ÖZEL EGE LİSESİ KİLİN DOĞASINDAN GELEN MUCİZE

ÖZEL EGE LİSESİ
KİLİN DOĞASINDAN GELEN MUCİZE: FLUORODEL
HAZIRLAYAN ÖĞRENCİLER:
Ece TEMİZ
İpek ERTEM
DANIŞMAN ÖĞRETMEN: Özge ÇAKAR
İZMİR
2017
İÇİNDEKİLER
Sayfa
1. GİRİŞ….………………………………………………………………………..
1
1.1 Killer…………………………………………………………......................
1
1.2 Kompozit malzemeler……………………………………………………...
2
1.3 Kanser…………………………………………...........................................
3
1.3.1 Kolon kanseri……………………………………………………………………..
3
1.3.2 5-FU……………………………………………………………............................
4
Projenin Amacı…………………………………………………………….
5
2. YÖNTEM……………………………………………………………………....
5
2.1 Materyal………………………………………………………………………………
5
2.2 Dellite kilinin modifikasyonu………………………………………………
6
2.3 5-FU standart grafiğinin hazırlanması………………………………….....
7
2.4 İlaç salım denemesi…………………………………………………..........
7
2.4.1 Salım denemesi içim örneklerin hazırlanması……………………..
7
2.4.2 pH 1,2 tamponunda ilaç salımı……………………………………
8
2.4.3 pH 7,4 tamponunda ilaç salımı……………………………………..
8
3. BULGULAR………………………………………………………………….
9
4. SONUÇLAR VE TARTIŞMA………………………………………………
14
5. ÖNERİLER…………………………………………………………………..
14
KAYNAKLAR………………………………………………………………….
14
1.GİRİŞ
1.1 Killer
Genel olarak killer birbirinden farklı iki yapı bloğunun belli bir kurala göre üst üste
dizilmesiyle oluşur. Bu yapı bloğundan ilki tetrahedral yapı bloğudur. Tedrahedral yapının
merkezinde Silisyum atomu, köşelerinde ise Oksijen atomu bulunur. İkinci yapı ise
oktahedraldir. Oktahedral yapının merkezinde Alüminyum, Magnezyum veya Demir
atomları, köşelerinde ise Oksijen atomu veya OH- iyonları bulunur.
Montmorillonit kil minerali ise, iki tetrahedral yapının (Silika) arasına bir oktahedral
yapının (Alümina) geçmesiyle oluşur (Şekil 1.3). Doğadan çıkarıldıktan sonra saflaştırılarak
(Saka ve ark., 2006) kullanılan montmorillonit, hektorit, saponit ve sentetik yolla elde edilen,
florohektorit, laponit, veya magadit en çok kullanılan katmanlı killerdir. Kil katmanlarının
kalınlıkları yaklaşık 1 nm civarındadır. Katmanların büyüklükleri ise yaklaşık olarak 200 nm
civarındadır. Bu özellikler silikat yapısına bağlı olarak değişebilir. Bu katmanlar interlayer
veya tabaka olarak adlandırılan, birbirlerine van der Walls kuvvetleriyle tutunarak aralıklı
yığınlar oluşturmak üzere organize olurlar. İzomorfik sübstitüsyon ile katmanlardaki Al3 +
yerine Mg2 + , Fe2 + , veya Mg2 + yerine Li1 + geçmesiyle yapıda negatif yük fazlalığı ortaya
çıkar. Alkali veya toprak alkali iyonların tabakalar arasında adsorplanmasıylaelektronötrallik
sağlanır. Katmanları birbirine tutan kuvvetler nispeten zayıf olduğu için, katmanlar arasında
küçük moleküllerin yerleşmesi kolaydır (Bourbigot ve ark., 2000).
Şekil 1: Montmorillonit Kil Mineralinin Yapısı
Montmorillonit; katmanlı silikat yapısında ve katmanlar arasında değişebilen iyonların
bulunduğu bir kil mineralidir. Kil katmanlarının arasındaki bu mesafe değiştirilebilir. Bu
mesafeyi değiştirmek için mineralin katmanlar arasındaki değişebilen katyonlar yerine,
organik katyonların (alkilamonyum veya alkilfosfonyum), katyon değişim reaksiyonu ile yer
değiştirerek kilin modifiye edilir (Şekil 1.4). Bu şekilde hidrofilik özeliğe sahip olan kil
organofilik özellik kazanır. Organofilik özellik kazanan kil (veya organokil), yüzey enerjisi
1
daha düşüktür böylece organik polimerler ile daha uyumlu hale gelir. Uygun deneysel
koşullar altında bu polimer tabakalar arasına girerek tabakaları dağıtabilirler.
a) C+n kil
Şekil 2: Katyon Değişim Prosesi
b) Alkil İyonlarının Yerdeğişimi (modifiye kil)
Tabakalı silikatlar, katyon değişim kapasitesi (CEC) olarak da bilinen yüzey yükü ile
karakterize edilirler ve genellikle 100 g / mequiv olarak ifade edilir. Bu değer sabit olmayıp,
tabakalar arasında değişir ve bütün kristal yapı üzerinde ortalama bir değer olarak
düşünülmelidir.
Killer dünya üzerindeki geleneksel tedavi yöntemlerinde iyileştirme amaçlı kullanılan
eski materyallerden biridir. Belli yörelerdeki yerli insanlar killeri şifalı ve koruyucu özellikleri
nedeniyle sık sık kullanırlardı.
Killer çoğunlukla ilaç endüstrisinde ara madde veya ana materyal olarak kullanılır.
Polimer ve polisakkarit yapılı kil kompozitler ilaçların görünebilir çözünürlüğünü yükseltir.
