Su Ürünleri Yetiştiricilik Ana Bilim Dalı Hastalıklar Bilim Dalı Bilim

EGE ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ (DOKTORA TEZİ) ALABALIKLARDA (ONCORHYNCHUS MYKİSS, WALBAUM) ENFEKSİYÖZ PANKREATİK NEKROZİS (IPN) HASTALIĞININ TEŞHİSİNDE ENZYMELİNKED İMMUNOSORBENT ASSAY (ELISA) YÖNTEMİNİN GELİŞTİRİLMESİ Buket ÖZKAN ÖZYER Su Ür ünler i Yetiştir icilik Ana Bilim Dalı Hastalıklar Bilim Dalı Bilim Dalı Kodu : 504.05.01 Sunuş Tar ihi : 04.06.2007 Tez Danışmanı: Pr of. Dr . Haşmet ÇAĞIRGAN Bor nova  İZMİR
II
III
IV
V ÖZET ALABALIKLARDA (ONCORHYNCHUS MYKİSS, WALBAUM) ENFEKSİYÖZ PANKREATİK NEKROZİS (IPN) HASTALIĞININ TEŞHİSİNDE ENZYMELİNKED İMMUNOSORBENT ASSAY (ELISA) YÖNTEMİNİN GELİŞTİRİLMESİ ÖZKAN ÖZYER, Buket Doktora Tezi, Su Ürünleri Yetiştiricilik Ana Bilim Dalı, Hastalıklar Bilim Dalı Tez Yöneticisi: Prof. Dr. Haşmet ÇAĞIRGAN Haziran 2007, 89 Sayfa Enfeksiyöz pankreatik nekrozis (IPN), genç salmonid balıklarda yüksek mortalite ile seyreden ve önemli ekonomik kayıplara neden olan akut bulaşıcı viral bir hastalıktır. Bu tezde hastalığının teşhisinde standart bir metot olan enzim linked immunosorbent assay (ELISA) yönteminin geliştirilmesi ve IPN hastalığının teşhisi için kullanılması amaçlanmıştır. Enfeksiyöz pankreatik nekrozis virusunun (IPNV) teşhisi hücre kültüründe izolasyonu takiben serolojik tekniklerle identifikasyon ile yapılmaktadır. Bu çalışmada indirekt çift antikor ELISA yöntemi kullanılmıştır. Bunun için IPNV’nin VR 299, Sp ve Ab serotipleri pürifiye edilmiş ve bu serotiplere karşı tavşan ve kobaydan hiperimmun serum elde edilmiş ve bu antikorlar testte kullanılmıştır. Testin spesifitesini belirlemek için salmonid balıklarda hastalığa neden olan diğer viruslardan enfeksiyöz hematopoetik nekrozis virus (IHNV) ve viral hemorajik septisemi virusu (VHSV) kullanılmış ve çapraz reaksiyon görülmemiştir. Testin sensitivitesi VR299 serotipi için DKID50 değeri 10 6,6 /ml, Ab serotipi için DKID50 değeri 10 6,8 /ml ve Sp serotipi için DKID50 değeri 10 7,3 /ml olarak tespit edilmiştir.
VI Sonuç olarak IPN hastalığının teşhisi için geliştirilen ELISA yönteminin hızlı, basit ve ekonomik bir yöntem olarak kullanılabileceği düşüncesine varılmıştır. Anahtar sözcükler: Balık hastalıkları, IPN, ELISA, salmonid balıklar , teşhis
VII ABSTRACT DEVELOPMENT OF ENZYME LINKED IMMUNOSORBANT ASSAY (ELISA) METHOD FOR DIAGNOSIS OF INFECTIOUS PANCREATIC NECROSİS DİSEASE IN RAINBOW TROUT (ONCORHYNCHUS MYKİSS, WALBAUM) ÖZKAN ÖZYER, Buket PhD Thesis, Department of Fisheries Aquaculture , Branch of Fish Diseases Supervisor Prof Dr. Haşmet ÇAĞIRGAN June 2007, 89 pages Infectious pancreatic necrosis (IPN) is an acute contagious disease and causes high mortality and significant economic losses in young salmonid fish. In this thesis, ELISA that is used as a standart method was developed to be used for diagnosis of IPN. The diagnosis of IPN virus is made by virus isolation followed by serological identification technics. In this study sandwich ELISA technics was used. Fort his purpose VR299, Sp, and Ab serotypes of infectious pancreatic necrosis virus was purified and then hiperimmun sera were produced in rabbit and gine pigs against these serotypes. Finally these antibodies were used in the test. Other viruses like infectious hematopoietic necrosis virus and viral hemorrgagic septisemia virus that cause diseases in salmonid fish were used to determine the specificity of the test and cross reaction was not seen. Sensitivity of the test was found to be TCID50 10 6.6 /ml, 10 6.8 /ml, and 10 7.3 /ml for VR299, Ab and Sp respectively.
VIII As a result, development of ELISA method was considered to be simple, rapid, and economic method to be used for diagnosis of ınfectious pancreatic necrosis disease. Key words: Viral fish disease, IPN, ELISA, salmonid fish, diagnosis
IX TEŞEKKÜR Bu tezin hazırlanması, uygulanması ve sonuçlanması aşamasında yardımlarını esirgemeyen danışmanım Sayın Prof. Dr. Haşmet Çağırgan’a, doktora eğitimim süresince desteklerini gördüğüm Bornova Veteriner Kontrol ve Araştırma Enstitüsü idaresine, Viroloji Bölümü şefi Dr. Gülnur Kalaycı ve mesai arkadaşlarıma, tez çalışmamın farklı aşamalarında destek gördüğüm E.Ü Su Ürünleri Fakültesi Balık Hastalıkları Bilim Dalı araştırma görevlisi Uğur Değirmenci ve araştırma görevlisi Ulviye Karacalar’a, tez çalışmamın her aşamasında bana destek veren eşim Dr. Mestan Özyer’e, çalışmam süresince gösterdiği anlayış ve moral desteği için kızım Irmak Apaydın ve aileme çok teşekkür ederim.
X
XI İÇİNDEKİLER Sayfa ÖZET ………………………………………………………...............V ABSTRACT ……………………………………………………….VII TEŞEKKÜR ………………………………………………………. IX ÇİZELGELER DİZİNİ …………………………………………. XV GRAFİKLER DİZİNİ …………………………………………… XIX EKLER DİZİNİ ………………………………………………… XXI SİMGELER VE KISALTMALAR DİZİNİ …………………….XXIII 1. GİRİŞ ………………………………………………………. 1 2. Literatür Özeti ………………………………………………... 2 2.1 Hastalığın Tarihçesi ……………………………………….. 2.2 Etiyoloji …………………………………………………….. 2.3 Epizootiyoloji ………………………………………………. 2.4 Klinik Belirtiler ……………………………………............ 2.5 Patogenez ……………………………………………............ 2.6 Patoloji …………………………………………………….... 2.7 Teşhis …………………………………………………….…. 2.8 İmmunite ………………………………………………….… 2.9 Kontrol …………………………………………………….... 2 3 5 6 7 8 8 14 15 3.GEREÇ VE YÖNTEM ………………………………….….. 16 3.1 Gereç …………………………………………………….….. 16 3.1.1 Hücre Kültürü ………………………………………….….. 3.1.2 Antijen ……………………………………………….…… 3.1.3 Deneme hayvanları ………………………………………. 3.1.4 Mikroplaklar ……………………………………………… 3.1.5 Konjugatlar …………………………………………….…. 16 16 16 17 17
XII İÇİNDEKİLER (devam) 3.1.6 Virus izolasyon materyalleri ……………………………… 3.2 Yöntem……………………………………………………… 17 17 3.2.1 Hücre kültürünün hazırlanması …………………………… 3.2.2 Saha materyalinden virus izolasyonu ve identifikasyonu…. 3.2.3 ELISA testi için hazırlık basamakları……………………... 3.2.3.1 Virusların üretilmesi …………………………………….. 3.2.3.2 Virusların titrasyonu …………………………………….. 3.2.3.3 IPN virusunun pürifikasyonu …………………………… 3.2.3.4 Tavşan ve kobay antiserumlarının hazırlanması ………... 3.2.3.5 Tavşan ve kobay antiserum titreleri …………………….. 3.2.3.6 Deneysel enfeksiyon ……………………………………. 3.2.3.7 Antikorların pürifikasyonu ……………………………… 3.2.4 ELISA testinin uygulama basamakları …………………… 3.2.4.1 Mikroplakların kaplanması ……………………………... 3.2.4.2 Bloklama ………………………………………………... 3.2.4.3 Yıkama …………………………………………………. 3.2.4.4 Antijen ilave edilmesi …………………………………... 3.2.4.5 Sekonder antikor ilave edilmesi ………………………… 3.2.4.6 Konjugat ………………………………………………… 3.2.4.7 Substrat ilave edilmesi ………………………………….. 3.2.4.8 Konjugat ve sekonder antikor konsantrasyonu………….. 3.2.4.9 Testin spesifitesinin belirlenmesi ……………………….. 3.2.4.10 Testin sensitivitesinin belirlenmesi ……………………. 3.2.4.11 Saha izolatına testin uygulanması ……………………... 3.2.5 ELISA sonuçlarının değerlendirilmesi……………………… 17 18 18 18 19 19 20 21 21 22 22 22 23 23 23 24 24 24 25 25 25 26 26 4. BULGULAR …………………………………………………. 27 4.1 Virusların Üretilmesi ……………………………………… 4.2 Virusların Titrasyonu ……………………………………… 27 27 4.3 Virusların Pürifikasyon Sonucu …………………………... 27 4.4 Deneysel Enfeksiyon ………………………………………... 28 4.5 Tavşan ve Kobay Antiserumlarının Nötralizan Antikor titreleri …………………………………………………………... 28
XIII İÇİNDEKİLER (devam) 4.6 Pürifiye Edilen Antikorların Protein Miktarları …………… 29 4.7 SahaVirusu İzolasyon ve İdentifikasyonu ………………….. 4.8 ELISA Test Sonuçları …………………………………….. 30 30 4.8.1 Konjugat ve sekonder antikor konsantrasyonu …….…….. 30 4.8.2 Testin spesifitesi ile ilgili çalışma sonuçları ……………… 33 4.8.3 Primer antikor olarak anti IPNV kobay antikorları kullanımı…………………………………………………... 4.8.4 IPNV VR299 sensitivitesinin belirlenmesi ………………. 37 39 4.8.5 IPNV Ab sensitivitesinin belirlenmesi ………………....… 42 4.8.6 IPNV Sp sensitivitesinin belirlenmesi ………………….…. 45 4.8.7 IPNV VR299, AB, Sp birlikte kullanımda sensitivitenin belirlenmesi ............................................................................ 4.8.8 Deneysel enfeksiyonda ELISA test sonuçları …………..….. 48 54 4.8.9 Saha izolatına uygulanan ELISA test sonuçları 63 5. TARTIŞMA …………………………………………………. 67 6. SONUÇ ………………………………………………………. 73 7. KAYNAKLAR DİZİNİ ……………………………………… 74 8. EKLER ……………………………………………………….. 82 9. ÖZGEÇMİŞ ………………………………………………….. 89
XIV
XV ÇİZELGELER DİZİNİ Çizelge Sayfa 4.1 IPNV serotiplerinin DKID50 /ml değerleri …………………... 27 4.2 Deneysel enfeksiyondan ölen balıkların dokularında bulunan virusun DKID50 /gr değerleri …………………………………….. 28 4.3 Tavşan ve kobaylardan elde edilen IPNV’ye spesifik serumların nötralizan antikor değerleri …………………………... 29 4.4 Tavşan ve kobaylardan elde edilen IPNV’ye spesifik serumların sodyum sülfat ile pürifikasyonu sonucu elde edilen protein konsantrasyonları ………………………………………… 29 4.5 IPNV VR299 serotipi için optimum konjugat ve sekonder antikor konsantrasyonlarının belirlenmesi için uygulan ELISA testinin 492 nm de OD değerleri ………………………………… 31 4.6 IPNV Ab serotipi için optimum konjugat ve sekonder antikor konsantrasyonlarının belirlenmesi için uygulan ELISA testinin 492 nm de OD değerleri ………………………………………….. 32 4.7 IPNV Sp serotipi için optimum konjugat ve sekonder antikor konsantrasyonlarının belirlenmesi için uygulan ELISA testinin 492 nm de OD değerleri ………………………………………….. 33 4.8 IPNV VR299 serotipi için uygulanan ELISA testinin spesifitesi ile ilgili çalışma sonucunda 492 nm’de okunan OD değerleri ………………………………………………………...... 34 4.9 IPNV Ab serotipi için uygulanan ELISA testinin spesifitesi ile ilgili çalışma sonucunda 492 nm’de okunan OD değerleri……. 35 4.10. IPNV Sp serotipi için uygulanan ELISA testinin spesifitesi ile ilgili çalışma sonucunda 492 nm’de okunan OD değerleri……. 36
XVI ÇİZELGELER DİZİNİ (devam) 4.11.IPNV VR299, Ab ve Sp serotiplerinin birlikte uygulandığı ELISA testinin spesifitesi ile ilgili çalışma sonucunda 492 nm’de okunan OD değerleri ……………………………………………... 37 4.12 Kobay anti IPNVAb antikoru ile kaplama yapıldığında Ab serotipine ait OD değerleri ……………………………………….. 38 4.13 Kobay anti IPNVSp antikoru ile kaplama yapıldığında Sp serotipine ait antikor değerleri …………………………………… 39 4.14 IPNV VR299 serotipi için uygulanan ELISA testinin sensitivite sonuçları ………………………………….………….. 40 4.15 IPNVVR299 serotipi Doku kültürü sonuçları Pozitif / Negatif OD oranları(492 nm) ve cut off değerleri …………….... 41 4.16 IPNV Ab serotipi için uygulanan ELISA testinin sensitivite sonuçları ……………………………………………………..…… 43 4.17 IPNV Ab serotipi Doku kültürü sonuçları pozitif / Negatif OD oranları (492 nm) ve cut off değerleri ...................................... 44 4.18 IPNV Sp serotipi için uygulanan ELISA testinin sensitivite sonuçları ………………………………………………………….. 46 4.19 IPNV Sp serotipi Doku kültürü sonuçları pozitif / Negatif OD oranları (492 nm) ve cut off değerleri ………......................... 47 4.20 Üç serotipe karşı elde edilen antikorların birlikte uygulandığı sistemde VR299 serotipinin sonuçları …………..….. 49 4.21 Üç serotipe karşı elde edilen antikorların birlikte uygulandığı sistemde Ab serotipinin sonuçları …………………………….….. 50 4.22 Üç serotipe karşı elde edilen antikorların birlikte uygulandığı sistemde Sp serotipinin sonuçları ……………..…….. 50
XVII ÇİZELGELER DİZİNİ (devam) 4.23 IPNV VR299, Ab, Sp serotipinin birlikte uygulanmasındaki pozitif / Negatif OD oranları (492 nm) ……... 51 4.24 Üç serotipe karşı elde edilen antikorların birlikte uygulandığı ELISA testinde Cut Off Değerleri ………………….. 51 4.25 IPNV VR299 serotipinin deneysel enfeksiyondan sonra direk balık dokusundan yapılan ELISA test sonuçları…………… 55 4.26 IPNV Ab serotipinin deneysel enfeksiyondan sonra direk balık dokusundan yapılan ELISA test sonuçları ……………...…. 56 4.27 IPNV Sp serotipinin deneysel enfeksiyondan sonra direk balık dokusundan yapılan ELISA test sonuçları ……………..…... 56 4.28 IPNV VR299 serotipi için deneysel enfeksiyon sonrası direk balık dokusundan uygulanan ELISA testinin Pozitif / Negatif OD oranları (492 nm) ……………………………..……. 57 4.29 IPNV Ab serotipi için deneysel enfeksiyon sonrası direk balık dokusundan uygulanan ELISA testinin Pozitif / Negatif OD oranları (492 nm) ……………………………………………….. 58 4.30 IPNV Sp serotipi için deneysel enfeksiyon sonrası direk balık dokusundan uygulanan ELISA testinin Pozitif / Negatif OD oranları (492 nm) ……………………………………………….. 58 4.31. IPNV VR299, Ab, Sp serotipleri için direk balık dokusundan uygulanan ELISA testinin cut off değerleri……….… 59 4.32. Saha izolatının üç serotipin birlikte kullanıldığı sistemdeki OD değerleri (492 nm) …………………………………….……... 63 4.33. Saha izolatının üç serotipin birlikte kullanıldığı sistemdeki Pozitif / negatif (P/N) OD oranları (492 nm) ve cut off değerleri 64 4.34. Saha izolatının ticari test kiti kullanımı sonucunda OD değerleri (450 nm)…………………………………………………………………. 66
XVIII
XIX GRAFİKLER DİZİNİ Grafik Sayfa 4.1 IPNV VR299 serotipine karşı uygulanan sistemdeki sensitivite sonuçları …………………………………………... 42 4.2 IPNV Ab serotipine karşı uygulanan sistemdeki sensitivite sonuçları ……………………………………………………… 45 4.3 IPNV Sp serotipine karşı uygulanan sistemdeki hücre kültüründen sensitivite sonuçları …………………………….. 48 4.4 Üç serotipe karşı elde edilen antikorların birlikte uygulandığı ELISA sisteminde VR299 serotipinin sensitivite sonuçları ……….. ……………………………………………. 52 4.5 Üç serotipe karşı elde edilen antikorların birlikte uygulandığı ELISA sisteminde Ab serotipinin sensitivite sonuçları ……………. ……………………………………….. 53 4.6 Üç serotipe karşı elde edilen antikorların birlikte uygulandığı ELISA sisteminde Sp serotipinin sensitivite sonuçları …………….. ………………………………………. 54 4.7 IPNVVR299 serotipinin deneysel enfeksiyondan sonra direk balık dokusundan yapılan ELISA test sonuçları ………. 60 4.8 IPNVAb serotipinin deneysel enfeksiyondan sonra direk balık dokusundan yapılan ELISA test sonuçları ……………. 61 4.9 IPNVSp serotipi için deneysel enfeksiyondan sonra direk balık dokusundan yapılan ELISA test sonuçları ……………... 62 4.10 Saha izolatının 3 serotipin birlikte kullanıldığı sistemdeki bulguları(492 nm de OD değerleri) ………………………….. 65
XX
XXI EKLER DİZİNİ EK Sayfa 1. Çift antikor sandviç ELISA yönteminin basamaklarının şematik görünümü ……………………………………………. 82 2. Çift antikor sandviç ELISA yönteminin genel uygulama basamakları …………………………………………………... 83 3. IPNV pürifikasyonu için uygulanan %1545 sukroz gradient sonucu oluşan bandlar ………………………………. 84 4. IPNV ile yapılan deneysel enfeksiyon sonucunda yavru alabalıklarda oluşan klinik semptomlar ……………………… 85 5. BF2 hücre hattında virus izolasyonu ……………………... 86 6. Saha materyaline uygulanmış IFAT sonucu ………………. 87 7. Geliştirilen ELISA testi sonucunda oluşan renklenmenin göz ile değerlendirilebilir görünümü …………………………. 88
XXII
XXIII SİMGELER VE KISALTMALAR DİZİNİ Ab Abild AS Atlantic salmon BF2 Bluegill fry CHSE214 chinook salmon embriyo CPE Sitopatolojik effekt DKID50 Doku kültürü enfeksiyon dozu % 50 EMEM Earle minimum essential medium ELISA Enzyme linked immunosorbent assay EPC Epithelioma papulosum cyprini FCA Freund complete adjuvan FHM Fead head minnow FIA Freund incomplete adjuvan HRP Horse radish peroxidase IFAT Immun floresan antikor tekniği Ig Immunglobulin IHNV Enfeksiyöz hematopoetik nekrozis virus IPN Enfeksiyöz pankreatik nekrozis IPNV Enfeksiyöz pankreatik nekrozis virus
ml Mikrolitre
mg Mikrogram
mm Mikrometre OD Optik dansite OIE Dünya hayvan sağlık örgütü OPD ophenylenediamine
XXIV SİMGELER VE KISALTMALAR DİZİNİ (devam) PBS Phosphate buffer saline PEG 6000 polyethylen glicol 6000 RNA Ribonükleik asit RTG2 Rainbow trout gonad 2 PCR Polimeraz zincir reaksiyonu SDG Sukroz dansiti gradient SN Serum nötralizasyon
°C Derece santigrat Sp Spjarup TKB Tarım ve Köyişleri Bakanlığı WB West Buxton VHSV Viral hemorajik septisemi virus VP Viral protein
1 1.GİRİŞ Enfeksiyöz pankreatik nekrozis (IPN) özellikle genç salmonid balıklarda yüksek mortalite ile seyreden, önemli ekonomik kayıplara neden olan bulaşıcı akut viral bir hastalıktır. Dünyanın birçok ülkesinde yaygın olarak seyrederen IPN hastalığı Türkiye’de de görülmekte olup ihbarı mecburi hastalıklar listesinde bulunmaktadır. Ülkemizde IPN’nin epizootiyolojik durumu ve yaygınlığı henüz tam olarak bilinmemektedir. Bu nedenle balık çiftliklerinden temin edilmiş materyaller üzerinde muayeneler yapılarak hastalığın filyasyonunun belirlenmesi, hastalığın kontrol ve eradikasyon programlarının yapılması gerekmektedir. Viral balık hastalıklarının teşhisinde enzim linked immunosobent assay (ELISA); yüksek duyarlılıkta olması, diğer testlere göre daha kısa sürede sonuç alınması, çok sayıda örneğin eş zamanlı muayene edilebilmesi ve sonuçların tekrarlanabilirliğinin yüksek olması gibi avantajlarından dolayı tercih edilmektedir. Bu çalışmada doku kültüründe izole edilen enfeksiyöz pankreatik nekrozis virusunun (IPNV) teşhisinde kullanılabilecek bir ELISA yönteminin geliştirilmesi ve bu amaçla bir teşhis kiti hazırlanması amaçlanmıştır. IPN gibi önemli bir balık hastalığının teşhisi ve rutin tarama çalışmaları için ELISA’nın kullanılması maliyet, iş gücü ve zaman açısından büyük avantajlar sağlayacaktır. ELISA kitinin ülkemizde hazırlanması ile test maliyetinin düşürülmesi yanında dışa bağımlılığı azaltacak, ülke ekonomisine de katkıda bulunulacaktır.
