KimyaKongreleri.org

VIII. Ulusal Kimya Kongresi, Marmara Üniversitesi, 7-11 Eylül 1992, Istanbul
ONOPORDUM TURCÎCUM' DAN P R O T E A Z İZOLASYO N U V E
K İN E TİK M ODELLEM EDE Y E N Î B ÎR YA K L A ŞIM
1.Melih TAM ER ve Mehmet M U T L U
Hacettepe Üniversitesi, Mühendislik Fakültesi,Gıda Mühendisliği Bölümü
Beytepe - Ankara - Türkiye
ISOLATION OF PROTEASE FROM ONOPORDUM TURCÎCUM AND A NEW
APPROACH IN KINETIC MODELLING
SUMMARY
The kinetics o f enzyme catalyzed reaction by the enzyme extract isolated from
Onopordum tarcicum in media containing variable proportions o f powder milk was
studied. The results indicated that rate of enzyme catalyzed reaction underwent both
activation and inhibition phases by changing amount of substrate concentration. Substrate
depletion rate was proportional to substrate concentration in the activation phase with a
saturation term. The effect of inhibition accelerated at higher substrate concentrations.
A mathematical model was proposed to enhance the phenomenon of rate activation and
inhibition by substrate concentration. The variation of rate with temperature was found
to obey Arrhenius law and the energy of activation of enzyme catalyzed reaction was
calculated to be 18.12 kcal/mol.
ÖZET
Değişen oranlarda süt tozu içeren ortamlarda, Onopordum
turcicum ' dan
izole edilen
enzim ekstresi ile
katalizlenen enzimatik reaksiyonun k in etiği
incelenmiştir. Sonuçlar, enzimatik reaksiyon hızının, değişen substrat konsantrasyonu
ile hem aktivasyon hemde inhibisyon fazlarını geçirdiğini göstermiştir. Substrat
tüketim hızı, aktivasyon fazında substrat konsantrasyonuna bir saturasyon sabiti ile
orantılıdır. İnhibisyon etkisi, yüksek substrat konsantrasyonlarında ivmelenmiştir.
Substrat konsantrasyonu tarafından hızın aktive ve inhibe edilmesi, önerilen matematik
model ile açıklanmaya çalışılmıştır.
H ızın
sıcaklık ile değişiminin, Arrhenius
kanuna uygun olarak
meydana geldiği
bulunmuştur. Enzimatik
katalizlem e
reaksiyonunun aktivasyon enerjisi değeri 18.12 kcal/mol olarak hesap edilmiştir.
G İRÎŞ
Buzağı kökenli rennet peynir üretimine en uygun ve ideal koagülant olarak
kabul edilmektedir ( 1). Her ne kadar sütü koagüîe edebilen bitki orijinli proteaz
ekstreleri bulunmakta isede, sadece mikrobial kaynaklı Mucor miehei ve Mucor
301
KimyaKongreleri.org
VIII. Ulusal Kimya Kongresi, Marmara Üniversitesi, 7-11 Eylül 1992, Istanbul
puaillusy ticari peynir yapımında kullanılmaktadır ( 2 ). içerdikleri gereğinden fazla
proteolitik aktivite sebebiyle, bitki kökenli proteazlar ticari peynir üretimi için uygun
bulunmamaktadır (3). Ancak bazı ülkelerde organlarında proteolitik enzim içeren
bitkilerden elde edilen proteaz ekstrelerinin süt koagülanı olarak geleneksel
yumuşak peynir yapımında kullanıldığı bilinmektedir(4). Compositae familyasının
bir türü olan Onopordum turcicumâan izole edilen koagülan yeni keşfedilmiş
olup ticari peynir üretiminde bir önem taşımamaktadır. Bu çalışmada enzim
aktı vitesine substrat konsantrasyonunun etkisi, 33°C-48°C sıcaklık değerleri
arasında kinetik modellemede yeni bir yaklaşım kullanılarak araştırılmıştır.
Biyolojik ve biyokimyasal sistemlerin benzer kinetik modeller ile ifade edilmesi
daha önceki çalışmalarda mevcuttur (5-7,9). Bu makale içinde yer alan "enzimatik
hız" terimi gözle görünebılen kazein protein agregatlarmm ilk belirlendiği am
temel almaktadır. İlk agregatlann görüldüğü zaman itiban ile total kazeinin %
10.1 'ini içeren ( 10) K-kazeinin yaklaşık %95-100 civarında ürüne dönüştüğü
varsayılmaktadır (10,11). Enzimatik hızın hesaplanmasında pıhtılaşmanın ilk
görüldüğü pıhtılaşma zamanı, K-kazeinin tamamının agregat halinde, kararsız
toplam kazein içinde yer aldığı an olarak değerlendirilmiştir.
