ÖZEL EGE LİSESİ KANSERDEN DEĞİL, GEÇ KALMAKTAN KORK

advertisement
ÖZEL EGE LİSESİ
KANSERDEN DEĞİL, GEÇ KALMAKTAN KORK
HAZIRLAYAN ÖĞRENCİLER:
Berna AKDENİZ
Leyla AL MASOUD
DANIŞMAN ÖĞRETMEN: Dr. Onur AKPINAR
İZMİR
2017
İÇİNDEKİLER
Sayfa
1. GİRİŞ….………………………………………………………………………..
1
1.1 Kanser Nedir?................................................................................................
1
1.2 Dünya’da En Sık Görülen Kanser Türleri………………………………….
2
1.2.1 Akciğer Kanseri……………………………………………………….
2
1.2.2 Meme Kanseri…………………………………………………………
4
1.2.3 Prostat Kanseri………………………………………………………...
5
1.3 Kanser Teşhisi………………………………………………………………
6
1.4 Kanser Teşhisinde Mikroakışkan Yaklaşımların Kullanılması…………….
8
1.5 Projenin Amacı……………………………………………………………...
11
2. YÖNTEM……………………………………………………………………....
11
2.1 Materyal…………………………………………………………………….
12
2.2 Hücre Kültür Şartları………………………………………………………..
12
2.3 Mikroakışkan Temelli Çiplerin Fabrikasyonu……………………………...
13
2.4 Mikroakışkan Çiplerin Yüzey Kimyasının Oluşturulması………………….
14
2.5 Kanser Hücre Hatlarının Mikroakışkan Çiplerde Analiz Edilmesi…………
15
3. BULGULAR……………………………………………………………………
15
4. SONUÇLAR VE TARTIŞMA………………………………………………..
19
5. ÖNERİLER…………………………………………………………………….
20
KAYNAKLAR.…………………………………………………………………...
20
1. GİRİŞ
1.1 Kanser Nedir?
Çok hücreli canlılarda, hücrenin bölünerek büyümesi çok sıkı kontrol altında
gerçekleşir. Hücre, iç ve dış sinyallerle uyarılınca bölünür. Bu kontrol, bölünmenin doğru
dokuda ya da organda gerçekleştiğini garantiye alır. Bazı dokularda, örneğin kemik iliği, deri
ve mide içzarında hücreler sürekli bölünür ve ölen hücrelerin yerini alır. Fakat bazı diğer
dokularda, örneğin sinir hücresinde, mitoz bölünme nadir görülür ve kaybedilen hücreler
yenilenemez. Kanser kavramı, büyümesi kontrol edilemeyen hücrelerin sebep olduğu
hastalıkları temsil eder. Kanser hücreleri, kontrol sinyallerine yanıt vermez ve büyümeleri
kontrol altına alınamaz. Tümör hücreleri iyi huylu ya da kötü huylu olabilir. Bununla birlikte,
günümüzde kanser kavramı kötücül hücre olarak bilinmektedir (Ahmed ve ark., 2007).
Kanser vücudun herhangi bir yerinde ortaya çıkabilir hatta vücudun 100’ü aşkın farklı
bölgesinde saptanabilmiştir. Bazı bölgelerde kanserin yayılması diğerlerine göre daha
yatkındır. Bilinen en yaygın kanser türleri akciğer, meme, prostat, mide ve deridir. Bazı
kanserler, yaşlılarda gençlere nazaran daha sık rastlanır. Bazı kanser tipleriyse sadece
çocuklarda görülür. Kanserler genellikle bulundukları dokuya ve kökenine göre
sınıflandırılırlar. Bir kanser türü epitel hücreden türevlenen karsinom, kas, kemik ve kıkırdak
gibi mezodermal bir kökenden türevlenen sarkom adını alır. Lösemi kavramı, kemik
iliğindeki kanda rastlanan tek tip bir hücreyi tanımlamakta kullanılır. Lenfoma da lenf bezleri
gibi lenfomik bir dokudan türeyen bir kanseri temsil eder (Lyons, 2007). Bazı kanser türleri
belli bir cinsiyete özgüdür. En belirgin örnek; rahim ağzı kanseri sadece kadınlarda, prostat ve
testis kanseri ise yalnızca erkeklerde görülmesidir. Bunun yanında akciğer kanseri hem
kadınlarda hem erkeklerde görülür (Ahmed ve ark., 2007).
Dünyada, erkeklerde ilk üç sırada bulunan kanser türü, prostat, akciğer ve kolon iken,
Türkiye’de bu sıralama akciğer, prostat ve mesane şeklinde olmaktadır (Şekil 1).
Şekil 1. Dünya Sağlık Örgütüne göre dünyada (A) ve Türkiye’ de (B) kanserin
insidans ve mortalite oranları (GLOBOCAN, 2012).
-1-
Erkeklerde akciğer kanseri insidansı Türkiye’de yüz binde yaklaşık 69’larda, dünya
ortalaması ise yüz binde 30-35’lerde, Avrupa Birliği ortalaması ise 100.000’de 48’lerdedir.
Bu şekilde kanser artış hızının devam etmesi durumunda, Dünya nüfusunun artışına ve
nüfustaki yaşlanmaya bağlı olarak 2025 yılında toplam 19,3 milyon yeni kanser vakası
olacağı belirtilmiştir. Gerek kanser vakalarının (%56,8) gerekse de kanserden kaynaklanan
ölümlerin (%64,9) yarısından fazlasının az gelişmiş ülkelerde olduğu gösterilmiştir (T.C.
Sağlık Bakanlığı, 2016) (Şekil 2).
Şekil 2. Amerika Birleşik Devletleri’nde cinsiyete göre kanser dağılım gösteren on
kanser tipi (Siegel ve ark., 2013).
1.2 Dünya’da En Sık Görülen Kanser Türleri
Hem Dünya Sağlık Örgütü (WHO) hem de Türkiye Cumhuriyeti Sağlık Bakanlığı
Türkiye Halk Sağlığı Kurumu Kanser Daire Başkanlığı’na göre Dünya’da ve Türkiye’de en
sık görülen ve en çok ölüme sebep olan kanser türleri sırasıyla akciğer, meme ve prostat
kanserleridir (GLOBOCAN, 2012; T.C. Sağlık Bakanlığı, 2016).
1.2.1 Akciğer Kanseri
Akciğerler, göğüs boşluğumuzda bulunan, nefes alıp verirken oksijenin dokulara
alınmasını ve karbondioksitin dışarı atılmasını sağlayan solunum sisteminde görevli temel
organlardır. Akciğerler süngerimsi yapıda ve koni şeklinde bir çift organdır ve ''lob'' adı
verilen bölümlerden oluşmaktadır. Sol akciğer 2, sağ akciğer ise 3 lobdan oluşmaktadır.
Akciğerler, solunum işlevini yapısında bulunan bronş ve bronşcuk olarak adlandırılan hava
kesecikleri sayesinde gerçekleştirmektedir (Stanson, 2008). Akciğer kanseri, trakeobronşiyal
ağaç ve alveollerdeki olgun epitel hücrelere farklılaşma yeteneğine sahip hücrelerin, heterojen
bir neoplazm grubu oluşturması ile oluşur (Rom ve ark. 2000).
Akciğer kanseri erkeklerde ölüme en çok neden olan kanser olmakla birlikte,
kanserlerin %60’ını oluşturmaktadır. Bayanlarda akciğer kanseri, meme kanserinden sonra en
çok görülen kanser tipidir. 65 yaştan sonra ölüm oranı yaklaşık %75’ e çıkmaktadır. Sigara
içiciliği ve pasif içicilik, akciğer kanseri vakalarının %90’ının sebebidir. Buna ek olarak,
radyoaktif bir gaz olan radon ve mineral asbest gibi kimyasallara maruz kalmak akciğer
kanseri riskini beş kat oranda arttırmaktadır (Ahmed ve ark., 2007). Ülkemizde akciğer
kanseri tüm kanserler içinde erkeklerde birinci sırada, kadınlarda dördüncü sıradadır (T.C.
Sağlık Bakanlığı, 2016) (Şekil 3).
-2-
Şekil 3. Akciğer dokusunda kanser varlığının şematik gösterimi (Ahmed ve ark.,
2007).
Akciğer karsinogenezinde önemli genetik olaylar; onkogenlerin mutasyonel
aktivasyonu, tümör baskılayıcı genlerin aktivasyon kaybı, hücre döngüsü regülasyonunda
görev alan genlerde ortaya çıkan değişiklikler, DNA onarımında görev alan genlerde ortaya
çıkan değişiklikler ve büyüme faktörleri ile reseptörlerine ilişkin değişikliklerdir. DNA
hasarının oluşumu, kimyasal karsinogenezin ilk aşamasıdır. Genetik hasarın temelinde,
mutasyonlar ve delesyonlar yatar. Mutasyonlar, kalıtım molekülünde oluşan ve kuşaktan
kuşağa aktarılan kalıcı değişikliklerdir. Mutasyonlar büyüklüğüne göre (nokta ve gen),
nedenine göre (kendiliğinden ya da uyarılmış), etkilenen doku tipine göre (vücut) ve genetik
şifrenin anlamlılığı gibi birçok özelliğe göre sınıflandırılabilir (Köktürk ve ark., 2003).
Akciğer kanseri iki ana gruba ayrılır. Küçük hücreli akciğer kanseri (SCLC) ve küçük hücreli
olmayan akciğer kanseri (NSCLC). Akciğer kanseri vakalarının %20’sini küçük hücreli
akciğer kanseri oluşturur. Akciğer kanseri hücrelerinde çekirdek oranı sitoplazma oranına
göre daha fazladır. Küçük hücreli olmayan akciğer kanserleri üç gruba ayrılır. Skuamoz
hücreli kanser, adenokarsinom ve büyük hücreli karsinomlardır. Skuamoz hücreli
karsinomalar solunum dokularında bulunan epitel hücrelerinden gelişirler ve akciğer
kanserlerinin % 35’inden sorumludurlar. Adenokarsinomlar solunum dokularında bulunan
mukus salgılayan hücrelerden gelişirler ve akciğer kanserlerinin %27’sinden sorumludurlar.
Son olarak, büyük hücreli karsinoma ise diğer hücre formları ile karşılaştırılırsa daha büyük
hücrelerden oluşur ve toplam akciğer kanserlerinin %10’unu oluştururlar (Ahmed ve ark.,
2007).