2 2. LİTERATÜR ÖZETİ IPN enfeksiyonu özellikle genç salmonid balıklarda yüksek mortalite ile seyreden önemli ekonomik kayıplara neden olan akut seyirli bulaşıcı viral bir hastalıktır. IPNV balıklardan izole edilen ilk virustur ve balık virolojisinde önemli gelişmelerin başlangıcı olmuştur (Wolf, 1988; Dopazo and Barja, 2002). IPNV salmonid balıkların yanısıra 20 den fazla balık türünden, çift kabuklu yumuşakçalardan ve diğer omurgasızlardan da izole edilmiştir (Suzuki and Nojima, 1999, Essbauer and Ahne, 2001). 2.1 Hastalığın Tarihçesi Hastalık ilk olarak Kanada’ da 1940 yılında M’Gonigle tarafından, ilk yem alma dönemindeki yavru alabalıklarda görülmüş, beslenme hatalarına bağlı bir sendrom olduğu düşünülerek “akut kataral enteritis” olarak isimlendirilmiştir. Daha sonra Wood et.al. Amerika’da 1955 yılında akut kataral enteritisle seyreden olgunun enfeksiyöz özellikte olduğunu belirterek hastalığa “enfeksiyöz pankreatik nekrozis” adını vermişlerdir. IPNV ilk olarak 1957 yılında Wolf and Dunbar tarafından Salvelinus fontinalis’ den izole edilmiştir. Gökkuşağı alabalıklarından (Oncorhynchus mykiss) ise 1963 yılında Parisot et.al. tarafından rapor edilmiştir (Wolf, 1988). Avrupa’da ilk IPN salgını 1964 yılında Güney Fransa’da gökkuşağı alabalıklarında (Oncorhynchus mykiss) görülmüştür. Hastalığın Danimarka’ da 1969, İskoçya’da 1971, İngiltere ve İtalya’ da 1972, İsveç’ de 1973, Almanya’ da 1975, Norveç’ de 1976 yılında görüldüğü bildirilmiştir. Asya da ilk IPNV izolasyonu Japonya’ da 1971 yılında, Tayvan’ da 1983 ve Yeni Zelanda’ da 1987 yılında bildirilmiştir (Wolf, 1988; Dopazo and Barja, 2002). Türkiye’de IPN hastalığı ilk olarak, 2000 yılında Candan tarafından gökkuşağı alabalıklarında bildirilmiştir (Candan, 2000).
3 IPN 2006 yılı sonuna kadar Dünya Hayvan Sağlık Örgütü (OIE)’de ve Avrupa Birliği (AB)’nde önemli hastalıklar listesinde yer alırken (Anonim, 1991; Anonim, 2003) 2006 yılından sonra listelerden çıkarılmıştır (Anonim, 2006). Ancak Türkiye’de 3285 sayılı Hayvan Sağlığı Zabıtası Kanununa (Tarım ve Köyişleri Bakanlığı, 1986) göre yayınlanan “ihbarı mecburi hastalıklar” tebliğine göre (Tarım ve Köyişleri Bakanlığı, 2004) bildirimi zorunlu balık hastalıkları içinde yer almaktadır. 2.2 Etiyoloji IPNV, Birnaviridae familyasında Aquabirnavirus genusunda yer almaktadır (Reno, 1999). Birnaviridae familyasında Avibirnavirus ve Entomobirnavirus genuslarıda bulunmaktadır (Essbauer and Ahne, 2001) IPNV 5575 nm çapında, ikozahedral simetrili, zarsız, iki segmentli ve çift iplikçikli bir RNA ya sahiptir (Wolf, 1988). IPNV’unun genomunda 2,5 kb’lik A segmenti ve, 2,3 kb’lik B segmenti bulunur (Dobos, 1976, 1977). Kapsomerlerin toplam sayısı 132 dir. Kapsid belirgin olarak tek kılıf şeklindedir. IPNV asit, eter ve gliserole dayanıklıdır (Smail and Munro, 1989). IPNV pH 5,07,0 aralığında serum içeren vasat içerisinde 4°C de 4 ay, 20°C veya daha düşük sıcaklıklarda daha uzun süre canlı kaldığı bildirilmektedir (Wolf, 1988). IPNV % 10 gliserol içinde +4°C de birkaç yıl, % 10 serum veya % 50 gliserol içinde 80°C de daha uzun süre saklanabilmektedir (Smail and Munro, 1989). Hücre kültüründe üremiş bazı IPNV suşlarının dondurma ve çözdürme sonrasında virulansının önemli ölçüde düştüğü gösterilmiştir (Wolf and Qimby, 1971). Laktalbumin hidrolizat, laktoz ve yağsız süt tozu ilavesi ile liyofilizasyon ile saklanması mümkündür (Wolf et al., 1969). Virus asidik pH (2,5)’ya dayanıklı ancak alkali pH (12,2)’ya dayanıksızdır. IPNV, ultraviole ışığına oldukça dirençlidir ve inaktivasyon için gereken doz enfeksiyöz hematopoetik nekrozis virusu (IHNV) için gerekenin 100 katıdır. Tatlı suda iodin ve klorin gibi okside olan ajanlar tarafından hızla inaktive olmaktadır (McAllister, 1979; Wolf,1988; Smail and Munro, 1989).
4 IPNV in vitro olarak hücre kültürlerinde 10 6 10 9 PFU/ml enfeksiyözite gücünde ve litik CPE oluşturarak üreyebildiği gibi CPE oluşturmadan defektif interfering partikülleri ile persiste enfeksiyonlarada yol açabilmektedir (Wolf, 1988). IPNV’ye ait 5 viral polipeptid (VP) bulunmaktadır; Bunlardan VP1; RNA polymeraz karakterde ve 95105 kDa’dur. VP2; major kapsid protein olup, enfektivitede ve tip spesifik nötralizan monoklonal antikor üretiminde önemli ve 46 54 kDa dominant virion proteinidir. VP3; internal virion proteinidir ve 3132 kDa’dur. VP4; yapısal olmayan bir proteindir ve 29 kDa’dur.VP5; yapısal olmayan bir proteindir ve 17 kDa’dur (Dobos and Rowe, 1977; Smail and Munro 1989; Rimstad, 2003). IPNV’nin içinde bulunduğu Aquabirnaviruslar bir çok akuatik hayvandan izole edilmiştir ve antijenik olarak farklı gruplardan oluşmaktadır (Dopazo and Barja, 2002). Yapılan araştırmalarda IPNV izolatlarının serotiplendirme çalışmalarında poliklonal antikorlarla nötralizasyon, poliklonal antikorlar ve monoklonal antikorlar ile immunodot testleri ve poliakrilamid jel elektroforezisi kullanılmıştır (Caswell Reno et al.,1986; Nicholson, 1993; Novoa et al., 1995; Cutrin et al., 2000). IPNV’nin serolojik sınıflandırılmasında 3 ana serotip tanımlanmıştır. Bunlardan VR299 (WB) ilk defa Amerika’da, Ab (Abild) ve Sp (Spjarup) serotipleri ise Avrupa’dan izole edilmişlerdir (Novoa et. al., 1995; Rimstad, 2003). Aquatik canlılardan izole edilen IPNV ve benzeri virusların serotiplendirmesinde değişik araştırmacılar farklı adlandırmalar kullanmışlardır. Bunlar serogrup A ve serogrup B olmak üzere iki ana grupta toplanmışlardır. Serogrup A içinde A1 (WB, VR 299), A2 (Sp), A3 (Ab), A4 (He), A5 (Te), A6 (C 1), A7 (C 2), A8 (C 3) ve A9 (Jasper) olmak üzere 9 alt serotip tanımlanmıştır. Serogrup B içinde sadece B1 serotipi tanımlanmıştır (Hill and Way, 1995; Rimstad, 2003). Bazı yazarlar tarafından serogrup A içinde A10 (N 1) serotipininde olduğu ileri sürülmüş (Christie et al., 1988) ancak bu serotipin Sp ile ilgili olduğu gösterilmiştir ( Melby and Christie, 1994).
5 IPNV genetik olarak da incelenmiş ve son yapılan çalışmalarda 7 genogrubun olduğu belirtilmiştir. Ancak bu grupların serolojik ilişkileri üzerindeki çalışmalar oldukça yenidir (Nishizawa et. al., 2005). 2.3 Epizootiyoloji IPNV Dünyada yaygın olarak görülmektedir. Virus hem tatlı su hemde deniz balıklarında , salmonid ve diğer teleost balık türlerinde bulunabilmektedir. Salmonid olmayan balık türlerinden japon balığında (Carassius auratus), diskusta (Symhysodon discus), çapak balığında (Abramis brama ) (Adair et. al., 1981), kalkanda (Scophthalmus maximus) (Novoa et. al., 1993), sarıkuyrukta (Seriola quinqueradiata ), yılan balığında (Anguilla Sp), çizgili levrekde (Morone saxatilis), halibutta (Hippoglossus hippoglossus), Atlantik kodda (Gadus morhua ) ve levrekte (Dicentrarchus labrax) hastalık bildirilmiştir.(Hudson et. al., 1981; Sano et. al., 1981; Wechsler et. al., 1987; McAllister et. al., 1984; Hsu et. al., 1993; Noga, 1996; Isshiki et. al., 2001; OIE, 2003; Gahlawat et. al., 2004; Cutrin et al., 2005). Hastalığın ana kaynağı IPNV ile enfekte kuluçkahaneler ve asemptomatik taşıyıcı balıklardır. Virus, taşıyıcı balıkların üreme sıvıları ve dışkıları ile yayılmaktadır. Aktif bir salgın sırasında virus dışkı ve idrar yolu ile yayılabilmektedir (Wolf,1988; Dopazo and Barja, 2002). Bulaşma direkt olarak kontakt, solungaçlar ve sindirim sistemi kanalı yoluyla, vertikal olarak yumurta ve spermler aracılığıyla olmaktadır (Wolf, 1988). IPNV deneysel enfeksiyondan sonra tavuk, baykuş, martı ve minklerden reizole edilmesine rağmen bu hayvan türlerinde doğal enfeksiyon yaptığı gösterilememiştir. Bu yüzden kanatlı ve memeli hayvanların IPNV’nun yayılmasında mekanik vektör olduğu düşünülmektedir (Schlotfeldt, 1979). Taşıyıcı balıkların böbreklerinden virus izolasyonu, dalak, pankreas, gonad ve feçesden izolasyonuna göre daha başarılıdır. Dolaşımda nötralizan antikor varlığının taşıyıcılık oranını ve dokudaki virus miktarını düşürdüğü yapılan çalışmalarda
6 gösterilmiştir (Yamamoto, 1975). IPNV taşıyan erişkin balıklarla ilgili yapılan diğer bir çalışmada, deneysel enfeksiyondan 15 ay sonra bile lökositlerden virus izole edilmiş, serumda da nötralizan antikor varlığı gösterilmiştir (Ahne and Thomsen, 1986). IPNV ile kontamine çiftliklerin atık suları, doğal balıklarda ve çevrede virusun yayılımında rol oynadığı bildirilmiştir (Mc Allister and Bebak, 1997). Hastalık stok yoğunluğu, balığın kondisyonu, mevsim, su sıcaklığı, suyun kirliliği, diğer enfeksiyonların varlığı, parazit enfestasyonu ve etkenin virulansına bağlı olarak %1090 mortalite ile seyredebilir (Schlotfeldt, 1979). Salmonidlerde Sp serotipinin virulent olmasına rağmen Ab serotipinin avirulen olduğu belirtilmektedir (Vestergard Jorgensen and Kehlet,1971). 2.4 Klinik Belirtiler IPN hastalığının belirtileri etkilenen konakçının türüne, yaşına, virusun serotipine ve su sıcaklığına göre değişebilmektedir (Frantsı and Savan, 1971). Tipik belirtiler ilk besleme yapılan alabalıklarda tanımlanmıştır. Etkilenen balıklarda; iştahsızlık, renkte koyulaşma (özellikle vücudun arka 1/3 lük bölümünde), ekzoftalmus, tirbişon şeklinde yüzme, abdominal şişlik, solungaçlarda solukluk, ventral bölgede ve vetral yüzgeçlerde hemorajiler, uzamış halde dışkı (pseudofeçes) görülür. İç organların muayenesinde mide ve barsaklar besinden yoksun, renksiz sarı sütümsü jelatinimsi bir eksudat ile dolu olup, sıklıkla pankreas, midebağırsak bölümünde hemorajiler, bazı yavru balıkların dalak, kalp, karaciğer ve böbreklerinde anormal solgunluk, pilorik seka ve anterior adipoz dokuda nokta tarzında kanamalar, karın boşluğunda assit görülür (Yasutake, 1975; Wolf, 1988; Smail, 1989; Noga, 1996). IPNV salmonid olmayan balık türlerinden sarı kuyruklarda (Seriola quinqeradiata ) kranial hemoraji ve assit, Japon yılan balıklarında (Anguilla japonica ) nefritis ve kalkan balıklarında (Scophthalmus maximus) hematopoietik dokuda nekroz,
7 levrek (Dicentrarchus labrax) larvalarında spiral şeklinde yüzme, hava keselerinde şişlik ve ekzoftamus ile ilişkili olduğu bildirilmiştir (Wolf, 1988; Noga, 1996; Dopazo and Barja, 2002). 2.5 Patogenez IPNV, konakçı vücuduna solungaçlar, lateral çizgi ve sindirim yolu aracılığı ile girmektedir (Smail and Munro, 1989; Dopazo and Barja, 2002). Hastalığın inkubasyon süresi; sıcaklık, balığın yaşı, türü, balığın fiziksel durumu, virusun sayısı ve virulansına göre değişmektedir. IPNV ile yapılan deneysel enfeksiyonlarda immersiyon yolu ile uygulamadan 620 gün sonra, virusun enjekte edilmesinden ise 310 gün sonra ölümler başlamıştır. Su sıcaklığı 1016°C arsında olduğu zaman hastalığın inkubasyon periyodu kısadır. En fazla ölümler 1013°C arasında görülmektedir. 46°C ve 16°C nin üzerinde ölüm oranı düşmektedir. Salgınlar 46°C de 4 ay, 1016°C de ise 36 hafta sürebilmektedir (Dopazo and Barja, 2002). Deneysel olarak kontamine edilmiş yemlerin yedirilmesi ve intra peritoneal enjeksiyon ile de hastalık oluşturulmuştur. Deneysel enfeksiyondan sonraki 40 günlük sürede, IPNV plazma ve başlıca mononüklear hücreleri içeren kan lökositlerinden izole edilebilmektedir. Virus kan yoluyla ana hedef organlar olan ekzokrin pankreas, böbrek, karaciğer ve dalağa yayılır. İntra peritoneal enjeksiyon ile oluşturulan enfeksiyondan sonra viral antijen floresan antikor tekniğiyle 3. günde pankreasta, 9. günde ise böbrekte bulunduğu gösterilmiştir. Kandaki mononüklear hücrelerin, enfeksiyonun ilk yayılımından sorumlu olduğu, makrofajların da virusu barındırdıkları düşünülmektedir. Klinik belirti göstermeksizin virus, taşıyıcı olan balıklarda 3 yıla kadar ön böbrekde bulunmakta ve periferal kan lökositlerinden izole edilebilmektedir. Virus ayrıca lökositlerde enfeksiyöz olmayan halde bulunabilir (defektif virus) ve hücre bölünmesinin stimilasyonu ile enfeksiyöz hale geçebilmektedir (Smail and Munro, 1989).