D E N E L BÖ LÜ M
Enzim kompleksi, Onopordum turcicum bitkisinin tohum ve çiçeklerinden,
ortamda sırasıyla 1/7 (w/v) oranında katı ve sıvı olmak kaydıyla 0.08M fosfat
tamponu (pH;7.0) kullanılarak ekstrakte edilmiştir. Söz konusu tampon aynca
litrede 6.0 g CaCl2H 20 , 1.3 g EDTA, 2.0 g polyvinyl polypyrolidone ve 0.Ö5 mİ
fl-mercaptoetanol içermektedir. Blending ve homojeni zasy on, sırasıyla
commercial Waring Blendor ve Virtis 23 ile 2 dakika süre iîe yapılmıştır.
Ekstrenin kaba filtrasyou yapılmış ve vakum fırında (Cole Parmer) 25 in Hg ve
35-40 °C ’de konsantre edilmiştir. Yağsız süttozu %3.67 nem ve %3.4 protein
içermektedir. Deneyler sabit sıcaklıktaki su banyosunda (Haake,SW B 20)
yapılmıştır. Reaksiyon ortamında % 0.5-20 oranlarında değişen miktarlarda
yağsız süt tozu, 0.005g/mî CaCl^H^O, ve 0.05 mî /mî enzim ekstraktesi kullanılmıştır.
Süt pıhtılaşma aktivitesi, süt tozunun içerdiği K-kazein(molekÜÎ ağırlığı :19000)
(12) dikkate alınarak hesaplanmıştır. Süt pıhtılaşma zamanı Berridge metodunun
modifikasyonu ile saptanmıştır( 8). Sütte toplam protein, ve kazein tayini Rowland
metodu ile yapılmıştır (13). Ticari toz rennet Christian Hansen laboratuvarmdan
sağlanmıştır.
SO N U Ç LA R V E TA R TIŞM A
Sonuçlar, yağsız süt tozu içeren oltamda enzim aktivitesinin, düşük substrat
konsantrasyonlarında arttığını, Öte yandan yüksek substrat konsantrasyonlarında
düştüğünü göstermektedir. Enzimatik hız agregasyonun ilk görüldüğü anda ürüne
dönüşen toplam K-kazein miktarı ile ifade edilmiştir. Şekil 1 ‘de düşük K-kazein
k onsan trasyon1an n da enzimatik hızdaki artışm K-kazein miktarındaki artış sonucu
oluştuğu gözlenmektedir. Yüksek K-kazein konsantrasyonlarında, enzimatik
reaksiyon hızı, ortamda bulunan fazlalık K-kazein tarafından düşürülmektedir.
Böylece enzimatik hız aşağıdaki şekilde ifade edilebilir :
302
KimyaKongreleri.org
VIII. Ulusal Kimya Kongresi, Marmara Üniversitesi, 7-11 Eylül 1992, Istanbul
(1)
V * V 1[ l - e ' KlS]- V2[ l - e ^ ]
Burada .V dakikada katalizlenen {imol K-kazein, V j , V g, K * , Kg parametreler, S ;
K-kazein konsantrasyonudur. Parametrelerin sayısal değerleri aşağıdaki sınırlama
göz önüne alınarak bulunabilir:
EK13 > [K 31
(2 )
Bu kısıtlama , başlangıçta enzimatik katalizleme reaksiyonunun , artan S
konsantrasyonu eşliğinde inhibisyona baskın çıktığını ima etmektedir. Böylece
düşük ve yüksek S konsantrasyonları söz konusu olduğunda ( 1 ) numaralı denklem
aşağıdaki terimlere indirgenebilir:
V== Vt [ 1 - e ^ |S]
eğer
(dV/dS) > 0
(3 )
V = V x - V2[ l - e ' ^ j
eğer
(dV/dS) < 0
(4 )
Maksimum aktivasyon hız sabiti; V j, aktivasyon sabiti; Kb minimum inhibisyon
hız sabiti; V 2) inhibisyon sabiti; K 2‘ nin sayısal değerleri İn (dV/dS)' e karşılık
S
grafiklerinin eğim ve interseptlerinden bulunmaktadır. Benzer fiziksel
durumlarda; substrat aktivasyon ve inhibisyonu olduğunda Michaelis Menten
modifikasyonu aşağıdaki gibidir (9):
V=
k x
--------------------------------------------1 + ( K , / S ) + ( S / K ü)
(5 )
burada V, x, ve S sırasıyla hız, ilk enzim konsantrasyonu, ve substrat
konsantrasyonudur. Parametreler; k, K t ve Kg, iki değişik deney seti tasarlanarak
bulunabilmektedir. (5) Numaralı denklemin fiziksel kısıtlaması, hıza karşılık substrat
konsantrasyonu değişiminde (dv/dS)=0 ifadesine karşılık gelen tek platonun
varlığıdır. Öte yandan modelin moâiüye Michaelis Menten modeli ile olan
303
KimyaKongreleri.org
VIII. Ulusal Kimya Kongresi, Marmara Üniversitesi, 7-11 Eylül 1992, Istanbul
benzerliği hem aktivasyon hemde
in h ib is y o n
fa z la r ın ın
gerekliliğinin
dikte edildiği
f iz ik s e l
fe n o m e n a n m
t a n ın m a s ıd ır .
