izole perfüze sıçan kalbinde iskemi/iskemik önkoşullama üzerinde
advertisement
T.C. EGE ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ İZOLE PERFÜZE SIÇAN KALBİNDE İSKEMİ/İSKEMİK ÖNKOŞULLAMA ÜZERİNDE LEVOSİMENDANIN AKUT VE KRONİK ETKİLERİ Farmakoloji Programı DOKTORA TEZİ Uzm. Ecz. Elif ERTUNA İZMİR-2007 T.C. EGE ÜNİVERSİTESİ SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ İZOLE PERFÜZE SIÇAN KALBİNDE İSKEMİ/İSKEMİK ÖNKOŞULLAMA ÜZERİNDE LEVOSİMENDANIN AKUT VE KRONİK ETKİLERİ Farmakoloji Programı DOKTORA TEZİ Uzm. Ecz. Elif ERTUNA Danışman Öğretim Üyesi Prof. Dr. Mukadder Yasa İZMİR-2007 i ii DEĞERLENDİRME KURULU ÜYELERİ (Adı Soyadı) Başkan (İmza) : Prof.Dr. Mukadder YASA (Danışman) ..................... Üye : Prof.Dr. Sibel GÖKSEL ........................ Üye : Doç.Dr. Metiner TOSUN ...................... Üye : Prof.Dr. Aslı ÖZER ……………………... Üye : Prof.Dr. Hüray İŞLEKEL ………………… Doktora Tezinin kabul edildiği tarih: ............................................. ÖNSÖZ Değerli bilgi ve deneyimleri ile çalışmama yön veren, bir bilimsel araştırmanın nasıl planlanması ve yürütülmesi gerektiğini bana öğreten, çalışmamın her aşamasında bana yardım eden ve aynı zamanda manevi destek veren tez danışmanım sayın hocam Prof.Dr. Mukadder YASA’ya, Araştırmamın gerçekleşmesi için gerekli altyapı olanaklarının sağlanmasına yardım eden ve istediğim araştırma alanında çalışma yapmam için beni teşvik eden değerli hocam Prof.Dr. Aslı ÖZER’e, Tez çalışmam süresince bana yardım eden Dr.Ecz. Saadet TÜRKSEVEN başta olmak üzere gerektiğinde yardımıma koşan bütün arkadaşlarıma, Tez çalışmamın elektron mikroskobik incelemelerini yürüten Hacettepe Üniversitesi Tıp Fakültesi Anatomi Anabilim Dalı Öğretim Üyelerinden sayın Prof.Dr. Mürvet TUNCEL ve sayın Prof.Dr. Mustafa SARGON’a, Tez çalışmam kapsamındaki biyokimyasal incelemelerde bana yol gösteren ve yardımcı olan Dokuz Eylül Üniversitesi Tıp Fakültesi Biyokimya Anabilim Dalı Öğretim Üyelerinden sayın Prof.Dr. Hüray İŞLEKEL ve Dr. Zahide ÇAVDAR’a, Deney düzeneğinin kurulması aşamasında yardımlarını esirgemeyen İ.Ü. Cerrahpaşa Tıp Fakültesi Öğretim Üyelerinden sayın Prof.Dr. Öner SÜZER’e, Manevi destekleri ile her zaman yanımda olan aileme teşekkürlerimi sunarım. Bu çalışma E.Ü. Bilimsel Araştırma Projeleri (BAP-04ECZ015 ve BAP04ECZ026) ve Novartis Farmakoloji Dalı, 2005 Yılı Araştırma Desteği kapsamında desteklenmiştir. İzmir, 2007 Elif Ertuna iii İÇİNDEKİLER 1 GİRİŞ VE GENEL BİLGİLER................................................................1 1.1 GİRİŞ .....................................................................................................1 1.2 GENEL BİLGİLER .....................................................................................2 1.2.1 İ/R hasarı ve postiskemik miyokardiyal disfonksiyon....................4 1.2.1.1 ... Hasarlı miyokardda oluşan fizyolojik, biyokimyasal ve hücresel değişiklikler.... ................................................................................................. 4 1.2.1.1.1 İskeminin etkileri ...................................................................4 1.2.1.1.2 Reperfüzyonun etkileri ..........................................................7 1.2.1.2 İ/R hasarının sonuçları ............................................................... 8 1.2.1.3 Deneysel ve klinik açıdan miyokardiyal sersemleme ............... 12 1.2.1.4 Miyokardiyal sersemlemenin mekanizması .............................. 14 1.2.1.4.1 Oksiradikal hipotezi.............................................................15 1.2.1.4.2 Kalsiyum hipotezi................................................................17 1.2.1.4.2.1 Miyokardiyal sersemleme patofizyolojisinde kalsiyumun rolü ................................................................................. 17 1.2.1.4.2.2 Miyokardiyal sersemleme patojenezinde kalsiyumun rolü .... ................................................................................. 19 1.2.1.4.3 Oksiradikal ve kalsiyum hipotezi dışındaki mekanizmalar ..22 1.2.1.5 İskemi sonrası moleküler adaptasyon ...................................... 23 1.2.1.6 Miyokariyal sersemlemede tedavi yaklaşımları ........................ 23 1.2.2 İskemik ve farmakolojik önkoşullama .........................................26 1.2.2.1 Klasik önkoşullama................................................................... 28 1.2.2.1.1 Klasik önkoşullamanın tetikleyicileri....................................30 1.2.2.1.2 Klasik önkoşullamanın mediyatörleri ..................................31 1.2.2.1.3 KATP kanalları ......................................................................33 1.2.2.1.4 Klasik önkoşullamanın olası son-efektörleri........................35 1.2.2.2 İnsan miyokardında önkoşullama ............................................. 38 iv 1.2.2.3 Önkoşullamanın terapötik önemi .............................................. 42 1.2.3 Levosimendan ............................................................................45 1.2.3.1 Kalp kasının kasılma mekanizması ve levosimendanın inotrop etki mekanizması........................................................................................... 46 1.2.3.2 Levosimendanın fosfodiesteraz enzimi üzerine etkileri ............ 50 1.2.3.3 KATP kanal açıcı olarak levosimendan....................................... 52 1.2.3.4 Levosimendanın miyokardiyal yeniden modellenme üzerine etkileri ............ ............................................................................................... 54 1.2.3.5 Levosimendanın farmakokinetiği .............................................. 56 1.2.3.6 Levosimendanın klinik kullanımı ve yapılan araştırmalar ......... 58 1.2.3.6.1 Kalp yetmezliği ve levosimendan tedavisi ..........................58 1.2.3.6.2 Levosimendanın kalp yetmezliğindeki kullanımı ile ilgili klinik araştırmalar ...... .........................................................................................62 1.2.3.6.3 Kalp cerrahisinde levosimendan kullanımı .........................65 1.2.3.7 Oral yoldan ve uzun süreli levosimendan uygulaması ile ilgili çalışmalar ...... ............................................................................................... 67 1.2.3.8 Levosimendanın damarlar üzerindeki etkileri ........................... 67 2 GEREÇ VE YÖNTEM.........................................................................76 2.1 DENEYLERDE KULLANILAN HAYVANLAR ..................................................76 2.2 DENEY GRUPLARI VE ÇALIŞMA PROTOKOLLERİ .......................................76 2.2.1 İzole perfüze kalp çalışmaları .....................................................78 2.2.1.1 Kalplerin izolasyon ve perfüzyonu ............................................ 78 2.2.1.2 İzole perfüze kalp çalışmalarında deney grupları ..................... 78 2.2.1.2.1 Sıçan kalbinde global iskeminin etkilerinin incelendiği deney grupları ............. .........................................................................................78 2.2.1.2.1.1 Sıçan kalbinde global iskeminin etkilerinin incelendiği deney gruplarında perfüzyon protokolleri .............................................. 79 2.2.1.2.2 Levosimendanın etkilerinin incelendiği deney grupları .......79 2.2.1.2.2.1 Levosimendanın etkilerinin incelendiği deney gruplarında perfüzyon protokolleri ......................................................... 81 v 2.2.1.3 İzole kalplerde ölçülen fonksiyonel parametreler...................... 82 2.2.1.4 İzole kalplerde ölçülen biyokimyasal parametreler ................... 84 2.2.1.4.1 Koroner akımdan CK-MB ölçümü .......................................84 2.2.1.4.2 İzole kalp dokusunda cAMP ölçümü...................................84 2.2.1.4.2.1 İzole kalp dokusunda protein miktarı ölçümü ........... 86 2.2.1.5 İzole kalplerde yapılan morfolojik çalışmalar ............................ 86 2.2.1.5.1 İzole kalp dokusunda hücresel yapıların değerlendirmesi ..86 2.2.1.5.2 İzole kalp dokusunda infarkt alanı değerlendirmesi............87 2.2.2 İzole damar çalışmaları...............................................................88 2.2.2.1 İzole damar çalışmalarında sıçanların hazırlanması ................ 89 2.2.2.2 İzole organ banyosu deney protokolü....................................... 90 2.3 DENEYLERDE KULLANILAN CİHAZLAR VE YAZILIMLAR ..............................90 2.4 ARAŞTIRMADA KULLANILAN ÇÖZELTİLER VE İLAÇLAR ..............................91 2.4.1 Fizyolojik tuz çözeltileri ...............................................................91 2.4.2 Fosfat tamponları........................................................................92 2.4.2.1 Sorenson Fosfat tamponu ........................................................ 92 2.4.2.2 Trifeniltetrazolyum boyamada kullanılan tampon çözelti .......... 92 2.4.3 Araştırmada kullanılan ilaçlar......................................................93 2.4.3.1 İlaç çözeltilerinin hazırlanması.................................................. 93 2.5 3 VERİLERİN ANALİZİ ................................................................................94 BULGULAR ........................................................................................96 3.1 İZOLE KALPLERDE ÖLÇÜLEN FONKSİYONEL PARAMETRELER ...................96 3.1.1 İskemi süresinin etkilerinin incelendiği deney grupları................96 3.1.1.1 Diyastol sonu basınç (LVDP).................................................... 96 3.1.1.2 Kasılmanın maksimum hızı (+dP/dtmaks) ................................... 96 3.1.1.3 Gevşemenin maksimum hızı (-dP/dtmaks).................................. 98 3.1.1.4 Kalbin dakikadaki atım hızı....................................................... 99 3.1.1.5 Perfüzyon basıncı................................................................... 100 vi 3.1.1.6 Aritmi insidansı ve süresi........................................................ 101 3.1.2 Levosimendanın etkilerinin incelendiği deney grupları .............102 3.1.2.1 Diyastol sonu basınç (LVDP).................................................. 102 3.1.2.2 Kasılmanın maksimum hızı (+dP/dtmaks) ................................. 104 3.1.2.3 Gevşemenin maksimum hızı (-dP/dtmaks)................................ 105 3.1.2.4 Kalbin dakikadaki atım hızı..................................................... 107 3.1.2.5 Perfüzyon basıncı................................................................... 108 3.1.2.6 Aritmi insidansı ve süresi........................................................ 110 3.2 İZOLE KALPLERDE ÖLÇÜLEN BİYOKİMYASAL PARAMETRELER .................110 3.2.1 İskemi süresinin etkilerinin incelendiği deney gruplarında koroner akımda CK-MB değerleri ..................................................................................110 3.2.2 Levosimendanın etkilerinin incelendiği deney gruplarında koroner akımda CK-MB değerleri ..................................................................................111 3.2.3 Levosimendanın etkilerinin incelendiği deney gruplarında kalp dokularında ölçülen cAMP değerleri ................................................................113 3.3 İZOLE KALPLERDE YAPILAN MORFOLOJİK ÇALIŞMALAR ..........................113 3.3.1 İzole kalplerde iskemi süresine bağlı olarak hücrelerde meydana gelen yapısal değişiklikler ................................................................................113 3.3.2 3.4 İzole kalplerde infarkt alanı .......................................................119 VASKÜLER REAKTİVİTE ÇALIŞMALARI ...................................................121 3.4.1 Kastırıcı ajanlara karşı yanıtlar .................................................121 3.4.1.1 KCl (120 mM) yanıtları............................................................ 121 3.4.1.2 Kümülatif fenilefrin (10-9-10-4M) yanıtları................................. 121 3.4.1.3 Kümülatif 5-HT (10-9-3x10-5M) yanıtları .................................. 123 3.4.2 Gevşetici ajanlara karşı yanıtlar................................................124 3.4.2.1 Fenilefrin (10-6 M) önkastırması sonrasında kümülatif asetilkolin (10-9-10-4 M) gevşeme yanıtları ................................................................... 124 3.4.2.2 Fenilefrin (10-6 M) önkastırması sonrasında kümülatif nitrogliserin (10-9-3x10-5 M) gevşeme yanıtları ............................................ 126 vii 4 TARTIŞMA .......................................................................................128 5 SONUÇ VE ÖNERİLER ...................................................................148 6 ÖZET ................................................................................................150 ABSTRACT ......................................................................................152 7 YARARLANILAN KAYNAKLAR........................................................154 viii TABLO VE ŞEKİL LİSTESİ Şekil 1: Klasik önkoşullamanın tetikleyicileri ve mediyatörleri ................................................. 35 Şekil 2: Levosimendanın kimyasal yapısı................................................................................ 46 Şekil 3: Pozitif inotrop ilaçların etki mekanizması.................................................................... 60 Şekil 4: Damar düz kasında levosimendanın vazodilatör mekanizması ................................. 69 Şekil 5: Araştırma planı ve incelenen parametreler................................................................. 77 Şekil 6: İskemi süresinin sıçan kalbi üzerindeki etkilerinin incelendiği gruplarda perfüzyon protokolleri. .............................................................................................................................. 79 Şekil 7: Kontrol, levosimendan akut etki ve levosimendan kronik etki gruplarında perfüzyon protokolleri. .............................................................................................................................. 81 Şekil 8: cAMP standart eğrisi ve cAMP standartlarına karşı okunan absorbans değerlerinden hesaplanan % bağlanma değerleri .......................................................................................... 85 Şekil 9: İskemi süresinin etkilerinin incelendiği deney gruplarında diyastol sonu basıncı....... 97 Şekil 10: İskemi süresinin etkilerinin incelendiği deney gruplarında kasılmanın maksimum hızı ................................................................................................................................................. 97 Şekil 11: İskemi süresinin etkilerinin incelendiği deney gruplarında gevşemenin maksimum hızı ........................................................................................................................................... 98 Şekil 12: İskemi süresinin etkilerinin incelendiği deney gruplarında kalbin dakikadaki atım hızı ................................................................................................................................................. 99 Şekil 13: İskemi süresinin etkilerinin incelendiği deney gruplarında perfüzyon basıncı........ 100 Şekil 14: Levosimendanın etkilerinin incelendiği iskemi hasarı protokolü uygulanan sıçan kalplerinde diyastol sonu basıncı........................................................................................... 103 Şekil 15: Levosimendanın etkilerinin incelendiği iskemi hasarı protokolü uygulanan sıçan kalplerinde kasılmanın maksimum hızı.................................................................................. 104 Şekil 16: Levosimendanın etkilerinin incelendiği iskemi hasarı protokolü uygulanan sıçan kalplerinde gevşemenin maksimum hızı................................................................................ 106 Şekil 17: Levosimendanın etkilerinin incelendiği iskemi hasarı protokolü uygulanan sıçan kalplerinde kalbin dakikadaki atım hızı .................................................................................. 107 Şekil 18: Levosimendanın etkilerinin incelendiği iskemi hasarı protokolü uygulanan sıçan kalplerinde perfüzyon basıncı................................................................................................ 109 ix Şekil 19: İskemi süresinin etkilerinin incelendiği deney gruplarında kontrol kalplerinde ultrastrüktürel görünüm.......................................................................................................... 114 Şekil 20: İskemi süresinin etkilerinin incelendiği deney gruplarında 15dk iskemi uygulanan kalplerde ultrastrüktürel görünüm .......................................................................................... 115 Şekil 21: İskemi süresinin etkilerinin incelendiği deney gruplarında 30dk iskemi uygulanan kalplerde ultrastrüktürel görünüm. ......................................................................................... 116 Şekil 22: İskemi süresinin etkilerinin incelendiği deney gruplarında 45dk iskemi uygulanan kalplerde ultrastrüktürel görünüm. ......................................................................................... 117 Şekil 23: İskemi süresinin etkilerinin incelendiği deney gruplarında 60dk iskemi uygulanan kalplerde ultrastrüktürel görünüm. ......................................................................................... 118 Şekil 24: İskemi süresinin etkilerinin incelendiği deney gruplarında trifeniltetrazolyum ile boyanmış kalp kesiti örnekleri ............................................................................................... 120 Şekil 25: Levosimendan kontrol grubunda trifeniltetrazolyum ile boyanmış kalp kesiti örnekleri ............................................................................................................................................... 120 Şekil 26: Levosimendan akut etki grubunda trifeniltetrazolyum ile boyanmış kalp kesiti örnekleri ................................................................................................................................. 120 Şekil 27: Levosimendan kronik etki grubunda trifeniltetrazolyum ile boyanmış kalp kesiti örnekleri ................................................................................................................................. 120 Şekil 28: Sıçan torasik aortasında 21 gün süre ile oral levosimendan tedavisinin (0.2 mg/kg/gün) ve mekanik endotelsizleştirmenin kümülatif fenilefrin (10-9-10-4 M) yanıtları üzerindeki etkileri. .................................................................................................................. 122 Şekil 29: Sıçan torasik aortasında 21 gün süre ile oral levosimendan tedavisinin (0.2 mg/kg/gün) ve mekanik endotelsizleştirmenin kümülatif 5-HT (10-9-3x10-5 M) yanıtları üzerindeki etkileri. .................................................................................................................. 123 Şekil 30: 21 gün süre ile oral levosimendan tedavisinin (0.2 mg/kg/gün) 10-6 M fenilefrinle önkastırmaya tabi tutulmuş sıçan torasik aortasında kümülatif asetilkolin (10-9-10-4 M) gevşeme yanıtları üzerindeki etkileri. .................................................................................... 125 Şekil 31: 21 gün süre ile oral levosimendan tedavisinin (0.2 mg/kg/gün) ve mekanik endotelsizleştirmenin 10-6 M fenilefrinle önkastırmaya tabi tutulmuş sıçan torasik aortasında kümülatif NG (10-9-3x10-5 M) gevşeme yanıtları üzerindeki etkileri....................................... 126 x Tablo 1: Klinikte miyokard sersemlemesi gözlemlenen durumlar ve deneysel eşdeğerleri .... 13 Tablo 2: Levosimendanın etkilerinin incelendiği deney gruplarında izole perfüze kalp çalışmalarında verilerin elde edildiği hayvan sayıları .............................................................. 82 Tablo 3: Aritmi değerlendirmesinde kullanılan skorlama kriterleri........................................... 84 Tablo 4: Elektron mikroskobik çalışmada kullanılan skorlama kriterleri. ................................. 88 Tablo 5: İzole kalp ve izole damar deneylerinde kullanılan fizyolojik tuz çözeltilerinin bileşimi ................................................................................................................................................. 92 Tablo 6: İskemi süresinin etkilerinin incelendiği deney gruplarında kalplerde ölçülen fonksiyonel parametreler ....................................................................................................... 101 Tablo 7: İskemi süresinin etkilerinin incelendiği deney gruplarında 90. ile 100. dakikalar arasında gözlenen aritmi insidansı ve süresi ........................................................................ 102 Tablo 8: Levosimendanın etkilerinin incelendiği deney gruplarında diyastol sonu basıncı... 103 Tablo 9: Levosimendanın etkilerinin incelendiği deney gruplarında kasılmanın maksium hızı ............................................................................................................................................... 105 Tablo 10: Levosimendanın etkilerinin incelendiği deney gruplarında gevşemenin maksimum hızı ......................................................................................................................................... 106 Tablo 11: Levosimendanın etkilerinin incelendiği deney gruplarında kalbin dakikadaki atım hızı ......................................................................................................................................... 108 Tablo 12: Levosimendanın etkilerinin incelendiği deney gruplarında perfüzyon basıncı ...... 109 Tablo 13: Levosimendanın etkilerinin incelendiği deney gruplarında 90. ile 100. dakikalar arasında gözlenen aritmi insidansı ve süresi ........................................................................ 110 Tablo 14: İskemi süresinin etkilerinin incelendiği deney gruplarında koroner akımda ölçülen CK-MB değerleri .................................................................................................................... 111 Tablo 15: Levosimendanın etkilerinin incelendiği deney gruplarında koroner akımda ölçülen CK-MB değerleri .................................................................................................................... 112 Tablo 16: Levosimendanın etkilerinin incelendiği deney gruplarında kalp dokularında cAMP değerleri................................................................................................................................. 113 Tablo 17: İskemi hasarının incelendiği gruplarda hücrelerde meydana gelen yapısal değişikliklerin total skorları..................................................................................................... 119 xi Tablo 18: Sıçan torasik aortasında 21 gün süre ile oral levosimendan tedavisinin (0.2 mg/kg/gün) ve mekanik endotelsizleştirmenin 120 mM KCl ile oluşan maksimum kasılma yanıtları (Emaks) üzerindeki etkileri.......................................................................................... 121 Tablo 19: Sıçan torasik aortasında 21 gün süre ile oral levosimendan tedavisinin (0.2 mg/kg/gün) ve mekanik endotelsizleştirmenin kümülatif fenilefrin (10-9-10-4 M) Emaks yanıtları ve pD2 değerleri üzerindeki etkileri. ....................................................................................... 122 Tablo 20: Sıçan torasik aortasında 21 gün süre ile oral levosimendan tedavisinin (0.2 mg/kg/gün) ve mekanik endotelsizleştirmenin kümülatif 5-HT (10-9-3x10-5 M) Emaks yanıtları ve pD2 değerleri üzerindeki etkileri............................................................................................. 124 Tablo 21: 21 gün süre ile oral levosimendan tedavisinin (0.2 mg/kg/gün) 10-6 M fenilefrinle önkastırmaya tabi tutulmuş sıçan torasik aortasında kümülatif asetilkolin (10-9-10-4 M) gevşeme Emaks yanıtları ve pD2 değerleri üzerindeki etkileri. ................................................ 125 Tablo 22: 21 gün süre ile oral levosimendan tedavisinin (0.2 mg/kg/gün) ve mekanik endotelsizleştirmenin 10-6 M fenilefrinle önkastırmaya tabi tutulmuş sıçan torasik aortasında kümülatif NG (10-9-3x10-5 M) gevşeme Emaks yanıtları ve pD2 değerleri üzerindeki etkileri... 127 xii 1 GİRİŞ VE GENEL BİLGİLER 1.1 Giriş Akut miyokardiyal iskeminin neden olduğu olayların ve kardiyovasküler hastalıkların tedavisinde kullanılacak ilaçların etkilerinin incelenmesinde izole perfüze Langendorff sistemi in situ kalp modellerinden daha iyi kontrol edilebilir deney şartları sağlamaktadır. Ancak fare, sıçan, tavşan ve kobay gibi deney hayvanlarının kalpleri ile oluşturulan izole perfüze kalp preparatlarında iskemi/reperfüzyon (İ/R) hasarı ve bu hasar üzerinde iskemik önkoşullamanın (preconditioning) ya da farmakolojik ajanların etkilerinin incelendiği çalışmalar arasında miyokard iskemisi süreleri ve post-iskemik hasar dereceleri arasındaki farklılıklar, elde edilen sonuçların karşılaştırılmasında güçlük oluşturmaktadır. doğrultusunda Ayrıca her İ/R çalışmalarında laboratuvarın kendi incelenmek istenen standartlarını konu belirlemesi gerekmektedir. Bu nedenle çalışmamızda Langendorff perfüze sıçan kalbinde uygun İ/R modelinin seçilmesi ilk amacımız olmuştur. Bu çalışmalar esnasında sıçan kalbinde iskemi süresine bağlı olarak meydana gelen yapısal değişiklikler ile fonksiyonel değişikliklerin birlikte değerlendirilerek aralarındaki olası bağlantının belirlenmesi de hedeflenmektedir. Konjestif kalp yetmezliği (KKY)’nin kısa süreli tedavisinde kullanılan bir ilaç olan levosimendanın standart tedavi kapsamında olan ilaçlara karşı gözlenen üstünlüklerine karşın kronik ve profilaksiye yönelik kullanımına ait veriler henüz yeterli değildir. Bu çalışmanın amacı, sıçanlarda oluşturulacak miyokard iskemisi üzerinde uzun süre oral yoldan verilen levosimendanın oluşturacağı kronik etkiler ile akut uygulama sonucunda oluşan etkileri karşılaştırmalı olarak incelemektir. Olası yararlı etkiler, halen gündemde olan bu ilacın, klinikte kronik kullanımına yönelik bilgiler sağlayacaktır. Ayrıca, bu çalışma kapsamında, kalbin iskemiye karşı korunmasında levosimendan ile iskemik önkoşullama arasındaki etkileşimlerin incelenmesi de amaçlanmıştır. Bu yöndeki araştırmaların olası olumlu sonuçları, kalbin çeşitli patolojik durumları veya cerrahi müdahalelerinde kullanılması düşünülen farmakolojik veya iskemik önkoşullama yöntemleri ile birlikte profilaktik olarak oral levosimendan kullanımının da yararlı olabileceğini düşündürebilecektir. Kardiyak etkileri açısından çok sayıda araştırmaya konu olan levosimendanın kronik kullanımının olası vasküler etkileri bilinmemektedir. Farmakolojik önkoşullama için aday olarak gösterilen ve kronik kullanım açısından değerlendirilen birçok bileşiğin damarlar üzerindeki yaygın sistemik etkileri kullanımlarını sınırlandırmaktadır. Kronik levosimendan kullanımının damarlar üzerindeki etkileri profilaktik kullanımını destekleyecek bilgiler edinmemizi sağlayabilir. Bu nedenle çalışmamızda kronik levosimendan kullanımının vasküler reaktivite üzerindeki etkilerinin araştırılması da amaçlanmıştır. 1.2 Genel bilgiler Akut koroner arter oklüzyonu batı dünyasında morbidite ve mortalitenin en önde gelen nedenidir ve Dünya Sağlık Örgütüne göre 2020 yılında tüm dünyada en yaygın ölüm nedeni olması beklenmektedir. Bu hastalığın 2 önlenmesi ilk hedef olmakla birlikte sonuçlarına karşı koruyucu tedaviler geliştirilmesine de acil olarak ihtiyaç duyulmaktadır. Koroner oklüzyonun akut fazında infarkt gelişimini sınırlandırıcı tedaviler geliştirilmeye çalışılmaktadır. Ölen miyokard hücrelerinin yenilenmesi söz konusu olmadığından iskemik miyokardın canlılığının korunması en büyük terapötik hedeftir. Bu da ancak perfüzyon yeniden sağlanırsa mümkündür. Bu nedenle trombolitik tedavinin yararlı sonuçları görülmüş ve rutin olarak uygulanmaya başlanmıştır. Ne yazık ki trombolitik tedavi de tek başına yeterli değildir, çünkü dakikalar içerisinde hücre ölümü başlarken trombolitik tedavi ile perfüzyonun yeniden sağlanması ancak saatler sonra gerçekleşmektedir. Bu durum infarkt sınırlayıcı tedavilere olan ihtiyacın devam etmesine neden olmaktadır (176). İskemi ve reperfüzyonun kalpte neden olduğu hasar daha önceki yıllarda ayrıntılı olarak tanımlanmış olsa da 1986 yılına kadar infarkt alanının terapötik olarak sınırlandırılabileceği bilinmemekteydi. Murry ve arkadaşlarının (114) ileri sürdükleri “önkoşullama” kavramı daha sonraları “erken reperfüzyon haricinde miyokardiyal iskemik hasara karşı en etkili in vivo koruma” olarak kabul gördü. Daha sonra bu etkin korumanın mekanizmasının araştırılarak bu mekanizmayı taklit eden farmakolojik ajanların tanımlanması ve klinikte kullanıma sokulması hedeflendi (176). Bu bölümde İ/R hasarı, iskemik ve farmakolojik önkoşullama ve antiiskemik etkili kalsiyum duyarlılaştırıcı bir ilaç olan levosimendan hakkında genel bilgiler verilecektir. 3 1.2.1 İ/R hasarı ve postiskemik miyokardiyal disfonksiyon Koroner arter stenozu, taşikardi, sol ventrikülün aşırı dolması, hipoksemi, sistolik hipertansiyon ve β-adrenerjik stimülasyon oksijen gereksinimini artırır veya kalbe gelen oksijen miktarını azaltır. Sempatik sistem aktivasyonu ve endotel kaynaklı faktörler vazokonstriksiyon oluşturabilir. Sonuç olarak miyokard yeterince oksijenlenemez. Miyokardın yeterince oksijenlenememesi miyokard iskemisi olarak adlandırılır (185). Önceden iskemik olan miyokarda kan akımının tekrar sağlanması İ/R hasarı olarak adlandırılan durumla sonuçlanır (108). Kısa süreli geçici miyokard iskemisi miyositler tarafından tolere edilmektedir. Ancak iskemi sonrasında hücre ölümü gözlenmemesine rağmen miyositler hasar görmüştür. Kısa süreli iskemi sonucunda miyositlerde yüksek enerjili fosfat ve adenin nükleotid havuzunda azalma, glikojen deplesyonu, laktat ve hidrojen (H+) birikimi ve ultrastrüktürel olarak gözlemlenebilen intraselüler ödem gibi değişiklikler oluşur, fakat kan akımı kısa süre içerisinde tekrar sağlandığında miyositler iyileşir (71). 