Akciğer kanseri genellikle ilk evrelerde semptom göstermez ve hastalığın belirtisi
görülmeye başlandığında akciğer kanseri ilerlemiş olur. Bazı hastalarda belirti gözlenmez ve
sadece göğüsün rutin olarak çekilen X-ışını filmleri ile teşhis edilebilir. Bazı semptomlar;
sürekli ve şiddetli öksürük, nefes darlığı, bronşit ve pnömokok gibi tekrar eden göğüs
enfeksiyonları ile belirtilerini göstermektedir. Eğer bu gibi belirtiler gözleniyorsa, pozitron
emisyon tomografisi (PET) ile kanser aşamalandırılmalıdır. Diğer testler göğsün muayenesini
içerir. Bu işlemler, boynun üst tarafına küçük bir kesik açılıp endoskopi yapılmasıyla saptanır.
Buna ek olarak; biyopsi, CT tarayıcı ve X-ışını eşliğinde, akciğere ince uçlu iğne sokularak
yapılabilir. Küçük hücreli olmayan akciğer kanserinde birincil tümör T1–T4’e kadar
sınıflandırılmıştır. T1; 3 cm’ den küçük ve ana bronşlara sıçramadığını, T2; 3 cm’ den büyük
ve ana bronşlara sıçradığını, T3; herhangi bir boyutta ve göğüs kafesi, diafram, göğüs zarı ve
perikardiyum ve ana bronşlarda yer aldığını, T4; herhangi bir boyutta olup kalp, trake veya
özofagus gibi farklı dokulara sıçradığını ifade eder. Bölgesel lenf nodları N0’dan N3’e kadar
sınıflandırılmaktadır. N0, herhangi bir bölgesel lenf nodül metastazı içermez. N1 ve N2
-3-
sırasıyla aynı bölgedeki ya da zıt yöndeki tümörlerin metastazını içermektedir (Ahmed ve
ark., 2007).
1.2.2 Meme Kanseri
Meme dokusu; epiteliyal parankim, kas, bağ ve yağ doku, kan damarları, lenf ve sinir
sisteminden oluşmaktadır. Epiteliyal parankim, alveolun kanalcıklarının birleşerek
oluşturduğu lobüllerden ve her biri ayrı bir kanal ile meme ucuna açılan 20 veya daha fazla
lobdan oluşur (Masso-Welch, 2000). Meme kanseri, lobülleri ya da süt kanallarını oluşturan
hücrelerin kontrolsüz çoğalmaları ve vücuttaki diğer dokulara yayılarak çoğalmaya devam
etmeleriyle gelişir. Süt kanallarından kaynaklanan kansere duktal karsinom, lobüllerden
kaynaklanan kansere ise lobüler karsinom adı verilmektedir (Dimri ve ark., 2005) (Şeki4).
Meme kanseri, süt bezlerinde ya da meme ucuna süt ileten kanallarda gelişir. Meme
kanserinin semptomlarına memede oluşan ağrısız bir yumru oluşması, meme şekli ve
boyutunun değişmesi, meme ucunun pozisyonunu değişmesi, göğüs akıntısı olması, meme
ucu çevresinde egzamaya bağlı kızarıklık oluşması ve koltuk altında yumru oluşması örnek
verilebilir (Ahmed ve ark., 2007).
Şekil 4. Meme dokusunda kanser varlığının şematik gösterimi (Ahmed ve ark., 2007).
Meme kanseri hem genetik hem epigenetik mekanizmalardaki bozukluklardan
kaynaklanır. Bu bozuklukta hem ekzojen hem endojen kaynaklı iç ve dış çevresel faktörler rol
oynadığı gibi, atalarından kalıtılan bozuk genler de rol alır. Meme kanserinin hem kalıtsal
(ailesel) hem de sporadik tipleri mevcuttur. Birincil veya ikincil derece akrabalarında birden
fazla kişide meme kanseri görülen ve diğer kanserlerin metastaz yapması sonucu (sekonder)
oluşmamış olan meme kanserleri kalıtsal (ailesel) meme kanserleri olarak tanımlanır. Meme
kanserlerinin %5-10’unda meme kanserine yatkınlık genlerinde mutasyonlar görülmektedir.
Bu genlerden BRCA1, BRCA2, PTEN, TP53, LKB1/STK11 ve CDH1 yüksek risk genleri,
CHEK2, TGF-β1, CASP8 ve ATM ise düşük risk genleri olarak kabul edilmektedir. BRCA1
ve BRCA2 genlerindeki mutasyonlar kalıtsal meme kanserlerinin üçte birinden sorumludur
(Beckmann ve ark.,1997).
Meme kanseri, dünya çapında kadınlarda en sık görülen (%23) kanser tipidir ve
kansere bağlı ölümlere bakıldığında akciğer kanserinin ardından ikinci sırada yer alır. 2008
yılında, dünyada yaklaşık 1.38 milyon kadına meme kanseri tanısı konulduğu ve bu hastaların
üçte birinin (460.000 kişi) öldüğü bilinmektedir (Giuliano, 2009). Göğüs kanseri Amerika ve
İngiltere’de kadınlarda en çok görülen kanser olmakla birlikte en çok ölümle sonuçlanan
-4-
ikinci kanser türüdür (Ahmed ve ark., 2007). Türkiye’deki en güncel meme kanseri istatistiği
2016 yılında Sağlık Bakanlığı tarafından yapılmıştır ve bu istatistiklere göre meme kanseri
%45.90’lık oranla ülkemiz kadınları arasında en yaygın görülen kanser tipidir. Meme
kanserinin görülme sıklığı, son yıllarda giderek artmıştır (T.C. Sağlık Bakanlığı, 2016).
Meme kanserine yakalanma riskleri şunlardır; artan yaş, çocuğa sahip olamama, erken
adet görülmesi ya da geç menopoza girilmesi, hormon tedavisi, kilolu ya da obez olmak,
doğum kontrol hapı alınması ve düzenli alkol tüketimi (Ahmed ve ark., 2007).
Günümüzde sıklıkla teşhis yöntemi olarak kullanılan mamografi, X-ray ışınlarını
kullanarak potansiyel tümörün yerini tespit eder. Mamografi aynı zamanda kanseri
görüntülemek için de kullanılır. Yumru aynı zamanda ultrason ile gözlenebilir ya da
yumrunun kan akışını resimleyen Renkli Doppler ultrason (Color Doppler ulrasound) ile de
incelenir. Yumrudan ince iğne yöntemiyle alınan hücre örneğinin mikroskobik incelenmesi de
yararlı olabilir. Buna ek olarak, genel anesteziyle alınan yumru, patolojik incelemeye
gönderilebilir. Meme kanserinin aşamalandırma sistemi iki istilacı, dört istilacı olmayan
olmak üzere gruplara ayrılır. in situ’ daki lobüler karsinoma kanser hücreleri meme loblarında
meydana geldiği zaman lobüler karsinoma gerçekleşir. 2 cm’den kısa ve henüz lenf
nodüllerine sıçramadıysa 1. aşama, eğer 2 – 5 cm arasındaysa ve lenf nodüllerine sıçradıysa 2.
aşama, eğer 5 cm’i aşmışsa ve kas ve deriye sıçramışsa 3. aşama, eğer herhangi bir boyuttaysa
ve metastaz gerçekleşmişse 4. aşamadadır. Tümör hücreleri ayrıca FISH ya da
immünohistokimyasal yollarla östrojen reseptörünün veya hücre yüzeyindeki HER2
molekülünün yakalanmasıyla teşhis edilebilir. Bu iki proteinden birinin yakalanması, tedaviye
başlanması gerektiğini ifade eder. Östrojen reseptörlerine sahip hücreler normal östrojen
hücresi elde etmek için bölünebilir ve hormon terapisi uygulanabilir. HER2, insan epidermal
büyüme reseptörü olarak kullanılabilir. HER2’de pozitif çıkan meme kanseri hücreleri, doğal
olarak meydana gelen insan büyüme faktörü (EGFR) hücrelerini oluşturmak için uyarır
(Ahmed ve ark., 2007).
1.2.3 Prostat Kanseri
Prostat, sadece erkeklerde bulunan ve seminal sıvının bir kısmını üretmek ile görevli
tübulo-alveolar bir bezdir. Rektumun (kalın bağırsağın son kısmı) önünde ve mesanenin
altında yerleşmiştir. İdrar akımını sağlayan üretra (idrar yolu) ile çevrilmiştir. Prostat bezi,
mesane fonksiyonunu kontrol etmek için; sinirlerin, kan damarlarının ve kasların yakınında
lokalize olmuştur. Prostatın büyüklüğü, yaş ile değişiklik göstermektedir. Daha genç
erkeklerde sağlıklı bir prostat bezi, ceviz büyüklüğündedir. Prostat, yetişkinlerde genellikle
aynı büyüklükte kalır ve hormonlara bağlı olarak yavaş bir büyüme gösterir. Yaşlı erkeklerde,
prostat boyutu daha büyük olabilmektedir. Androjen olarak adlandırılan erkek hormonu
prostatın büyümesine katkı sağlamaktadır. Prostat aşırı büyüdüğü zaman üretraya baskı
yaparak idrarın mesaneden akımını yavaşlatır ya da durdurur (American Cancer Society,
2016a) (Şekil 5).
Prostat kanseri özellikle elli yaş üzeri erkekleri etkileyen bir hastalıktır. Tümör, uzun
süre belirti göstermediğinden, çoğu prostat kanseri teşhis edilemez. Yıllık teşhis edilememe
oranı, İngiltere’de yaklaşık 30.000 iken Amerika’da ise bunun yarısı kadardır (Ahmed ve ark.,
2007). Türkiye’deki en güncel prostat kanseri istatistiği 2016 yılında Sağlık Bakanlığı
tarafından yapılmıştır ve bu istatistiklere göre prostat kanseri %36,40’lık oranla ülkemizde
erkekler arasında en yaygın görülen ikinci kanser tipidir. (T.C. Sağlık Bakanlığı, 2016).
-5-
Şekil 5. Prostat bezinin normal görünümünün (A), prostat bezinin rektal muayenesinin
(B) şematik gösterimi (Ahmed ve ark., 2007).