Onopordum
t u r c i c u m â an ekstrakte edilmiş
olan enzimin k atalizlediği
enzimatik hızın substrat ile
değiştiği reaksiyon trendleri,
33°C, 38°C, 43°C, 48°C, sıcaklık
derecelerinde yapılan deney,
lerde birbirleri ile uyum içinde
olan sonuçlar vermişlerdir. Salt
bir
deney
setinin (T=33°C)
6
simulasyonu Şekil 1 'de grafik
K-kazein derişimi, P 4 & 0
olarak verilmiştir. Model, ticari
Şekil 1. K<kazarkirtyagtfj* aUt toiu «'tatrunda 33*Cda 0,05 rol «n ü m
rennet
ile yapılan benzer
ektreyi cyh^nâe dönüşümü f { * ) hız, ( —) aimülaayon}, V l*£ ,9 fi ıımol/âu
K1*SS472M, V2=a4 5 (iajol/d *k,K 2 ȣ 5 S0 9 M .4
denemelerde de
fiziksel
durumu ifade edebilmiştir (
Şekil 2 ). Simulasyonlann deneysel verilerle olan uyumu, korelasyon katsayıları
ile test edilmiş ve 33, 38, 43, 48 °C, sıcaklıklarda yapılan denemelerde sırasıyla
0.948, 0.944, 0.935, 0.978 olarak bulunmuştur. Ticari rennet ile aynı koşullarda
yapılan denemelerde bulu-nan korelasyon katsayıları sırasıyla 0.903, 0.903, 0.903,
0.900 'dür. Tüm sıcaklık değerlerinde, ve her iki en2İm ile ayrı ayn yapılan
denemelerde
artan S
konsantrasyonu, inhibisyonun etkisi avantajına hızı
etkilemektedir. Bu fiziksel
durum, (1) ve (5) numaralı
denklem ler tarafındanda
onaylanmaktadır, Enzimatik
hızın sıcaklık ile değişimi
Arrhenius tipi bir ilişki
sergilemiştir ( Şekil 3 ). Bu 0)
numaralı denklemin evrensel
Arrhenius kanunu ile uyum
h a lin d e
o ld u ğ u n u
göstermektedir. Aktivas-yon
enerji değerleri Onopordum
turcicum ve buzağı renneti ile
yapılan deneyler için sırasıyla
18.12 kcal/mol ve
15.40
KimyaKongreleri.org
VIII. Ulusal Kimya Kongresi, Marmara Üniversitesi, 7-11 Eylül 1992, Istanbul
kcal/mol
olarak hesap
edilmiştir. Bu değerler
diğer benzer çalışmalarda
bulunmuş olan değerler
ile kıyaslanabiîmektedir
(9).
Bu çalışmanın ama­
cı enzimatik reaksiyon hızı
ile şubstrat konsantras­
yonu arasındaki ilişkiyi
Onopordum turcicum' dan
izole edilen ektsreyi
biyolojik katalizör ve
süttozundaki toplam Kkazeinı substrat olarak
kullanarak belirlemektir.
