3/6/2016 • Ürün saflaştırma prosesleri GIDA BİYOTEKNOLOJİSİ Saflaştırma prosesi Saflaştırma prosesi seçilirken dikkate alınması gereken kriterler • Fermentasyon ürünlerinin saflaştırılması oldukça masraflı bir süreçtir. • Amaç, en az maliyetle en yüksek kalitedeki ürünün mümkün olan en kısa sürede elde edilmesidir. • Doğal olarak seçilen proses ve bunun ürün maliyetine etkisi istenilen son ürüne bağlıdır. • Bir fermentasyon prosesi sonunda ortam sıvısı içinde ürün düşük konsantrasyonlardadır ve ürünle birlikte ortamda m.olar, hücre parçaları, çözünmüş ve çözünmemiş ortam bileşenleri ile birlikte diğer metabolik ürünler bulunur Bütün bu faktörler saflaştırma prosesini zorlaştıran etkenlerdir • • • • • • • • Ürünün hücre içi veya hücre dışı oluşu Ürünün fermentasyon sonundaki konsantrasyonu Ürünün fiziksel ve kimyasal özellikleri Ürünün kullanım alanı Kabul edilebilir en düşük saflık oranı Ürünün toksisitesi Fermentasyon sırasında ortamda bulunan safsızlıklar Ürünün fiyatı • Öte yandan ürün hücre içi bir metabolit de olabilir. 3 • Ürün saflaştırmada ilk adım büyük katı parçaların, çöktürme, santrifüj veya filtrasyon yolu ile ortamdan uzaklaştırılmasıdır • İkinci adım, elde edilen sıvının ultrafiltrasyon, ters osmoz, kromatografi yöntemleri, sıvı-sıvı ekstraksiyonu, çöktürme yolu ile bölümlenmesidir. • Son adımda ise daha hassas kromatografik yöntemler veya kristalizasyon teknikleri kullanılarak yüksek saflıkta ürün elde edilir. 4 Çöktürme • Çöktürme ürün saflaştırmanın çeşitli evrelerinde kullanılan bir yöntemdir. • Tek bir adımda hem zenginleştirme hem de konsantre etmesi bakımından oldukça kullanışlı bir yöntemdir. • Çöktürme için kullanılan kimyasallar arasında asitler ve bazlar, tuzlar, organik çözücüler vb yer almaktadır. 5 6 1 3/6/2016 • Santrifüj Santrifüjleme (seperasyon) • Kesikli ve sürekli olmak üzere iki tipte uygulanabilen santrifüj işleminde kesikli uygulamanın kapasitesi oldukça düşüktür ve endüstriyel uygulamalar için uygun değildir. • Endüstriyel uygulamalarda sürekli sistemler kullanılır (seperatorler) • Hem farklı yoğunluktaki maddeleri hem de katı ve sıvıları birbirinden ayırmak için kullanılabilirler. Çözeltideki partiküllerin uygulanan merkezkaç kuvvetin etkisiyle çeperlere veya tabanlara oturtulması esasına dayanır. M.o’lar ve benzer büyüklükte diğer partiküller, filtrasyonla iyi sonuç alınamadığında santrifüj yardımı ile ortamdan ayrılabilirler. Santrifüj filtrasyon ile birleştirildiğinde pahalı bir seçenek olsa da, filtrasyonun zor gerçekleştiği, filtrasyonu kolaylaştıracak kimyasalların kullanılamadığı ve yüksek saflıkta ayırmanın gerektiği durumlarda zorunlu bir seçenektir. 8 Hücre parçalama Eğer istenilen ürün hücre dışına salınmıyorsa, m.o’nın hücre duvarının parçalanarak ürünün dışarı alınması gerekmektedir. Bu amaçla bazı hücre parçalama yöntemleri geliştirilmiştir. Bu yöntemlerin sahip olması gereken en önemli özellik, elde edilmesi istenilen ürüne zarar vermeyecek şekilde olmasıdır. Endüstriyel amaçlarla kullanılan yöntemler 1) fiziko-kimyasal yöntemler: dondurma-çözündürme, ultrasonikasyon gibi yöntemleri içerir 2) Kimyasal yöntemler: deterjanlar, alkali kimyasallar ve enzim uygulamalarından yararlanılır Genellikle amilaz, proteaz ve lipaz enzimleri kullanılır. • Filtrasyon • Filtrasyon tüm ölçeklerde süspansiyon parçacıkları uzaklaştırmak için en çok yöntemlerden biridir. halindeki kullanılan • Filtrasyon farklı koşullarda gerçekleştirilebilir • Uygun yöntemin seçimini filtrat özellikleri, katı parçacıkların boyutları, katı/sıvı oranı, katı fazın mı sıvı fazın mı toplanması gerektiği, prosesin boyutu, filtrasyonun kesikli mi sürekli mi olacağı, steril şartlara olan ihtiyaç, filtrasyon sırasında vakuma gerek olup olmadığı gibi faktörler belirler. 