8 2.6 Patoloji IPN’de histopatolojik bulgular virusun serotipi, konakçı ve çevresel koşullara bağlıdır (Smail and Munro, 1989). Özellikle ekzokrin salgı dokularının nekrozu ve yangısıyla karakterize pankreatit vardır. Pankreas nekrozu genellikle fokal seyreder ve asiner dokuda lenfositik infiltrasyon vardır. Enfeksiyonu atlatan balıklarda ekzokrin doku fibrotik doku ile yer değiştirir. Bağırsaklarda patolojik bozukluklar sadece klinik olarak hasta balıklarda görülür ve bağırsak mukozasında dökülme veya nekroz ile karakterize kataral enterit tablosu vardır. Pilorik seka epitel hücrelerinde McKnight hücreleri şekillenir. Böbrekdeki hematopoietik dokuda ödem ve nekrobiotik değişiklikler vardır. Karaciğer oldukça az etkilenir (Wolf and Quimby, 1971; Yasutake, 1975; Noga, 1996). Asemptomatik taşıyıcı ve büyük balıklarda hastalık strese bağlı olarak aktive olabilir. Bu gibi enfeksiyonu geçiren taşıyıcılarda balık 2,5 yaşına gelinceye kadar ekzokrin pankreasının %75’inde dejeneratif bulgular görülebilir. Ancak ekzokrin pankreasın kalan kısmı sindirim işlevlerinin sürmesi için yeterlidir. Asiner dokunun çevresindeki yağ doku kaybolur ve fibröz stromada küçük piknotik hücreler görülür (Smail and Munro, 1989). 2.7 Teşhis Viral hastalıklarda hastalığın yayılımının önlenmesi ve sağlıklı stokların korunması için erken ve hızlı teşhis çok önemlidir. Viral hastalıklarda virus izolasyonu veya antijenin belirlenmesi ile yapılan teşhise direkt, kandaki spesifik antikorların aranmasıyla yapılan teşhise indirekt teşhis denir. Viral enfeksiyonların tanısı için kullanılan yöntemleri üç ana grupta toplamak mümkündür. Bunlar; 1. Direkt olarak virusun veya viral antijenin hastadan alınan örneklerde gösterilmesi 2. Etken virusun izolasyonu ve identifikasyonu
9 3. Serolojik testlerle etkene özgül antikorların gösterilmesi şeklindedir. 1. Direkt olarak virusun veya viral antijenin hastadan alınan örneklerde gösterilmesi; Bu grupta bulunan yöntemler hem kısa zamanda cevap vermesi yönünden hemde in vitro olarak üretilemeyen virusların saptanmasında oldukça önemlidir. Bu yöntemler elektron mikroskobi, inklüzyon cisimciklerin saptanması, virus için spesifik DNA veya RNA’ nın ortaya konulması ve antijen antikor reaksiyonlarını ortaya koyan serolojik testlerdir. Elektron mikroskobinin pahalı bir yöntem olması yanında incelenen örnekte birden fazla aynı veya farklı yapı ve morfolojide viruslar bulunması gibi sakıncaları vardır. Mikroskobik tekniklerden biri olan inklüzyon cisimciklerinin saptanmasında da esas viral partiküllerin diğer viral partiküllerden ayrılmasında güçlükler olabilmektedir. Virus için spesifik DNA veya RNA’nın ortaya konması prensibinde olan moleküler yöntemlerden sık kullanılanlar in situ hibridizasyon ve amplifikasyon esasına dayanan polimeraz zincir reaksiyonu (PCR)’dur. PCR yöntemi testin hızlı olması, sensitivitesinin yüksek olması ve az miktarda örnek ile çalışılması gibi avantajlara sahip olmasına rağmen, hedef DNA sekans bilgilerine ihtiyaç duyulması, kontaminasyondan kaynaklanan yalancı pozitif sonuçların olması ve pahalı ekipman gerektirmesi ile canlı ve inaktif virusun ayırt edilememesi gibi dezavantajları vardır. 2. Etken virusun izolasyonu ve identifikasyonu Virusların izolasyonu embriyonlu yumurta, deney hayvanları ve duyarlı hücre kültürü sistemleri kullanılarak yapılmaktadır. İzole edilen virusun identifikasyonu için immunolojik testlerden yararlanılır. Tanımlamada referans alınan test virus nötralizasyon testidir. Ayrıca immunofloresan testi (IF), ELISA, radio immo assay (RIA), komplement birleşme testi (CF), hemadsorbsiyon inhibisyon testi (HadI) ve
10 hemagglütinasyon inhibisyon testi (HAI) kullanılabilir. Virus izolasyonu zaman alıcı ve zahmetli olmasına rağmen en özgün klasik yöntemdir. 3. Serolojik testlerle etkene özgül antikorların gösterilmesi Akut viral enfeksiyonlar sırasında etkene özgül antikorlar oluşmaktadır. Enfeksiyonun akut devresinden başlayarak konvelesan devresine kadar antikorlarda artış görülür. Çift serumla (akut ve konvelasan dönemde toplanan örnekler) yapılan serolojik testlerle tanıya gitmek mümkündür. Ancak bu yöntemde serum toplanmasının zorluğu ve zaman alıcı olması gibi dezavantajları kullanımı sınırlamaktadır (Ustaçelebi, 1992). Bu yöntemlerden her birinin bir diğerine karşı avantaj ve dezavantajları bulunmaktadır. Belirtilen nedenlerden dolayı viral enfeksiyonların teşhisinde virusun izolasyonunun yapılması ve izole edilen virusun immunolojik tekniklerle identifikasyonunun yapılması önerilmektedir (Yolken, 1982). Virusun izolasyonunu takiben identifikasyon amacıyla uygulanan, antijen ve antikorların bazı maddelerle işaretlenerek kullanıldığı immunolojik teknikler 3 bölüm halinde incelenir. Bunlar; 1İmmunofluoresans 2Radioimmunoloji 3İmmunoenzimolojidir. Aynı prensip üzerinde geliştirilmiş bu tekniklerde antijen veya antikor immunolojik özelliklerini kaybetmeden bir işaretleyici (marker) ile işaretlenir. İşaretleyici olarak bu tekniklerede adını veren fluoresans yayan (fluorescein isothiocyanate, rhodamine vb.), radioaktivite ( 125 I, 35 S vb.) ve enzimatik aktivite (horse radish peroxidase, alkalıne phosphatase) gösteren maddelerden yararlanılmaktadır (Harlow and Lane, 1988). Radioimmunoloji yönteminde kullanılan radioaktif maddelerin yarı ömürlerinin sınırlı olması, pahalı olmaları, güvenlik ve çevre sorunları ile hazırlanan preparatların stabil olmaması bu yöntemin kullanımını
11 kısıtlamaktadır. İmmunofloresans yönteminde ise floresan mikroskoba ihtiyaç duyulması, zaman alıcı olması ve sonuçların yorumlanmasında deneyim gerektirmesi gibi dezavantajları vardır. İmmunoenzimoloji yönteminin diğer yöntemlere göre sonuçların kantitatif olması, non spesifik reaksiyonların azlığı, enzim ile işaretli reaktiflerin daha stabil olması, sonucun gözle yada basit araçlarla okunabilmesi, sonuçların tekrarlanabilir olması ve sensitivitenin fazla olması gibi avantajları vardır (Bidwell, 1976, Arda ve ark., 1994). Bununla birlikte çapraz reaksiyonların oluşumu, klinik örneklerde bulunan endogenaz enzim varlığı, non spesifik reaksiyonlar gibi dezavantajları da bulunmaktadır. İmmunoenzimoloji içinde yer alan ELISA tekniği antikorantijen arasındaki spesifik bağlanmanın uygun bir konjugat ve onun spesifik substratı aracılığıyla görülebilir hale getirilmesini sağlayan immunolojik bir reaksiyondur. Bu teknik 70’li yılların başında geliştirilmiştir. Enfeksiyöz hastalıkların teşhisi yanında, hormonlar, kanser markırları, hematoloji, ilaçlar ve toksik ürünlerin saptanması gibi alanlarda da kullanılmaktadır. İmmunoenzimatik tekniklerin birçok çeşidi vardır. Bu teknikler temelde homojen faz ve heterojen faz teknikleri olarak ikiye ayrılır. 1 Homojen faz teknikleri: Bu teknikte tek bir reaksiyon ve sonucunda değerlendirme vardır. 2 Heterojen faz teknikleri: Bu teknikte reaksiyonun çeşitli aşamaları bulunmaktadır. Her aşamada yıkama işlemi ile reaksiyona katılmayan fazla reaktiflerin elimine edildiği ayırma evresi vardır. Öncelikle antijen veya antikor, immunolojik özellikleri bozulmaksızın katı bir taşıyıcıya tespit edilirler. Sonuçta seperasyon aşamaları nedeniyle fazla reaktifler elimine edilince şekillenmiş antijen antikor kompleksi de taşıyıcıya tespit olmuştur. Bu amaçla kompetisyon ve non kompetisyon esasına dayanan teknikler kullanılmaktadır (Arda ve ark., 1994) a) Kompetisyon teknikleri: Bu teknikte test materyalindeki antijen ve enzim ile işaretli antijen arasında katı taşıyıcıya tespit edilen spesifik antikor için yarışma söz konusudur. Test sonucunda ortamdaki enzim işaretli antijenin miktarıyla orantılı
12 olarak renk değişimi görülecektir. Yani test materyalindeki antijen miktarı ne kadar çok olursa katı taşıyıcıda antikorlarla birleşen enzim miktarı o kadar az olacaktır ve bu durumda da substrat ilavesinden sonra test materyalindeki antijenin miktarına bağlı olarak renk değişimi görülmeyecektir. Bu teknik antijen tespitinde olduğu kadar antikor tespitinde de kullanılabilmektedir. b) Nonkompetisyon teknikleri: Bu teknikte de farklı uygulama şekilleri vardır. Non kompetatif ELISA üç şekilde uygulanmaktadır. 1. Direkt ELISA, antijen veya antikor tespitinde kullanılabilmektedir. Enzim ile işaretli bir antikor veya işaretli bir antijen ile test uygulanır. Bu yöntemin üstünlüğü inkubasyon basamağının az olmasıdır. Ancak her antiviral antikorun enzim ile bağlanmasının gerekliliği, veya her antikor için işaretli antijen ihtiyacının olması çeşitli zorluklara neden olmaktadır. 2. İndirekt ELISA, serumdaki antikorların indirekt olarak ortaya konulmasında çok kullanılan bir yöntemdir. Solid faz aranan antikora spesifik antijen ile kaplanır. Aranan antikor içeren serum ilave edilir. Daha sonra serumun ait olduğu hayvan türü antikorlarına karşı elde edilen ve enzim ile işaretlenmiş antikor (konjugat) ilave edilir. Daha sonra substrat ilave edilir ve reaksiyon gözlenir. 3. Çift antikor (sandviç) ELISA, bu teknik özellikle antijenin varlığının ortaya konulması ve miktarının hesaplanmasında kullanılmaktadır. Direkt ve indirekt olarak uygulanabilmektedir. Direkt uygulamada; aranan antijene spesifik antikor solid faza bağlanır. Antijen ilave edilir. Daha sonra aranan antijene spesifik, farklı bir türden elde edilmiş enzim ile işaretli antikorlar (konjugat) ilave edilir ve substrat ilavesinden sonra reaksiyon okunur. İndirekt uygulamada; aranan antijene spesifik antikor solid faza bağlanır. Antijen ilave edilir. Daha sonra aranan antijene spesifik, farklı bir türden elde edilmiş sekonder antikor ilave edilir. Konjugat olarak sekonder antikorun elde edildiği türe karşı elde edilmiş antiimmunglobulin ilave edilir ve substrat ilavesinden sonra reaksiyon okunur (Crowther, 1995 ).
13 IPNV’nin virusunun identifikasyonu hücre kültüründe izolasyonu takiben immunolojik testler ile yapılmaktadır (Wolf, 1960; Wolf, 1970; Agius et. al., 1982; Smail and Munro, 1989; Sanz and Coll, 1992). Klinik vakalarda teşhis direkt balık dokularında histolojik olarak ve/veya IPNV antijeninin immunolojik olarak gösterilmesi ile yapılabilmektedir (Evensen and Rimstad, 1990). Ancak teşhis konfirmasyonu için hücre kültüründe izolasyon ve immunolojik olarak identifikasyon gerekmektedir. Standart olarak kullanılan immunolojik testler nötralizasyon testi, indirekt floresan antikor testi ve ELISA’ dır. (Anonim, 2006). IPNV’nin izolasyonu amacıyla 4 cm’den küçük balıklarda tüm balık; 4  6 cm boyundaki balıklarda böbreği de içeren tüm iç organlar; 6 cm’ den büyük balıklarda karaciğer, dalak ve anterior böbrek; taşıyıcı balıkların tespitinde ise ek olarak yumurtlama zamanında ovaryum sıvısı uygun materyallerdir (Anonim, 2006). IPNV’nin izolasyonu için atlantic salmon (AS), bluegill fry (BF2), chinook salmon embriyo (CHSE214), epithelioma papulosum cyprini (EPC) ve rainbow trout gonad (RTG2) gibi bir çok hücre hattının duyarlı olduğu bildirilmesine rağmen rutin teşhis amacıyla duyarlılığı daha fazla olan CHSE214, RTG2 ve BF2 hücre hatları kullanılmaktadır (Lidgerding, 1981; Wolf, 1988; Anonim, 2006). Fead head minnow (FHM) hücre hattı Ab ve Te Avrupa serotipleri için ilk izolasyonda duyarlı olmadığından rutin kullanım için uygun değildir (Wolf, 1988; Smail and Munro, 1989). IPNV’nin hücre kültüründe izolasyonunda kullanılan sıcaklık 1520°C dir. Genellikle 48 saat içinde CPE görülür. Enfeksiyöz pankreatik nekrozis virusunun oluşturduğu CPE ilk 24 saat içinde çekirdek piknozisi ve gözle görülebilir küçük plaklar, 4872.saatte içinde total hücre yıkımıyla karakterizedir (Samail and Munro, 1989). Hücre kültüründe izole edilen virusun identifikasyonu amacıyla serolojik teknikler gereklidir. Bunların arasında spesifik poliklonal antikor ile uygulanan nötralizasyon testi referans olarak kullanılmakla birlikte bir ile 4 hafta arasında süre
14 gerekli olduğu için zaman alıcı bir testtir. Poliklonal ve monoklonal antikorlar kullanarak birçok serolojik teknikler geliştirilmiştir. Bu testler koaglutinasyon testi (Kimura et. al., 1984; Taksdal, 1999), komplement fikzasyon, floresan antikor testi (Tu et. al., 1974), immunodotblot (CaswellReno et. al.,1989; Hsu et.al., 1989), ELISA (Nicholsan and Caswell, 1982; Dixon and Hill, 1983), immunperoksidaz, counterimmunoelektroforezis, immunopresipitasyon testleridir (Smail and Munro, 1989; Sanz and Coll, 1992; Reno, 1999; Dopazo and Barja, 2002). Son yıllarda IPNV’nin tanısı ve tiplendirmesinde elektroforesis, fingerprinting, nükleik asit sekansı, nükleik asit hibridizasyonu, RTPCR ve restriction fragment length polymorphism gibi moleküler tekniklerde kullanılmaya başlanmıştır (Heppell et. al., 1992; LopezLastra et. al., 1994; Dopazo and Barja, 2002). IPNV, taşıyıcı balıkların pürifiye lökositlerinden flow sitometri ve RTPCR teknikleri kullanılarak da identifiye edilmiştir (Cutrin, 2005). IPN’den şüpheli popülasyonda spesifik antikorun belirlenmesi ile hastalıktan şüphelinilir fakat kesin teşhis için virus izole ve identifiye edilmesi gerekmektedir (Anonim, 2006). 2.8 İmmunite Balıklarda patojen etkenlere karşı immun savunma memelilerde olduğu gibi non spesifik ve spesifik yollarla olmaktadır. Salmonid balıklarında IPNV’ye karşı non spesifik savunmanın sitokinlerden tip I interferon (IFNα /β) aracılığı ile olduğu bildirilmektedir. Humoral immun cevap ile ilgili çalışmalar da bulunmaktadır (Jensen, 2003; Larsen et. al., 2004). Yapılan çalışmalarda erişkin alabalıklara IPN virusunun VR299 serotipi enjekte edilmiş ve birkaç ay sonra balıklarda nötralizan antikor tespit edilmiştir (Wolf and Quimby, 1969). Taşıyıcı balıkların serumlarında da nötralizan antikor tespit edilmiş ve bu antikorun tetramerik yapıda Ig M benzeri yapıda olduğu bildirilmiştir (Smail and Munro, 1989). Yapılan çalışmalarda attenüe ve formalin ile inaktive edilmiş IPN virusunun yetişkin alabalıklara enjekte edildiğinde immunojen
15 olduğu gösterilmiştir (Dixon and Hill, 1983). Hastalığı atlatan yavru alabalıklarda bağışıklık oluştuğu bildirilmektedir (Wolf, 1988). 2.9 Kontrol Hastalıktan korunma, en etkili ve en ekonomik kontrol yöntemidir. Bunun için virusun bulaşma kaynağı bilinmeli ve bu kaynaklardan kaçınılmalıdır. IPN virusundan ari yumurtalar, balık stokları ve kuluçkahaneler seçilmelidir. IPNV taşıyıcısı olabilecek mekanik vektörler (kuşlar, omurgasızlar vb.) ve diğer dış enfeksiyon kaynaklarıyla (ziyaretçiler, balık çifliğinde kullanılan alet ve ekipmanlar) ilgili tedbirler alınmalıdır (Schlotfeldt, 1979). Kuluçkahanelerde, hastalığın bulaşmasını önlemek amacıyla yeni embriyolanmış ve gözlü yumurtalara iodoforlar (100 ppm 10 dakika) ile dezenfeksiyon önerilmektedir. Ancak bu uygulama yumurta dışındaki virusu inaktive ederse de embriyo içindeki viruslara etkin değildir (Smail and Munro, 1989). Düşük yoğunluktaki popülasyonlarda, yüksek yoğunluğa göre enfeksiyon oranının azaldığı bildirilmektedir (Schlotfeldt, 1979; Anonim, 2006). IPN virusuna dirençli genetik seleksiyon çalışmaları hastalığın kontrolünde önemli gelişmelerdir. Ribavarine veya virazole gibi sentetik nükleosidler ile yapılan kemoterapi çalışmaları sonucunda maliyet ve yararlığı açısından uygulanabilir olmadığı görülmüştür (Wolf, 1988). IPN virusuna karşı inaktif ve rekombinant aşılar ticari olarak bulunmakla birlikte, hastalığın, ilk yem alma dönemindeki larvalarda görülmesinden dolayı pratikte değeri tartışmalıdır. Hastalığın kontrolü için yapılan aşı çalışmaları özellikle DNA aşıları ile ilgili olarak devam etmektedir (Leong et. al., 2001; Biering et. al., 2005; Lorenzen and LaPatra, 2005).
16 3.GEREÇ ve YÖNTEM 3.1 Gereç 3.1.1 Hücre kültürü Referans virusların çoğaltılması, titrasyonları ve balık materyallerinden virus izolasyonu amacıyla Bornova Veteriner Kontrol ve Araştırma Enstitüsü’ nden sağlanan EPC ve BF2 hücre hatları kullanıldı. 3.1.2 Antijen Hiperimmun serum elde edilmesi, deneysel enfeksiyon oluşturulması ile ELISA testinin sensitivite ve spesifitesinin belirlenmesinde referans viruslar kullanıldı. Bu amaçla; IPNV Spjarup serotipi (Sp, Danish Institute for Food and Veterinary Research, Danimarka), IPNV VR299 serotipi (IPN436, Institute of Diagnostic Virology, Almanya) ve IPNV Abıld serotipi (IPN428, Institute of Diagnostic Virology, Almanya), Viral Hemorajik Septisemi Virusu (VHSV,DK5151, Danish Institute for Food and Veterinary Research, Danimarka) ve Enfeksiyöz Hematopoietik Nekrozis Virus (IHNV izolat 32/87, Danish Institute for Food and Veterinary Research, Danimarka) kullanıldı. Negatif kontrol antijeni olarak enfekte edilmemiş BF2 hücre hattı kullanıldı. Ayrıca geliştirilen ELISA sisteminde IPN virusunun teşhisi için saha materyali ve izolatı kullanıldı. 3.1.3 Deneme hayvanları ELISA testi için gerekli antiserumun elde edilmesinde kullanılan 9 adet Yeni Zelanda tipi beyaz tavşan, 6 adet kobay Bornova Veteriner Kontrol ve Araştırma Enstitüsü Elevaj servisinden sağlandı. IPN virusunun serotipleri ile ilgili yapılan deneysel enfeksiyon çalışmalarında IPNV ile enfekte olmadığı bilinen 60 adet yavru gökkuşağı alabalığı kullanıldı.
17 3.1.4 Mikroplaklar Testin uygulanmasında kullanılmak için düz tabanlı 96 gözlü Maxisorp (Nunc, Danimarka) ELISA mikroplakları kullanıldı. 3.1.5 Konjugatlar ELISA ‘da kullanılmak üzere konjugat olarak; horse radish peroksidase (HRP) ile işaretli tavşanlardan elde edilen antikobay IgG konjugat (Pirbright, İngiltere) ve HRP ile işaretli domuzlardan elde edilen antitavşan IgG konjugat (Testline, Çek Cumhuriyeti) kullanıldı. 3.1.6 Virus izolasyon materyalleri Hastalık teşhisi amacıyla Bornova Veteriner Kontrol ve Araştırma Enstitüsü’ne teşhis amacıyla getirilen yavru alabalıklar kullanıldı. 3.2 Yöntem 3.2.1 Hücre kültürünün hazır lanması EPC ve BF2 hücre kültürleri –74 °C lik derin dondurucudan çıkartılarak içerisinde %10 fötal dana serum (FCS Biochrom,Almanya) %1 antibiyotik antimikotik (10000 IU/ml penicilline, 10 mg/ml streptomisin, 0,025mg/ml amphotericin B, Biological Industries, Israil) ve %1 4(2hydroxyethyl)1 piperazineethanesulfonic acid (HEPESBiochrom,Almanya) bulunan Eagle’s Minimal Essential Medium (EMEM, pH 7.6 Biochrom,Almanya) içerisinde süspanse edildi ve 75 cm 2 yüzeyli doku kültürü flasklarında ve 24 gözlü hücre kültürü plaklarında 24°C de % 80 kofluent hücre kültürü olarak üretildi.
