sFETAL DNA - Türkiye Maternal Fetal Tıp ve Perinatoloji Derneği

İstanbul Üniversitesi Fetal Nükleik Asit
Araştırma Grubu Sonuçları
Türkiye
Maternal Fetal Tıp ve Perinatoloji Derneği
VIII.Kongresi
11-14 Ekim 2012 , İstanbul
sFETAL DNA
Lo ve ark. 1997 yılında anne plazma
ve serumunda erkek fetusa ait
DNA’yı saptadığını yayınladı.
Lo YM ve ark. Lancet 350 , 485 , 1997
GEN DNA molekülü üzerinde protein kodlayan
özgül bir nukleotid dizisidir.
GENOM
DNA
TRANSKRİPTOM
RNA
(mRNA , rRNA , tRNA , miRNA , siRNA , snoRNA )
PROTEOM
Hastalıklar genetik koddaki hata veya kodun proteine
çevrilmesi sırasında oluşan düzensizlikler nedeniyle olabilir.
.Spektral analiz
. Elektroforetik analiz
Genomik
DNA
. PCR
.Real-time PCR
. Dijital PCR
. Southern Blot Analiz
Yöntemler
Anlatım
Miktar
Dizi
.Q-PCR
. Array-CGH
. Dizileme
. Kopya sayısı değişiklikleri
Transkriptomik
RNA
.Elektroforetik Analiz
. cDNA ile PCR
.cDNA ile Dijital PCR
.Northen Blot Analiz
.Dizileme
. Mikroarray ile gen anlatımı
.Western Blot Analiz
Proteomik
Protein
.Poliakrilamid jel
elektroforezi
.Kromotografik yöntemler
analizi esasına
dayanmaktadır.
sFETAL DNA
RT-PCR
Dijital PCR
QF-PCR
Cinsiyet
Karşılaştırmalı
Genomik
Hibridizasyon
(Array CGH)
Tek gen hastalıkları
RhD
Kromozom sayısı
Kromozom yapısı
Tüm genom
mikrodizin
(microarray)
Preeklampsi
IUGG
MPSS
(Masif paralel
rastgele dizileme)
Fetal Fizyoloji
Fetal Gelişim
İstanbul Üniversitesi Fetal Nükleik Asit
Araştırma Grubu
İstanbul Tıp Fakültesi Kadın Hastalıkları ve Doğum ABD
Prof.Dr. Hayri Ermiş
Dr. İbrahim Kalelioğlu
Cerrahpaşa Tıp Fakültesi Kadın Hastalıkları ve Doğum ABD
Prof.Dr.Kılıç Aydınlı
Prof.Dr.Semih Kaleli
Doç.Dr.Ali Benian
Dr. Görkem Yosun Zeybek
Dr. Hayrettin Şahin
İÜ Fen Fakültesi Moleküler Biyoloji ve Genetik Bölümü
Y.Doç.Dr. Tuba Günel
Mohammad Hosseini (Doktora öğr)
Ece Gümüşoğlu
Didem Altındirek
sFETAL DNA
Cinsiyet Tayini
Kuşkulu Genitalia
KAH
X – Kromozomu
geçişli hastalıklar
Maternal kanda cinsiyet tayini yapılan
5.-10. GH arasındaki 24 olgunun analiz sonuçları
İ.Ü. Fetal Nükleik Asit Çalışma Grubu
Marker gen olarak Y kromozomu üzerinde
bulunan DYS14 geni kullanıldı
5.GH 10 olgu
6.GH 7 olgu
7.GH 3 olgu
9.GH 3 olgu
10.GH 1 olgu
RT-PCR ile 15 erkek (pozitif ) 9 kız ( negatif ) sonuç elde edildi ve bütün
sonuçlar doğumdan sonra doğrulandı ( % 100 )
sFETAL DNA
RhD Tayini
Rh sisteminin antijenleri 1. kromozom’da
taşınan bir çift paralog gen
(RHD-RHCE) tarafından kodlanır.