Prostat kanseri genellikle yavaş büyürken, az oranda tümörler daha hızlı büyür ve daha
çabuk metastaza uğrar. Prostat kanseri olma riski yakın akrabaların prostat kanseri geçmişine
bağlı olarak artar. Genellikle prostat kanserinin belirtileri tümör küçükken gözlenmez. Ancak
tümör büyüdükçe idrara çıkarken yanma ve zorluk, daha sık idrara çıkma (özellikle geceleri)
gibi sorunlar gözlenir. Aynı zamanda idrarda kan da gözlenebilir. Eğer kanser hücreleri
kemiğe yayılmışsa, belde ve pelviste acı meydana gelebilir. Prostat kanseri semptomları
gösteren bir hastaya rektal muayenesi uygun görülür (Şekil 5). Bu muayene sırasında el
yordamıyla rektum incelenir ve prostat hissedilmeye çalışılır. Genişlemiş bir prostat, yuvarlak
ve yumuşak ise iyi huylu tümör olma olasılığı daha yüksektir. Bununla birlikte, prostat
tümörü et bezinin daha sert ve yumru yumru hissedilmesine neden olur. PSA testi için de kan
örneği alınır. PSA testinde prostat spesifik antijeni ölçülür. 50 yaşındaki erkeklerde 2,8 ng
cm-3 iken, 70 yaş ve üzerindeki erkeklerde bu oran 5,3 ng cm-3’tür. 10 ng cm-3’ten fazla olan
erkekler için daha gelişmiş testler yapılmalıdır. Prostat kanseri genellikle Gleason sistemine
göre kanserin büyüme düzenini ve dağılımını derecelendirir. Bu derecelendirmede, T1;
prostat bezindeki tümör çok küçük ve rektal muayenede tümör saptanamıyor, T2; tümör
muayene ile saptanabilecek kadar büyük ancak sadece prostatta yer alıyor, T3/4; tümör
mesane gibi çevrelerindeki dokulara yayılmış, Metastatik kanser; tümör lenf nodülleri, kemik
veya vücudun diğer uzak bölgelerine sıçramış demektir (Ahmed ve ark., 2007).
1.3 Kanser Teşhisi
Kanserin ölüm oranı oldukça yüksektir. Dahası, hastalar ve aileleri üzerindeki yıkıcı
etkileri, büyük ekonomik maliyetleri göz ardı edilemez. Erken teşhis kavramı kısaca tümörleri
erkenden, tedavi edilemez hale gelmeden önce bulma olarak tanımlanan ve kanser
araştırmacılarının uzun yıllar dikkatini çeken bir konudur. Ancak günümüze kadar sadece
birkaç erken teşhis denemeleri başarılı olmuştur. Son günlerde, genomik ve proteomik
alanlarındaki büyük ilerlemeler kullanışlı tarama testlerinin yaygın şekilde erken teşhiste
kullanılmasına olanak sağlamaktadır (Etzioni ve ark., 2003).
İleri düzeydeki kanserler için geliştirmiş tedavilerin başarı oranı düşüktür. Bu alanda
yapılan binlerce araştırma ve harcamaya rağmen alınan sonuçlar pek de istenilen düzeyde
olmamakla birlikte yetersizdir. Tanısı konulan kanserler genelde hep ileri düzeyde teşhis
edildiğinden yapılan araştırmalar çoğunlukla tedavi etkinliğini arttırmaya yöneliktir. İleri
seviyede teşhis konulan hastalarda, çok az derecede kurtulma gözlemlenmiştir. Bu nedenle
kanserin erken teşhisinin sağlanması, hastanın yaşama şansını büyük ölçüde arttırmaktadır.
Dünya Sağlık Örgütü, kanser hastalığının kontrolüne doğru bir yaklaşım için çeşitli kriterler
belirlemiştir. İlk olarak, hastalığın yaygın olması ve ölüm oranının (morbidite ve mortalite)
yüksek olması gerekir. İkincisi, görüntüleme testleri, hastalığı erken evresinde doğru bir
-6-
şekilde tespit edebilmelidir. Üçüncü olarak, görüntüleme testleri klasik teşhis yöntemleri ile
de desteklenerek tedaviye başlanmalıdır (Etzioni ve ark., 2003).
Tümör yeterince büyüyünce diğer dokuları istila ederek acıya, ateşe ve kanamaya
sebep olur. Bu belirtiler ilk başta ciddi görünmediği için hasta doktora danışmadan aylarca
hastalığın geçmesini bekleyebilir. Bu yanlış anlaşılmalar nedeniyle oluşan gecikmeler
kanserin büyümesine ve hatta metastaz denilen mekanizma ile başka organlara yayılmasıyla
tedavinin zorlaşmasına neden olur (Lyons, 2007).
Akciğer kanseri dünyadaki en yaygın kanser türlerinden biri olup klasik belirtileri
arasında sürekli öksürük, göğüs ağrısı, nefes darlığı, açıklanamayan kilo kaybı, ses kısıklığı
ve bronşit gibi diğer akciğer hastalıkları ile karıştırılabilecek belirtilere sahiptir. Bu sebeple
her belirti zararsız gibi görünmektedir ve genellikle endişe yaratmamaktadır. Çoğu zaman,
yukarıdaki gibi belirtiler yalnızca bir günlük ağrı olarak göz ardı edilir. Dahası, bu belirtiler
genellikle akciğer kanserinin erken evrelerinde kendini göstermez. Bunun yerine, çoğu
akciğer kanseri, hastalığın ilerleyen aşamalarında tedaviyi daha sorunlu hale getirir ve sonuç
olarak akciğer kanserinin sağkalım oranını önemli ölçüde düşürür. Amerikan Kanser Derneği,
küçük hücreli olmayan akciğer kanseri (NSCLC) için beş yıllık sağkalım oranlarının geç
dönemde teşhis edilenlere göre önemli derecede yüksek olduğunu bildirmiştir (Lung Cancer
Foundation of America, 2016).
Eğer doktor muayene ve testler sırasında şüpheli bir bulguya rastlarsa daha detaylı
incelemeler için uzmanlara yönlendirir. Bu uzmanlar, biyopsi, endoskopi ve sitoloji denilen
yöntemler kullanır. Bu yöntemler arasında biyopsi, küçük bir dokunun mikroskop altında
incelenmesi için hastadan alınmasıdır. Eğer fiziksel muayenede ya da diğer testlerde şüpheli
bir bulguya rastlanırsa doktor ilgili dokunun kanser olup olmadığını anlamak için biyopsiyi
önerir. Biyopsi bazen ultrason, manyetik rezonans görüntüleme, bilgisayarlı görüntüleme gibi
görüntüleme testleri yardımıyla yapılabilir. Ara sıra doku incelemek için cerrahi müdahale de
gerekebilir. Hastaya uygulanacak biyopsi türü, kanserin bulunabileceği muhtemel dokuya
göre değişir. Test sonuçlarının alınması için geçen süre, hastanın olduğu biyopsiye ve teşhis
edilmesi için gereken test sayısına bağlıdır. Analizler doğrultusunda bir patolog, alınan
dokuda tümör olup olmadığına karar verir. Tümör iyi ya da kötü huylu olabilir. Kötü huylu
tümör, vücudun diğer bölümlerine yayılabilir. Patolog, tümörün tipinin belirlenmesini sağlar.
Komplike olmayan sonuçlar 2-3 gün içerisinde alınabilirken, komplike sonuçlar daha fazla
test gerektirdiği için 7-10 gün arasında alınmaktadır (Lyons, 2007).
Biyopsi dışında rutin görüntüleme, kanseri erken tespit etmemizi sağlayabilir. Bu da
tedavinin geç teşhis edilen hastalara göre daha başarılı olacağını gösterir. Örneğin;
mamogram adı verilen bir X-ışını prosedürü memedeki kanser veya kanser olmayan
anormallikleri saptayabilir. Mamogramda meme iki tabakanın arasına sıkıştırılır. Daha sonra
üstten ve yanlardan X-ışını filmi çekilir. Memedeki bu anormallik basitçe bir kist, iyi huylu
bir tümör ya da kanser olabilir. Eğer bir anormallik gözlenirse doktor, daha detaylı testlerin
yapılmasını uygun görür. Kırk yaş ve üstündeki kadınlar, her bir ya da iki yılda bir
mamogram çektirmelidir. Meme kanseri erken aşamalarda teşhis edildiği zaman hastaların
%97’sinin en az beş yıl daha fazla yaşadığı görülür. Tümörlü dokular daha yoğun
olduklarından dolayı X-ışınlarını daha çok absorplarlar ve böylece X-ışını filminde daha açık
renkte görülürler. Bilgisayarlı tomografi gibi yeni X-ışını teknikleri kanseri standart X-ışını
tekniklerine göre daha iyi teşhis eder (Lyons, 2007).
1928’de Cornell Üniversitesinden George Papanicolaou serviks kanserinin, serviksten
hücreler alıp incelenerek teşhis edilebileceğini keşfetmiştir. 1940’ larda Pap testi (adı
Papanicolaou’dan alınmıştır) medikal kullanıma sunulmuş ve düzenli olarak yapılan bir
kanser testi haline gelmiştir. Doktorlar aynı zamanda düzenli olarak kolon ve rektum
-7-
muayenesi yaparlar. Rektal bir muayenede doktor eldiven giyerek şüpheli kısımları
hissedebilmek için rektumun içine parmağını yerleştirir. Bu süreçte rektumun sadece belirli
bir kısmı muayene edilir. Elli yaşının üstündeki hastalar için daha detaylı bir muayene
yöntemi olan ve direk rektum ile kolonu incelemeye yarayan kolonoskopi yöntemi kullanılır.
Polip denilen ve kanserli olmayan urlar bu prosedürde ileride kanser riski yaratmaması için
önceden alınır. Görüntüleme prosedürlerinin dışında, doktorlar tarafından yapılan düzenli
fiziksel muayeneler de kanseri tespit edebilir. Doktor gözüyle ve eliyle kanser belirtilerini
kontrol eder. Bunun için ağıza, boğaza, tiroid bezine, lenf düğümlerine, deriye, pelvise,
prostata, testislere ve rektuma bakabilir. Fiziksel muaynenin dışında kan testi de istenir.
Örnek olarak; kan sayımı, metabolik testler, karaciğer, böbrek ve tiroit işleyişini ölçen testler
verilebilir (Lyons, 2007).
Tümör markırları, kanser veya vücutta kansere ya da iyi huylu tümörlere tepki
gösteren maddelerden yola çıkarılarak hazırlanan maddelerdir. Çoğu markır normal
hücrelerden üretilebildiği gibi, kanser hücrelerinden de üretilebilir; ancak bu kanser hücresi
ilerlemiş bir seviyede olmalıdır. Bu maddeler kanser hastalarının kanında, idrarında,
dışkısında, tümörlü dokusunda ya da başka dokularında ve vücut sıvılarında bulunabilir. Çoğu
tümör markır protein yapılıdır. Fakat son zamanlarda gen ve DNA yapısındaki değişiklikler
de tümör markır olarak kullanılmaya başlanmıştır. Bazı markırlar sadece tek bir kanser türüne
özgüyken, bazı markırlara birden çok kanser türünde rastlanabilir (American Cancer Society,
2016b). Örneğin meme kanseri için ALDH1, CD24, CD44, CD90, CD133, HER2; prostat için
ALDH1, CD44, CD133, CD166, PSA; akciğer için ALDH1, CD90, CD117, CD133, CD44 ve
PD-L1; melonoma için ALDH1, CD20, CD44, CD133, CD271; kolon kanseri için CD44,
CD24, CD166, LGR5 markırları kullanılabilir. (Medema, 2013).