9 10 11 12 2 3/6/2016 • Kromatografi • Düşük konsantrasyonlarda ürün elde edilen proseslerde fiziksel ayırmanın ardından ürün saflaştırmanın en önemli basamağı kromatografidir. • Kromatografi karışımdaki maddeleri birbirinden ayırmada kullanılan en etkin yöntemdir. • Endüstride kullanılan kromatografi türleri Adsorbsiyon kromatografisi İyon değiştirme kr. Jel filtrasyon kr. Affinite kr. • Mikrobiyal gelişme ve ürün oluşum kinetiği 13 • M.o’ların gelişmeleri ve ürün oluşturmaları çevreye bağımlı olarak meydana gelir. • Bu nedenle gelişme ve ürün oluşumunu anlayabilmek için mikrobiyal metabolizmanın düzenlenmesiyle fiziksel ve kimyasal çevre arasındaki ilgiyi anlamak gerekir. • Mikroorganizma gelişmesi genellikle hücre kitlesi veya hücre sayısındaki artışın 2 katına ulaşması için geçen zaman olarak tanımlanır. Buna jenerasyon süresi (ikilenme süresidoubling time) denir. • Gelişme kinetiği: mikroorganizmaların üremesini ve ürün oluşturmasını matematiksel bağlantılarla tanımlar. Mikroorganizmaların büyüme eğrisi • M.o’ların büyümesi belirli kurallara uyar. Bu nedenle bazı koşullar altında inkübasyon sonunda beklenen hücre sayısı ve biyokitle miktarı hakkında önceden tahminde bulunulabilir. • Kesikli bir sistemde m.o’ların gelişmesi şekildeki gibi olur. • Bakteriler, mayalar ve küflerin birçoğunun büyümesinde ayrı ayrı fazlar (üreme eğrisi) vardır 17 3 3/6/2016 A) Lag faz: • B) Uyum (adaptasyon) ve hızlanma fazı (asselerasyon) Bu fazda hiç hücre bölünmesi olmaz ve bu faz ilk hücre bölünmesi gerçekleşinceye kadar devam eder. bu fazda hücre çoğalması başlar ama yavaştır. Artış eksponansiyel değildir. • DNA miktarı artar enzim sentezi devam eder. Hücrelerdeki RNA miktarında önemli artış olur. • Genellikle A ve B fazları birlikte değerlendirilir. • Aşılanan hücre sayısında hiçbir değişiklik olmaz. Besi ortamından su ve substratlar alınıp RNA, ribozom ve protein (özellikle enzim) biyosentezinde kullanılır. • Bu nedenle hücre çoğalması olmadığı halde biyokütle artar. • Bu fazın süresi, aşı kültürü miktarına, aşı materyalinin yaşına, substratın uygunluğuna bağlıdır. C) Eksponansiyel faz (logaritmik) Büyüme hızı pratikte sabittir ve maksimuma ulaşmıştır. RNA’ya kıyasla DNA sentezi daha fazladır. M.o gelişmesinin sınırlayan hiçbir faktör yok • Hücre çoğalması kolaylıkla hesaplanabilir. D) Geçiş fazı bu fazda hücre çoğalma hızı sürekli azalır. Fakat global olarak düşünüldüğünde hücre sayısı ve biyokitle artışı devam eder. • Logaritmik fazdan üreme hızının düşük olduğu geçiş fazına geçmenin başlıca sebepleri: Toksik metabolik ürünlerin oluşması Substratın tükenmesi Viskozite artışı ile oksijen alımının zorlaşması Bu fazda değişik yaşlarda hücreler bulunur E) durağan faz (stationary phase) Bu fazda yeni oluşan hücre sayısı ile ölen hücre sayısı dengelenmiştir. Toplam hücre sayısı sabit kalır. • Metabolizma anabolizmadan katabolizbolizmaya dönmüştür. • Biyosentezler daha çok sekonder metabolit üretimine yöneliktir. • Sekonder metabolit üretimi amaçlanıyorsa bu fazın mümkün olduğu kadar uzun sürmesinde yarar vardır. F) Azalma ve ölüm fazı (lethal faz): ölen hücrelerin sayısı yeni oluşan hücrelerden fazladır. m.o’ların ölüm hızları arttığı için zamanla konsantrasyonlarında azalma olur. Spesifik gelişme hızı (-) olur 4 3/6/2016 Spesifik (özgül) gelişme hızı (μ): • • • Birim zamanda toplam hücre sayısına kıyasla hücre miktarındaki artıştır. μ= 0.6 g m.o 1 saat sonunda 1.6 g olmuş demektir. (biyokitle