Genetik Mühendisliği - Hacettepe Üniversitesi

BYM613
Genetik Mühendisliği
Rekombinant DNA Teknolojisi - Özet
Hacettepe Üniversitesi
Biyomü
Biyomühendislik Bö
Bölümü
20122012-2013 Gü
Güz Dö
Dönemi
Dr. Eda Çelikelik-AKDUR
edacelik@hacettepe.edu.tr
Ref: The Scientist, Oct 17, 2012.
1
DNA Tamir Mekanizmaları
1.Direkt onarım ya da hasarın geri döndürülmesi
Fotoreaktivasyon
O-6-metilguanin onarımı
Basit tek zincir kırıklarının ligasyonu
2.Eksizyon (kesip-çıkarma) onarımı
Baz eksizyon onarımı (BER) (base excision repair)
Nükleotid eksizyon onarımı (NER) (nucleotide excision repair)
Mismatch (yanlış eşleşme) eksizyon onarımı (MER)
3. Rekombinasyonal Onarım
4. SOS Onarımı
5. DNA Çift Zincir Kırıklarının Onarımı
Serbest Uçların Homolog Olmayan Bağlanması (NHEJ)
Homolog Rekombinasyon (HR)
Burcu Sarıkaya, BYM613- 2012 sunumundan
Bölge Yönlendirilmiş Mutasyon
Oligonükleotid
Plazmid
DNA
dizisi
*Sentetik
*DNA sarmalı, tekli
diziler oluşturmak
için denature edilir.
İstenen mutasyonu
içeren bir
oligonükleotid
sentezlenir.
oligonnükleotid
hedeflenen bölgeye
gelecek şekilde
tavlama yapılır.
*Plazmid DNA
dizisi şablon olarak
kullanılarak mutant
oligonükleotid
uzatılır.
* Elde edilen DNA dizileri E.coli
içine yerleştirilerek çoğalması
sağlanır. Çoğalan heteroduplex
yapıların yaklaşık %50sinin
mutasyona uğramış, %50sinin ise
mutasyoına uğramamış olduğu
kabul edilir. Çeşitli yöntemler
kullanılarak bu iki yapı birbirinden
ayrılır.
Gökçe Dicle Demir, BYM613- 2012 sunumundan
In vitro site-specific mutagenesis - From Human Molecular Genetics, 1999. (web-books.com)
2
BAKTERİLERİN DOĞAL GEN TRANSFER
MEKANİZMALARI
1. Genetik Rekombinasyon
2. Transformasyon
3. Transdü
Transdüksiyon
4. Epizomlar ve Konjugasyon
5. Transpozonlar: İç Gen Aktarı
Aktarımı
27.11.2012
In Vivo Homolog Rekombinasyon
In vivo homolog rekombinasyon özellikle büyük DNA moloküllerinin
birleştrilmesinde kullanılmaktadır.
Bu method ile DNA parçası taşıyan plazmit (otonom) ile DNA
parçası taşımayan plazmit (nonotonom) arasında eş-bütünleşik bir
yapı oluşturularak karşılıklı genetik bilgi alış verişi amaçlanmaktadır.
Fig Ref. Robert M. Q. Shanks, Nicky C. Caiazza. Saccharomyces cerevisiae-Based Molecular Tool Kit for Manipulation of Genes from GramNegative Bacteria
Ebru Doğangün, BYM613- 2012 sunumundan
Company Logo
3
Transpozon Çeşitleri
Handan Cebeci, BYM6132012 sunumundan
Company
Logo
rDNA için temel basamaklar
Doku yada hü
hücreden DNA izole edilir; PCR ve/veya
Restriksiyon Enzimleri kullanı
sifik DNA
kullanılarak spe
spesifik
parç
parçaları
aları elde edilir.
Bu parç
yıcı DNA (vektö
parçalar, taşı
taşıy
(vektör) ile birleş
birleştirilir
(rDNA)
rDNA molekü
molekülü, çoğaltı
altılmak üzere konak hü
hücreye
aktarı
aktarılır.
Klonlar izole edilir
ve analizlenir.
