klinik mikrobiyolojide son yıllarda yeni neler var

KLİNİK MİKROBİYOLOJİDE SON
YILLARDA YENİ NELER VAR
Mikroflora
Dirençli bakteriler
Yeni teknolojiler
Dr Uğur Çiftçi
Düzen Laboratuvarlar Grubu
Workshop 2011
Bağırsak Flora Bakterileri
Bağırsak Mikroflorası
• Mikroflora = Flora = Mikrobiota
• Bağırsak mikroflorası insan ve hayvanların
ince ve kalın bağırsaklarında (sindirim
kanalında) yaşayan mikroorganizmaların
tümüne verilen isimdir.
• Microbiome
Bağırsak Mikroflorası
• İnsan – Bağırsak mikroflorası ilişkisi
Kommensal ilişki???
Simbiyotik ilişki!!!
Unutulan Organ
Bağırsak mikroflorasını teşkil eden
bakteriler tarafından meydana getirilen
metabolik aktiviteler çoklu fonksiyon gören
bir organın işlevini görmektedir ve bilim
adamları yakın bir süre önce unutulan bu
organı! hatırlamışlardır.
Niçin Bağırsak Mikroflorasına İlgi
Başladı
• Fekal materyalden ekstrakte edilen bakteriyel nükleik
asitlerdeki 16 S Ribozomal RNA (rRNA) genlerinin
sekansı ile bakterilerin idantifikasyon ve sınıflandırılması
kolaylaşmıştır.
• Metagenomik yaklaşımlarla bağırsak bakterilerinin
idantifikasyonu ve yoğunluğu belirlenmiş ve daha önce
bilinmeyen ekosistemlerin yapısı ortaya çıkartılmıştır.
İnceleme Yöntemleri
Moleküler fingerprint
Ekolojik istatistik yaklaşımlar
Gnotobiotik farelerde yapılan çalışmalar
Bağırsak Mikroflorasının Rolü
•
•
•
•
•
•
•
Bağırsak gelişimi ve fonksiyonunda
Immun modülasyonda
Gastrointestinal hareketde
İlaç metabolizmasında
Gıda toksinlerinin parçalanmasında
Karsinojenlerin parçalanmasında
Mikronutrientlerin sentezlenmesinde
Bağırsak Mikroflorasının Rolü
• Hazmolmayan gıda maddelerinin
fermantasyonunda
• Bazı elektrolitlerin ve eser minerallerin
absorbsiyonunda
• Enterosit ve kolonisitlerin çoğalmasında
• Bağırsak lumenine patojen bakterilerin
kolonizasyonunu önlemede
rol aldığı görülmüştür.
Bağırsak mikroflorasının obezitede rolü
John K. Dibaise ve and. Mayo Clinic Proceedings 2008 83 460-469
Bağırsak mikroflorasının obezitenin ve insülin
direncinin gelişimindeki rolü
Coni PD ve ark. Pathol Biol 2008 56:305-309
Obesite tedavisinde bağırsak mikroflorası
Tsukumo DM ve ark. Arg.Bras.Endocrinol. Metabol. 2009 53:139-144
IBS (Irritable Bowel Syndrome) patogenezinde
bağırsak mikroflorası)
Lee BJ, Bal YT J. Neurogastroenterology 2011 17:252-66
IBD (Inflamatory Bowel Disease) etiyolojisinde
bağırsak mikroflorasının rolü?
Hugat J.P Best Proct. Res. Clin. Gastroenterol. 2008 18:451-62
Bağırsak Mikroflorası
• Yakın zamana değin sağlık üzerindeki rolü
küçümsenmiştir.
• Yaşamsal öneme sahiptir. Sağlıklılık halini
güçlendiren özelliklere sahiptir
• Sağlık üzerine henüz netleşmemiş bir çok rolü
olduğu tahmin edilmektedir. Ve konu üzerinde
daha bir çok araştırmaya gereksinim olduğu
düşünülmektedir.