Roche tarafından geliştirilen Cobas 6000 isimli cihaz rutin biyokimya testleri ile
birlikte hormon ve belirli kanser markırlarını da analiz edebilmektedir. Örnek olarak, CA 15.3
isimli kanser markırı meme kanserini saptamada kullanılmasına rağmen meme kanseri
yanında diğer durumlarda (siroz, yumurtalık ve meme kanserinin iyi huylu tümörleri) da bu
markırın seviyesinde yükselme gözlenmektedir. Benzer şekilde, CA 19.9 gastrik, pankreatik
ve mide kanserlerini göstermekle birlikte vücutta normalde gözlemlenen gastrit, göğüs ağrısı
veya gaz gibi durumlarda da artmaktadır. Diğer bir kanser markırı olan CA 125, kadınlarda
üreme sistemindeki uterus, fallopi tüpleri ve ovaryum gibi kanserleri ile ilişkilendirilmekle
birlikte pankreas, akciğer, meme ve kolon kanserlerinde de CA 125 seviyesi artmaktadır. Bu
testler ortalama 1-8 saat arasında analiz edilmektedir (Roche Diagnostic, 2015). Roche Cobas
6000 cihazı günlük sağlık taramalarında işlevsel görünse de direkt olarak kanserli ve
kansersiz hücreyi ayıramaması ve kanserli hücrelere spesifik olmaması bu cihazın
dezavantajıdır.
Bu tarama programlarının tanıtımı ve yaygın kullanımı, düzenli bir sağlık programının
parçası olarak kullanılmasına ve kanserin erken teşhisine dolayısıyla da kanser ölüm
oranlarının azalmasına olanak sağlayacaktır (Lung Cancer Founfadation of America, 2016).
1.4 Kanser Teşhisinde Mikroakışkan Yaklaşımların Kullanılması
Mikroakışkanlar, 1 µl–1000 µl arasındaki mikrokanallarda mikrolitre hacimleri
işlenmesidir. Bu tür bir rejimde, molekül konsantrasyonları iyi kontrol edildiğinden sıvı akışı
kesinlikle katmanlıdır. Mikroakışkan teknoloji, 1990'ların başında biyolojik bir araç olarak
biyoteknolojiye girmiştir. O günden bu yana, minyatürize edilmiş platformlar içinde test
edilen malzemenin manipülasyonu için iyi bilinen bu disiplinlerarası teknoloji hızla
gelişmektedir (Zhang ve Nagrath, 2013). Mikroakışkanların azalan numune boyutu ve reaktif
tüketimi, kısa işleme süreleri, gelişmiş hassasiyet, gerçek zamanlı analiz ve otomasyon gibi
kendine özgü birçok avantajı vardır. Yaşam bilimlerinde mikroakışkan tekniklerin
-8-
uygulanmasına yönelik motivasyonlardan biri, elektronik devrelerde gerçekleştirilen yoğun
deneysel süreçleri otomatikleştirmektir (Zhang ve Nagrath, 2013; Wen ve ark., 2014; Chiriacò
ve ark., 2016). Biyolojik mikroakışkan cihazlar şimdi yeni ve alışılmamış yollarla kanseri
araştırmak için kullanılabilmektedir (Zhang ve Nagrath, 2013).
Heterojenik popülasyonlardan spesifik hücrelerin yakalanması, izolasyonu ve
saflaştırışması; mikroakışkan sistemler, hücre spesifik genomik/proteomik analizleri klonal ve
popülasyon çalışmaları ile kanser ve kök hücre çalışmalarındaki hücre temelli teşhisleri içeren
çok çeşitli bilim alanlarındaki ilerlemeleri sağlamıştır. Örneğin, kandan CD4+ hücrelerinin
izolasyonu biyolojik ve farmasötik araştırmaları için HIV takibinde yaygın bir biçimde
kullanılmaktadır. Bu yöntemler karışık hücre popülasyonlarından hücreleri güçlü bir şekilde
ayıklamalarına rağmen kompleks, maaliyetli ve uzman personele ihtiyacı olması nedeniyle
hasta yatağından tedaviye (point-of-care) uygun olmamaktadırlar (Gurkan ve ark., 2011).
Ayrıca, 1 ml tam kan örneği milyarlarca kırmızı kan hücresi, milyonlarca beyaz kan hücresi,
binlerce hematopoetik kök hücre ve sadece onlarca ifade edilebilecek dolaşımdaki tümör
hücrelerini barındırmaktadır (Mittal ve ark., 2012).
Antikorlar özellikle kanser terapisindeki gibi insan terapötiklerinin geniş sınıfını
oluşturmaktadır. Tümörlerle ilişkili hücre yüzey antijenlerinin tanılanması ve onkolojide
antikor hedefleme için uygunluklarının onaylanması hem in vitro hem de in vivo anti-tümör
aktivitelerin taranmasında önemli yer teşkil etmektedir. Potansiyel olarak antijenlerin önemli
sınıfları onkolojide antikor hedeflenmesi için uygun olmakla birlikte hücre dışı matriks
proteinleri, yüzey proteinler gibi çeşitli hedeflere yönelebilirler. Tümör veya tömör ile ilişkili
olmayan hücreler gibi hedef tanılanması için biyolojik materyalin kazanılması dört ana
aşamadan ilkini oluşturmaktadır. İkinci aşama, hedef tanılanması olup DNA, mRNA, protein
ve antikor reaktivitesi gibi bu dört seviyeden birinde tümör ve normal hücreler arasındaki
farkı tanımlayı kapsamaktadır. Üçüncü ana aktivite hedefin geçerliliği olup normal ve tümör
dokularında antijenin ekspresyonunu profillemek için reaktifler olarak antikorların
üretilmesini gerektirir. Dördüncü ana aşama istenen anti-tümör aktiviteleri için antikor
panellerinin in vitro ve in vivo taranmasını sağlamalıdır (Carter ve ark., 2004).
Geleneksel olarak, kanser teşhisi, tümör dokularının örneklenmesine veya dolaylı
proteinlerin nicelenmesine bağlıdır. Çoğu zaman, bu geleneksel örnekleme yaklaşımları, doku
hasarına, sınırlı erişime, güvenilir örnekleri almaya ve yüksek düzeyde hasta rahatsızlığına
yol açmaktadır. Proteomik ve genomik araştırmalar, kan ve tükürük gibi vücut sıvıları içinde
aday kanser biyolojik belirteçlerinin bir listesini tespit etmesine rağmen, hızlı, non-invazif
tanı için hala bakım cihazlarının eksikliği bulunmaktadır. Geleneksel hücre kültür
teknikleriyle karşılaştırıldığında mikroakışkanlar, konsantrasyon gradyentlerini, hücre dışı
matris bileşenlerini ve hücre-hücre etkileşimlerini tam olarak kontrol ederek hücresel çevreye
daha iyi bir yaklaşım sunar (Zhang ve Nagrath, 2013).
Mikroakışkan teknolojisinin kanser araştırması üzerindeki etkisini göstermek için dört
ayrı alan tanımlanmıştır. Birincisi, CTC'lerin izolasyonuna, immünoafinite dayalı, boyuta
dayalı ve manyetik tabanlı ayırma yöntemleri uygulanmıştır. İkincisi, moleküler teşhis
yoluyla tümör hücrelerinin tespiti veya karakterizasyonu, tek hücreli RT-qPCR, damlacık
esaslı DNA mutasyon dizilerinden protein bulgulama analizlerine genişletilebilir. Üçüncüsü,
tümör biyolojisi çok hücreli sfero oluşumu gibi mikrokanallarda tümör hücresi göçü ve hücre
kültürlenmesini anlamaya odaklanmasıdır. Dördüncüsü, kan proteini ölçümü, ilaç kaynaklı
apoptoz ve bir ilaç test platformu çalışmak için tek hücreli diziler de dahil olmak üzere
yüksek verimli tarama sayılabilmektedir (Zhang ve Nagrath, 2013; Zeliadt, 2014) (Şekil 6).
-9-
Şekil 6. Kanser araştırmalarında mikroakışkan teknolojilerin rolü (Zhang ve Nagrath,
2013)
Bilim insanları son yıllarda dolaşımdaki tümör hücrelerinin (CTC'ler) metastazda
önemli bir rol oynadığına inanıyorlar. CTC'ler, rutin kan alımı ile elde edilebilir; bu işlem, bir
tümör biyopsisinden daha kolay ve daha az invaziv bir prosedür olduğundan tekrar etmeye
müsaittir. Birçok bilim insanı, hücrelerin erken bir aşamada kanser ve metastazları saptamak
için kullanılabileceğinden umutludur. CTC'ler doktorlara zamanla bireysel bir tümörün
moleküler imza planlamasına, tümörün terapiye olan yanıtını izlemesine ve kişisel terapilerin
geliştirilmesi için hedeflerin belirlenmesine yardımcı olabilir (Zeliadt, 2014).
Mikroakışkan sistemlerde yakalanan hücreler üzerine yapılan genomik çalışmalar
temel olarak büyük yüzey/hacim oranından dolayı kanaldaki genomik materyalin kaybını
engellemiştir. Yakalanan canlı hücrelerin geri alınması, akış yönünde bu sınırlamayı ortadan
kaldırabilir. Dahası, yakalanmış canlı hücrelerin salınımı ile izole edilen hücrelerde klonal ve
popülasyon çalışmalarına fırsat yaratmaktadır (Gurkan ve ark., 2011).
CellSearch (Janssen Diagnostics) isimli ticari mikroakışkan ürün EpCAM proteini
(epitel hücre adezyon molekülü) bağlanan bir antikor kullanarak kandan hücrelerin
yakalanmasına olanak sağlamıştır. Bu ürün, anti-EpCAM antikorları ile kaplı manyetik
partiküller kullanılarak kanda dolaşımdaki tümör hücrelerini (CTC) izole etmektedir. Bununla
birlikte, anti-EpCAM antikoru metastatik meme, kolorektal ve prostat kanserlerindeki hücre
yüzey reseptörleri ile birleşmesi nedeniyle kan gibi genel dokulardan kanser tipini belirlemesi
dezavantajdır (Miller ve ark., 2010).
Hou ve arkadaşları (2013) tarafından geliştirilen ve spiral kanallara sahip
mikroakışkan çip, kandan 10-20 µm çapındaki CTC’leri izole etmektedir. Cihaza bir kan
örneği pompalanır ve hücreler yüksek hızda kanaldan akarken, ortaya çıkan atalet ve santrifüj
- 10 -
kuvvetleri arasındaki etkileşim, kırmızı ve beyaz kan hücrelerini de içeren daha küçük
hücrelerin dış duvar boyunca akmasına neden olurken, CTC'ler ve daha büyük beyaz kan
hücreleri de dahil olmak üzere daha büyük hücreler iç duvar boyunca akar. Çipin çıkışında
kanal ikiye bölünür ve dış duvar boyunca ilerleyen hücreler bir atık kabına akarken, iç duvarın
yakınındaki hücreler daha fazla analiz için bir toplama odasına girer. Bununla birlikte, bütün
kanser hücrelerinin boyutunun büyük olmaması sebebiyle (örn., küçük hücreli akciğer kanser
hücreleri) bütün kanser hücrelerinin yakalanmasında uygulanamaz.