18 3.2.2 Saha materyalinden virus izolasyonu ve identifikasyonu Virolojik muayene amacıyla 4 cm’den küçük balıklarda anüsün gerisinde kalan kısım çıkarıldı ve diğer kısımların tümü kullanıldı. 46 cm boyundaki balıklarda böbreği de içeren tüm iç organlar,. 6 cm’ den büyük balıklarda dalak, anterior böbrek, karaciğer ve ek olarak kalp veya beyin alındı. Dokular steril kum ile havanda homojenize edildi ve homojenizat 1:10 oranında %2 FCS, %1 antibiyotikantimikotik içeren EMEM ile dilue edilerek steril santrifüj tüplerine aktarıldı. Homojenizat 25 ºC de soğutmalı santrifüjde 2000xg de 15 dakika santrifüj edildi ve üstte kalan süpernatant toplandı ve 0.45µm membran filtreden (Sartorius, A.B.D) geçirildi ve cryoviallere bölünerek 80°C’de saklandı. Daha önceden cryovialler ile saklanan materyaller EPC ve BF2 hücre hatları ile hazırlanan 24 gözlü plaklara 1/10 ve 1/100 dilüsyonlarda ekildi. Plaklar 15 o C’lik soğutmalı inkubatörlerde 710 gün inkube edilerek sitopatolojik effekt (CPE) oluşumu yönünden gözlendi. CPE yönünden pozitif olan gözlerden toplanan materyale identifikasyon amacıyla Indirekt Floresan Antikor Testi (IFAT, Bio X , Bio K 010) uygulandı. 3.2.3 ELISA Testi için hazır lık basamakları Hücre kültüründe izole edilen virusun identifikasyonu ve direk balık dokusunda bulunan virusu belirlemek amacıyla Hattori et al., (1984) tarafından belirtilen Çift Antikor Sandvich ELISA yöntemi uygulandı. 3.2.3.1 Virusların üretilmesi Testte kullanılan IPN Virusu (Sp, VR299 ve Ab serotipi) BF2 hücre kültürlerinde, VHSV ve IHNV’u EPC hücre kültüründe üretildi. Hücre kültürleri %10 FCS, % 1 antibiyotikantimikotik ve %1 hepes içeren EMEM kullanılarak üretildi. Hücre kültürlerinin tek katmanlı üremeleri %8090 oranına ulaşınca hücre vasatları dökülerek viruslar 1:10 oranında inokule edildi. Bir saat adsorbsiyondan sonra hücre kültürüne %2 FCS , %1 hepes ve % 1 antibiyotik
19 antimikotik içeren virus üretme vasatı ilave edildi. Hücre kültürleri, % 9095 oranında CPE görüldükten sonra 74°C’ de dondurulduktan sonra hızla çözdürüldü ve 2000xg’de, +4°C’de 15 dakika santrifüj edilerek klarifikasyon işlemi yapıldı. Supernatantlardan doku kültürü enfektif titrenin hesaplanması için bir miktar ayrıldıktan sonra geri kalan kısım yüksek hacim virus üretilmesi ve ELISA spesifitesinin belirlenmesi amacıyla 1 ve 2’ şer ml’lik hacimlerde bölünerek 74 °C’ lik derin dondurucuya kaldırıldı. 3.2.3.2 Virusların titrasyonu Virusların titrasyonunda mikrotitrasyon yöntemi kullanıldı. Bu amaçla BF2 hücre hattı 96 gözlü doku kültürü mikroplaklarında hücre üretme vasatı (% 10 FCS, % 1 antibiyotikantimikotik, %1 HEPES) ile hazırlandı. Virusların 96 gözlü yuvarlak tabanlı mikrotitrasyon plaklarinda 10 1 ‘den 10 9 ’ a kadar 10 katlı sulandırmaları hazırlandı. Kofluent olan 24 saatlik BF2 hücre hattına her sulandırma için 4 adet göz kullanılarak 25 ml/göz olacak şekilde virus sulandırmalarından konuldu. Soğutmalı inkubatörde 15°C’ de 7 gün inkubasyondan sonra Spaerman ve Kaerber metodu ile virusun DKID 50 değerleri hesaplandı (Villegas and Purchase, 1989). 3.2.3.3 IPN virusunun pürifikasyonu Pürifikasyon işlemi Dixon and Hill (1983), tarafından bildirilen yönteme göre yapıldı. Mikrotitrasyon yöntemi ile DKID 50 değerleri 2,5x10 7 / ml hesaplanan IPNV Sp ve IPNVAb ve VR299 serotipleri 175 cm 2 yüzeyli doku kültürü flasklarına 1:10 oranında inokule edildi. İnkubasyon süresince % 9095 oranında CPE gözlenen hücreler 74°C’ ye kaldırılarak donduruldu ve hızla çözdürüldükten sonra virus süspansiyonu 1500xg de 15 dakika santifüj edilerek klarifikasyon işlemi yapıldı. Santrifüj tüplerindeki süpernatant toplandı. % 2.2 NaCl (w/v) ve % 7 PEG6000 (Merck, Almanya) (w/v) ilave edilerek 4° C de manyetik karıştırıcıda bir gece bırakıldı. Hücre peletleri TNE buffer (0,01M TrisHCl, 0,1M NaCl, 0,001M EDTA,
20 pH, 7,4) ile süspanse edildi. Süspansiyon eşit miktarda 1,1,2 trichlorotrifluoraethane (Uvasol, Merck, Almanya) ile karıştırıldı ve 1500xg de 10 dakika santrifüj edildi ve üstteki sıvı faz alındı. 1,1,2 trichlorotrifluoraethane ile muamele bir kez daha tekrar edildi. PEG 6000 ile muamele edilen süpernatant 2000xg de 1 saat santrifüj edildi ve elde edilen pellet TNE buffer ile resüspanse edildi. Süspansiyon 1,1,2 trichlorotrifluoraethane ile mumele edilen hücre peleti ile birleştirilip 2 kez aynı şekilde 1,1,2 trichlorotrifluoraethane ile muamele edildi. Ayrılan üstteki sıvı faza TNE buffer ile hazırlanmış olan %1545 sukroz dansiti gradient uygulandı ve Beckman OptimaLE80K ultrasantrifüjde SW 41 rotor kullanılarak 45000xg’de 2 saat santrifüj edildi. Santrifüj sonrası oluşan virus bandları bir enjektör ile toplandı. TNE buffer ile dilue edilen virus içeren band 126000xg’de 6°C 1,5 saat santrifüj edildi (SW 41 rotor). Oluşan pelet 1 ml TNE ile resüspanse edilerek protein konsantrasyonu spektrofotometre ile ölçüldü (Dixon and Hill, 1983). 3.2.3.4 Tavşan ve kobay antiserumlarının hazır lanması Antiserum elde etmek amacıyla Bornova Veteriner Kontrol ve Araştırma Enstitüsü Elevaj Ünitesinden alınan tavşanlar ve kobaylar kullanıldı. Antiserum elde edilmesinde Hattori et al. (1984) tarafından bildirilen yöntem uygulandı. Bu amaç için her bir serotip için 3 tavşan ve 2 kobay kullanıldı. Tavşanlar, 200 µg/ml ve kobaylar 100 µg/ml konsantrasyonunda olan BF2 hücre kültürlerinde üretilerek pürifiye edilen virus ile immunize edildi. Fosfat tampon solüsyonu (PBS) içinde hazırlanan pürifiye virus süspansiyonu eşit hacimde Freund’s complete adjuvantı (FCA, Sigma A.B.D) ile emulsifiye edildi. Hazırlanan karışımdan tavşan ve kobaylara 1‘er ml, 4 farklı bölgeden deri altı yolu ile verildi. Aynı şekilde 4 hafta sonra immunizasyon tekrarlandı. 710 gün sonra kan alınarak toplanan serumlar 0,22 µm enjektöre adapte membran filtrelerden (sartorius, A.B.D) süzüldü ve 20°C’ de stoklandı.
21 3.2.3.5 Tavşan ve kobay antiserum titr eleri Serumların nötralizan antikor titresinin hesaplanmasında Beard (1989), tarafından bildirilen mikrotitrasyon yöntemi kullanıldı. Bu amaçla BF2 hücre hattı 96 gözlü doku kültürü mikroplaklarında hücre üretme vasatı (% 10 FCS, % 1 antibiyotik antimikotik, %1 HEPES) ile hazırlandı. Serumların 96 gözlü yuvarlak tabanlı mikrotitrasyon plaklarında 1/100 den 1/ 6400 ‘ e kadar 2 katlı sulandırmalar hazırlandı. Serumlar, 1000 DKID 50 değeri bilinen IPNVSp, Ab ve VR299 ile eşit miktarda karıştırılarak 15°C de bir saat inkube edildi. Kofluent olan 24 saatlik BF2 hücre hattına her sulandırma için 4 adet göz kullanılarak 50 ml/göz olacak şekilde viruslar konuldu. Aynı zamanda aynı işlem VHSV ile de yapıldı. Sadece serum sulandırmaları konularak serum kontrol, pozitif virus kontrol, sadece hücre kültür mediumu hücre kontrolü için bırakıldı. Sonuçlar 7 günlük inkubasyondan sonra Reed ve Muench Metodu ile DKID 50 değerleri hesaplandı. 3.2.3.6 Deneysel enfeksiyon Geliştirilen ELISA yöntemi ile enfekte dokulardaki antijenin tespit edilebilirliğinin belirlenmesi için, IPN virusunun VR 299, Ab, ve Sp serotipleri ile 13 gr yavru alabalıklar enfekte edilerek deneysel enfeksiyon yapıldı. Deneysel enfeksiyondan önce IPNV yönünden kontrol amacıyla popülasyondan 50 balık alınıp virolojik muayene yapıldı. IPNV, VHSV ve IHNV yönünden negatif olduğu tespit edildikten sonra deneysel enfeksiyon yapıldı. Deneysel enfeksiyon IPN virusunun VR 299, Ab, ve Sp serotipleri için ayrı ayrı olmak üzere, 1 ml’inde 10 5 DKID50 virus içeren 5 ml hücre kültürü sıvısı, yarım litre suya ilave edilerek virus süspansiyonları hazırlandı. Hazırlanan virus süspansiyonlarında 20 şer adet 13 gr yavru alabalıklar yarım saat süre ile bekletildi. Bu süre sonunda balıklar su sıcaklığı 18°C olan 20 lt’lik akvaryumlara aktarıldı
22 (Vestergard Jorgensen and Kehlet, 1971). Kontaminasyonu önlemek için 3 akvaryum bir tankın içine alınıp tanka klorlu su ilave edildi. Deneysel enfeksiyon sonucunda hastalık belirtileri göstererek ölen balıklar toplandı. İç organlarından 1 gr tartılıp 9 misli vasat ile homojenize edildi. Daha sonra 2000xg’de 15 dakika santrifüj edildi. Elde edilen süpernatantın bir kısmı virus titresini belirlemek için uygulanacak olan titrasyon testinde kullanılmak üzere 74°C’ye, bir kısmıda ELISA testin de kullanılmak üzere 20°C’ye kaldırıldı. 3.2.3.7 Antikor ların pürifikasyonu Antikorlar Adams (1992) tarafından belirtilen yöntem ile pürifiye edildi. Antiserumun 2 ml’ sine 0,28 gr sodyum sülfat ilave edildi. Çözünene kadar karıştırıldıktan sonra süspansiyon ependorf tüplerine ikiye bölündü. 4°C ‘ de 11500 x g’ de 15 dakika santrifüj edildi. Santrifüjden sonra supernatant atıldı. % 14 (w/v) hazırlanan sodyum sülfat peletlere 1 ml ilave edilerek karıştırıldı. 4°C ‘ de 11500 x g’ de 15 dakika tekrar santrifüj edildi. Aynı işlem bir kez daha tekrar edildi. Son olarak 0,25’ er ml PBS (pH:7,4) ile peletler çözdürüldü. Ig G konsantrasyonunu belirlemek için örnek 1/100 PBS ile 1 cm’lik quartz tüp içinde sulandırılarak 280 nm optik dansite okundu. Spektrofotometrede okunan OD değerine, 1,400 OD = 1 mg/ml formülü uygulanarak protein konsantrasyonu hesaplandı. 3.2.4 ELISA testinin uygulama basamakları Uygulanan indirekt çift antikor (sandviç) ELISA yönteminin basamakları şematik olarak EK1’de ve tablo olarak EK.2’de gösterilmiştir. 3.2.4.1 Mikroplakların kaplanması Mikroplak gözleri IPNV VR299, Ab ve Sp serotiplerine karşı tavşanda hazırlanan IgG’ ler ile kaplandı. Bu amaçla tavşan antikorları pH 9,6 olan karbonat bikarbonat tampon solüsyonunda 10µg/ml olan olacak şekilde sulandırıldı. Kaplama
23 için karbonat bikarbonat solüsyonunda dilue edilmiş antikorlardan her bir göze 100µl konuldu. Mikroplak önceden 37°C‘ye ayarlanmış su banyosuna yerleştirildikten sonra su banyosunun ısıtıcısı kapatılarak antikorla kaplanabilmesi için bir gece bekletildi. Kaplanmanın kontrolü amacıyla 2 göz kaplanmamış olarak bırakıldı. Karbonat bikarbonat tampon solusyonu stok A: 0,2 M Na2CO3 ( 21,2gr /1litre distile suda ) ve stok B: 0,2 M NaHCO3 (16,8 gr /1 1litre distile suda) olarak hazırlandı ve stok A’ dan 16 ml ve stok B’ den 34 ml alınarak toplam hacim distile su ile 200 ml’ e tamamlandı. 3.2.4.2 Bloklama Spesifik olmayan bağlanmaları önlemek amacıyla yapıldı. Bu amaçla her bir göze 200µl %1,5 sığır serum albümini (BSA, AppliChem, Almanya) içeren karbonat bikarbonat tampon solüsyonu konuldu. Mikroplak 37°C su banyosunda 1 saat inkübe edildi. 3.2.4.3 Yıkama Farklı reaktiflerin kullanıldığı tüm inkübasyonlardan sonra yıkama yapılarak bağlanmayan reaktifler uzaklaştırıldı. Kaplamadan sonra PBS pH :7,4 (8,0 gr NaCl, 0,2 gr KH2PO4 , 2,9 gr Na2HPO4.12 H2O, 0,2 gr KCl 1 litre distile suda) ile 2 kez 2 dakika bekleyerek bloklama aşamasından sonra PBS pH :7,4 ile 3 kez 2 dakika, antijen konduktan sonra % 0,05 Tween 20 ilave edilmiş PBS (PBST) ile 3 kez 2 dakika, sekonder antikordan sonra PBST ile 4 kez 3 dakika , konjugatla inkubasyondan sonra PBST ile 4 kez 3 dakika yıkama yapıldı. Her yıkama basamağından önce yıkama solüsyonuyla bir kez hızlı ön yıkama uygulandı. 3.2.4.4 Antijen ilave edilmesi Bloklama işleminden sonra sensitivitenin belirlenmesi için antijen olarak IPN virus Sp, Ab ve VR299 içeren hücre kültürü sıvısından ve negatif kontrol antijeni olarak enfekte edilmemiş BF2 hücre kültürü sıvısından direkt (sulandırmadan), 1/10,
24 1/100, 1/1000 dilüsyonlardan 4’er göz; spesifitenin belirlenmesi amacıyla ise VHSV ve IHNV içeren hücre kültürü sıvılarından 2’şer göze 100’er µl ilave edildi. Testte kullanılan reaktiflerin negatif kontrolü (blank) amacıyla 2’şe göze PBS konuldu. Mikroplaklar 24°C de nemli ortamda (içerisinde ıslak kağıt konulmuş plastik kap içinde) bir saat inkube edildi. 3.2.4.5 Sekonder antikor ilave edilmesi Sekonder antikor olarak anti IPNV Sp kobay antikorları (3,6 mg/ml), anti IPNV Ab kobay antikorları (1,7mg/ml) ve anti IPNV VR299 kobay antikorları (3,4 mg/ml) kullanıldı. Bu antikorların testte kullanılabilecek uygun konsantrasyonlarını belirlemek için 5, 10, 20 µg/ml olacak şekilde %1 BSA içeren PBST ile hazırlanan dilüsyonlar her bir göze 100µl ilave edildi ve nemli ortamda 24°C de bir saat inkube edildi. Blank olarak antikor yerine %1 BSA içeren PBST kullanıldı. 3.2.4.6 Konjugat Horse radish peroksidase ile işaretli antikobay IgG konjugatının (Pirbrigth Lab., İngiltere) test için uygun konsantarasyonunu belirlemek için, %1 BSA içeren PBST ile 1/250, 1/500 ve 1/700 oranlarında dilue edilerek konjugat mikroplakların gözlerine 100’er µl konularak test edildi ve 24 °C de nemli ortamda bir saat inkube edildi. Blank olarak antikor yerine %1 BSA içeren PBST kullanıldı. 3.2.4.7 Substrat ilave edilmesi Hidrojen peroksit (H2O2) ile aktive edilmiş OPD substrat (P5412, Sigma) her bir göze 100µl eklenerek oda ısısında 20 dakika bekletildikten sonra 1 M sülfürik asit (H2SO4 ) 100µl ilave edilerek reaksiyon durduruldu ve ELISA okuyucusunda (ELx800, BioTek) 492 nm dalga boyunda okundu.
25 3.2.4.8 Konjugat ve sekonder antikor konsantrasyonu Mikroplak IPNV VR299, Ab ve Sp serotiplerine karşı tavşandan elde edilen Ig G ile (10 µg/ml) kaplandı. Antijen olarak IPNV VR299 (10 8,6 DKID50 /ml), Ab (10 8,8 DKID50 /ml) ve Sp (10 8,3 DKID50 /ml) konuldu. Sekonder antikor olarak IPNV VR 299 serotipi için anti IPNV VR299 kobay antikoru (3,4 mg/ml) 5 µg/ml ve 10 µg/ml, IPNV Ab serotipi için anti IPNV Ab kobay antikorunun (1,7 mg/ml) 5 µg/ml ve 10 µg/ml, IPNV Sp serotipi için anti IPNV Sp kobay antikorunun (3,6 mg/ml) 10 µg/ml ve 20 µg/ml ilave edildi. Konjugat olarak IPNV VR299 ve Ab serotipi için, HRP ile işaretli tavşanda hazırlanan kobay IgG’lerinin 1/500 ve 1/700 dilüsyonları, IPNV Sp serotipi için 1/250 ve 1/500 dilüsyonları ve kullanıldı. Testte negatif kontrol antijeni olarak enfekte olmayan BF2 hücre kültür sıvısı ve blank olarak PBS kullanıldı. Test sonucunda OD değerleri ve pozitif/negatif oranları dikkate alınarak uygun konsantrasyon belirlendi. 3.2.4.9 Testin spesifitesinin belir lenmesi Testte kullanılan reaktifler ile gökkuşağı alabalıklarında enfeksiyonlara neden olabilen diğer viral etkenler arasında kros reaksiyonun olup olmadığını ortaya koymak amacıyla EPC hücre hatlarında üretilmiş olan VHSV ve IHNV kullanıldı. Bunun yanında IPNV serotiplerinin birbirleriyle çapraz reaksiyonlarının belirlenmesi için ise, VR299 serotipine karşı oluşturulan modelde IPNV Sp ve Ab serotipi; IPNV Ab serotine karşı oluşturulan modelde IPNV VR299 ve Sp; IPNV Sp serotipine karşı oluşturulan modelde IPNV VR299 ve Ab serotipleri kullanıldı. Testlerde negatif kontrol antijeni olarak enfekte olmayan BF2 hücre kültürü sıvısı ve blank olarak PBS kullanıldı . 3.2.4.10 Testin sensitivitesinin belir lenmesi Testin sensitivitesinin belirlenmesi amacıyla mikroplaklar ayrı ayrı IPNV VR 299, Ab ve Sp serotiplerine karşı tavşandan elde edilen Ig G ile (10 µg/ml) kaplandı.
26 IPNV VR299(10 8,6 DKID50 /ml), Ab (10 8,8 DKID50 /ml) ve Sp (10 8,3 DKID50 /ml) direkt, 1/10, 1/100, 1/1000 dilüsyonlarda ve negatif kontrol antijeni olarak enfekte edilmemiş BF2 hücre kültürü sıvısı; direkt, 1/10, 1/100, 1/1000 dilüsyonlarda 4’er göz olmak üzere test edildi. Aynı şekilde üç serotip için elde edilen primer ve sekonder antikorların birlikte kullanılarak uygulandiğı testte her bir serotip için ayrı sensitivite belirlemesi yapıldı. Ayrıca, IPNV VR299, Ab ve Sp ile oluşturulan deneysel enfeksiyon sonucu 5., 6., ve 7. gün klinik belirti gösteren ve ölen balıklardan hazırlanan inokulumlar ile ELISA testi uygulandı. Negatif kontrol antijeni olarak deneysel enfeksiyon çalışmasında ki negatif kontrol grubundan alınan enfekte edilmemiş balıklardan hazırlanan inokulum kullanıldı. 3.2.4.11 Saha izolatına testin uygulanması Hücre kültüründe izole edilen saha virusu ve aynı materyalin direk balık dokusundan hazırlanan inokulum, geliştirilen ELISA yöntemiyle 3 serotipin birlikte uygulandığı sistemde test edildi. Ayrıca ticari ELISA kiti (IPNV Ag ELISA, Test line) ile test yapılarak sonuçlar karşılaştırıldı. 3.2.5 ELISA sonuçlarının değerlendirilmesi Uygulanan test sonuçlarında ELISA okuyucuda okunan OD değerinin pozitif olarak değerlendirilmesi için; pozitif antijenlerin ortalamaları ve negatif antijen ortalamaları ile elde edilen pozitif/negatif (P/N) oranlarının değerinin ≥2 olması ve bu değerin negatif kontrol antijenlerinin istatistiki olarak 3 standart sapması (3SS) alınarak hesaplanan cut offdeğerinden (kritik değer) büyük olması esas alınmıştır (Savigny ve Voller, 1980, Nicholsan and Caswell, 1982; Medina et.al., 1992).
27 4. BULGULAR 4.1 Virusların Üretilmesi Hiperimmun serum elde etmek ve geliştirilen ELISA testinde sensitivitenin belirlenmesi için üretilen IPNV VR299, Ab ve Sp serotipi BF2 hücre kültürlerinde 2436 saat içerisinde, ELISA testinin spesifitesinin belirlenmesi amacıyla kullanılan VHS ve IHN virusları EPC hücre kültüründe 4872 saat içerisinde CPE oluşturarak üredi. 4.2 Virusların Titrasyonu ELISA testinin sensitivitesinin belirlenmesinde kullanılmak için üretilen IPNV VR299, Ab ve Sp serotiplerinin titresini saptamak amacı ile uygulanan mikrotitrasyon test sonucunda SpearmenKaerber metodu ile hesaplanan enfeksiyozite gücü Çizelge 4.1’de belirtilmiştir. Çizelge 4.1 IPNV serotiplerinin DKID50 /ml değerleri IPNVVR299 10 8,6 IPNVAb 10 8,8 IPNVSp 10 8,3 4.3 Virusların Pürifikasyon Sonucu Virusların pürifikasyonu amacıyla uygulanan %1545 sukroz gradient sonucunda oluşan opak bantlar toplandı (Ek 3). Toplanan bantların protein konsantrasyonları spektrofotometrik yöntemle ölçüldü. IPNV VR299 serotipinin konsantrasyonu 1800 µg/ml, IPNV Ab serotipinin konsantrasyonu 2200 µg/ml ve
28 IPNV Sp serotipinin konsantrasyonu 2000 µg/ml olarak hesaplandı. Pürifiye viruslar tavşan ve kobaylarda hiperimmun serum elde etmek için kullanıldı. 4.4 Deneysel Enfeksiyon Üç ayrı akvaryumda 18°C’ de tutulan IPNV VR299, Sp ve Ab serotipleri ile yapılan deneysel enfeksiyondan sonra 5. gün, 6. gün ve 7. günde klinik semptom gösteren ve ölüm görülen balıklar toplandı (Ek 4). Bu balıkların dokularından hazırlanan supernatantlara uygulanan Mikrotitrasyon Testi sonucunda Spearmen Kaerber metodu ile hesaplanan enfeksiyozite güçleri Çizelge 4.2 de belirtilmiştir. Çizelge 4.2 Deneysel enfeksiyondan ölen balıkların dokularında bulunan virusun DKID50 /gr değerleri Deneysel enfeksiyon sonucu ölüm görülen günler IPNV VR299 DKID50 IPNVAb DKID50 IPNVSp DKID50 5. gün 10 5.6 10 5,5 10 5,35 6.gün 10 5,8 10 5,6 10 4,85 7. gün 10 6 10 6,1 10 5,85 4.5 Tavşan ve Kobay Antiserumlarının Nötralizan Antikor Titreleri Tavşan ve kobaylardan elde edilen anti IPNV VR299, Ab ve Sp antikorlarınnın nötralizan antikor titrelerini belirlemek amacıyla uygulan Mikrotitrasyon Testi sonucunda Reed ve Muench metodu ile hesaplan SN 50 değerleri Çizelge 4.3 de belirtilmiştir.