İlaca Dirençli Bakteriler
• Şayet önlem alınmazsa, Dünya, antibiyotik
sonrası çağa doğru gitmektedir, birçok
harcıalem enfeksiyon artık tedavi
edilemeyecek ve halen antibiyotiklerle
tedavi edilebilen enfeksiyon hastalıkları bir
kez daha ölümcül hale gelecektir.
Dr. M. Chan
DSÖ Genel Müdürü
DSÖ Dirençle İlgili Son Durum
Raporundan
• Geçen yıl Dünya genelinde 440.000 MDR
tüberküloz belirlendi ve en az 150.000 i
ölümle sonuçlandı.
• Sıtma paraziti en yeni kuşak ilaçlara bile
direnç kazanmaktadır.
• Gonore ve dizanteriden sorumlu dirençli
suşlar, tedavi alternatiflerini giderek
sınırlandırmaktadır.
DSÖ Dirençle İlgili Son Durum
Raporundan
• Hastane kökenli ciddi enfeksiyonların
büyük bir kısmından MRSA gibi dirençli
bakteriler sorumlu olmaktadır.
• İlaca dirençli suşlar uluslar arası yayılım
göstermektedir.
• Hastaneler yüksek dirençli patojenlerin
yuvası haline gelmiştir.
• MRSA (Metisilin Dirençli Staphylococcus
aureus)
• VRE (Vankomisin Dirençli Enterokoklar)
• C. difficile (Clostridium difficile)
• CRKP (Karbapenem Dirençli Klebsiella
pneumoniae)
• MDR TB/XDR TB (Çoklu İlaca Dirençli TB,
Yaygın İlaca Dirençli TB)
• Bakteriyel direnç
-Yapısal (intrinsic)
- Sonradan kazanılmış direnç (acquired)
Kromozomal
Plazmide bağlı
Bakteriyel direncin plazmid ile transferi
MRSA kaynağı?
• HA – MRSA
• CA – MRSA
NDM-1 KP
NDM-1 New Delhi metallo-betalactamase -1
PCM (Plasmid encoding Carbapenem resistant
Metallobetalactamase)
Çoklu İlaca Dirençli TB
MDR-TB (Multi Drug Resistant Tuberculosis)
X DR-TB (Extensively Drug Resistant
Tuberculosis)
İlaç Dirençli TB halk sağlığını tehdit eden
global bir sorun haline gelmiştir.
İlaca Duyarlı TB, Nasıl İlaca Dirençli
Hale Geliyor?
İlaca duyarlı TB hastalarının
uygunsuz / yetersiz ilaç kullanımı
MDR / XDR TB için Ne Yapılabilir?
• Erken teşhis için laboratuvarların güçlendirilmesi
• Hasta odaklı etkin tedavi
• Bulaşmayı önleyici politikalar
Laboratuvarın Rolü Ne Olabilir?
• Referans laboratuvarlar ağı içinde kalitesine güvenilen ilaç duyarlılık
testlerinin ve diğer laboratuvar proseslerinin kullanılması
• Hızlı laboratuvar sonucu
Hızlı ve etkin tedavi
Sağlıklı toplum
Laboratuvar Testleri
Klasik Yöntemler
• ARB
• Geleneksel yöntemlerle
kültür/idantifikasyon/duyarlılık testi
• Otomatize sistemlerle kültür/idantifikasyon/duyarlılık
testi
Doğrudan materyalden
MTB-DNA tayini
Cobas Taqman MTB
PCR
NAA
TB İlaç Direnç Genleri
Belirlenmesi
• Real time nükleik ait amplifikasyonu teknolojisi ve
reverse hibridizasyon ile direnç genlerinin belirlenmesi
yoluyla doğrudan TB direncinin gösterilmesi
• X pert MTB/RIF Otomatize nükleik asit amplikasyonu ile
eş zamanlı TB idantifikasyonu ve Rifampisin
duyarlılığının belirlenmesi
KLİNİK MİKROBİYOLOJİDE YENİ
TEKNOLOJİLER
Geleneksel Kültür- Antibiyogramda
• Kültür ve idantifikasyon süresi uzun
olduğundan klinisyenler tedavilerini klinik
semptomlara göre başlıyor (non-spesifik
tedavi)
• Geniş spektrumlu ilaçlar kullanılıyor
• Laboratuvar bulgusuna dayalı tedavi
ancak 3-5 gün sonra başlayabiliyor
Geleneksel Uygulama Sonuçları
•
•
•
•
Tedavi süresi uzuyor
Dirençli suşlar çoğalıyor
Mortalite artıyor
Parasal kayıplar artıyor
Niçin Hızlı İdantifikasyon
• Etkili antibiyotiklerin hızla uygulanmasını sağlıyor
• Hedefe yönelik antibiyotik kullanımı ile etkin tedavi
yapılabiliyor
• Mortalite azalıyor
• Hastanede kalış süresi kısalıyor
• Dirençli suşların ortaya çıkması azalıyor.