Kil kompozitler aynı zamanda kontrollü ilaç salınımını da sağlarlar. Çoğu killer saf halinde
kullanılmasına rağmen ilaç salınımı için gerekli olan bütün ön koşulları karşılarlar. Fakat
bazen modifiye işlemine ihtiyaç duyulur. Bu modifikasyonlar kilin ilaç içinde dağılma
istikrarını, iyon değişimini, şişme kapasitesini, hücre biyoadhezyonunu içerir.
Nanoteknolojinin gelişmesiyle ortaya çıkan mikrondan daha da küçük parçacıklar ilaç
üretimini de olumlu etkiledi. Nanokompozitler kanser önleyici ilaçlarda ara madde (terapötik
etkileri ve ilaç salınımı için) olarak kullanılır. Doğal polimer ve killer kontrollü ilaç salınımı
için hazırlanır. İlaç kil kompozitleri kanser kemoterapileri için iyi bir materyal olarak kabul
edilir. Dong ve Feng, biyoadhezyon etkili nanoparçacıklıpolimermontmorillonite (MMT) ile
anti-tümör özellikli ilacın belli bir özellikte salınmasını inceledi.
Bir çok kil çeşidine rağmen MMT, polimer kil kompozitleri için kullanılan en etkili ve
en yaygın maddedir. MMT’nin kristal yapısı katmanlı tabakalardan oluşur. Bu katmanlar
kendilerini van der Waals bağına göre düzenlerler.
Doğal ve sentetik killerin ilaç endüstrisinde çok yönlü etkileri vardır. Killer ilacın
çözürlüğünü yükseltir, salınımını kontrol eder, toksikliğini azaltır. Kil bazlı ilaçlar belli bir
bölgeye(kanser hücresine) hedeflenmek amacıyla modifiye edilebilir. Ayrıca killer
biyofarmasötik ve farmasötik alanda gelecek vaadeden materyallerdir.
1.2 Kompozit Maddeler
İki veya daha fazla sayıdaki aynı veya farklı gruptaki malzemelerin, en iyi özelliklerini
bir araya toplamak ya da ortaya yeni bir özellik çıkarmak amacıyla, bu
malzemelerin makro seviyede birleştirilmesiyle oluşan malzemelere denir. Başka bir deyişle
birbirlerinin zayıf yönünü düzelterek üstün özellikler elde etmek amacı ile bir araya getirilmiş
değişik tür malzemelerden veya fazlardan oluşan malzemeler olarak da adlandırılabilir.
Polimer nanokompozitler genelde polimer matrikslerinkombinasyonu olarak
adlandırılırlar. Aynı zamanda yüksek esneklik katsayısı, güçlülüğü, alev geciktirici özelliği
nedeniyle çok tercih edilen materyallerdir.
2
1.3 Kanser
Kelime anlamı ile kanser, bir organ ya da dokudaki hücrelerin düzensiz olarak
bölünüp çoğalmasıyla beliren kötü huylu tümörlere denir. Çok çeşitli kanser tipleri olmasına
rağmen hepsi anormal hücrelerin kontrolsüz bir biçimde çoğalmasıyla başlar. Tedavi
edilemezse ciddi rahatsızlıklara hatta ölüme neden olabilir.
Sağlıklı bir hücre ne kadar bölüneceğini vene zaman öleceğini bilir. Buna apoptosis
denir. Bazen buna rağmen süreç yoldan sapar ve yeni hücrelere gerek olmamasına rağmen
hücreler bölünmeye devam eder. DNA hücrenin normal fonksiyonlarını görmesi için
gereklidir. Kanserli hücreler bu DNA ipliğindeki hasardan dolayı oluşur. Kanserli hücrelerde
hasar görmüş DNA onarılamaz ve kontrolsüz çoğalma başlar. Bu kütleler de bir büyüklük
veya tümör oluştururlar. Tümörler iyi huylu veya kötü huylu olabilirler. İyi huylu tümörler
kanser değildir ve vücudun başka bölümlerine yayılmazlar. Kötü huylu tümörler ise kanserdir.
Hücreler anormaldirler ve kontrolsüz bölünürler. Eğer kanser hücreleri tümörden ayrılırsa
başka yerlere taşınabilir, buna metastaz adı verilir.
Kanser tedavisi bölümler arasında çok yakın bir işbirliği gerektiren takım oyununa benzer.
Tanı aşamasında görüntüleme, patoloji ve biyokimya uzmanları ile endoskopistlerin de dâhil
olduğu bu takımda tedavi aşamasına gelindiğinde aşağıdaki 3 faktör başrolü oynar.
1) Hastalıklı dokuları cerrahi müdahalelerle vücuttan uzaklaştıran cerrahlar ve girişimsel
tedaviler uygulayan uzman hekimler
2) Kanser hücrelerini çok çeşitli sınıftan ilaçlarla yok eden ve bağışıklık arttırıcı ilaçları
uygulayan medikal tıbbi onkologlar
3) Hastalıklı dokuları radyoaktif ışınlarla yok eden radyasyon onkologları
Bu tedavilerin alanlarında uzmanlaşmış hekimlerce yapılmaları yaşamsal öneme sahiptir.
Hastalar, kendilerine tedavi ve kanser ilaçları uygulayan hekimlerin medikal onkolog olup
olmadıklarını mutlaka sorgulamalıdırlar. (Kanser Danışmanlık 6.)
Kanser hastalarına uygulanan ve en bilinen yöntemlerden biri olan kemoterapinin de yan
etkileri mevcuttur. Uygulanan kemoterapötik ilaçların sadece kanser hücrelerini etkilemesini
sağlamak zordur. Sağlıklı dokuların da zarar görmesi nedeniyle tedavi istenmeyen yan
etkilere neden olabilir.
Kanser tedavisinin yan etkileri kişiden kişiye ve tedaviden tedaviye değişiklik
gösterebilir. Doktorlar bu yan etkileri en aza indirmeye çalışırlar. Bu yüzden doktorun tedavi
sırasında ve sonrasında oluşabilecek sağlık problemlerini çok iyi bilmesi gerekir. (T.C. Sağlık
Bakanlığı 12.)