29 Çizelge 4.3 Tavşan ve kobaylardan elde edilen IPNV’ una spesifik serumların nötralizan antikor değerleri IPNV Serotipleri Tavşan antikoru Kobay antikoru SN50 SN50 IPNVVR299 1/4732 1/1585 IPNVAb 1/1122 1/168 IPNVSp 1/944 1/200
Çizelge 4.3 e göre tavşandan elde edilen antikor titrelerinin kobaylara göre daha yüksek olduğu ve VR299 serotipinin diğer serotiplere göre daha yüksek titre verdiği görülmüştür. 4.6 Pürifiye Edilen Antikor ların Protein Miktar ları Sodyum sülfat ile pürifiye edilen tavşan ve kobay antikorlarının protein konsantrasyonları Çizelge 4. 4 de belirtilmiştir. Çizelge 4.4 Tavşan ve kobaylardan elde edilen IPNV’ una spesifik serumların sodyum sülfat ile pürifikasyonu sonucu elde edilen protein konsantrasyonları IPNV serotipleri Tavşan (mg/ml) antikoru Kobay (mg/ml) IPNVVR299 5,1 3,4 IPNVAb 2,1 1,7 IPNVSp 5,5 3,6 antikoru 30 4.7 Saha Virusu İzolasyon ve İdentifikasyonu Virus izolasyonu amacıyla inokulasyon yapılan EPC ve BF2 hücre hatlarından, BF2 hücre hattında 72. saatte % 8590 CPE gözlenmesine rağmen, EPC hücre hattında 6. ve 7. günlerde zayıf CPE gözlendi. Bu nedenle bu çalışmada BF2 hücre hattından izole edilen virus kullanıldı. Saha izolatının BF2 hücre hattında oluşturduğu CPE Ek 5’de gösterilmiştir. Hücre kültüründe izole edilen virusun identifikasyonu amacıyla IFAT uygulandı ve bunun için CPE görülen hücre kültürleri IPNV’ una spesifik monoklonal antikorları ile inkube edildikten sonra Fluorescein İsothiocyanate (FITC) ile işaretli konjugat ile inkube edildi. Hazırlanan preparatlar floresan boyalı antijenantikor kompleksinin oluşumu yönünden floresan mikroskop da incelendiğinde pozitif olan hücreler granüler tarzda yeşil floresan verdi, negatif hücreler ise kırmızı olarak görüldü (Ek 6). Testin sonucunda izole edilen virusun IPN virusu olduğu sonucuna varıldı. 4.8 ELISA Test Sonuçları 4.8.1 Konjugat ve sekonder antikor konsantrasyonu IPNV VR299 serotipi için; mikroplak anti IPNV VR299 tavşan antikoru ile 10µg/ml olacak şekilde kaplandı ve % 1,5 BSA ile bloklama yapıldı. Antijen olarak IPNV VR299 virusu ilave edildi. Daha sonra anti IPNV VR299 kobay antikorundan 5 µg/ml ve 10µg/ml konuldu. Konjugat olarak HRP ile işaretli anti kobay antikoru 1/500 ve 1/700 konsantrasyonda ilave edildi. Daha sonra OPD substrat ilave edildi ve stop solüsyonu ile reaksiyon durdurulduktan sonra ELISA okuyucuda 492 nm’de OD değerleri okundu. Bu değerler Çizelge 4. 5’de verilmiştir.
31 Çizelge 4. 5 IPNV VR299 serotipi için optimum konjugat ve sekonder antikor konsantrasyonlarının belirlenmesi için uygulan ELISA testinin 492 nm de OD değerleri Kobay anti IPNV VR299 antikoru Konjugat Antijen 5 µg /ml 10 µg/ml Virus 0,783 0,814 0,804 0,810 Negatif 0,106 0,096 0,099 0,099 Blank 0,097 0,092 0,094 0,102 1/500 P/N oranı 7,9 8,2 Virus 0,655 0,651 0,684 0,670 Negatif 0,094 0,096 0,096 0,094 Blank 0,091 0,093 0,104 0,096 1/700 P/N oranı 6,9 7,1 Sonuç olarak OD değerleri ve P/N oranları esas alınarak VR299 serotipi için uygun HRP ile işaretli anti kobay konjugat konsantrasyonunun 1/500, anti IPN VR 299 kobay antikorunun uygun konsantrasyonunun 10 µg/ml olduğu tespit edilmiştir. Uygulanan ELISA testinde göz ile de pozitif değerlendirme yapılabilmiş ve Ek 7’de gösterilmiştir IPNV Ab serotipi için; mikroplak anti IPNV Ab tavşan antikoru ile 10µg/ml olacak şekilde kaplandı. %1,5 BSA ile bloklama yapıldı. Antijen olarak IPNV Ab virusu ilave edildi. Daha sonra anti IPNV kobay antikorundan 5 µg/ml ve 10µg/ml konuldu. Konjugat olarak HRP ile işaretli anti kobay antikoru 1/500 ve 1/700 konsantrasyonda ilave edildi. Daha sonra OPD substrat konuldu ve stop solüsyonu ile
32 reaksiyon durdurulduktan sonra 492 nm’de ELISA okuyucuda OD değerleri okundu. Bu değerler Çizelge 4. 6’da verilmiştir. Çizelge 4. 6 IPNV Ab serotipi için optimum konjugat ve sekonder antikor konsantrasyonlarının belirlenmesi için uygulan ELISA testinin 492 nm de OD değerleri Kobay anti IPNV Ab antikoru Konjugat Antijen 5 µg/ml 1/500 Virus 0,592 0,546 0,613 0,601 Negatif 0,098 0,099 0,106 0,108 Blank 0,099 0,100 0,093 0,111 5,7 P/N oranı 1/700 10 µg/ml 5,7 Virus 0,533 0,496 0,515 0,502 Negatif 0,091 0,097 0,095 0,094 Blank 0,083 0,096 0,041 0,042 P/N oranı 5,5 5,4 Sonuç olarak OD değerleri ve P/N oranları esas alınarak Ab serotipi için uygun HRP ile işaretli anti kobay konjugat konsantrasyonunun 1/500, anti IPN Ab kobay antikorunun uygun konsantrasyonunun 10 µg/ml olduğu tespit edilmiştir. IPNV Sp serotipi için; Mikroplak anti IPNV Ab tavşan antikoru ile 10µg/ml olacak şekilde kaplandı. %1,5 BSA ile bloklama yapıldı. Antijen olarak IPNV Sp virusu ilave edildi. Daha sonra anti IPNV kobay antikorundan 10 µg/ml ve 20 µg/ml konuldu. Konjugat olarak HRP ile işaretli anti kobay antikoru 1/250 ve 1/500 konsantrasyonda ilave edildi. Daha sonra OPD substrat konuldu ve stop solüsyonu ile
33 reaksiyon durdurulduktan sonra 492 nm’de ELISA okuyucuda OD değerleri okundu. Bu değerler Çizelge 4.7’de verilmiştir. Çizelge 4.7 IPNV Sp serotipi için optimum konjugat ve sekonder antikor konsantrasyonlarının belirlenmesi için uygulan ELISA testinin 492 nm de OD değerleri Kobay anti IPNV Ab antikoru Konjugat 1/250 Antijen 10µg/ml 20 µg/ml Virus 0,521 0,543 0,556 0,531 Negatif 0,126 0,129 0,131 0,138 Blank 0,131 0,123 0,206 0,142 4,2 P/N oranı 4 Virus 0,421 0,436 0,477 0,453 Negatif 0,126 0,114 0,121 0,124 Blank 0,121 0,114 0,125 0,123 1/500 P/N oranı 3,6 3,8 Sonuç olarak OD değerleri ve P/N oranları esas alınarak Sp serotipi için uygun HRP ile işaretli anti kobay konjugat konsantrasyonunun 1/250, anti IPN Sp kobay antikorunun uygun konsantrasyonun 10 µg/ml olduğu tespit edilmiştir. 4.8.2 Testin spesifitesi ile ilgili çalışma sonuçları IPNV VR299 serotipi için uygulanan ELISA testinin spesifitesinin belirlenmesi için; mikroplak anti IPNV VR299 tavşan antikoru ile 10µg/ml olacak şekilde kaplandı ve %1,5 BSA ile bloklama yapıldı. Antijen olarak IPNV VR299, IPNV Ab, IPNV Sp, IHNV, VHSV ve enfekte edilmemiş BF2 hücre kültürü sıvısı (negatif kontrol) konuldu. Daha sonra anti IPNV VR299 kobay antikorundan 10 µg/ml olarak ilave edildi. Konjugat olarak 1/500 oranında sulandırılan HRP ile işaretli anti kobay
34 ilave edidi. Daha sonra OPD substrat konuldu ve stop solüsyonu ile reaksiyon durdurulduktan ELISA okuyucuda sonra 492 nm’de OD değerleri okundu. Test sonucu okunan değerler Çizelge 4.8’de belirtilmiştir. Çizelge 4.8 IPNV VR299 serotipi için uygulanan ELISA testinin spesifitesi ile ilgili çalışma sonucunda 492 nm’de okunan OD değerleri Antijenler OD değerleri IPNVVR299 0,749 0,761 IPNVSp 0,180 0,201 IPNVAb 0,164 0,164 IHNV 0,083 0,078 VHSV 0,077 0,077 Negatif kontrol 0,064 0,065 Blank 0,068 0,065 Sonuç olarak IPNV VR299 serotipi için uygulanan ELISA testinde diğer balık virusları olan IHNV, VHSV ve BF2 hücre kültürü sıvısı ile çapraz reaksiyon görülmemiştir. Diğer serotipler ile düşük düzeyde kros reaksiyon tespit edilmiştir. IPNV Ab serotipi için uygulanan ELISA testinin spesifitesinin belirlenmesi için; mikroplak anti IPNV Ab tavşan antikoru ile 10µg/ml olacak şekilde kaplandı ve %1,5 BSA ile bloklama yapıldı. Antijen olarak IPNV Ab, IPNV VR299, IPNV Sp, IHNV, VHSV ve enfekte edilmemiş BF2 hücre kültürü sıvısı (negatif kontrol) konuldu. Daha sonra anti IPNV Ab kobay antikorundan 10 µg/ml olarak ilave edildi. Konjugat olarak 1/500 oranında sulandırılan HRP ile işaretli anti kobay antikoru ilave edildi.
35 Daha sonra OPD substrat konuldu ve stop solüsyonu ile reaksiyon durdurulduktan sonra ELISA okuyucuda 492 nm’de OD değerleri okundu. Test sonucu okunan değerler Çizelge 4.9’da belirtilmiştir. Çizelge 4.9 IPNV Ab serotipi için uygulanan ELISA testinin spesifitesi ile ilgili çalışma sonucunda 492 nm’de okunan OD değerleri Antijenler OD değerleri IPNV Ab 0,601 0,602 IPNVSp 0,333 0,347 IPNVVR299 0,181 0,227 IHNV 0,132 0,133 VHSV 0,129 0,132 Negatif kontrol 0,136 0,133 Blank 0,142 0,147 Sonuç olarak Ab serotipi için uygulanan ELISA testinde diğer balık virusları olan IHNV, VHSV ve BF2 hücre kültürü sıvısı ile çapraz reaksiyon görülmemiştir. Diğer serotiplerden IPNV VR299 ile düşük, IPNV Sp serotipi ile daha fazla kros reaksiyon tespit edilmiştir. IPNV Sp serotipi için uygulanan ELISA testinin spesifitesinin belirlenmesi için; mikroplak anti IPNV Sp tavşan antikoru ile 10µg/ml olacak şekilde kaplandı. %1,5 BSA ile bloklama yapıldı. Antijen olarak IPNV Sp, IPNV VR299, IPNV Ab, IHNV, VHSV ve enfekte edilmemiş BF2 hücre kültürü sıvısı (negatif kontrol) konuldu. Daha sonra anti IPNV Sp kobay antikorundan 10 µg/ml olarak ilave edildi. Konjugat olarak 1/250 oranında sulandırılan HRP ile işaretli anti kobay ilave edildi. Daha sonra OPD substrat konuldu ve stop solüsyonu ile reaksiyon durdurulduktan sonra ELISA
36 okuyucuda 492 nm’de OD değerleri okundu. Test sonucu okunan değerler Çizelge 4.10’da belirtilmiştir. Çizelge 4.10. IPNV Sp serotipi için uygulanan ELISA testinin spesifitesi ile ilgili çalışma sonucunda 492 nm’de okunan OD değerleri Antijenler OD değerleri IPNVSp 0,498 0,516 IPNVVR299 0,151 0,164 IPNVAb 0,327 0,346 IHNV 0,088 0,085 VHSV 0,085 0,085 Negatif kontrol 0,085 0,086 Blank 0,087 0,086 Sonuç olarak Sp serotipi için uygulanan ELISA testinde diğer balık virusları olan IHNV, VHSV ve BF2 hücre kültürü sıvısı ile çapraz reaksiyon görülmemiştir. Diğer serotiplerden IPNV VR299 ile düşük, IPNV Ab serotipi ile daha fazla çapraz reaksiyon tespit edilmiştir. IPNV VR299, Ab ve Sp serotiplerinin birlikte kullanılarak uygulanan ELISA testinin spesifitesinin belirlenmesi için mikroplak; anti IPNV VR299, Ab, Sp tavşan antikorlarının 10’ar µg/ml olacak şekilde kaplandı ve %1,5 BSA ile bloklama yapıldı. Antijen olarak IPNV Sp, IPNV VR299, IPNV Ab, IHNV, VHSV ve enfekte edilmemiş BF2 hücre kültürü sıvısı (negatif kontrol) konuldu. Daha sonra anti IPNV VR299, Ab, Sp kobay antikorları 10’ar µg/ml olacak şekilde ilave edildi. Konjugat olarak 1/500 oranında sulandırılan HRP ile işaretli anti kobay antikoru ilave edidi. Daha sonra OPD substrat konuldu ve stop solüsyonu ile reaksiyon durdurulduktan
37 sonra ELISA okuyucuda 492 nm’de OD değerleri okundu. Test sonucu okunan değerler Çizelge 4.11’de belirtilmiştir. Çizelge 4.11. IPNV VR299, Ab ve Sp serotiplerinin birlikte uygulandığı ELISA’nın spesifitesi ile ilgili çalışma sonucunda 492 nm’de okunan OD değerleri Antijenler OD değerleri IPNV VR299 0,643 0,624 IPNV Ab 0,531 0,575 IPNV Sp 0,324 0,391 IHNV 0,124 0,124 VHSV 0,124 0,122 Negatif kontrol 0,127 0,120 Blank 0,122 0,123 Sonuç olarak üç serotipin birlikte kullanıldığı sistemde diğer balık virusları olan IHNV, VHSV virusları ve negatif kontrol antijeni (BF2 hücre kültür sıvısı) ile çapraz reaksiyon görülmemiştir. 4.8.3 Primer antikor olar ak anti IPNV kobay antikor ları kullanımı IPNV Ab ve Sp serotipleri için; primer antikor olarak anti IPNV tavşan antikorları, sekonder antikor olarak anti IPNV kobay antikorları kullanılarak uygulanan test sonucunda okunan OD değerlerinin ortalaması IPNV Ab serotipi için 0,498, P/N oranının 4,9 ve IPNV Sp serotipi için 0,570, P/N oranın 5,8 olduğu tespit edilmiştir. Elde edilen bu değerler pozitif olarak değerlendirildi. Ancak IPNV VR299 serotipi için bulunan 0,748 ve P/N oranı 11,5 değere göre düşük bulunmuştur. Bu nedenle primer ve sekonder antikor uygulama basamakları değiştirilerek uygulanan
38 testte; mikroplaklar anti IPNV Ab ve anti IPNV Sp kobay antikorları ile 10 µg/ml olarak kaplandı. İnkubasyon ve yıkama işleminden sonra % 1,5 BSA ile bloklama yapıldı. İnkubasyon ve yıkama işleminden sonra antijen olarak ikişer göz IPNV Ab ve IPNV Sp virusları konuldu. İnkubasyon ve yıkama işleminden sonra sekonder antikor olarak anti IPNV Ab ve anti IPNV Sp tavşan antikorları 10 µg/ml ilave edildi. İnkubasyon ve yıkama işleminden sonra konjugat olarak 1/50 oranında sulandılan HRP ile işaretli anti tavşan antikorları konuldu. İnkubasyon ve yıkama işleminden sonra OPD substrat ilave edilerek 492 nm’de ELISA okuyucuda OD değerleri okundu. Test sonucu okunan değerler IPNV Ab serotipi için Çizelge 4.12 ve IPNV Sp serotipi için Çizelge 4.13 belirtilmiştir. Çizelge 4.12. Kobay anti IPNVAb antikoru ile kaplama yapıldığında Ab serotipine ait OD değerleri Antijenler 492nm OD değerleri IPNVAb 0,891 0,900 Negatif kontrol 0,215 0,216 Blank 0,206 0,208
39 Çizelge 4.13. Kobay anti IPNVSp antikoru ile kaplama yapıldığında Sp serotipine ait antikor değerleri Antijenler 492nm OD değerleri IPNVSp 0,590 0,563 Negatif kontrol 0,146 0,147 0,143 0,149 Blank Sonuç olarak ortalama OD değerleri IPNV Ab için 0,895, P/N oranı 4,14 ve IPNV Sp için 0,577, P/N oranı 3,9 olarak bulunmuştur. Bulunan bu değerlere göre pozitif kontrollerdeki OD değerlerinin artmasına rağmen, negatif kontrollerde de OD değerlerinin de arttığı, P/N oranların ise düştüğü tespit edilmiştir. Bu yüzden mikroplakların kaplanması için tavşan anti IPNV antikorlarının, sekonder antikor olarak kobay anti IPNV antikorlarının, konjugat olarak da HRP ile işaretli antikobay antikorunun kullanılmasının uygun olduğu kanısına varıldı. 4.8.4 IPNV VR299 sensitivitesinin belir lenmesi IPNV VR299 serotipinin sensitivitesinin belirlenmesi için uygulanan ELISA testinde; mikroplaklar anti IPNV VR299 tavşan antikoru (protein konsantrasyonu 10µg/ml) ile kaplandı. % 1,5 BSA ile bloklama işlemi yapıldı. Antijen olarak DKID50 değeri 10 8,6 /ml olan IPNV VR299 virusu direk, 1/10, 1/100, 1/1000 dilüsyonda ve negatif kontrol antijeni (enfekte edilmemiş BF2 hücre kültürü sıvısı) antijeni direk, 1/10, 1/100, 1/1000 dilüsyonda ilave edildi. Daha sonra anti IPNV VR299 kobay antikorundan (protein konsantrasyonu 10µg/ml) konuldu. Konjugat olarak 1/500 konsantrasyonda HRP ile işaretli anti kobay antikor ilave edidi. Daha sonra OPD substrat konuldu ve stop solüsyonu ile reaksiyon durdurulduktan sonra ELISA
40 okuyucuda 492 nm’de okuyucuda OD değerleri okundu. Bu değerler Çizelge 4.14’de verilmiştir. Çizelge 4.14. IPNV VR299 serotipi için uygulanan ELISA testinin sensitivite sonuçları 492 nm de OD değerleri Direk virus 0,749 0,761 0,737 0,745 Negatif kontrol 0,064 0,065 0,065 0,065 1/10 dilue virus 0,582 0,584 0,587 0,597 Negatif kontrol 0,065 0,067 0,064 0,064 1/100 dilue virus 0,179 0,191 0,183 0,205 Negatif kontrol 0,063 0,063 0,062 0,061 1/1000 dilüe virus 0,073 0,076 0,077 0,075 Negatif kontrol 0,064 0,064 0,061 0,064 Blank 0,087 0,068 0,065 0,085 Testin sensitivitenin belirlenmesinde önemli parametreler olan OD değerlerinin pozitif negatif oranları (P/N) ile test sonucunda kritik değerin (CutOff Değeri) belirlenmesi için hesaplanan negatif kontrol antijenlerin ortalamasının 3 standart sapması (3 SS) Çizelge 4.15’ de belirtilmiştir.
41 Çizelge 4.15. IPNVVR299 serotipi Doku kültürü sonuçları Pozitif / Negatif OD oranları ve Cut Off değerleri (492 nm) Pozitif Negatif ortalama ortalama (P) (N) Direk 0,748 0,065 11,5 0,066 1/10 dilusyon 0,588 0,065 9 0,069 1/100 dilusyon 0,190 0,062 3,1 0,065 1/1000 dilusyon 0,076 0,063 1,2 0,068 P/N oranları Cut off değeri (3SS) Sonuç olarak P/N oranlarının ≥2 olması ve negatif kontrol antijen ortalamalarının 3SS değerinin (CutOff değeri) pozitif kontrol antijenin değerinden küçük olduğu tespit edilerek testin geçerli olduğu ve IPNV VR299 serotipi için sensitivitenin 10 6,6 /ml DKID50 olarak tespit edilmiştir. Grafik 4.4’de pozitif OD, negatif OD ve Cut Off değerleri gösterilmiştir.