1.2.1.1 Hasarlı miyokardda oluşan fizyolojik, biyokimyasal ve hücresel değişiklikler 1.2.1.1.1 İskeminin etkileri Koroner akımın kesilmesinden veya azalmasından saniyeler sonra fizyolojik ve metabolik değişiklikler oluşmaya başlar. Enerji metabolizması aerobik ya da mitokondriyal metabolizmadan anaerobik glikolize doğru kayar. Bu değişiklik dokuda oksihemoglobin ve oksimiyoglobin olarak tutulmuş 4 bulunan oksijen kullanıldıktan hemen sonra ortaya çıkar. Metabolizmadaki bu değişimle paralel olarak efektif kalp kontraksiyonları azalır ve zamanla durur. Potasyum (K+) iyonlarının dışarı sızması sonucunda membran potansiyeli azalır ve elektrokardiyogram (EKG) S-T segmenti değişiklikleri ortaya çıkar. Yüksek enerjili fosfatlardan ve anaerobik glikolizden sağlanan enerji miyositlerin enerji ihtiyacını karşılamaktan çok uzaktır ve dokudaki adenozin trifosfat (ATP) azalırken adenozin difosfat (ADP) ve sonunda adenozin monofosfat (AMP) birikmeye başlar (185). Hücre içinde biriken AMP adenozine yıkılır ve ekstraselüler sıvıya difüze olarak adenin nükleotid havuzundan kaybedilir. İskeminin tersinir (reversible) fazının geç dönemlerinde adenin nükleotid havuzu başlangıç seviyesinin %30-40’ı kadardır (71). Yüksek enerjili fosfatların ana kaynaklarından biri olan kreatin fosfat rezervi kısa sürede büyük ölçüde azalır. Ekstraselüler sıvıda az miktarda glukoz bulunduğundan anaerobik glikoliz substrat olarak glikojenolizden kaynaklanan glukoz-1-fosfat (glukoz-1-P)’ı kullanır. Doku glikojeni azalır. Bu süreçte, glukoz-1-P’tan yüksek enerjili fosfat üretimi esnasında laktat oluşur. Laktat ve laktata bağlı olarak H+ birikir. Sadece 10 dakika iskemi sonrasında intraselüler pH 6.0’dan 5.8’e düşer ve laktat, inorganik fosfat, kreatin gibi intraselüler ozmotik etkili partiküller anlamlı derecede artar. Bu ozmotik yük nedeniyle şiddetli iskemiye maruz kalan dokuda intraselüler alanda az miktarda bulunan su artarak hücrenin şişmesine neden olur. Meydana gelen ödemin sarkoplazmik alanda artış şeklinde transmisyon elektron mikroskop (EM)’unda da görülmesi mümkündür (71). İskeminin ileri safhalarında lezyonlardaki değişiklik geri döndürülemez hale 5 gelir. Hücre yapısında ultrastrüktürel değişiklikler oluşur ve kreatin kinaz-MB (CK-MB), troponinler gibi makromoleküller salıverilir (185). Miyofibrillerin ve Z-bantlarının iskemi nedeniyle ve patofizyolojik durumlarla ilgili çeşitli nedenlerle dejenere olması ve atrofisi miyofibriler dejenerasyon olarak adlandırılır. Dejeneratif sürecin şiddeti ve seviyesi hücrede çeşitli morfolojik değişimlerin görülmesine neden olur. Erken veya orta dereceli lezyonlarda miyofibrillerin genişliğinde bir azalma gözlenir fakat sarkomer yapısı korunmuştur. Daha şiddetli değişikliklerde bir ya da daha fazla sarkomer boyunca miyofibrillerin kaybı ya da bozulması görülebilir ve Zbandında çeşitli değişiklikler oluşur. Miyofibrillerin kaybı gerçekleştiğinde miyofibril şekli ve büyüklüğünde çok fazla değişiklik olur. Bu yöndeki değişimlerin ilerlemesi sonucunda kasta nekroz gelişir (40). İskeminin ilk dakikalarında adenozin, bradikinin, opioidler, norepinefrin ve anjiyotensin gibi çeşitli maddeler ekstraselüler sıvıya salıverilir ve bu maddeler miyositlerde bulunan reseptörlere bağlanarak hücre içi sinyal yolaklarını uyarırlar. Bu reaksiyonlar hızla oluşmaktadır, örneğin, iskemiye karşı yanıt olarak intramiyokardiyal sinir uçlarından salıverilen norepinefrin, saniyeler içerisinde fosforilaz’ı aktive eder (71). İn vitro izole perfüze kalplerden elde edilen bilgiler intraselüler kalsiyum (Ca+2) iyonunun iskemi esnasında arttığını göstermektedir. İskemi sonucunda intraselüler H+ artışı sodyum/hidrojen (Na+/H+) pompası aracılığı ile intraselüler sodyum (Na+) artışına neden olur. Na+ artışı Na+/Ca+2 pompası aracılığı ile kalsiyumun hücre içinde birikmesine neden olur. Sitozolik ve mitokondriyal Ca+2 artışı hücre ve hücre membranı hasarında anahtar rol oynar (185). Hücre ve hücre membranındaki irreversibl hasarın 15 dakika 6 gibi kısa süreli iskemi ile meydana gelmediği tersinir iskemiye neden olan daha uzun süreli iskemik periyodlar sonucunda oluştuğu ileri sürülmektedir (71,175). 1.2.1.1.2 Reperfüzyonun etkileri İskemik canlı kalp dokusunda arteriyal kan akımının ani olarak yeniden sağlanması ile aerobik metabolizma tekrar başlar ve iskemik miyositler kurtulur. Dokuda ilk 5 dakika süresince reaktif hiperemi meydana gelir, reperfüzyondan 15-20 dakika sonra kanlanma kontrol seviyelerine geri döner. Reperfüzyonun ilk dakikası içerisinde yüksek miktarda serbest oksijen radikalleri oluşur ve reperfüzyonun 4. ve 7. dakikaları arasında serbest radikallerin pik yaptığı görülmüştür. Bu değişikliklerle birlikte EM’de jeneralize mitokondriyal ve hücresel şişme gözlemlenir (71). Reperfüzyondan 60-120 saniye sonra EKG değişiklikleri kaybolur ve yine yaklaşık aynı süre içerisinde iskemi esnasında birikmiş olan ADP ve AMP’den refosforilasyon ile ATP oluşarak adenin nükleotid havuzunun %90’ı ATP’ye çevirilir. Laktat miktarı sistemik sirkülasyona geçmek veya karbondioksit ve suya okside olmak sureti ile azalır. 30-120 saniye içerisinde doku pH’sı normale döner, kreatin fosfat miktarı yükselir ve glukoz seviyesi 4-6 kat artar. (71). Süperoksit dismutaz, ısı şok proteinleri ve indüklenebilir nitrik oksit sentaz (iNOS) gibi çeşitli proteinlerin iskemi sonrasında miyositlerde arttığı görülmüştür. Bu yeni proteinler reperfüzyon süresince sentezlenir ve reperfüzyondan 24 saat sonra varlıkları gözlenebilir. Protein sentezi iskemik hasara karşı miyositlerin verdiği bir cevaptır (71). 7 1.2.1.2 İ/R hasarının sonuçları Bir veya daha fazla kısa süreli bölgesel veya global iskemi periyodunu takiben ortaya çıkan uzamış tersinir postiskemik kontraktil disfonksiyon “miyokardiyal sersemleme” (myocardial stunning) olarak tanımlanmaktadır (45). Postiskemik disfonksiyon ya da miyokardiyal sersemleme, reperfüzyon sonrasında kalıcı hasar görülmemesine ve koroner akımın tekrar normal veya normale yakın düzeye dönmesine rağmen devam eden mekanik bir fonksiyon bozukluğudur. Kalbin hem sistolik hem de diyastolik fonksiyonları bozulur, bu nedenle miyokardiyal sersemleme kalbin mekanik özelliklerinin global düzensizliği olarak değerlendirilmelidir (16). Postiskemik disfonksiyon ilk kez Heyndrickx ve arkadaşları tarafından 1975’te tanımlanmıştır (53) ve daha sonraki yıllarda miyokardiyal sersemleme terimi kullanılmaya başlanmıştır. Bu fenomenin bulunduğu dönemde koroner reperfüzyonun çok sık rastlanmayan bir olgu olduğu düşünüldüğünden miyokardiyal sersemleme sadece laboratuvar ortamında incelenen bir deneysel durum olarak kabul edilmiştir. 1980’ler ve özellikle 1990’larda trombolitik tedavi, perkütanöz transluminal koroner anjiyoplasti (PTCA) veya koroner arter baypas graftı (KABG) ameliyatları ile koroner reperfüzyonun sağlanmasının koroner arter hastalığındaki akut iskemik sendromların tedavisinde standart yaklaşım olarak benimsenmesinden sonra miyokardiyal sersemleme deneysel olduğu kadar klinik olarak da ilgi görmeye başlamıştır. Ayrıca bazı çalışmalarda birçok hastada koroner trombusların parçalanması veya koroner spazmların kendiliğinden çözülmesi ile spontan reperfüzyon olabildiği gösterilmiştir (16). 8 Miyokardiyal sersemlemenin biyolojik açıdan önemli bir yönü inotropik uyarıya maruz kalması halinde kasılabilmesidir. İnotropik uyarı alan ve almayan sersemlemiş kalplerin aynı süre sonrasında normale döndükleri gösterildiğinden inotropik uyarının sersemlemiş kalbin durumunu kötüleştirmediği söylenebilir. Ayrıca β-blokör gibi negatif inotrop bir ajanla sersemlemenin derecesinin değiştirilmesi de iyileşmeyi hızlandırmamıştır. Eğer sersemleme, kalbin iskemiye karşı doğal bir korunma mekanizması olsaydı katekolaminlerle sersemlemiş dokunun uyarılması iyileşme sürecini kötü yönde etkilemeli ve sersemleme benzeri olan diğer uyarılar iyileşme sürecini hızlandırmalıydı, fakat durum böyle olmadığından miyokardiyal sersemlemenin iskemiye karşı koruyucu bir mekanizma olmadığı söylenebilir. Tekrarlanan kısa süreli iskemi periyodlarını takiben kalbin iskemiye karşı önkoşullanarak daha sonraki uzun süreli iskemiye karşı koruyucu etki oluşması iskemik önkoşullama olarak bilinir (71). İskemik önkoşullama kavramı Bölüm 1.2.2’de açıklanacaktır. Canlı kalp kası normal veya sersemlemiş halde olabileceği gibi hiberne halde de olabilir. Miyokardiyal hibernasyon, şiddetli şekilde azalmış koroner kan akımından kaynaklanan kronik miyokardiyal iskemi nedeniyle oluşan ventriküler disfonksiyondur. Tek başlarına ya da kollektif olarak kalp yetmezliğine neden olabildiklerinden hem sersemleme hem de hibernasyon klinik açıdan önemlidir. Sersemleme akut miyokard infarktüsü sonrasında gözlemlenebileceği gibi infarktlı, cansız miyokardın komşuluğunda canlı fakat bölgesel disfonksiyon gösteren sersemlemiş doku da bulunabilir. Tekrarlanan sersemleme olayları hibernasyon ile birlikte görülebilir ya da hibernasyonu taklit edilebilir. Genel bir deyişle, hem akut hem de kronik miyokard iskemisi 9 ventriküler disfonksiyonun farklı tersinir formlarını oluşturabilir. Kalp yetmezliğinin en yaygın nedeni koroner arter hastalığı ve miyokardiyal disfonksiyondur (42). Sersemlemiş ve hiberne kalpte substrat olarak yağ asitlerinden çok glukoz tercih edilmeye başlanır ve her iki durumda da kontraktilite inotroplara duyarlıdır (42). Sözü edilen benzerliklerle birlikte sersemleme ve hibernasyon arasında ayırıcı iki nokta vardır. Miyokardiyal sersemlemede, postiskemik disfonksiyon ne kadar şiddetli ve uzun olursa olsun tamamen düzelir ve disfonksiyon primer miyokard perfüzyon bozukluğu sonucunda oluşmamıştır (16). revaskülarizasyon Ancak sonrasında hiberne miyokardın iyileşebilmektedir fonksiyonları (42). Bu ise nedenle postiskemik kontraktil disfonksiyonun bu iki farklı çeşidinin birbirinden ayrılması klinik açıdan önemlidir. Laboratuvar çalışmalarında da ventriküler disfonksiyonun bu iki çeşidinin karıştırılmamasına özen gösterilmelidir. İ/R hasarının miyokardiyal sersemleme dışındaki bazı sonuçları reperfüzyon aritmileri, miyosit ölümü, endotelyal ve mikrovasküler disfonksiyon olabilir (100,108). İnsanlarda en yaygın reperfüzyon aritmisi hızlı idiyoventriküler ritim olmakla birlikte, oluşan ventriküler taşikardi (VT) ve ventriküler fibrilasyon (VF) kan akımının tekrar başlaması sonucunda görülen ani ölümlerin en önemli nedenlerindenidir. Serbest oksijen radikallerinin reperfüzyon aritmisi gelişiminde anahtar rol oynadığı ileri sürülmektedir (100,108). İskemi esnasında kardiyomiyosit hücre ölümü onkozis olarak adlandırılır. Erken dönemde kardiyomiyosit kontraktür gelişimi nekrotik kardiyomiyosit 10 hasarından sorumlu olabilir. Daha sonraki dönemlerde ise nekroz ve apoptoz hücre ölümüne neden olabilir (108). Endotelyal disfonksiyon, endotele bağımlı gevşemelerde azalma ve endotele bağlı vazokonstriktörlere yanıtta artma olarak tanımlanmaktadır. İ/R hasarı sonucunda endotelin-1 ve oksijen radikalleri gibi vazokonstriktörlerin üretimi ve koroner vazokonstriksiyon artar, kan akımı azalır. Reperfüzyonun ilk dakikalarında endotel disfonksiyonel hale gelir ve nitrik oksit (NO) oluşumu azalır. Daha sonraki dönemde ise lökosit adhezivitesi artarak lökositler endotele yapışır ve nötrofiller endotelden reperfüze olan dokuya göç eder. Aktive nötrofiller sitokinler, proteazlar, lökotrienler ve serbest oksijen radikalleri gibi sitotoksik ve kemotaktik maddeler salıverirler. Endotel disfonksiyonu 4-12 hafta kadar sürebilir (108). İ/R sonrasında oluşan endotel disfonksiyonu, mikrovasküler tıkanıklıklar (trombositler ile mikroemboli, de novo trombozis), ödem ve oksidatif stres mikrovasküler disfonksiyonun patojenezinde rol oynayabilir. Mikrovasküler disfonksiyon da hücre ölümü ve aritmilere neden olabilir (52). Şiddetli mikrovasküler disfonksiyon bazen reperfüzyon sonrasında yeterli akım sağlanmasını engeller, bu duruma “no-reflow fenomeni” denir. Koroner oklüzyonun tamamen ortadan kalkmasından sonra koroner akımın yeniden sağlanamaması dinlenim durumundaki miyokardiyal kan akımının azalmasına utrastrüktürel vasküler değişikliklere ve hipoperfüzyon görülen alanların oluşumuna neden olur. No-reflow fenomeni sonucunda akut miyokard infarktüsü riskinde artma, miyokardiyal rüptür ve ölüm görülebilir (108). 11 1.2.1.3 Deneysel ve klinik açıdan miyokardiyal sersemleme Miyokardiyal sersemleme bir tek olgu olarak değil daha çok çeşitli koşullarda oluşan sersemlemenin bir sendrom şiddetini olarak belirleyen nitelendirilmelidir. faktörlerin Miyokardiyal başlıcaları kan akımı kısıtlanmasının süresi ve şiddeti ile kalbin sıcaklığıdır. Aşağıda deneysel koşullar altında gerçekleştirilen miyokardiyal sersemleme modelleri verilmektedir (16,70): 1. İn vivo, bir tek, tamamen tersinir bölgesel iskemi: Miyokard sersemlemesinin ilk tanımlandığı (53) ve deneysel olarak sıklıkla kullanılan klasik şeklidir. 2. İn vivo, çoklu, tamamen tersinir bölgesel iskemi: Farklı sayılarda ve farklı sürelerde iskemi uygulamaları tanımlanmış olan bu modelde mekanik disfonksiyon aşamalı olarak oluşur ve toplam iskemik yük daha fazladır. 3. İn vivo, kısmen tersinir bölgesel iskemi (subendokardiyal infarktüs): 20-120 dakikalık koroner oklüzyon sonrasında perfüzyon tekrar sağlandığında genellikle risk bölgesinin subendokardiyal bölümünde infarkt olduğu, subepikardiyal dokunun değişken oranlarda canlı olduğu gözlemlenmiştir. 4. İn vitro, global iskemi: in vivo sersemleme ile çeşitli açık farklılıklar bulunmasına rağmen izole kalp preparatlarında miyokard sersemlemesi bu uygulama ile taklit edilebilmektedir. 5. İn vivo, global iskemi: Hipotermik kardiopleji olmaksızın intakt hayvanlarda oluşturulan global anormalitelerle sonuçlanmaktadır. 12 iskemi, uzamış kontraktil 6. Egzersiz ile indüklenen iskemi (yüksek-akım iskemisi): Kalbi besleyen kan akımının sınırlı olduğu stenoz durumunda kalbin oksijen gereksiniminin egzersiz ile artması halinde miyokard iskemisi ve disfonksiyonu oluşabilir ve kontraktil bozukluk egzersiz sonlandırıldıktan sonra da devam eder. Bu deneysel koşullar miyokardiyal sersemleme ile ilişkili olması muhtemel klinik durumların eşdeğerleri olarak görülebilir. Tablo 1’de (45) klinikte miyokard sersemlemesi gözlenen durumların eşdeğeri olarak kabul edilen deneysel modeller verilmektedir. Tablo 1: Klinikte miyokard sersemlemesi gözlemlenen durumlar ve deneysel eşdeğerleri Deneysel koşul Klinik durum Bölgesel iskemi Tamamen tersinir iskemi (koroner oklüzyon ≤ PTCA 20dk) Stabil olmayan anjina Varyant anjinası Kısmen tersinir iskemi (subendokardiyal Erken reperfüzyonlu akut miyokard infarktüsü infarktüs, koroner oklüzyon 20-120dk) Egzersiz ile indüklenen iskemi Koroner stenoz varlığında egzersiz ile indüklenen iskemi Global iskemi Kardioplejik arrest Kardiyak cerrahi Kalp nakli Kardiyak arrest Egzersiz ile indüklenen iskemi Hipertrofik kalplerde egzersiz ile indüklenen iskemi PTCA uygulamaları esnasında balonun 60 saniyeden az süre ile şişirilmesinin kardiyak fonksiyonda bir değişiklik oluşturmadığı, bununla birlikte daha uzun süreli koroner oklüzyon sonucunda kardiyak fonksiyon depresyonun 24-36 saat kadar sürebileceği insanlarda yapılan çeşitli 13 araştırmalar ile ortaya koyulmuştur (52,71). Stabil olmayan anjinalı hastalarda da miyokardiyal sersemleme görüldüğüne ilişkin çalışmalar bulunmaktadır. İnsanlarda egzersiz ile indüklenen iskemide fonksiyon ve koroner perfüzyon arasındaki dengesizliğin ve buna benzer şekilde dobutamin ve dipridamol ile stres testinin de miyokardiyal sersemlemeye yol açabildiği gösterilmiştir. Akut miyokard infarktüsü sonrasında bir miktar nekroz bulunmasına rağmen sersemleme olgusuna rastlandığı bilinmektedir. Bu durumun incelenmesi nekrotik ve sersemlemiş doku miktarlarının değişkenliği nedeniyle daha komplikedir. İntravenöz trombolitik ajanlarla tedavi gören veya anjiyoplasti uygulanan vakalarda gecikmiş kardiyak fonksiyon düzelmesi olduğu bildirilmiştir (70). KABG sonrası sersemlemiş miyokard klinikte önemli bir problem olabilir (15). Kardiopleji solüsyonlarının kullanımına rağmen cerrahi işlemler sonrasında değişen oranlarda fonksiyon bozukluğu ortaya çıktığı ve yine değişik süreler sonrasında kontraktil fonksiyonda düzelme oluştuğu bildirilmiştir. Postoperatif sersemlemeye klinikte sık rastlanır ve operasyon sonrası dönemde ilk saatler ya da günlerde inotroplara ihtiyaç duyulur (71). 1.2.1.4 Miyokardiyal sersemlemenin mekanizması Genel bir bakış açısıyla miyokardiyal sersemleme iskemi esnasında ortaya çıkan anormallikler tarafından modüle edilen, oksiradikal hipotezi ve kalsiyum hipotezi ile açıklanmaya çalışılan bir durumdur. Bir önceki bölümde söz edilen deneysel miyokardiyal sersemleme uygulamalarının hepsinin aynı mekanizma üzerinden hasar oluşumuna neden olup olmadığı bilinmemekle birlikte in vitro global iskemi uygulaması en çok çalışılan ve mekanizması en 14 iyi aydınlatılmış olan metoddur. İn vitro izole kalplerde global iskemi uygulamasında oksiradikal hipotezi ve kalsiyum hipotezinde incelenen hasar mekanizmalarının hepsinin geçerli olduğu düşünülmektedir (16). 1.2.1.4.1 Oksiradikal hipotezi Reaktif oksijen türlerinin (süperoksit anyonu, hidrojen peroksit ve hidroksil radikali) miyokardiyal sersemlemede rol oynadığı düşünülerek yapılan deneylerde oksiradikallerin kantitatif ölçümleri sonucunda iskemik hasarın şiddeti ile serbest oksijen radikali üretiminin miktarı arasında pozitif lineer bir ilişki olduğu ve hidroksil radikalinin sersemlemede önemli rol oynadığını gösteren veriler elde edilmiştir. Genel olarak bütün çalışmalarda reperfüzyondan hemen sonra serbest oksijen radikallarinin üretiminin şiddetli bir şekilde arttığı ve ilk birkaç dakika içerisinde artışın pik yaptığı ve zamanla azaldığı belirlenmiştir (16,45). İn vitro ve in vivo yapılan deneylerde oksiradikallerin sersemlemeden sorumlu olduğuna ilişkin varılan ortak kanıya rağmen oksijen metabolitlerinin tam olarak hangi mekanizma ile kontraktil fonksiyonu baskıladığı kesin değildir. Teorik olarak serbest radikaller bütün hücresel komponentlere saldırabilecek reaktif türlerdir. En azından iki hücresel komponent, proteinler ve lipidler, radikaller tarafından başlatılan reaksiyonların hedefi olabilir. Serbest oksijen radikalleri protein denatürasyonu, enzim inaktivasyonu ve hücre zarında bulunan poliansatüre yağ asitlerinin peroksidasyonuna yol açabilirler ve son etkileri nedeniyle de membran permeabilitesinin seçiciliğini etkileyebilir, çeşitli hücre organelinin fonksiyonlarını etkileyebilirler (16,52). 15 Oksiradikaller sarkolemmal Ca+2 transportunu ve Ca+2 ile uyarılan ATPaz aktivitesini değiştirebileceğinden sarkolemma serbest radikallerin aracılık ettiği hasarın önemli bir hedefi olabilir. Oksijen radikallerinin Na+/Ca+2 pompa aktivitesini değiştirebileceği ve Na+-K+-ATPaz aktivitesini inhibe edebileceği gösterilmiştir. Na+-K+-ATPaz aktivitesinin inhibe edilmesi hücre içi Na+ miktarının artışına ve böylece Na+/Ca+2 pompa aktivitesinin artışına neden olabilir. Bu değişiklikler transsarkolemmal Ca+2 akımının (flux) artışına ve hücresel Ca+2 miktarının artışına neden olabilir (16,70). Ayrıca oksiradikallerin kritik tiyol gruplarının oksidasyonu gibi kontraktil proteinlerin selektif hasarı yolu ile miyofibrillerin kalsiyuma cevap verebilirliğini azaltma ihtimali de mevcuttur. Gerçekten de miyofibrillerin süperokside karşı oldukça duyarlı oldukları ve çapraz köprü kinetiğinin süperoksit anyonundan kolayca etkilenebildiği gösterilmiştir (16,71). Sersemlemiş miyokardda oksiradikal üretiminin kaynakları tam olarak bilinmemekle birlikte ksantin oksidaz, araşidonik asit kaskadının aktivasyonu, katekolaminlerin otooksidasyonu, nikotinamid adenin dinükleotid fosfat (NADPH) oksidazların aktivasyonu ve mitokondriyal elektron transport zincirinin zarar görmesinin oksijen radikallerinin kaynağı olabileceği düşünülmektedir (108). Oksiradikal hipotezinde öne sürülen mekanizmalar aynı zamanda Ca+2 homeostazını etkileyebileceğinden oksiradikal hipotezi ile kalsiyum hipotezinin birlikte düşünülmesi ve yorumlanması daha doğru olabilir. 16 1.2.1.4.2 Kalsiyum hipotezi Kalsiyum hipotezi çok genel bir deyişle sersemlemenin hücresel Ca+2 homeostazındaki bir bozukluk sonucu olduğunu varsaymaktadır. Bu hipotez üç ayrı noktayı vurgulamaktadır: 1. Kontraktil proteinlerin kalsiyuma karşı duyarlılığının azalması, 2. Hücre içi Ca+2 konsantrasyonu artışı, 3. Ekzitasyon-kontraksiyon kenetinin sarkoplazmik retikulum disfonksiyonu nedeniyle bozulması. Ca+2 miyokardiyal sersemlemede iki ayrı rol oynamaktadır. Birincisi, Ca+2, kontraksiyonun kimyasal aktivatörü olarak fonksiyon bozukluğunun patofizyolojisinde majör determinanttır. İkincisi ise hasara yol açan bir ajan olarak Ca+2, sersemlemenin patojenezine katılabilir (16). 1.2.1.4.2.1 Miyokardiyal sersemleme patofizyolojisinde kalsiyumun rolü Kasılma yanıtı iki basamakta özetlenebilir. Ekzitasyonu takiben kanallar ve taşıyıcılar aracılığı ile hücre içi Ca+2 konsantrasyonunun artması ve artan Ca+2 konsantrasyonu sonucunda kontraktil proteinler aracılığı ile kasılma oluşması. Bu durumda bozukluk Ca+2’un içe ve dışa yönelik akımlarının bozulması yani başka bir deyişle Ca+2 döngüsünün bozulması şeklinde veya kontraktil proteinlerin kalsiyuma karşı yanıtlarının değişmesi şeklinde olabilir. Ca+2 yanıtının değişmesi üç komponentten oluşan bir durumdur: 1. Miyofibrillerin maksimum güç oluşturucu kapasitesi (intraselüler kalsiyumun yeterli olduğu konsantrasyonlarda), 2. Miyofibrillerin Ca+2 duyarlılığı (kontraktil proteinleri aktive eden hücre içi Ca+2 konsantrasyonu aralığı), 17 3. Çapraz-köprü kinetiği. Kontraktil bileşenlerin kalsiyuma karşı yanıt olarak güç oluşturabilme yeteneği miyofibril cevap verirliği olarak adlandırılan ve yukarıda bahsi geçen üç mekanizmayı da içeren bir terimdir (16). İzole kalplerde yapılan çalışmalarda miyokardiyal sersemleme sonucunda geçici hücre içi Ca+2 konsantrasyonu yükselmelerinin (Ca+2 transientleri) değişmediği buna karşın kalbin kasılma gücünün azaldığı gözlenmiştir (52). Miyofibrillerle yapılan fonksiyonel çalışmalarda kararlı durum (steady-state) Ca+2 aktivasyonunun maksimal güçte ve duyarlılıkta azalma oluşturduğu (intraselüler Ca+2-güç ilişkisinde sağa kayma), ayrıca çapraz-köprü kenetlenme hızındaki değişikliklerin sersemlemiş kalpte belirgin disfonksiyona neden olduğu bildirilmiştir. Miyofibrillerin cevap verirliğinin azalmasından maksimum Ca+2 düzeyi ile aktive olan gücün azalmasının mı yoksa Ca+2 duyarlılığının azalmasının mı yoksa her iki etkinin birden mi sorumlu olduğu kesin olarak bilinmemektedir (16,45). Bununla birlikte sersemlemiş miyokardda kullanılabilir Ca+2 miktarının sınırlı olmadığı ve ekzitasyon-kontraksiyon kenetindeki bozukluğun kontraktil proteinler seviyesinde olduğu kabul edilmektedir (16). Veriler kalsiyuma cevap verirliğin azalmasının nedeninin bir veya daha çok miyofibriler proteinin yapısal değişikliği olduğuna işaret etmektedir. Bu noktada kalsiyum ve oksiradikal hipotezinde öne sürülen fikirler uyuşmaktadır. Oksiradikaller diğer birçok etkilerinin yanı sıra miyofibriler proteinlerin tiyol gruplarının oksidasyonu gibi bir mekanizma ile kalsiyuma cevap verirliğin azalmasına neden olabilirler (16). 18 İn vivo olarak miyofibrilleirn yapısal değişiklikleri dışında başka mekanizmalar da Ca+2 duyarlılığını etkileyebilir. Oksijen radikalleri indirgenmiş glutatyon miktarını azaltıp yükseltgenmiş glutatyon miktarını artırabilirler. Yükseltgenmiş glutatyon Ca+2 duyarlılığını azaltabilir ve indirgenmiş glutatyonun tam ters yönde bir etkisi olabilir. Sitozolik glutatyonun redoks halindeki değişiklikler miyofibrillerin duyarsızlaşmasına katkıda bulunabilir. Hücre membranının kimyasal çözünmesinden önce ve sonra yapılan incelemelerden elde edilen sonuçların benzerliği hücre protein matriksinde meydana gelen değişikliklere işaret etmektedir (16). Yapılan oluşturulan immunohistokimyasal sıçan miyokardında çalışmalarda miyofibillerde global α-aktinin sersemleme degredasyonu gösterilmiştir. Regülatör ince fibril proteini olan Troponin I (TnI)’nın sersemlemiş miyokardda İ/R sonrasında kısmen degredasyona uğradığı fakat iskemik non-perfüze miyokardda degrede olmadığı gösterilmiştir (167). TnI’nın degredasyonu bu proteinin Ca+2 aktivasyonu ve çapraz-köprü hareketi üzerindeki etkisi nedeniyle özellikle önemlidir ve TnI’da meydana gelen lezyonlar miyofibrillerin baskılanan fonksiyonlarının açıklaması olabilir. 1.2.1.4.2.2 Miyokardiyal sersemleme patojenezinde kalsiyumun rolü Reperfüzyon sonrasında hücre içi Ca+2 düzeyi artmaktadır. Reperfüzyon ile indüklenen hücre içi Ca+2 artışının mekanizması şu şekilde açıklanmaktadır: İskemi esnasında enerji kaynaklarının azalması nedeniyle intraselüler Na+ miktarı artar, fakat bu duruma eşlik etmekte olan asidoz nedeniyle Na+/Ca+2 pompası inhibe olur. Reperfüzyon ile birlikte intraselüler Na+ miktarındaki fazlalık düzelmeden asidozun hızla düzelmesi Na+/Ca+2 19 pompasının tekrar aktive olmasına ve kalsiyumun hücre içine çekilmesine neden olur. Reperfüzyonun başlangıcında asidozun sürdürülmesinin sersemlemeye karşı koruyucu olduğu gösterilmiştir (66). Yapılan hücre içi Na+ konsantrasyonu ölçümlerinde, iskemi süresince sodyumun hücre içinde hızla yükseldiği ve reperfüzyonun ilk 10 dakikası süresince seviyesinin azalmadığı gösterilmiştir. İntraselüler pH ise reperfüzyon başladıktan 30 saniye sonra normale dönmektedir. İntraselüler Ca+2 konsantrasyonlarının direkt ölçümü ile yapılan çalışmalar 10-15 dakika gibi nispeten kısa iskemi sürelerinde bile intraselüler kalsiyumun arttığını ve reperfüzyonun, geçici olmakla birlikte, intraselüler Ca+2 miktarında daha fazla yükselmeye neden olduğunu göstermiştir (16). İskemi esnasında intraselüler Ca+2 düzeyleri artsa da miyofibrillerin kalsiyuma yanıtı değişmemektedir ve yine iskemik fazda kontraktil proteinlerin degredasyonu söz konusu değildir. Bu nedenle Ca+2 düzeylerindeki değişikliklerin sersemlemede gözlenen mekanik bozuklukları oluşturması için reperfüzyonun gerekli olduğu söylenebilir. Bunun nedeni iskemi esnasında oluşan asidoz nedeniyle protonların Ca+2 bağlanma bölgeleri ile yarışması olabilir (16). Geçici Ca+2 yükselmesi tekrar oksijenlenme esnasında miyofibrillerin aşırı aktivasyonuna, mitokondriyal Ca+2 artışı ile mitokondrilerin ATP üretme kapasitesinde azalmaya yol açabilir. Ayrıca kalsiyuma bağımlı proteaz aktivasyonu ile kontraktil proteinlerin fonksiyonlarını etkileyebilirler (169). Kalpainler hücre Ca+2 düzeyleri arttığında diğer proteinleri yıkan (cleave) enzimlerdir ve miyokard dahil birçok dokuda bulunurlar. İskemi ve reperfüzyonun erken döneminde geçici olarak artan hücre içi Ca+2 20 konsantrasyonu kalpain 1’i aktive edebilecek düzeydedir (16). İ/R sonrasında kalpte kalpain 1 aktivitesinin arttığı gösterilmiştir ve hücre iskeleti yapısında bulunan ve kalpian 1’in spesifik substratı olan kalspektin’in İ/R sonrasında proteolize uğradığı gösterilmiştir (183). Kalpain 1’in TnI ve TnT ile etkileştiği bilinmektedir. Bu nedenle kalpain 1 İ/R sonrası miyofibril proteolizinden sorumlu olabilir. Eğer Ca+2 ile aktive olan proteoliz sersemlemede anahtar rol oynuyorsa kalpain inhibitörlerinin hasarı azaltıcı etkisi olabilir (16). Kalsiyum hipotezini özetleyecek olursak: 1. Sersemlemenin patojenezi ile geçici hücre içi Ca+2 artışının ilişkili olduğu ve yine sersemleme ile ilişkili olduğu bilinen reaktif oksijen türlerinin hücre içi kalsiyumu artırabildiği gösterilmiştir. 2. Sersemlemiş miyokard histolojik açıdan bozulmamıştır. Ca+2 ile aktive olan proteoliz sarkomerde görünür değişiklikler (nekroz vb.) oluşturmamaktadır. 3. Miyofibrillerin proteolizi ile ilişkili hipotez sersemlemiş miyokardın inotrop uyaranlara cevap verebiliyor olması ile desteklenmektedir. İntraselüler Ca+2 konsantrasyonunu kontrol eden mekanizmaların intakt olduğu kabul edilmektedir. 4. Miyokardiyal sersemlemenin belki de en ilginç yönü hasarın tersinir nitelikte olmasıdır. Birkaç saatten birkaç haftaya kadar değişebilen bu iyileşme süreci proteolitik hipotezle uyum içerisindedir. Kısmen parçalanmış olan kontraktil proteinlerin yerini yeni sentezlenen proteinler alarak miyofibrillerin tamir edilmesi için gereken zaman sersemleme sonrasında görülen gecikmiş dönemdeki iyileşme sürecini açıklayabilir. 21 5. Miyofibril miyokardın kalsiyuma cevap tedavisinde verirliğinin Ca+2 azalması duyarlılaştırıcıların sersemlemiş dikkate değer etkilerinin görülmesini açıklamaktadır (16). 1.2.1.4.3 Oksiradikal ve kalsiyum hipotezi dışındaki mekanizmalar 1. Renin-anjiyotensin sisteminin İ/R hasarında rol oynadığı düşünülmektedir. Renin-anjiyotensin sisteminin ana ürünü olan anjiyotensin II pozitif inotropik etki oluşturur, ancak diyastolik fonksiyon bozukluğu ve koroner vazokonstriksiyona da neden olabilir. Patofizyolojik seviyelerde anjiyotensin II’nin kardiyotoksik olduğu ve miyokard nekrozuna yol açtığı da bildirilmiştir (108). 2. Reperfüzyonun başlangıcından kısa süre sonra hasarlı miyokardda nötrofil aktivasyonu ve birikimi oluşur. Nötrofiller serbest oksijen radikalleri, proteazlar ve proinflamatuvar mediyatörler salıvererek hasarlı miyokarda nötrofil infiltrasyonuna neden olur ve böylece reperfüzyon hasarı artar. Ayrıca, nötrofillerin hemoreolojik özellikleri lökositlerin kapilerlerde hapsolmasına neden olarak mikrovasküler tıkanıklığa yol açar (108,169). 3. Bölgesel trombosit mikrovasküler hasara agregasyonu yol açtığından ve İ/R mikroembolizasyon hasarından kısmen sorumludur ve hasarın büyümesine neden olabilir. Trombosit kaynaklı tromboksan A2 ve serotonin (5-hidroksitriptamin, 5-HT) gibi ürünler mikrosirkülasyonda spazma yol açarak tromboza ve koroner akımın yavaşlamasına neden olabilir (108). 22 4. İ/R hasarı esnasında kompleman sistemi de aktive olur. Kompleman faktörleri hem hücre geçirgenliğini artırarak hem de histamin ve trombosit aktive edici faktör salıverilişini artırarak direkt hücre hasarına neden olur. Ayrıca kompleman faktörleri nötrofil adhezyonunun ve süperoksid üretiminin potent uyaranlarıdırlar (108,169). 1.2.1.5 İskemi sonrası moleküler adaptasyon Miyokardiyal sersemlemede oluşan gecikmiş fonksiyonel iyileşmenin iskemi sonrası moleküler adaptasyon ile sağlandığı düşünülmektedir. Koroner oklüzyon sonrasında bazı protoonkojenlerin upregüle olduğu, CaATPaz, kalsekestrin ve transkripsiyonlarının proteinlerinin fosfolamban arttığı spesifik tamir gibi Ca+2 görülmüştür. regüle Bu edici sonuçlar mekanizmalarının iyileşme Ca+2 proteinlerin regülatör sürecinde rol oynadığını düşündürmektedir. Bir başka çalışmada da hücre sağkalımında (apoptoz, hücre büyümesi) rolü olan bazı genlerin iskemi sonrasında upregüle olduğu gösterilmektedir (52). 