RHD
D+
D-
RHCE
RHD
veya
RHCE
Maternal kanda RHD geni açısından analiz edilen
11.-15. GH arasındaki immunize olmamış 60 olgunun
analiz sonuçları
İ.Ü. Fetal Nükleik Asit Çalışma Grubu
Örnek
Exon 7 CT
Exon 10 CT
(34,11 – 37,21)
(34,45 – 37,35)
Fetal RHD
_________________________________________________________________
40 (%66.7)
17 (%28,3)
2 (% 3.3)
pozitif
negatif
negatif
pozitif
negatif
pozitif
1 (% 1.6)
pozitif
negatif
pozitif
negatif
RhDΨ
RHD variant
psödogen
pozitif
Exon 7 daha güvenilir
_________________________________________________________________
SERBEST FETAL DNA ile RHD TANISI
Detection of fetal RHD pseudogene (RHDΨ)
and hybrid RHD-CE-Ds from RHD-negative
pregnant women with a free DNA fetal kit
T. Gunel, I. Kalelioglu, A. Gedikbasi, H. Ermis
and K. Aydinli
Genet. Mol. Res. 10 (4): 2653-2657 (2011)
İ.Ü. Fetal Nükleik Asit Çalışma Grubu
sFetal DNA Preeklampsi Sonuçları
İntervillöz aralık
Desidua
1/3
miyometriyum
Spiral arter
Fizyolojik değişiklikler
çap 500 mm
Spiral arter
Daralmış
damar
Bazal arter
Radial arter
Normal
Elastik müsküler duvar çap 150-200 mm
Bazal arter
Radial arter
Preeklampsi
Yetersiz trofoblastik invazyon
Endotel hasarı
Oksidatif stres artışı
Akut aterozis
Sitokin salınımında bozukluk
Tromboz veya luminal obliterasyon
Maternal dolaşıma trofoblast
salınımında artış
Trombofili
Apoptosis artışı
Antifosfolipid sendromu
REAL TIME PCR ARACILIĞI İLE ANNE KANINDA FETAL DNA
MİKTARININ SAPTANMASI VE PREEKLAMPSİ GELİŞİMİ İLE
İLİŞKİSİNİN ORTAYA KOYULMASI
Zeybek YG1, Gunel T2, Kaleli S1 Benian A1,Aydınlı K1
1: İstanbul Üniversitesi, Cerrahpaşa Tıp Fakültesi, Kadın Hastalıkları ve Doğum Ana Bilim Dalı
2: İstanbul Üniversitesi, Fen Fakültesi, Moleküler Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı
Zeybek YG ve ark : Clinical evaluations of cell-free fetal DNA quantities
in pre-eclamptic pregnancies , J. Obstet. Gynaecol. Res (baskıda)
MATERYAL VE YÖNTEM
• 26-40 gebelik haftaları arasında klinik olarak tanı
koyulmuş 30 preeklamptik hasta 18 kontrol hastası ile
eşleştirildi.
• Anne kanındaki serbest fetal DNA düzeyi
SRY (Y kromozomu üzerinde cinsiyet belirleyici bölge) ve
GAPDH (gliseraldehid fosfat dehidrogenaz)
gen dizileri
kullanılarak Real Time PCR yöntemi ile karşılaştırıldı.
Zeybek ve ark 2012
SONUÇLAR
Zeybek ve ark, 2012
SONUÇLAR
• 30 preeklamptik hastada aynı haftadaki
kontrol hastalarına göre anne kanındaki
serbest DNA düzeyinde 3,06 kat
• ikinci trimestrede 1,5
• üçüncü trimestrede 3,5
• Erken başlangıçlı preeklampside 4,6
• Geç başlangıçlı preeklampside 3,2 kat artış
saptanmıştır.
Zeybek ve ark ,2012
Real Time PCR ile 12.-14. Gebelik Haftasında CD34
ve CD 133 Geninin Maternal Kanda Düzey Analizi
ve Gebelik Prognozu ile İlişkisi
Dr. Hayrettin Şahin – Uzmanlık Tezi - 2012
• 12.-14. GH’ları arasında 65 gebe rastgele seçildi.
• 6 hastada preeklampsi gelişti.
• CD34+ ve CD133+ kodlayan serbest fetal DNA
analiz edildi.
Fetal Anöploidilerin Noninvaziv
Prenatal Tanısı
Maternal kanda çalışılan sFetal DNA ile
trizomi 21 sonuçlarımız
İ.Ü. Fetal Nükleik Asit Çalışma Grubu
40 örnek çalışıldı.
20 tanesi Trizomi olgularına
20 tanesi normal gebelere
ait DNA örnekleri incelendi.
Yukarıdada görülen grafik 2.trimestrede sitogenetik olarak trizomi saptanan 10 gebenin
tıbbi tahliye öncesi alınan maternal kan örneklerinde DSCR3 (Down Syndrome Critical
Region ) geninin anlatımına göre normal fetal DNA ile karşılaştırılmasından elde edilen
değerleri gösteriyor. Tüm örneklerde artan gen anlatım miktarları görülüyor.
Yukarıda ise 15 gebede çalışılan DSCR3 (Down Syndrome Critical Region ) genine ait
miktar belirleme grafiği. Yedinci ve 11. örnekler trizomi 21 olgularına diğerleri normal
olgulara ait. Alta doğru olan çizgi grafikleri trizomili örneklere göre genin miktarının az
olduğunu gösteriyor (normal olgular).