miktarında % 60 artış olmuştur) birimi=1/h ; h-1 M.o’lar logaritmik evrede üstel çoğalırlar. Buna göre logaritik evredeki m.o gelişme hızı: • Problem: Bir maya fermentasyonunda inokülasyonun 6. saatinde ve 8. saatinde alınan örneklerde yapılan ölçümlerde biyokitle miktarları sırası ile 3.5 ve 5.4 g/L olarak ölçülmüştür. Bu mikroorganizmanın özgül gelişme hızını hesaplayınız. dN dx = μN = μx dt dt N=hücre sayısı Hücre sayısının deneysel olarak belirlenmesi zor olduğundan hücre büyümesi biyokitle artışı olarak hesaplanır. lnx2/x1 μ= ∆t μ= spesifik üreme hızı X1= hücre kons (g/L) t= süre (saat) M.o’ların üreme eğrileri ile spesifik üreme hızlarının bağlantısı • Lag fazda μ=0 • Uyum fazında sürekli artar • Logaritmik fazda sabittir ve μ=μmax • geçiş fazında azalmaya başlar • Durağan fazda sıfıra yakındır İkilenme (jenerasyon) süresi (generation doubling time) (td) • M.o konsantrasyonunun iki katına çıktığı süredir lnx2/x1 μ= ∆t Denkleminde yerine konulursa ln2 td= μ • Problem: Belirli kültür koşullarında spesifik gelişme hızı μ= 0.524 h-1 olan bir mikroorganizmanın ikilenme süresini hesaplayınız. • M.o’lar için tipik gelişme hızı değerleri μmax Jenerasyon süresi (h) Bakteri 0.69-3.0 1-0.25 Maya 0.34-0.6 2-1.15 Küf 0.1-0.34 6.9-2 5 3/6/2016 Verim katsayıları Bazı bakterilerin çeşitli substratlar üzerindeki ikilenme süreleri Bakteri substrat jenerasyon süresi (dakika) Escherichia coli Glikoz 17 Bacillus megaterium Sakkaroz 25 Streptococcus lactis Süt 26 Streptococcus lactis Laktoz broth 48 Lactobacillus acidophilus Süt 66-87 • M.o’ların gelişmeleri ve ürün oluşturmaları biyodönüşüm işlemleridir. Burada biyodönüşümü besleyen kimyasal besin maddeleri hücre kitlesi ve metabolitlere dönüşür. • Besin maddeleri ve enerji kaynakları ile oluşan hücre kitlesi ve ürünler arasındaki bağlantıları açıklayabilmek için verim etkinliğin bilinmesi gerekir. • Bu biyodönüşümler tüketilen her birim besin maddesine karşılık oluşan ürün veya hücre kitlesi olarak verim katsayıları şeklinde kantitatif olarak hesaplanabilir. Verim katsayıları • Hücre verim katsayısı: Tüketilen her birim substrata karşılık oluşan birim biyokitle Yx s • Ürün oluşum verim katsayısı: Tüketilen her birim substrata karşılık oluşan ürün miktarı dx x xo ds so s Yp s dP P P0 ds s0 s Teorik verim • Yukarıda açıklanan verim değerleri gözlemlenen (gerçekleşen) verim değerlerini ifade eder • Substrat üzerinden hücre kitlesi veya ürünlerin teorik verimlerini de hesaplamak mümkündür. • Örneğin : etil alkol fermentasyonunda • C6H12O6 (180g) • • Pratikte substratın bir kısmı hücre kitlesi oluşmu ve enerji bir kısmı da diğer yan ürünlerin oluşumunda kullanıldığı için belirtilen teorik verim elde edilemez. Ancak çok yaklaşılabilir. Örn etil alkol üretiminde teorik verimin % 90-95’ine ulaşılabilir. 2C2H5OH + 2CO2 (92 g) 100 g glikozdan 51.1 g etil alkol oluşur 6 3/6/2016 Substrat dönüşüm oranı • Gerçekleşen verimin teorik verime oranı ile % verim hesaplanır % verim = Gerçekleşen verim *100 Teorik verim Substratın % kaçının kullanıldığını gösterir. (Başlangıç subs miktarı – kalan substrat) Substrat dönüşümü % = * 100 başlangıçtaki subs. miktarı • Bu değer denemeleri planlamada ve sonuçları yorumlamada standart bir ölçü olarak kullanılır (S1- S2) Substrat dönüşümü % = * 100 S1 • Problem: S. cerevisiae ile glikozdan etil alkol üretiminin yapıldığı bir çalışmada 48 saatlik fermentasyon sonucunda aşağıdaki sonuçlar elde edilmiştir Glikoz Biyokitle Etil alkol Buna göre; Başlangıç 200g 0.5 0.8 48h 16 g 4.8 83 a) ürün oluşum verimini b) biyokitle verimin c) % verimi d) substrat dönüşüm oranını hesaplayınız 7