Hızlı İdantifikasyon Sağlayan
Moleküler Metotlar
• PNA-FISH (Peptide Nucleic Acid
Fluorencent in situ hybridization)
• Real-time PCR
Hızlı İdantifikasyon Sağlayan
Moleküler Metotlar
• Avantajları
Hızlı sonuç
Laboratuvar iş akışına kolay adaptasyon
• Dezavantajları
Gram boyaya ihtiyaç göstermesi
Test edilen mikroorganizma menüsünün sınırlı
olması
Geleneksel kültür-antibiyogram testlerinin
paralel yürütülmesi zorunluluğu
MS (Mass spectrometry) Teknolojisi
• PCR/ESI-MS (PCR ile kombine
electrospray ionizasyon-mass
spectrometry)
• MALDI-TOF MS (Matrix-assisted laser
desorption ionisation-time of flight mass
spectrometry)
PCR / ESI-MS
• Bakteri veya mantarların genomlarında
multipleks PCR ile hedef bölgeleri çoğaltır.
• Ampliconların mass/charge oranını ölçer
• Veri tabanındaki bilenen mikroorganizma
kompozisyonuna göre idantifiye eder.
• Genetik idantifikasyon suşun tipini ve
antimikrobik direnç genlerini belirleyebilir.
• Bu nedenle idantifikasyon yanında
epidemiyolojik sürveyans ve enfeksiyon
kontrolünde de kullanılabilir.
MALDİ-TOF MS
• Protein biomarkerlarını mass spectrometry ile
ölçer (Ribosomal, chaperone, transcription /
translation factor proteinleri)
• Bakteri, mantar, mikobakterileri tür düzeyinde
idantifiye eder.
• Doğrudan koloninin veya bakteriyel ekstresinin
doğrudan ionizasyonu ile protein profilleri elde
edilir. İdantifikasyon referans suşlardan elde
edilen veri tabanı ile karşılaştırılarak yapılır.
• Mikroorganizma gruplarına göre ayrı işlem
gerekmez.
MALDİ TOF MS PEAKS
MALDİ-TOF MS
•
•
•
•
Doğru idantifikasyon yeteneği yüksek
Sarf malzemelerinin bedeli düşük
Hızlı sonuç
İdantifiye edilecek mikroorganizma ile ilgili
ön bilgi gerekmiyor
• Prefraksinasyon aşaması gerekmiyor.
• 2-20 kDa arasındaki bütün m/z değerini
ölçer
Mikrobiyoloji Pratiği
Renal tüberküloz düşünülen bir hasta var hekim
idrarda tbc tetkiki yaptırmak istiyor.
a)
b)
c)
d)
e)
Teksifle ARB
Tbc PCR
Tbc kültürü LJ
Tbc kültürü Bactec / MGIT
İdrar mikroskobisi
En uygun tek yanıt verecek olursanız
hangisini önerir siniz?