4
Plasmid saflaştırılması
Tek kloni
LB
+
Antibiyotik
37°C’da inkübasyon
Alkalin parçalama ve kaynatma Stratejileri (yaklaşımları)
CsCl ile Saflaştırma
Affinite Teknikleri
Ticari kitler
9
Araz Norouz Dizaji, BYM613- 2012 sunumundan
°
94 C
°
37-65 C
Temel 3 aşama 30-35 döngü (cycle) tekrarlanır:
°
70-75 C
1.Denatürasyon (90-95°C): Dubleks DNA‟nın (çift iplikçikli DNA) yüksek sıcaklıkta
tek iplikçiklere ayrılması
2.Hibridizasyon (Annealing) (50-70 °C) : Primerlerin uygun sıcaklıkta hedef
DNA‟ya bağlanması.
3.Amplifikasyon (Extension) (70-75 °C) : DNA polimeraz ile primerin 3’OH grubuna
nükleotitlerin eklenerek DNA’nın uzatılması.
5
Primer tasarımı için kullanılan belli başlı yazılımlar :
Primer3
PrimerZ
PerlPrimer
Vector NTI Advantage 10
DNASIS SmartNote
Pride
Primer BLAST
Primer tasarımında parametreler:
Boyutu
Erime sıcaklığı
Pürin:Pirimidin içeriği
Primer-primer etkileşimi
Dimer oluşumu
5’ ucu RE tanıma bölgesi
27.11.2012
ule Ünal, BYM613- 2012 sunumundan
PCR Tipleri HEDEF
UYGULAMA
AVANTAJ
DEZAVANTAJ
Klasik
DNA
DNA dizisinin
amplifikasyonu
ve araş
araştırılması
lması
•
•
• Amplifikasyon sonrası
sonrası analiz
gerektirir.Daha fazla zaman
,araç
,araç/gereç
/gereç harcanı
harcanır.
• İnsan hatası
hatası ve kroskontaminasyon
riski taşı
r.
taşır.
• Elde edilen ürünün prob
hibridizasyonu veya dizileme ile
doğ
doğrulanması
rulanması tercih edilir.
Real Time
DNA
Hedef nü
nükleik
asit dizisinin
kopya sayı
sayısının
tespiti ile
quantifikasyon
• Hızlı
zlı
• Bağı
Bağıll veya kesin hedef dizi
quantifikasyonu
• Genellikle amplifikasyon sonrası
sonrası
analize gerek duyulmaz.
• Prob ve melting curve (erime
eğrisi) kullanı
kullanıldığı
ldığı için daha
kesin sonuç
sonuç.
• Daha az kroskontaminasyon
riski
• Daha pahalı
pahalı ekipman ve sarf
malzeme gerektirir.
• Primer ve prob seç
seçimi sı
sınırlı
rlıdır.
• Doğ
Doğrulama analizlerine (dizileme
gibi) izin vermez.
Multiplex
DNA
İki veya daha
fazla sayı
sayıdaki
farklı
farklı DNA
dizisinin aynı
aynı
anda
amplifikasyonu
•
•
•
En kolay uygulanan PCR tipi.
Düşük maliyetli ve az ekipman
gereksinimi
Çoklu hedef dizisinin tek bir
reaksiyonda amplifikasyonu ile
zaman ve araç
araç/gereç
/gereç tasarrufu.
•
Primer seç
seçim olanakları
olanakları sınırlı
rlıdır
Önemli ölçüde
çüde optimizasyon
gerektirir.
Çoğunlukla hassasiyeti ve
özgü
zgünlü
nlüğü düşüktü
ktür.
Nested
DNA
External ve
internal primer
takı
takımları
mları
kullanı
kullanılarak
• Daha hassas
• Nonspesifik amplifikasyonun
azaltı
azaltılması
lması
• İlk amplifikasyon sonrası
sonrası ürünün
taşı
nmasıı nedeniyle yanlış
taşınmas
yanlış pozitif
sonuç
sonuç ihtimali var.
(RT)(RT)-PCR
ReversReversTranskripsion
mRNA,
rRNA,
Viral RNA
RNA ‘nın
amplifikasyonu
ve araş
araştırılması
lması
•
•
•
Tüm RNA çeşitlerinin
amplifikasyonu
Göksu Gür, BYM613- 2012 sunumundan
RNA’
RNA’nın çabuk bozunması
bozunması
Ek RT aş
aşaması
aması daha fazla zaman
ve para gerektirir ,kontaminasyon
riski taşı
r.
taşır.