42 Grafik 4.1. IPNV VR299 serotipine karşı uygulanan sistemdeki sensitivite sonuçları 0,800 0,700 OD değerleri (492 nm) 0,600 0,500 Pozitif OD Negatif OD Cut Off 0,400 0,300 0,200 0,100 0,000 Direk virus 1/10 dilüsyon 1/100 dilüsyon 1/1000 dilüsyon Virus dilusyonları 4.8.5 IPNV Ab sensitivitesinin belir lenmesi IPNV Ab serotipinin sensitivitesinin belirlenmesi için uygulanan ELISA testinde; mikroplaklar anti IPNV Ab tavşan antikoru (protein konsantrasyonu 10µg/ml) ile kaplandı. % 1,5 BSA ile bloklama yapıldı. Antijen olarak DKID50 değeri 10 8,8 /ml IPNV Ab virusu direk, 1/10, 1/100, 1/1000 dilüsyonda ve negatif kontrol (enfekte edilmemiş BF2 hücre kültürü sıvısı) antijeni direk, 1/10, 1/100, 1/1000 dilüsyonda ilave edildi. Daha sonra anti IPNV Ab kobay antikorundan (protein konsantrasyonu 10µg/ml) konuldu. Konjugat olarak 1/500 konsantrasyonda HRP ile işaretli anti kobay antikoru ilave edildi. Daha sonra OPD substrat konuldu ve stop
43 solüsyonu ile reaksiyon durdurulduktan sonra ELISA okuyucuda 492 nm’de OD değerleri okundu. Bu değerler Çizelge 4.16’da verilmiştir. Çizelge 4.16. IPNV Ab serotipi için uygulanan ELISA testinin sensitivite sonuçları; 492 nm de OD değerleri Direk virus 0,544 0,601 0,602 0,536 Negatif kontrol 0,119 0,116 0,110 0,118 1/10 dilüe virus 0,385 0,378 0,437 0,480 Negatif kontrol 0,099 0,103 0,106 0,108 1/100 dilüe virus 0,149 0,184 0,174 0,202 Negatif kontrol 0,102 0,102 0,102 0,108 1/1000 dilüe virus 0,105 0,106 0,108 0,104 Negatif kontrol 0,097 0,099 0,098 0,096 Blank 0,105 0,108 0,100 0,100 Testin sensitivitenin belirlenmesinde önemli parametreler olan OD değerlerinin pozitif negatif oranları (P/N) ile test sonucunda kritik değerin (CutOff Değeri) belirlenmesi için hesaplanan negatif kontrol antijenlerin ortalamasının 3 Standart Sapması (3SS) Çizelge 4.17. de belirtilmiştir.
44 Çizelge 4.17. IPNV Ab serotipi Doku kültürü sonuçları pozitif / Negatif OD oranları ve Cut Off değerleri (492 nm) Pozitif Negatif ortalama ortalama (P) (N) Direk 0,570 0,116 4,9 0,128 1/10 dilusyon 0,420 0,104 4 0,116 1/100 dilusyon 0,106 0,098 1,7 0,113 1/1000 dilusyon 0,106 0,098 1,1 P/N oranları Cut Off değeri (3SS) 0,101 Sonuç olarak P/N oranlarının ≥2 olması ve negatif kontrol antijen değerlerinin 3SS değerinin (CutOff Değeri) pozitif kontrol antijenin değerinden küçük olduğu tespit edilerek testin geçerli olduğu ve IPNV Ab serotipi için sensitivitenin 10 6,8 /ml DKID50 olarak tespit edilmiş ve Grafik 4.5’ de pozitif OD, negatif OD ve cut off değerleri gösterilmiştir.
45 Grafik 4.2. IPNV Ab serotipine karşı uygulanan sistemdeki sensitivite sonuçları 0,600 OD değerleri (492 nm) 0,500 0,400 0,300 Pozitif OD Negatif OD 0,200 Cut Off 0,100 0,000 Direk virus 1/10 dilüsyon 1/100 dilüsyon 1/1000 dilüsyon Virus dilusyonları 4.8.6 IPNV Sp sensitivitesinin belir lenmesi IPNV Sp serotipinin sensitivitesinin belirlenmesi için uygulanan ELISA testinde; mikroplaklar anti IPNV Sp tavşan antikoru (protein konsantrasyonu 10µg/ml) ile kaplandı. % 1,5 BSA ile bloklama işlemi yapıldı. Antijen olarak DKID50 değeri 10 8,3 /ml IPNV Ab virusu direk, 1/10, 1/100, 1/1000 dilüsyonda ve negatif kontrol(enfekte edilmemiş BF2 hücre kültürü sıvısı) direk, 1/10, 1/100, 1/1000 dilüsyonda ilave edildi. Daha sonra anti IPNV Sp kobay antikorundan (protein konsantrasyonu 10µg/ml) konuldu. Konjugat olarak 1/250 konsantrasyonda HRP ile işaretli anti kobay antikoru ilave edildi. Daha sonra OPD substrat konuldu ve reaksiyon stop solüsyonu ile durdurulduktan sonra ELISA okuyucuda 492 nm’de OD değerleri okundu. Okunan değerler Çizelge 4.18’de verilmiştir
46 Çizelge 4.18. IPNV Sp serotipi için uygulanan ELISA testinin sensitivite sonuçları; 492 nm de OD değerleri Direk virus 0,498 0,516 0,481 0,496 Negatif kontrol 0,085 0,086 0,086 0,086 1/10 dilüe virus 0,259 0,238 0,258 0,294 Negatif kontrol 0,090 0,087 0,086 0,089 1/100 dilüe virus 0,114 0,112 0,111 0,118 Negatif kontrol 0,097 0,090 0,088 0,089 1/1000 dilüe virus 0,096 0,095 0,095 0,093 Negatif kontrol 0,089 0,090 0,091 0,092 Blank 0,087 0,086 0,092 0,090
Testin sensitivitenin belirlenmesinde önemli parametreler olan OD değerlerinin pozitif negatif oranları (P/N) ile test sonucunda kritik değerin (CutOff Değeri) belirlenmesi için hesaplanan negatif kontrol antijenlerin ortalamasının 3 standart sapması (3SS) Çizelge 4.19’ da belirtilmiştir. 47 Çizelge 4.19. IPNV Sp serotipi Doku kültürü sonuçları pozitif / Negatif OD oranları ve Cut Off değerleri (492 nm) Pozitif Negatif ortalama ortalama (P) (N) Direk 0,498 0,086 5,8 0,087 1/10 dilüsyon 0,262 0,088 2,9 0,094 1/100 dilüsyon 0,114 0,091 1,3 0,103 1/1000 dilüsyon 0,095 0,091 1,1 0,093 P/N oranları Cut off değeri (3SS) Sonuç olarak P/N oranlarının ≥2 olması ve negatif kontrol antijen değerlerinin ± 3SS değerinin (CutOff Değeri) pozitif kontrol antijenin değerinden küçük olduğu tespit edilerek testin geçerli olduğu ve IPNV Sp serotipi için sensitivitenin DKID50 10 7,3 /ml olarak tespit edilmiş ve Grafik 4.6’ da pozitif OD, negatif OD ve Cut Off Değerleri gösterilmiştir.
48 Grafik 4.3. Sp serotipine karşı uygulanan sistemdeki hücre kültüründen sensitivite sonuçları 0,600 OD değerleri (492 nm) 0,500 0,400 Pozitif OD Negatif OD 0,300 Cut Off 0,200 0,100 0,000 Direk virus 1/10 dilüsyon 1/100 dilüsyon 1/1000 dilüsyon Virus dilusyonları 4.8.7 IPNV VR299, AB, Sp birlikte kullanımda sensitivitenin belirlenmesi IPNV VR299, IPNV Ab ve IPNV Sp serotipleri için hazırlanan antikorların birlikte kullanımı sonucunda uygulanan ELISA testinde sensitivitenin belirlenmesi için; her serotip için ayrı mikroplak anti IPNV VR299, Ab ve Sp tavşan antikorlarından 10’ar µg/ml olacak şekilde kaplandı. %1,5 BSA ile bloklama yapıldı. Antijen olarak kullanılan her serotip (IPNV VR299, Ab, Sp) için direk , 1/10, 1/100, 1/1000 dilüsyon ve negatif kontrol (enfekte edilmemiş BF2 hücre kültürü sıvısı) direk, 1/10, 1/100, 1/1000 dilüsyonda ilave edildi. Daha sonra anti IPNV VR299, Ab ve Sp kobay antikorlarından 10’ar µg/ml olacak şekilde konuldu. Konjugat olarak
49 1/500 oranında sulandırılan HRP ile işaretli anti kobay antikoru ilave edildi. Daha sonra OPD substrat konuldu ve stop solüsyonu ile reaksiyon durdurulduktan sonra ELISA okuyucuda 492 nm’de OD değerleri okundu. Test sonucu okunan değerler IPNV VR299 serotipi için Çizelge 4.20’de, IPNV Ab serotipi için Çizelge 4.21’ de ve IPNV Sp için Çizelge 4.22’de belirtilmiştir. Çizelge 4.20. Üç serotipe karşı elde edilen antikorların birlikte uygulandığı sistemde VR299 serotipinin sonuçları 492 nm de OD değerleri Direk virus 0,643 0,624 0,641 0,659 Negatif kontrol 0,113 0,126 0,116 0,129 1/10 dilue virus 0,541 0,508 0,543 0,484 Negatif kontrol 0,113 0,117 0,114 0,131 1/100 dilue virus 0,243 0,229 0,240 0,208 Negatif kontrol 0,110 0,116 0,116 0,116 1/1000 dilue virus 0,137 0,142 0,145 0,146 Negatif kontrol 0,113 0,115 0,112 0,112
50 Çizelge 4.21. Üç serotipe karşı elde edilen antikorların birlikte uygulandığı sistemde Ab serotipinin sonuçları 492 nm de OD değerleri Direk virus 0,531 0,674 0,602 0,575 Negatif kontrol 0,113 0,126 0,116 0,129 1/10 dilue virus 0,437 0,509 0,494 0,534 Negatif kontrol 0,113 0,117 0,114 0,131 1/100 dilue virus 0,219 0,211 0,158 0,215 Negatif kontrol 0,110 0,116 0,116 0,116 1/1000 dilue virus 0,120 0,124 0,121 0,125 Negatif kontrol 0,113 0,115 0,112 0,112 Çizelge 4.22. Üç serotipe karşı ele edilen antikorların birlikte uygulandığı sistemde Sp serotipinin sonuçları 492 nm de OD değerleri Direk virus 0,324 0,391 0,341 0,342 Negatif kontrol 0,113 0,126 0,116 0,129 1/10 dilüe virus 0,201 0,251 0,224 0,273 Negatif kontrol 0,113 0,117 0,114 0,131 1/100 dilüe virus 0,131 0,132 0,140 0,163 Negatif kontrol 0,110 0,116 0,116 0,116 1/1000 dilüe virus 0,116 0,124 0,124 0,123 Negatif kontrol 0,113 0,115 0,112 0,112
51 Testin sensitivitenin belirlenmesinde önemli parametreler olan OD değerlerinin pozitif negatif oranları (P/N) Çizelge 4.23’de, test sonucunda kritik değerin (cutoff değeri) belirlenmesi için hesaplanan negatif kontrol antijenlerin ortalamasının 3 standart sapması (3 SS) Çizelge 4.24’de belirtilmiştir. Çizelge 4.23. IPNVVR299, Ab, Sp serotipinin birlikte uygulanmasındaki pozitif / Negatif OD oranları (492 nm) Pozitif ortalama VR299 Pozitif ortalama Ab Pozitif ortalama Sp Negatif ortalama (N) P/N oranları VR299 P/N P/N oranları oranları Ab Sp Direk 0,642 0,600 0,350 0,121 5,3 5 2,9 1/10 0,519 0,493 0,237 0,119 4,4 4,1 2 1/100 0,230 0,201 0,142 0,115 2 1,7 1,2 1/1000 0,143 0,123 0,122 0,113 1,3 1,1 1,1 Çizelge 4.24. Üç serotipe karşı elde edilen antikorların birlikte uygulandığı ELISA testinde Cut Off Değerleri Negatif kontrol Negatif kontrol ortalama Cut off değeri (3SS) Direk 0,121 0,142 1/10 0,119 0,143 1/100 0,115 0,124 1/1000 0,113 0,116
52 P/N oranlarının ≥2 olması ve negatif kontrol antijen değerlerinin 3SS değerinin pozitif kontrol antijenin değerinden küçük olduğu tespit edilerek, VR299 serotipi için DKID50 değeri 10 6,6 /ml, Ab serotipi için DKID50 değeri 10 6,8 /ml ve Sp serotipi için DKID50 değeri 10 7,3 /ml sensitivite tespit edilmiş ve Grafik 4.7’de IPNV VR299 serotipi için, Grafik 4.8’de IPNV Ab serotipi için, Grafik 4.9’da IPNV Ab serotipi için pozitif OD, negatif OD ve Cut Off Değerleri gösterilmiştir. Grafik 4.4. Üç serotipe karşı elde edilen antikorların birlikte uygulandığı ELISA sisteminde VR299 serotipinin sensitivite sonuçları 0,700 OD değerleri (492 nm) 0,600 0,500 Pozitif OD 0,400 Negatif OD 0,300 Cut Off
0,200 0,100 0,000 Direk virus 1/10 dilue virus 1/100 dilue virus Virus dilusyonları 1/1000 dilue virus 53 Grafik 4.5. Üç serotipe karşı elde edilen antikorların birlikte uygulandığı ELISA sisteminde Ab serotipinin sensitivite sonuçları 0,700 OD değerleri (492 nm) 0,600 0,500 0,400 Pozitif OD Negatif OD 0,300 Cut Off
0,200 0,100 0,000 Direk virus 1/10 dilue virus 1/100 dilue virus Virus dilusyonları 1/1000 dilue virus 54 Grafik 4.6. Üç serotipe karşı elde edilen antikorların birlikte uygulandığı ELISA sisteminde Sp serotipinin sensitivite sonuçları 0,400 0,350 OD değerleri (492 nm) 0,300 0,250 Pozitif OD Negatif OD Cut Off 0,200 0,150 0,100 0,050 0,000 Direk virus 1/10 virus dilüsyonu 1/100 virus dilüsyonu 1/1000 virus dilüsyonu Virus dilusy onları 4.8.8 Deneysel enfeksiyonda ELISA test sonuçları IPNV VR299, IPNV Ab ve IPNV Sp serotipi ile yapılan deneysel enfeksiyon sonrasında 5. gün, 6. gün ve 7. günde hastalık semptomu gösteren ve/veya ölen balıklardan alınan organ örneklerinden hücre kültürüne ekim yapılmadan direk balık dokularından uygulanan ELISA testinde; her üç serotip için ayrı mikroplak kullanılarak anti IPNV VR299, Ab Sp tavşan antikoru ile 10µg/ml olacak şekilde
55 kaplandı. % 1,5 BSA ile bloklama işlemi yapıldı. Antijen olarak deneysel enfeksiyon sonrasında 5., 6., ve 7. günde balıklardan hazırlanan supernatant ve negatif kontrol (enfekte edilmemiş BF2 hücre kültürü sıvısı) ilave edildi. Daha sonra anti IPNV VR 299, Ab Sp kobay antikorundan 10µg/ml konuldu. Konjugat olarak IPNV VR299 ve Ab serotipi için 1/500, Sp serotipi için 1/250 konsantrasyonda HRP ile işaretli anti kobay ilave edildi. Daha sonra OPD substrat konuldu ve stop solüsyonu ile durdurulduktan sonra 492 nm’de ELISA okuyucuda OD değerleri okundu. Okunan değerler IPNV VR299 serotipi için Çizelge 4.25’de, IPNV Ab serotipi için Çizelge 4.26’da ve IPNV Sp serotipi için Çizelge 4.27’de verilmiştir. Çizelge 4.25. IPNV VR299 serotipinin deneysel enfeksiyondan sonra direk balık dokusundan yapılan ELISA test sonuçları 492 nm de OD değerleri Deneysel enfeksiyon 5. gün 0,070 0,072 0,075 0,073 Negatif kontrol 0,068 0,067 0,068 0,070 Deneysel enfeksiyon 6. gün 0,080 0,082 0,082 0,083 Negatif kontrol 0,069 0,067 0,070 0,072 Deneysel enfeksiyon 7. gün 0,070 0,071 0,071 0,073 Negatif kontrol 0,067 0,068 0,074 0,068 Blank 0,087 0,068 0,065 0,085
56 Çizelge 4.26. IPNV Ab serotipinin deneysel enfeksiyondan sonra direk balık dokusundan yapılan ELISA test sonuçları; 492 nm de OD değerleri Deneysel enfeksiyon 5. gün Negatif kontrol Deneysel enfeksiyon 6. gün Negatif kontrol Deneysel enfeksiyon 7. gün Negatif kontrol Blank 0,100 0,109 0,095 0,108 0,114 0,117 0,108 0,102 0,120 0,125 0,108 0,121 0,105 0,105 0,102 0,099 0,136 0,133 0,121 0,130 0,103 0,103 0,343 0,316 0,105 0,108 0,100 0,100 Çizelge 4.27. IPNVSp serotipinin deneysel enfeksiyondan sonra direk balık dokusundan yapılan ELISA test sonuçları; 492 nm de OD değerleri Deneysel enfeksiyon 5. gün 0,104 0,109 0,101 0,104 Negatif kontrol 0,095 0,095 0,094 0,094 Deneysel enfeksiyon 6. gün 0,098 0,094 0,098 0,101 Negatif kontrol 0,097 0,097 0,096 0,101 Deneysel enfeksiyon 7. gün 0,095 0,099 0,095 0,100 Negatif kontrol 0,092 0,102 0,101 0,098 Blank 0,087 0,086 0,092 0,090
57 Testin sensitivitenin belirlenmesinde önemli parametreler olan OD değerlerinin pozitif negatif oranları (P/N) IPNV VR299 için Çizelge 4.28’de, IPNV Ab için Çizelge 4.29’da, IPNV Sp için Çizelge 4.30’da; test sonucunda kritik değerin (cutoff değeri) belirlenmesi için hesaplanan negatif kontrol antijenlerin ortalamasının 3 standart sapması (3SS) Çizelge 4.31’de belirtilmiştir. Çizelge 4.28. IPNV VR299 serotipi için deneysel enfeksiyon sonrası direk balık dokusundan uygulanan ELISA testinin Pozitif / Negatif OD oranları (492 nm) IPNV VR299 Pozitif Negatif P/N Ortalama ortalama oranları (P) (N) Deneysel enfeksiyon 5.gün 0,073 0,068 1,1 Deneysel enfeksiyon 6.gün 0,082 0,070 1,2 Deneysel enfeksiyon 7.gün 0,071 0,071 1,0
58 Çizelge 4.29. IPNV Ab serotipi için deneysel enfeksiyon sonrası direk balık dokusundan uygulanan ELISA testinin Pozitif / Negatif OD oranları (492 nm) IPNV Ab Pozitif Negatif P/N Ortalama ortalama oranları (P) (N) Deneysel enfeksiyon 5.gün 0,103 0,110 0,9 Deneysel enfeksiyon 6.gün 0,119 0,103 1,2 Deneysel enfeksiyon 7.gün 0,130 0,130 1,0 Çizelge 4.30 IPNV Sp serotipi için deneysel enfeksiyon sonrası direk balık dokusundan uygulanan ELISA testinin Pozitif / Negatif OD oranları (492 nm) IPNV Sp Pozitif Negatif P/N oranları Ortalama ortalama VR299 (P) (N) 5.gün 0,105 0,095 1,1 6.gün 0,098 0,098 1,0 7.gün 0,097 0,098 1,0
59 Çizelge 4.31. IPNV VR299, Ab ve Sp serotipleri direk balık dokusundan uygulanan ELISA testinin cut off değerleri VR299 Cut off değeri (3SS) Deneysel nfeksiyon 5.gün Deneysel enfeksiyon 6.gün Deneysel enfeksiyon 7.gün 0,071 0,076 0,078 Ab Cut off değeri (3SS) Sp Cut off değeri (3SS) 0,130 0,106 0,111 0,104 0,110 0,110 Sonuç olarak P/N oranlarının 2 değerinden düşük olması ve negatif kontrol antijen değerlerinin 3SS hesaplanarak elde edilen kritik değer (Cut Off Değeri) dikkate alındığında her üç serotip için uygulanan test sonucu da negatif bulunmuştur. Test sonucu alınan değerlerin pozitif OD, negatif OD ve cut off değerleri IPNV VR 299 serotipi için Grafik 4.10’da, IPNV Ab serotipi için Grafik 4.11’de IPNV Sp serotipi için Grafik 4.12’de gösterilmiştir.