Renal tüberküloz düşünülen bir hasta var hekim
otomatize sistemle tbc kültürü yaptırmak istiyor
örnek olarak aşağıdakilerden hangisini önerir
siniz?
a)
b)
c)
d)
e)
Spot idrar (herhangi bir saatte)
24 saatlik toplanmış idrar
Orta idrar
Sabah ilk idrarın tamamı
Ön idrar
Hekim hastadan Quantiferon gold testi istedi
test pozitif çıktı bu test bize ne bilgi verir?
a)
b)
c)
d)
Hastada aktif tbc enfeksiyonu vardır.
Hastada latent tbc enfeksiyonu vardır.
Hasta tbc’ye karşı bağışıktır.
Hastada aktif/latent tbc enfeksiyonu vardır
bu testle ayırt edilemez.
e) Hastada tbc hastalığı vardır
Quantiferon gold (gama interferon) testi için kan
hangi tüpe/tüplere alınır?
a)
b)
c)
d)
e)
Düz kan tüpü
EDTA’lı kan tüpü
Heparinli kan tüpü
Sitratlı kan tüpü
TB antijenleri içeren tüp
Resimde görülen Balgam örneğinden hazırlanan
Ziehl-Nelson boyalı preparatı nasıl rapor eder siniz?
a)
b)
c)
d)
e)
Aside dirençli basil görüldü.
Tüberküloz basili görüldü.
Gram negatif basil görüldü.
Bakteri görülmedi artefaktlar görüldü.
Difteroid basil görüldü
Hastada çalışılan EBV serolojik test profilinde
aşağıdaki sonuçlar elde edilmiştir
•
•
•
•
VCA IgG
VCA IgM
EA
EBNA
: Pozitif
: Negatif
: Negatif
: Pozitif
a)
b)
c)
d)
e)
Primer enfeksiyondur
Geçirilmiş enfeksiyondur
EBV enfeksiyonu yok
Belirsiz sonuç
Reaktivasyondur
Hastada çalışılan EBV serolojik test profili
•
•
•
•
VCA IgG
VCA IgM
EA
EBNA
: Pozitif
: Pozitif
: Negatif
: Negatif
a) Primer enfeksiyondur
b) Geçirilmiş
enfeksiyondur
c) EBV enfeksiyonu yok
d) Belirsiz
e) Reaktivasyondur
Bir çocuk hastada EBV profili çalışılmış
•
•
•
•
VCA IgM: Pozitif
VCA IgG : Pozitif
EA-D IgG : Pozitif
EBNA IgG : Pozitif
bulunmuştur.
a) Erken dönem primer
enfeksiyon
b) Geç dönem /
geçirilmiş enfeksiyon
c) Reaktivasyon
d) Belirsiz sonuçtur
Yetişkin bir hastada yapılan serolojik testde
Toksoplazma IgM : Pozitif
Toksoplazma IgG : Negatif
Bir ay sonra testler tekrarlanmış aynı sonuç bulunmuştur.
a)
b)
c)
d)
e)
Yeni başlayan (akut dönemde) bir toksoplazma enfeksiyonu
ile uyumludur.
Geçirilmiş bir toksoplazma enfeksiyonu ile uyumludur.
Sub akut dönemde bir toksoplazma enfeksiyonu ile
uyumludur.
Toksoplazma ile enfekte olmamıştır.
Reaktive olmuş toksoplazma enfeksiyonu ile uyumludur.
Yetişkin bir hastada yapılan serolojik testde
Toksoplazma IgM : Pozitif
Toksoplazma IgG : Pozitif
Altı ay ve bir yıl sonra testler tekrarlanmış aynı sonuçlar
bulunmuştur.
a)
b)
c)
d)
e)
Yeni başlayan (akut dönemde) bir toksoplazma enfeksiyonu
ile uyumludur.
Geçirilmiş bir toksoplazma enfeksiyonu ile uyumludur.
Sub akut dönemde bir toksoplazma enfeksiyonu ile
uyumludur.
Toksoplazma ile enfekte olmamıştır.
Reaktive olmuş toksoplazma enfeksiyonu ile uyumludur.
1 aylık gebe kadından yapılan serolojik testde
Rubella IgM
: Pozitif
Rubella IgG
: Pozitif
Rubella IgG Avidite Testi : Düşük avidite
a)
b)
c)
d)
e)
Yeni başlayan (akut dönemde) bir rubella enfeksiyonu
ile uyumludur.