Maternal kanda çalışılan
sFetal RNA / microRNA
İ.Ü. Fetal Nükleik Asit Çalışma Grubu
RT-PCR
Dijital PCR
QF-PCR
Preeklampsi
Karşılaştırmalı
Genomik
Hibridizasyon
(Array CGH)
Tüm genom
mikrodizin
(microarray)
MPSS
(Masif paralel
rastgele dizileme)
IUGG
Fetal Gelişim
Fetal Fizyoloji
PLASENTAL micro RNA
• Maternal plazmadaki plasental microRNA’lar küçük (19-25 nt) ,
tek sıra , kodlamayan ve daha stabil RNA’lardır.
• Hedef mRNA’nın 3’ ucuna (kopyalama yapmayan ) bağlanır ve
protein kopyalamasını baskılar. Bir veya birden fazla hedef genin
anlatımını değiştirerek gelişim , farklılaşma , çoğalma , hücre
ölümü gibi süreçlerde rol oynarlar.
• micro RNA’lar bir çok genin anlatımının anlaşılmasında etkili
olabilir. Bu nedenle yeni bir belirteç bulmak için en uygun
nükleik asittir.
Maternal kanda çalışılan
sFetal RNA / microRNA sonuçları
İ.Ü. Fetal Nükleik Asit Çalışma Grubu
• 20 normotensif
• 20 preklamptik hasta incelendi
• mir-152 ( HLA-G ‘yi suprese eder , NK-cell kökenli sitolizi indükler , immuniteyi
arttırır )
Çalışmada değişmediği bulundu.
• mir-210 ( sinsisyotrofoblastlardan eksprese edilir. İmmunite , apoptozis ve lipid
metabolizmasından sorumludur)
Çalışmada 2x arttığı saptandı
Mir-152 ve mir-210 ‘u VEGF geninin
düzenlenmesinde rol oynadıkları için
araştırmayı tercih ettik.
Serum microRNA expression in pregnancies with preeclampsia
T. Gunel1, Y.G. Zeybek2, P. Akçakaya1, I. Kalelioğlu3, A. Benian4,H. Ermis3 and K. Aydınlı 5
1Department of Molecular Biology and Genetics, Faculty of Science,
Istanbul University, Vezneciler, Istanbul, Turkey
2Siverek State Hospital, Sanlıurfa, Turkey
3Department of Obstetrics and Gynecology, Faculty of Medicine,
Istanbul University, Istanbul, Turkey
4Department of Obstetrics and Gynecology, Cerrahpasa Medical Faculty, Istanbul University, Istanbul, Turkey
5Medicus Health Center, Istanbul, Turkey
Corresponding author: T. Gunel
E-mail: gunel@istanbul.edu.tr
Genet. Mol. Res. (2011) Ahead of Print
Received October 4, 2011
Accepted November 1, 2011
Published November 8, 2011
DOI http://dx.doi.org/10.4238/2011.November.8.5
Preeklampsi ile bağlantılı olarak farklı metabolik yollarda
seçtiğimiz özel genler ile belirteç arayışlarımız sürmektedir.
sFETAL DNA , sFETAL RNA ,miRNA
ve Fetal Tıp
RT-PCR
Dijital PCR
QF-PCR
Cinsiyet
Karşılaştırmalı
Genomik
Hibridizasyon
(Array CGH)
Tek gen hastalıkları
RhD
Kromozom sayısı
Kromozom yapısı
Tüm genom
mikrodizin
(microarray)
Preeklampsi
MPSS
(Masif paralel
rastgele dizileme)
Fetal Fizyoloji
IUGG
Fetal Gelişim
PRENATAL TANININ GELECEĞİ
sFETAL DNA’nın /
sFETAL RNA’nın analizi , bireysel fetal tıp ,
tedavi?
• Serum tarama testleri ve/veya
• İnvaziv girişim daha az yapılacak,
sitogenetik analizde patolojik bulgu > % 99
• ULTRASONOGRAFİ
Teşekkür ederim ....
sFETAL microRNA
• Plasental microRNA transkriptleri maternal
plazmada 4.GH’sından itibaren saptanabilir.
• Ortalama yarılanma yaşamı 14 dakikadır.
• Doğumdan sonra hızla anne kanından
temizlenir.
Chiu RW ve ark. Clin Chem , 52 , 313 , 2006
sFETAL DNA
RhD Tayini
• RT-PCR ile ilk trimestrede sensivite % 100.
• Yanlış pozitif olgular genellikle RhD psödogeninden
(nonfonksiyonel) kaynaklanıyor.
• Özel primer’ler ile bu hata büyük oranda
giderilebiliyor.
Costa MJ ve ark. Br J Haematol , 119 , 255 , 2002
Finning KM ve ark. Transfusion, 42 , 1079 , 2002
Günel T ve ark. Genet Mol Res , 10 , 2653 , 2011