1.3.1 Kolon Kanseri
Kolon ve rektum, sindirim sisteminin kalın bağırsak denen kısmını oluşturur. Son 20
cm’lik kısım rektum, buradan ince bağırsaklara kadar olan kısım ise kolon olarak adlandırılır.
Kolon kanseri en sık görülen ilk beş kanser arasındadır. Kalın bağırsak kanseri genellikle
cerrahi, kemoterapi ve/veya radyasyon (ışın) tedavisi ile tedavi edilir. Biyolojik tedavi gibi
yeni tedavi yaklaşımları ile ilgili çalışmalar sürdürülmektedir. Bir hasta için bu tedavi
şekillerinden biri veya birkaçının kombinasyonu gerekebilir. (AcademicHospital 7.)
Cerrahi, kalın bağırsak kanseri için en sık kullanılan tedavi şeklidir. Ameliyatın tipi
hastalığın yerine ve büyüklüğüne bağlı olarak değişir. Hastaların çoğunda bağırsakların bir
kısmının alınması (partialcolectomy) şeklinde bir yöntem uygulanır. Bu operasyonda cerrah
kalın bağırsakların kanserli kısmı ile birlikte onun çevresindeki bir miktar sağlam dokuyu
çıkarır. Cerrahi, sıklıkla erken evre bağırsak kanserlerinde gerekli tek tedavi şeklidir.
Genelde tümör çevresindeki lenf nodlarını da çıkarmak kanserin evresi konusunda
yardımcı olur. Patoloji uzmanları bu lenf nodlarını mikroskop altında inceleyerek onlara
3
kanserin bulaşıp bulaşmadığını tespit ederler. Eğer kanser bu lenf düğümlerine sıçramışsa,
vücudun diğer bölümlerine de sıçramış olması muhtemeldir ve bu durum daha fazla tedaviyi
gerektirir.
Çoğu vakada cerrahlar, kalın bağırsakların tümörlü kısmını çıkardıktan sonra sağlam
kısımlarını birbirine bağlarlar. Cerrahi uygulamanın bu kısmı “anastamoz” olarak adlandırılır.
Eğer kalın bağırsakların sağlam kısımları birbirine bağlanamazsa cerrah “kolostomi” denilen
bir işlem uygulayarak, karın duvarında kalın bağırsak içeriğinin dışarı atılmasını sağlayan bir
delik açarak bağırsakları buraya bağlar. Hasta bu deliğe bir torba takarak gaitanın bu torbada
birikmesini sağlar. Kolostomi geçici veya kalıcı olabilir. (Medical Park Kanser Hastanesi 9. )
Geçici kolostomi; daha alttaki bağırsak kısmının cerrahi işlem sonrası iyileşmesi için
geçici süre kullanılır. Daha sonra ikinci bir ameliyatla cerrah sağlam bağırsak kısımlarını
birbirine bağlar ve kolostomiyi kapatır. Hastaların bağırsak fonksiyonları normale döner.










Kalıcı kolostomi; kanser rektumda ise gerekli olabilir. Kanserli bölgesi kolonun daha
aşağısında olan az sayıdaki hasta için kalıcı kolostomi gerekebilir. Hastaların yaklaşık %15
kadarı için kalıcı kolostomi gerekir.
(Mynet Haber 10.)
Kolon kanserinin tedavisinde kullanılan ilaçlara örnekler vermek gerekirse:
5-FLUOROURACIL EBEWE 500 mg/10 ml enj. için çöz. içeren 1 flakon
5-FLUOROURACIL 1000 mg/20 ml enj. çöz. içinflakon
5-FLUOROURACIL EBEWE 500 mg/10 ml enj. içinçöz. içeren 1 flakon {Sandoz}
FLURO-5 DEVA 1000 mg/20 ml IV/IA enjeksiyonlukçözeltiiçerenflakon
5-FLUOROURACIL BIOSYN 10 ml 500 mg 1 ampül
5-FLUOROURACIL BIOSYN 5 ml 250 mg 10 ampül
EFUDIX %5 krem 20 G
5-FLUOROURACIL BIOSYN 20 ml 1000 mg 1 ampül
FLUOROURACIL-KOCAK 250 mg/5 ml IV enjeksiyoniçinsolüsyoniçerenflakon
5-FLUOROURACIL 1000 mg/20 ml enj. çöz. içinflakon {Liba}
gibi ilaçlar bu hastalığın tedavisinde kullanılmaktadır.
(Türk İlaç Rehberi 8.)
1.3.2 5-FU
5-Fluorouracil kemoterapi için etkili bir ilaçtır. Özellikle kolon kanseri, akciğer
kanseri, karaciğer kanseri ve pankreas kanserinde sıkça kullanılan oral bir ilaçtır. Bir
pirimidin türevi olan ilaç DNA replikasyonu için gerekli olan deoksiribonükleotitlerin
sentezlenmesini engeller. Fakat bazı kısıtlayıcı yönleri de vardır: Kısa biyoljik etki süresi,
tamamlanmamış oral emilim gibi. (Genetiks 11.)
İlacı diğerleriyle karşılaştırmak için kullanılan ilaçlarla 5-FU hakkında içeriklerden
örnekler:
• 5-Fluorourasil (5-FU): 5-FU ilacı kalın bağırsak kanseri tedavisinde uzun yıllardan beri
kullanılmakta olan ana ilaçtır ve sıklıkla lökovorin (folinik asit) ile birlikte verilir. İlaç toplardamar yolu ile
yaklaşık 2 saat içinde hastaya sıklıkla bir serum pompası aracılığı ile verilir.
• Lökovorin (folinik asit): bağırsak kanseri tedavisi için 5-FU, irinotekan, oksaliplatin gibi ilaçlarla
birlikte kullanılan ana ilaçtır.