6
Yeterli miktar DNA elde edildikten sonra,
Restriksiyon Enzimleri (RE) ile kesilir.
Ref: Dr. M. Erayman ders notları.
DNA Ligaz enzimi ile DNA parç
parçaları
aları birleş
birleştirilir
(kü
kan uç
(küt uç
uçlu veya yapış
yapışkan
uçlu olabilir).
Fig. Pearson Education Inc., 2009
7
Vektörler
Plazmid klonlama vektö
vektörleri
Lambda ve M13 bakteriyofaj
vektö
vektörleri
Kozmid vektö
vektörler
Mekik vektö
vektörler
BAC (Bacterial artifical chromosomes)
YAC (Yeast artificial chromosomes)
Agaroz, elektroforez tamponu ile %0.3-2.0 konsantrasyon aralığında, yüksek
sıcaklıkta çözülerek hazırlanır.
Hazırlanan agaroz çözeltisi 50-60 °C soğuduktan sonra
boya çözeltisi (etidyum bromid) ilave edilir.
Jel katılaştıktan sonra ayrımı yapılacak örnek
taraklarla oluşturulmuş kuyucuklara yüklenir ve
elektriksel alanda yürütülerek ayrımı yapılır.
Örnekler UV ışığı altında görüntülenir.
Burcu Güven, BYM613- 2012 sunumundan
http://www.biotech.iastate.edu/ppt_presentations/html/Fingerprinting StudentInstruction-gel/05.html
8
Floresan boyalar sayesinde otomatik DNA sekanslama
Spektrofotometre ile DNA miktarı belirleme
•UV absorbansı kullanılarak DNA
miktarı ve saflığı belirlenir.
•DNA maksimum absorbansı 260 nm
• Proteinler, bazı aminoasitler 280 nm
•En iyi sonuçlar için A260 değerleri
0.1-1 arasında olmalı
•DNA saflığı A260 / A280 = 1.8 – 2.0
• DNA konsantrasyonu:
A = O.D. = ε.b.c
• 260 nm’ lik dalga boyu ve1 cm ışık
yolu için :
1 O.D. = 50 μg/ mL
http://www.nanodrop.com/Productnd2000overview.aspx
DNA konsantrayonu = O.D. 260 x 50 μg/ mL x Seyreltme Faktörü
İlkay Koçer, BYM613- 2012 sunumundan
[4] http://www.nfstc.org/pdi/Subject03/pdi_s03_m05_03.htm
[5] QIAGEN, Germany, Philippe Sauer, Markus Müller and Jie Kang, Quantitation of DNA
9
DNA SAKLAMA KOULLARI
Farklı saklama sıcaklıkları:
Oda sıcaklığı (GenPlateTM, Sample Matrix TM)
- 196 ˚C (sıvı azot içinde)
Bu iki koşulun ortak mekanizması : DNA camsı duruma geçer,
kimyasal ve proteaz bozulmasını engeller.
4 ˚C
-20 ˚C
-80 ˚C
Laboratuvar koşullarında,
İyi kalite DNA için önerilen saklama koşulları :
Haftaları kapsayan saklama : 4°C, Tris-EDTA
Ayları kapsayan saklama : –80°C Tris-EDTA
Uzun süreli saklama (yıllar) : –80°C, ethanol
Çok uzun süreli saklama : -196 ˚C
[3] http://www.ogt.co.uk/resources/literature/403_dna_storage_and_quality
KİMYASAL TRANSFORMASYON
İlkay Koçer, BYM613- 2012 sunumundan
ELEKTROPORASYON
sn
Kaynak: Competent Cell Guide, Bioline, Third Edition
Hande Günan Yücel, BYM613- 2012 sunumundan
10
RNA İZOLASYONU
İşlem 4 aşamada gerçekleşmektedir;
1. Hücrelerin parçalanması: Hücre veya doku kültürü lize solüsyonu
içersinde parçalanır. Bu işlem hızlı ve etkin bir biçimde soğuk ortamda
gerçekleştirilmelidir.