1.2.1.6 Miyokariyal sersemlemede tedavi yaklaşımları Miyokardiyal sersemlemenin mekanizması ne olursa olsun bu mekanizma iskemi ile başlar ve modüle edilir. İskeminin şiddetinin azaltılması postiskemik disfonksiyonun şiddetinin azaltılmasında en etkili yöntem olabilir, bununla birlikte perfüzyonun tekrar sağlandığı aşamadaki girişimler de etkili olabilir, fakat reperfüzyon aşamasındaki tedavi uygulamalarının gecikmesi tedavi edici etkilerin yok olmasına neden olacaktır (16). 23 İnfarktüs tehlikesi altındaki miyokardın iyileşmesi için gereken şart mümkün olan en kısa sürede koroner akımın yeniden başlamasıdır. Reperfüzyon sağlanmasında en yaygın klinik yaklaşım trombolitik kullanımıdır. Bununla birlikte hasarlı dokunun korunması için hasarı modifiye edici girişimler yapılabilir. Bu girişimler ya iskemiden önce olmalı ya da iskemi başlangıcından sonra fakat terapötik reperfüzyon başlangıcından önce olmalıdır (175). Koroner oklüzyondan önce hastaların tedavi edilmeye başlanması stabil olmayan anjina teşhisi koyulmuş vakalar gibi yüksek risk altında olanların belli olduğu durumlarda mümkün olabilir. Yüksek risk grubundaki hastalara trombolitik tedaviye ek olarak kardiyoprotektif ajanların verilmesi iskemi anında miyokard hücrelerinin sağkalımını artırabileceği gibi anjiyoplasti, baypas ameliyatı gibi bu hastalara uygulanması söz konusu olabilecek cerrahi girişimler esnasında da kardiyoproteksiyon sağlayacaktır (175). Eğer kardiyoprotektif olarak kullanılan ajanlar kalbi reperfüzyon hasarına karşı korumakta ise iskemi başlangıcından sonra verilmeleri tedavi açısından hem zaman kazandırıcı hem de iyileşme sürecini hızlandırıcı yönde etkili olacaktır (175). Tedavide kullanılacak olan ajanın ne zaman verildiği çok önemlidir. Deneysel modellerde iskemi öncesinde verildiğinde infarkt alanını sınırlandıran fakat reperfüzyon esnasında verildiği taktirde koruyucu etki göstermeyen ajanların kullanılması sağladıkları klinikte yararı reperfüzyona azaltacaktır. yardımcı Yine ajanlar benzer olarak şekilde, reperfüzyonun ilk anlarında kullanıldıklarında etkili oldukları gösterilen deneysel ajanların klinikte reperfüzyonun erken döneminde uygulanmaması 24 yararlarının görülememesi ile sonuçlanabilir. Klinik denemelerde çeşitli ajanlarla ilgili olarak varılan çelişkili sonuçların (adenozin-AMISTAD, MgLIMIT2 ve ISIS4 çalışmalarında olduğu gibi) nedenlerinden biri tedavi zamanlamasının doğru olarak yapılamaması olabilir (175). İ/R hasarı tedavisinde oksijen radikali tutucuları, antioksidanlar, Ca+2 kanal blokörleri, Na+/H+ pompa inhibitörleri, Na+/Ca+2 pompa inhibitörleri, trombosit inhibitörleri, endotelin-1 inhbitörleri, NO donörleri, magnezyum, trimetezidin, statinler, kontraktilite inhibitörleri, kompleman sistem inhibitörleri, apoptoz yolağını modifiye eden büyüme faktörleri kullanılmakta veya denenmekte olan ilaç gruplarıdır. Bu ajanların bir bölümü tedaviye de girmiştir (108,169,175). Ayrıca kısa süreli tekrarlanan iskemi periyodlarının kalbi daha uzun süreli iskemiye karşı koruması olarak bilinen iskemik önkoşullama kavramı ortaya atıldıktan ve mekanizması aydınlatılmaya başlandıktan sonra kalbin iskemiye karşı “önkoşullama mimetikleri” de denilen farmakolojik ajanlarla korunması gündeme gelmiştir. Kısa süreli iskemi periyodları esnasında miyositler ve endotel hücreleri tarafından adenozin, bradikinin ve opioid peptidler gibi çeşitli maddelerin salıverilmesi önkoşullamayı tetiklemektedir. Bu maddeler A1, A3, B2 ve δ1 reseptörleri üzerinden etkili olurlar ve iskemiye karşı koruyucu etkilerinden son-efektör (end-effector) olarak tanımlanmış olan ATP’ye duyarlı potasyum (KATP) kanalları sorumludur. Bu reseptörleri ve KATP kanalını aktive eden farmakolojik ajanlar da iskemi öncesinde uygulandıklarında kardiyoprotektif etki gösterirler (175). Adenozin reseptör agonistleri A1 ve A3, reseptörleri üzerinden önkoşullayıcı 25 etkilerini oluştururlar. Ayrıca A2 reseptörlerinin de nötrofil fonksiyonu ve serbest radikal oluşumu üzerinde inhibitör etkili olduğu düşünülmektedir (108,175). Anjiyotensin dönüştürücü enzim (ADE) inhibitörleri endojen bradikinin metabolizmasını inhibe ederek bazal bradikinin konsantrasyonunu artırabilir ve bradikinin üzerinden kardiyoprotektif etki gösterebilirler (175). ADE inhibitörleri ile yapılan klinik çalışmaların infarkt alanı ve reperfüzyon aritmileri üzerinde olumlu etkileri bildirilmiştir (108). 1.2.2 İskemik ve farmakolojik önkoşullama Murry ve arkadaşları (114) kısa süreli iskemi periyodlarının kalbin ATP rezervini azaltmadığı ve nekroz oluşturmadığı yönündeki gözlemleri sonucunda kısa süreli iskemi periyodlarının kalp üzerinde koruyucu etkisi olabileceği varsayımını geliştirmişlerdir. Bu varsayımlarını kanıtlamak üzere köpeklerde yaptıkları deneyde dört kez beşer dakikalık koroner oklüzyon ve reperfüzyon periyodunu takiben uygulanan 40 dakikalık iskemi sonrasında sadece 40 dakika iskemi uygulanan grupla karşılaştırıldığında kalplerin infarkt alanlarında azalma olduğu ve kısa süreli iskemi ve reperfüzyon periyodu uygulanmış kalplerin kontrol kalplerinden hemodinamik açıdan fark göstermediğini gözlemlemişlerdir. Bu gözlemler araştırmacıların deyimi ile “önkoşullama” olarak adlandırılmıştır (114). Subletal bir iskemi periyodunun, daha sonra oluşan bir iskemik hasar esnasında hücreleri infarkttan koruması “iskemik önkoşullama” olarak adlandırılmaktadır. İskemik önkoşullamanın iki tip koruyuculuğa aracılık ettiği bilinmektedir: 26 1. Önkoşullayıcı iskemiden sonra ortaya çıkan ve yaklaşık iki saat kadar süren klasik formu, 2. Önkoşullayıcı iskemiden bir gün kadar sonra tekrar ortaya çıkan ve yaklaşık 3 gün kadar süren geç formu (önkoşullamanın ikinci penceresi). Her iki önkoşullama tipi de benzer özellikler göstermektedir. Önkoşullayıcı nitelikteki iskemi çeşitli otakoidlerin salıverilmesine ve hücre yüzeyindeki reseptörlerin aktivasyonu sonucunda korumanın tetiklenmesine neden olur. Reseptör aktivasyonu kompleks sinyal yolaklarının aktivasyonuna neden olarak letal iskemi (indeks iskemisi) esnasında bir ya da daha fazla son-efektörün korumaya aracılık etmesini sağlar (176). Farklı birçok farmakolojik ajanın farklı noktalarda sinyal yolaklarını aktive ettiği ve böylece önkoşullamayı taklit ettiği gözlemlenmiştir (70). Bu gözlemler iskemik önkoşullamanın sağladığı etkileyici korumanın terapötik ajanlarla da sağlanabileceği düşüncesini oluşturmuştur (73,176). Adenozin, adenozin agonistleri ve opioidler ile önkoşullama oluşturulabildiği bilinmektedir. Kalp ameliyatlarında kullanılan anesteziklerin de önkoşullayıcı etkileri olan farmakolojik ajanlar olabileceği gösterilmiştir. Fonksiyonel iyileşme ve infarkt alanı sınırlandırma açısından halotan, izofluran, sevofluran ve dezfluran gibi inhalasyon anesteziklerinin fentanil, propofol ve pentobarbital gibi intravenöz anesteziklerden daha etkili olduğu düşünülmektedir. Anestezikler ile oluşan önkoşullama cevabı opioid ve adenozin reseptörleri ile KATP kanalları üzerinden gelişir (73,185). Anesteziklerin önkoşullayıcı etkileri deneysel çalışmalar planlanırken dikkate alınmalıdır. 27 Ayrıca, daha sonraki bölümlerde ayrıntılı olarak açıklandığı gibi, önkoşullama yanıtında tetikleyici, mediyatör ve son-efektör olmaları nedeniyle KATP kanallarının açıcıları farmakolojik önkoşullayıcı ajanlar olarak kabul edilmektedir (47,73). levosimendan KATP önkoşullama kanalları üzerindeki mimetikleri arasında aktivitesi nedeniyle araştırılmakta olan bileşiklerdendir. 1.2.2.1 Klasik önkoşullama Çalışmalarda kullanılan bütün hayvan türlerinde ve insanlarda iskemik önkoşullama olduğu gösterilmiştir. Korumanın ölçüsü açısından, letal iskemik hasar 3 saate kadar uzarsa önkoşullamanın oluşturduğu korumanın kaybedildiği (114) ve indeks iskemisi sonrasında reperfüzyonun kesin olarak gerektiği göz önünde tutulmalıdır. Başka bir deyişle, iskemik önkoşullama hücre ölümünü önlemekten çok geciktirmektedir. Önkoşullamanın tetiklenmesi için gerekli iskeminin süresi en az 30 saniye ile 1 dakika arasında olmalıdır (3). Her ne kadar ilk başlarda iskemik önkoşullamanın “hep ya da hiç” şeklinde bir cevap olduğu düşünülse de kısa süreli iskeminin meydana getirdiği koruyuculuğun dereceli olduğu ve iskemi süresi ile ilişkili olduğu gösterilmiştir (11). İskemi süresi ve koruyuculuk arasındaki doz-yanıt eğrisi oldukça diktir ve bir kez maksimum koruyuculuğu oluşturan iskemi süresine erişildiğinde sürenin uzatılması ek bir yarar sağlamamaktadır (176). Kimi çalışmalarda iskemik önkoşullamanın bu özelliği kullanılarak tek başına önkoşullama oluşturmaya yetmeyecek kadar kısa süreli iskemi bir önkoşullayıcı farmakolojik ajan ile birlikte kullanılmakta ve koruyucu etkinlik bu şekilde oluşturulmaktadır (47). 28 Önkoşullama kullanılmaktadır. çalışmalarında Önkoşullamanın farklı koruyucu değerlendirme etkinliğinin orijinal ölçütleri olarak tanımlandığı infarkt büyüklüğünün sınırlandırılması ölçütü halen kullanılmakta olan ve test edilen bütün türlerde önkoşullama sonrasında görülmüş olan ortak kriterdir. Miyokardiyal sersemleme önkoşullama çalışmalarında kullanılan bir değerlendirme ölçütü olmakla birlikte klasik önkoşullamanın sersemlemeyi engelleyip engellemediği konusu kesin olarak açıklık kazanmamıştır. Genel olarak klasik önkoşullamanın sersemlemeyi engelleyici yöndeki etkisinin zayıf olduğu fakat geç önkoşullamanın bu etkisinin daha fazla olduğu kabul edilmektedir. İskemi sonrasında mekanik fonksiyonların iyileşmesi sıçan çalışmalarında çok kullanılmakta olan bir parametredir. Bununla birlikte iskemik önkoşullama sonrasında mekanik iyileşmenin diğer türlerde sıçanlara nazaran daha az olduğu öne sürülmüştür (150). Sıçan kalbinde ksantin oksidaz miktarının yüksek olmasının sıçan kalplerinin sersemleme etkisine daha yatkın olması ile sonuçlandığı ve bu nedenle önkoşullamanın koruyucu etkinliğinin sıçanlarda mekanik açıdan daha fazla olduğu düşünülmektedir (39). İskemik önkoşullamanın iskemi ve reperfüzyon kaynaklı aritmilerin insidansını azalttığı sıçan ve köpeklerde (168) gösterilmekle birlikte diğer türlerde önkoşullamanın aritmiler üzerindeki etkisinin çok az olduğu hatta aritmileri artırma eğilimi olduğu ileri sürülmektedir. İnsanlarda yapılan çalışmalarda koroner anjiyoplastide balonun ikinci kez şişirilmesi esnasında S-T segmenti yükselmesinin daha az olduğu gözlemlenmiştir ve insan çalışmalarında bu etki değerlendirme ölçütü olarak kullanılmaktadır (176). 29 İskemik önkoşullama yanıtında yukarıda açıklandığı gibi türe bağlı farklılıklar olabildiği gibi cinsiyete bağlı farklılıklar da görülmektedir. İ/R hasarı gibi akut hasar durumlarına karşı dişilerin erkeklere göre avantajlı oldukları bilinmektedir. İskemik önkoşullama yanıtında da mitokondriyal ATP’ye duyarlı potasyum kanalı (mitoKATP), ısı şok proteinleri, reaktif oksijen türleri veya p38 mitojen aktive protein kinaz (MAPK) aracılı cinsiyete bağımlı değişiklikler olabilir. Ayrıca dişi cinsiyetin önkoşullama eşiğinin daha yüksek olduğu da bilinmektedir (137). Klasik önkoşullama sadece kalpte değil, iskelet kası (1,4) ve böbrek (4,17) gibi başka organlarda da gösterilmiştir. Ayrıca kalbin bir bölgesinin önkoşullayıcı iskemiye maruz bırakılmasının kalbin diğer bölgelerini de indeks iskemiye karşı koruduğu ve benzer şekilde vücudun bir bölgesinde yapılan önkoşullama uygulamasının uzak bir başka bölgesini de koruyabildiği gösterilmiştir (139). Bu kavram “uzaktan önkoşullama (remote preconditioning)” olarak adlandırılmaktadır (4,29). 1.2.2.1.1 Klasik önkoşullamanın tetikleyicileri Kısa süreli iskemi esnasında kalp adenozin, bradikinin, opioidler ve norepinefrin salıvermektedir. Bu maddelerin reseptörleri Gi proteini aracılığı ile önkoşullamayı tetiklemektedir. İlk olarak adenozin A1 resepörlerinin önkoşullamayı tetiklediği gösterilmiştir (95) ve şu anki bilgilerimize göre Gi ile kenetli reseptörleri aktive eden bütün maddeler önkoşullama oluşturabilir. Bir tek reseptör tipinin blokajı koruyucu etkiyi ortadan kaldıramadığından birkaç reseptör tipinin birlikte önkoşullama yanıtına katıldığı düşünülmektedir (176). Adenozin A1 ve A3 reseptörleri, opioid reseptörlerin δ alttipi ve bradikinin 30 reseptörlerinin önkoşullamayı tetikledikleri düşünülmektedir (30). Kardiyak miyositler bunlardan başka anjiyotensin AT1, endotelin ET1 ve muskarinik reseptörler gibi Gi ile kenetli reseptörleri de eksprese etmektedir. Ancak iskemik miyokardda bu reseptörlerin agonistleri üretilmediğinden bu reseptörlerin önkoşullamada tetikleyici rol oynuyor olmaları uzak bir olasılıktır (29,176). Reseptör aracılı mekanizmalar dışında serbest radikallerin, kısa süreli geçici Ca+2 yükselmesinin, kısa süreli hiperterminin, miyokardiyal fibrillerin gerilmesinin, kısa süreli etanol maruziyetinin, hipoksinin ve kalbin dışarıdan uyarılmasının (pacing) da önkoşullamanın tetikleyici mekanizmaları arasında olabileceği ileri sürülmektedir (30,176). Serbest radikal tutucuları ile tedavinin önkoşullama eşiğini artırdığı, buna karşın serbest radikal üreten maddelere maruziyetin önkoşullama oluşturduğu gösterilmiştir (10,160). Serbest radikallerin tetikleyici mekanizmada yer aldıkları fikri kabul görmektedir. Kısa süreli Ca+2 artışları da protein kinaz C (PKC)’ye bağımlı olarak önkoşullama oluşturmaktadır (107). Tetikleyici mekanizmalar arasında sayılan NO’in klasik önkoşullamadaki rolü ise araştırmacılar tarafından sınırlı ya da şüpheli olarak nitelenmektedir. NO’in kendisi tetikleyici olmasa bile önkoşullama eşiğini düşürdüğü bilinmektedir. NO hakkındaki genel düşünce bu maddenin korumanın mediyatörleri arasında olduğu yönündedir (176). 1.2.2.1.2 Klasik önkoşullamanın mediyatörleri PKC, tirozin kinaz, MAPK ve fosfatidil inozitol 3-kinaz (PI-3 kinaz)’ın klasik önkoşullamanın sinyal iletim düşünülmektedir. 31 yolakları içerisinde oldukları PKC blokajının önkoşullamanın koruyucu etkisini yok ettiği fakat önkoşullama uygulanmamış kalplerde herhangi bir etkisinin olmadığı gösterilmiştir (106). PKC’nin ε, δ ve α izoformlarının önkoşullamanın koruyucu etkisinden sorumlu olduğu öne sürülmüştür, fakat hücre içi hedefleri henüz belirlenememiştir. PKC’nin kinaz aktivitesi önkoşullama esnasında bloke edildiğinde kalp yine de korunmuş duruma geçmekte fakat indeks iskemi esnasında PKC aktivitesinin inhibisyonu korunmayı engellemektedir. Benzer şekilde adenozinin oluşturduğu önkoşullamanın PKC inhibitörleri ile bloke edilebildiği fakat PKC aktivatörleri ile koruma oluşan kalpte adenozin reseptör blokörlerinin korumayı engelleyemediği gösterilmiştir (58). Bu bulgular önkoşullamanın mekanizma basamaklarında PKC’nin adenozinden sonra geldiğini ve bir mediyatör olduğunu göstermektedir (30,176). Tirozin kinaz mekanizmasında düşündürmüştür. en inhibitörleri ile yapılan çalışmalar azından bir tirozin kinazın Tirozin kinazın önkoşullama önkoşullama rolü olduğunu mekanizmasının basamaklarında PKC’den sonra yer alabileceğini öneren bulgular olduğu gibi bu iki kinazın yeterli derecede uyarıldıklarında kendi başlarına ayrı ayrı önkoşullama oluşturabilecekleri de ileri sürülmektedir (176). MAPK ile ilgili bulgular ise daha çelişkilidir ve kesinlik kazanmamıştır. 38kDa stres ile aktive MAPK (p38 MAPK), 42/44-kDa ektraselüler reseptör kinaz (ERK) ve 46/54-kDa c-jun kinaz (JNK) gibi MAPK ailesinin her bir alt üyesinin önkoşullamadan sorumlu olabileceğini öneren çalışmalar bulunmaktadır (29,176). 32 PI-3 kinazın ise önkoşullamanın sinyal iletim sisteminin hangi basamağında yer aldığı bilinmemekle birlikte klasik önkoşullamada rolü olduğu yönünde veriler mevcuttur (176). 1.2.2.1.3 KATP kanalları KATP kanallarının kalbin korunmasında önemli rol oynadığı bilinmektedir ve iskemik önkoşullamadaki anahtar rolleri ilk kez Gross ve arkadaşları tarafından gösterilmiştir (44). Bu kanallar fizyolojik konsantrasyonlardaki ATP ile inhibe olurlar. Düzenlenmelerinde ise pH, yağ asitleri, NO, SH-redoks durumu, çeşitli nükleotidler, G proteinleri ve çeşitli ligandlar rol oynar. KATP kanal açıcılarının önkoşullamayı taklit ettikleri ve blokörlerinin önkoşullamanın koruyucu etkisini yok ettiği gösterilmiştir (44). A1 reseptör uyarılması ile oluşturulan koruma KATP kanal blokörleri ile inhibe olduğundan KATP kanal aktivasyonunun önkoşullama mekanizmasının basamaklarında reseptör aktivasyonundan sonra geldiğini yani başka bir deyişle KATP kanallarının adenozin önkoşullama yanıtında mediyatör rol oynadığını göstermiştir (176). Kardiyomiyositlerde farklı farmakolojik profilleri olan iki tip KATP kanalı bulunur: sarkolemmal (yüzey) ve mitoKATP kanalı. Her iki tip kanalın da içe yönelik doğrultucu K+ kanalı (Kir) ve sülfonilüre bağlayıcı protein (Sur) alt ünitelerinden meydana geldiği bilinmektedir. Bununla birlikte iki kanal tipinin farmakolojik profilleri değişiktir. mitoKATP kanalları 5-hidroksidekanoat (5-HD) tarafından inhibe edilirken sarkolemmal kanallar bu maddeden etkilenmemektedir. Diazoksitin mitokondriyal kanallar için potentliği daha yüksektir. Glibenklamid her iki kanalı da bloke eder. Yapılan çalışmaların 33 çoğunda elde edilen bulgular önkoşullamadan mitokondriyal kanalların sorumlu olduğu yönündedir (47,176). Mitokondri elektron transfer aparatının dışarı attığı H+ iyonunu güçlü elektrokimyasal gradiyent sayesinde tekrar mitokondri içerisine alarak ADP’nin ATP’ye fosforilasyonu ile ATP üretir. KATP kanalının açılması elektrokimyasal olarak tercih edilen yönde potasyumun mitokondriye girmesini sağlar. Mitokondri iç membranında yer alan bir K+/H+ pompası mitokondri içindeki K+ ile mitokondri dışındaki hidrojenin yer değiştirmesini sağlar. Hücre içine giren H+ teorik olarak ATP üretimine neden olmaz ve böylece ATP üretimi azalır. Hücre içine giren K+ ozmotik olarak aktiftir ve mitokondrilerin şişmesine neden olur. mitoKATP kanallarının açılmasının nasıl koruma oluşturduğuna yönelik birkaç teori vardır. mitoKATP kanallarının açılmasının izole mitokondrileri Ca+2 girişine karşı dirençli hale getirdiği gösterilmiştir (55). K+ girişi sonucu oluşan mitokondriyal şişmenin dış membranda mitokondriyal kreatin kinaz ve adenin nükleotid translokaz arasındaki fonksiyonel bağlanmayı koruduğu öne sürülmüştür ve ADP bu şekilde membran içine alınmaktadır (25,83). Bu güne kadar yapılan çalışmalardan elde edilen verilerin çoğunluğu KATP kanallarının iskemik önkoşullamanın hem tetikleyicisi hem de mediyatörü olduğu yönündedir. Kanal açılması kinaz kaskadını aktive ederek pozitif geribildirim mekanizması ile indeks iskemi esnasında kanalın açık kalmasını sağlıyor olabilir ve bu şekilde KATP kanalları hem tetikleyici hem de mediyatör olarak ikili bir rol oynayabilir. Reseptör aktivasyonu mitoKATP kanallarını açarak ve mitokondrinin reaktif oksijen türleri üretmesine neden olabilir, böylece serbest radikaller kinazları aktive ederek son-efektörü modüle edebilir (176). 34 Serbest radikallerin önkoşullamanın sinyal yolağına katılması önkoşullama ile ilgili bir noktayı daha açıklamaktadır. Koroner oklüzyon esnasında salıverilen agonistler reseptörlerini aktive ederek mitoKATP kanallarını açarlar. Bununla birlikte reperfüzyon sağlanana kadar serbest radikal üretiminde büyük artışlar meydana gelmez ve sinyal yolağı tamamlanamaz. Bu nedenle önkoşullama oluşabilmesi için oklüzyonu takiben reperfüzyon sağlanması gerekmektedir. Şekil 1 klasik iskemik önkoşullamanın sinyal yolaklarını özetlemektedir (176). Şekil 1: Klasik önkoşullamanın tetikleyicileri ve mediyatörleri K(ATP), ATP’ye duyarlı potasyum kanalı; MPTP, mitokondriyal permeabilite geçiş poru; PI 3 kinaz, fosfatidil inozitol 3 kinaz; PKC, protein kinaz C; PLC, fosfolipaz C; PLD, fosfolipaz D; TK, tirozin kinaz. 1.2.2.1.4 Klasik önkoşullamanın olası son-efektörleri Yapılan bütün çalışmalara rağmen önkoşullama sonucunda hücrenin nasıl korunduğu halen bilinmemektedir. Murry ve arkadaşlarının (114) öne 35 sürdüğü ilk teori önkoşullanmış iskemik miyokardın enerji dengesinin korunduğu yönündedir fakat mekanizma tam olarak bu şekilde olmayabilir. Son-efektörlerin indeks iskemi esnasında etkili olması gerektiği düşünülür. mitoKATP kanalının indeks iskemi sırasında tekrar açılması gerektiği gözlemlendiğinden bu kanallar önkoşullamanın son-efektörleri olarak en güçlü adaylar arasındadır. mitoKATP kanalının açılmasının mitokondriyi Ca+2 yüklemesine karşı dirençli hale getirdiği ve mitokondriyal permeabilite geçiş porunun (MPTP) açılmasını engellediği ve bu şekilde koruyucu etkinlik gösterdiği düşünülmektedir (176). Reperfüzyon sırasında serbest radikal oluşumu ve hücre içi Ca+2 miktarının artmasının adenin nükleotid translokazın mitokondri membranındaki büyük çaplı bir porun açılmasına neden olduğu öne sürülmüştür. Bu por, mitokondri fonksiyonunu bozar ve yabancı maddelerin matrikse girmesine neden olarak mitokondrinin hasarlanmasına ve hücre ölümüne neden olur. MPTP’nin kapanmasının önkoşullama yanıtının oluşmasında etkili olduğu düşünülmektedir (38). Na+/H+ pompasının iskemideki rolü bilinmektedir ve bu pompanın inhibisyonu iskemik kalbin korunmasında en etkili yollardan biridir. Önkoşullanmış kalplerde bu pompanın reperfüzyon süresince kapalı olduğu gösterilmiştir. Selektif Na+/H+ pompası inhibitörlerinin iskemik önkoşullama uygulanmayan kalplerde de koruma oluşturduğu, iskemik önkoşullama ile birlikte inhibitör uygulamasının ise ek bir fayda sağlamadığı bildirilmiştir. Bu son veri Na+/H+ pompası inhibitörleri ile iskemik önkoşullamanın ortak mekanizmaya sahip olduğuna işaret etmektedir. Bu konu ile ilgili tek çelişkili 36 nokta önkoşullamada anahtar rolü bulunan PKC’nin pompayı inhibe değil aktive etmesidir (176). Hücreler ozmotik denge halindedir. Denge, hücre içindeki proteinlerin ve nükleotidlerin ozmotik çekim gücüne karşı hücre dışındaki Na+ tarafından sağlanmaktadır. Sarkolemmanın Na+ geçirgenliği az olduğundan ekstraselüler Na+ efektif bir dengeleyicidir. İskemi esnasında ATP, AMP ve iki inorganik fosfata yıkılarak nükleotidlerin ozmotik çekim gücünü üç katına çıkarır. Na+/H+ pompalarındaki bozukluk da sodyumun hücre içine sızmasına neden olarak yaşamsal Na+ gradientinin tamamen bozulmasına neden olur. Reperüzyon sağlanmış miyokardda membran bozukluğu ve hücre ölümünün nedeninin ozmotik şişme olduğu gösterilmiştir. İskemi esnasında suyun hücre içine girmesi ekstraselüler alanın konsantre olmasına yol açarak şişmeyi sınırlandırır. Reperfüzyonla birlikte ekstraselüler sıvı izotonik hale gelerek şişme artar. İskemi ile önkoşullanan kalplerde miyokardiyal ödem oluşumunun az olduğu gözlemlenmiştir. Eğer Na+/H+ pompasının son-efektör olduğu düşünülürse bu pompanın etkilerini hücre şişmesinin engellenmesi üzerinden gösteriyor olması olasıdır (176). Önkoşullamanın koruyucu etkisi hücre iskeletinin modifikasyonu ile hücrelerin şişmeye karşı dirençli hale geliyor olması yolu ile de oluşabilir. İskemik miyositlerin ozmotik yırtılmaya daha duyarlı oldukları ve önkoşullanmış miyositlerin ozmotik kırılganlığının azaldığı gösterilmiştir (176). Aşırı kontraktil aktivasyon (hiperkontraktür) hücre ölümünde önemli rol oynar ve kontraktilitenin inhibisyonunun sarkolemmal yırtılmayı azalttığı, sitoskeletal kırılganlıkla ilişkili olduğu bilinmektedir (38). 37 İ/R hasarının apoptozu tetikleyerek doku kaybına neden olduğu bilinmektedir. MAPK’ların antiapoptotik etkileri sonucu önkoşullama apoptozu engelliyor olabilir. Bununla birlikte protein sentezi tamamen inhibe edilse bile hücrelerin saatlerce yaşayabildikleri bilinmektedir fakat reperfüzyonun ikinci saatinde hücre ölümü gerçekleşmektedir. Bu nedenle önkoşullamanın antiapoptotik etkilerinin son-efektör rolünün olduğunun ileri sürülmesi çok doğru olmayabilir (176). Kalp hücreleri arasında düşük rezistanslı kanallar olan tünel bağlantılar (gap junction) üzerinden nekrozun bir hücreden diğerine geçerek yayıldığı düşünülmektedir. Önkoşullama bu kanalların kapanmasını sağlayarak koruyucu etki oluşturuyor olabilir. Fakat bu kanallar ile ilgili çalışmaların sonuçları kesin bir yargıya varmak için yeterli değildir (38). Tümör nekroz faktörü-α (TNF-α)’nın iskemik hücre ölümüne neden olduğu düşünülmektedir. Önkoşullama sonrasında TNF-α seviyelerinin düştüğü bildirilmiştir, bundan yola çıkarak TNF-α’nın bir son-efektör olduğu söylenebilir. İlginç olarak TNF-α aynı zamanda önkoşullamanın tetikleyicileri arasında da sayılmaktadır (176). 1.2.2.2 İnsan miyokardında önkoşullama Hayvanlardan elde edilen veriler önkoşullamanın önemi ve gücünü ortaya koyduktan sonra bu fenomenin insanlarda meydana gelip gelmediği sorusu gündeme gelmiştir. Etik açıdan kısıtlamaları olması nedeniyle insan çalışmaları, insan ventriküler miyositleri, atriyal trabekül çalışmaları ve doğal olarak iskemik sendrom yaşamakta olan hastalarda yürütülmüştür. Buna ek 38 olarak kısa iskemi periyodlarını içeren PTCA ve KABG ameliyatları da önkoşullama çalışmalarında kullanılmıştır (176). İn vitro çalışmalarda insan ventriküler hücre kültürlerinde önkoşullama oluştuğu ve bu olayda adenozin ve PKC’nin tetikleyici ve sinyal yolağı elemanı olarak rol oynadığı bulunmuştur. KABG ameliyatına giren hastalardan elde edilen atriyal trabeküllerde yapılan çalışmalarda A1, A3 ve δ-opioid reseptörlerin aracılık ettiği önkoşullama yanıtı oluşturulmuştur. PKC ve KATP kanallarının insan kasında korumaya aracılık ettiği gözlemlenmiştir (149). İnsan sağ atriyal kasından alınan dokularla yapılan bir diğer çalışmada hem iskemik hem de farmakolojik önkoşullamanın mümkün olduğu görülmüştür (41). İn vivo çalışmalar 3 başlık altında incelenebilir: 1. Egzersiz ile indüklenen önkoşullama, 2. İnfarktüs öncesi anjina, anjiyoplasti çalışmaları, 3. Cerrahi çalışmalar. Hastaların bir kısmının anjina gelişene kadar egzersiz yaptıktan sonra dinlendiklerinde tekrar egzersize başlamalarının çok az semptom oluşturduğu bilinmektedir. Egzersizin ikinci bölümü incelendiğinde anjina şiddetinin ve S-T segment depresyonunun azaldığı gözlemlenmiştir (163). Bu tarz bir etkinin ilk egzersizin yapılmasından 1-2 saat sonrasına kadar devam ettiği ve klasik önkoşullamanın zamanlamasına uyduğu belirlenmiştir. Bununla birlikte iki durum arasında adenozin reseptörleri ve KATP kanallarının etkileri açısından çeşitli farklılıklar gözlenmiştir. Bu nedenle tekrarlanan egzersizle gözlenen bu adaptasyonun önkoşullamayı tam olarak bilinmemektedir (70,176). 39 temsil edip edemeyeceği Birçok hasta akut miyokard infarktüsü öncesinde kısa süreli iskemiye maruz kalır. Teoride eğer infarkt ile ilişkili olan arter tekrar perfüze olursa bu durumun önkoşullamaya benzer koruyucu etkileri olabileceği düşünülebilir. Tıkalı arterin açılarak reperfüzyonun yeniden sağlanması klinikte her zaman oluşmadığından bu durum ile ilgili veriler çelişkilidir. Trombolitiklerin kullanıldığı çalışmaların sonuçları incelendiğinde infarkt öncesi anjinası olan hastaların infarkt alanlarının daha az olduğu, sol ventrikül fonksiyonlarının daha iyi olduğu, KKY insidansının ve mortalitenin az olduğu görülmüştür (74,75). Akut miyokard infarktüsü öncesinde anjina gelişmesinin infarkt alanı sınırlandırdığı da belirtilmektedir (120). Hastalarda gözlemlenen bu tür adaptasyonların iskemik önkoşullama ile aynı mekanizmayı taşıyıp taşımadığı bilinmemekle birlikte, olayların zamanlaması geç önkoşullamanın koruma periyodu ile benzerlik göstermektedir. Ancak bu alandaki bazı çalışmaların sonuçları ise olumsuz yönde olmuştur (30,72,176). Koroner anjiyoplasti uygulaması, tekrarlanan intrakoroner balon şişirilmesi ve aralarda reperfüzyona izin verilmesi ile gerçekleştirilen bir prosedür olması nedeniyle insan miyokardının kontrollü kısa süreli iskemi ve reperfüzyona yanıtının incelenmesi açısından çok değerli olmuştur. İskemik önkoşullama ile ilgili ilk klinik çalışmada koroner arter anjiyoplasti esnasında 2 kez ard arda 90 saniyelik koroner oklüzyon oluşturulmuş ve ikinci iskemi periyodunun göğüste daha az ağrı oluşturduğu ve S-T segment yükselmesinin daha az olduğu ve hastaların miyokardiyal laktat üretiminin daha az olduğu gösterilmiştir şişirilmesinden (23). sonra Çalışmaların göğüs çoğunda ağrısının 60-90 şiddeti, saniyelik sol ilk balon ventriküler duvar hareketlerindeki anormallikler, S-T segment yükselmesi, Q-T dispersiyonu 40 (yayılması), ventriküler ektopik aktivite ve CK-MB gibi miyokardiyal enzimlerin salıverilmesi gibi miyokardiyal iskemi belirtilerinin azaldığı görülmüş ve ilk iskemiden sonra miyokardda adaptasyon oluştuğu düşünülmüştür. PTCA esnasında meydana gelen bu hızlı koruma incelendiğinde etkinin glibenklamid ve adenozin reseptör antagonizması ile engellendiği, PTCA öncesinde uygulanan nikorandil ve adenozin ile desteklendiği, opioid ve bradikinin reseptörlerinin de yanıtı düzenlediği gözlemlendiğinden PTCA uygulamasının önkoşullama benzeri etki oluşturduğu söylenmektedir. Yaşlılarda PTCA’nın önkoşullama benzeri etkisinin bozulduğu ileri sürülmekle birlikte fiziksel aktivite düzeyi yüksek hastalarda koruyucu etkinlik gözlenebilmektedir (30,70,72,176). İnsanlarda önkoşullama ile ilgili en net bilgiler belirli bir önkoşullama protokolü sonrasında aortik çapraz klempleme ile global iskemi oluşturulan KABG ameliyatlarından elde edilmiştir. Yellon ve arkadaşları (174) 10 dakikalık global iskemi ve VF öncesinde iki kez 3 dakikalık global iskemi ve 2 dakika reperfüzyon uygulaması ile önkoşullamanın insan kalbindeki etkilerini incelemişlerdir. Bu çalışmada da önkoşullamanın ilk kez tanımlandığı orijinal çalışmada (114) olduğu gibi önkoşullama uygulanan kalplerde ATP seviyesinin daha iyi korunduğu gözlemlenmiştir. Miyokardiyal nekrozun belirteci olarak serumda TnT ölçümü yapılan bir çalışmada önkoşullama uygulanan kalplerde nekrozun azaldığı bulunmuştur (61). Ayrıca aortik ve mitral kapakçık replasmanı ameliyatları öncesinde iskemik önkoşullama prosedürünün uygulanmasının da kardiyoprotektif etkileri olduğu ve baypas sonrası fonksiyonel iyileşmeye katkıda bulunduğu çeşitli çalışmaların sonuçları arasındadır (73). 