60 Grafik 4.7. IPNVVR299 serotipinin deneysel enfeksiyondan sonra direk balık dokusundan yapılan ELISA test sonuçları 0,300 OD değerleri (492 nm) 0,250 0,200 Pozitif OD Negatif OD Cut Off
0,150 0,100 0,050 0,000 Deneysel enfeksiyon sonrası numune alma 6. gün 7. gün günleri 5. gün 61 Grafik 4.8. IPNVAb serotipinin deneysel enfeksiyondan sonra direk balık dokusundan yapılan ELISA test sonuçları 0,300 0,250 OD değerleri (492 nm) 0,200 Poziti f OD 0,150 Nega tif OD Cut Off
0,100 0,050 0,000 5. gün 6. gün 7. gün Deneysel enfeksiyon sonrası num une alm a günleri 62 Grafik 4.9. IPNVSp serotipi için deneysel enfeksiyondan sonra direk balık dokusundan yapılan ELISA test sonuçları 0,200 OD değerleri (492 nm) 0,150 Pozitif OD Negatif OD Cut Off
0,100 0,050 0,000 5. gün 6. gün 7. gün Deneysel enfeksiyon sonrası numune alma günleri 63 4.8.9 Saha izolatına uygulanan ELISA test sonuçları Laboratuvara sahadan gönderilen enfekte balıklardan hücre kültüründe izole edilen şüpheli virus ve aynı materyalin direk balık dokusundan hazırlanan supernatant geliştirilen ELISA yöntemiyle üç serotipin reaktiflerinin birlikte uygulandığı sistemde test edildi. Bunun için mikroplak anti IPNV VR299, Ab ve Sp tavşan antikorları (10’ar µg/ml) ile kaplandı. %1,5 BSA ile bloklama yapıldı. Antijen olarak hücre kültüründe izole edilen şüpheli virus ve negatif kontrol (enfekte edilmemiş BF2 hücre kültürü sıvısı) ilave edildi. Daha sonra anti IPNV VR299, Ab ve Sp kobay antikorlarından (10’ar µg/ml) şekilde konuldu. Konjugat olarak 1/500 oranında sulandırılan HRP ile işaretli anti kobay ilave edildi. Daha sonra OPD substrat konuldu ve stop solüsyonu ile reaksiyon durdurulduktan sonra 492 nm’de ELISA okuyucuda OD değerleri okundu. Test sonucu okunan değerler Çizelge 4.32’de belirtilmiştir. Çizelge 4.32. Saha izolatının üç serotipin birlikte kullanıldığı sistemdeki OD değerleri (492 nm) Hücre kültüründe 0,572 0,453 0,614 0,605 0,212 0,330 0,452 0,392 Negatif kontrol 0,113 0,126 0,116 0,129 Blank 0,110 0,116 0,128 0,117
saha izolatı Direk dokudan saha materyali 64 Testin sensitivitenin belirlenmesinde önemli parametreler olan OD değerlerinin pozitif negatif oranları (P/N) ve test sonucunda kritik değerin (CutOff Değeri) belirlenmesi için hesaplanan negatif kontrol antijenlerin ortalamasının 3 standart sapması (3 SS) Çizelge 4.33’de belirtilmiştir. Çizelge 4.33. Saha izolatının üç serotipin birlikte kullanıldığı sistemdeki pozitif / negatif (P/N) OD oranları (492 nm) ve cut off değerleri Hücre kültüründe saha izolatı Direk dokudan saha materyali Pozitif ortalama (P) Negatif ortalama (N) P/N oranları Cut off değeri (3SS) 0,561 0,121 4,6 0,144 0,347 0,121 2.8 0,144 Sonuç olarak; hem hücre kültüründe izole edilen virus hem de sahadan izole edilen virusun, geliştirilen ELISA yöntemi ile testi sonucu elde edilen P/N oranının ≥2 olması ve negatif kontrolün 3SS hesaplanarak elde edilen kritik değer (Cut Off Değeri) dikkate alındığında test edilen şüpheli virusun IPNV olduğu ve bu testin IPN virus teşhisinde uygulanabilir olduğu tespit edilmiştir. Test sonucu alınan değerlerin pozitif OD, negatif OD ve cut off değerleri Grafik 4.13’de gösterilmiştir.
65 Grafik 4.10. Saha izolatının 3 serotipin birlikte kullanıldığı sistemdeki bulguları(492 nm de OD değerleri) 0,6 OD değerleri (492 nm) 0,5 0,4 Pozitif OD 0,3 Negatif OD Cut off
0,2 0,1 0 Hücre kültüründen Direk dokudan Saha izolatı 66 IPNV’nin identifikasyonu için kullanılan ticari ELISA kiti protokolüne uygun olarak sahadan izole edilen virusa uygulandığında elde edilen sonuçlar Çizelge 4.34’de belirtilmiştir.
Çizelge 4.34. Saha izolatının ticari test kiti kullanımı sonucunda OD değerleri (450 nm) Hücre kültüründe Ortalama P/N ortalama 0,647 0,614 0,631 3,6 0,482 0,330 0,406 2,3 Pozitif kontrol 0,892 0,778 0,835 4,8 Negatif kontrol 0,184 0,165 0,175 Blank 0,222 0,218 0,220 saha izolatı Direk dokudan saha materyali Sonuç olarak P/N oranları dikkate alındığında tezde geliştirilen ELISA testi ve ticari kit ile uygulanan ELISA testinde benzer sonuçların elde edilmiştir.
67 5. TARTIŞMA IPN hastalığı özellikle genç salmonid balıklarda mortalite oranı yüksek olan önemli viral hastalıklardan biridir. Klinik veya subklinik hastalık sonucunda taşıyıcılık durumu gelişmekte ve yaşam boyunca virus saçılabilmektedir. Hastalığın hızlı ve doğru teşhisi, etkili kontrolü, hastalığın epizootiyolojisinin anlaşılması ve eradikasyonu için oldukça önemlidir (Nicholsan and Caswell, 1982). IPNV’nin teşhisi hücre kültüründe virus izolasyonunu takiben nötralizasyon, IFAT ve ELISA gibi serolojik metotlarla identifikasyon ile yapılmaktadır. Klinik olarak hasta balıklarda histolojik ve serolojik metotlarla enfekte dokularda IPNV antijeni gösterilmekle birlikte konfirmasyon hücre kültüründe izolasyon ve serolojik metotlarla teşhis ile yapılmaktadır (Anonim, 2006). Serolojik metotlar yüksek spesifite ve sensitivitelerinden dolayı teşhisde kullanılmaktadır. Serolojik metotlardan yaygın olarak kullanılan immunfloresan ve virus nötralizasyon testlerinin zaman alıcı olması, pahalı ekipmanlara ihtiyaç duyulması, sonuçların değerlendirilmesinde ve uygulamada zorlukların olması gibi dezavantajları vardır (Voller et al., 1979). Nicholsan and Caswell (1982) IPNV’nin tespiti için hücre kültüründe izolasyondan sonra identifikasyon amacıyla uygulanan virus nötralizasyon testine alternatif olarak kullanılan immunfloresan ve immunperoksidaz testlerinin hızlı ve sensitif olmasına rağmen değerlendirilmesinde tecrübe gerektirdiği ve test maliyetlerinin fazla olması nedeniyle daha hızlı, basit ve daha ucuz testlere ihtiyaç olduğunu ve ELISA testinin diğer testlere göre daha fazla avantajlı olduğunu belirtmişlerdir. ELISA’da bilinmeyen antijen, spesifik antikor ile oluşturduğu kompleks ile tespit edilebildiği için testin sensitivitesi büyük oranda antikorun aviditesi ve konsantrasyonuna bağlıdır. Antijen tespitinde kompetatif olmayan ve indirekt uygulanan sistemlerin daha duyarlı olduğu belirlenmiştir (Yolken, 1982). Gould
68 (1988) sensitivite ile ilgili en önemli faktörün, affinite pürifiye poliklonal veya monoklonal antikor kullanımı ile ilgili olduğunu belirtmiştir. Türkiye’de IPN hastalığının tanısında, doku kültüründe virusun izolasyonunu takiben IFAT ve ELISA rutin olarak kullanılmaktadır. Kullanılan iki test için de ticari kitler ithal olarak gelmektedir. Bu çalışmada gökkuşağı alabalıklarında IPN hastalığı etkeni olan IPNV’nin teşhisinde kullanılan ve diğer serolojik metotlardan daha hızlı, basit, ucuz ve kolay uygulanabilen bir test olan ELISA testinin geliştirilmesi amaçlanmıştır. Genel olarak direkt, indirekt, sandviç ve kompetatif olmak üzere ELISA yöntemleri 4 grup halinde sınıflandırılmıştır (Crowther, 1995). Uygulanacak ELISA yöntemi seçiminde, direkt teknikte teşhis edilecek her bir antijen için farklı antikor enzim konjugatı gerekli olduğundan kullanımı sınırlı kalmaktadır. Bu yüzden indirekt teknikler geliştirilmiş ve direk ELISA’dan daha duyarlı olduğu tespit edilmiştir. İndirek ELISA için gerekli olan antikorlardan, enzim işaretli antiglobulin ile solid fazda kaplama için kullanılan antikorlar arasında nonspesifik reaksiyonu önlemek için immunolojik olarak farklı immunglobulin içeren 2 hayvan türünde hazırlanması önerilmektedir (Yolken,1982). Çift antikor sandviç ELISA tekniğini uygulanan çalışmalarda antikorları elde etmek amacıyla Rodak et. al. (1988) IPNV Sp serotipi için tavşan ve domuz, Nicholsan and Caswell (1982) WB serotipi için ve Hattori et. al. (1984) VR299 serotipi için tavşan ve kobay kullanmışlardır. Bu çalışmada antijen tespitinde daha duyarlı olan ve her bir antijen için farklı antikor konjugatı gerektirmeyen çift antikor sandviç ELISA yöntemi seçilmiştir. IPNV VR299, Sp ve Ab serotiplerinden antikor elde etmek için hayvan türü olarak bakım ve beslemesi kolay olan tavşan ve kobay kullanılmıştır. Hill et al., (1981) yaptıkları araştırmada immunojen olarak konsantre virüs, doku kültürü supernatantı ve pürifiye virus, adjuvan olarak Freund Complete Adjuvan (FCA) ve Freund Incomplete Adjuvan (FIA) kullanarak çeşitli immunizasyon tekniklerini karşılaştırmışlar, en iyi sonucu pürifiye virus ile FCA kullanarak,
69 intramuskuler yoldan uygulama ile elde etmişlerdir. Hattori et. al. (1984) kobayda konsantre virus, tavşanda pürifiye virus kullanarak eşit miktarda Freund complete adjuvan ile emülsifiye edildikten sonra subkutan yol ile ilk inokulasyonu, 3 hafta sonra aynı şekilde ikinci enjeksiyonu yapmışlar, son enjeksiyondan 1 hafta sonra hayvanlardan kan almışlardır. Bu çalışmada daha spesifik antikor elde etmek amacıyla immunojen olarak her iki hayvanda da pürifiye virus kullanılmış, adjuvan olarak FCA seçilmiş ve immunizasyon subkutan yoldan enjeksiyon yöntemiyle uygulanmıştır. ELISA testinde antijen veya antikoru solid faza bağlamak için çeşitli taşıyıcılar kullanılmakta olup en çok kullanılanları poliesteren, propilen, polivinil ve diğer plastiklerden oluşmaktadır. Yapılan çalışmalarda poliesterenden yapılan mikroplaklarin avantajlı olduğu, polivinil plaklarin de kullanışlı olduğu ancak göz ile yapılan değerlendirmelerde yüksek backround oluşumundan dolayı uygun olmadığı gösterilmiştir (Voller, 1979). Bu çalışmada polystren mikroplaklar kullanılmıştır. Konjugatlardan alkalin fosfataz ve HRP; ucuz, kolay konjugasyon uygulanması ve fazla çeşitte substrat kullanılabilmesi nedeniyle tercih edilmektedir (Voller ve ark., 1979). İndirekt sandviç ELISA’da ticari olarak bulunabilen tür spesifik enzim işaretli antiimmunglobulinlerin kullanılmasının daha avantajlı olduğu belirtilmiştir (Sauer ve ark., 1985). Kullanılan substrat ucuz, güvenli ve kullanımı kolay olmalıdır. Peroksidaz için OPhenylenediamine (OPD)’ in iyi bir substrat olduğu belirtilmiştir (Voller et.al., 1979). Bu çalışmada konjugat olarak HRP ile işaretli anti kobay Ig ve substrat olarak OPD kullanılmıştır. Yıkama aşamasında Tween 20 içeren PBS ile birkaç dakika bekletilerek 3 kez yıkama önerilmektedir (Voller et. al., 1979). Bu çalışmada 3 er dakika bekleme ile 4 kez yıkama yapılması uygun bulunmuştur. Değerlendirme de substratın konsantrasyonu spektrofotometrik veya göz ile ölçülebilmektedir (Yolken, 1982). ELISA okuyucuda 400500 nm dalga boyu arasında absorbans değeri 0,10,2 olduğunda, göz ile negatif ve pozitif reaksiyonlar ayrılabilmektedir (Voller et.al., 1979). Bu çalışmada 492nm dalga boyunda ELISA
70 okuyucu ile sonuçlar kantitatif olarak değerlendirilmesine rağmen 0,124 (VR299 serotipi), 0,196 (Ab serotipi) ve 0,180 (Sp serotipi) olarak okunan optik dansitelerde oluşan sarı renk, göz ile de pozitif olarak değerlendirilebilmiştir. Hattori et. al. (1984) ve Rodak et. al. (1988) IPNV’ nun pürifikasyonu için ultrasantrifüj ile konsantrasyon işleminden sonra CsCl gradient uygulamışlardır. Dixon and Hill (1983) pürifikasyon amacıyla PEG 6000 ile konsantrasyon ve sukroz dansiti gradient uygulamışlardır. Virusun konsantrasyonu amacıyla kullanılan metotlardan PEG 6000’ in ultra santrifüj ve moleküler filtrasyondan daha iyi bir yöntem olduğu belirtilmektedir (Killington et. al., 1996). Bu çalışmada PEG 6000 ile konsantrasyon ve ultrasantrifüj kullanılarak sukroz dansiti gradient ile pürifikasyon işlemi uygulanmıştır. ELISA sensivite çalışmalarında, Dixon (1983) 10 5 PFU / ml sensitivite ve serotipler arasında düşük seviyede çapraz reaksiyon olduğunu, Hattori et. al. (1984) 10 4 DKID50 / ml sensitivite, Rodak et. al. (1988) 10 3 DKID50 /ml sensitivite, Dominquez et. al. (1990) monoklonal antikorlar ile avidinbiotin sistemini kullanarak 10 4 DKID50/ ml sensitivite olduğunu belirlemişlerdir. Araştırmacılar serolojik metodlardaki sensitivitenin büyük oranda kullanılan antikorların spesifite ve kalitesine bağlı olduğunu belirtmişlerdir. Hattori et. al. (1984) sensitivitede ki düşüklüğünün kullanılan anti serumların saflığına bağlı olacağını belirtmişlerdir. Nicholsan and Caswell (1982) yaptıkları çalışmada WB (VR299) serotipine karşı geliştirdikleri sistemde sensitivitenin 10 5,5 DKID50/ ml olduğunu tespit etmişler. Bu sensitivitenin IPNV ile enfekte hücre kültüründe genellikle virusun titresinin 10 7 10 9 DKID50/ ml olmasından dolayı hücre kültüründe identifikasyon için çok kullanışlı olduğunu belirtmişlerdir. ELISA uygulamasının sonucunda minimum pozitif OD değerinin belirlenmesi için, elde edilen absorbans değerleri standartize edilmesi gerektiği belirtilmiş ve bu amaçla yapılan çalışmalarda, Nicholsan and Caswell (1982), negatif antijenlerin OD değer ortalamalarının 3 standart hatasını hesaplamış ve P/N oranlarının 1,4’ den
71 büyük olması, Savigny and Voller (1980) P/N oranlarının 2’ den büyük olması gerektiğini bildirmeşlerdir. Bu çalışmada minimum pozitif OD değerinin belirlenmesi için negatif antijenlerin OD değer ortalamalarının 3 standart hatası hesaplanmış ve P/N oranları 2’ den büyük olan değerler pozitif olarak değerlendirilmiştir. IPNV serotipleri ayrı ayrı test edildiklerinde sensitivitelerinin, DKID50 değerlerinin VR299 serotipi için; 10 6,6 /ml, Ab serotipi için; Nicholsan and Caswell (1982) tarafından belirtilen P/N oranlarının 1,4’ den büyük olması dikkate alınarak 10 6,8 /ml ve Sp serotipi için 10 7,3 /ml olduğu belirlenmiştir. Serotipler birlikte uygulandıklarında da her üç serotip için ayrı uygulandıkları testlerle aynı duyarlılık tespit edilmiştir. Bu sonuçlara göre en duyarlı sistemin VR299 serotipin olduğu belirlenmiştir. Way and Dixon (1988), tavşanlarda yaptıkları immunizasyon çalışmasından sonra nötralizan antikor titresinin düşük olduğunu (1/1000’ in altında) fakat bu antikorların yüksek bağlanma kapasitesinin olduğunu göstermişler ve ELISA yöteminde kullanılan antikor ile bu antikorların nötralizan antikor titreleri arasında bir ilişki bulunmadığını belirtmişlerdir. Bu çalışmada da elde edilen antikorların nötralizan antikor titreleri ile ELISA testindeki performansları arasında bir ilişki bulunamamıştır. Bu çalışmada alabalık yavrularında yapılan deneysel enfeksiyon sonucu ölüm görülen balık dokularından hazırlanan supernatantlara uygulanan mikrotitrasyon sonucunda DKID50 değerleri 10 5 10 6 /gr arasında bulunmuştur. Bu değerlerdeki virus, geliştirilen ELISA sisteminde tespit edilememiştir. Deneysel enfeksiyon oluşturulan balık dokularında virusun titresinin düşük olmasının nedenlerinin yavru balıkların organları ayrılmadan tüm olarak ve materyal hazırlama vasatı ile 10 katı dilue edilerek kullanılmış olması düşünülmektedir. Bununla birlikte saha enfeksiyonundan alınan balık dokularında uygulanan ELISA testi sonucunda IPN virusu tespit edilebilmiştir. Yolken (1982) Enzim immunoassay testlerinin doku kültürü analizleri ile karşılaştırıldığında daha hızlı ve daha az pahalı olmasına rağmen daha az duyarlı
72 olduğunu ve EIA metodunda negatif çıkan örneklerin doku kültürü analizleriyle doğrulanması gerektiği belirtilmiştir. Testin spesifitesinin belirlenmesi için uygulanan ELISA test bulgularına göre üç serotipin ayrı ayrı uygulandığı sistemde ve üç serotipin birlikte kullanıldığı sistemde diğer balık virusları olan IHN, VHS virusları ile çapraz reaksiyon görülmemiştir. Serotipler arasında çapraz reaksiyonun bulunduğu, bu reaksiyonun Sp ve Ab arasında daha fazla olduğu ancak VR299 serotipi için olduça düşük olduğu görülmüştür. Bu sonuçlar serotipler arasında düşük seviyede çapraz reaksiyon olduğunu bildiren Dixon (1983) ve IPN virusları ile diğer balık virusları arasında çapraz reaksiyon görülmediğini bildiren araştırmacılar ile uyum göstermektedir (Nicholsan and Caswell,1982; Hattori et. al.1984).
73 6. SONUÇ IPNV’nin identifikasyonu amacıyla üç ana serotipine karşı tavşan ve kobayda antiserum üretilmiş ve bu antiserumlar kullanılarak ELISA testi uygulanmıştır. IPNV’yi tespit etmek amacıyla geliştirilen ELISA’nın, her üç IPNV serotipine karşı uygulanan testlerde yeterli sensivite ve spesifite gösterdiği tespit edilmiştir. ELISA testinin sensitivitesini belirlemek için yapılan çalışmalarda, VR299 serotipinin duyarlılığının DKID50 değerinin 10 6,6 /ml olduğu, Ab serotipinin duyarlılığının DKID50 değerinin 10 6,8 /ml olduğu ve Sp serotipinin duyarlılığının DKID50 değerinin 10 7,3 /ml olduğu belirlenmiştir. Testin spesifitesini belirlemek için yapılan çalışmalarda ise IPNV serotipleri ile diğer balık viruslarından olan IHN ve VHS viruslarının çapraz reaksiyon vermediği tespit edilip yeterli spesifitenin varlığı ortaya konulmuştur. Saha materyali olarak alınan balık dokusu ve saha materyalinin hücre kültürlerine ekimi sonucu izole edilen virus ile uygulanan ELISA testi sonucunda IPN virusunun tespit edilebildiği gösterilmiştir. Ayrıca aynı saha materyalinin ticari ELISA kiti ile yapılan testinden elde edilen sonuçlar ile geliştirilen metot sonuçları arasında paralellik olduğu da görülmüştür. Bu çalışmada elde edilen sonuçlar, geliştirilen ELISA yönteminin, IPNV’ nun teşhisinde uluslararası standart metot olarak kabul edilen doku kültüründe izolasyon yöntemini takiben identifikasyon amacıyla başarılı bir şekilde kullanılabileceğini ve sahadan gelen balık materyalin direk dokularından yapılan test sonucunda da virusu identifiye edilebileceğini göstermiştir. Bu çalışma sonucunda elde edilen bulgular bundan sonra yapılacak benzer çalışmalara kaynak olabilecektir.