Bir diğer mikroakışkan kullanılarak kanser hücrelerini yakalama yaklaşımında,
araştırmacılar önce bir kan örneğini, beyaz kan hücrelerinin yüzeyi üzerinde bir proteine
bağlayan antikor kaplı manyetik mikro boncuklarla karıştırıyorlar. Daha sonra, numuneyi üç
odalı mikroakışkan aygıtlarına pompalar: birinci bölme, kırmızı kan hücreleri ve trombositleri
içeren bir kan örneğinin en küçük bileşenlerinin atık çıkışına doğru akmasına neden olan bir
dizi mikropost içerir; ikinci bölmede, geri kalan hücreler tek bir dosyaya dizilir ve cihazın
üçüncü bölmesine girer; burada, bir mıknatıs, bir mikroboncuğa bağlı beyaz kan hücrelerini
bir toplama odasına doğru yönlendirir. Geri kalan hücreler (CTC dahil) üçüncü bir toplama
odasına akar. Bu yöntemin dezavantajı, yakalanan CTC’lerin %100 saf olmamasıdır
(Ozkumur ve ark., 2013).
1.5 Projenin Amacı
Kanser, günümüzde en fazla görülen, teşhisi ve tedavisi en zor olan hastalıklardan
biridir. Kansere yakalanan insan sayısı ve ölüm oranları her geçen gün artmaktadır. Kanser,
çoğu zaman metastaz ilerledikten ve diğer dokulara yayılıp belirtileri ortaya çıktıktan sonra
teşhis edilebilmektedir. Maalesef metastaza uğradıktan sonraki aşamalarda tanısı koyulan
kanser, tedavi edilmesi açısından geç kalınmıştır. Bu sebeple kanserin erken teşhisi, tedavi
edilebilmesi için atılacak en önemli adımdır. Biyopsi, tomografi, mamografi ve MRI gibi
günümüzde kullanılmakta olan geleneksel tanı yöntemleri her ne kadar kanser teşhisinde
önemli bir rol oynasa da tanı konulma süreci uzun sürebilir ve konulan tanı yanlış olabilir.
Bununla birlikte bu yöntemler spesifik kanser türlerini teşhis etmekte oldukça yetersizdir.
Günümüzde mikroakışkan yöntemiyle kanser teşhisi adına birçok çalışma yapılsa da istenilen
sonuçları henüz sağlayamamakta olup geliştirilmeye açıktır.
Bu projede, Dünya’ da ve Türkiye’ de en çok görülen ve ölüme yol açan ilk üç kanser
çeşidi olan meme, akciğer ve prostat kanserlerinin hızlı, doğru ve mikroakışkan yaklaşımla
yakalanması amaçlanmıştır. Bu amaç doğrultusunda geliştirilen mikroakışkan tanı çipi iki
aşamalı olarak çalışmaktadır. İlk aşama, kanserli hücrelerde ifadesi artan CD44 ve CD90
hücre yüzey proteinlerini yakalamayı sağlayan ve bu sayede kanserli hücre ile normal hücreyi
ayıran düzenektir. İkinci aşama ise yukarıda belirtilen üç kanser hücre hattına spesifik hücre
yüzey reseptörlerinin (akciğer kanseri için PD-L1, meme kanseri için HER2, prostat kanseri
için PSA) yakalamayı sağlayan ve bu sayede kansere spesifik olarak teşhisine olanak sağlayan
düzenektir. Sonuç olarak, toplumda en yaygın görülen bu kanser tiplerinin güvenilir, yüksek
doğrulukla, hızlı ve ekonomik bir mikroakışkan çip tasarlanarak kanser hastalarının erken
teşhisinin sağlanması ve dolayısıyla erken tedaviye başlanılarak bu hastaların sağkalım
oranlarının yükseltilmesi hedeflenmiştir.
2. YÖNTEM
Projemizde deney planımız 3 aşamadan oluşmaktadır. İlk aşamada, kanser hücrelerini
yakalayacak olan mikroakışkan çipi tasarlamak için PMMA, DSA ve cam malzemelerini lazer
kesici ile oluşturduk. İkinci aşamada, dizayn edilen çipin hedeflenen kanseri yakalaması için
cam malzemenin yüzey kimyası protein G temelli kansere özgü antikorlar ile değiştirilerek ilk
aşamada üretilen PMMA ve DSA ile birleştirerek iki farklı çip ürettik. Son aşamada ise
- 11 -
mikroakışkan temelli çiplerin kanserin erken teşhisinde kullanılması araştırılmıştır: akciğer,
meme ve prostat kanser hücrelerinin üretilen ilk çiple kanserli hücre olup olmadığı ikinci
çiple ise spesifik olarak hangi kansere ait olduğunun saptanması hedeflenmiştir.
2.1 Materyal
Bu projede, RPMI 1640 (Gibco 11875-093), DMEM (Dulbecco’s Modified Eagle’s
Medium) Lonza (İsviçre), Fetal Bovin Serum (FBS) Sigma (ABD), Penisilin ve Streptomisin,
esansiyel olmayan aminoasitler ve Tripsin-EDTA Biological Industries (İsrail) kanserli hücre
hatlarının büyütülmesinde; Phosphate Buffer Saline (tuzlu fosfat tamponu=PBS) (14190-136,
Gibco Utah, USA) kanser hücrelerinin seyreltilmesinde ve mikroakışkan çiplerin
yıkanmasında; Poli-metil metakrilat (PMMA) (McMaster-Carr, Atlanta, GA), double-sided
adhesive film (çift taraflı bant=DSA) (3M, Scotch Plains, NJ, USA) mikroakışkan çip
fabrikasyonunda; (3-Mercaptopropyl) trimethoxysilane (3-MPS) (175617, Sigma-Aldrich, St
Louis, USA), 4-Maleimido butyric acid N-hydroxysuccinimide ester (GMBS) (63175, SigmaAldrich, St Louis, USA), Etanol (Merck, Darmstadt, Germany), Protein G (Thermo Fisher
Scientific, 21193, Pierce, USA), CD44 antikoru (Santa Cruz Biotechnology, sc-7297, CA,
USA), CD90 antikoru (Miltenyi Biotec, CA, USA), PD-L1 (programmed cell death protein 1)
antikoru (Cell Signaling Technology, E1L3N, MA, USA), HER2 (human epidermal growth
factor receptor 2) antikoru (Cell Signaling Technology, 29D8, MA, USA), PSA (prostat
spesifik antikor) antikoru (Abcam, ab76113, MA, USA), Bovine serum albümin (SigmaAldrich, A2153, Milan, Italy) mikroakışkan çipin yüzey kimyasının oluşturulmasında ve
kanser hücrelerine özgü antikorların bağlanmasında kullanılmıştır.
Küçük hücreli olmayan akciğer kanseri (NSCLC) örneği olarak A549 (ATCC® CCL185™) insan akciğer epitel karsinoma hücre hattı, prostat kanseri örneği olarak LNCaP
(ATCC® CRL-1740™) insan prostat karsinom hücre hattı ve meme kanseri örneği olarak
MCF7 (ATCC® HTB-22™) insan meme bezi adenokarsinom hücre hattı Ege Üniversitesi
Tıp Fakültesi Tıbbi Biyoloji Bölümü’nden temin edilmiştir. Küçük hücreli akciğer kanseri
(SCLC) örneği olarak H69 (ATCC® HTB-119™) insan akciğer karsinoma hücre hattı ile
H69AR (ATCC® CRL-11351™) insan akciğer karsinom hücre hattı ve bir diğer meme
kanseri örneği olarak SK-BR-3 (ATCC® HTB-30™) insan meme bezi adenokarsinom hücre
hattı Dokuz Eylül Üniversitesi Tıp Fakültesi İzmir Genom ve Biyotıp Merkezi’nden temin
edilmiştir.
2.2 Hücre Kültür Şartları
A549, H69, H69AR akciğer kanser hücre hatları ve LNCaP prostat kanseri hücre hattı,
% 1 L-Glutamin, 100 U/ml penisilin/streptomisin ve % 10 inaktif fetal sığır serum (FBS)
içeren RPMI–1640 besiyerinde; MCF7 ve SK-BR-3 meme kanseri hücre hatları, 1%
penisilin/streptomisin, % 10 inaktif fetal sığır serum (FBS), 10ug/ml insülin içeren DMEM
besiyerinde 37°C‘ de, % 5 CO2‘ li inkübatörde çoğaltılmıştır.
Kültüre edilen hücrelerin canlılıklarını ve sayılarını takip etmek amacıyla Tripan
mavisi boyası testi kullanılmıştır. Buna göre, 50 μl hücre ile 50 μl boya karıştırılarak, ışık
mikroskobu altında hücrelerin canlılıkları ve sayıları Neubauer lam kullanılarak
değerlendirilmiştir. Bu amaçla, Neubauer lamında bulunan 4x4‘ lük karelerden oluşmuş 4
alandaki hücreler sayılmıştır. Tripan mavisi boyası testi gereğince boyayı içine alıp mavi
renkte boyanan hücreler ölü, boyayı içine almayanlar ise canlı olarak değerlendirilmiştir.
Canlı hücre toplamının ortalaması alınıp 20.000 ile çarpılmasıyla, ml başına düşen canlı hücre
sayısı saptanmıştır. Aynı işlem ölü hücreler için de gerçekleştirildiğinde, ml başına düşen ölü
hücre sayısı belirlenmiştir. Hücre canlılığı ise, toplam hücre sayısının canlı hücrelere %
oranıyla belirlenmiştir.
- 12 -
Mikroakışkan çip denemelerinde kullanılmak üzere hücre hatlarının sayıları
belirlendikten sonra PBS (tuzlu fosfat tamponu) tamponunda uygun seyreltmelerde 104, 103,
102 hücre/ml olacak şekilde ayarlanmıştır.
2.3 Mikroakışkan Temelli Çiplerin Fabrikasyonu
Spesifik olarak erken kanser teşhisi için iki mikroakışkan çip tasarlanmıştır. Birinci
mikroakışkan çip, kanserli hücrelerde ifadesi artan CD44 ve CD90 hücre yüzey proteinlerini
yakalamayı sağlayan ve bu sayede kanserli hücre ile normal hücreyi ayıran platformdur.
İkinci mikroakışkan çip ise yukarıda belirtilen üç kanser hücre hattına spesifik hücre yüzey
reseptörlerini (akciğer kanseri için PD-L1, meme kanseri için HER2, prostat kanseri için
PSA) yakalamayı sağlar ve bu sayede kansere spesifik olarak teşhisine olanak tanır.