41 Hipotermi ve kardiyopleji gibi uzun süreli iskemi esnasında kalbi korumaya yönelik stratejilerle birlikte önkoşullama uygulamasının olumlu sonuçları olabileceğine yönelik veriler mevcut olsa da bu çalışmalarda her zaman koruyucu etkinlikte artış gözlenmemiştir. Bu iki kardiyoprotektif yöntemin yararları karşılaştırıldığında araştırmaların sonuçlarının tartışmalı olduğu dikkate alınmalıdır (73). İnsan kalbinde iskemik ve farmakolojik önkoşullama uygulaması yapılan çalışmalar değerlendirilirken önkoşullama için gerekli bir eşik uyaran olduğu göz önünde bulundurulmalıdır. Nitekim farklı önkoşullayıcı iskemi protokolleri ve farklı dozlarda farmakolojik ajanlar kullanılarak yapılan çalışmalardan çelişkili sonuçlar elde edilmiştir. Farmakolojik ajanlarla önkoşullama çalışmalarında elde edilen sonuçların değişkenliği ile ilgili olarak ise tek bir reseptörün uyarılmasının in vivo olarak önkoşullamayı tetiklemeye yetmeyebileceği şeklinde bir yorum yapılmıştır (176). 1.2.2.3 Önkoşullamanın terapötik önemi İnsan miyokardında doğal iskemik sendromların bazıları sonucunda kendiliğinden önkoşullama oluşabildiği gibi yapılan bazı girişimler ile de önkoşullama meydana gelebilmektedir. İskemik kalp hastalarının terapötik önkoşullamadan yararlanabileceği alanlar olup olmadığı bu durumda akla gelen ilk soru olmalıdır. İskemik enzimlerini önkoşullama koruduğu protokollerinin ayrıca kalbin fonksiyonlarda ATP iyileşmeye rezervlerini neden ve olduğu gösterilmiş olsa da ilginç olarak iskemik önkoşullama birçok cerrah tarafından rutin klinik uygulamada halen tercih edilmemektedir. İskemik önkoşullama 42 oluşturabilmek için aortun birkaç kez geçici olarak klemplenmesi ve tekrar perfüzyona yönündeki izin verilmesinin şüpheler bazı distal cerrahlar embolizasyona neden tarafından prosedürün bu olabileceği tercih edilmemesinin ilk nedenleri arasındadır. Gerçekten de farmakolojik ajanlarla iskemik önkoşullamanın moleküler mekanizmalarının hedeflenmesi yoluyla önkoşullama oluşturulması iskemi uygulamasına gerek olmayan daha güvenli bir teknik olacaktır (73). İskemik hasarı sınırlandırmak için erken dönemde revaskülarizasyon uygulamaları tedavideki en yaygın stratejidir. Semptomların başlangıcı ile revaskülarizasyon arasında geçen süre kritiktir ve uzadıkça tedavinin faydası kısıtlanmaktadır. Önkoşullama, miyokardiyal nekrozu geciktirdiğinden revaskülarizasyon tedavilerinin uygulanabilmesi için zaman kazandırabilir. Bununla birlikte birçok durumda profilaktik olarak iskemi uygulanması mümkün değildir ve tercih edilmez. Diğer taraftan iskemik önkoşullamanın koruyucu etkilerini taklit eden farmakolojik ajanların kullanılması kalbin korunması için daha uygun bir yaklaşımdır. Adenozin, adenozin analogları, PKC agonistleri ve KATP kanal açıcıları farmakolojik önkoşullama oluşturmak için aday bileşikler olarak değerlendirilmektedir. Bununla birlikte bu ajanların ciddi hemodinamik etkileri vardır ve yararın kesin olduğu bilinmeyen durumlarda kullanılamamaktadırlar. Sonuç olarak önkoşullama mimetiklerinin kronik kullanımları sözkonusu olduğundan bu ajanların toksik olmamaları ve yan etkilerinin az olması gerekmektedir. Ayrıca etkilerine karşı taşiflaksi gelişmemelidir. Uygun farmakolojik ajanlar geliştirilebildiğinde iskemik hasara neden olmaksızın iskemik önkoşullama için gerekli olan hücresel yolakların 43 direkt aktivasyonu ile önkoşullama sağlanabilmesi tedavide tercih sebebi olacaktır (30,72,176). Stabil olmayan anjina, S-T segmenti yükselmesi olmayan miyokard infarktüsü ve S-T segmenti yükselmesi olan miyokard infarktüsü gibi patofizyolojik durumlar akut koroner sendromlar olarak adlandırılmaktadır. S-T segmenti yükselmesi olan hastaların farmakolojik önkoşullamadan yarar sağlaması düşük bir olasılıktır ve bu hastaların tedavisinde fibrinolitik tedavi ve anjiyoplasti uygulanmaktadır. Diğer taraftan S-T segment yükselmesi olmayan akut koroner sendromlu hastalarda stabil koroner arter hastalığından stabil olmayan bir duruma geçiş mevcuttur. Bu grup hastalar akut koroner oklüzyon gelişimi açısından yüksek risk altındadır ve hastaların %10’u 6 ay içerisinde miyokard infarktüsü geçirir veya ölür. Bu grup hastalara reperfüzyon stratejilerinden herhangi biri uygulanana kadar zaman kazanılması açısından farmakolojik önkoşullama uygulanabilir. İskemik atağın zamanı bilinemeyeceğinden önkoşullayıcı ajanın tekrarlanan dozları ile hastaların önkoşullanmış halde kalmaları sağlanabilir (176). KABG veya PTCA gibi hasara yol açması muhtemel iskemik prosedürlerin uygulanacağı hastalara önkoşullama uygulanması iskemik önkoşullamanın en önemli kullanım alanları arasındadır (73). Kardiyopulmoner baypastan önce uygulanan adenozinin ameliyat sonrasında hemodinamik parametreler üzerinde yararlı etkileri olduğu gösterilmiştir (171). Adenozinin kardiyopleji ile birlikte kullanıldığında yararlı etkilerinin olduğu ve kalp ameliyatları sonrasında yüksek doz inotrop kullanılması ihtiyacını azalttığı bildirilmiştir (104). Önkoşullama tetikleyicilerini potansiyalize eden ADE inhibitörleri gibi ilaçlarla yapılan çalışmalardan elde 44 edilen olumlu sonuçların önkoşullamanın koruyucu etkisinden kaynaklanıyor olması olasıdır (176). Rutin PTCA uygulamaları koroner arter oklüzyonu açısından düşük risk taşısa da (<%5) bu hastalar da önkoşullamadan yararlanabilir ya da ilk balon şişirilmesinin sağladığı koruma önkoşullama ile artırılabilir. PTCA öncesi nikorandil uygulamasının balon uygulamasına toleransı artırdığı bildirilmiştir (144). Stabil anjinalı hastalarda yapılan bir çalışmada KATP kanal açıcı nikorandil ile tedavi gören hastalardan olumlu sonuçlar alınmıştır (154). Transplant öncesi organların korunması önkoşullamanın bir başka kullanım alanı olabilir. Donör kalbin izole edilmesi ile implantasyonu arasında geçen sürenin önkoşullama tarafından artırılması sağlanarak donör ve alıcı arasında en uygun eşleşme oluşturulabilir ve erken dönemde miyokard fonksiyonlarında iyileşme sağlanabilir (72,73,176). 1.2.3 Levosimendan Levosimendan, TnC’ye yüksek bağlanma afinitesi olan, (R)-[[4-(1,4,5,6tetrahidro-4-metil-6-okso-3-piridazinil)-fenil]hidrazono]propandinitril yapısında, kapalı formülü C14H12N6O olan piridazinon-dinitril türevi kardiyotonik bir ajandır (Şekil 2). Moleküler ağırlığı 280.3 g/mol’dür. Orta derecede lipofilik özelliktedir. Zayıf asittir (pKa=6.3). Distile su ve fosfat tamponlarında çözünürlüğü azdır. Etanoldeki çözünürlüğü yüksek olduğundan ticari infüzyon preparatlarında çözücü olarak etanol kullanılmıştır (68). 45 Şekil 2: Levosimendanın kimyasal yapısı 1.2.3.1 Kalp kasının kasılma mekanizması ve levosimendanın inotrop etki mekanizması Miyosit sarkolemması depolarize olduğunda ekstraselüler Ca+2, voltaja duyarlı L-tipi Ca+2 kanallarından hücre içine girer ve miyofibrillerin kasılması için sadece bu etki yeterlidir. Buna ek olarak hücre içine Ca+2 girişi, sarkoplazmik retikulumdan sitozole daha fazla Ca+2 salıverilmesine neden olarak (Ca+2 ile indüklenen Ca+2 salıverilişi) kontraksiyonu başlatır. Çeşitli yapısal ve regülatör proteinlerin [miyozin, aktin, tropomiyozin ve troponin kompleksi- troponin C (TnC), troponin T (TnT) ve TnI] etkileşimi ile kontraksiyon gelişir (148,157). Miyozin 4 adet hafif ve 2 adet ağır zincirden oluşan helikal bir proteindir. Her ağır zincirin sonundaki aminoasit zinciri yuvarlak bir miyozin başı oluşturur. Miyozin başlarının enzimatik aktivitesi vardır ve ATP’yi ADP’ye ve serbest enerjiye dönüştürürler. Bu enerji, intraselüler magnezyum ile birlikte miyozinin aktin fibrillerine bağlanmasını sağlar. ADP aracılı aktif bölgelere bağlanan miyozin başları aktin üzerinde “yürüyerek” aktin ve miyozin fibrillerinin birbiri üzerine gelen bölgeleri arttıkça kasılmaya yol açar. ADP aracılı aktif bölgeler tropomiyozin tarafından bloke haldedir ve kasılmanın oluşabilmesi için troponin kompleksi tarafından tropomiyozinin yerinden 46 oynatılması gerekir. Troponin kompleksindeki TnI aktin fibrili için çapa görevi görür ve TnT tropomiyozine bağlanır, TnC de kalsiyuma bağlanır. Böylece troponin kompleksi tropomiyozinin ADP aracılı aktif bölgelerden ayrılmasını sağlar. TnC’nin 4 Ca+2 bağlanma bölgesine Ca+2 bağlandığı zaman proteinde konformasyonel bir değişim meydana gelerek tropomiyozinin aktin fibrildeki ADP aracılı aktif bölgelerden ayrılması sağlanır. Yukarıda söz edildiği gibi sistolde Ca+2 konsantrasyonu yüksekken TnC’de konformasyonel değişiklik oluşur, diyastolde ise Ca+2 konsantrasyonu azalınca TnC dinlenim haline geri döner ve ADP aracılı aktif bölgeler tropomiyozin tarafından tekrar bloke edilir (101). Özet olarak gevşeme esnasında sitozolik Ca+2 düşük konsantrasyonlardayken (yaklaşık 10-7 M) tropomiyozin aktin ve miyozin arasındaki etkileşimi engeller. Sitozolik Ca+2 konsantrasyonu yükseldiğinde (yaklaşık 10-5 M) kalsiyumun TnC’ye bağlanarak proteinde konformasyonel değişiklik oluşturması ile kontraksiyon başlar. Aktin miyozin ile etkileşir (çapraz köprü hareketi). TnC’ye Ca+2 bağlı olduğu sürece enerji gerektiren bu süreç tekrarlanarak (çapraz köprü siklusu) kontraktil güç üretilir (148,157). Bazal durumda Ca+2 miyofibrilleri sature etmez, bu durumda sadece tam aktivasyonun %25’i elde edilebilir. Bu aktivasyon rezervi bağlanma için uygun olan Ca+2 miktarının artırılması ile veya miyofibrilleirn Ca+2 duyarlılığının artırılması ile hareket haline dönüştürülebilir. TnI’nın fosforilasyonu ve sitozolik kalsiyumun sarkoplazmik retikuluma hızlı bir şekilde geri alınması gevşemeyi başlatır. Sitozolik kalsiyumun sarkoplazmik retikuluma geri alınması enerji gerektiren bir süreçtir ve sarkoplazmik endoplazmik retikulum kalsiyum 47 adenozin trifosfataz izoform 2 (SERCA2) aracılığı ile yapılır. Her kasılmagevşeme döngüsünde hücresel Ca+2 düzeyi aynı kalır (148,157). Kronik kalp yetmezliği gelişmiş kalpte β1 adrenoreseptörler downregüle olduğundan endojen katekolaminler pozitif inotrop etkilerini gösteremezler ve sistolde Ca+2 artışı azaldığından yukarıda açıklanan mekanizmalar aracılığı ile kasılma ve kardiyak debi azalır (101). Asidoz, hipotermi, yüksek inorganik fosfat düzeyi, sepsis, İ/R hasarı, miyokardiyal sersemleme ve konjestif kalp yetmezliğindeki artmış nörohümoral aktivasyon gibi patofizyolojik durumlarla ve β-adrenerjik stimülasyonla miyofibrillerin spesifik intraselüler Ca+2 konsantrasyonuna yanıtı azalabilir (desensitizasyon). Bunun aksine αadrenerjik reseptör uyarılması veya kalsiyum duyarlılaştırıcı ajan uygulaması ile kontraktil proteinlerin Ca+2 duyarlılığı artırılabilir (157). Kalsiyum duyarlılaştırıcı bir ilaç olan levosimendan, kalsiyumun kardiyak TnC’ye bağlanma afinitesini artırmaz. Kardiyak TnC’nin N-terminal lobuna yüksek afinite ile bağlanır ve proteinin kalsiyuma bağlı konformasyonunu stabilize ederek pozitif inotrop etkisini gösterir (32,68,148,157). Bu nedenle çapraz köprü siklusunda değişiklik olmaksızın sistolde aktin-miyozin interaksiyonu uzar. Diğer Ca+2 duyarlılaştırıcılar TnC-Ca+2 kompleksine bağlandıklarından sistolik fonksiyonu olumlu etkilerken diyasyolik fonksiyonu da bozma ihtimalleri vardır. Levosimendanın TnC’ye bağlanması sitozolik Ca+2 konsantrasyonuna bağımlıdır. Yani sistolde sitozolik Ca+2 konsantrasyonu yüksekken bağlanma artar, diyastolde Ca+2 konsantrasyonu azaldığında ise TnC’ye bağlanma durumu nispeten değişmez. Bu mekanizma miyokardiyal kontraktilite artışına ve sol ventrikül diyastol fonksiyonunda iyileşmeye neden olur. Levosimendanın diyastolik fonksiyon üzerindeki olumlu 48 etkileri köpeklerde (124), kalp yetmezliği hastalarında (60) gösterilmiştir. Levosimendan yetmezlik sonrasında hem dinlenim durumunda hem de egzersiz esnasında sistolik ve diyastolik fonksiyonu iyileştirir (152). Yine bu nedenle kalbin kontraktilitesi üzerine olan olumlu etkisini oksijen ihtiyacını artırmadan gösterir (164). Ayrıca levosimendanın sağ kalp kontraktilitesini ve performansını artırdığı yapılan diğer çalışmalarda gözlemlenmiştir (85,133,173). Pilot çalışma olarak düzenlenen bir araştırmada akut solunumsal stres sendromlu hastalarda levosimendanın pulmoner vasküler rezistansı azaltarak sağ kalp fonksiyonlarını iyileştirdiği bildirilmiştir (113). Levosimendanın inotrop etkisini belirgin aritmojenez artışı oluşturmadan göstermesinin (27,119) nedeni de pozitif inotrop etkisini sitozolik Ca+2 konsantrasyonuna bağlı olarak göstermesi olabilir. Hayvanlarda yapılan bir çalışmada oral yoldan uygulanan levosimendanın aritmi insidansını artırmadığı gösterilmiştir (89). Yakın zamanda yapılan bir başka hayvan çalışmasında da levosimendanın fosfodiesteraz (PDE) inhibitörü olan milrinona göre daha az VT, VF ve diğer aritmi tipleri (VES) oluşturduğu bildirilmiştir (126). Hastalarda levosimendan uygulamasının ventriküler artirmileri belirgin bir şekilde artırmadığı bildirilmiştir (94). Klinik bulgular standart levosimendan infüzyonunun VT oluşumunu, frekansını ve QT intervalini artırmadığı yönündedir (155). Levosimendanın ortalama olarak ventriküler monofazik aksiyon potansiyeli süresini %50 ve repolarizasyon seviyesini % 90 oranında artırdığı, kalp hızını dakikada 9 atım artırdığı ve sinüs düğümü toparlanma zamanını (recovery time) kısalttığı belirtilmektedir. Levosimendanın hangi 49 mekanizma ile kalp hızını artırdığı bilinmemekle birlikte vazodilatasyon sonucu baroreseptör aracılı taşikardinin bu etkiden sorumlu olması muhtemeldir (51). Ayrıca levosimendanın atriyoventriküler düğümde (40-63 ms), atriyumda (22-33 ms) ve ventrikülde (5-9 ms) efektif refrakter periyodu kısalttığı bildirimiştir (155). Bu bulgular kısa süreli levosimendan uygulamasının kardiyak nodal dokuda impuls oluşumunu ve iletimini indüklediği ve miyokardda eksitabiliteyi artırdığı ve ventriküler repolarizasyonu geciktirebileceğini göstermektedir (7). Günümüzde levosimendanın kardiyak aritmiye yol açma riskinin yüksek olmadığına inanılsa da (94,146,155) bazı klinik çalışmalarda levosimendanın plaseboya göre daha fazla VT oluşturduğu (122) fakat levosimendanın aritmi insidansının dobutaminden farklı olmadığı (102) bildirilmiştir. Geniş çaplı klinik araştırmaların sonuçları levosimendan infüzyonunun atriyal fibrilasyon riskini artırdığını göstermektedir (102,122). Levosimendanın kardiyak aritmi oluşturma potansiyeli ile ilgili kesin bir yargıya varılabilmesi için araştırmaların devam etmesi gerekmektedir. 1.2.3.2 Levosimendanın fosfodiesteraz enzimi üzerine etkileri Levosimendan aynı zamanda, selektif bir PDE III inhibitörüdür. Yüksek dozda kullanıldığında bu etkisinin pozitif inotrop özelliğine katkısının bulunduğu düşünülmektedir. Çeşitli konsantrasyonlarda levosimendan ile yapılan çalışmalar, bileşiğin, düşük konsantrasyonlarda Ca+2 duyarlılaştırıcı (91), buna karşın yüksek konsantrasyonlarda PDE III inhibitörü (28) etkisi olduğunu göstermiştir. Levosimendanın, yüksek konsantrasyonlarda kullanıldığı deneysel çalışmalar dışında, PDE III inhibe edici etkisi belirgin 50 değildir, bu nedenle intraselüler Ca+2 artışına neden olmaz. Terapötik konsantrasyonlarına yakın konsantrasyonlarda, kobay izole ventriküler miyositlerinde yapılan bir çalışmada levosimendanın pozitif inotropik etki oluşturan konsantrasyonlarda kardiyak hücrelere Ca+2 akımını artırmadığı gösterilmiştir (84). Ayrıca pozitif inotrop etkisini protein kinaz A ve protein kinaz G aktivasyonu ile oluşturmadığı da bildirilmiştir (49). İzole normoksik kobay kalplerinde 0.03 µM levosimendanın siklik adenozin monofosfat (cAMP) düzeyini artırmadığı, ilaç konsantrasyonu 0.1 veya 0.3 µM’a yükseltildiğinde ise cAMP miktarında yükselme gözlendiği bildirilmiştir (28). İskemik kobay kalplerinde ise 0.03 µM levosimendanın cAMP düzeyini artırdığı belirtilerek iskeminin levosimendanın PDE inhibitör etkinliğini artırıyor olabileceği öne sürülmüştür (27). İzole kobay kalplerinde yapılan bir başka çalışmada 0.3 µM levosimendan uygulamasının normoksik ve iskemik kalpler arasında cAMP miktarı açısından bir fark oluşturmadığı bildirilmiştir (81). Ancak kobay ventriküler kardiyomiyositlerinde 1 ve 100 µM gibi yüksek konsantrasyonlarda kullanılan levosimendan cAMP miktarını artırmıştır ve bu etkinin ilacın PDE III enzimini inhibe etmesine bağlı olarak oluştuğu gösterilmiştir (14). Yakın tarihli, domuzlarda yapılan bir çalışmada ise günde iki kez 0.08 mg/kg oral levosimendan uygulanmış ve koroner arter ligasyonu öncesinde bolus levosimendan enjeksiyonunu takiben sürekli levosimendan infüzyonu uygulamasının iskemik olmayan dokuda cAMP düzeyini artırmadığı buna karşılık hem kontrol hem levosimendan tedavisi gören hayvanların iskemik dokularında cAMP miktarlarının arttığı gösterilmiştir (26). 51 1.2.3.3 KATP kanal açıcı olarak levosimendan Levosimendanın sıçan ventriküler hücreleri (181) ve sıçan arteriyel miyositlerinde (180) KATP kanallarını açıcı etkisi olduğu da bildirilmiştir. Karaciğer ve kardiyak miyositlerdeki mitokondriyal KATP kanallarını açtığı bilinmektedir (77,78). Böylece, hem inotrop etkili olması hem de KATP kanallarını açarak vazodilatör etki oluşturması nedeniyle inodilatör olarak isimlendirilmektedir. Levosimendanın sistemik ve pulmoner arter rezistansını azalttığı (147) ve koroner akımı artırdığı (105,182) ve koroner akım üzerindeki bu etkilerine KATP kanallarının aracılık ettiği (63) de bildirilmiştir. Levosimendanın damarlar üzerindeki etkileri Bölüm 1.2.3.8’de ayrıntılı olarak incelenecektir. Levosimendanın KATP kanal açıcı etkisi ilacın iskemiye karşı koruyucu etkileri olmasını da sağlamaktadır (27). Kardiyak miyositlerdeki mitokondriyal KATP kanallarınının açılması kadiyoprotektif bir mekanizma olduğundan levosimendanın antiiskemik etkilerini bu yolla gösterdiği düşünülmektedir (7). Levosimendanın sarkolemmal KATP kanalları üzerinde de benzer etkiye sahip olması muhtemeldir. Sarkolemmal KATP kanallarının kardiyoproteksiyonda rolleri olabileceği fakat bu kanalların aktivasyonunun aynı zamanda proaritmik etkinliğe de neden olduğu bilinmektedir. Sarkolemmal kanalların açılması dışa yönelik repolarize edici K+ akımına neden olarak membran hiperpolarizasyonuna, aksiyon potansiyeli süresinin kısalmasına ve sonuç olarak efektif refrakter periyodun kısalmasına yol açabilir ve böylece aritmiye neden olabilir. Levosimendan ile aritmiler arasındaki ilişkiler sarkolemmal KATP kanal açıcı etkinliğinin bir sonucu olabilir (7). 52 Akut miyokard infarktüsü geçiren hastalarda plasebo ile karşılaştırıldığında (111) ve KABG hastalarında perioperatif uygulandığında aritmi gelişimini artırmaması (119) levosimendanın antiiskemik etkinliğinin bir sonucu olabilir. Bununla birlikte, yüksek dozda kullanıldığında (muhtemelen PDE III inhibitör etkinliğinin de devreye girmesi ile) stabil iskemik kardiyomiyopati hastalarında ventriküler aritmi frekansını artırdığı bildirilmiştir (118). Bu nedenle miyokardiyal iskeminin devam etmekte olduğu durumlarda ilacın dozuna dikkat edilmesi gerekir. Miyokardiyal sersemleme, miyofibrillerin Ca+2 duyarlılığının azalması nedeniyle oluşabileceğinden levosimendanın yararlı etkileri olabilir. Miyokardiyal sersemlemede genellikle sistolik fonksiyon bozukluğuna belirgin bir diyastolik fonksiyon bozukluğu da eşlik eder. Ancak levosimendan sistolik fonksiyonu diyastolik fonksiyonu bozmaksızın iyileştirdiğinden ilacın oluşturduğu Ca+2 duyarlılaşması sersemlemiş miyokardın fonksiyonlarını doğrudan iyileştirebilir (7). Ayrıca levosimendanın iskemik miyokardiyal bölgelere kan akımını artırması (65), koroner akımı artırması (63), infarkt alanını azaltması (65), oksijen tüketimi üzerine olumlu etkilerinin olması (64) ve İ/R sonrasında enerji dengesi üzerinde nötral etkisinin olması bileşiğin antiiskemik etkilerine katkıda bulunur. Yapılan hayvan çalışmalarında çeşitli deney dizaynlarında oluşturulan miyokardiyal sersemleme üzerinde levosimendanın doza bağımlı olarak olumlu etkileri gözlenmiştir (27,59,81). Levosimendanın resüstasyon sonrasında (57), yıldırım çarpması (142) veya karbon monoksit zehirlenmesine (143) bağlı olarak oluşan miyokardiyal sersemlemede kardiyak fonksiyon üzerine 53 yararlı etkileri olduğu da bildirilmiştir. Ayrıca miyokard infarktüsü geçiren ve TnI seviyesi çok yükselmediğinden araştırmacılar tarafından miyokardiyal nekrozdan çok miyokardiyal sersemlemenin problem olarak görüldüğü bir hastada levosimendan uygulamasının yararlı sonuçları bildirilmiştir (31). Miyokardiyal KATP kanalları iskemik önkoşullamada da anahtar rol oynamaktadır. Bu nedenle iskemi öncesinde KATP kanal açıcısı olan levosimendanın uygulanması miyokardiyal sersemlemenin negatif etkilerini önleyebilir ya da azaltabilir (157). Yakın tarihte yapılan bir çalışmada levosimendanın iskemik önkoşullamaya benzer kardiyoprotektif ve antiaritmik etkilerinin olup olmadığı tavşanlarda koroner arter oklüzyonu ile oluşturulan iskemi reperfüzyon modelinde araştırılmıştır. Araştırmacılar sağkalım, infarkt alanı sınırlanması, antiaritmik aktivite ve metabolik durum açısından tavşan kalplerinde akut levosimendan uygulaması ile iskemik önkoşullama arasında benzerlik olduğunu bildirmişlerdir. Ayrıca levosimendanın önkoşullama benzeri etkilerini karidyomiyosit KATP kanalları ve nitrik okside bağımlı olarak gösterdiğini belirtmişlerdir (20). 1.2.3.4 Levosimendanın miyokardiyal yeniden modellenme üzerine etkileri Kronik kalp yetmezliğinde meydana gelen yeniden modellenmede moleküler ve hücresel değişilikler oluşur. Miyosit hipertrofisi, kontraktil proteinlerde anormallikler, gen ekspresyonu ile ekstraselüler matrikste değişiklikler ve apoptoz miyokardiyal yeniden modellenmede meydana gelen değişikliklerdendir (162). Yetmezlikte olan bir kalp, kalp yetmezliğinin patofizyolojisi ile ilişkili olan proinflamatuvar sitokinler üretir. Sitokinler asemptomatik yetmezliğin semptomatik yetmezliğe dönüşmesine neden 54 olurlar. Bunun nedeni, miyokardiyal kontraktiliteyi baskılamaları ve kardiyak yeniden modellenmeyle sonuçlanan monosit aktivasyonu, oksijen radikalleri oluşumu ve kardiyomiyosit apoptozuna neden olmalarıdır (7,127). Levosimendanın, KKY hastalarında matriks metalloproteinaz-2 (MMP-2) (162), B-tipi natriüretik peptid (BNP) (9,128,129,131), interlökin-6 (IL-6) (9,128,131,158), malondialdehit (MDA) (9,129), TNF-α (158) ve plazma apoptoz belirteci sFAS (158) seviyesini azaltarak inflamatuvar yanıtı modifiye ettiği ve apoptozu engellediği düşünülmektedir. Levosimendanın vasküler inflamatuvar aktivasyon üzerinde de etkileri olduğu plazma çözünebilen interselüler adhezyon molekülü-1 (sICAM-1) ve çözünebilen vasküler hücre adhezyon molekülü-1 (sVCAM-1) seviyerlerini azaltması ile gösterilmiştir (130). Ayrıca levosimendanın hastalarda azalan SERCA2a protein ekspresyonunu arttırdığı da bildirilmiştir (97). Bir çalışmada dekompanse kalp yetmezliği hastalarına uygulanan levosimendan tedavisinin nörohümoral ve immün aktivasyon belirteçleri olan plazma BNP, IL-6 ve C reaktif protein (CRP) miktarlarını azalttığı bildirimiştir (128). Bununla birlikte Moertl ve arkadaşları (110) levosimendanın meydana getirdiği BNP azalmasının 1 hafta içerisinde yok olduğunu bildirmektedir. Bu araştırmacılar başka bir yayınlarındaysa (109) BNP ve IL-6 seviyelerinde levosimendan ile meydana gelen azalmanın sadece konjesyonun ve hastaların hemodinamik parametrelerinin iyileşmesinden kaynaklanabileceğini belirterek levosimendan ile elde edilen BNP ve IL-6 azalmasına yönelik verilerin ilacın direkt etkisinden kaynaklanmıyor olabileceğini ve dikkatli yorumlanması gerektiğini bildirmektedirler. 55 1.2.3.5 Levosimendanın farmakokinetiği Levosimendanın intravenöz verilişini takiben terminal eliminasyon yarı ömrü yaklaşık 1 saattir. Distribüsyonu hızlıdır. İlacın yaklaşık olarak %97’si plazmada proteinlere bağlı halde bulunur. Total klerensi 200-360 mL/dk’dır (88). Sağlıklı levosimendanın bireyler kolay ve KKY absorbe hastalarında olduğu, 0,5-1 oral yoldan saatte verilen maksimum konsantrasyona ulaştığı ve biyoyararlanımının %85 oranında gerçekleştiği bildirilmiştir (35). Oral yoldan tek doz levosimendan uygulaması ile intravenöz uygulamada elde edilene benzer terapötik konsantrasyonların elde edilebildiği bildirilmiştir (50). Oral uygulama sonrasında levosimendanın metabolitlerinin plazma konsantrasyonlarının doza bağlı olarak arttığı, levosimendanın ise birikime uğramadığı gösterilmiştir (138). Levosimendanın aktif metabolitlerinin uzun yarı ömürleri düşünüldüğünde yaklaşık 14 gün içerisinde metabolitlerinin kararlı durum konsantrasyonlarına ulaşmaları beklenir (87). Levosimendan eliminasyon öncesinde metabolize olur. Metabolitlerinin eliminasyonu ana ilaçtan daha yavaştır. Sitokrom P-450 enzimlerinin levosimendan metabolizmasına katılmadığı düşünülmektedir (68). Levosimendan metabolizmasının ana yolağı glutatyonla konjugasyondur. İnaktif metabolitleri siklik veya N-asetile sisteinilglisin ve levosimendanın sistein konjugatlarıdır. Konjugatlarına ek olarak insan plazmasında iki indirgenme metabolitinin varlığına daha rastlanmıştır. Levosimendan barsaklarda bakteriler tarafından OR-1855’e dönüşütürülür. OR-1855 daha sonra asetillenerek OR-1896’ya dönüşür. OR-1896’nın farmakolojik olarak aktif olduğu ve ayrıca inotropik, kronotropik ve vazodilatör etkiler gösterdiği 56 bildirilmiştir N-asetilasyon (88). durumunun plazma OR-1896 konsantrasyonunu etkilediği ve bu nedenle hızlı asetilleyicilerin plazma OR1896 konsantrasyonlarının daha yüksek olduğu bulunmuştur (6). Ana ilaç ve konjugatlarının eliminasyonu barsak yoluyla olduğundan intravenöz uygulama sonrasında da levosimendanın indirgenme metabolitlerinin varlığı saptanabilir. OR-1855 ve OR-1896’nın eliminasyon yarı ömürleri 70 ile 80 saat arasında olduğundan farmakolojik olarak aktif olan bu metabolitler ana ilacın yok olmasından sonra da levosimendanın hemodinamik etkilerinin devam etmesini sağlar (88). Levosimendan ile 24 saat infüzyonu takiben ilacın kesilmesinden yakaşık iki gün sonra metabolit seviyelerinin maksimum konsantrasyona ulaştığı bildirilmiştir (67). Levosimendan modifiye salım preparatları ile ilgili in vivo in vitro korelasyon çalışmaları (79) ve transdermal farmasötik şeklinin hazırlanmasına ilişkin (166) çalışmalar da yapılmaktadır. Kalp yetmezliğinin levosimendanın farmakokinetiğini etkilemediği bildirilmiştir (62). Konjenital kalp hastalığı olan çocuklarda da levosimendan farmakokinetiğinin değişmediği gösterilmiştir (161). Levosimendanın farmakokinetiği popülasyonlar arasında, cinsiyete ve ırka bağlı olarak değişmemektedir (62). Oral yoldan verildiğinde plazma levosimendan konsantrasyonlarının konkomitan etanol uygulaması ile değişmediği bildirilmiştir (5). Levosimendan ile birlikte verildiklerinde izosorbid dinitrat, kaptopril ve karvedilolün sistemik vasküler rezistans ve sistemik kan basıncında değişikliğe neden olmadığı söylenmektedir (101). 57 1.2.3.6 Levosimendanın klinik kullanımı ve yapılan araştırmalar 1.2.3.6.1 Kalp yetmezliği ve levosimendan tedavisi KKY, yaşa bağımlı olmaksızın her 1000 kişiden 3-20 kişiyi ve 65 yaş üzerinde ise her 1000 kişiden 30-130 kişiyi etkileyen kompleks bir hastalıktır (98). Bu hastalıkta kalbin pompalama fonksiyonu üzerinde meydana gelen primer bozukluk kalp debisinin azalmasına neden olur ve dokulara giden kanın (ve dolayısıyla oksijen miktarının) yetersiz kalmasıyla sonuçlanır (99). Bu hastalarda hemodinamik bozukluklar, egzersize karşı dayanıksızlık, yaşam kalitesinde bozukluklar gözlenebilir ve yaşam süreleri kısalabilir. KKY, hipertansiyon, miyokard infarktüsü, kalp hipertrofisi, miyokard enfeksiyonları, iskemik kalp hastalıkları, kapakçık hastalıkları ve alkol kullanımı gibi çeşitli patolojik süreçlere bağlı olarak gelişebileceği gibi genetik bir bozukluk sonucu da oluşabilir (98). Ayrıca diyabet, metabolik sendrom, hiperlipidemi, sigara kullanımı hastalık gelişimindeki en önemli risk faktörlerindendir (8). Bu nedenle KKY günümüzün önemli kalp hastalıklarından biridir. Kronik kalp yetmezliğinin tedavisinde oral inotrop ajanların yanı sıra ADE inhibitörleri, diüretikler, beta-blokörler ve anjiyotensin II reseptör antagonistleri kullanılmaktadır. Akut kalp yetmezliğinde ise intravenöz diüretikler ve vazodilatörlerin yanı sıra intravenöz inotrop ajanlar kullanılmaktadır (68,98). KKY’nin tedavisi yaşam kalitesinin artırılması ve sağ kalım süresinin uzatılması yönündedir (98). Hastanede tedavi gerektiren KKY olgularında ilk 24 saatte hemodinamik stabilite sağlanmasının ardından kronik olarak oral yoldan ilaç tedavisine devam edilmesi gerekmektedir. KKY’nin tedavisinde inotropik ilaçlar ile kardiyak debinin artırılması yöntemi kullanılmaktadır (99). 