Kazein agregatlann oluşma hızım birçok faktör etkilemesine rağmen, agregat
oluşma hızı, esas olarak K-kazeinin parçalanmasından etkilenmektedir ( 10). Kkazein, diğer kazein moleküllerini normal süt ortamında çökelmekten koruyan bir
kolloid işlevi görmektedir (14), Daha Önce yapılmış olan çalışmalarda sütü
rennetleme (mayalama) işlemi, K-kazeinin spesifik proteolizi, ve devamla, kararsız
kazein misellerinin çökmesi ile tarif edilerek bu iki ardışık reaksiyonun sıcaklık,
pH, ve kalsiyum iyonu aktivitesinden farklı eğilimlerle etkilendiği ve sütün
pıhtılaşma zamanının bu iki reaksiyondan ayrı ayn etkilendiği belirtilmektedir
(15). Bu araştırmada her deney tasarımında, toplam K-kazein konsantrasyonu
dışında tüm etkiyen faktörler ( sıcaklık, pH, [Ca2+] ) sabit tutulmuştur. Ancak
toplam kazein miktarının K-kazein hidrolizine olası etkisinin K-kazein proteolizi
ile meydana getirilen koagüîasyon prosesinin dinamiğinde asimile olacağı
varsayılmaktadır. Toplam kazeinin bir parçası olan K-kazein olmadan herhangi
enzimatik pıhtılaşma eldesinın, yani agregat oluşumunun imkansızlığı diğer
çalışmalar tarafından da kabul edilmektedir (16).
K AYN AK LAR
1 . Fox, F. F. "Developm ents in D a iry Chemistry-4", Elsevier Applied Science,
London (1989) 27,
2. Aworh, O, C., ve Müller H. G. "Cheese making Properties of Vegetable Rennet
from Sodom Apple ( Calotropis procera)". Food Chem istry, 26 (1987) 71-79.
3.Barbosa, M., Corradini, C., Battistotti, B., "Cheese making experiments carried
out on some Italian cheeses with vegetable rennet from Cardo ( Cyanara
Cardunculus L . ) Scienza E Tecnica Lattiero-C asearia, 32,4 (1981) 203-221.
4.Fevereiro, P., Cabral, J. M. S., Fonseca, M. M. R., Novaus, J. M., Pais. M. S.,
"Callus and Suspension Culture of Silybum m arianum . Biosyhthesis of Proteins
with clotting Activity", Biotechnology Letters , 1, (1986) 19-24.
5.Tamer, I . M., Özilgen, M., Ungan, S .," Kinetics of riboflavin production by brewers
yeasts", Enzym e an d M ic ro b ia l Technology, 10, (1988) 754-757.
6.Özilgen, M., "Kinetics o f B atch Ferm entations w ith K. F r a g ilis ", (Ph. D.
305
KimyaKongreleri.org
VIII. Ulusal Kimya Kongresi, Marmara Üniversitesi, 7-11 Eylül 1992, Istanbul
Thesis), University of California Davis, USA, (1985).
7. Mutlu, M., Pişkin, E., '’Surface Modification of Polyurethane Biomaterials by
Plasma Glow Discharge and Investigation of Their Blood*Compatibilities by
Stimulus-Response Technique and Moment Analysis", M e d ic a l an d B io lo gic a l
E n gin eerin g an d Com puting 28, (1990) 232-236.
8. Chen, H. C. , Zail, R.R., "Evaluation of Thiol Activated Proteases from Clam
Viscera as a Rennet Substitute for Cheese - Making", J o u rn a l o f F ood Science,
51.3,0986), 815-820.
9. Bailey, J.E., Oîlis, D .F .," Biochem ical E n g in e e rin g F u n d am en tals ", Me.
Graw Hill, New York, (1987), 371-400.
10. Walstra, P., Jenness R .," D airy Chem istry an d P h y s ic s ", John Wiley and
Sons, New York, (1984), 107.
11. Carlson, A., Hill, C. G.,Jr., Olson. N. F., "Kinetics of milk Coagulation: "Kinetics
of Milk Coagulation III: Mathematical Modelling of the Kinetics of Curd Formation
Following Enzymatic Hydrolysis of K-Casein «Param eter Estimation",
Biotechnology an d Bioengineering , 29,0987) 601-611.
12. Schmidt, D. G.,"Colloidal aspects of casein", N eth .M ilk D a iry J . 34, (1980)
42-64.
13. Rowland, S.J., ” The Determination of the Nitrogen Distribution in Milk" Journal
of Dairy Research, 9, (1938) 42*46.
14. Carlson, A , Hill, C. G. Jr., Olson, N. F., "Kinetics of Milk Coagulation: I. The
Kinetics of Kappa Casein Hydrolysis in the Presence of Enzyme Deactivation",
Biotechnology an d Bioengineering , 29,0987) 582-589.
15. Hooydonk, van, A, C. M., Walstra, P., "Interpretation of the kinetics of the
renneting reaction in milk", Neth.Milk Dairy J. 41, (1987) 19-47.
16. Carlson, A., Hill, C. G. Jr.. Olson,N. F., "Kinetics of Milk Coagulation: II.Kinetics
of the Secondary Phase : Micelle Flocculation" , B io te c h n o lo g y a n d
B io e n g in e e rin g , 29, (1987) 590-600.
KimyaKongreleri.org