Her iki mikroakışkan çip 24 mm x 60 mm boyutlarında olup birinci mikroakışkan çip,
yan yana duran 10 µl hacime sahip iki adet S-şekilde kıvrımlı mikrokanallara sahipken ikinci
mikroakışkan çip, yan yana duran 7 µl hacime sahip üç adet S-şekilde kıvrımlı mikrokanallara
sahiptir. Her iki mikroakışkan çip 3 adet S’nin birbirini takip etmesinden oluşur ve kanalın
uzunluğu 152 mm, kanalın genişliği 1 mm ve derinliği 50 µm olacak şekilde dizayn
edilmiştir. 3,175 mm kalınlığa sahip Poli-metil metakrilat (PMMA) (McMaster-Carr, Atlanta,
GA) ve 50 µm kalınlığında çift tarafı yapışkan film (DSA) (3M, Scotch Plains, NJ) lazer
kesici (Universal VersaLaser VLS 2.30, Scottsdale, AZ) ile CorelDraw vektörel çizim
programı ile çizilen tasarım kesilerek PMMA ve DSA birleştirilmiştir. PMMA üzerine kanal
giriş çıkışlarına 0,65 mm çapında delikler açılarak mikropipet uçlarının girmesine olanak
sağlanmıştır (Zhang ve ark., 2011; Wang ve ark., 2012). Şekil 7’ de CorelDraw’da çizilen
mikroakışkan temelli çiplerin tasarımı görülmektedir.
Şekil 7. Kansere spesifik olan mikroakışkan çiplerin teknik çizimleri. I: birinci
mikroakışkan çipin sırasıyla üstten görünümü (A), PMMA (B) ve DSA (C) kesim noktaları.
II: ikinci mikroakışkan çipin sırasıyla üstten görünümü (A), PMMA (B) ve DSA (C) kesim
noktaları.
Cam ile birleştirilmeden önce yüzey kimyasının tutunabilmesi için camlar 0,1 Torr
basınç altında 100 W oksijen plazmada 3 dakika bekletilmiş ve sırasıyla taban camı-DSAPMMA olacak şekilde birleştirme işlemi gerçekleştirilmiştir (Lim ve Lee, 2004; Wang ve
ark., 2012) (Şekil 8).
- 13 -
Şekil 8. Plazma işleminin aşamaları. A: cam malzemenin plazma cihazına
yerleştirilmesi. B: yerleştirilmiş cam malzemeler. C: plazma cihazında işlemin gerçekleşmesi.
D: Plazma işlemine uğrayan taban camının DSA ve PMMA ile birleştirilmesi.
2.4 Mikroakışkan Çiplerin Yüzey Kimyasının Oluşturulması
Yüzey kimyasının hazırlanmasında ilk olarak kanalların içerisine 200 mM etanol
içerisinde çözülmüş 100 µl (3-Mercaptopropyl) trimethoxysilane (3-MPS) (175617, SigmaAldrich), doldurularak 30 dakika oda sıcaklığında inkübasyona bırakılmıştır. Sonrasında 100
µl 2 mM 4-Maleimidobutyric acid N-hydroxysuccinimide ester (GMBS) (63175, SigmaAldrich) ile kanallar doldurulup 35 dakika oda sıcaklığında inkübe edilmiştir. Sonrasında 100
µl etanol ve arkasından 100 µl Phosphate Buffer Saline (PBS) (14190-136, GIBCO) ile üç kez
mikrokanallar yıkanmıştır (Zhang ve ark., 2011; Wang ve ark., 2012).
Sonrasında her iki mikroakışkan çipin ilgili kanallara antikor sabitlemeyi sağlamak
amacı ile birinci mikroakışkan çip 10 µl, ikinci mikroakışkan çip 7 µl 100 µg/ml Protein G
(21193, Pierce, Thermo Fisher Scientific) ile kaplanmıştır. Arkasından tüm mikrokanallar üç
kez 30 µl PBS ile yıkanmıştır. Daha sonra, ilgili her mikrokanala üretici tarafından önerilmiş
1/50 oranında seyreltilmiş 10 µl CD44, CD90, PD-L1, HER2 ve PSA antikorları pipetlenmiş
ve 1 saat oda sıcaklığında inkübasyona bırakılmıştır. Yüzeyde kalan açık Protein G’ ler 30 µl
PBS ile yıkanmıştır. Daha sonra 10 µl %1 Bovine serum albumin (BSA) (A2153, SigmaAldrich) nötralize edilmiş ve son olarak 30 µl PBS ile ikinci kez yıkanmıştır (Zhang ve ark.,
2011; Wang ve ark., 2012). Şekil 9’da iki mikroakışkan çipin yüzey kimyasının
oluşturulmasının basamakları görülmektedir.
Şekil 9. Kansere spesifik mikroakışkan çiplerin yüzey kimyasının değiştirilme
basamakları görülmektedir. A: plazma işlemi sonucunda fabrikasyonu yapılan mikroakışkan
çipler. B: 3-MPS uygulaması. C: GMBS uygulanması. D ve E: PBS ile yıkama. F ve G:
Protein G uygulanması H: antikorların yüklenmesi. I: BSA ile nötralizasyon. J: Kansere
spesifik mikroakışkan çipler.
- 14 -
2.5 Kanser Hücre Hatlarının Mikroakışkan Çiplerde Analiz Edilmesi
Mikroakışkan çip üzerinde akciğer, meme ve prostat kanser hücre hatlarının analizi
için daha önceden uygun sıvı besiyerinde büyütülmüş ve PBS tamponunda son
konsantrasyonu koloni sayısı 104, 103, 102 hücre/ml olacak şekilde ayarlanmıştır. Her hücre
hattı iki mikroakışkan çipin bütün kanallarında üç tekrarlı olarak çalışılmıştır. Daha sonra,
mikroakışkan çiplerin hücre yakalamasını denemek için birinci mikroakışkan çipe 10 µl,
ikinci mikroakışkan çipe 7 µl akciğer, meme ve prostat kanser hücre hatları örneği
fonksiyonel olan çipin mikrokanallarına nazik bir şekilde pipetlenmiş ve 15 dakika 37 °C’ de
inkübe edilmiştir. İnkübasyonu takiben, mikrokanallar 30 µl PBS tamponu ile yıkanmıştır
(Zhang ve ark., 2011; Wang ve ark., 2012). Yıkama işleminden sonra, mikroakışkan çip
tarafından yakalanan hücreler mikroskop (Leica DM 750 microscope (Leica Microsystems
Heidelberg, Mannheim, Germany)) ile görüntüsü alınmıştır. Şekil 10’ da farklı kanser
hücrelerinin mikroakışkan çiplerde yakalanma aşamaları gösterilmiştir.
Şekil 10. Kanser hücrelerinin Neubauer lamda sayımı ve mikroakışkan çiplerde
denemesi. A: kültüre edilmiş MCF-7 hücresi. B: Neubauer lamda hücre sayımı. C: H69
hücresinin mikroakışkan çipe uygulanması. D: İnkübasyon sonunda mikroakışkan çiplerin
mikroskopta incelenmesi.
3. BULGULAR
Bu projede, günümüzde en fazla görülme ve ölüm oranına sahip olan akciğer, meme
ve prostat kanserlerinin erken teşhisine imkan sağlayacak mikroakışkan temelle çalışan
kansere spesifik iki mikroakışkan çip tasarlanmıştır. Bu amaç doğrultusunda; PMMA, DSA
ve cam malzemeler tercih edilmiştir. Çipin temel parçalarını oluşturan bu üç malzeme de
şeffaf olması ve işlem sonucunda örneklerin mikroskop altında incelenmesine olanak
sağladığından tercih edilmiştir. Mikroakışkan çip tasarlandıktan sonra sistemde sıvı akışının
düzgün olup olmadığı ve sistemin sıvı kaçırıp kaçırmadığı bütün mikrokanallara Orange G
boyası eklenerek incelenmiştir. Deneme sonucunda, mikrokanalların sıvı kaçırmadığı ve
eklenen sıvının kanallardan belirtilen yolu takip ettiği görülmüştür (Şekil 11). Sıvı akışkanlığı
denemelerinden sonra, birinci mikroakışkan çipin her iki kanalının hacmi 10 µl iken ikinci
mikroakışkan çipin her üç kanalının hacmi 7 µl olduğu bulunmuştur.
Şekil 11. Orange G boyası eklenen mikroakışkan çiplerin görünümü.
- 15 -
Daha sonra, mikroakışkan çiplerin yüzey kimyası değiştirilerek montajı
gerçekleştirilmiştir. Tasarlanan mikroakışkan çiplerin hedeflenen kanser hücrelerini
tutabilmesi için sırasıyla çipin alt parçası olan camın yüzey kimyası plazma uygulaması ile
değiştirilmiştir. Ardından altta cam, ortada mikrokanalları taşıyan ve alt ve üst parçaların
yapışmasını sağlayan DSA, en üstte PMMA bulunacak şekilde her iki mikroakışkan çip
monte edilmiştir. Montajı tamamlanan çipler, değişen yüzey kimyasından faydalanılarak her
kanalın spesifik bir antikora özgü olabilmesi için sırasıyla; 3-MPS, GMBS ve Protein G ile
pipetlenmiş ve her bir mikrokanala ilgili antikorlar pipetlenerek mikrokanallar kanser
hücrelerine spesifik hale getirilmiştir. Şekil 12’de montajı ve yüzey kimya modifikasyonu
tamamlanmış mikroakışkan çipler görülmektedir.
Şekil 12. Montajı ve yüzey kimya modifikasyonu tamamlanmış mikroakışkan çipler.
Geliştirilen iki mikroakışkan çip toplamda beş antikor bağlı olup yukarıda bahsedilen
farklı kanser hücre hatları çoğaltıldıktan sonra mikroakışkan çiplerde denenmiştir. Bunun için
her hücre hattı uygun seyreltmelere getirildikten sonra bütün mikrokanallarda denenmiştir.
Bütün hücreler mikrokanallarda 37 °C’ de 15 dakika inkübe edilip PBS ile yıkandıktan sonra
hücrelerin tutunup tutunmadıkları mikroskop altında incelenmiştir.
Küçük hücreli akciğer kanseri (SCLC) örneği olan H69 (ATCC® HTB-119™) insan
akciğer karsinoma hücre hattı, birinci mikroakışkan çipte denendikten sonra CD90 antikorunu
içeren mikrokanalda kuvvetli bir şekilde tutunmuşken, CD44 antikorunu içeren mikrokanalda
sadece birkaç hücrenin tutunduğu gözlemlenmiştir. H69 hücreleri ikinci mikroakışkan çipte
PD-L1, HER2 ve PSA antikorunu içeren mikrokanallarda tutunmadığı gözlemlenmiştir. Bir
diğer küçük hücreli akciğer kanseri örneği olan H69AR (ATCC® CRL-11351™) insan
akciğer karsinom hücre hattı birinci mikroakışkan çipte denendikten sonra hem CD44 hem de
CD90 mikrokanallarında çok miktarda tutundukları gözlemlenmiştir. H69AR hücreleri, H69’a
benzer şekilde ikinci mikroakışkan çipte her üç mikrokanalda da bulunmadığı saptanmıştır.