4
• Kapesitabin (Xeloda): bu ilaç hap şeklinde olup 5-FU kadar etkilidir. Genellikle, günde iki kez 2
hafta boyunca verilir. Genelde yan etkileri 5-FU’ya oranla daha az olmakla birlikte, el ve ayaklarda görülen
ağrı sorunu 5-FU’ya oranla daha fazladır.
• İrinotekan (Camptosar): Bu ilaç sıklıkla 5-FU ve lökovorin ile birlikte verilir ve buna FOLFİRİ protokolu
denilir. Bu ilaç damar yolu ile 30 dakika ile 2 saat içinde verilir. Bazı hastalarda genetik sorunlar (rutin olarak
araştırılmaz) nedeniyle, İrinotekan vücuttan rahat atılamaz ve aşırı ishal vb. fazla sayıda yan etki yaratabilir.
Bilürübin seviyesi yüksek olan ve yaşlı hastalarda bu ilacın kullanımı risklidir.
• Oksaliplatin (Eloxatin): Bu ilaç sıklıkla 5-FU ve lökovorin ile birlikte verilir ve buna FOLFOX protokolü
denilir. Kapesitabin ile birlikte verildiği protokol ise CapeOXprotokolu adını alır. Bu ilaç damar yolu ile iki saat
içinde ve her 2-3 haftada bir verilir.
Şekil 3: 5-FU’in kimyasal yapısı
Projenin Amacı
Günümüzde de çoğalarak vakalarına rastlanan kolon kanserinde çeşitli yollarda
tedaviler mevcuttur. İlaçlı ve cerrahi müdahaleli olmak üzere iki temele ayırdığımız tedavi
yöntemlerinde biz ilaçlı tedavi yöntemlerinden “oral” yolla planlanan tedavi alanında yer alan
bir proje çalışması yaptık. Bu sürede 5-FU ilacımızın Montmorillonit Kili’nin bölgeye özgü
olan alt türü Dellite Kili’ne yüklenmesini hedefleyen ve oral yolla tedavide kullanıma açık bir
yöntem geliştirme yolunda ilerledik.
Çoğu vakada cerrahlar, kalın bağırsakların tümörlü kısmını çıkardıktan sonra sağlam
kısımlarını birbirine bağlarlar. Cerrahi uygulamanın bu kısmı “anastamoz” olarak adlandırılır.
Eğer kalın bağırsakların sağlam kısımları birbirine bağlanamazsa cerrah “kolostomi” denilen
bir işlem uygulayarak, karın duvarında kalın bağırsak içeriğinin dışarı atılmasını sağlayan bir
delik açarak bağırsakları buraya bağlar. Hasta bu deliğe bir torba takarak gaitanın bu torbada
birikmesini sağlar. Kolostomi geçici veya kalıcı olabilir. Bunun haricinde kolon kanseri
sürecinde ağızdan alınan bazı oral ilaçlar da mevcuttur. Bu ilaçların salımı istenilen seviyede
ve sürede olmadığından; beklenen sonuçlar elde edilemediğinden kile uyguladık ve oral yolla
alınabilen bir ilaç tasarladık. Killer, kullandığımız Montmorillonit Kili ve kullandığımız
ilaç,5-FU hakkında bazı verilerle projemizin yolunu belirledik.
2. YÖNTEM
2.1. Materyal
Bu çalışmada kullanılan kil nanopartikülleriBentonit kil mineralinden elde edilen ticari
ismi Dellite olan TOT yapısına sahip kil mineralidir (LaviosaChimicaMinerariaS.p.a.).
Kullanılan Dellite mineralinin iyon değişim kapasitesi 128 meq/100 g kil’dir. Dellite
mineralinin yapısı Na-Montmorillonite ile büyük yapısal benzerlik göstermektedir.Saf kilin ve
5FU modifiye kilin FTIR spektrumları Perkin Elmer Spektrum 100 FTIR Spektrometresinde
KBr diskleri ile alınmıştır. Örneklerin termal kararlılığı termogravimetrik analiz (Perkin
5
ElmerPyris 1 TGA/DTA) ile tayin edilmiştir. Örnekler (5±1 mg) oda sıcaklığından 1000 oC
ye 10 oC/dk artışlarla N2 gazı altında (250 mL min-1) analiz edilmiştir. Tüm örnekler termal
analiz öncesi vakum etüvünde kurutulmuştur.
Şekil 4: SIGMA 3.18K Centrifuge
2.2. Dellite Kilinin Modifikasyonu
0.3 g Dellite( DEL) 250 mL saf su içinde 24 saat boyunca manyetik bar yardımıyla
karıştırmaya bırakıldı ve DEL’in tamamının suyun içine dağılması sağlandı. Modifikasyon
işleminde kullanılacak olan 5FU miktarı Dellite mineralinin iyon değişim kapasitesi
kullanılarak hesaplanmıştır. 0.3 g Dellite için 0.1 g/5 mL 5-FU kullanılmıştır. 55 mL saf su
içine enjektör ile 5 mL 5-FU eklendi, pH’ı8.8 olan ilacın pH’ı HCI(hidroklorik asit) ile 2’ye
indirildi ve çözelti iyice karıştırıldı. Böylelikle Dellite’ın tabakaları arasına girebilecek 5FU
Cl- tuzu elde edilmiş olur. İlaç çözeltisinin tamamı (60 mL) damlalık yardımı ile yavaş yavaş
DEL dispersiyonuna eklendi. DEL ile ilacın etkileşim stabilitesini arttırmak amacıyla karışım
24 saat oda sıcaklığında karışmaya bırakıldı. 24 saatin sonunda kilin içine bağlanmayan ilacı
uzaklaştırmak aynı zamanda 5-FU içeren kili elde etmek için beher içindeki karışım 15000
rpm, 22 °C’de 5 dk boyunca santrifüj edildi. Daha sonra örnekler 3 kez distile su ve
sonrasında eter ile yıkanır. Bu yıkama işlemi süzüntü 0.1 N lik AgNO3 ile titre edilerek AgCl
çökeleği görünmeyene kadar devam edilir. Elde edilen kil örneği 2 gün boyunca vakum
etüvünde bekletildi. Böylece, tamamen kuruyarak sonraki deneysel çalışmalar için uygun hale
getirildi.
