Kandan Genomik DNA İzolasyonu (Fenol

MOLEKÜLER BİYOLOJİDE KULLANILAN
YÖNTEMLER 1:
KANDAN DNA İZOLASYONU
MOLEKÜLER BİYOLOJİDE KULLANILAN
YÖNTEMLER
1. KANDAN DNA İZOLASYONU
DNA hücrede serbest bir molekül halinde değildir. Bazı
proteinler (histonlar, histon olmayan proteinler, HMG proteinler) ve
RNA ile bir kompleks halinde bulunur. Virüsler gibi canlılarda da bir
protein kılıfı içinde yer alır. DNA’nın izolasyonu, değişik organizma
gruplarında hatta aynı organizma grubu içerisinde farklılıklar
gösterse de temelde üç aşamadan meydana gelir.



1.Hücre duvarının parçalanması
2.DNA-protein kompleksinin çözülmesi
3.DNA’nın ortamdaki diğer moleküllerden ayrılması
Kandan Genomik DNA İzolasyonu



1- 1.5ml.lik tüpe 900l Red Blood Cell
(RBC) Lysis solüsyonu konur.
2- 300µl tam kan ilave edilir.Oda
sıcaklığında 10 kez ters düz edilerek 5dk
inkübe edilir. Eritrositlerin parçalanması
sağlanır.Hücrelerin iyi bir şekilde lisize
olmaları için bu süre uzatılabilir.
3- 14.000 rpm.de 20 san.santrifüjlenir.
Kandan Genomik DNA İzolasyonu



4- Tüpte lökositlerin oluşturduğu beyaz pellet
(tüpün dibinde) ile 10-20l residual
sıvı
kalacak
şekilde,
kalan
parçalanmış
eritrositlerin oluşturduğu supernatant (üst
kısım) atılır.Pellet ile sıvının karışması için 10
san. vortex yapılır.
5- 300l Cell Lysis solüsyonu eklenerek
pipetaj ile karıştırılır.
6- 100µl Protein Precipitation solüsyonu
eklenir.İyice karışması için yüksek hızda 10
Kandan Genomik DNA İzolasyonu




7- 14.000 rpm. de 1dk. santrifüjlenir. Hücrelerin
parçalanarak, proteinlerin dibe çökmesi sağlanır.
Böylece DNA proteinlerden uzaklaştırılmış olur.
8- 1.5ml.lik boş tüpe 300µl %100’lük isopropanol
konur.
9- DNA’yı içeren supernatant
kısmı alınarak
isopropanol üzerine ilave edilir.Yavaşça 50 kez ters
düz edilerek karıştırılır.İsopropanol kalan maddelerin
ve suyun DNA’dan uzaklaşmasını sağlar. Böylece DNA
ipliksi yapıda görünür hale gelir.
10- 14.000 rpm. de 1dk santrifüjlenir ve DNA’nın dibe
çökmesi sağlanır.
Kandan Genomik DNA İzolasyonu
11- Supernatant dikkatlice dökülür ve tüpler kurutma
kağıdı üzerinde kurutulur.
 12- DNA pelletini yıkamak için 300µl %70’lik etanol
ilave edilip birkaç kez ters çevrilir.
 13- 14.000 rpm.de 1dk santrifüjlenir.
 14- Etanol dikkatlice dökülür.Tüpler kurutma kağıdı
üzerine ters çevrilerek kurutulur.
 15- 50µl DNA Hydration solüsyonu ilave edilerek ve
orta hızda 5 san. vortexlenerek. DNA’nın çözünmesi
sağlanır
*Hazırlanan DNA aynı gün içinde kullanılacaksa +4ºC’ye
konulabilir.Uzun süre saklanabilmesi için –20 ya da 80ºC’ye konmalıdır.

Kandan Genomik DNA İzolasyonu (Fenol-Kloroform
ekstraksiyon yöntemiyle)







5- Yıkama işlemi tamamlandıktan sonra, pelletin
üzerine Proteinaz K ve Lysis Buffer eklenir.
Lysis Buffer:
-%10 SDS:............................... 80µl
-10 mg/ml Proteinaz K:..............5µl
-NaCl:.......................................90µl
-TE
Buffer:.............................500µl
’ye
tamamlayacak miktarda
6- Karışım, 56ºC’de 90dk inkübasyona bırakılır.

Optik Dansite (OD) = 260/280
~1.8
DNA (µg/ml)=260 nm’deki ODxSulandırım
oranıxkatsayı(50)