Her iki hücre konsantrasyonu 104, 103, 102 hücre/ml olduğunda mikroçipin hücreleri tuttuğu
görülmüştür. Şekil 13’ te H69 hücrelerinin ve Şekil 14’te H69AR hücrelerinin
mikrokanallardaki mikroskop altındaki görüntüleri verilmektedir.
Şekil 13. H69 hücrelerinin iki mikroakışkan çipteki beş farklı mikrokanaldaki
mikroskop görüntüleri.
- 16 -
Şekil 14. H69AR hücrelerinin iki mikroakışkan çipteki beş farklı mikrokanaldaki
mikroskop görüntüleri.
Küçük hücreli olmayan akciğer kanseri (NSCLC) örneği olarak A549 (ATCC® CCL185™) insan akciğer epitel karsinoma hücre hattı, birinci mikroakışkan çipte denendikten
sonra CD90 antikorunu içeren mikrokanalda kuvvetli bir şekilde tutunmuşken, CD44
antikorunu içeren mikrokanalda tutunmadığı gözlemlenmiştir. A549 hücreleri ikinci
mikroakışkan çipte PD-L1 mikrokanalında yakalanmışken, HER2 ve PSA antikorunu içeren
mikrokanallarda yakalanmadığı gözlemlenmiştir. Hücre konsantrasyonu 104, 103, 102
hücre/ml olduğunda mikroçipin hücreleri tuttuğu görülmüştür. Şekil 15’te A549 hücresinin
mikrokanallardaki görüntüleri verilmektedir.
Şekil 15. A549 hücresinin iki mikroakışkan çipteki beş farklı mikrokanaldaki
mikroskop görüntüleri.
Meme kanseri örneği olarak MCF7 (ATCC® HTB-22™) insan meme bezi
adenokarsinom hücre hattı, birinci mikroakışkan çipte denendikten sonra CD44 ve CD90
antikorunu içeren mikrokanallarda yakalandığı gözlemlenmiştir. MCF7 hücreleri ikinci
mikroakışkan çipte HER2 mikrokanalında kuvvetli bir şekilde yakalanmışken, PD-L1 ve PSA
antikorunu içeren mikrokanallarda yakalanmadığı gözlemlenmiştir. Bir diğer meme kanseri
örneği olarak SK-BR-3 (ATCC® HTB-30™) hücre hattında da aynı bulgulara ulaşılmıştır.
Her iki hücre konsantrasyonu 104, 103, 102 hücre/ml olduğunda mikroakışkan çipin hücreleri
tuttuğu görülmüştür. Şekil 16’da MCF7 hücrelerinin ve Şekil 17’de SK-BR-3 hücrelerinin
mikrokanallardaki mikroskop altındaki görüntüleri verilmektedir.
Şekil 16. MCF7 hücresinin iki mikroakışkan çipteki beş farklı mikrokanaldaki
mikroskop görüntüleri.
- 17 -
Şekil 17. SK-BR-3 hücresinin iki mikroakışkan çipteki beş farklı mikrokanaldaki
mikroskop görüntüleri.
Prostat kanseri örneği olarak LNCaP (ATCC® CRL-1740™) insan prostat karsinom
hücre hattı, birinci mikroakışkan çipte denendikten sonra CD44 antikorunu içeren
mikrokanalda yakalanmışken, CD90 antikorunu içeren mikrokanalda yakalanmadığı
gözlemlenmiştir. LNCaP hücreleri ikinci mikroakışkan çipte PSA mikrokanalında güçlü bir
şekilde yakalanmışken, HER2 ve PD-L1 antikorunu içeren mikrokanallarda yakalanmadığı
gözlemlenmiştir. Hücre konsantrasyonu 104, 103, 102 hücre/ml olduğunda mikroçipin
hücreleri tuttuğu görülmüştür. Şekil 18’de LNCaP hücresinin mikrokanallardaki görüntüleri
bulunmaktadır.
Şekil 18. LNCaP hücresinin iki mikroakışkan çipteki beş farklı mikrokanaldaki
mikroskop görüntüleri.
Tüm hücre hatlarının iki mikroakışkan çipteki sonuçları Çizelge 1’de özetlenmiştir.
Çizelge 1. Mikroakışkan çiplerde yakalanan kanser hücreleri.
Prostat
kanser
hattı
Meme
kanser
hatları
Akciğer
kanser
hatları
Hücreler
Birinci mikroakışkan çip
İkinci mikroakışkan çip
CD44
CD90
PD-L1
HER2
PSA
H69
z
++
-
-
-
H69AR
++
++
-
-
-
A549
-
++
+
-
-
MCF7
+
+
-
++
-
SK-BR-3
+
+
-
++
-
LNCaP
+
-
-
-
++
-: tutunmamış, z: zayıf, +: tutunmuş, ++: kuvvetli tutunmuş.
- 18 -
4. SONUÇLAR VE TARTIŞMA
Biyomedikal alanda heterojenik popülasyondan spesifik hücrelerin yakalanması, izole
edilmesi ve saflaştırılması; genomik, proteomik ve popülasyon çalışmalarında oldukça
önemlidir. Hücre temelli teşhise olanak sağlayan mikroakışkan sistemler geliştirilmeye açık
bir alandır (Gurkan ve ark., 2011). Bu projede, günümüzde en fazla görülme ve ölüm oranına
sahip olan akciğer, meme ve prostat kanserlerinin güvenilir ve erken teşhisine imkan
sağlayacak mikroakışkan temelle çalışan kansere spesifik iki mikroakışkan çip tasarlanmıştır.
Günümüzde kullanılan kanser teşhis yöntemlerinin cevabı uzun sürdüğünden doktor
ve hasta için zaman kaybına yol açar. Kanser gibi erken teşhisin hayati önem taşıdığı
hastalıklarda, teşhis süresinin uzun olması oldukça büyük bir dezavantajdır. Kanserin
heterojenik yapısı, çoğu zaman inceleyen uzmanı yanlış yönlendirip yanlış tanı konulmasına
sebep olabilir. Bu nedenle kanserin doğru teşhisi ve aşamalandırılması hastanın iyileşme ve
sağkalım sürecini büyük oranda etkiler. Buna ek olarak, cihaz kullanılan tanı yöntemleri,
kansere spesifik olmamakla birlikte maliyeti yüksektir. Bu sebeplerden dolayı, yanlış teşhisi
en aza indiren, 15 dakika gibi kısa bir sürede kansere spesifik sonuç veren ve uzmanlara
kolaylık sağlayan iki adet mikroakışkan çip üretilerek bu sorunların önüne geçilmiştir.
Ürettiğimiz mikroakışkan temelli kanser teşhis yöntemi yüzey antijenleriyle antikor
uyumuna dayanmaktadır. Birinci mikroakışkan çipte, hücre hattında kanserli hücre olup
olmadığını anlamak için, normal hücrelerin yüzeyinde çok az veya hiç ifade edilmeyen ancak
birçok kanser türünde ifade edilen hücre yüzey proteinlerine bağlanan CD44 ve CD90
antikorları kullanılmıştır (Medema, 2013; American Cancer Society, 2016b; Leon ve ark.,
2016). CD44 glikoprotein yapısında olup; hücre membranında çoğalma, farklılaşma, göç ve
angiogeneziz gibi çok hücreli canlılarda görev alan çok fonksiyonlu bir yüzey antijenidir.
CD90 antijeni özellikle lökosit hücreleri başta olmak üzere hücre-hücre ve hücre-matriks
etkileşimlerinde ifade edilen hücre yüzey glikoproteinidir (Leon ve ark., 2016). Bu
özelliklerinden dolayı birinci mikroakışkan çipte, normal hücrelerden kanserli hücreleri ayırt
etmede tercih edilmiştir.
İlk mikroakışkan çipte saptadığımız olası kanser hücrelerinin, hastanın en sık görülen
kanser türlerinden hangisine yakalandığını belirlemek için ikinci mikroakışkan çipte
denenmiştir. PD-L1 (Programlanmış ölüm-ligand 1) 40 kDa bir transmembran protein olup ve
bağışıklık sistemi baskılandığında akciğer kanser hücrelerinde ifadesi artan bir yüzey
proteinidir (Kerr ve Nicolson, 2016). HER2 (insan epidermal büyüme faktör reseptörü 2),
meme kanser hücrelerinin metastatik tiplerinde bol miktarda ifade edilmektedir (Kim ve ark.,
2017). Son olarak, PSA (prostat spesifik antijen), prostat kanserine özgü bir organik antijen
olup epitelinden türeyen hücrenin yüzeyinde bulunan bir serin proteaz glikoproteindir (Balk
ve ark., 2003). Dolayısıyla ikinci mikroakışkan çipte kanser spesifikliğini arttırmak için
literatür özenle taranmış ve akciğer kanseri için PD-L1, meme kanseri için HER2, prostat
kanseri için PSA antikorları tercih edilmiştir.
Birinci mikroakışkan çipte bulunan CD44 mikrokanalının H69AR, MCF7, SK-BR-3
ve LNCaP hücrelerini; CD90 mikrokanalının H69, H69AR, A549, MCF7 ve SK-BR-3
hücrelerini yakalaması literatürle benzer sonuçlar vermiştir. Dolayısıyla ilk mikroakışkan çip
akciğer, meme ve prostat kanseri için tarama testi niteliğinde olmuştur.
İkinci mikroakışkan çipte bulunan PD-L1 mikrokanalının sadece A549 akciğer kanser
hücrelerini; HER2 mikrokanalının MCF7 ve SK-BR-3 meme kanser hücrelerini; PSA
mikrokanalının sadece LNCaP prostat kanser hücrelerini yakaladığı bulunmuştur. Bu
sonuçlara dayanarak, ilk mikroakışkan çipte saptanan hücrenin hangi yaygın kanser hücresi
olduğu ikinci çip ile doğrulanmıştır. Ayrıca PD-L1 mikrokanalında küçük hücreli olmayan
akciğer kanseri hücresi yakalanırken (A549); küçük hücreli akciğer kanser (H69 ve H69AR)
- 19 -
hücreleri yakalanmaması akciğer kanserinin iki büyük tipinin ayırt edilmesine de olanak
sağlamıştır.
Sonuç olarak etkili, kullanımı kolay, maliyeti düşük, hızlı ve kansere spesifik, tıpta
yeni nesil teşhise olanak sağlayacak bir yaklaşım sunulmuştur.