6
Şekil 5: Dellite kilinin hazırlanması
2.3. 5-FU Standart Grafiğinin Hazırlanması
Salım çalışmalarında farklı pH’larda, 5-FU/DEL içinden salınan 5-FU’in miktarını
tayin edebilmek amacıyla, 5-FU standart grafiği hazırlandı. Stok 50 mg/mL 5-FU (Koçak
Farma A.Ş) ‘den 5-10-12.5-25-50 ve 100 µg/mL’lik çözeltiler mikropipet yardımıyla
hazırlandı ve 265 nm’demikroplate okuyucuda absorbans değerleri ölçüldü.
Mikroplatekuyucuğuna her bir konsantrasyondan 400 µL eklenerek ölçümler 3 tekrarlı olarak
gerçekleştirildi. Elde edilen absorbans değerleri ve bilinen konsantrasyonlar grafiğe
geçirilerek 5-FU standart grafiği oluşturuldu.
Şekil 6: 5-FU standart grafiği için örneklerin hazırlanması
2.4. İlaç Salım Denemesi
2.4.1. Salım Denemesi İçin Örneklerin Hazırlanması
Kurutma sonrası elde edilen 5-FU/DEL’den 10 mg hassas terazi yardımıyla tartıldı.
Tartılan 5-FU/DEL 10 mL’likfalkon tüpe aktarılarak üzerine 2 mL PBS (
phosphatebuffersaline pH:7) eklendi. 5-FU/DEL’in PBS içinde tamamen dağılması sağlanana
kadar sonik banyoda bekletildi. Sonik banyodan çıkan örnek 1 dk boyunca vortekslendi ve
tam bir karışım sağlandı. Diyaliz membranları uygun boyutta kesilerek yumuşaması için suya
bırakıldı. Membranlar yumuşadıktan sonra membranın alt kısmı sıkıca bağlandı ve sonra 2
mL PBS içinde çözünmüş olan 5-FU/DEL’denmikropipet yardımıyla 1 mL alınarak diyaliz
7
membranına aktarıldı. Son aşamada üst kısmı da sıkıca bağlandı ve salım çalışması için hazır
hale getirildi.
Şekil 7: 5-FU ve 5-FU/DEL içeren membranların hazırlanması
2.4.2.pH 1,2 Tamponunda İlaç Salımı
0.1 M HCI hazırlanan çözeltinin pH’ı1.2 ye ayarlandı. Bölüm 2.3.1’de anlatıldığı gibi
5-FU/DEL örneği içeren membran 8 mLpH 1,2 çözeltisinin içine yerleştirildi. 100 rpm
37°C’de 15-30-45-60-75-90-120-150 dakika boyunca örnekler diyalizlendi. Her aralığın
sonunda diyaliz suyundan 400 µL örnek alınarak mikroplate okuyucuda 265 nm’de ölçüm
alındı ve hacim kaybını önlemek için her adımda alınan örnek miktarı kadar pH 1,2 HCl
çözeltisi ile ekleme yapıldı. Ölçümler 3 tekrarlı olarak gerçekleştirildi. Bu deney seti ile
zaman bağımlı olarak DEL içinde hapsolan ilacın midedeki salınımının gözlemlenmesi
amaçlanmıştır.
Şekil 8:pH 1,2 tamponunda ilaç salımının gözlenmesi
2.4.3. pH 7,4 Tamponunda İlaç Salımı
Bu aşamada pH 7,4 sodyum fosfat tamponu hazırlandı. Bölüm 2.3.1’de anlatıldığı gibi
5-FU/DEL örneği içeren membran 8 mLpH 7,4 sodyum fosfat tamponu içine yerleştirildi.
Serbest ilaçla karşılaştırma yapabilmek için aynı miktar (1 mL) ilaç diyaliz membranının içine
yerleştirildi ve aynı adımlar burada da uygulandı. 100 rpm 37°C’de 15-30-60-90-150-210-300
dakikaya ek olarak 24-27-31-36-39-43 saatlik ölçümler boyunca pH 7,4 sodyum fosfat
tamponuna karşı diyalizlendi. Her aralığın sonunda diyaliz suyundan 400 µL örnek alınarak
mikroplate okuyucuda 265 nm’de ölçüm alındı ve hacim kaybını önlemek için her adımda
alınan örnek miktarı kadar pH7.4 sodyum fosfat tamponu hacim tamamlandı. Ölçümler 3
8
tekrarlı olarak gerçekleştirildi. Bu deney seti ile zaman bağımlı olarak serbest ve DEL içinde
hapsolan ilacın ince bağırsaktaki (ilk 5 saat) ve kolondaki (5 saatten 43 saate kadar)
salınımının gözlemlenmesi amaçlanmıştır.
Ölçüm sonucunda elde edilen değerler standart grafiğine yerleştirilerek
konsantrasyonlar belirlenmiştir. Belirlenen konsantrasyonlar Şekil 9’da gösterilen formüle
yerleştirilerek elde edilen her bir değer kendinden önceki değerler ile toplanmıştır. pH 1,2 ve
pH 7,4 için yapılan hesaplamalardan en yüksek değer %100 kabul edilmiş ve diğer değerler
%100 kabul edilen değere göre rölatif olarak hesaplanmıştır. Serbest ilaç için stok ilacın
konsantrasyonu ve ölçülen değerler, DEL içindeki ilaç miktarı için ise 1 mg DEL’in içindeki
5-FU konsantrasyonu( salım çalışması ile yapılan ölçümle aynı şekilde hesaplanmıştır.) ve
salımdan elde edilen ölçümler baz alınarak hesaplama yapılmıştır.