58 Kalp yetmezliği patojenezi ve hastalığın ilerleyişi ile ilgili bilgilerimiz arttıkça kontraktiliteyi azaltan β-adrenerjik antagonistler gibi ilaçların da uzun dönemde yararlı oldukları görülmüştür. Aslında, standart tedavide kullanılan pozitif inotroplar ile ilgili yapılan klinik çalışmalar bu ilaçların uzun dönemde hastalığın seyrini kötü yönde etkilediklerini ortaya koymuşlardır (88). Kronik kalp yetmezliğinin karakteristik özelliklerinden biri sempatik tonusun artmasıdır. sağlanmasına Sempatik yardımcı olurken tonusun artışı uygun aynı zamanda kan basıncının miyokardiyal oksijen tüketiminin artmasına da neden olur. Batı toplumlarında kalp yetmezliğinin en başta gelen nedenlerinden birisi iskemik kalp hastalığı olduğundan bu hastalarda oksijen ihtiyacının artması miyokard iskemisi ve ventriküler aritmi riskini artırmaktadır. Ayrıca sirkülasyonda yüksek konsantrasyonda katekolamin bulunması kardiyak apoptoz yoluyla kalp fonksiyonlarının daha fazla bozulmasına yol açabilir. Hastalığın ilerlemesini yavaşlattıklarından kronik kalp yetmezliğinde nörohümoral antagonizma ve bunu takiben vazodilatasyon günümüzde tedavinin ana bileşenleridir (88). Bununla birlikte, hem akut kalp yetmezliğinde hem de dekompanse kronik hastalarda nörohümoral blokaj dolaşım kolapsı ile sonuçlanabilir. Bu hastalarda nörohümoral antagonistlerin kullanımına başlanılmadan önce dolaşım homeostazının hızlıca sağlanması gerekir. Parenteral vazodilatörler ve diüretikler artmış hacmi ve pulmoner konjesyonu azaltırlar. Bu arada intravenöz inotrop ajanlar da kardiyak debiyi ve idrar çıkışını artırarak tedavisi güç hastalarda yararlı olurlar (88). KKY’nin tedavisinde kullanılmakta olan hiç bir ilaç yaşam kalitesini ve sağ kalım süresini artırma bakımından tek başına 59 yeterli görünmemektedir, bu nedenle polifarmasi standart tedavi yaklaşımı olarak kabul edilmektedir. Kalp yetmezliğinin tedavisine yönelik yeni tedavi arayışları nesiritid, tezosentan, tolvaptan, konivaptan, NKH477, UK-1745, Bay k8644, gingerol ve ayrıca levosimendan başta olmak üzere çeşitli kalsiyum duyarlılaştırıcı ajanların araştırılmasını gündeme getirmiştir (33,82,141). Miyofibrillerin Ca+2 duyarlılığının artırılması hücre içi Ca+2 artışına yol açan tedavilere bir alternatiftir. Günümüzde intraselüler Ca+2 konsantrasyonunu artıran ilaçların infarkt alanını ve aritmi insidansını artırma gibi olumsuz etkileri nedeniyle yeni tedavi yaklaşımlarına yönelik araştırmalar Ca+2 duyarlılaştırıcı ilaçlar üzerinde yoğunlaşmaktadır. Levosimendan ve diğer klasik pozitif inotrop ilaçların etki mekanizması Şekil 3’te gösterilmektedir (157). Şekil 3: Pozitif inotrop ilaçların etki mekanizması AC, adenilat siklaz; β-AR, β-adrenerjik reseptör; cAMP, siklik adenozin monofosfat; Gs, stimülatör guanin nükleotid bağlayıcı protein; P, fosforilasyon; PDE, fosfodiesteraz; PKA, protein kinaz A; PL, fosfolamban; RyR2, Ryanodin reseptörü tip 2; SR, Sarkoplazmik reticulum; SERCA2, sarkoplazmik endoplazmik retikulum kalsiyum adenozin trifosfataz izoform 2; TcC, Troponin C; TnI, Troponin I 60 Avrupa Kardiyoloji Topluluğu levosimendanı akut kalp yetmezliği hastalarının ikinci sıra tedavisi için önermektedir. Sürekli pozitif havayolu basıncı, kıvrım diüretikleri ve vazodilatörler ile yapılan ilk sıra tedavi başarılı değilse ve hastanın kan basıncı uygunsa (sistolik basınç 85-100 mmHg) levosimendan uygulaması önerilmektedir (87). Levosimendan klinikte akut dekompanse kalp yetmezliğinde 24 saat süre ile intravenöz yoldan uygulanmaktadır. İskemik kalp hastalarıyla yapılan bir çalışmada 4 mg i.v. yolla verilen levosimendan, kalp debisini artırmanın yanısıra vazodilatasyona da neden olmuş, 2 ve 4 mg’dan sonra refleks olarak kalp hızını artırmış ve 0.25-0.5 mg dozlarda sadece kalp debisinde artma oluşturmuştur. Araştırmacılar 0.25 ve 0.5 mg dozlarında levosimendanın yararlı hemodinamik etkileri olduğunu belirtmişlerdir (93). İskemi orijinli kalp yetmezliği olan hastalarla yapılan bir çalışmada (118) farklı dozlarda bolus levosimendan enjeksiyonunu takiben yine farklı dozlarda 24 saat süreli sürekli infüzyon uygulanarak ilacın terapötik doz aralığının saptanmasına çalışılmıştır. Bu çalışmanın sonuçları levosimendanın nörohümoral aktivasyon oluşturmadığını (plazma norepinefrin seviyeleri değişmemiştir) göstermiştir (118). Ayrıca bir başka çalışmada da kalp yetmezliği hastalarında levosimendan uygulaması sonrasında plazma norepinefrin seviyelerinin değişmediği ve endotelin-1 seviyesinin azaldığı bildirilmektedir (117). Nieminen ve arkadaşları (118) levosimendanın doza bağımlı olarak olumlu hemodinamik etkiler oluşturduğunu göstermiştir. Bu çalışmada iskemik orijinli hastalarda levosimendanın varolan kardiyak iskemiyi artırmadığı belirtilmiştir. Sonuç olarak 6-24 µg/kg bolus enjeksiyonu (10 dk içerisinde) takiben 0.05-0.2 µg/kg/dk’lık infüzyon hızının KKY hastalarının tedavisinde iyi tolere edildiği ve 61 bu doz aralığının kullanılmasının uygun olduğu bildirilmiştir (118). Levosimendanın 10 dakikalık bir süre içerisinde infüzyonla verilen 6-12 µg/kg yükleme dozunu takiben 0.1 µg/kg/dk dozdaki sürekli infüzyon şeklinde uygulanması önerilmektedir. Parissis ve arkadaşları (132) tarafından yapılan bir çalışmada şiddetli kalp yetmezliği hastalarında levosimendan uygulamasının sadece hastaların hastanede yatmaları gereken zamanı kısaltmakla kalmayıp KKY tedavisinde amaçlandığı gibi yaşam kalitesini, fiziksel aktivitelerini artırdığı ve duygudurumlarını olumlu yönde etkilediği bildirilmektedir. Ayrıca levosimendanın peripartum kardiyomiyopati (13), çeşitli nedenlere bağlı kardiyojenik şok (21) gibi bazı özel durumlarda görülen kalp yetmezliğinde de etkili olduğu gösterilmiştir. Yetşkinlerdeki kullanımına ek olarak şiddetli kalp yetmezliği olan yenidoğan ve çocuklarda da levosimendan ile tedavinin güvenli ve etkili olduğu bildirilmiştir (115). 1.2.3.6.2 Levosimendanın kalp yetmezliğindeki kullanımı ile ilgili klinik araştırmalar Sağlıklı gönüllülerle yapılan çalışmalarda genellikle kısa süreli levosimendan infüzyonları kullanılmış ve invazif olmayan metodlarla ölçüm yapılmıştır. 1 mg dozuna kadar genellikle kalp hızında değişiklik olmamıştır. Levosimendanın kardiyak debiyi ve ejeksiyon fraksiyonunu doza bağımlı olarak artırdığı ve bu etkilerini kontraktilitede artış oluşturması ile birlikte artyükü azaltması suretiyle gösterdiği belirtilmiştir. Çalışmalarda sistolik kan basıncı artarken ya da değişmezken diyastolik kan basıncının düştüğü 62 gözlenmiştir. Levosimendan bu hemodinamik aktiviteleri gösterirken miyokardiyal oksijen kullanımında artışa da neden olmamıştır (68). Levosimendanın 24 saatlik uygulama süresinde terapötik doz aralığı araştırılan çalışmada 6-24 µg/kg bolus enjeksiyonu (10 dk içerisinde) takiben 0.05-0.2 µg/kg/dk’lık infüzyon hızının KKY hastalarının tedavisinde iyi tolere edildiği ve bu doz aralığının kullanılmasının uygun olduğu bildirilmiştir (118). Kısa süreli levosimendan kullanımı ile yapılan bir doz titrasyon çalışmasında 0.1-0.4 µg/kg/dk’lık bir doz aralığında titrasyon yapılmış ve levosimendanın dekompanse kalp hastalarının hemodinamik fonksiyonlarını hızlı ve doza bağımlı bir şekilde iyileştirdiği gösterilmiştir. Gözlenen olumlu hemodinamik etkiler semptomlarda iyileşme ile birlikte oluşurken belirgin yan etki oluşmamıştır (147). Uzun süreli levosimendan infüzyonunun etkileri ile ilgili bir çalışmada levosimendanın hemodinamik etkilerinin 24 ve 48 saatlik infüzyonlar arasında değişmediği, ilacın kesilmesinden 24 saat sonrasına kadar hemodinamik etkilerinin sürdüğü ve aktif metabolitinin ilaç infüzyonunun kesilmesinden sonra en az 24 saat süresince arttığı ve hemodinamik etkiye katkıda bulunduğu gösterilmiştir (69). Düşük debili kalp hastalarında levosimendan ve dobutaminin etkilerinin karşılaştırıldığı çalışmasında LIDO (Levosimendan levosimendanın Infusions hemodinamik versus parametreleri DObutamine) iyileştirmekte dobutamine göre daha etkili olduğu bildirilmiştir. Hastalara yapılan 180 günlük takip çalışması sonucunda levosimendan tedavisinin dobutamine göre daha düşük mortalite ile sonuçlandığı görülmüştür (36). Akut miyokard infarktüsü sonrasında gelişen sol ventrikül yetmezliği olan hastalarda yapılan RUSSLAN (Randomized 63 Study on Safety and Effectiveness of Levosimendan in Patients with Left Ventricular Failure after an Acute Myocardial Infarction) çalışmasında 0.1-0.2 µg/kg/dk’lık bir doz aralığında uygulanan levosimendanın hipotansiyon ve iskemi oluşturmadığı ve kalp yetmeziğinin daha kötüye gitme riski ile ölüm riskini azalttığı bulunmuştur (111). Kalp yetmezliği hastalarında 24 saat levosimendan infüzyonunun etkilerinin dobutamin ve plasebo ile karşılaştırıldığı CASINO (Calcium Sensitizer or Inotrope or None in Low-Output Heart Failure) çalışmasında levosimendanın dekompanse düşük debili kalp hastalarının uzun dönem prognozunu dobutamin ve plasebodan daha iyi etkilediği gösterilmiştir (184). REVIVE I (Randomized Multicenter Evaluation of Intravenous Levosimendan Efficacy) çalışmasında akut dekompanse kalp yetmezliği hastalarında 24 saatlik levosimendan infüzyonu ile başlayan 5 günlük süre içerisinde hastanın subjektif semptom değerlendirmesi ile birlikte semptomlardaki değişikliklerin değerlendirilmesi sonucunda levosimendan tedavisi gören grupta iyileşmenin daha sık gözlendiği bildirilmiştir (123). Akut dekompanse kalp hastalarında yapılan REVIVE II çalışmasında ilaç bolus dozu takiben 24 saatlik infüzyon halinde verilmiştir. Plasebo ile karşılaştırıldığında levosimendanın klinik iyileşme oluşturma açısından daha yararlı olduğu, BNP seviyelerinin levosimendan alan hastalarda daha az olduğu ve hastanede geçirilen gün sayısının levosimendan grubunda daha az olduğu bildirilmiştir. Bununla birlikte, levosimendan tedavisi gören hastalarda daha fazla hipotansiyon, atriyal ve ventriküler aritmi görüldüğü bildirilmiştir. Ayrıca 6 ay sonrasında plaseboya göre levosimendan grbunda mortalitenin bir 64 miktar daha fazla olduğu ve risk-yarar oranının belirlenebilmesi için daha fazla klinik araştırmaya gereksinim duyulduğu söylenmektedir (8,122). Akut kalp yetmezliği hastalarında kısa süreli levosimendan ve dobutamin infüzyonlarının uzun dönem sağkalıma etkisinin incelendiği SURVIVE (Survival of Patients with Acute Heart Failure in Need of Intravenous Inotropic Support) çalışmasında başlangıçta BNP seviyeleri levosimendan tedavisi alan hastalarda daha düşük olmasına rağmen 180 günlük takip süresi sonunda levosimendanın mortaliteyi azaltmadığı bildirilmiştir (8,103). 1.2.3.6.3 Kalp cerrahisinde levosimendan kullanımı Kalp cerrahisinde levosimendan kullanımı ile ilgili araştırmalarda farklı hasta popülasyonlarında levosimendanın etkileri incelenmiştir. Lilleberg ve arkadaşları (92) KABG sonrasında levosimendan kullanımının etkilerini randomize klinik bir çalışma ile ilk inceleyenler olmuşlardır. Bu çalışmada KABG ameliyatı sonrasında kalp debisinin düşük olduğu durumlarda levosimendanın kalp performansını artırdığı ve bu etkisini miyokardiyal oksijen tüketimini artırmadan ve kardiyak substrat (serbest yağ asitleri, glukoz, laktat ve piruvat) yararlanımını bozmadan oluşturduğu gösterilmiştir. Nijhawan ve arkadaşlarının (119) çalışmasında kardiyopulmoner baypastan 15 dakika önce verilmeye başlanıp 6 saat sonrasına kadar devam eden levosimendan uygulamasının kalp debisini artırdığı, arteriyel oksijenasyonu etkilemediği ve aritmojenik etkilerinin olmadığı gösterilmiştir. Levosimendanın bu etkilerini düşük dozda atım hacmindeki artış ve artyükteki 65 azalma ile yüksek dozda ise bu etkilere ek olarak atım hızında bir miktar artma ile sağladığı önerilmiştir (119). Operasyon öncesinde sol ventrikül fonksiyonu zayıf olan mitral ve aortik kapakçık replasmanı ameliyatına giren hastalarda levosimendanın kalp debisini artırdığı, pulmoner kapiler veç basıncını azalttığı, ayrıca hastaların kardiyopulmoner baypastan ayrılmasının bütün hastalarda başarılı olduğu ve yoğun bakımda da katekolamin ihtiyaçlarının azaldığı bildirilmiştir. Bu çalışmadan sonra başka araştırıcılar da benzer koşullarda levosimendanın etkinliğini göstermişlerdir (140). Off-pump KABG ameliyatı olan hastalarda yapılan bir klinik çalışmada ameliyattan 20 dk önce bolus enjeksiyonla verilen levosimendanın düşük dozunun (12 µg/kg) yüksek doza (24 µg/kg) göre daha olumlu hemodinamik etkilerinin olduğu belirtilmiştir. Levosimendanın ameliyat öncesinde sol ventrikül fonksiyonu iyi olan hastalarda off-pump KABG ameliyatı esnasında ve sonrasında optimal hemodinamik stabilite sağladığı ve sol ventrikül performansını artırdığı bildirilmiştir (12). Acil cerrahi revaskülarizasyon gerektiren akut miyokard iskemisi bulunan hastalarda katekolaminlere ek olarak levosimendan kullanıldığında pozitif inotrop ve kardiyoprotektif etkiler görülmüştür. Bu çalışmanın sonuçları büyük çaplı randomize klinik çalışmalar ile doğrulanırsa iskemik orijinli hastaların kalp ameliyatlarında levosimendanın kullanılabileceği bildirilmiştir (86). Levosimendanın kalp ameliyatı olan pediyatrik hastalarda da etkili olduğu gösterilmiştir (140). 66 1.2.3.7 Oral yoldan ve uzun süreli levosimendan uygulaması ile ilgili çalışmalar KKY hastalarında intravenöz yoldan uzun süreli veya tekrarlanan levosimendan uygulamasının bu hasta grubunda yararlı etkileri olduğu söylenmektedir (67,116). Ayrıca konvansiyonel tedavi görmekte olan KKY hastalarında oral yoldan tek doz ya da tekrarlanan uygulama şeklinde verilen levosimendanın yararlı kardiyak ve hemodinamik etkileri olduğu da bildirilmiştir (50,56,138). Bununla birlikte levosimendanın kronik ve oral yoldan kullanılmasının miyokardiyal iskemi sonrasında oluşan disfonksiyon ve damarlar üzerindeki etkileri henüz açıklık kazanmamıştır. 1.2.3.8 Levosimendanın damarlar üzerindeki etkileri Levosimendan oluşturabilmektedir. in vitro ve Levosimendanın in vivo insan olarak internal vazodilatasyon meme arteri (2,112,179), insan umblikal arteri (178), insan portal veni (134), insan safen veni (54), insan internal torasik arteri (165), insan koroner arteri (80), domuz, kobay ve inek koroner arterleri (18,46,48,63,76,80,135), kedi pulmoner vasküler yatağı (22) ve sıçan mezenterik arterinde (121) gevşeme oluşturduğu ve sıçan arteriyel miyositlerinde KATP kanallarını aktive ettiği (180) gösterilmiştir. Ayrıca levosimendanın aktif metaboliti olan OR1896’nın da vazodilatör etkileri olduğu gösterilmiştir (34). Damar düz kasının membran potansiyelinin düzenlenmesinde K+ kanallarının önemli rolü vardır. K+ kanallarının açılması hücre membranının hiperpolarizasyonuna yol açarak voltaja duyarlı Ca+2 kanalları ve Na+/Ca+2 pompasından hücre içine Ca+2 girişini engeller ve böylece tonik kontraksiyon 67 halindeki vasküler düz kasın gevşemesine yol açar. KATP kanalları ATP tarafından inhibe olduklarından normal metabolik koşullar altında kapalı konumda bulunurlar. Asidoz, laktat, adenozin ve nükleotid difosfatlar tarafından ise uyarılırlar. PKC üzerinden etki gösteren vazokonstriktörler tarafından kapatılabilir ve PKA ile PKG üzerinden etkilerini oluşturan vazodilatörler ile açılabilirler (63). Levosimendanın koroner akımı artırıcı yöndeki etkilerinin PKA ve PKG’den bağımsız olduğu ve oluşturduğu etkinin diğer bir PDE III inhibitörü olan milrinondan farklı olduğu gösterilmiştir (49). Bu nedenle yüksek dozda levosimendan PDE III inhibisyonu yaparak vasküler düz kasta cAMP konsantrasyonunu artırabilse bile damar düz kasındaki geveştici etkilerini bu yolla göstermediği söylenilebilir. Levosimendanın vazodilatör etkisinin mekanizması ile ilgili olarak yapılan çalışmalar ilacın bu etkisini başlıca iki yoldan gösteriyor olabileceğine işaret etmektedir. Levosimendanın KATP kanallarını, voltaja duyarlı potasyum (KV) kanallarını ve Ca+2 ile aktive olan potasyum (KCa) kanallarını aktive ettiği in vivo ve in vitro çalışmalarda gösterilmiştir. Levosimendanın büyük kondüktans damarlarında KV ve KCa kanallarını, küçük rezistans damarlarında ise KATP kanallarını tercihli olarak uyardığı düşünülmektedir (182). Levosimendanın vazodilatör etki mekanizmasına yönelik ikinci hipotez ise ilacın vasküler düz kasta desensitizasyon yaptığı yönündedir. Kontraktil agonistler PKC aktivasyonu yolu ile damar düz kasında Ca+2 duyarlılığını artırırlar. K+ kanallarının açılması ile meydana gelen hiperpolarizasyonun agonist ile indüklenen fosfatidil inozitol difosfat (PIP2) hidrolizini azaltarak hem 68 inozitol trifosfat (IP3)’a duyarlı depolardan Ca+2 mobilizasyonunu hem de PKC aktivasyonunu baskıladığı öne sürülmüştür. Böylece K+ kanallarının açılması hem Ca+2 miktarını hem de kontraktil proteinlerin kalsiyum duyarlılığını azaltarak Ca+2 duyarsızlaşması yaratabilir (182). Gerçekten de domuz koroner arterlerinde yapılan bir çalışmada levosimendanın kontraktil proteinlerin Ca+2 duyarlılığını azalttığı gösterilmiştir (18). Levosimendanın vazodilatör mekanizması ile ilgili olarak öne sürülen mekanizmalar Şekil 4’te özetlenmektedir (182). Şekil 4: Damar düz kasında levosimendanın vazodilatör mekanizması [Ca2+]i, intraselüler kalsiyum konsantrasyonu; KATP, ATP’ye duyarlı potasyum kanalları; KCa, Ca+2 ile aktive olan potasyum kanalları; KV, voltaja duyarlı potasyum kanalları; LS, levosimendan Bowman ve arkadaşları (18) domuz koroner arterinde yaptıkları çalışmada levosimendanın intraselüler Ca+2 miktarını azaltmaksızın KCl kasılmalarını azalttığını göstermişlerdir. Çalışmalarında KCl stimülasyonuna karşı hücre içi Ca+2 ve güç arasındaki ilişkinin anlamlı bir şekilde sağa kaydığını ve bunun levosimendanın 69 damar düz kasında kalsiyum desensitizasyonu yapması ile ilişkili olabileceğini belirtmişlerdir. Levosimendanın kalpteki hedef proteini olan TnC, Ca+2 bağlayıcı EF-hand proteinlerindendir. Araştırmacılar levosimendanın damar düz kasında da Ca+2 bağlayıcı EF-hand proteinlerine (örn. Kalmodulin) bağlanarak buradaki kalsiyumun ayrılmasına neden olabileceğini ve hücre içi Ca+2 miktarında artışa neden olabileceğini önermektedirler. Levosimendanın KCl kasılmaları üzerindeki etki mekanizmasından farklı olarak bir tromboksan analoğu ile damar düz kası kasıldığında ilacın etkisinin bir kısmının hücre içi Ca+2 azalması ile ilişkili olabileceğini belirtmektedirler. Levosimendanın gevşetici etkisinin endoteli sağlam arterlerde daha az olduğu da çalışmanın sonuçları arasındadır (18). Domuz ve insan koroner arteri kullanarak yaptıkları çalışmada Krassoi ve arkadaşları (80) KCl ile önkastırma yapılan damarlarda levosimendanın gevşetici etkisi olduğunu ve bu etkinin ekstraselüler Ca+2 miktarı arttıkça azaldığını bildirmişlerdir. Çalışmada kullandıkları K+ konsantrasyonu K+ denge potansiyelinin üzerinde olduğundan voltaja duyarlı Ca+2 kanallarının aktif halde olduğunu ve yüksek ekstraselüler Ca+2 konsantrasyonunda hücre içine daha fazla Ca+2 girerek levosimendanın oluşturduğu gevşeme cevabını azaltabileceğini bildirmişlerdir. Levosimendanın vazodilatör etkisinin ekstraselüler Ca+2 ve depolarize edici K+ konsantrasyonuna bağımlı olduğu düşünülmektedir (121). Yüksek konsantrasyonda (20-45 mM) K+ kullanılarak yapılan çalışmalarda K+ kanal fonksiyonları değişeceğinden levosimendanın vazodilatör etkinliği azalabilir. Bu tür deney dizaynlarında dinlenim membran potansiyeli potasyumun denge potansiyeline yaklaşacaktır ve K+ kanallarının aktivasyonu ile oluşan hiperpolarizasyon azalacaktır (177). 70 Krassoi ve arkadaşlarının (80) yaptıkları çalışmada artmış ekstraselüler Ca+2 konsantrasyonu KATP kanal aktivatörü olan kromakalimin vazodilatör etkinliğini artırırken levosimendanın etkisini azaltması Pataricza ve arkadaşları (135) tarafından levosimendanın etkilerinin diğer K+ kanalları tarafından da regüle edilebileceği şeklinde yorumlanmıştır. Pataricza ve arkadaşları (135) domuz epikardiyal koroner arterinde yaptıkları çalışma sonucunda terapötik konsantrasyonlarda kullanılan levosimendanın oluşturduğu gevşeme yanıtına KATP kanallarının değil voltaja duyarlı K+ kanalları ile Ca+2 ile aktive olan K+ kanallarının aracılık ettiğini bildirmişlerdir. Araştırmacılar KATP kanalları ile ilgili bu çelişkili bulgularının nedeninin domuz koroner arterlerinin farmakolojik ve elektrofizyolojik olarak diğer damar yataklarından farklılık göstermesine bağlamışlardır. Gruhn ve arkadaşlarının (48) izole domuz koroner arterinde yaptıkları çalışmada levosimendanın in vivo dilatasyon oluşturan dozlarının çok daha üstündeki konsantrasyonlarını kullanmışlardır. Bu çalışmada levosimendanın etkilerinin endotelden, vazodilatör prostaglandin salıverilişinden, hücre içine Ca+2 girişinden, K+ kanallarından ve β-adrenoreseptör uyarılmasından bağımsız olduğu bildirilmiştir. Araştırmacılar kullanılan yüksek konsantrasyonlarda levosimendanın vazodilatör etkinliğinin cAMP üzerinden olabileceğini öne sürmüşlerdir. Domuzlarda intrakoroner levosimendan uygulaması ile yapılan bir çalışmada ilacın koroner akımı artırıcı yöndeki etkisinin α- ve β- adrenoreseptör ya da muskarinik reseptör blokajı ile değişmediği NO sentezine bağımlı olduğu gösterilmiştir. Levosimendanın klinikte kullanılan 71 konsantrasyonlarda arteryel kan basıncı, kalp hızı ve santral venöz basıncı etkilemeden koroner akımı artırdığı da belirtilmiştir (46). Ozdem ve arkadaşlarının (121) sıçan küçük mezenterik arterinde yaptıkları çalışmada levosimendanın vazodilatör etkisinin endotelden ve KV kanalları ile KCa kanallarından bağımsız olduğu, KATP kanallarının vazodilatör etkiye aracılık ettiği söylenmektedir. Çalışmada kullanılan konsantrasyon aralığının levosimendan ile tedavi gören hastalarda damar düz kasında efektif bir gevşeme oluşturmayabileceği de belirtilmektedir. Kedi pulmoner damar yatağında bir tromboksan analoğu kullanılarak bazal tonus yükseltildiğinde levosimendanın sistemik arteryel basıncı değiştirmeksizin pulmoner arteryel basıncı azalttığı bildirilmiştir. Bu etkinin kısmen KATP kanal aktivasyonuna bağımlı olduğu, NO sentezi, siklooksijenaz enzim aktivasyonundan bağımsız olduğu gösterilmiştir. Levosimendanın etkisinin vazoselektif KATP kanal blokörü ile tamamen ortadan kaldırılamamış olması pulmoner yatakta ilacın etkisine aracılık eden başka mekanizmalar da olabileceğini düşündürmektedir (22). İzole inek koroner arterlerinde yaptıkları çalışmada Köppel ve arkadaşları (76) dinlenim halindeki damarlarda levosimendanın gevşetici etkilerinin minimal düzeyde olduğunu ve istatistiksel olarak anlamlılık taşımadığını bildirmişlerdir. KABG ameliyatlarında graft olarak sıklıkla kullanılmaları nedeniyle insan internal torasik arteri ile internal meme arteri üzerinde levosimendanın etkilerinin incelendiği çalışmalar yapılmıştır. Levosimendan fenilefrin ile kastırılan internal torasik arterlerde gevşeme oluşturmuştur. Levosimendanın bu etkisinin KATP kanalları ve KCa kanalları üzerinden olduğu bildirilmiştir 72 (165). İnsan internal meme arterinde yapılan çalışmalarda levosimendanın fenilefrin kasılmalarını gevşettiği, KCl kasılmaları üzerinde ise daha az etkili olduğu ve bu etkilerinin kısmen KATP kanalları aracılığı ile olduğu belirtilmektedir (179). İzole internal meme arteri ile yapılan bir diğer çalışmada levosimendanın noepinefrin ve tromboksan A2 kasılmalarını tersine çevirdiği ve aynı zamanda da konsantrasyona bağımlı bir şekilde norepinefrin aracılı kasılmaları inhibe ettiği bildirilmiştir. Levosimendanın bu etkilerini endotelden bağımsız olarak göstermiştir (112). Levosimendanın norepinefrin kasılmalarını doza bağımlı olarak azalttığı ve ayrıca vazodilatör etkilerinin erkeklerde kadınlara göre daha fazla olduğu gösterilmiştir. İlginç olarak levosimendan aracılı gevşeme yanıtı erkeklerde KATP kanal inhibitörü ve KCa kanal inhibitörü varlığında anlamlı bir şekilde azalırken kadınlarda K+ kanal inhibitörlerinin gevşeme yanıtı üzerinde etkisi olmamıştır. Bu sonuçlar klinikte levosimendan kullanımını etkileyebilir (2). İnsan portal veninde yapılan bir çalışmada levosimendanın noradrenalin kasılmalarını antagonize ettiği ve bu etkisinin glibenklamide duyarlı olduğu belirtilmiştir. Siroz ve portal ven hipertansiyonu ile ilişkili kalp yetmezliğinde sempatik sinir sistemi aktivitesinin arttığı bilindiğinden levosimendanın noradrenalin kasılmalarını antagonize etmesi önemlidir (134). Levosimendanın venler üzerindeki gevşetici etkisi ile ilgili bir çalışma da insan safen veninde yapılmıştır (54). Kalp yetmezliği tedavisinde klinikte kullanılan dozlarında ilaç serotoninin oluşturduğu tonus artışını azaltmıştır. Bu iki çalışmada (54,134) farklı önkastırıcılar kullanılmasına rağmen benzer vazodilatör potansiyel gözlenmiş olması levosimendanın venler üzerindeki etkilerinin koroner arterlerdekine (48) benzer 73 şekilde reseptörlerden bağımsız olduğunu düşündürmektedir. Höhn ve arkadaşlarının (54) yaptıkları çalışmada KCa kanallarının selektif bir inhibitörü olan iberotoksin varlığında levosimendanın venodilatör etkisinin ortadan kalktığı ve levosimendanın kasılma oluşturduğu bildirilmiştir. KCa kanallarının blokajının levosimendanın doza bağımlı kontraktil etkisini ortaya çıkardığı öne sürülmektedir. Levosimendanın kalbin önyükünü azaltıcı etkisi venöz tonus üzerindeki direkt etkisine bağlı olduğu bu çalışmalardan çıkan sonuçlar arasındadır. KABG ameliyatları esnasında internal meme arterinde spazm oluşabilmekte ve bunun sonucuda oluşan miyokardiyal iskemi perioperatif morbidite ve mortaliteyi artırmaktadır. Nitrogliserin (NG) internal meme arterinde güçlü bir gevşetici etkiye sahip olsa da bu ilacı daha önceden kullanan hastalarda karşılaşılan taşiflaksi ilacın kullanımını kısıtlayabilmektedir. Bu nedenle nitrogliserine alternatif ilaçlar geliştirilmeye çalışılmaktadır. İzole damarlarda levosimendan inkübasyonu yapılan bir çalışmada ve levosimendan varlığında norepinefrin kasılmalarının azaldığı görülmüştür. Bu nedenle ilacın baypas operasyonlarında profilaktik olarak kullanılabileceği öne sürülmüştür (112). Levosimendanın submikromolar konsantrasyonlarda vazodilatör etkili olduğunu gösteren az sayıda çalışma olsa da çalışmaların genelinde vazodilatasyon oluşturmak için mikromolar konsantrasyonlarda levosimendan uygulamasına ihtiyaç olduğu belirtilmektedir. 0.25 ve 0.5 mg levosimendan uygulamasının iskemik kalp hastalığı olan kişilerde sol ventrikül fonksiyonunu artırdığı ve ancak 2 ve 4 mg dozunda uygulanması halinde total periferik rezistansta bir azalma meydana getirdiği bildirilmiştir. Bu nedenle levosimendanın vazodilatör etkinliğinin görülmesi için pozitif inotropik 74 dozlarından daha yüksek dozara ihtiyaç olduğu söylenebilir. Levosimendanın klinikte vasküler yan etkiler meydana getirmeksizin profilaktik olarak kullanılması mümkün olabilir (177). Levosimendanın düz kas tonusunu azaltıcı etkisinin mekanizmasının ilacın konsantrasyonuna, incelenen türe ve kan damarının tipine bağımlı olduğu görülmektedir. Levosimendan baypas ameliyatları esnasında oluşabilecek arter spazmında (80), pulmoner basıncın yükseldiği durumlarda (22), portal hipertansiyonda (134) yararlı olabilir. Sonuç olarak levosimendanın pozitif inotrop, antiiskemik ve antiaritmik etkileri dikkate alındığında, bu ilacın akut kullanımı yanısıra uzun süreli oral kullanımının, iskemik önkoşullama varlığında ve yokluğunda oluşturabileceği etkilerin araştırılması, klinikteki kullanımına yeni yaklaşımlar getirebilir. Levosimendanın pozitif inotropik etkileri yanısıra antiiskemik ve vazodilatör özelliğinin de bulunmasına, koroner kan akımını artırmasına, kalbin hem önyük hem de artyükünü azaltmasına ve ağır kalp yetmezliği tablosunu düzeltebilecek olumlu hemodinamik etkiler oluşturmasına yönelik bilgiler olmakla birlikte (182), oral yoldan uzun süreli kullanımına ilişkin bilgiler oldukça kısıtlıdır. Bu açıdan ilacın etkinliğinin araştırılması giderek önem kazanmaktadır. 75 2 GEREÇ VE YÖNTEM 2.1 Deneylerde kullanılan hayvanlar Çalışmada 200-300 g ağırlığındaki erkek Wistar sıçanlar kullanıldı. Yiyecek ve içecek kısıtlaması uygulanmayan hayvanlar standart laboratuvar pellet yemi ve çeşme suyu ile beslendi. Hayvanlar Ege Üniversitesi Eczacılık Fakültesi Deney Hayvanları Etik Kurulu tarafından onaylanmış protokoller doğrultusunda bakıldı ve deneye alındı. 2.2 Deney grupları ve çalışma protokolleri Çalışmanın planı ve incelenen parametreler Şekil 5’de verilmektedir. İzole kalplerde koroner akımdan CK-MB tayini Dokuz Eylül Üniversitesi Tıp Fakültesi Merkez Laboratuvarının ve kalp dokusunda cAMP tayini Dokuz Eylül Üniversitesi Tıp Fakültesi Biyokimya Anabilim Dalının olanakları kullanılarak yapıldı. İzole kalp kesitlerinde elektron mikroskobik incelemeler Hacettepe Üniversitesi Tıp Fakültesi Anatomi Anabilim Dalı’nda gerçekleştirildi. Tez çalışması kapsamındaki diğer araştırmaların tamamı Ege Üniversitesi Eczacılık Fakültesi Farmakoloji Anabilim Dalı’nda yürütüldü. Wistar Sıçan İzole damar çalışmaları İzole kalp çalışmaları 21 gün p.o. levosimendan (0.2 mg/kg/gün) İskemi süresinin etkileri Kontrol grubu 15dk iskemi grubu 30dk iskemi grubu 45dk iskemi grubu 60dk iskemi grubu Fonksiyonel çalışmalar • LVDP • ±dP/dtmaks • Kalp hızı • Perfüzyon basıncı • Aritmi insidans ve süresi Biyokimyasal çalışmalar • CK-MB Morfolojik çalışmalar • Nekrotik alan tayini • Elektron mikroskobik çalışma 21 gün p.o. çözücü Endoteli sağlam ve mekanik olarak kazınmış damarlarda vasküler reaktivite çalışması • Fenilefrin • 5-HT • KCl • Ach • NG Levosimendanın etkileri Kontrol: 21 gün p.o.çözücü LA: 0.1 µM levosimendan L1: 7 gün p.o. levosimendan (0.2 mg/kg/gün) L2: 14 gün p.o. levosimendan (0.2 mg/kg/gün) L3: 21 gün p.o. levosimendan (0.2 mg/kg/gün) Normal perfüzyon İskemi hasarı İskemik önkoşullama Fonksiyonel çalışmalar • LVDP • ±dP/dtmaks • Kalp hızı • Perfüzyon basıncı • Aritmi insidans ve süresi Biyokimyasal çalışmalar • CK-MB • cAMP Morfolojik çalışmalar • Nekrotik alan tayini Şekil 5: Araştırma planı ve incelenen parametreler. 77 2.2.1 İzole perfüze kalp çalışmaları 2.2.1.1 Kalplerin izolasyon ve perfüzyonu Sıçanlar anestezi uygulanmaksızın giyotin ile dekapite edildi. Sağ sternotomi ile toraks açıldı ve kalpte mekanik hasar oluşturulmamasına dikkat edilerek assendan aort izole edildi. İzole edilen kalpler soğuk perfüzyon solüsyonuna (Fizyolojik tuz çözeltisi, Tyrode) koyularak durduruldu. Kalpler Langendorff düzeneğinde hazır bekletilen kanüle takılarak aort aracılığı ile retrograd olarak ve sabit akım uygulanarak perfüzyona başlandı. Akım hızı hayvanların ağırlıklarına göre dakikada 7-10 mL olacak şekilde ayarlandı. Perfüzat 37 °C’de sabit tutularak %95 O2, %5 CO2 karışımı ile sürekli gazlandırıldı. Kalpler düzeneğe takıldıktan sonra sol atrium yoluyla sol ventrikül içerisine içi sıvı dolu lateks bir balon yerleştirildi ve bipolar elektrogram kaydı için elektrodlar kalbin apeksi ve atrioventriküler septuma yakın bir kısmına yerleştirildi, aort kanülü referans elektrod olarak kullanıldı. 2.2.1.2 İzole perfüze kalp çalışmalarında deney grupları 2.2.1.2.1 Sıçan kalbinde global iskeminin etkilerinin incelendiği deney grupları İzole kalp çalışmalarının bu bölümünde uygun miyokardiyal sersemleme modeline karar verilmesi amaçlanarak kullanılan sıçanlar kontrol grubu, 15, 30, 45 ve 60 dakika global iskemi grupları olmak üzere 5 gruba ayrıldı. 78 2.2.1.2.1.1 Sıçan kalbinde global iskeminin etkilerinin incelendiği deney gruplarında perfüzyon protokolleri İskemi süresinin sıçan kalpleri üzerindeki etkilerinin incelendiği deneylerde Şekil 6’da gösterilmekte olan perfüzyon protokolleri uygulandı. Bu deneylerde verilerin elde edildiği hayvan sayıları kontrol grubu, 30dk, 45dk ve 60dk iskemi grupları için 5; 15dk iskemi grubunda ise bir verinin değerlendirmeye alınma kriterlerini sağlamaması nedeniyle 4’tür. Şekil 6: İskemi süresinin sıçan kalbi üzerindeki etkilerinin incelendiği gruplarda perfüzyon protokolleri. A, normal perfüzyon; B, 15 dk iskemi; C, 30 dk iskemi; D, 45 dk iskemi; E, 60 dk iskemi. ■, iskemi; □, normal perfüzyon. 2.2.1.2.2 Levosimendanın etkilerinin incelendiği deney grupları İzole kalp çalışmalarının bu bölümünde kullanılan sıçanlar kontrol grubu, levosimendan akut etki grubu ve levosimendan kronik etki grubu olmak üzere üç ana gruba ayrıldı. Kontrol grubu: Kontrol grubundaki sıçanlara 21 gün süre ile günde bir kez oral yoldan gastrik gavaj aracılığı ile kronik etki grubundaki sıçanlara verilene eşit miktarda çözücü distile su içindeki solüsyonu halinde verildi. Çözücünün 1 79 mL’si 50 mg povidon ve 10 mg anhidr sitrik asidi 1 mL’ye tamamlayacak kadar anhidr etanol içermektedir. Akut etki grubu: Akut etki grubunda (LA) levosimendan 0.1 µM konsantrasyonunda kullanıldı. Bu konsantrasyon ilacın sadece kalsiyum duyarlılaştırıcı etkilerinin gözlemlenebilmesi için seçilmiştir. Ayrıca seçilen konsantrasyon tedavide kullanılan dozlar ile erişilen plazma konsantrasyonuna yakındır (90) ve cAMP düzeyleri üzerinde herhangi bir etki oluşturmamaktadır (49,81). 