1 protein. Plant Physiol. Suppl. 108, 151.
Matsuoka, T., Kawashima, Y., Akiyama, H., Miura, H., Goda, Y., Kusakabe, Y.,
Isshiki, K., Toyota, M. and Hino. A. (2000). A method of detecting Recombinant
DNAs from four lines of genetically modified maize. Journal of Food Hygienic
Society of Japan 41, 137-143
Monsanto Company (2000). Updated Molecular Characterization and safety
Assessment of Roundup Ready Soybean Event 40-3-2. Monsanto Report,
Product Safety Centre.
Padgette, S.R., Kolacz, K.H., Delannay, X., Re, D.B., LaVallee, B.J., Tinius, C.N.,
Rhodes, W.K., Otero, Y.I., Barry, G.F., Eicholtz, D.A., Perchke, V.M., Nida,D.L.,
Taylor, N.B. and Kishore, G.M. (1995). Development, identification and
characterization of a glyphosate-tolerant soyabean line. Crop Science 35, 14511461
Gıda Örneklerinde Genetiği Değiştirilmiş Organizma Analizleri
Bölüm 7
MON810 Mısır, Bt-176 Mısır ve Roundup Ready® Soyanın Özellikleri
18
Padgette, S.R., Re, D.B., Barry, G.F., Eicholtz, D.A., Delannay, X., Fuchs, R.L.,
Kishore, G.M and Fraley, R.T. (1996). New weed control opportunities:
Development of soybeans with Roundup Ready gene. In Duke, S.O. (ed.).
Herbicide-Resistant Crops. Agricultural, Economic, Regulatory and Technical
Aspects. CRC Lewis Publishers., pp 53-84.
Privalle L. (1994). Quantification of Cry1A(b) and PAT proteins in Bt corn (corn)
tissues, whole plants and silage. Performing laboratory: Ciba Seeds Agricultural
Biotechnology Research Unit, Ciba-Geigy Corporation, research Triangle Park.
NC, USA. Study No CAB-009-94.
Windels, P., Taverniers, I., Depicker, A., Van Bockstaele, E. and De Loose, M.
(200!). Characterization of the Roundup Ready soybean insert. European Food
Research Technology 213, 107-112.
Gıda Örneklerinde Genetiği Değiştirilmiş Organizma Analizleri
Bölüm 7