Şekil 9: İlaç salımı hesaplaması için kullanılan formül, Vt; değiştirilen çözelti
miktarı(mL), Ci; n. dakikadaki ölçüm için n. dakikadan önceki ölçülen ilaç
konsantrasyonlarının toplamı, Vo; diyaliz ortamının toplam hacmi (mL), Cn; n.
dakikadaki ilaç konsantrasyonu, mD; 0. dakikada örneğin içinde bulunan toplam ilaç
miktarı (µg/mL).
Şekil 10: pH 7,4 tamponunda ilaç salımının gözlenmesi
3. BULGULAR
3.1. Modifiye Dellite Kil Mineralinin Karakterizayonu
DEL ve 5FU/DEL kil örneklerine ait FTIR absorpsiyon spektrumu 400-4000 cm-1
aralığında alınmıştır. FTIR absorpsiyon spektrumu Şekil 11 de verilmiştir. Dellite, 3622 cm-1
de geniş bir tipik OH gerilim bandı vermektedir. Adsorplanan moleküler suya ait absorpsiyon
bandı 1630 and 3400 cm-1 de görülmektedir. 1150 cm-1 de genişçe bir Si-O titreşim bandı
bulunmaktadır. Dellite’a ait OH deformasyon bandı 915 cm-1 de ve de Si-O tireşiminden
kaynaklanan absorpsiyon bandı ise 550 cm-1 de görülmektedir. 5FU ile modifikasyon
işleminden sonra saf kile ait bandlara ek olarak 2900cm−1 civarında görülen iki küçük pik
yapıdaki N-H ve C-H varlığını kanıtlamaktadır. Ayrıca buna ek olarak 1600 cm-1 de pikin
9
şiddetinin artması 5FU yapısındaki C=O karbonil grubunun kaynaklanmaktadır. Saf kile göre
görülen bu absorpsiyon bandları saf kile modifikason işleminin başarıyla gerçekleştiğini
göstermektedir.
Del
5FU/Del
60
Geçirgenlik
50
40
30
20
10
0
4000
3500
3000
2500
2000
1500
1000
500
-1
Dalga Sayı ı (cm )
Şekil 11: Del ve 5FU/Del Mineraline ait FTIR Spektrumu.
Del ve 5FU/Del mineraline ait N2 atmosferi altında alınan TGA termogramı Şekil
12verilmiştir. Dellite mineralinde yaklaşık 800°C de yapısındaki uçucu materyallerden dolayı
toplamda % 9 kütle kaybı görülmüştür. Termogramda, 0-1100C de yapıdaki suyun (nemin)
ayrılmasından kaynaklanan montmorillonitin kütlece ağırlığındaki azalma görülmektedir.
6000C den daha büyük sıcaklıklardaki kütle kaybının nedeni ise, yapıdaki hidroksillerin su
olarak yapıdan ayrılmasından (dehidroksilasyon) kaynaklanmaktadır.Modifikayon işleminden
sonra ise kütle kaybı %19 değerine yükselmiştir. Bu da saf kilin yapısındaki 5FU den
kaynaklanmaktadır. FTIR analizine ek olarak TGAanalizindeki bu kütle kaybı
artışımodifikasyonişlemini kanıtlamaktadır.
Del
5FU/Del
100
Kütle Kaybı (%)
95
90
85
80
0
100 200 300 400 500 600 700 800 900
Sı
o
ı ( C)
Şekil 12: Del ve 5FU/Del mineraline ait TGA Termogramı.
Del ve 5FU/Del mineraline ait DTG termogramı Şekil 13’te verilmiştir. DTG analizi
ile saf Del örneği ile modifikasyon işlemi sonrasındaki 5FU/Del örneğinin termal
10
kararlılıkları incelenmiştir. Bu karakterizayon işleminden sonra Dellite örneğinin bozunma
sıcaklığı 650 oC olarak tespit edilirken, 5FU/Del örneğinin bozunma sıcaklığı 685 oC olarak
bulunmuştur. Bu sonuçlardan modifikayon işlemi ile Dellite mineralinin termal kararlılığının
arttığı görülmüştür.
Kütle Degisimi (ug/min)
0,00
-0,03
-0,06
-0,09
-0,12
-0,15
Del
5FU/Del
100
200
300
400
500
600
700
800
900
Sıcaklı (oC)
Şekil 13: Del ve 5FU/Del mineraline ait DTG Termogramı
3.2. 5-FU Standart Grafiği
Bölüm 2.2’de anlatıldığı gibi hazırlanan 5-FU standart grafiğinden elde edilen
denklem ile absorbansı ölçülen örneklerin 5-FU konsantrasyonları belirlenmiştir.Standart
grafiğindeki R2 değeri grafiğin lineerliği hakkında bilgi verir. R2 değeri 1’e ne kadar yakınsa
grafik o kadar lineerdir denir. Elde edilen grafikte R2 değeri 0,9996’dır. Standart grafiği
hazırlanırken konsantrasyonlar µg/mL olarak verilmiştir.
Absorbans (265 nm)
3
2,5
2
1,5
y = 0,0273x + 0,0122
R² = 0,9996
1
0,5
0
0
20
40
60
80
Konsantrasyon (µg/mL)
Şekil14: 5-FU Standart Grafiği
11
100
120
Rölatif ilaç salımı (%)
3.3. pH 1,2’de İlaç Salımı
50 yılı aşkın süredir kolon kanseri tedavisinde intervenöz olarak uygulanan 5FU kullanılmaktadır. Diğer terapötik ilaç sınıflarında olduğu gibi, onkolojide oral
formülasyonların geliştirilmesine odaklanılmıştır. Oral ilaç formülasyonları üzerine artan
ilginin sebebi ise kullanımının kolay olması ve hastaların tedavilerinin daha kolay hale
gelmesi, sağlık kuruluşlarını ziyaret etme sıklığını azaltmasıdır. Bu tedavi yöntemi aynı
zamanda hastaların günlük yaşamını daha az kısıtlaması sebebiyle de önem arz etmektedir.