74 7. KAYNAKLAR DİZİNİ Adair, B.M. and Ferguson, H.W., 1981, Isolation of infectious pancreatic necrosis (IPN) virus from nonsalmonid fish, Journal of Fish Diseases, 46976 Adams, A.,1992, Sandwich Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA) to Detect and Quantify Bacterial Pathogens In Fish Tissue, Techniques in Fish İmmunology, SOS publications, 43 Denormandie Ave., Fair Haven, NJ.07704 3303 USA, 177182 pp. Agıus, C., Mangunwıryo, H., J ohnson, R.H. and Smail, D.A., 1982, A more sensitive technique for isolating infectious pancreatic necrosis virus from asymptomatic carrier rainbow trout, Salmo gairdneri Richardson, Journal of fish diseases., 5 285292. Ahne, W. and Thomsen, I., 1986, İnfectious pancreatic necrosis Detection of virus and antibodies in rainbow trout IPNVcarrier (Salmo gairdneri), J. Vet. Med. B., 33 552554. Anonim, 1991, 91/67/EEC, concerning the animal health condiotions governing the placing on the market of aquaculture animals and products. http//ec.europa.eu/food/animal/animalproducts/aquaculture/index_en.htm. Anonim, 2003,OIE, Diagnostic Manual for Aquatic Animal Diseases, Fourth edition, OIE, Paris. Anonim, 2006, OIE , İnfectious Pancreatic Necrosis, Manual of Diagnostic Tests for Aquatic Animals, http//www.oie.int/eng/normes/fmanual/A_summry.htm. Arda, M., Minbay, A., Aydın, N., Akay, Ö., İzgür, M., Diker, K.S.,1994, İmmunoloji, Medisan Yayınevi, Ankara,353388ss. Beard, C.W., 1989, Serological procedure, A laboratory Manual for the Isolation and Identification of Avian Pathogens, third edition. H. Graham Purchase, Chairman Lawrence H., Charles H. Domermuth, James E. Pearson (Eds), Kendall/Hunt Publishing Company Iowa, 192200 pp. Biering, E., Villoing, S., Sommer set, I. and Christie, KE., 2005, Update on viral vaccines for fish, DevBiol (Basel)., 12197113.
75 Bidwell, D.E, 1976, The enzymelinked immunosorbent assay (ELISA), Bull. World Health Organ, 54 129139. Candan, A., 2002, First report on the diagnosis of infectious pancreatic necrosis (IPN) based on reverse transcription polymerase chain reaction (RTPCR) in Turkey, Bull. Eur. Ass. Fish Pathol., 22(1)4548. CaswellReno, P., Reno, P.W. and Nicholson, B.L., 1986, Monoclonal antibodies to infectious pancreatic necrosis virus analysis of viral epitopes and comparison of different isolates, J.Gen. Virol., 67 21932205. CaswellReno, P., Lipipun, V., Reno, P. W. and Nicholson, L., 1989, Use of a groupreactive and other monoclonal antibodies in an enzyme immunodot assay for identification and presumptive serotyping of aquatic birnaviruses, Journal of Clinical Microbiolgy, 27 19241929. Crowther, J . R.,1995, ELISA Theory and Practice. Humana Press Inc. 999 Riverview Drive, Suite 208 Totowa, New Jersey 07512. Cutrin, J .M., Olveira, J .G., Barja, J.L. and Dopazo, C.P., 2000, Diversty of infectious pancreatic necrosis virus strains isolated from fish, shellfish, and other reservoirs in Northwestern Spain, Applied and Environmental Microbiology, 66 839843. Cutrin, J .M., LopezVazquez, C., Olveira, J .G., Castro, S., Dopazo, C.P. and Bandin, I., 2005, Isolation in cell culture and detection by PCRbased technology of IPNVlike virus from leucocytes of carrier turbot, Scophthalmus maximus (L.), Journal of Fish Diseases, 28 713722 Dixon, P.F. and Hill, B.J ., 1983, Inactivation of infectious pancreatic necrosis virus for vaccine use, Journal of Fish Diseases, 6399409. Dixon, P.F. and Hill, B.J ., 1983, Rapid detection of infectious pancreatic necrosis virus (IPNV) by the enzymelinked immunosorbent assay (ELISA), J.gen.Virol., 64 321330. Domínguez, J ., Hedrick, R.P. and SánchezVizcaino, J .M.,1990, Use of monoclonal antibodies for detection of infectious pancreatic necrosis virus by the enzyme linked immunosorbent assay (ELISA), Disease of Aquatic Organism, 8157163.
76 Dobos, P, 1976, Size and structure of the genome of infectious pancreatic necrosis virus, Nucleic Acids Research, 3 19031924. Dobos, P, 1977, Virus spesific protein synthesis in cells infected by infectious pancreatic necrosis virus, Journal of Virology, 21242258. Dobos, P. and Rowe, D., 1977, Peptide map comparison of infectious pancreatic necrosis virusspecific polypeptides, Journal of Virology, 24805820. Dopazo, C. P. and Barja, J . L, 2002, Diagnosis and identification of IPNV in salmonids by molecular methods, C.O Cunningham (Ed.) Molecular Diagnosis of Salmonid Diseases, 2348pp. Essbauer, S. and Ahne, W., 2001,Viruses of lover vertebrates. J.Vet. Med B., 48 403475. Evensen, Ø. and Rimstad, E., 1990, Immunohistochemical identification of infectious pancreatic necrosis virus in paraffinembedded tissues of Atlantic salmon (Salmo salar ). J. Vet. Diagn. Invest 2:288293. Frantsi, C. and Savan, M., 1971, Infectious Pancreatic necrosis Virus Tempperature and Age Factors in Mortality. Journal of Wildlife Diseases 7: 249255. Gahlawat, S.K., Munro, E.S., and Ellis, A.E., 2004, A nondestructive test for detection of IPNVcarriers in Atlantic Halibut, Hippoglossus hippoglossus (L.), Journal of Fish Diseases, 27 233239. Gould, B.J., 1988, The use of enzymes in ultrasensitive immunoassay, İmmunoassays for Veterinary& Food analysis1, Morris, Clifford& Jackman (Eds), Elsevier Applied Science, London& N.Y., 5365 pp. Har low, E. and Lane, D.,1988, Antibodies a Laboratory Manual,. Cold Spring Laboratory,1988, New York, 340348pp. Hattori, M., Kodama, H., Ishiguro, S., Honda, A., Mikami, T., and Izawa, H., 1984, In vitro and in vivo detection of infectious pancreatic necrosis virus in fish by enzyme linked immunosorbent assay, Am. J. Vet. Res., 45(9)18761879. Heppell, J ., Berthiaume, L., Tar rab, E., Lecomte, J . and Arella, M., 1992, Evidence of genomic variations between infectious pancreatic necrosis virus strains determined by restriction fragment profiles, Journal of General Virology, 7328632870.
77 Hill, B. J ., Williams, R.F., and Finlay, J , 1981, Preparation of antisera against fish virus disease agents, Develop. Biol.Standart., 49 209218. Hill, B. J., and K. Way., 1995, Serological classification of infectious pancreatic necrosis (IPN) virus and other aquatic birnaviruses, Annu. Rev. Fish Dis., 555 77. Hsu, Y.L., Chiang, S.Y., Lin, S.T. and Wu, J.L. 1989. The spesific detection of infectious pancreatic necrosis virus in infected cells and fish by the immuno dot blot method, Journal of fish diseases, 12561571. Hsu, Y.L., Chen, B. S. and Wu, J .L., 1993, Demonstration of infectious pancreatic necrosis virus strain VR299 in Japanese eel, Anguilla japonica Temminck &Schlegel, Journal of Fish Diseases., 16, 123129. Hudson, E.B., Bucke, D. and For rest, A., 1981, Isolation of infectious pancreatic necrosis virus from eels, Anguilla anguilla L., in United Kingdom, Journal of Fish Diseases, 4 429431. Isshiki, T., Nagano, T. and Suzuki, S., 2001, Infectivity of aquabirnavirus strains to various marine fish species, Disease of Aquatic Organism, 73 28632870. J ensen,I., 2003, Antiviral mechanisms in fish, IPN in salmonids a review, http//www.fiskerifond.no/files/projects/attach/ipnsalmonids.pdf Killington, R.A., Stokes, A. and Hierholzer, J .C., 1996, Virology Methods Manual, Edited by Mahy, B. WJ. and Kangro, H.O., Academic Press Limited, London, 7188 pp Kimura, T., Yoshımızu, M. and Yasuda, H., 1984, Rapid, simple serological diagnosis of infectious pancreatic necrosis by coagglutination test using antibodysensitized staphylococci, Fish Pathology, 19(1) 2533 Larsen, R., Rokenes, T.P. and Robertsen, B., 2004, Inhibition of infectious pancreatic necrosis virus replication by atlantic salmon Mx1 protein, Journal of Virology, 78 (15) 79387944. Leong, J .C., Alonso, M., Leisy, D., Lewis, T., Robertsen, B., Simon, B., Song,C.B. and Thomann, E., 2001, Genetic Vaccines for Aquaculture, ARSOI BiotechnologyAquaculture Workshop.
78 Lidgerding, B.C., 1981, Cell lines used for the production of viral fish disease agents, international symposium on fish biologics serodiagnostics and vaccines, Leetown, W. Va., U.S.A., Develop.biol.standard, 49233241. Lorenzen, N. and LaPatra, S.E., 2005, DNA vaccines for aquacultured fish, Rev.Sci.tech.Off.İnt.Epiz., 24(1) 201213. LopezLastra, M., Gonzalez, M., J ashes, M. and Sandino, A.M., 1994, A detection method for infectious pancreatic necrosis virus (IPNV) based on reverse transcription (RT)polymerase chain reaction (PCR), Journal of Fish Diseases., 17, 269282. McAllister, P.E., 1979, Fish Viruses and Viral Infections, Plenum Press, New York, 401469 pp. Mc Allister, P.E., Newman, M.W., Sauber, J .H. and Owens, W.J ., 1984, İsolation of infectious pancreatic necrosis virus (serotype Ab) from diverse species of estuarine fish, Helgoländer Meeresunters, 37 317328. McAllister, P.E. and Bebak, J ., 1997, Infectious pancreatic necrosis virus in the environment relationship to effluent from aquaculture facilities, Journal of Fish Diseases, 20 201207. Medina, J .M., Chang, P.W., Bradley, T.M., Yeh, M.T. and Sadasiv, E.C., 1992, Diagnosis of infectious hematopoietic necrosis virus in Atlantic salmon ,Salmo salar by enzymelinked immunusorbent assay, Dis. of Aquat. Org., 13 147150. Nicholson, B. L and Caswell, P., 1982, Enzymelinked immunosorbent assay for identification of infectious pancreatic necrosis virus, J Clin Microbiol. ,16(3) 469–472. Nicholson, B.L., 1993, Use of monoclonal antibodies in identification and characterization of fish viruses,Annual Rev.of Fish Diseases, 241257pp. Nishizawa, T., Kinoshita, S. and Yoshimizu, M., 2005, An approach for genogrouping of Japanese isolates of aquabirnaviruses in anew genogroup, VII, based on the VP2/NS junction region, Journal of General Virology, 86 1973 1978. Noga, E. J ., 1996, Fish Disease Diagnosis and Treatment,. MosbyYear Book, Inc. 11830 Westline Industrial Drive St. Louis, Missouri, 208211pp.
79 Novoa, B., Toranzo, A.E., Dopazo, C.P., Barja, J.L. and Figueras, A., 1993, Isolation of IPN virus serotype VR299 from turbot in Europe, Diseases of Aquatic Organisms., 176165. Novoa, B., Blake, S., Nicholson, B.L., and Figueras, A., 1995, Comparison of different procedures for serotyping aquatic birnavirus, Applied and Environmental Microbiology, 61 29252929. Reno, P.W. 1999. İnfectious pancreatic necrosis virus and associated aquatic birnaviruses http//www.cabiPublishing.org/pdf/Books/0851991947/1947ch1.pdf Rimstad,E., 2003, IPN in salmonids a review, http//www.fiskerifond.no/files/projects/attach/ipnsalmonids.pdf Ross, K. and Munro A.L.S.,1995, Serological analysis of virulent infectious pancreatic necrosis virus strains, Journal of Fish Diseases, 18377380. Rodák, L., Pospíšıl, Z., Tománek, J ., Veselý, T., Obr, T. and Valíček. L., 1988, Enzymelinked immunosorbent assay (ELISA) detection of infectious pancreatic necrosis virus (IPNV) in culture fluids and tissue homogenates of the rainbow trout, Salmo gairdneri Richardson. Journal of Fish Diseases, 11 225235. Sano, T., Okamoto, N. and Nishımura, T., 1981, A new viral epizootic of Anguilla japonica Temminck &Schlegel, Journal of Fish Diseases., 4 127139 Sanz, F. and Coll, J .,1992, Techniques for diagnosing viral diseases of salmanid fish, Diseases of Aquatic Organisms, 13 211223 Sauer, M.J., Foulkes, J .A. and Morris, B.A.,1985, Principles of Enzyme Immunoassay, İmmunoassays in Food Analysis, 5372 pp. Savigny, D. and Voller, A., 1980, The communication of ELISA data from laboratory to clinician, Journal of Immunoassay,1 (1) 105128. Schlotfeldt, H.J .,1979, İnfectious pancreatic necrosis (IPN) salmonids part 1 Aetiology, epizootiology and control, Tierärztliche Umschau, 34 539546. Smail, D.M. and Munro, A.L.S., 1989, The Virology of Teleost in Fish Pathology. Edited by R.J Roberts. Bailliera Tindall, 2428 Oval Road, London NW1 7DX, England, 216226 pp. Suzuki, S. and Nojima, M., 1999, Detection of marine birnavirus in wild molluscan shellfish species from Japan, Fish Pathology, 34(3) 121125.
80 Taksdal, T. and Thorud, K., 1999, Evaluation of rapid coagglutination (COA) test for the detection of infectious pancreatic necrosis virus (IPNV) in tissue samples of Atlantic salmon, Salmo salar L Journal of Fish Diseases, 22 117 124. Tarım ve Köyişleri Bakanlığı (TKB), 1986, Hayvan Sağlığı ve Zabıtası Kanunu, Kanun Numarası 3285, Kabul Tarihi 08.05.1986, Yayımlandığı R.Gazete 16.05.198619109. Tarım ve Köyişleri Bakanlığı (TKB), 2004, İhbarı Mecburi Hastalıklar hakkında Tebliğ (tebliğ no: 2004/14), Yayınlandığı resmi gazete. 1 Nisan 2004, 25420. Tu, K.C., Spendlove, R.S. and Goede, R.W.,1974, Immunofluorescent cell assay of infectious pancreatic necrosis virus, Appl. Microbiol., 27 593599. Ustaçelebi, Ş., 1992, Genel Viroloji, HacettepeTaş Kitapçılık, Ankara, 139155ss. Vestergard J orgensen, P.E., and Kehlet, N.P.,1971, İnfectious pancreatic necrosis (IPN) viruses in Danish rainbow trout, their serological and pathogenic properties, Nord.Vet.Med., 23568575. Villegas, P. And Purchase H. G., 1989, Titration of biological suspensions, A laboratory Manual for the Isolation and Identification of Avian Pathogens, third edition. H. Graham Purchase, Chairman Lawrence H., Charles H. Domermuth, James E. Pearson (Eds), Kendall/Hunt Publishing Company Iowa. 186191 pp. Voller, A., Bidwell, D.E. and Bar lett, A., 1979, The Enzyme Linked Immunosorbent Assay (ELISA). A quide with abstracts of microplate applications. Dynatech Laboratories, Inc., Alexandria, Va. Way, K. and Dixon, P.F., 1988, Rapid detection of VHS and IHN viruses by the enzymelinked immunosorbent assay (ELISA), J. Appl. Ichthyol., 4 182189. Wechsler, S.J ., Woods, L.C., Kraeuter, J .N., Hetrick, F.M. and McAllister, P.E., 1987, Transmission of infectious pancreatic necrosis virus in striped bass, Morone saxatilis (Walbaum), Journal of Fish Diseases., 10 2934 Wolf, K., Dunbar, C.E., and Snieszko, S.F.,1960, .İnfectious Pancreatic Necrosis virus of Trout I. A Tissue Culture Study, The Progressive Fish Culturist,.6468 pp
81 Wolf, K., Quimby, M. C. and Carlson, C. P.,1969, İnfectious pancreatic necrosis virus lyophilization and subsequent stability in storage at 4˚C, Appl. Microbiol.,17623624 Wolf, K., 1970, Guidelines for Virological Examination of Fishes.In A symposium on diseases of Fishes and Shellfishes. 327350 pp. Wolf, K., and Qimby, M.C., 1970.Salmonid viruses İnfectious pancreatic necrosis virus morpholgy, pathology and serology of first European isolations, Archiv für die gesamte Virusforschung, 34 144156. Wolf, K., 1988, Fish Viruses and Fish Viral Diseases, Cornell University Press, Ithaca, N.Y., 115157 pp. Yamamoto, T., 1975, Infectious pancreatic necrosis (IPN) virus carriers and antibody production in apopulation of rainbow trout (Salmo gairdneri), Can. J. Microbiol., 21 13431347 Yasutake, W.T.,1975, Fish Viral Diseases Clinical, Histopathological, and Comparative Aspects, The Pathology of Fishes, Edit by William E Ribelin, George Migaki.The University of Visconsin Press,London,247269 pp. Yolken, R.H., 1982, Enzyme imunoassays for the detection of inectious antigens in body fluids current limitations and future prospects, Reviews of infectious diseases, 4(1) 3565.
82 8. EKLER EK.1. Çift Antikor Sandviç ELISA Yönteminin Basamaklarının Şematik Görünümü Primer antikor ile kaplama Antijen Sekonder antikor Enzim ile işaretli konjugat Substrat
83 EK 2. Çift Antikor Sandviç ELISA Yönteminin Genel Uygulama Basamakları Uygulama Diluent Konsantrasyon Miktar/göz Basamakları Primer antikor ile Karbonat buffer 10mg/ml 100ml kaplama (pH 9,6) İnkubasyon durumu 37°C’ ye ayarlandıktan sonra kapatılan su banyosunda bir gece  Hızlı ilk   yıkamadan sonra 2 kez 2 dakika % 1,5 BSA ile Karbonat buffer  kaplanmayan (pH 9,6) alanları bloklama  200ml 37°C’ ayarlı su banyosunda 1 saat Hızlı ilk  yıkamadan sonra 3 kez 2 dakika Virus içeren hücre PBST + % 1 kültürü BSA supernatantı    Değişken 100ml 24°C’ de 1 saat Hızlı ilk  yıkamadan sonra 3 kez 2 dakika Sekonder antikor PBST + % 1 BSA Hızlı ilk  yıkamadan sonra 3 kez 2 dakika HRP ile işaretli PBST + % 1 konjugat BSA    Değişken 100ml 24°C’ de 1 saat    Değişken 100ml 24°C’ de 1 saat Hızlı ilk  yıkamadan sonra 4 kez 2 dakika OPD Substrat Sitrat buffer     100ml Stop solüsyonu 1M H2SO4  100ml Oda sıcaklığı 20 dakika 
 84 Ek 3. IPNV Pürifikasyonu İçin Uygulanan %1545 Sukroz Gradient Sonucu Oluşan Bandlar
85 Ek 4. IPNV İle Yapılan Deneysel Enfeksiyon Sonucunda Yavru Alabalıklarda Oluşan Klinik Semptomlar
86 (a) (b) Ek 5. BF2 Hücre Hattında Virus İzolasyonu (a) Hücre Kontrol (b) CPE Pozitif
87 (a) (b) Ek 6. Saha Materyaline Uygulanmış IFAT Sonucu (a) Hücre Kontrol (BF2) (b) IPNV Pozitif
88 Ek 7. Geliştirilen ELISA Testi Sonucunda Oluşan Renklenmenin Göz İle Değerlendirilebilir Görünümü
89 9. ÖZGEÇMİŞ Buket ÖZKAN ÖZYER 28.04.1974 yılında Urfa’ da doğdu. İlk ve orta eğitimini Bergama’ da tamamladıktan sonra, 1991 yılında Ankara Üniversitesi Veteriner Fakültesi’ni kazandı. 1996 yılında yüksek lisans diploması ile mezun oldu. 2000 yılında Tarım ve Köyişleri Bakanlığı’nda Veteriner Hekim olarak göreve başladı. 2002 yılında Ege Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Su Ürünleri Fakültesi, Su Ürünleri Yetiştiriciliği Anabilim Dalı, Balık Hastalıkları Bilim Dalında doktora eğitimine başladı. Halen Tarım ve Köyişleri Bakanlığı, Bornova Veteriner Kontrol ve Araştırma Enstitü Viroloji Bölümünde Veteriner Hekim olarak çalışan Buket ÖZKAN ÖZYER evli ve bir çocuk annesidir.

Su Ürünleri Yetiştiricilik Ana Bilim Dalı Hastalıklar Bilim Dalı Bilim

Related documents

Products

Support

Su Ürünleri Yetiştiricilik Ana Bilim Dalı Hastalıklar Bilim Dalı Bilim

Related documents

Add this document to collection(s)

Add this document to saved

Suggest us how to improve StudyLib