0.1 µM levosimendan 1 mL perfüzyon sıvısı içerisinde izole kalbe aort kanülünün hemen üzerinden direkt bolus enjeksiyonla verildi. Akut etki grubundaki bütün kalplere 55. dakikada ilaç uygulandı. Kronik etki grubu: Levosimendanın yüksek dozlarda PDE III inhibisyonu oluşturması nedeniyle çalışmamızda kullandığımız levosimendan oral tedavi dozu, ilacın literatürde PDE III inhibisyonu yaparak cAMP düzeyini artırmadığı ve etkilerini kalsiyum duyarlılaştırıcı mekanizma aracılığı ile gösterdiği belirtilen 0.2 mg/kg/gün olarak seçildi (26). Kronik etki grubundaki sıçanlara belirtilen doz, ilacın ticari preparatının distile su içindeki solüsyonu halinde 7, 14 veya 21 gün süre ile oral yoldan gastrik gavaj aracılığı ile günde bir kez verildi. 7 gün levosimendan ile tedavi edilen grup L1, 14 gün süre ile tedavi edilen grup L2 ve 21 gün süre ile tedavi edilen grup L3 olarak isimlendirildi. 80 2.2.1.2.2.1 Levosimendanın etkilerinin incelendiği deney gruplarında perfüzyon protokolleri Levosimendanın etkilerinin incelendiği deneylerde kontrol, akut etki ve kronik etki gruplarının her biri ilacın İ/R hasarı ve miyokardiyal sersemleme üzerindeki etkilerinin ve iskemik önkoşullama ile etkileşiminin belirlenebilmesi amacıyla normal perfüzyon, iskemi hasarı ve iskemik önkoşullama protokolleri uygulanan 3 alt gruba ayrıldı (Şekil 7). Bütün kalplere ameliyat sonrası stabilizasyon periyodu (30 dakika) uygulandı. Normal perfüzyon uygulanan kalpler deney süresince iyi oksijenlenmiş koşulda tutuldu. İskemi gruplarında ise stabilizasyon periyodundan sonra deneyin 60. dakikasında 30 dakika global iskemi uygulandı daha sonra 30 dakika reperfüzyona izin verildi. İskemik önkoşullama gruplarında, stabilizasyon periyodundan sonra önkoşullama üç kez 5’er dakikalık global iskemi ve 5’er dakika reperfüzyon sağlanarak oluşturulduktan sonra kalplere 30 dakika global iskemi uygulandı daha sonra 30 dakika reperfüzyona izin verildi. Şekil 7: Kontrol, levosimendan akut etki ve levosimendan kronik etki gruplarında perfüzyon protokolleri. A, normal perfüzyon; B, iskemi hasarı; C, iskemik önkoşullama. ■, iskemi; □, normal perfüzyon. 81 Levosimendanın etkilerinin incelendiği deney gruplarında her perfüzyon protokolü için hayvan sayısının 5 olması hedeflendi fakat deneye alınma kriterlerini sağlamayan verilerin elimine edilmesi sonucunda Tablo 2’de belirtilen sayılarda veri değerlendirmeye alındı. Tablo 2: Levosimendanın etkilerinin incelendiği deney gruplarında izole perfüze kalp çalışmalarında verilerin elde edildiği hayvan sayıları Kontrol LA L1 L2 L3 Normal perfüzyon 4 4 4 5 5 İskemi Hasarı 6 4 4 4 5 İskemik Önkoşullama 4 4 4 4 4 2.2.1.3 İzole kalplerde ölçülen fonksiyonel parametreler Kalbin kontraktil gücü sol ventrikül içine yerleştirilen içi sıvı dolu bir balon ile ölçüldü. Bir kateter aracılığıyla basınç transdusırına bağlı olan balonun iç basıncı 0-10 mmHg olacak şekilde ayarlanarak bir ön yük oluşturuldu. Balon içinde oluşan basınç değişiklikleri intraventriküler basıncı temsil ettiğinden diyastol sonu basıncı (LVDP: Left ventricular developed pressure), sol ventrikül pik sistolik basınçtan (LVPSP) sol ventrikül diyastol sonu basıncı (LVEDP) çıkarılarak hesaplandı (LVDP= LVPSP- LVEDP). Deney sonrasında sol ventrikül kontraksiyon eğrisinden basınç olarak kaydedilen değişiklikler zamana bağlı olarak hesaplanarak (eğrinin 1. dereceden türevi) maksimum kasılma ve gevşeme değerleri (+dp/dtmaks, -dp/dtmaks) hesaplandı. Kalp hızı deney süresince sürekli olarak kaydedildi. Kalbe yerleştirilen iki iğne elektrod aracılığı ile bipolar EKG kaydı yapıldı. Aritmi insidansı ve süresi Lambeth Conventions’a göre değerlendirildi. Kullanılan aritmi sınıflandırması ve aritmi tiplerinin tanımları şu şekildedir. 82 1. İzole prematür ventriküler atım (PVC, prematür ventiküler kompleks): Ayrı olarak tanımlanabilen prematür QRS kompleksi (P dalgası yok) 2. Bigemini: En az P, QRS, PVC, P, QRS, PVC şeklindeki ardışık diziden oluşan ventriküler prematür atım varyasyonları 3. Salvo: İki veya üç adet prematür QRS kompleksleri 4. Ventriküler taşikardi (VT): Ardışık olarak gözlenen dört veya daha fazla prematür QRS kompleksi (tanımlama atım hızı ve geçerli olan sinüs ritminden bağımsız olarak yapılmaktadır.) 5. Ventriküler fibrilasyon (VF): QRS komplekslerinin birbirinden ayırt edilemediği ve atım hızının ölçülemediği EKG Bu sınıflandırmaya göre aritmiler üçe ayrıldı: VF ve VT ile bigemini, salvo ve ventriküler prematür kompleksleri de içeren diğer aritmi tipleri (VES). VF, VT ve diğer aritmi tiplerinin süreleri ölçüldü. Deney sonrasında 90 ile 100. dakikaları arasının incelenmesi ile aritmi insidans ve süresini kapsayan bir değerlendirme yapılarak aritmi skorlaması Tablo 3’te belirtildiği şekilde yapıldı (43,89). Kalbin düzeneğe takıldığı kanülün hemen üzerinde bulunan transdusır aracılığı ile aort perfüzyon basıncındaki değişiklikler kaydedildi. Stabilizasyon periyodu sonunda LVDP’si 60 mmHg’nin, aort perfüzyon basıncı 70 mmHg’nin altında olan kalpler deney dışı bırakıldı. 83 Tablo 3: Aritmi değerlendirmesinde kullanılan skorlama kriterleri Skor Elektrokardiyogramda gözlenen bozukluk 0 Aritmi yok 1 <10 sn VES ve/veya VT 2 11-30 sn VES ve/veya VT 3 31-90 sn VES ve/veya VT 4 91-180 sn VES ve/veya VT, <10 sn VF 5 >180 sn VES ve/veya VT, >10 sn VF 6 İrreversibl VF 2.2.1.4 İzole kalplerde ölçülen biyokimyasal parametreler 2.2.1.4.1 Koroner akımdan CK-MB ölçümü Kardiyak hücrelerde irreversibl hasar oluşumunun tespit edilebilmesi amacıyla koroner akımdan CK-MB ölçümü yapıldı. İskemi süresinin etkilerinin incelendiği gruplarda deney süresince 30, 90 ve 120. dakikalarda toplanan koroner akım örneklerinden, levosimendanın etkilerinin incelendiği gruplarda ise deney süresince 30, 60, 90 ve 120. dakikalarda toplanan koroner akım örneklerinden CK-MB tayini BioDPC Turbo CK-MB kiti kullanılarak Immulite 1000 (BioDPC) cihazında yapıldı. Bütün gruplarda alınan örnekler enzim tayini yapılacak güne kadar -20 ˚C’de bekletildi. 2.2.1.4.2 İzole kalp dokusunda cAMP ölçümü Levosimendan düşük dozlarda kalsiyum duyarlılaştırıcı, yüksek dozlarda ise PDE III inhibitörü olduğundan ilacın gözlemlenen etkilerinden hangi mekanizmanın sorumlu olduğunun belirlenebilmesi amacıyla kalp dokusunda cAMP ölçümü yapıldı. Deney sonunda kalbin apeksinden yaklaşık 100 mg 84 doku kriyotüp içerisinde sıvı azota alındı ve ölçüm yapılan güne kadar 80˚C’de bekletildi. Analiz günü doku örnekleri sıvı azot buharında pulverize edildikten sonra ağırlığının 10 katı hacminde 0.1 N HCl ile yarı otomatik homojenizatörde (Potter-Elverhjem, S.B.Braun) (1000 devir/dk, 30 sn süre ile) homojenize edildi. Elde edilen homojenatlar 10 dakika 600 devirde oda sıcaklığında santrifüjlendi. Süpernatanlar alınarak 0.1N HCl ile 1:2 oranında dilüe edildi. cAMP Direct immunoassay kit, (Colorimetric, Calbiochem) kullanılarak örneklerden ön asetilasyonun ardından cAMP miktar tayini yapıldı. Kitteki poliklonal cAMP antikoru örneklerdeki cAMP’ye kompetitif olarak bağlanmaktadır. Oda sıcaklığında 2 saat inkübasyonu takiben çözeltilerin fazlası yıkanarak substrat ilave edildi. 1 saat inkübasyonu takiben reaksiyon durdurularak oluşan sarı renk 405 nm’de Multi-Detection Microplate Reader (Synergy Ht, Biotek Instruments, Inc, USA) mikroplak okuyucuda okundu. Okunan absorbans değerlerinden pmol/mL cinsinden hesaplanan cAMP miktarı doku total protein miktarına bölünerek pmol/mg protein cinsinden doku cAMP miktarı hesaplandı. cAMP değerlerinin hesaplanmasında kullanılan standartlara ait veriler Şekil 8’de gösterilmektedir. 100 % Bağlanma cAMP 80 (pmol/mL) % Bağlanma 60 20 7,48 40 5 17,72 1,25 50,79 0,312 73,23 0,078 81,10 20 0 -1.5 -1.0 -0.5 0.0 0.5 1.0 1.5 log[cAMP] Şekil 8: cAMP standart eğrisi ve cAMP standartlarına karşı okunan absorbans değerlerinden hesaplanan % bağlanma değerleri 85 2.2.1.4.2.1 İzole kalp dokusunda protein miktarı ölçümü cAMP tayininde kullanılan süpernatanlar kullanılarak Pierce BCA Protein Assay Kit ile kalp dokusunda total protein miktar tayini yapıldı. Alkali ortamda proteinler Cu+2’yi Cu+1’e dönüştürürler (biüret reaksiyonu). Kitin içeriğindeki bikinkoninik asit (BCA) Cu+1 ile şelat yaparak mor renkli bir ürün verir ve bu ürünün absorbansının okunması ile total protein miktarı hesaplanır. Kısaca 1:5 oranında seyreltilen örnekler 37˚C’de yarım saat BCA reaktifi ile inkübe edildi. 562 nm’de plak okuyucuda absorbans okundu. Total protein miktarı mg/mL cinsinden hesaplandı. Sonuçlar dilüsyon faktörü ile çarpıldı. 2.2.1.5 İzole kalplerde yapılan morfolojik çalışmalar 2.2.1.5.1 İzole kalp dokusunda hücresel yapıların değerlendirmesi İskemi süresinin etkilerinin incelendiği deney gruplarında morfolojik değişikliklerin saptanabilmesi amacıyla elektron mikroskobik çalışma yapıldı. Deney sonunda kalpler düzenekten çıkarıldı ve apeksten başlanarak 1 mm kalınlığında üç kesit alındı. Standardizasyonun sağlanması için alınan kesitlerin apekse komşu olan ikisi elektron mikroskobik inceleme için ayrıldı. Alınan örnekler daha önceden küçük şişelerde hazırlanmış olan % 2.5 gluteraldehit solusyonu içine koyuldu ve etiketlendi. 24-48 saat süre ile glutaraldehitte bekletilen örnekler daha sonra Sorenson fosfat tamponu içerisine alınarak postfiksasyonun yapılacağı güne kadar +4˚C’de bekletildi. Daha sonra örnekler % 1’lik osmiyum tetroksit içerisine alınarak 1 saatlik postfiksasyon uygulandı. Tamponla yıkanan örnekler alkol serilerinden geçirilerek dehidrate edildi, propilen oksit ile muamele edildikten sonra, propilen oksit ile araldit karışımı içerisinde rotatorda 2 saat tutuldu. Bu şekilde 86 hazırlanmış olan örnekler araldit CY 212 içinde plastik bloklara gömüldü ve 48 saat 60 derecelik etüvde bekletilerek polimerizasyon sağlandı. Elde edilen araldit bloklardan LKB ultratom ile alınan 5 mikronluk yarı ince kesitlerde ince kesitler için kullanılacak sahalar tespit edildi. Daha sonra 60-90 nm kalınlıkta ince kesitler alındı; uranil asetat ve kurşun sitrat ile kontrastlandıktan sonra (boyama) JEOL JEM 1200 EX transmisyon elektron mikroskobu (Tokyo, Japoya) ile değerlendirildi, skorlama yapıldı ve fotoğraflandı. Skorlama kriterleri Tablo 4’te gösterilmektedir. Skorlama için her gruptan (5 grup) dörder örnek değerlendirmeye alındı. Her örnek için intraselüler ödem ve kapiller skoru için 20 farklı saha; glikojen, nukleus ve miyofibril skorlaması için 20 hücre incelemeye alınarak skorlandı. Mitokondri skoru için ise her örnekte 100 mitokondri değerlendirildi. Skorlama tablosu oluşturulurken literatürde yer alan tablolardan yararlanıldı (153). Bu kriterlerin belirlenmesi için bir ön inceleme yapıldı ve bu çalışma için uygun olan kriterler seçildi. 2.2.1.5.2 İzole kalp dokusunda infarkt alanı değerlendirmesi Kardiyak hücrelerde irreversibl hasar oluşumunun tespit edilebilmesi amacıyla trifeniltetrazolyum boyama ile infarkt alanı değerlendirmesi yapıldı. Tetrazolyum tuzları NADH ve dehidrogenaz enzimleri ile etkileşerek canlı dokuyu boyarlar. Ölü hücreler membran hasarı sonucu enzim ve kofaktörlerini kaybederek boyanmazlar (176). Deney sonunda streç filme sarılarak 1-2 saat -20 ˚C’de bekletilen kalpler 2-3 mm kalınlığında dilimlendi ve trifeniltetrazolyum klorürün tampon çözelti içerisinde hazırlanmış %1’lik çözeltisinin içerisine alındı. Kalp kesitleri 37˚C’de 15-20 dakika süresince boya çözeltisi ile inkübe edildikten sonra %10’luk formalin çözeltisi kullanılarak 20 87 dakika fikse edildi. Fiksasyon sonrasında kalp kesitlerinin fotoğrafları çekilerek infarktlı doku varlığı araştırıldı. Tablo 4: Elektron mikroskobik çalışmada kullanılan skorlama kriterleri. İntraselüler ödem Glikojen Mitokondri Kapillerler Nukleus Miyofibriller Yok 0 Hafif ödem az vakuol 1 Belirgin ödem ve çok sayıda vakuol 2 Sarkolemmada yırtılma 3 Normal 0 Hafif azalma 1 Orta derecede azalma 2 Belirgin azalma veya yokluğu 3 Normal 0 Kristaların zigzag profili veya bal peteği görüntüsü 1 Kristaların destrüksiyonu 2 Mitokondrinin tam destrüksiyonu 3 Normal endotel hücreleri 0 Pinositotik veziküllerin azlığı 1 Lokalize endoteliyal şişme 2 İnterseluler birleşkelerde ayrılma ve dejenerasyon 3 Normal 0 Homojen dağılımlı kromatin 1 Topaklaşma ve marjinasyon 2 Büzüşme 3 Normal I bandları 0 Kontraksiyon bandlarının varlığı 1 İleri derecede gevşek sarkomer 2 Miyofibrillerde lizis 3 2.2.2 İzole damar çalışmaları Çalışmanın bu bölümü, sıçan torasik aortası ring preparatları üzerinde 21 gün levosimendan uygulamasının çeşitli ajanların vasküler reaktivitesi üzerindeki etkilerinin ve bu etkilerde endotelyumun rolünün araştırılması için düzenlenmiştir. 88 Kontrol grubunu (K) oluşturan hayvanlara 21 gün süre ile günde bir kez oral yoldan gastrik gavaj aracılığı ile kronik etki grubundaki sıçanlara verilene eşit miktarda çözücünün distile su içindeki solüsyonu halinde verildi. İlaç grubunu (L3) oluşturan hayvanlara ise 21 gün süre ile oral yoldan günde bir kez 0.2 mg/kg levosimendan verildi. Kontrol ve ilaç gruplarında endotelyumu sağlam (E+) ve endotelyumu mekanik olarak kazınmış (E-) sıçan torasik aorta ringleri endotelyumun olası etkisinin incelenmesi amacıyla kullanıldı. 2.2.2.1 İzole damar çalışmalarında sıçanların hazırlanması Sıçanlar anestezi uygulanmaksızın giyotin ile dekapite edilerek öldürüldü. İzole edilen torasik aortalar, fizyolojik tuz çözeltisi (Krebs) içerisine alındı ve kendisini çevreleyen bağ dokusu ve yağdan temizlendi. Temizlenen damarlar yaklaşık 2,5-3 mm uzunluğunda halka şeklinde kesilerek dört tane torasik aorta segmenti elde edildi. Bütün torasik aorta ringleri %95 O2 ve %5 CO2 ile gazlandırılan, 25 mL hacminde, sıcaklığı 37°C’de sabit tutulan ve fizyolojik tuz çözeltisi içeren organ banyosuna alındı. İnce paslanmaz çelikten uygun biçimde hazırlanmış üçgen şeklindeki klipsler halka şeklindeki preparatların lümenleri içinden geçirildi. Her bir halkanın lümeni içinden geçirilen iki klipsten biri damarı sabitlemek için organ banyosunun askısına, diğeri ise uygun uzunluktaki ip kullanılarak izometrik transdusıra bağlandı. 15 dakikalık dengeleme döneminden sonra torasik aortalar daha önceki ön denemelerle belirlenmiş olan 2.5 g’lık öngerilim düzeyine kademeli olarak gerildi. Öngerilim uygulanan damarlar 45 dakikalık stabilizasyon süresince 15 dakikalık aralıklarla organ banyolarının fizyolojik tuz çözeltileri değiştirilerek 89 yıkandı. Endoteli sağlam veya endotel tabakası mekanik olarak tahrip edilmiş damarlar deney protokolüne (bakınız Bölüm 2.2.2.2) uygun biçimde çeşitli kastırıcı ve gevşetici ajanlara maruz bırakıldı. 2.2.2.2 İzole organ banyosu deney protokolü Stabilizasyon sonrası organ banyosundaki Krebs çözeltisi 120 mM KCl içeren depolarizan Krebs çözeltisi ile değiştirilerek potasyum klorür (KCl) için kasılma yanıtları kaydedildi. Daha sonra damar preparatlarında fenilefrine (106 M) karşı kümülatif asetilkolin (Ach), (10-9- 10-4M) gevşeme yanıtları alındı ve preparatların endotelli olup olmadıkları tespit edildi. Bütün deney gruplarındaki damarlarda kümülatif fenilefrin (10-9-3x10-5M), serotonin (5-hidroksitriptamin, 5-HT), (10-9-3x10-5M) veya tek doz (10-6 M) fenilefrine karşı kümülatif nitrogliserin (NG), (10-9-3x10-5M) konsantrasyon-yanıt eğrileri alındı. Her konsantrasyon-yanıt eğrisi sonunda dokular 30 dakika dinlenmeye bırakıldı ve bu sırada her 15 dakikada bir banyo çözeltisi değiştirildi. 2.3 Deneylerde kullanılan cihazlar ve yazılımlar İzole kalp deneyleri Langendorff düzeneğinde (Commat Ltd., Ankara, Türkiye) gerçekleştirildi. Deneyler süresince Tyrode çözeltisinin temperatürü sirkülatörlü su banyosu (Commat Ltd., Ankara, Türkiye) yardımıyla 37°C’ de sabit tutuldu ve kalpler Masterflex L/S pompa (7518-10, Cole-Parmer, Ilinois, ABD) ile sabit hızda perfüze edildi. Kalbin fonksiyonel işlevlerindeki değişiklikler Biopac MP35 veri kazanım sistemi ile Biopac Student Lab PRO 3.7.0 yazılımı (CA, ABD) kullanılarak kaydedildi. 90 Koroner akımdan CK-MB tayini BioDPC Immulite 1000 (CA, ABD) cihazında yapıldı. Kalp dokuları Potter-Elverhjem homojenizatör (B.Braun, Almanya) kullanılarak homojenize edildi. Kalp dokusunda cAMP tayini Multi-Detection Microplate Reader (Synergy Ht, Biotek Instruments, Inc, ABD) cihazında yapıldı. Kalp dokusunda total protein miktar tayini Multi-Detection Microplate Reader (Synergy Ht, Biotek Instruments, Inc, ABD) cihazında yapıldı. Kalp kesitlerinin fotoğrafları Fuji finepix 9500 ile çekildi. Kalp kesitlerinde hücresel yapıların değerlendirilmesi JEOL JEM 1200 EX (Tokyo, Japonya) marka transmisyon elektron mikroskobu kullanılarak yapıldı. İzole damar deneyleri 25 mL’lik deney hacmine sahip Schuler tipi izole organ banyolarında gerçekleştirildi. Bu deneyler boyunca Krebs çözeltisinin temperatürü Nüve BM 402 (Ankara, Türkiye) marka termostatlı sirkülatörler ile 37°C’ de sabit tutuldu. Agonist uygulanmasına bağlı olarak torasik aorta ringlerinin gerilimlerindeki değişimler Grass FT03 izometrik transduser (ABD) ile ölçüldü ve BIOPAC MP100 (CA, ABD) veri kazanım sistemi ve farmakolojik deney yazılımı kullanılarak bilgisayarla izlenerek ve kaydedildi. 2.4 Araştırmada kullanılan çözeltiler ve ilaçlar 2.4.1 Fizyolojik tuz çözeltileri İzole kalp deneylerinde fizyolojik tuz çözeltisi olarak Tyrode çözeltisi, izole damar deneylerinde ise Krebs çözeltisi kullanıldı. Kullanılan çözeltilerin bileşimi Tablo 5’te verilmektedir. 91 Tablo 5: İzole kalp ve izole damar deneylerinde kullanılan fizyolojik tuz çözeltilerinin bileşimi Krebs Tyrode g/L mM g/L mM NaCl 6.90 118.00 7.50 128.00 KCl 0.35 4.70 0.35 4.70 MgCl2 - - 0.10 1.00 CaCl2 * 0.37 2.50 0.15 1.30 KH2PO4 0.16 1.20 - - MgSO4.7H2O 0.30 1.17 - - NaH2PO4 - - 0.05 0.40 NaHCO3 2.10 25.00 1.70 20.20 Glukoz * 2.00 11.10 2.00 11.00 * Krebs çözeltisi hazırlanırken CaCl2.2H2O, glukoz.H2O kullanılmıştır 2.4.2 Fosfat tamponları 2.4.2.1 Sorenson Fosfat tamponu Disodyum hidrojen fosfat (Na2HPO4) ve potasyum dihidrojen fosfatın (KH2PO4 ) 1/15 Molarlık çözeltileri distile su içerisinde hazırlandıktan sonra iki çözelti pH’sı 7.38 olacak şekilde karıştırılarak Sorenson Fosfat Tamponu hazırlandı. 2.4.2.2 Trifeniltetrazolyum boyamada kullanılan tampon çözelti 0.1 M Sodyum dihidrojen fosfat (NaH2PO4) ve 0.1 M Disodyum hidrojen fosfat (Na2HPO4) çözeltileri hazırlandı. Bu çözeltiler pH’sı 7.4 olacak şekilde karıştırılarak trifeniltetrazolyum boyamada kullanılacak olan tampon çözelti hazırlandı. 92 2.4.3 Araştırmada kullanılan ilaçlar Aşağıda araştırmada kullanılan ilaçların listesi verilektedir. Farmakolojik ajan Üretici firma/Kaynak Levosimendan Simdax (Abbott) Asetilkolin HCl Merck Fenilefrin HCl Sigma Potasyum Klorür Merck Serotonin Sigma Nitrogliserin Merck Glutaraldehit Agar Trifeniltetrazolyum Klorür Merck 2.4.3.1 İlaç çözeltilerinin hazırlanması Levosimendan: Oral yoldan gastrik gavaj ile sıçanlara verilen levosimendan çözeltisi ilacın ticari preparatının distile su içerisindeki çözeltisi (16 µg/mL) şeklinde hazırlandı. Akut etki deneylerinde kullanılan 100 µM stok levosimendan çözeltisi Tyrode çözeltisi içinde hazırlanarak daha sonraki seyreltmeler yine Tyrode çözeltisi ile yapıldı. Asetilkolin: 10-1 M’lık stok çözelti distile su ile taze hazırlandı, daha sonraki dilüsyonlar %0,9’luk NaCl ile yapıldı. Fenilefrin: 10-1 M’lık stok çözelti distile su ile taze hazırlandı, daha sonraki dilüsyonlar %0,9’luk NaCl ile yapıldı. Potasyum Klorür: 120 mM KCl içeren depolarizan Krebs çözeltisi şeklinde hazırlandı. Krebs çözeltisinin bileşimi (g/L): NaCl, 0.16; KCl, 8.95; MgSO4.7H2O, 0.30; KH2PO4, 0.16; CaCl2.2H2O, 0.37; CaEDTA, 0.01; NaHCO3, 0.21 ve glukoz.H2O, 0.2 şeklindedir. Serotonin: 10-2 M’lık stok çözelti distile su ile taze olarak hazırlandı, daha sonraki dilüsyonlar %0,9’luk tuzlu su ile hazırlandı. 93 Nitrogliserin: 4.4x10-2 M’lık stok çözeltiden %0,9’luk tuzlu su ile dilüe edilerek hazırlandı. Glutaraldehit: % 25 EM grade Glutaraldehtitten 10 mL, Sorenson Fosfat tamponundan 90 mL alınarak hazırlandı. Trifeniltetrazolyum Klorür: Tampon çözelti içerisinde %1’lik (1g/100mL) hazırlandı. 2.5 Verilerin analizi Aritmi ve elektron mikroskobik skorlar [medyan (minimum ve maksimum değer)] olarak, diğer tüm veriler ortalama ± ortalamanın standart hatası (Ort. ± O.S.H.) olarak verildi ve “n” izole perfüze kalp deneylerinde kalplerin izole edildiği hayvan sayısını ve izole damar çalışmalarında damarların izole edildiği hayvan sayısını göstermektedir. İzole damar çalışmalarında gevşemeler önkastırıcıya verilen yanıtın yüzdesi olarak ifade edilmiştir. Endoteli korunmuş torasik aorta ringlerinde asetilkoline %50’den daha fazla maksimum gevşeme yanıtı veren damar halkaları endotelli kabul edildi. Mekanik olarak endotelsizleştirme uygulanan damar halkalarında asetilkolin gevşeme yanıtı gözlenmediği durumlarda damarlar endotelsiz kabul edildi. Maksimum kasılmanın veya gevşemenin yarısını oluşturan konsantrasyonun negatif logaritması (-logEC50 veya pD2) her agonist için iteratif non-lineer regresyon kullanılarak yapıldı. Bunun için MarquardtLevendberg algoritmasını kullanan GraphPad Prism 4.03 for Windows (GraphPad Software, San Diego, CA) bilgisayar yazılımı kullanıldı. 94 Verilerin analizi SPSS 9.05 (Chicago, IL, ABD) programında yapıldı. Aynı hayvandan elde edilen veriler için “Wilcoxon matched-pairs signed rank test” ve farklı hayvandan elde edilen veriler için “Mann-Whitney U-test” kullanıldı. Aritmi skorlarının değerlendirilmesinde “Chi-kare test”i kullanıldı. EM skorlarının değerlendirilmesi “Kruskal Wallis Test” sonrasında “Mann-Whitney U-test” ve “Jonckheere Test for Ordered Alternatives” kullanılarak yapıldı. p değerleri 0.05’den küçük bulunduğunda fark istatistiksel olarak anlamlı kabul edildi. 95 3 BULGULAR 3.1 İzole kalplerde ölçülen fonksiyonel parametreler 3.1.1 İskemi süresinin etkilerinin incelendiği deney grupları 3.1.1.1 Diyastol sonu basınç (LVDP) Kontrol grubunda ve 15dk iskemi uygulanan grupta LVDP deney süresince değişmemiştir. 45dk iskemi uygulanan izole sıçan kalplerinde LVDP perfüzyonun 100. dakikasında anlamlı olarak azalmış (p<0.05) fakat deney sonunda bazal değerlere dönmüştür. 30dk ve 60dk iskemi uygulanan gruplarda izole sıçan kalplerinde LVDP iskemi sonrasında anlamlı şekilde azalmıştır ve bu azalma deney sonuna kadar devam etmiştir (p<0.05) (Şekil 9). Bütün gruplarda stabilizasyon sonu (30. dk), reperfüzyonun 10. dakikası (100. dk) ve reperfüzyon sonunda (120. dk) kaydedilen LVDP değerleri Tablo 6’da gösterilmektedir. 3.1.1.2 Kasılmanın maksimum hızı (+dP/dtmaks) Kontrol grubunda, 15dk, 30dk ve 45dk iskemi uygulanan gruplarda izole sıçan kalplerinde +dP/dtmaks deney sonunda değişmemiştir. 30dk, 45dk ve 60dk iskemi uygulanan grubunda +dP/dtmaks iskemiden sonra anlamlı şekilde azalmıştır (p<0.05). Bu değerde gözlenen azalma 30dk ve 45dk iskemi uygulanan gruplarda deney sonunda bazal değere dönerken 60dk iskemi grubunda deney sonunda da +dP/dtmaks değeri azalmış olarak kalmıştır (p<0.05) (Şekil 10). Bütün gruplarda stabilizasyon sonu (30. dk), reperfüzyonun 10. dakikası (100. dk) ve reperfüzyon sonunda (120. dk) kaydedilen +dP/dtmaks değerleri Tablo 6’da gösterilmektedir. LVDP * * * Basınç (mmHg) 100 30. dk 50 100. dk 120. dk i m is ke dk 60 30 45 dk dk is ke is ke m i i m i is ke m 15 dk Ko nt ro l 0 Şekil 9: İskemi süresinin etkilerinin incelendiği deney gruplarında diyastol sonu basıncı Stabilizasyon sonrası (30. dk, □), reperfüzyonun 10. dk’sı (100. dk, ) ve reperfüzyon sonu (120. dk, ■). (*p<0.05, Wilcoxon matched-pairs signed rank test, 30. dakika ile 100. ve 120. dakikalar arasında) +dP/dtmaks * * * mmHg/sn 3000 2000 30. dk 100. dk 120. dk 1000 i 60 dk ke m is dk 45 is ke m i i is ke m 30 dk is ke m 15 dk Ko nt ro l i 0 Şekil 10: İskemi süresinin etkilerinin incelendiği deney gruplarında kasılmanın maksimum hızı Stabilizasyon sonrası (30. dk, □), reperfüzyonun 10. dk’sı (100. dk, ) ve reperfüzyon sonu (120. dk, ■). (*p<0.05, Wilcoxon matched-pairs signed rank test, 30. dakika ile 100. ve 120. dakikalar arasında) 97 3.1.1.3 Gevşemenin maksimum hızı (-dP/dtmaks) Kontrol grubunda ve 15dk iskemi uygulanan grupta -dP/dtmaks deney süresince değişmemiştir. 45dk iskemi uygulanan izole sıçan kalplerinde -dP/dtmaks perfüzyonun 100. dakikasında anlamlı olarak artmış (p<0.05) fakat deney sonunda bazal değerlere dönmüştür. 30dk ve 60dk iskemi uygulanan gruplarda izole sıçan kalplerinde -dP/dtmaks iskemi süresi sonrasında anlamlı şekilde azalmıştır ve bu azalma deney sonunda da devam etmiştir (p<0.05) (Şekil 11). Bütün gruplarda stabilizasyon sonu (30.dk), reperfüzyonun 10. dakikası (100. dk) ve reperfüzyon sonunda (120.dk) kaydedilen -dP/dtmaks değerleri Tablo 6’da gösterilmektedir. -dP/dtmaks * mmHg/sn * * 2000 1000 30. dk 100. dk 120. dk i em i dk 60 dk is k is k em i em 45 30 dk is k is k dk 15 Ko nt ro l em i 0 Şekil 11: İskemi süresinin etkilerinin incelendiği deney gruplarında gevşemenin maksimum hızı Stabilizasyon sonrası (30. dk, □), reperfüzyonun 10. dk’sı (100. dk, ) ve reperfüzyon sonu (120. dk, ■). (*p<0.05, Wilcoxon matched-pairs signed rank test, 30. dakika ile 100. ve 120. dakikalar arasında) 98 3.1.1.4 Kalbin dakikadaki atım hızı Kontrol grubunda ve 15dk iskemi uygulanan grupta izole sıçan kalplerinde dakikadaki atım hızı deney süresince değişmemiştir. 30dk ve 45dk iskemi gruplarında dakikadaki atım hızı deney sonunda anlamlı şekilde azalmıştır (p<0.05). 60dk iskemi uygulanan grupta reperfüzyon sonrasında gelişen vetnriküler fibrilasyon nedeniyle izole kalplerde gözlenen atım hızı artışına büyük bir standart hata eşlik ettiğinden bu grupta 100. dakikada gözlemlenen atım hızı artışı istatistiksel olarak anlamlı değildir, bu grupta deney sonunda da izole kalplerde dakikadaki atım hızı değişmemiştir (Şekil 12). Bütün gruplarda stabilizasyon sonu (30.dk), reperfüzyonun 10. dakikası (100. dk) ve reperfüzyon sonunda (120.dk) kaydedilen dakikadaki atım hızı değerleri Tablo 6’da gösterilmektedir. Atım hızı atım/dk 400 * * 300 200 30. dk 100. dk 120. dk 100 i m ke is dk 60 dk 45 dk 30 is is ke ke m m i i ke m i is dk 15 Ko nt ro l 0 Şekil 12: İskemi süresinin etkilerinin incelendiği deney gruplarında kalbin dakikadaki atım hızı Stabilizasyon sonrası (30. dk, □), reperfüzyonun 10. dk’sı (100. dk, ) ve reperfüzyon sonu (120. dk, ■). (*p<0.05, Wilcoxon matched-pairs signed rank test, 30. dakika ile 120. dakika arasında) 99 3.1.1.5 Perfüzyon basıncı Kontrol grubunda ve 15dk iskemi uygulanan grupta izole sıçan kalplerinde perfüzyon basıncı deney süresince değişmemiştir. 30dk, 45dk ve 60dk iskemi grubunda perfüzyon basıncı iskemi sonrasında anlamlı şekilde artmıştır (p<0.05). Perfüzyon basıncında gözlenen artış 30dk ve 45dk iskemi gruplarında reperfüzyon sonunda bazal değere dönerken 60dk iskemi grubunda deney sonunda perfüzyon basıncı artışı istatistiksel olarak anlamlıdır (p<0.05) (Şekil 13). Bütün gruplarda stabilizasyon sonu (30.dk), reperfüzyonun 10. dakikası (100. dk) ve reperfüzyon sonunda (120.dk) kaydedilen perfüzyon basıncı değerleri Tablo 6’da gösterilmektedir. Basınç (mmHg) Perfüzyon basıncı * 200 * * 100 30. dk 100. dk 120. dk i ke m i 60 dk is em is k 45 dk is k em i i 30 dk ke m is 15 dk Ko nt ro l 0 Şekil 13: İskemi süresinin etkilerinin incelendiği deney gruplarında perfüzyon basıncı Stabilizasyon sonrası (30. dk, □), reperfüzyonun 10. dk’sı (100. dk, ) ve reperfüzyon sonu (120. dk, ■). (*p<0.05, Wilcoxon matched-pairs signed rank test, 30. dakika ile 100. ve 120. dakikalar arasında) 100 Tablo 6: İskemi süresinin etkilerinin incelendiği deney gruplarında kalplerde ölçülen fonksiyonel parametreler Stabilizasyon sonrası (30. dk), reperfüzyonun 10. dakikası (100. dk) ve reperfüzyon sonunda (120. dk) ölçülen kalbin fonksiyonel parametreleri, (*p<0.05, Wilcoxon matched-pairs signed rank test, 30. dakika ile 100. ve 120. dakikalar arasında) Kontrol 15dk iskemi 30dk iskemi 45dk iskemi 60dk iskemi 30. dk 97±11 95±9 99±7 94±6 97±5 100.dk 97±5 71±10 61±6 * 83±6 * 63±20 120. dk 96±4 82±6 95±6 * 98±3 84±6 * LVDP (mmHg) +dP/dt maks (mmHg/sn) 30. dk 3020±306 3090±128 3228±224 3033±140 2954±134 100.dk 3055±98 2106±266 1854±202 * 2400±205 * 1804±527 * 120. dk 2974±95 2726±170 3091±166 3164±143 2588±229 * -dP/dt maks (mmHg/sn) 30. dk 1767±204 1778±55 1844±123 1684±96 1695±56 100.dk 1731±97 1184±207 955±103 * 1388±131 * 1195±221 * 120. dk 1654±73 1410±148 1578±91 * 1660±95 1443±107 * Kalbin dakikadaki atım hızı (atım/dk) 30. dk 274±8 251±9 246±6 263±8 251±10 100.dk 273±13 248±10 246±7 260±12 356±68 120. dk 264±9 236±2 220±10 * 233±8 * 236±9 Perfüzyon Basıncı (mmHg) 30. dk 202±11 170±8 178±5 178±7 152±8 100.dk 215±9 160±6 124±12 * 105±7 * 90±8 * 120. dk 220±9 180±5 177±4 186±6 162±8 * 3.1.1.6 Aritmi insidansı ve süresi Kalbe yerleştirilen iki iğne elektrod aracılığı ile bipolar EKG kaydı yapılarak aritmi insidansı ve süresi değerlendirilmiştir. Sıçan kalplerinde kontrol grubu ile karşılaştırıldığında 15dk, 30dk, 45dk ve 60dk iskemi uygulanan bütün gruplarda 90. ile 100. dakikalar arasında aritmi insidansı ve süresinin istatistiksel olarak anlamlı 101 bir şekilde arttığı (p<0.05) gözlemlenmiştir. İskemi süresinin etkilerinin incelendiği deney gruplarında aritmi skorlarının medyan (min-maks) değerleri Tablo7’de gösterilmektedir. Tablo 7: İskemi süresinin etkilerinin incelendiği deney gruplarında 90. ile 100. dakikalar arasında gözlenen aritmi insidansı ve süresi *p<0.05, Chi-kare testi, kontrole karşı Aritmi skoru Kontrol 1 (1-1) 15 dk iskemi 3 (2-4) * 30 dk iskemi 4 (2-5) * 45 dk iskemi 4 (3-5) * 60 dk iskemi 5 (4-6) * 3.1.2 Levosimendanın etkilerinin incelendiği deney grupları 3.1.2.1 Diyastol sonu basınç (LVDP) Normal perfüzyon protokolü uygulanan kontrol, levosimendan akut ve kronik etki gruplarındaki izole sıçan kalplerinde LVDP deney süresince değişmemiştir (Tablo 8). İskemi hasarı protokolü uygulanarak 30 dk iskemiye maruz bırakılan kontrol grubuna ait sıçanların kalplerinde LVDP anlamlı şekilde azalmıştır (p<0.05). Akut ve kronik olarak levosimendan verilen sıçanların kalplerinde iskemi hasarı protokolü sonrasında diyastol sonu basınç azalması gözlenmemiştir. Sadece L3 grubunda reperfüzyonun 10. dakikasında gözlenen LVDP azalması (p<0.05) deney sonunda normale dönmüştür (Şekil 14, Tablo 8). İskemik önkoşullama protokolü uygulanan kontrol, levosimendan akut ve kronik etki gruplarındaki izole sıçan kalplerinde LVDP deney süresince değişmemiştir (Tablo 8). 