Yapılan bir çalışmada kanser hastalarının intervenöz tedavi yerine oral tedaviyi tercih ettikleri
ve bu tedavinin daha etkili olduğunu düşündükleri bulunmuştur. Oral yolla alınan ilaçlarda
gastrointestinal kanalda ilacın stabilitesi ve gastrointestinal kanal tarafındanabsorplanan ilaç
miktarı gibi parametreler ilacın biyoyararlanımının arttırılması ve uygun dozun belirlenmesi
açısından incelenmelidir. Klinik denemelerde, oral olarak uygulaması mevcut olan
kemoterapi ajanları giderek artış göstermektedir. Bunlar başlıca; merkaptopürinler,
hidroksiüre, metotreksattır ancak yeni kemoterapi ajanlarının bulunması için bir çok araştırma
devam etmektedir.
Bir çok kanser ilacının oral kullanımı mümkün değildir. Bunun sebebi bu ilaçların
midedeki
asidik
ortamda
stabilizasyonlarını
koruyamamaları
ve
farmasötik
formülasyonlasyon oluşturmada zorluk çıkarmalarıdır. Bu gibi sorunlar ilacın çözünürlüğünü
olumsuz etkileyebilir veya bu ilaçlar oral uygulamada yüksek toksisite gösterebilir.
Gastrointestinal sistem, sahip olduğu doğal savunma mekanizmaları nedeniyle oral olarak
uygulanan ilaçların biyoyararlanımını olumsuz etkileyebilir. Örneğin 5-FU gastrointestinal
sistemde yüksek seviyede eksprese edilen dihidropirimidin dehidrogenaz enzimi tarafından
hızlı bir şekilde degredasyona uğratılır.
Yeni farmasötik formülasyonlara öncü olması amacıyla aynı zamanda 5-FU’in oral
yolla alımını mümkün kılabilmek, degredasyona ve asidik ortama karşı stabilitesini
arttırabilmek amacıyla ilaç DEL içine hapsedilmiş ve mide pH’ında ilacın DEL içinden salımı
izlenmiştir. Salım denemesinde rölatif olarak hesaplanan değerler sonucunda ilacın %20’sinin
mide pH’ında salındığı dolayısıyla büyük bir miktarının kil içinde hapsolduğu gözlenmiştir.
Serbest ilacın oral yol ile alımı mümkün olmadığı için serbest ilaç ile karşılaştırma yapılması
uygun bulunmamıştır.
120
100
80
60
40
20
0
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
Zaman(saat)
Şekil15: DEL/5-FU’in pH 1,2’deki zamana bağımlı ilaç salımı
12
3.4. pH 7,4’de İlaç Salımı
Kolon, kalın bağırsağın ana bölümünü oluşturur ve insan gastrointestinal(GIT)
sisteminde ince bağırsağın hemen sonrasında konumlanmıştır. Yaklaşık 1,5 m uzunluğunda
ve 7,5 cm çapında olup dört bölümden oluşur. Kolonun işlevi ince bağırsaktan geçtikten sonra
geriye kalan ve sindirilmeyen gıdalardan suyu, tuzu ve bazı yağda çözünen vitaminleri
absorplamak ayrıca katı atıkları vücuttan atmaktır. Bu yüzden homeostasisi sağlamak
amacıyla oldukça önemli görevler üstlenir.
Kolon kanseri tedavisinde en çok kullanılan yöntem, folinik asit (lökovorin) ile
modüle edilen 5-fluorourasil'in intravenöz enjeksiyonudur. Oral uygulama için sadece birkaç
oral yaklaşım önerilmektedir. Son zamanlarda, yan etkilerin azaltılmasıyla kombine etkili bir
tedaviye olanak tanıyan, enzim bağımlı tablet tabanlı sistemler önerilmiştir. Bununla birlikte,
GIT boyunca ilacın geçiş süresinin değişmesi nedeniyle, kolon spesifik matris tableti kolayca
çözülmediğinde ilaç salınımı eksik olabilir ve tedavi yetersiz kalabilir. 5-FU’in kolon kanseri
tedavisinde kontrollü salınımı için literatürde çalışılan bazı taşınım sistemleri mevcuttur.
Biyobozunurpolimerikpartiküller; alginatboncuklar, polikaprolakton, kitosan, jelatin,
poliakrilamid, dendrimerler aynı zamanda veziküler sistemler; lipozom ve niozomlar 5-FU’in
kolon kanseri tedavisinde kullanılan ilaç taşınım sistemleridir.
5-FU terapisi iyileştirilebilir ve toksisitesi, hücrelerin bu ajana uzun süre maruz
kalmasıyla ve tümörün olduğu bölgelerdeki anti kanser maddesinin spesifik birikimini
kolaylaştırarak azaltılabilir. Üstelik, 5-FU, yararlılığını sınırlayan başka bir etken ise 10
dakika serum yarılanma ömrüne sahip olmasıdır. Bu sebepler doğrultusunda, 5-FU'nun
terapötik etkisini en üst düzeye çıkarmak ve toksisiteyi en aza indirgemek için kontrollü salım
sistemi olarak DEL seçilmiştir. Böylece GIT boyunca ilerlerken ilaç belirli miktarlarda
salınacak ve toksik doza ulaşmadanspesifik olarak kolonda birikerek etkinlik
gösterebilecektir. Şekil 16’da görüldüğü gibi ilacın pH 7,4’de salımı karakteristik bir eğri
göstermektedir. 43 saatin sonunda serbest ilacın tamamı salınmış iken DEL içine hapsolmuş
ilaçta sadece %20 salım görülmüştür. Bu sonuç doğrultusunda 5-FU’in kontrollü salınımının
gerçekleştiği dolayısıyla hedefe ulaşıldığı görülmektedir.