Geçirilmiş bir rubella enfeksiyonu ile uyumludur.
Sub akut dönemde bir rubella enfeksiyonu ile
uyumludur.
Rubella ile enfekte olmamıştır.
Reaktive olmuş rubella enfeksiyonu ile uyumludur.
Resimdeki yapıya dışkı örneğinde incelemede rastlanmıştır.
a)
b)
c)
d)
Kancalı kurt larvası
Strongiloides larvası
Pseodoparazit
Ascaris
Resimdeki yapı dışkıda görülmüştür,
boyutu 25 μm dir.
a) Entamoeba histolytica
kisti
b) Entamoeba hartmani
kisti
c) Entamoeba coli kisti
d) Endolimax nana kisti
Erişkin Ascaris lumbricoidesler vücutta hangi
bölgede bulunur?
a)
b)
c)
d)
e)
Akciğer
Karaciğer
İnce bağırsak
Kalın bağırsak
Mide
İdrar kültür örneğinin hemen ekimi
yapılamıyorsa
a) Oda ısısında 8 saate kadar bekletilebilir
b) Dondurarak 48 saat bekletilebilir
c) +4 °C (buzdolabında) 24 saat kadar
bekletilebilir
d) 37 °C etüvde 8 saate kadar bekletilebilir.
e) Bekletilemez
Akut idrar yolu enfeksiyonlarında etken olarak
en sık rastlanan mikroorganizma
a) Escherchia coli
b) Klebsiella pneumoniae
c) Proteus mirabilis
d) Staphylococcus
saprophyticus
e)Streptococcus pyogenes
Yetişkinlerde bakteriyel menenjit etkeni olarak
en sık rastlanan bakteri
a) Streptococcus
pneumoniae
b) Neisseria meningitidis
c) Haemophilus influenza
d) Escherichia coli
e) Klebsiella
pneumonia
Endokarditlerle ilişkili olarak en sık rastlanan
mikroorganizma
a)
b)
c)
d)
Viruslar
Neisseria
Stafilokoklar
Streptokoklar
e) Riketsiyalar
Aşağıdakilerden hangisi bağırsağın normal flora
bakterileri arasında değildir?
a)
b)
c)
d)
Shigella
Clostridium
Peptostreptococcus
Laktobasil
e) Bifidobacterium
Bakteri kökenleri (suşları) en iyi hangi ısı
derecesinde muhafaza edilebilir?
a)
b)
c)
d)
e)
37 °C
Oda sıcaklığı
+ 4 °C
- 20 °C
- 70 °C
A grubu Streptokokların tip ayırımında hangisi
kullanılır?
a)
b)
c)
d)
e)
ASO (anti streptolizin O)
Bacitracin diski
T antijen
M antijen
C karbohidratı
Beta hemolitik Streptokoklarda A Grubu
ayırımı için
a)
b)
c)
d)
e)
Gram boya yapılır
Koagulaz testi yapılır
PYR testi yapılır
Beta hemolizin kuvvetli olmasına bakılır
Bacitracin duyarlılığına bakılır
(Birden fazla doğru yanıt olabilir)
Basitracin duyarlılığı aşağıdakilerden
hangisi için kullanılır.
a) Stafilokokların mikrokoklardan ayrılmasında
b) Streptokokların Stafilokoklardan
ayrılmasında
c) Neisseriaların muhtemel teşhisinde
d) Hemophilus’ların muhtemel teşhisinde
e) Pnomokokların muhtemel teşhisinde
Aşağıdakilerden hangisi sifiliz için doğrulama
testidir.
a) TPHA (Treponema pallidum hemaglütinasyon
testi)
b) VDRL
c) RPR
d) Kolmer
e) CRP
Sifiliz tedavisinin takibinde kullanılır.
a)
b)
c)
d)
e)
VDRL titresi
TPHA titresi
FTA-Abs titresi
CRP
Abbott architect syphilis assay