2. Ribonüklezların inaktivasyonu: Bunun için genelde çok güçlü bir
denatürant olan Guanidyum tiyosiyanat kullanılır.
3. RNA ekstrasyonu: Bu işlem RNA’ya düşük pH’da ekstraksiyon çözeltisi
(fenol:kloroform çözeltisi) eklenip santrifüjlenmesiyle gerçekleşir. Santrifüj
sonrası üst sıvı faz RNA içerir. DNA ve proteinler ise organik fazda ve ara
fazda kalır.
4. RNA’nın çöktürülmesi: RNA etanol:LiCl çözeltisi kullanılarak çöktürülür ve
santrifüj edilerek ayrılır.
[2]http://www.istanbul.edu.tr/fen/notlar/1260103777.doc
Merve Özkutlu, BYM613- 2012 sunumundan
Teknik 1975 yılında İngiliz
biyolog Sir Edwin Southern
tarafından bulunmuştur.
Hedeflenen bir genin ya da
aranılan DNA dizisinin, DNA
molekülündeki varlığının
belirlenmesini sağlar.
Moleküler biyoloji ve
rekombinant DNA
teknolojisi için önemli bir
adımdır.
Gökçe Dilli, BYM613- 2012 sunumundan
Brown, T.A., Southern Blotting and Related DNA Detection
Techniques, 2001
22
11
Nükleik Asit Blotlaması
Birbirinin tamamlayıcısı olan nükleik asit
molekülleri arasındaki hibridizasyona dayanır.
Northern Blot:
•James Alwine, David Kemp, George Stark 1977
•RNA’nın filtreye bağlandığı blotlama
tekniği
Western Blot:
proteinler
Eastern Blot:
post-translasyonal modifikasyonlar
Southern Blot: DNA
Bakiye Göker, BYM613- 2012 sunumundan
Ref: Klug, S.W., Cummings M. R., Spencer C. A., 2006, Consepts of Genetics, Pearson Education Publishing
http://www.transcriptome.ens.fr/sgdb/presentation/principle.php
Nurşen Ziğal, BYM613- 2012 sunumundan
12
FACS ile Hücre Ayrımı
•
Floresan işaretli hücrelerin
ayrılmasında elektrostatik
yükten yararlanılır.
Kullanım Alanları
•
•
•
•
•
•
•
•
İmmün fenotipleme
DNA analizi
Hücre proliferasyonu
Hücre ölümü
RNA ve protein içerik analizi
İlaç alım ölçümü
Mikroorganizma tayini
Virüs ve viral ürün tayinleri
Gökçe Kaynak, BYM613- 2012 sunumundan
Güner U., 2012, J FisheriesSciences.com, 6(1): 9-17 .
26
Mikroorganizmaların Moleküler
Tanımlanma Yöntemleri
Metod
Tanımlama
kapasitesi
Ayırma
Gücü
Tekrarlanabilirlik
Uygulama
Kolaylığı
Yorumlama
Kolaylığı
Plazmid
analizi
PFGE
İyi
İyi
İyi
Yüksek
İyi
Yüksek
Yüksek
Yüksek
Orta
İyi
PCRRFLP
RAPD
İyi
Orta
İyi
Yüksek
Yüksek
Yüksek
Yüksek
Zayıf
Yüksek
Yüksek
AFLP
Yüksek
Yüksek
İyi
Orta
Yüksek
Sekans
analizi
Yüksek
Yüksek
Yüksek
Orta
Yüksek
Buckingham, L., Flaws, M., 2007, Molecular Diagnostics
Applications, Medicus Media, 462 s.
Fundementals, Methods and Molecular
Gamze Nur Kara, BYM613- 2012 sunumundan
13
DNA metilasyonu
Gen ifadesinin
Kromozomal bütünlüğün
Rekombinasyonel olayların
kontrolü
rollerine sahip bir
modifikasyondur.
DNA’ ya bağlanabilen
proteinlerin bağlanmasını
engelleyerek
transkripsiyonu önlemesi
Zeynep Acar, BYM613- 2012 sunumundan
Cindy D. Davis and Eric O. Uthus, DNA Methylation, Cancer Susceptibility, and Nutrient Interactions, Experimental Biology and Medicine 2004, 229:988-995.
14