5. ÖNERİLER
Yukarıdaki özelliklerinden dolayı bu projede geliştirilen mikroakışkan çipler, sadece
bu araştırmada olduğu gibi hücre hatlarında değil heterojen hücre popülasyonlarının
bulunduğu kan veya spesifik doku örneklerinde de denemelerde kullanılabilir. Ancak bu proje
kapsamında TÜBİTAK proje rehberinde belirtilen sebeplerden dolayı heterojen biyolojik
örneklerle çalışılamamıştır.
Proje kapsamında mikroakışkan çiplerin yüzey modifikasyonu sonucunda istenilen
hedef hücre doğrultusunda kullanılan antikorlar değiştirilerek diğer kanser türlerine de
uygulanabileceği düşünülmektedir. Aynı zamanda herhangi bir kanserin alt tipini belirlemede
PD-L1 antikorunun bulunduğu mikrokanal örneğinde olduğu gibi uygun antikorlar seçilerek
kanser alt tiplerinin sınıflandırılması da yapılabilir.
Projede mikroakışkan çip, kanser hücrelerinin yakalanmasına olanak sağlayacak
şekilde gerçekleştirilmiştir. Ancak yakalanan hücrelerin genetik ve moleküler biyolojik
özelliklerinin ileriki araştırmalarda kullanılması için hücrelerin izolasyonu elzemdir. Bu
sebeple mikroakışkan çipin yüzey modifikasyonunda Protein G aşamasından önce farklı
sıcaklık ya da pH ile kolayca ayrılmasını sağlayacak linkerlar yapıya eklenerek yakalanan
hücrelerin izolasyonuna olanak sağlanabilir.
Bu proje kapsamında gerçekleştirilen mikroakışkan çipler sadece kanser hücrelerinin
değil, dolaşım sistemi ile saptanması çok zor olan sirküle tümör kök hücrelerinin (CTC) de
yakalanmasında kullanılabilir.
KAYNAKLAR
Ahmed N., Dawson M., Smith C. ve Wood E. (2007), Cancer. Biology of Disease,
sayfa 475-514.
American Cancer Society, (2016a), What is prostate cancer?, Erişim Tarihi:
28.11.2016, http://www.cancer.org/cancer/prostatecancer/%20detailedguide/prostate-cancerwhat-is-prostate-cancer
American Cancer Society, (2016b), How are laboratory tests used in cancer medicine?,
Erişim
Tarihi:
28.11.2016,
https://www.cancer.gov/about-cancer/diagnosisstaging/understanding-lab-tests-fact-sheet
Balk, S.P., Ko, Y.J., Bubley, G.J. (2003), Biology of prostate-spesific antigen. Journal
of Clinical Oncology, 21(2): 383-391.
Beckmann, M.W., Niederacher, D., Schnurch, H.G., Gusterson, B.A., Bender, H.G.
(1997). Multistep carcinogenesis of breast cancer and tumor heterogeneity. Journal of
Molecular Medicine, Vol. 75, pp. 429-439.
Carter, P., Smith, L., Ryan, M. (2004), Identification and validation of cell surface
antigens for antibody targeting in oncology. Endocrine-Related Cancer. 11: 659–687.
Chiriacò, M.S., Primiceri, E., De Feo, F., Montanaro, A., Monteduro, A.G., Tinelli, A.,
Megha, M., Carati, D., Maruccio, G. (2016), Simultaneous detection of multiple lower genital
tract pathogens by an impedimetric immunochip, Biosensors and Bioelectronics, 79: 9-14.
- 20 -
Dimri, G., Band, H., Band, V. (2005), Mammary epithelial cell transformation:
insights from cell culture and mouse models, Breast Cancer Research, 7: 171-179.
Dünya Sağlık Örgütü, (2015), Kanser,
http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs297/en/.
Erişim
Tarihi:
21.11.2016,
Etzioni, R., Urban, N., Ramsey, S., McIntosh, M., Schwartz, S., Reid, B., Radich, J.,
Anderson, G., Hartwell, L. (2003), The case for early detection. Nature Review Cancer, 3(4):
243-252.
Giuliano, A.,E., 2009. Breast disorders. Current Medical Diagnosis & Treatment. 48th
ed. McGraw-Hill Companies, Inc. USA, sayfa 630-654.
GLOBOCAN, (2012), 2012 yılında dünya çapında kanser insidans ve mortalite
oranları, Erişim Tarihi: 21.11.2016, http://globocan.iarc.fr/Pages/fact_sheets_population.aspx
Gurkan, U.A., Anand, T., Tas, H., Elkan, D., Akay, A., Keles, H.O., Demirci, U.
(2011), Controlled viable release of selectively captured label-free cells in microchannels. Lab
on a Chip, 11: 3979-3989.
Hou, H.W., Warkiani, M.E., Khoo, B.L., Li, Z.R., Soo, R.A., Tan, D.S.-W., Lim, W.T., Han, J., Bhagat, A.A.S., Lim, C.T. (2013), Isolation and retrieval of circulating tumor cells
using centrifugal forces. Nature Scientific Report, 3:1259, 1-8.
Kerr, K.M., Nicolson, M.C. (2016), Non-Small Cell Lung Cancer, PD-L1, and the
Pathologist. Archives of Pathology & Laboratory Medicine, 140: 249-254.
Kim, J., Pareja, F., Weigelt, B., Reis-Filho, J.S. (2017), Prediction of Trastumab
Benefit in HER2-Positive Breast Cancers: is it in the Intrinsic Subtype?. Journal of the
National Cancer Institute. 109(2): djw218.
Köktürk N, Öztürk C, Kırısoglu CE. (2003), Akciğer kanseri moleküler biyolojisi.
Solunum Dergisi, 5: 127-138.,
Leon, G., MacDonagh, L., Finn, S.P., Cuffe, S., Barr, M.P. (2016), Cancer stem cells
in drug resistant lung cancer: Targetting cell surface markers and signaling pathways.
Pharmacology Therory,158:71-90
Lim, K.-B., Lee, D.-C. (2004), Surface modification of glass and glass fibres by
plasma surface treatment. Surface and Interface Analysis, 36: 254–258. Pharmacology and
Therapeutics, 158: 71 – 90.
Lung Cancer Founfadation of America, (2016), Is early diagnosis important? Erişim
Tarihi:
25.11.2016,
http://lcfamerica.org/lung-cancer-info/detection/is-early-diagnosisimportant/
Lyons, L. (2007), The Biology of the Cancer: Diagnosis and Treatment of Cancer,
sayfa 11 – 42.
Masso-Welch, P.A., Darcy, K.M., Stangle-Castor, N.C., Ip, M.M. (2000), A
Developmental Atlas of Rat Mammary Gland Histology. Journal of Mammary Gland Biology
and Neoplasia, 5(2): 165 – 185.
Medema, J.P. (2013), Cancer stem cells: the challenges ahead. Nature Cell Biology,
15(4):338-344.
Miller, M.C., Doyle, G.V., Terstappen, L.W.M.M. (2010), Significance of Circulating
Tumor Cells Detected by the CellSearch System in Patients with Metastatic Breast Colorectal
and Prostate Cancer. Journal of Oncology,
- 21 -
Mittal, S., Wong, I.Y., Deen, W.M., Toner, M. (2012), Antibody-functionalized fluidpermeable surfaces for rolling cell capture at high flow rates. Biophysical Journal, 102: 721730.
Ozkumur, E., Shah, A.M., Ciciliano, J.C., Emmink, B.L., Miyamoto, D.T., Brachtel,
E., Yu, M., Chen, P., Morgan, B., Trautwein, J., Kimura, A., Sengupta, S., Stott, S.L.,
Karabacak, N.M., Barber, T.A., Walsh, J.R., Smith, K., Spuhler, P.S., Sullivan, J.P., Lee, R.J.,
Ting, D.T., Luo, X., Shaw, A.T., Bardia, A., Sequist, L.V., Louis, D.N., Maheswaran, S.,
Kapur, R., Haber, D.A., Toner, M. (2013), Inertial Focusing for Tumor Antigen–Dependent
and –Independent Sorting of Rare Circulating Tumor Cells. Science Translational Medicine,
5: 179, 179ra47.
Roche Diagnostic, (2015), Products and Solutions, Erişim Tarihi: 05.12.2016
http://www.cobas.com/content/dam/cobas_com/pdf/lists/Products-Solutions-2015interactive.pdf
Rom, W.N., Hay, J.G., Lee, T.C., Jiang, Y., Tchou-Wong, K.M. (2000), Molecular
and genetic aspects of lung cancer. American Journal of Respiratory and Critical Care
Medicine, 161: 1355-1367.
Sağlık Bakanlığı, (2016), Türkiye Kanser İstatistikleri. Erişim Tarihi: 05.12.2016
http://kanser.gov.tr/daire-faaliyetleri/kanser-istatistikleri.html
Siegel, R., Naishadham, D., Jemal, A. (2013), Cancer Statistics, 2013. CA: A Cancer
Journal for Clinicians, 63: 11–30.
Stanton, editors, Bruce M. Koeppen, Bruce A. (2008). Berne & Levy physiology (6th
ed.). Philadelphia, PA: Mosby/Elsevier. pp. 418–422. ISBN 978-0-323-04582-7.
Wang, S., Inci, F., Chaunzwa, T.L., Ramanujam, A., Vasudevan, A., Subramanian, S.,
Chi Fai Ip, A., Sridharan, B., Gurkan, U.A., Demirci, U. (2012), Portable microfluidic chip
for detection of Escherichia coli in produce and blood, International Journal of
Nanomedicine, 7, sayfa 2591 – 2600.
Wen, X.X., Xu, B.L., Wang, W.X., Liang, G.T., Chen, B., Yang, Y.M., Liu, D.Y.
(2014), Rapid identification of multiple bacteria on a microfluidic chip, Chinese Journal of
Analytical Chemistry, 42, 6 sayfa 791 – 798.
Zeliadt, N. (2014), Capturing Cancer Cells on the Move: Three approaches for
isolating and characterizing rare tumor cells circulating in the bloodstream Erişim Tarihi:
04.12.2016
http://www.the-scientist.com/?articles.view/articleNo/39503/title/CapturingCancer-Cells-on-the-Move/
Zhang, X., Khimji, I., Gurkan, U.A., Safaee, H., Catalano, P.N., Keles, H.O., Kayaalp,
E., Demirci, U. (2011), Lensless imaging for simultaneous microfluidic sperm monitoring and
sorting, Lab on a Chip, 7,11, sayfa 2535 – 2540.
Zhang, Z., ve Nagrath, S. (2013), Microfluidic and cancer: are we there yet?,
Biomedical Microdevices, 15: 595–609.
- 22 -
Download