102 LVDP İskemi hasarı * Basınç (mmHg) 100 * 75 50 30. dk 100. dk 120. dk 25 0 Kontrol LA L1 L2 L3 Şekil 14: Levosimendanın etkilerinin incelendiği iskemi hasarı protokolü uygulanan sıçan kalplerinde diyastol sonu basıncı Stabilizasyon sonrası (30. dk, □), reperfüzyonun 10. dakikası (100. dk, ) ve reperfüzyon sonu (120. dk, ■). (*p<0.05, Wilcoxon matched-pairs signed rank test, 30. dakika ile 100. ve 120. dakikalar arasında) Tablo 8: Levosimendanın etkilerinin incelendiği deney gruplarında diyastol sonu basıncı Stabilizasyon sonrası (30. dk), reperfüzyonun 10. dakikası (100. dk) ve reperfüzyon sonu (120. dk). (*p<0.05, Wilcoxon matched-pairs signed rank test, 30. dakika ile 100. ve 120. dakikalar arasında) LVDP (mmHg) Kontrol LA L1 L2 L3 Normal perfüzyon 30.dk 82±8 81±8 65±3 70±4 71±3 100.dk 80±5 86±1 68±4 73±6 72±4 120.dk 74±4 81±5 67±3 69±6 68±3 30.dk 84±12 80±6 66±4 76±9 63±2 100.dk 65±11 * 68±7 46±6 61±8 48±3 * 120.dk 69±9 * 77±8 64±7 70±8 60±3 İskemi hasarı İskemik önkoşullama 30.dk 69±5 96±13 93±5 72±5 82±8 100.dk 53±5 80±14 83±3 57±8 72±8 120.dk 68±7 92±11 94±3 73±5 81±7 103 3.1.2.2 Kasılmanın maksimum hızı (+dP/dtmaks) Normal perfüzyon protokolü uygulanan kontrol, levosimendan akut ve kronik etki gruplarındaki izole sıçan kalplerinde sistolik fonksiyonun belirteci olan +dP/dtmaks deney süresince değişmemiştir (Tablo 9). İskemi hasarı protokolü uygulanarak 30 dk iskemiye maruz bırakılan kontrol grubuna ait sıçanların kalplerinde +dP/dtmaks anlamlı şekilde azalmıştır (p<0.05). Akut ve kronik olarak levosimendan verilen sıçanların kalplerinde iskemi hasarı protokolü sonrasında +dP/dtmaks azalması gözlenmemiştir. Sadece L3 grubunda reperfüzyonun 10. dakikasında gözlenen LVDP azalması (p<0.05) deney sonunda normale dönmüştür (Şekil 15, Tablo 9). İskemik önkoşullama protokolü uygulanan kontrol, levosimendan akut ve kronik etki gruplarındaki izole sıçan kalplerinde +dP/dtmaks deney süresince değişmemiştir (Tablo 9). +dP/dt maks İskemi hasarı * mmHg/sn 3000 * 2000 30. dk 100. dk 120. dk 1000 0 Kontrol LA L1 L2 L3 Şekil 15: Levosimendanın etkilerinin incelendiği iskemi hasarı protokolü uygulanan sıçan kalplerinde kasılmanın maksimum hızı Stabilizasyon sonrası (30. dk, □), reperfüzyonun 10. dakikası (100. dk, ) ve reperfüzyon sonu (120. dk, ■). (*p<0.05, Wilcoxon matched-pairs signed rank test, 30. dakika ile 100. ve 120. dakikalar arasında) 104 Tablo 9: Levosimendanın etkilerinin incelendiği deney gruplarında kasılmanın maksium hızı Stabilizasyon sonrası (30. dk), reperfüzyonun 10. dakikası (100. dk) ve reperfüzyon sonu (120. dk). (*p<0.05, Wilcoxon matched-pairs signed rank test, 30. dakika ile 100. ve 120. dakikalar arasında) Kasılmanın maksimum hızı (+dP/dtmaks) (mmHg/sn) Kontrol LA L1 L2 L3 Normal perfüzyon 30.dk 2562±231 2599±305 1967±122 2200±203 2268±132 100.dk 2554±178 2813±110 2125±90 2348±212 2395±146 120.dk 2346±139 2606±187 2085±90 2178±201 2217±132 30.dk 2665±364 2547±148 1975±128 2310±353 1914±69 100.dk 1927±319 * 2037±212 1342±138 1789±275 1450±100 * 120.dk 2156±269 * 2418±212 1995±221 2235±327 1932±89 İskemi hasarı İskemik önkoşullama 30.dk 2369±213 3057±386 3101±179 2342±67 2660±190 100.dk 1739±151 2518±433 2605±88 1761±203 2179±199 120.dk 2340±233 3004±334 3166±109 2426±78 2641±196 3.1.2.3 Gevşemenin maksimum hızı (-dP/dtmaks) Normal perfüzyon protokolü uygulanan kontrol, levosimendan akut ve kronik etki gruplarındaki izole sıçan kalplerinde diyastolik fonksiyonun belirteci olan -dP/dtmaks deney süresince değişmemiştir (Tablo 10). İskemi hasarı protokolü uygulanarak 30 dk iskemiye maruz bırakılan kontrol grubuna ait sıçanların kalplerinde -dP/dtmaks anlamlı şekilde azalmıştır (p<0.05). Akut ve kronik olarak levosimendan verilen sıçanların kalplerinde iskemi hasarı protokolü sonrasında -dP/dtmaks azalması gözlenmemiştir (Şekil 16, Tablo 10). İskemik önkoşullama protokolü uygulanan kontrol, levosimendan akut ve kronik etki gruplarındaki izole sıçan kalplerinde -dP/dtmaks deney süresince değişmemiştir (Tablo 10). 105 -dP/dtmaks İskemi hasarı * mmHg/sn 2000 1000 30. dk 100. dk 120. dk 0 Kontrol LA L1 L2 L3 Şekil 16: Levosimendanın etkilerinin incelendiği iskemi hasarı protokolü uygulanan sıçan kalplerinde gevşemenin maksimum hızı Stabilizasyon sonrası (30. dk, □), reperfüzyonun 10. dakikası (100. dk, ) ve reperfüzyon sonu (120. dk, ■). (*p<0.05, Wilcoxon matched-pairs signed rank test, 30. dakika ile 100. ve 120. dakikalar arasında) Tablo 10: Levosimendanın etkilerinin incelendiği deney gruplarında gevşemenin maksimum hızı Stabilizasyon sonrası (30. dk), reperfüzyonun 10. dakikası (100. dk) ve reperfüzyon sonu (120. dk). (*p<0.05, Wilcoxon matched-pairs signed rank test. 30. dakika ile 100. ve 120. dakikalar arasında) Gevşemenin maksimum hızı (-dP/dtmaks) (mmHg/sn) Kontrol LA L1 L2 L3 Normal perfüzyon 30.dk 1560±176 1722±202 1145±64 1395±110 1405±79 100.dk 1457±146 1643±73 1235±67 1397±133 1414±64 120.dk 1342±107 1553±133 1184±54 1285±139 1280±53 30.dk 1703±274 1589±99 1286±75 1587±152 1098±59 100.dk 1146±213 * 1225±108 811±91 1124±150 806±54 120.dk 1268±198 * 1432±137 1171±131 1469±152 1057±45 İskemi hasarı İskemik önkoşullama 30.dk 1551±160 1965±239 1904±133 1425±57 1493±124 100.dk 1027±79 1569±247 1505±57 1020±123 1203±127 120.dk 1384±139 1856±189 1857±99 1408±57 1440±129 106 3.1.2.4 Kalbin dakikadaki atım hızı Normal perfüzyon protokolü uygulanan kontrol, LA ve L1 gruplarındaki izole sıçan kalplerinde kalbin dakikadaki atım hızı deney süresince değişmemiştir. L2 grubunda deneyin 100. ve 120. dakikasında, ayrıca L3 grubunda deneyin 120. dakikasında kalbin dakikadaki atım hızı anlamlı şekilde azalmıştır (p<0.05) (Tablo 11). İskemi hasarı protokolü uygulanarak 30 dk iskemiye maruz bırakılan kontrol grubuna ait sıçanların kalplerinde kalp hızı reperfüzyon sonunda anlamlı şekilde azalmıştır (p<0.05). Akut ve kronik olarak levosimendan verilen sıçanların kalplerinde iskemi hasarı protokolü sonrasında kalbin atım hızında azalma gözlenmemiştir (Şekil 17, Tablo 11). İskemik önkoşullama protokolü uygulanan kontrol, levosimendan akut ve kronik etki gruplarındaki izole sıçan kalplerinde kalp hızı deney süresince değişmemiştir (Tablo 11). Atım hızı İskemi hasarı atım/dk 300 * 200 30. dk 100. dk 120. dk 100 0 Kontrol LA L1 L2 L3 Şekil 17: Levosimendanın etkilerinin incelendiği iskemi hasarı protokolü uygulanan sıçan kalplerinde kalbin dakikadaki atım hızı Stabilizasyon sonrası (30. dk, □), reperfüzyonun 10. dakikası (100. dk, ) ve reperfüzyon sonu (120. dk, ■). (*p<0.05, Wilcoxon matched-pairs signed rank test, 30. dakika ile 120. dakika arasında) 107 Tablo 11: Levosimendanın etkilerinin incelendiği deney gruplarında kalbin dakikadaki atım hızı Stabilizasyon sonrası (30. dk), reperfüzyonun 10. dakikası (100. dk) ve reperfüzyon sonu (120. dk). (*p<0.05, Wilcoxon matched-pairs signed rank test, 30. dakika ile 100. ve 120. dakikalar arasında) Dakikadaki atım hızı (atım/dk) Kontrol LA L1 L2 L3 Normal perfüzyon 30.dk 267±20 293±10 277±13 283±16 280±11 100.dk 241±17 277±8 279±17 255±8 * 279±11 120.dk 234±13 276±8 275±19 252±5 * 268±9 * 30.dk 277±9 269±12 272±17 291±25 271±15 100.dk 255±14 236±21 281±12 316±26 291±13 120.dk 229±26 * 226±11 253±15 291±18 266±8 İskemi hasarı İskemik önkoşullama 30.dk 285±24 264±11 279±18 295±15 239±9 100.dk 265±11 243±8 253±7 286±17 229±14 120.dk 236±17 247±7 255±17 279±16 215±7 3.1.2.5 Perfüzyon basıncı Normal perfüzyon protokolü uygulanan kontrol, LA, L1 ve L3 gruplarındaki izole sıçan kalplerinde aort perfüzyon basıncı deney süresince artma yönünde bir eğilim göstermiş olmasına rağmen bu artış istatistiksel anlamlılığa ulaşmamıştır. L2 grubundaki kalplerde ise perfüzyon basıncı deney sonunda anlamlı şekilde artmıştır (p<0.05) (Tablo 12). İskemi hasarı protokolü uygulanarak 30 dk iskemiye maruz bırakılan kontrol ve L3 gruplarına ait sıçanların kalplerinde perfüzyon basıncı reperfüzyonun 10. dakikasında azalmış, deney sonunda ise anlamlı şekilde artmıştır (p<0.05). LA, L1 ve L2 gruplarındaki sıçanların kalplerinde iskemi hasarı protokolü sonrasında perfüzyon basıncı artışı gözlenmemiştir (Şekil 18, Tablo 12). İskemik önkoşullama protokolü uygulanan kontrol, levosimendan akut ve 108 kronik etki gruplarındaki izole sıçan kalplerinde perfüzyon basıncı deney süresince değişmemiştir (Tablo 12). Basınç (mmHg) 200 Perfüzyon basıncı İskemi hasarı * * 100 30. dk 100.dk 120. dk 0 Kontrol LA L1 L2 L3 Şekil 18: Levosimendanın etkilerinin incelendiği iskemi hasarı protokolü uygulanan sıçan kalplerinde perfüzyon basıncı Stabilizasyon sonrası (30. dk, □) reperfüzyonun 10. dakikası (100. dk, ) ve reperfüzyon sonu (120. dk, ■). (*p<0.05, Wilcoxon matched-pairs signed rank test, 30. dakika ile 100. ve 120. dakikalar arasında) Tablo 12: Levosimendanın etkilerinin incelendiği deney gruplarında perfüzyon basıncı Stabilizasyon sonrası (30. dk), reperfüzyonun 10. dakikası (100. dk) ve reperfüzyon sonu (120. dk). (*p<0.05, Wilcoxon matched-pairs signed rank test, 30. dakika ile 100. ve 120. dakikalar arasında) Perfüzyon basıncı (mmHg) Kontrol LA L1 L2 L3 Normal perfüzyon 30.dk 129±5 126±7 145±13 142±6 150±7 100.dk 163±3 135±7 161±9 152±4 149±6 120.dk 161±2 140±6 163±7 154±4 * 150±6 30.dk 132±5 111±11 145±13 110±15 157±13 100.dk 119±6 * 98±10 103±18 89±15 117±15 * 120.dk 157±5 * 127±12 152±7 123±13 168±11 * İskemi hasarı İskemik önkoşullama 30.dk 139±8 112±15 97±6 127±5 136±8 100.dk 108±11 113±10 79±3 92±17 105±7 120.dk 144±6 125±8 105±5 133±12 135±8 109 3.1.2.6 Aritmi insidansı ve süresi Kontrol ve levosimendan tedavi gruplarında 90. ile 100. dakikalar arasında aritmi insidansı ve süresi incelendiğinde perfüzyon protokollerinin üçünde de gruplar arasında bir fark olmadığı gözlemlenmiştir. Perfüzyon protokolleri karşılaştırıldığında, kontrol, LA, L2 ve L3 gruplarında normal perfüzyon ile iskemi hasarı ve yine normal perfüzyon ile iskemik önkoşullama uygulanan gruplar arasında 90. ile 100. dakikalar arasında aritmi insidansı ve süresinin istatistiksel olarak anlamlı bir şekilde arttığı (p<0.05) gözlemlenmiştir. Levosimendanın etkilerinin incelendiği deney gruplarında aritmi skorlarının medyan (min-maks) değerleri Tablo 13’te gösterilmektedir. Tablo 13: Levosimendanın etkilerinin incelendiği deney gruplarında 90. ile 100. dakikalar arasında gözlenen aritmi insidansı ve süresi *p<0.05, Chi-kare testi, normal perfüzyon protokolüne karşı Aritmi skoru Normal perfüzyon İskemi hasarı İskemik önkoşullama Kontrol 1 (1-1) 2 (2-3) * 3 (2-3) * Akut 1 (1-1) 3 (2-3) * 3 (2-4) * L1 1.5 (1-2) 4 (2-5) 2 (1-5) L2 1 (1-1) 3 (2-3) * 4 (2-5) * L3 1 (1-1) 3 (2-3) * 2.5 (2-3) * 3.2 İzole kalplerde ölçülen biyokimyasal parametreler 3.2.1 İskemi süresinin etkilerinin incelendiği deney gruplarında koroner akımda CK-MB değerleri Bütün deney gruplarından deney süresince 30., 90. ve 120. dakikalarda toplanan koroner akımdan kreatin kinaz miyokardiyal izoenzim CK-MB ölçümleri yapılmıştır. Kontrol grubunda bazal olarak ölçülen (30.dk) CK-MB 110 değerlerinin 120 dakika süren protokol sonunda istatistiksel olarak anlamlı bir şekilde azaldığı gözlemlenmiştir (p<0.05). 15 ve 30 dk iskemi uygulanan kalplerde deney süresince CK-MB değerleri değişmemiştir. 45 dk iskemi uygulanan kalplerde bazal değerlerle karşılaştırıldığında iskemi sonrası (90.dk) okunan CK-MB değerlerinin istatistiksel olarak anlamlı bir şekilde (p<0.05) arttığı gözlemlenmiştir. 60 dk iskemi uygulanan kalplerde iskemi sonrasında CK-MB değerlerinde gözlenen artış istatistiksel anlamlılığa ulaşmamasına karşın 90 ile 120. dakikalar karşılaştırıldığında 120. dakikada CK-MB değerlerinin istatistiksel olarak anlamlı bir şekilde azaldığı (p<0.05) görülmüştür. Tüm gruplarda yapılan CK-MB ölçümlerine ilişkin değerler Tablo 14’te verilmiştir. Tablo 14: İskemi süresinin etkilerinin incelendiği deney gruplarında koroner akımda ölçülen CK-MB değerleri (*p<0.05, Wilcoxon matched-pairs signed rank test, 30.dakika ile 90. ve 120. dakikalar arasında; !p<0.05, Wilcoxon matched-pairs signed rank test, 90. dakika ile 120. dakika arasında) CK-MB (ng/mL) 30. dk 90. dk 120. dk Kontrol 1.80±0.06 1.84±0.12 1.64±0.05 * İskemi 15 1.64±0.11 2.02±0.17 1.87±0.10 İskemi 30 1.97±0.13 1.76±0.08 1.78±0.10 İskemi 45 1.54±0.12 1.93±0.11 * 1.97±0.15 İskemi 60 1.92±0.06 2.11±0.11 1.90±0.08 ! 3.2.2 Levosimendanın etkilerinin incelendiği deney gruplarında koroner akımda CK-MB değerleri Levosimendanın etkilerinin incelendiği deney gruplarından deney süresince 30., 60., 90. ve 120. dakikalarda toplanan koroner akımdan kreatin kinaz miyokardiyal izoenzim CK-MB ölçümleri yapılmıştır. İskemi hasarı 111 grubunda kontrol kalplerden alınan koroner akım örneklerinin bazal (30. dk) CK-MB değerlerine göre perfüzyon sonunda 120. dakikada alınan örneklerdeki CK-MB değerlerinde ve iskemi sonrasında (90. dk) değerlerine göre yine perfüzyon sonunda (120. dk) alınan örneklerdeki CK-MB değerlerinde istatistiksel olarak anlamlı (p<0.05) bir azalma olduğu belirlenmiştir. Diğer grupların koroner perfüzatlarında yapılan CK-MB ölçümlerinde bazal değerler ile zamana karşı okunan değerler arasında bir fark olmadığı saptanmıştır. Tüm gruplarda yapılan CK-MB ölçümlerine ilişkin değerler Tablo 15’de verilmiştir. Tablo 15: Levosimendanın etkilerinin incelendiği deney gruplarında koroner akımda ölçülen CK-MB değerleri (*p<0.05, Wilcoxon matched-pairs signed rank test, 30. dakika ile 120. dakika arasında; !p<0.05, Wilcoxon matched-pairs signed rank test, 90. dakika ile 120. dakika arasında) CK-MB (ng/mL) 30. dk 60. dk 90. dk 120. dk Kontrol 1.42±0.03 1.23±0.07 1.27±0.11 1.48±0.20 Akut 1.38±0.16 1.32±0.14 1.59±0.18 1.72±0.14 L1 1.16±0.10 0.97± 0.13 0.92±0.08 0.96±0.04 L2 1.47±0.10 1.52±0.14 1.65±0.28 1.63±0.18 L3 1.03±0.12 1.01±0.16 1.16±0.18 1.02±0.12 Kontrol 1.49±0.11 1.53±0.12 1.51±0.08 1.30±0.06 *! Akut 1.50±0.14 1.41±0.08 1.46±0.15 1.62±0.14 L1 1.06±0.18 1.01±0.07 0.86±0.02 0.89±0.02 L2 1.40±0.24 1.34±0.21 1.26±0.18 1.40±0.22 L3 1.02±0.05 0.89±0.09 0.96±0.06 0.91±0.08 Normal perfüzyon İskemi hasarı ! İskemik önkoşullama Kontrol 1.56±0.10 1.70±0.06 1.43±0.12 1.73±0.06 Akut 1.58±0.16 1.61±0.21 1.57±0.14 1.52±0.30 L1 1.56±0.11 1.63±0.15 1.56±0.20 1.47±0.26 L2 L3 1.54±0.20 1.72±0.30 1.41±0.13 1.67±0.10 1.43±0.06 1.90±0.16 1.55±0.10 1.78±0.12 112 3.2.3 Levosimendanın etkilerinin incelendiği deney gruplarında kalp dokularında ölçülen cAMP değerleri Deney sonunda alınan kalp doku örneklerinden tayin edilen cAMP değerleri doku total protein miktarına oranlanarak pmol/mg protein cinsinden hesaplanmıştır (Tablo 16). Akut ve kronik levosimendan uygulaması sonucunda kalp dokusunda cAMP artışı gözlenmemiştir. Tablo 16: Levosimendanın etkilerinin incelendiği deney gruplarında kalp dokularında cAMP değerleri cAMP (pmol/mg) Normal perfüzyon İskemi hasarı İskemik önkoşullama Kontrol 7.18±3.71 5.76±0.92 5.89±0.72 Akut 6.05±1.95 3.86±1.69 4.73±0.22 L1 3.79±0.62 5.85±1.19 3.05±0.40 L2 7.32±2.53 8.72±3.19 7.24±3.85 L3 5.72±0.91 2.75±0.79 8.42±2.42 3.3 İzole kalplerde yapılan morfolojik çalışmalar 3.3.1 İzole kalplerde iskemi süresine bağlı olarak hücrelerde meydana gelen yapısal değişiklikler Kontrol grubu: Kontrol grubuna ait örneklerde ultrastrüktürel olarak herhangi bir değerlendirilmesi patolojik görünüm sonucunda tespit yalnızca edilmedi. birkaç hücrede Tüm sahaların hafif derecede intraselüler ödem ve glikojende çok hafif azalma vardı. Ayrıca çok az sayıdaki mitokondride de kristaların zigzag profilli veya bal peteği görüntüsünde olduğu izlendi. Bununla birlikte bu çok minimal patolojik bulgu gösteren hücrelerin her örnekte ve tüm saha içerisinde sadece birkaç tane olduğu izlendi. Bu 113 örneklerde kapillerler, nukleus ve miyofibrillerde herhangi bir patolojik bulgu mevcut değildi. Kontrol grubuna ait örneklerin temsili fotografları Şekil 19’da verilmiştir. A B Şekil 19: İskemi süresinin etkilerinin incelendiği deney gruplarında kontrol kalplerinde ultrastrüktürel görünüm A: Normal bir kalp kası hücresi; miyofibriller (My) ve nukleus(N). (X 6000); B: Normal bir kalp kası hücresi; miyofibriller (My) ve nukleus(N). (X 6000) 15dk iskemi grubu: Bu gruptaki örneklerde intraselüler ve interselüler ödemin mevcudiyeti dikkat çekici idi. Glikojendeki hafif azalma tüm örneklerde ve tüm sahalarda izleniyordu. Mitokondrilerin pek çoğunun krista’ları zigzag görünümlü veya bal peteği görünümünde idi. Arada çok az sayıda normal mitokondri mevcut idi. Kapillerlerde herhangi bir patolojik bulgu tespit edilmedi. Bu grupta nukleus’ların hepsinde ultrastrüktürel patolojik değişiklikler izlenmekte idi. Nukleus’ların bir kısmında kromatin homojen olarak dağılmış iken, diğerlerinde kromatinde topaklaşma ve marjinasyon izlenmekte idi. Bu grubun en belirgin özelliklerinden biri de miyofibrillerde ayrılmaların bulunması 114 idi. 15dk iskemi grubuna ait örneklerin temsili fotografları Şekil 20’de verilmiştir. A B Şekil 20: İskemi süresinin etkilerinin incelendiği deney gruplarında 15dk iskemi uygulanan kalplerde ultrastrüktürel görünüm A: Miyofibrillerde ayrılmalar ve lizis (oklar), Glikojen miktarında azalma, hücre içi vakuol (V) mevcut. (X 10000); B: Miyofibrillerde ayrılmalar ve lizis (oklar), Glikojen miktarında azalma. (X 15000) 30 dk iskemi grubu: Bu grupta izlenen ultrastrüktürel patolojik bulgular yer yer değişkenlik göstermekte idi. Lokalize sahalarda çok belirgin bir intraselüler ödem, glikojen miktarında hafif azalma ve mitokondrilerde 15dk iskemi grubunda tarif edilen ultrastrüktürel patolojik değişiklikler çok belirgin olarak izlenmekte iken; bu grupta diğer sahalarda ise intraselüler ödemin daha az olduğu tespit edildi. Kapillerler normal idi. Hücre nukleus’larının az bir miktarı tamamen normal idi. Geriye kalan büyük bir grup nukleus ise grup 2’deki ultrastrüktürel patolojik değişiklikleri göstermekte idi. Bu grupta bazı sahalarda miyofibrillerdeki ayrılmalar daha fazla, bazı sahalarda ise daha az miktarda idi. 30dk iskemi grubuna ait örneklerin temsili fotografları Şekil 21’de verilmiştir. 115 A B Şekil 21: İskemi süresinin etkilerinin incelendiği deney gruplarında 30dk iskemi uygulanan kalplerde ultrastrüktürel görünüm. A: Belirgin ödem (*) ve miyofibrillerde (My) ayrılma (X 6000); B: Miyofibrillerde (My) hafif ayrılma, hücre içi glikojen miktarında hafif azalma ve çoğu normal görünümlü mitokondri izlenmekte (X 15000) 45dk iskemi grubu: Bu grupta intraselüler ve interselüler ödem ultrastrüktürel olarak izleniyor idi. İntraselüler ödem genelde perinükleer ödem şeklinde idi. Bununla birlikte, yer yer bazı hücrelerde intraselüler ödemin bulunmadığı fark edilmekte idi. Fakat bu normal görünümlü hücrelerin sayısı çok az idi. 45dk iskemi grubunda hücre içi glikojen miktarı çoğu hücrede normal iken, yer yer de hafif bir azalma göstermekteydi. Ultrastrüktürel patolojik değişiklikler izlenen mitokondri sayısı ise 15dk ve 30 dk iskemi grubuna göre daha azdı. Ayrıca mitokondrilerin çoğu normal görünümde idi. Bu grubun en belirgin özelliklerinden bir tanesi de miyofibrillerin ultrastrüktürel olarak normal görünümde olması idi. 45dk iskemi grubuna ait örneklerin temsili fotografları Şekil 22’de verilmiştir. 116 A B C Şekil 22: İskemi süresinin etkilerinin incelendiği deney gruplarında 45dk iskemi uygulanan kalplerde ultrastrüktürel görünüm. A: Normal bir kapillerin elektron mikroskobik görüntüsü (ok) (X 7500), B: Perinükleer ödem (*) ve miyofibriller (My) (X 6000); C: Miyofibriller (My) ve mitokondriler(M) . (X 15000) 60dk iskemi grubu: Bu grupta intraselüler ve interselüler ödem çok az izleniyor idi. Hücrelerin çok büyük bir kısmında glikojen miktarı normal, çok azında ise hafif de olsa bir azalma gösteriyor idi. Bu gruptaki hasarlı mitokondri sayısı 45dk iskemi grubu ile aynı idi. Kapillerler normaldi. Nukleus değerlendirildiğinde 45dk iskemi grubundan daha az sayıda patolojik değişiklik 117 gösteren nukleusun varlığı saptandı. Bununla birlikte, bu grupta yer yer miyofibrillerde hafif ayrılmaların mevcut olduğu tespit edildi. 60dk iskemi grubuna ait örneklerin temsili fotografları Şekil 23’te verilmiştir. A B Şekil 23: İskemi süresinin etkilerinin incelendiği deney gruplarında 60dk iskemi uygulanan kalplerde ultrastrüktürel görünüm. A: Miyofibrillerde çok hafif ayrılma (My), normal hücre nukleusu (N) ve mitokondriler(M) (X 6000); B: Miyofibrillerde çok hafif ayrılma (My), hücre içi normal glikojen ve hafif hasarlı mitokondri (M)(X 15000) Her örnek için değerlendirilen 20 hücre veya alan ve 100 mitokondri için verilen skorlar toplanmış, her örnekte ultrastrüktürel değişiklikleri ifade eden bir total skor intraselüler ödem, glikojen, mitokondri, nukleus, kapiler ve miyofibriller için ayrı ayrı hesaplanarak istatistik yapılmıştır. İskemi süresinin hücrelere etkileri değerlendirildiğinde 0 dakika (kontrol grubu) ile 60 dakika arasında değişen iskemi süresinin hücresel ödem, glikojen, mitokondri ve nukleus üzerinde değişikliklerin 15 anlamlı dakika etkileri iskemi olduğu belirlenmiştir uygulaması sonrasında (p<0.05). pik Bu yaptığı gösterilmiştir (p<0.05). 15 dakikayı aşan sürelerdeki iskemi uygulamalarında iskemi süresi arttıkça hasarın azalma yönünde eğilim gösterdiği saptanmıştır 118 [ödem (p=0.000), glikojen (p=0.000), mitokondri (p=0.012) ve nukleus (p=0.000)]. Kapiler ve miyofibril skorları bütün gruplardaki deneklerde 0 olarak bulunmuştur. Tablo 17’de iskemi hasarının incelendiği gruplarda hücrelerdeki intraselüler ödem ile glikojen, mitokondri ve nukleuslarda meydana gelen değişikliklerin total skorlarının medyan (min-maks) değerleri verilmektedir. Tablo 17: İskemi hasarının incelendiği gruplarda hücrelerde meydana gelen yapısal değişikliklerin total skorları + p<0.05, Mann-Whitney U-Test, kontrol ile 15dk iskemi uygulanan grup arasında; *p<0.05, Jonckerheere Test for Ordered Alternatives, 15dk, 30dk, 45dk ve 60dk grupları arasında. Hücrelerde meydana gelen yapısal değişiklikler [medyan (min-maks)] Ödem Kontrol Glikojen 1 (1-1) 1 (0-1) + 20 (20-20) + Mitokondri Nukleus 15,5 (13-16) 1 (1-2) 69 (67-71) + 32 (31-32) + 15dk 28,5 (27-31) 30dk 19 (17-21) 14 (13-15) 45 (39-54) 24 (23-26) 45dk 15 (13-16) 7,5 (5-10) 34 (28-43) 20,5 (20-24) 60dk 7,5 (5-14) * 6,5 (4-9) * 43,5 (37-52) * 15 (11-18) * 3.3.2 İzole kalplerde infarkt alanı İskemi süresinin etkilerinin incelendiği deney gruplarında farklı iskemi süresi uygulanan kalplerden alınan kesitlerde trifeniltetrazolyum boyama sonrasında belirgin infarkt alanına rastlanmamıştır. 45dk ve 60dk iskemi uygulanan gruplarda az sayıda örnekte infarktlı bölge gözlenmiştir. Grupların temsili örnekleri Şekil 24’te görülmektedir. Levosimendanın etkilerinin incelendiği deney gruplarında normal perfüzyon, iskemi hasarı ve iskemik önkoşullama protokolleri uygulanan kalplerden alınan kesitlerde trifeniltetrazolyum boyama sonrasında belirgin infarkt alanına rastlanmamıştır. Az sayıda örnekte gözlenen infarktlı bölgeler subepikardiyal alanla sınırlı kalmıştır. Grupların temsili örnekleri Şekil 25, 26 ve 27’de görülmektedir. 119 Şekil 24: İskemi süresinin etkilerinin incelendiği deney gruplarında trifeniltetrazolyum ile boyanmış kalp kesiti örnekleri A, kontrol grubu; B, 15dk iskemi grubu; C, 30dk iskemi grubu; D, 45dk iskemi grubu; E, 60dk iskemi grubu. İskemik alanlar oklarla gösterilmiştir. Şekil 25: Levosimendan kontrol grubunda trifeniltetrazolyum ile boyanmış kalp kesiti örnekleri A, normal perfüzyon; B, iskemi hasarı; C, iskemik önkoşullama Şekil 26: Levosimendan akut etki grubunda trifeniltetrazolyum ile boyanmış kalp kesiti örnekleri A, normal perfüzyon; B, iskemi hasarı; C, iskemik önkoşullama Şekil 27: Levosimendan kronik etki grubunda trifeniltetrazolyum ile boyanmış kalp kesiti örnekleri A, normal perfüzyon; B, iskemi hasarı; C, iskemik önkoşullama 120 3.4 Vasküler reaktivite çalışmaları 3.4.1 Kastırıcı ajanlara karşı yanıtlar 3.4.1.1 KCl (120 mM) yanıtları Kontrol ve 21 gün oral levosimendan tedavi grubundaki hayvanlardan izole edilen endoteli sağlam ve endoteli mekanik olarak kazınmış sıçan torasik aortasında 120 mM KCl kasılma yanıtı oluşturmuştur. Levosimendan ile tedavinin ve endotelsizleştirmenin KCl maksimum kasılma (Emaks) yanıtlarını değiştirmediği gözlemlenmiştir (Tablo 18). Tablo 18: Sıçan torasik aortasında 21 gün süre ile oral levosimendan tedavisinin (0.2 mg/kg/gün) ve mekanik endotelsizleştirmenin 120 mM KCl ile oluşan maksimum kasılma yanıtları (Emaks) üzerindeki etkileri. Kontrol grubu Levosimendan grubu (n = 4) (n = 4) Endotelyumu sağlam 1.18±0.14 1.67±0.15 Endotelyumu kazınmış 1.43±0.16 1.67±0.22 KCl, Emaks (g) 3.4.1.2 Kümülatif fenilefrin (10-9-10-4M) yanıtları Kontrol ve 21 gün oral levosimendan tedavi grubundaki hayvanlardan izole edilen endoteli sağlam ve endoteli mekanik olarak kazınmış sıçan torasik aortasına kümülatif olarak uygulanan fenilefrin (10-9-10-4M) konsantrasyona bağımlı kasılma yanıtları oluşturmuştur (Şekil 28). Kronik levosimendan tedavisinin ve endotelsizleştirmenin fenilefrin Emaks yanıtlarını ve fenilefrin duyarlılığını (pD2) değiştirmediği gözlemlenmiştir (Tablo 19). 121 2.0 Kasılma (g) 1.5 1.0 L3 E+ L3 EK E+ K E- 0.5 0.0 -9 -8 -7 -6 -5 -4 log [Fenilefrin] M Şekil 28: Sıçan torasik aortasında 21 gün süre ile oral levosimendan tedavisinin (0.2 mg/kg/gün) ve mekanik endotelsizleştirmenin kümülatif fenilefrin (10-9-10-4 M) yanıtları üzerindeki etkileri. L3E+, 21 gün oral levosimendan tedavi grubunda endoteli sağlam damarlar; L3E-, 21 gün oral levosimendan tedavi grubunda endoteli mekanik olarak kazınmış damarlar; KE+, kontrol grubunda endoteli sağlam damarlar; KE-, kontrol grubunda endoteli mekanik olarak kazınmış damarlar, (n=4). Tablo 19: Sıçan torasik aortasında 21 gün süre ile oral levosimendan tedavisinin (0.2 mg/kg/gün) ve mekanik endotelsizleştirmenin kümülatif fenilefrin (10-9-10-4 M) Emaks yanıtları ve pD2 değerleri üzerindeki etkileri. Kontrol grubu Levosimendan grubu (n = 4) (n = 4) Endotelyumu sağlam 7.20±0.12 7.02±0.20 Endotelyumu kazınmış 7.47±0.02 7.31±0.25 Endotelyumu sağlam 1.05±0.22 1.58±0.16 Endotelyumu kazınmış 1.74±0.21 2.06±0.06 Fenilerin, pD2 Fenilerin, Emaks (g) 122 3.4.1.3 Kümülatif 5-HT (10-9-3x10-5M) yanıtları Kontrol ve 21 gün oral levosimendan tedavi grubundaki hayvanlardan izole edilen endoteli sağlam ve endoteli mekanik olarak kazınmış sıçan torasik aortasına kümülatif olarak uygulanan 5-HT (10-9-3x10-5M) konsantrasyona bağımlı kasılma yanıtları oluşturmuştur (Şekil 29). Levosimendan varlığında kontrol grubu ile karşılaştırıldığında endoteli sağlam damarlarda 5-HT Emaks yanıtının istatistiksel olarak anlamlı bir şekilde arttığı (p<0.05), duyarlılığının ise istatistiksel olarak anlamlı bir şekilde azaldığı görülmüştür (p<0.05), (Tablo 20). Kontrol ve ilaçlı gruplarda endotelsizleştirme işlemi sonucunda 5-HT Emaks yanıtının ve duyarlılığının değişmediği belirlenmiştir (Tablo 20). + 2.0 + Kasılma (g) 1.5 1.0 0.5 L3 E+ L3 EK E+ K E- 0.0 -9 -8 -7 -6 -5 Log [5-HT] M Şekil 29: Sıçan torasik aortasında 21 gün süre ile oral levosimendan tedavisinin (0.2 mg/kg/gün) ve mekanik endotelsizleştirmenin kümülatif 5-HT (10-9-3x10-5 M) yanıtları üzerindeki etkileri. L3E+, 21 gün oral levosimendan tedavi grubunda endoteli sağlam damarlar; L3E-, 21 gün oral levosimendan tedavi grubunda endoteli mekanik olarak kazınmış damarlar; KE+, kontrol grubunda endoteli sağlam damarlar; KE-, kontrol grubunda endoteli mekanik olarak kazınmış damarlar. (+p<0.05, Mann-Whitney U test) , (n=4). 123 Tablo 20: Sıçan torasik aortasında 21 gün süre ile oral levosimendan tedavisinin (0.2 mg/kg/gün) ve mekanik endotelsizleştirmenin kümülatif 5-HT (10-9-3x10-5 M) Emaks yanıtları ve pD2 değerleri üzerindeki etkileri. (+p<0.05, Mann-Whitney U test) Kontrol grubu Levosimendan grubu (n = 4) (n = 4) Endotelyumu sağlam 6.29±0.07 5.84±0.09 + Endotelyumu kazınmış 6.80±0.30 6.22±0.22 Endotelyumu sağlam 1.24±0.15 1.98±0.08 + Endotelyumu kazınmış 1.25±0.26 1.86±0.10 5-HT, pD2 5-HT, Emaks (g) 3.4.2 Gevşetici ajanlara karşı yanıtlar 3.4.2.1 Fenilefrin (10-6 M) önkastırması sonrasında kümülatif asetilkolin (10-910-4 M) gevşeme yanıtları Önkastırıcı olarak 10-6 M fenilefrin kullanılan endoteli sağlam sıçan torasik aortasında kümülatif asetilkolin (10-9-10-4 M) uygulanması hem kontrol hem de 21 gün oral levosimendan tedavi grubunda konsantrasyona bağımlı gevşeme yanıtları oluşturmuştur (Şekil 30). Levosimendan asetilkolin duyarlılığını artırmıştır ve artış istatistiksel olarak anlamlıdır (p<0.05), (Tablo 21). 124 0 + Gevşeme % -25 + -50 -75 L3 E+ K E+ -100 -9 -8 -7 -6 -5 -4 Log [Ach] M Şekil 30: 21 gün süre ile oral levosimendan tedavisinin (0.2 mg/kg/gün) 10-6 M fenilefrinle önkastırmaya tabi tutulmuş sıçan torasik aortasında kümülatif asetilkolin (10-9-10-4 M) gevşeme yanıtları üzerindeki etkileri. L3E+, 21 gün oral levosimendan tedavi grubunda endoteli sağlam damarlar; KE+, kontrol grubunda endoteli sağlam damarlar. (+p<0.05, Mann-Whitney U test) , (n=4). Tablo 21: 21 gün süre ile oral levosimendan tedavisinin (0.2 mg/kg/gün) 10-6 M fenilefrinle önkastırmaya tabi tutulmuş sıçan torasik aortasında kümülatif asetilkolin (10-9-10-4 M) gevşeme Emaks yanıtları ve pD2 değerleri üzerindeki etkileri. (+p<0.05, Mann-Whitney U test) Kontrol grubu Levosimendan grubu (n = 4) (n = 4) 7.28±0.10 7.78±0.09 + 74.25±4.39 76.50±3.95 Ach, pD2 Endotelyumu sağlam Ach, Emaks (%) Endotelyumu sağlam 125 3.4.2.2 Fenilefrin (10-6 M) önkastırması sonrasında kümülatif nitrogliserin (109 -3x10-5 M) gevşeme yanıtları Önkastırıcı olarak 10-6 M fenilefrin kullanılan sıçan torasik aortasında kümülatif nitrogliserin (10-9-3x10-5 M) uygulanması hem kontrol hem de 21 gün oral levosimendan tedavi grubunda konsantrasyona bağımlı gevşeme yanıtları oluşturmuştur (Şekil 31). Levosimendan varlığında endoteli kazınmış damarlarda nitrogliserin Emaks yanıtları istatistiksel olarak anlamlı bir şekilde artmıştır (p<0.05), (Tablo 22). Endoteli sağlam damarlarda ise levosimendanın nitrogliserin Emaks yanıtlarını artırıcı yöndeki etkisi istatistiksel anlamlılığa ulaşmamıştır (Tablo 22). Levosimendan ve endotelsizleştirme nitrogliserin duyarlılığını değiştirmemiştir (Tablo 22) 0 Gevşeme % -25 -50 -75 L3 E+ L3 EK E+ K E- -100 + + + + -125 -9 -8 -7 -6 -5 Log [NG] M Şekil 31: 21 gün süre ile oral levosimendan tedavisinin (0.2 mg/kg/gün) ve mekanik endotelsizleştirmenin 10-6 M fenilefrinle önkastırmaya tabi tutulmuş sıçan torasik aortasında kümülatif NG (10-9-3x10-5 M) gevşeme yanıtları üzerindeki etkileri. L3E+, 21 gün oral levosimendan tedavi grubunda endoteli sağlam damarlar; L3E-, 21 gün oral levosimendan tedavi grubunda endoteli mekanik olarak kazınmış damarlar; KE+, kontrol grubunda endoteli sağlam damarlar; KE-, kontrol grubunda endoteli mekanik olarak kazınmış damarlar. (+p<0.05, Mann-Whitney U test) , (n=4). 