Rölatif İlaç Salımı (%)
120
100
80
5-FU
60
5-FU/DEL
40
20
0
0
10
20
30
40
50
Zaman(saat)
Şekil 16: DEL/5-FU’in pH 7,4’deki zamana bağımlı ilaç salım grafiği
13
4. SONUÇLAR VE TARTIŞMA
Kilin modifikasyonu işlemi sonrasında materyali karakterize etmek amacıyla yapılan
analizler doğrultusunda. FTIR Spektrumu, TGA Termogramı ve DTG Termogramı
incelendiğinde 5-FU’nun DEL içine başarılı bir şekilde hapsedildiği kanıtlanmıştır. DEL
örneğinin bozunma sıcaklığı 650 oC olarak tespit edilirken, FLUORODEL’inbozunma
sıcaklığı 685 oC olarak bulunmuştur yani ilaçla etkileşim sonucunda DEL’in termal stabilitesi
artmıştır. Bu da materyale aynı zamanda yeni bir özellik kazandırmıştır. Bunun sonucunda
FLUORODEL başarılı bir şekilde karakterize edilmiştir. Deneysel süreçte yeni oluşturulan
materyalin karakterizasyonu oldukça önem arz etmektedir.
Mide ve kolon pH’ında yapılan salım çalışmasının sonucunda midede 2,5 saatin
sonunda ilacın %20’sinin salındığı gözlenmiştir. Asidik pH’larda 5-FU’nun stabilitesi çok
düşük olması ve enzimler tarafından hızlıca parçalanması gibi nedenlerden dolayı
FLUORODEL’indegredasyona karşı daha stabil olacağı öngörülmektedir. pH 7,4’de ise
serbest ilaç ile karşılaştırıldığında 43 saatin sonunda ilacın %20 civarlarında salındığı
dolayısıyla kontrollü salım sisteminin geliştirildiği görülmektedir. Böylece sentetik polimerler
veya biyobozunur polimerler kullanmadan 5-FU ilacı için kil bazlı kontrollü salınım sistemi
geliştirilmiştir.
5.ÖNERİLER
Günümüzde yaygın olarak bulunan hastalıkların tedavisi için giderek doğal
materyallere yönelim artmaktadır. Bu sebeple, 5-FU’nun oral yolla tedavisini mümkün
kılmak, kontrollü salım sistemi geliştirmek aynı zamanda kilin doğal yapısından
faydalanabilmek amacıyla FLUORODEL geliştirilmiştir. Bu projenin ileriki çalışmalara ve
yeni ilaç formülasyonlarının geliştirilmesine katkı sağlayacağı düşünülmektedir.
KAYNAKLAR
1. Azeez, A.A., Rhee, K.Y., Park, S.J., Hui, D. (2013), Epoxy clay nanocompositesprocessing, proterties and applications: A Review. Composites: Part B, 308-320.
2. Rodrigues, L.A.S,, Figueiras, A., Viega, F., Freitas, R.M., Nunes, L.C.C., Filho,
E.C.S., Leite, C.M.S. (2013), The systems containing clays and clay minerals from
modified drug release: A Review. Colloids and Surfaces B: Biointerfaces, 642-651
3. Kar, S. (2016), An Overview Of Recent Advances İn Application Of Some Inorganic
Metarials-Biological And Technological Perspectives. Journal of Biotechnology&
Biomaterials, 6:3
4. Kim, S.E., Cole, P.D., Cho, R.C., Ly, A., Ishiguro, L., Sohn, K.J., Croxford, R.,
Kamen, B.A., Kim, Y.I. (2013), γ- Glutamly hydrolase modulation and folate
influence chemosensitivity of cancer cells to 5-fluluorouracil and methotrexate. British
Journal of Cancer, 109,2175-2188
5. Wang, W.Y., Lui, H., Li, S.P., Li, X.D. (2016), Synthesis of methotrexatum
intercalates zinc-aluminum-layered double hydroxides and corresponding cell studies.
Applied Clay Science, 103-110
6. Kanser Danışmanlık, Giriş ve Ön Bilgiler ,Erişim Tarihi: 10 Aralık 2016,
http://www.kanserdanismanlik.com/icerik/kategori/25
7. Academic
Hospital,
Tanı,
Erişim
Tarihi:
10
Aralık
2016,
http://www.academichospital.com.tr/tr/e-saglik/kalin-bagirsak-kanseri/
14
8. Türk İlaç Rehberi, Kolon, Rektum yada Bağırsak Kanseri ile ilgili
olabilecek
ilaçlar,
Erişim
Tarihi:
15
Aralık
2016,https://www.ilacrehberi.com/h/kolon-rektum-bagirsak-kanseri/
9. Medical Park Kanser Hastanesi, Kolon Kanseri, Erişim Tarihi: 17 Aralık
2016, http://www.kanserhastanesi.com.tr/kanser-turleri/kolon-kanseri/
10. Mynet Haber, Kalın Bağırsak Kanseri tedavisi, Erişim Tarihi: 22 Aralık
2016, http://www.mynet.com/haber/saglik/kalin-bagirsak-kanseri-tedavisi895983-1
11. Genetiks, Fluorouracil (5-FU), Erişim Tarihi: 23 Aralık 2016,
http://www.farmakogenetik.com/tr/fluorouracil-5-fu
12. T.C. Sağlık Bakanlığı, Kanser Daire Başkanlığı, Kanser Nedir?,Erişim
Tarihi: 24 Aralık 2016, http://kanser.gov.tr/kanser/kanser-nedir/4-kansernedir.html
15