126 Tablo 22: 21 gün süre ile oral levosimendan tedavisinin (0.2 mg/kg/gün) ve mekanik endotelsizleştirmenin 10-6 M fenilefrinle önkastırmaya tabi tutulmuş sıçan torasik aortasında kümülatif NG (10-9-3x10-5 M) gevşeme Emaks yanıtları ve pD2 değerleri üzerindeki etkileri. (+p<0.05, Mann-Whitney U test) Kontrol grubu Levosimendan grubu (n = 4) (n = 4) Endotelyumu sağlam 7.55±0.09 7.89±0.12 Endotelyumu kazınmış 7.74±0.11 8.01±0.07 Endotelyumu sağlam 96.00±1.08 113.25±11.66 Endotelyumu kazınmış 100.00±1.96 115.75±5.57 + NG, pD2 NG, Emaks (%) 127 4 TARTIŞMA Kalp yetmezliği, çok nedenli kompleks bir kardiyovasküler hastalıktır. Semptomları genellikle sol ventrikül geometrisinde değişiklikler ile gelişen sol ventrikül disfonksiyonu modellenme, sol nedeniyle ventrikül oluşmaktadır. kontraktilitesini azaltır Kardiyak ve kalp yeniden üzerindeki hemodinamik stres artar. Bu hastalığın tedavisi, inotroplar ile miyokardiyal kontraktiliteyi artırmayı, vazodilatörler ile önyük veya artyükü azaltmayı, ADE inhibitörleri ve beta blokörler gibi ilaçlar kullanılarak kardiyak yeniden modellenme sürecini değiştirmeyi amaçlar. Ne yazık ki, hastalığın tedavisindeki gelişmeler kalp yetmezliğinin hala majör ölüm nedenleri arasında olmasını engelleyememektedir. Benzer şekilde, perioperatif bakım alanındaki gelişmelere rağmen önceden kalp yetmezliği olan hastalar kalp cerrahisi haricindeki herhangi bir ameliyattan sonra morbidite ve mortalite riski altında olmaya devam etmektedir. Kronik kalp yetmezliği, pulmoner ödem ve miyokard infarktüsü sonucu oluşan kardiyojenik şok gibi nedenlerle ve özellikle ameliyat sonrası dönemde akut kalp yetmezliği gelişebilmektedir. Akut kalp yetmezliğine sebep olabilecek hipertansiyon, taşiaritmi, hiperkoagülabilite gibi çeşitli etkenler nispeten kolaylıkla önlenebildiği halde miyokard iskemisi yetmezliğin en önemli tetikleyicisi olarak karşımıza çıkmaktadır (156). Miyokardın iskemiye karşı korunmasında iskemik ve farmakolojik önkoşullama kavramları son 20 yıl içerisinde ortaya koyulmuştur (70) ve iskemik önkoşullamanın altında yatan mekanizmaların daha iyi anlaşılması ile birlikte araştırmalar farmakolojik önkoşullama üzerinde yoğunlaşmıştır. Levosimendan akut ve kronik kalp yetmezliği tedavisinde kullanılmak üzere geliştirilmekte olan kalsiyum duyarlılaştırıcı bir ilaçtır. Levosimendan miyokardın kasılma gücünü miyosit Ca+2 konsantrasyonunu yükseltmeden artırır, böylece miyokardda nekroz oluşma riskini de azaltır. Koronerlerde ve periferik damarlarda vazodilatasyon oluşturması nedeniyle koroner kan akımını artırır ve kalbin artyükünü azaltır (101). Potent bir kalsiyum duyarlılaştırıcı olan levosimendanın klinikte tavsiye edilen konsantrasyonlarda çok az PDE inhibitör etkinliği olduğu, KATP kanallarını aktive ettiği, diyastolik fonksiyon üzerinde olumsuz bir etkisinin olmadığı, kalp ritmi üzerinde nötral etkileri olduğu ve uzun dönem hayatta kalma açısından değerlendirildiğinde konvansiyonel tıpta kullanılmakta olan dobutamine göre üstünlüğü olduğu bildirilmiştir (157). Ayrıca bileşiğin önkoşullayıcı etkileri olduğu önerilerek yapılan çalışmalarda iskemiye karşı koruyuculuğu gösterilmiştir (20,27,89,90,159). Levosimendan, günümüzde, akut dekompanse kronik kalp yetmezliğinin kısa süreli tedavisinde kullanılmaktadır. Bileşiğin ilgi çekici farmakolojik profili nedeniyle şu anki kullanımına ek bazı muhtemel endikasyonlar da önerilmekte ve bunlarla ilgili çalışmalar da devam etmektedir. Levosimendanın miyokard iskemisi, akut koroner sendromları olan hastalarda PTCA sonrasında görülen miyokard sersemlemesi, kalp cerrahisi, kardiyojenik şok ve sağ kalp yetmezliği esnasında ve sonrasında inotropik destek olarak kullanılabileceği düşünülmektedir (21,140,157). Ayrıca ilacın çocuklarda, peripartum kardiyomiyopatide, septik şoka bağlı dolaşım yetmezliğinde, kardiyopulmoner 129 resüstasyon sonrasında kullanımı ile ilgili çalışmaların olumlu sonuçları da bildirilmiştir (157). Çalışmamızda, önce farklı sürelerde uygulanan miyokard iskemisinin etkileri incelenerek, uygun sersemleme modeline karar verilmiştir. Levosimendanın yüksek dozlarda PDE III inhibisyonu oluşturması nedeniyle çalışmamızda akut etki grubunda kullanılacak levosimendan dozu, cAMP düzeylerini artırmayan (49,81) bir konsantrasyon olan 0.1µM olarak seçilmiştir. Kronik etki grubundaki sıçanlara ise 7, 14 ve 21 gün süre ile yine ilacın cAMP konsantrasyonlarını artırmadığı belirtilen (26) bir doz olan 0.2 mg/kg oral yoldan verilmiştir. Daha sonra normal ve iskemik koşullarda levosimendanın akut ve kronik etkileri karşılaştırmalı olarak incelenmiş, iskemik önkoşullama ile levosimendan kullanılarak oluşturulan farmakolojik önkoşullama veya her ikisinin birlikte uygulanmasının profilaktik antiiskemik etkinlikleri değerlendirilmiştir. Ayrıca çalışmamızda, 21 gün süre ile kronik levosimendan tedavisi uyglanan sıçanlardan izole edilen torasik aortalarda çeşitli vazokonstriktör ve vazodilatör ajanların etkinlikleri incelenmiştir. İskemi süresinin kalp fonksiyonları, aritmi ve CK-MB üzerine etkisi İskemi süresinin incelendiği deney gruplarında ölçülen bütün fonksiyonel parametreler kontrol grubunda ve 15dk iskemi grubunda deney süresince değişmemiştir. 30dk iskemi grubunda LVDP, +dP/dtmaks, -dP/dtmaks ve perfüzyon basıncı reperfüzyonun 10. dakikasında azalmış, kalbin dakikadaki atım hızında ise sadece deney sonunda bir azalma gözlenmiştir. +dP/dtmaks ve perfüzyon basıncı reperfüzyon sonunda bazal değerlere dönerken LVDP ve -dP/dtmaks değerleri deney sonunda da düşük olarak belirlenmiştir. Lochner ve arkadaşları (96) da 30 dakika global iskemi uygulanan sıçan kalplerinde 130 reperfüzyon sonunda LVDP’nin azaldığını ve perfüzyon basıncının değişmediğini göstermişlerdir. İzole sıçan kalplerinde farklı iskemi süreleri uygulanarak yapılan bir diğer çalışmada ise bizim çalışmamızdan farklı olarak 15 dakika iskeminin sol ventrikülün kontraktil fonksiyonlarında orta şiddette bir azalmaya neden olduğu, ancak iskemi süresi 30 dakikaya yükseltildiğinde çalışmamızın sonuçlarına benzer şekilde daha belirgin bir fonksiyonel bozukluk oluştuğu bildirilmiştir (125). Bizim çalışmamızda 45 dakika iskemi grubunda kalp hızı hariç ölçülen bütün fonksiyonel parametreler reperfüzyonun 10. dakikasında azalırken reperfüzyon sonunda bazal değerlere yakın fonksiyonlar gözlenmiştir. Bu grupta sadece kalbin dakikadaki atım hızı deney sonunda azalmıştır. 60dk iskemi grubunda ise +dP/dtmaks, -dP/dtmaks ve perfüzyon basıncı hem reperfüzyon başlangıcında hem de sonunda değişirken LVDP’de sadece deney sonunda bir azalma gözlenmiştir. Farelerde yapılan bir çalışmanın sonuçları bizim bulgularımızı destekler niteliktedir (170). Bu çalışmada 25 dakikadan daha az süren iskeminin kalbin fonksiyonlarında geçici ve hafif bir bozukluğa neden olduğu fakat reperfüzyon sonunda mekanik işlevin düzeldiği, uzun süren iskemi periyodlarında ise kalp fonksiyonlarında daha belirgin ve kalıcı bozukluklar oluştuğu söylenmektedir. Ancak bizim çalışmamızda 45 dakika iskemi sonrasında gözlenen hasarın kalıcı olmadığı belirlenmiştir. Bu iki çalışmanın bulguları arasındaki farklılığın nedeni deneylerde kullanılan hayvan türleri olabilir. Bu araştırmacılar iskemi reperfüzyon çalışmalarında izole Langendorff perfüze fare kalplerinden elde edilen sonuçların istikrarlı olmadığını belirtmektedirler (170). 15dk, 30dk, 45dk ve 60dk iskemi gruplarında iskemi uygulanması sonucunda izole kalplerde kontrol grubuna göre aritmi insidansı ve süresi 131 artmıştır. İskemi reperfüzyon hasarının aritmojenik etkisi bilinmektedir (100) ve çalışmamızın bulguları literatür ile uyumludur. Çalışmamızda 15 dakika ve 30 dakika iskemi uygulanan kalplerde CKMB miktarlarında değişiklik gözlenmemiştir. Trifeniltetrazolyum boyama sonrasında bu gruplardaki kalplerde nekrotik bölgelere rastlanmamış olması da 15 ve 30 dakika iskemi uygulamasının sıçan kalplerinde irreversibl hasar oluşturmadığı yönündeki bulgularımızı desteklemektedir. 45 dakika iskemi uygulaması reperfüzyonun ilk dakikalarında kalplerden salıverilen CK-MB miktarında bir artışa neden olmuştur. 60 dakika iskemi uygulanan grupta iskemi sonrası ile bazal değerler arasında anlamlı bir fark gözlenmemiş olsa da reperfüzyon sonunda ölçülen CK-MB değerlerinin iskemi sonrası değerlerden daha yüksek olduğu saptanmıştır. Tetrazolyum boyama ile bu gruplarda az miktarda nekrotik alana rastlanmış olması 45 ve 60 dakika iskeminin kardiyomiyositlerin bir bölümünde irreversibl hasar oluşturduğunu düşündürmektedir. Kalp hücrelerinde yapısal hasar oluştuğu zaman kardiyak enzimler hücrelerden dışarı sızar. Serumda normal değerlerin üzerinde enzim bulunması miyokard infarktüsü ile ilişkili iskemiyi de kapsayan çeşitli patolojik durumların klinik tanısı için geniş ölçüde kullanılmaktadır. Ayrıca iskemireperfüzyon hasarını da içeren farklı deney şartları altındaki izole kalplerden enzim salıverilişini gösteren birçok çalışma da yapılmıştır (37,125,172). Kısa süreli iskemi periyodlarında CK-MB değerlerinde yükselme olmamakta, bununla birlikte hücrede irreveribl hasar meydana geldiğinde CK-MB değerleri yükselmektedir (125). Dolayısıyla çalışmamızda 15 ve 30 dakika iskemi 132 uygulanan grupta CK-MB değerlerinde yükselme saptanmamasının nedeni hücre ölümünün gerçekleşmemiş olmasıdır. İskemi hasarının incelendiği deney gruplarında morfolojik değişikliklerin saptanabilmesi amacıyla elektron mikroskobik çalışma da yapılmıştır. Çalışma grupları içerisinde en belirgin ultrastrüktürel patolojik değişikliklerin saptandığı grup, 15 dakika iskemi uygulanan gruptur. Miyofibrillerin dizilişi ve lizis oranı bu grup için diğerlerine göre daha belirgin olsa da hücrelerin çoğunda çok yüksek skor değerlerine ulaşmamamıştır. 10 dakika süren iskeminin intraselüler ozmotik etkili partikül miktarını artırdığı, hücrenin şişmesine neden olduğu ve meydana gelen bu değişikliklerin elektron mikroskobunda görülebildiği bilinmektedir (71). Bununla birlikte hücre ve hücre membranındaki irreversibl hasarın 15 dakika gibi kısa süreli iskemi sonucunda oluşmadığı, tersinir iskemiye neden olan daha uzun süreli iskemik periyodlar sonucunda oluştuğu ileri sürülmektedir (71,175). Hücre içi ödem dikkate alındığında 30, 45 ve 60 dakika iskemi uygulanan grupların skorlarının 15 dakika iskemi uygulanan gruptakilere oranla daha düşük olduğu görülmüştür. 15 dakika iskemi uygulanan grupta miyofibrillerin ayrılmış görülmesi ve yer yer lizise rastlanmasının nedeni hücre içi ödem olabilir. 60 dakika iskemi uygulanan grupta diğerlerinden farklı olarak ultrastrüktürel skorlama yapılan sahalar dışında hasarın çok belirgin olduğu daha küçük sahalar görülmüştür. Ancak skorlamada hücre içi elemanların tam olarak seçilebildiği ve örneğin tamamını temsil eden sahalar seçildiğinden teknik gereği bunlar dikkate alınmamıştır. 60 dakikalık örneklerde de bazı sahalarda belirgin hasar olmasına rağmen çalışılan sahaların çoğunda ultrastrüktürel görünüm iskemi oluşturulan diğer grup örneklere göre daha az olmuştur. 15, 30 ve 45 dakika 133 iskemi uygulanan grupların ise tüm sahaları değerlendirmeye dahil edilmiştir. 15 dakika iskemi uygulanan örneklerde miyofibril skorunun düşük oluşu bu kalplerde belirgin bir fonksiyonel bozulma oluşmamasını açıklamaktadır. Elektron mikroskobik çalışmalarda hücresel düzeyde çok detaylı bilgi elde edilebilmesine karşılık dokunun çok az bir kısmı incelenebildiğinden daha genel ve dokunun bütünü hakkında bilgi veren başka incelemelerin de çalışmaya dahil edilmesi gerekmektedir. Bu nedenle çalışmamızdan elde edilen elektron mikroskobik bulgular doku hasarının belirteci olan iskemik miyokarddan CK-MB enzim salıverilişi ve trifeniltetrazolyum boyama sonuçları ile birlikte yorumlanmalıdır. Sonuç olarak 45 ve 60 dakika iskemi uygulanan gruplardaki CK-MB enzim miktarındaki artış ve yine bu gruplardaki örneklerde daha çok nekrotik alan gözlemesi, bu gruplarda daha çok hücresel hasar meydana gelmiş olduğunu göstermektedir. Bu nedenle bu gruplarda elektron mikroskobik bulgular kalbin fonksiyonel işlevlerindeki bozulmayı bire bir yansıtmamakadır. 30 dakika iskemi uygulanan grupta 45 ve 60 dakika iskemi uygulanan gruplarla kıyaslandığında trifeniltetrazolyum boyama sonrasında kalp kesitlerinde daha az nekrotik alan gözlenmiş olması, bu gruptaki kalplerde CK-MB artışı olmaması, elektron mikroskobik incelemede orta derecede hasar belirten bulgulara rastlanmış olması nedeniyle ve iskemi sonrasında kalbin mekanik fonksiyonlarında görülen değişiklikler sistolik ve diyastolik disfonksiyona işaret ettiğinden çalışmamızın geri kalanında miyokardiyal sersemleme modeli olarak 30 dakika iskemi ve 30 dakika reperfüzyon protokolünün uygulanmasına karar verilmiştir. 134 Levosimendan tedavisinin cAMP düzeyleri üzerine etkisi Çalışmamızda akut ve kronik levosimendan uygulamasının kalp dokusunda cAMP miktarını artırmadığı belirlenmiştir. Bu bulgu akut ve kronik levosimendan uygulaması için çalışmamızda seçilen dozun ilacın etkilerini sadece kalsiyum duyarlılaştırıcı etki mekanizması üzerinden gösterdiği düşük bir doz olduğunu doğrulamaktadır. Benzer iskemi modeli kullanılan bir başka çalışmada günde iki kez 0.08 mg/kg oral levosimendan uygulanan ve koroner arter ligasyonu öncesinde bolus enjeksiyonu takiben sürekli levosimendan infüzyonuna devam edilmesinin cAMP artışına neden olmaması çalışmamızın sonuçları ile uyumludur (26). Çalışmamızda ayrıca normoksik, iskemik ve iskemik önkoşullama uygulanan kalplerde ölçülen cAMP miktarları açısından da bir fark gözlenmemiştir. İskemik kalplerde normoksik olanlara göre bir artış oluşmaması Kristof ve arkadaşlarının (81) bulguları ile uyumludur. İskeminin doku cAMP miktarını artırdığı fakat bu artışın reperfüzyonun ilk dakikaları içerisinde bazal düzeye döndüğü bilinmektedir (81). Bizim de çalışmamızda iskemik kalplerden reperfüzyon sonrasında alınan doku örneklerinde normoksik kalplerdekine benzer cAMP miktarları belirlenmiştir. Sonuç olarak çalışmamızda kullanılan dozda levosimendan, kalp fonksiyonları üzerinde saptanan etkilerini PDE III enzimini inhibe ederek değil sadece kalsiyum duyarlılaştırıcı etkisi aracılığı ile göstermektedir. Normal perfüzyon ve levosimendan tedavisi İki saat iyi oksijenlenmiş koşullar altında Langendorff düzeneğinde perfüze edilen kontrol grubundaki kalplerin fonksiyonel göstergeleri olan LVDP, ±dP/dtmaks, kalp hızı ve perfüzyon basıncı deney süresince 135 değişmemiştir. Normal perfüzyon grubunda akut levosimendan uygulamasının izole kalpte ölçülen parametreler üzerinde bir etkisinin olmadığı belirlenmiştir. Kalp transplantlarında primer graft yetmezliği erken dönemdeki en önemli ölüm nedenlerindendir (136). Donör organ bulunmasının zorluğu göz önüne alındığında donör kalbin korunmasının önemi anlaşılabilir. Kalp transplantlarında donör kalbe iskemik veya farmakolojik önkoşullama uygulanması gündemde olan bir konudur (70). Sağlıklı kalplere akut levosimendan uygulanmasının kalbin mekanik işlevini değiştirmediği çalışmamızda gösterilmektedir, bu bulgular donör kalbin levosimendan ile önkoşullanmasının mümkün olabileceği fikrini desteklemektedir. Kronik levosimendan verilmiş hayvanlardan izole edilen kalplerin deney süresince iyi oksijenlenmiş koşullarda tutulması kalbin kasılma gücünü etkilememiştir. İki veya üç hafta süre ile oral yoldan levosimendan uygulanan hayvanlardan izole edilen normoksik kalplerde deney sonunda kalp hızında azalma gözlenmiştir. Levosimendanın in vivo koşullarda uygulanması kalp hızında hafif bir artışa neden olmakta ve bu artışın mekanizması kesin olarak bilinmemekle beraber periferik vazodilatasyona bağlı baroreseptör aktivasyonunun rolü olduğu düşünülmektedir (51). Kullandığımız izole kalp preparatında refleks mekanizmalar devreden çıkarılmış olduğundan izole kalpte levosimendanın kalp hızı üzerindeki nötral veya negatif etkilerinin görülmüş olması muhtemeldir. İskemi hasarı ve levosimendan tedavisi Kontrol kalplerinde 30 dk iskemi uygulaması sonrasında LVDP ve ±dP/dtmaks bazal değerlerle karşılaştırıldığında azalırken kalp hızı reperfüzyon başlangıcında değişmemiş fakat reperfüzyon sonunda azalmıştır. Perfüzyon 136 basıncı 30 dakika iskemi uygulaması sonrasında azalmış fakat deney sonunda artmıştır. Belirtilen değişiklikler istatistiksel olarak anlamlıdır. Çalışmamızda İ/R uygulaması sonrasında alınan kesitlerin trifeniltetrazolyum ile boyanması sonucunda kalp hücrelerinin canlılığının devam ettiği gösterildiği için kalplerde meydana gelen disfonksiyon miyokardiyal sersemlemenin bir sonucudur. İskemi periyodundan 5 dk önce 0.1 µM levosimendan verilen akut etki grubunda ve oral yoldan 7 veya 14 gün levosimendan ile tedavi edilen gruplarda iskemi hasarının neden olduğu sistolik disfonksiyon (+dP/dtmaks’ta azalma), reperfüzyonun hem erken döneminde hem de reperfüzyon sonunda engellenmiştir. Bizim bulgularımızın aksine, izole kobay kalplerinde iskemi öncesinde ve sonrasında levosimendan ile perfüzyonun miyokardiyal sersemleme üzerindeki etkilerinin incelendiği bir çalışmada oluşan sistolik disfonksiyonun 45 dakikalık reperfüzyon süresince devam ettiği görülmektedir (19). Önkoşullama uygulanan sıçan kalplerinde iskemi sonrasında fonksiyonel iyileşmenin diğer türlere göre daha belirgin olduğu söylenmektedir (150). Brendt ve arkadaşlarının (19) bulguları ile bizim bulgularımızda iskeminin etkilerinde görülen farklılık sıçan kalplerinin iskemiye daha dirençli olmasından kaynaklanıyor olabilir. İlginç olarak 21 gün süre ile levosimendan uygulanan İ/R hasarı grubundaki hayvanların kalplerinde reperfüzyonun erken döneminde diğer ilaç gruplarında gözlenen iyileşme oluşmamıştır. 30 dakika iskemiye maruz kalan kalplerde 21 gün levosimendan uygulaması ancak reperfüzyonun sonunda kalbin fonksiyonel parametrelerinde bazal değerlere dönülmesini sağlayabilmiştir. Bu nedenle, levosimendanın uygulama süresinin de çalışmamızda reperfüzyon başlangıcında gözlemlediğimiz fonksiyonel 137 iyileşmede rolü olduğu düşünülebilir. Kontrol kalplerinde gözlemlenilenin aksine, iskemi hasarı ilaçlı grupların hiçbirinde kalp hızında değişikliğe yol açmamıştır. Reperfüzyonun erken döneminde fonksiyonel iyileşme gözlenmesi levosimendanın sersemlemeye karşı kalbi koruduğunu göstermektedir. Bu bulgular iskemi öncesinde akut veya oral yoldan kronik olarak levosimendan uygulanmasının kalbi iskemiye karşı koruduğunu düşündürmektedir ve çalışmamızın bulguları literatür ile uyumludur (27,81,90,159). Levosimendanın sadece oral yol ile uygulanmasının miyokardiyal iskemiye karşı kalbin fonksiyonlarını koruyabileceği ilk kez tarafımızdan gösterilmiştir. Çeşitli araştırmalarda kalp yetmezliği hastalarında (50,138) ve deneysel koşullarda oluşturulan iskemi öncesinde (26,89) oral yoldan verilen levosimendanın yararlı etkileri olduğu belirtilmektedir. Çalışmamızda da oral yoldan verilen levosimendanın yararlı etkileri gözlenmiştir. Nanas ve arkadaşları (116) tarafından, 24 saat sürekli dobutamin infüzyonuna rezistan şiddetli kalp yetmezliği hastalarında başlangıç tedavisinden sonra iki haftada bir tekrarlanan levosimendan infüzyonlarının hastaların sağkalım süresini uzattığı bildirilmiştir. Benzer şekilde, Parissis ve arkadaşları (128), şiddetli kalp yetmezliğinde levosimendan infüzyonunun yararlı etkilerinin gözlendiğini, bu etkilerin 3 hafta kadar devam ettiğini ve dekompansasyon oluşmadan önce hastalara 20 günde bir tekrarlanan levosimendan uygulamasının yapıldığını belirtmektedir. Araştırmamızın sonuçları levosimendanın oral yoldan uzun süreli kullanımının akut tek doz uygulanması ile eşit seviyede kalbin mekanik işlevini koruduğunu göstermektedir. Oral yoldan ilaç verilişinin hasta uyuncunu artırma, hastanede uygulama zorunluluğunun 138 ortadan kalkması gibi üstünlükleri bulunmaktadır. Bu nedenle, çalışmamızın sonuçları tekrarlanan levosimendan uygulamasının gerektiği durumlarda uygulama kolaylığı açısından oral yoldan ilaç verilişinin infüzyon ile uygulamaya tercih edilebileceğini ortaya koymaktadır. İskemik önkoşullama ve levosimendan tedavisi Kısa süreli, tekrarlanan iskemi ve reperfüzyon periyodlarını takiben kalbin uzun süreli iskemi sonrasında meydana gelen nekroza ve aritmiler başta olmak üzere fonksiyon bozukluklarına karşı korunması iskemik önkoşullama olarak tanımlanmıştır (70). KATP kanallarının kalbin korunmasında önemli bir mediyatör ve/veya son-efektör olduğu gösterilmiştir (159). Hayvan çalışmalarındaki gözlemler, levosimendanın KATP kanallarını açmak suretiyle iskemik önkoşullamayı taklit ettiğini, kalp fonksiyonlarını iyileştirdiğini ve hücresel düzeyde koruyucu olduğunu göstermiştir (159). Akut miyokard infarktüsü gibi önceden tahmin edilemeyerek iskemik önkoşullamanın uygulanamadığı patolojik durumlarda farmakolojik önkoşullamanın tedaviye sunulmasının yararlı olabileceği düşünülmekte ve potansiyel önkoşullayıcı ajanların bu açıdan araştırılması devam etmektedir (29). İskemik ve farmakolojik önkoşullamanın uygulanabilirliğinin önerildiği bazı klinik alanlar arasında anjiyoplasti, KABG ameliyatları, kalp transplantlarında donör kalbin önkoşullanması, stabil veya stabil olmayan anjina bulunmaktadır (70). Önerilen bu alanlarda bazı ön denemeler yapılmaya başlanmıştır (140,159). Yapılan çalışmalarda sol ventrikül fonksiyonu zayıf olan yüksek risk grubundaki hastalara KABG, kapak replasmanı veya her ikisinin birlikte uygulanacağı cerrahi prosedürlerden önce levosimendan infüzyonu yapılarak ilacın yararlı olduğu gözlenmiştir (140). 139 Çalışmamızda da, üç kez 5’er dakikalık iskemi ve reperfüzyon periyodlarını takiben uzun süreli (30 dk) iskemiye maruz bırakılan kalplerin LVDP, ±dP/dtmaks, kalp hızı ve perfüzyon basıncı değerleri bazal değerlerle karşılaştırıldığında iskemi sonrasında değişmediği gözlenmiştir. İskemi hasarı protokolü uygulanan kronik veya akut levosimendan gruplarındaki kalplerde ilacın iskemiye karşı kalbin mekanik fonksiyonlarını koruyucu yöndeki etkileri kontrol kalplerinde iskemik önkoşullama etkileri ile karşılaştırılmıştır. İskemik önkoşullama, akut ve kronik levosimendan uygulamalarının iskemiye karşı eşit derecede koruyucu etkinlik gösterdiği gözlemlenmiştir. Levosimendanın farmakolojik bir önkoşullayıcı olduğu çalışmamızda elde edilen bu bulgular ışığında söylenebilir. Önkoşullama cevabının oluşması için minumum süreli iskemiye ihtiyaç olduğu ve belirli bir eşik uyarıya ulaşılması gerektiği bilinmektedir (159). Yaptıkları çalışmada Tritapepe ve arkadaşları (159), önerilen klinik dozlarda KABG öncesinde verilen levosimendanın önkoşullayıcı etki sağladığını bildirmektedirler. Çalışmamızda kullanılan levosimendan akut etki dozu klinikte kullanılan dozlarda erişilen plazma konsantrasyonuna yakındır ve bulgularımız Tritapepe ve arkadaşlarının (159) gözlemlerini destekler niteliktedir. Ayrıca çalışmamızda sıçanlara 7, 14 veya 21 gün süre ile günde bir kez oral yoldan 0.2 mg/kg levosimendan verilmesinin önkoşullayıcı cevabın oluşması için yeterli olduğu gösterilmiştir. Ayrıca, uzun süreli iskemi periyodlarına karşı kalbin mekanik işlevini koruyucu etkileri yönünden iskemik ve farmakolojik önkoşullamanın eşzamanlı uygulanmasının tek başlarına uygulanmalarına göre bir avantajının olup olmadığının araştırılması amacıyla akut ve kronik etki gruplarındaki kalplerde eşzamanlı iskemik önkoşullama protokolü de uygulanmıştır. Levosimendan 140 akut ve kronik etki gruplarında ilaçla eşzamanlı iskemik önkoşullama uygulanmasının LVDP, ±dP/dtmaks, kalp hızı ve perfüzyon basıncı değerleri açısından sadece iskemik önkoşullama uygulanan gruptakine benzer bir koruma oluşturduğu gösterilmiştir. Bu bulgularda istatistiksel anlamlılığın görülmemesinin nedeni veri sayısının yeterli olmamasından kaynaklanabilir. Diğer bir olasılık ise levosimendan ve iskemik önkoşullamanın aynı yolakları aktive etmek suretiyle koruyucu etkinliklerini göstermiş olması ve bu iki uygulama arasında aditif bir etkileşme görülmemiş olmasıdır. Klinik uygulamalara getireceği yenilikler düşünülerek iskemik önkoşullama ile birlikte uzun süreli levosimendan uygulamasının iskemiye karşı koruyucu etkinliği ileri çalışmalarla incelenmelidir. Ayrıca çalışmamızdan elde edilen bulgular, levosimendan ile birlikte iskemik önkoşullama uygulanmasının biribirlerinin etkilerini azaltmadığını gösterdiğinden gerektiğinde farmakolojik ve farmakolojik olmayan uygulamaların aynı anda kullanılabileceğini ortaya koymaktadır. Levosimendanın aritmiler üzerindeki etkisi Akut ya da kronik levosimendan uygulamasının normoksik, iskemik ve önkoşullanmış kalplerde kontrol grubuna göre aritmi sıklığını ve süresini artırmadığı gözlenmiştir. Bu bulgu hem hayvanlarda (27,89) hem de insanlarda (94,119,126,146,155) levosimendanın aritmojenik potansiyelinin incelendiği çalışmaların bulguları ile uyumludur. Kontrol, LA, L2 ve L3 gruplarında, iskemi hasarı ve iskemik önkoşullama protokolü uygulanan kalplerde ise normal perfüzyon uygulanan grupla karşılaştırıldığında aritmi insidans ve süresinde bir artış gözlemlenmiştir. Koroner arterleri normal olan hayvan modellerinde iskemik miyokardın 141 reperfüzyonunun VF ve VT dahil olmak üzere ritim bozukluklarına yol açtığı bilinmektedir. Ayrıca insanlarda da trombolitik tedavi sonrasında reperfüzyon aritmileri gelişebildiği ve bu reperfüzyon aritmilerinin koroner iskeminin atlatılmasından sonraki dönemde gözlenen ani ölüm nedenlerinden biri olduğu ileri sürülmektedir (100). İskemik önkoşullamanın sıçan ve köpek haricindeki bazı türlerde nötral veya hafif aritmojenik etkileri olduğu bilinmektedir (176). Çalışmamızda normoksik kalplerle karşılaştırıldığında iskemik ve önkoşullanmış kalplerde aritmi insidans ve süresinde artış olması beklenen bir sonuç olmakla birlikte iskemi hasarı ve iskemik önkoşullama protokolleri karşılaştırıldığında bu gruplar arasında aritmi insidans ve süresi arasında bir fark gözlenmemiştir. Bu durumda önkoşullamanın ya da önkoşullama ile birlikte levosimendan tedavisinin aritmojenik etkili olduğunu söylemek zordur. Levosimendan tedavisinin CK-MB düzeyleri üzerine etkisi Bu çalışmada, tüm gruplardan 30., 60., 90., ve 120. dakikalarda koroner akım sıvıları alınmış ve kardiyak hücre hasarının belirlenmesi amacı ile CKMB ölçümleri yapılmıştır. 30 dakika süre ile global iskemi uygulanması sonrasında reperfüzyonun ilk dakikalarında (90. dk) alınan koroner perfüzatta yapılan ölçümlerden elde edilen CK-MB değerleri ile bazal CK-MB değerleri arasında bir fark olmadığı belirlenmiştir. Reperfüzyon sonunda (120. dk) ölçülen CK-MB değerlerinin ise bazal değerlerden istatistiksel olarak anlamlı şekilde daha az olduğu saptanmıştır. Diğer bütün gruplarda, koroner perfüzatta yapılan kardiyak enzim değerlerinin bazal değerler ile karşılaştırılması sonucu herhangi bir fark saptanmamıştır. İzole perfüze kalplerde yapılan farklı çalışmalarda 30 dakika ve üzerindeki sürelerde iskemi 142 uygulanmasının irreversibl doku hasarı oluşturduğu ve kreatin kinaz salıverilişinde anlamlı bir artışa neden olduğu gösterilmiştir (37,125). Ancak bizim çalışmamızda, kalp kasında oluşan hasarın irreversibl olmadığı CK-MB değerinde bir yükselme olmaması ile gösterilmiştir. Ayrıca çalışmamızda tetrazoliyum boyama ile yapılan infarkt alanı ölçümlerinde de 30 dakikalık iskeminin kalp dokusunda nekroz oluşturmadığı gözlemlenmiştir. İskemi süresi arttıkça kalp kasında oluşan hasarın kalıcı olması söz konusudur. Palmer ve arkadaşlarının (125) yaptıkları çalışmada CK-MB artışı ve kalıcı doku hasarı oluşması kullandıkları farklı deney protokolüne bağlanabilir. Çalışmamızda, 30 dakika iskemi ve 30 dakika reperfüzyon sonrasında koroner perfüzatta kardiyak enzim CK-MB düzeylerinin değişmemesi ancak kalbin hemodinamik parametrelerinde değişiklik oluşması miyokard hücrelerinde yapısal bir hasar oluşmadığını göstermektedir. Kronik levosimendan tedavisinin vasküler etkileri Levosimendan vazodilatör etkisi nedeniyle koroner arter baypas graftlarında oluşabilecek arter spazmında, portal ve pulmoner basıncın yükseldiği durumlarda kullanılabileceği gibi vazodilatör etkinliği kalp rahatsızlıklarındaki kullanım alanlarında da yararlı olabilecektir. Diğer taraftan ilacın yaygın vazodilatasyon oluşturması özellikle uzun süreli profilaktik kullanımını kısıtlayabilecek istenmeyen bir etki olacaktır ve bu nedenle levosimendan ile damar üzerinde kasılma ve gevşeme oluşturan çeşitli ajanlar arasındaki ilişkinin incelenmesine ihtiyaç vardır. Bu nedenle, çalışmamızın bu bölümünde kronik levosimendan tedavisi uygulanan sıçanlardan izole edilen torasik aortalarda çeşitli vazokonstriktör ve vazodilatör ajanların etkinlikleri ve bu etkilerde endotelyumun olası rolü incelenmiştir. Oral yoldan 21 gün gibi 143 uzun süreli levosimendan kullanımının vasküler reaktivite üzerindeki etkileri ilk kez bu çalışmada incelenmiştir. 21 gün oral yoldan levosimendan ile tedavi edilen hayvanlardan izole edilen endotelli ve endotelsiz torasik aortalarda 120 mM KCl uygulaması eşit düzeyde kasılma yanıtlarına neden olmuştur. Oluşan kasılma yanıtları ile kontrol grubunun endotelli ve endotelsiz damar yanıtları arasında bir fark gözlenmemiştir. Yüksek konsantrasyonda K+ kullanılarak ve kümülatif levosimendan eklenerek yapılan in vitro çalışmalarda kasılma oluşturmak için kullanılan K+ konsantrasyonu arttıkça levosimendanın vazodilatör etkinliğinin azaldığı bildirilmiştir (177). Bizim çalışmamızda kullanılan yüksek K+ konsantrasyonunda levosimendanın kasılmaları azaltıcı bir etkisi gözlenmemiştir. KCl ile oluşan depolarizasyon voltaja duyarlı Ca+2 kanallarının açılmasına neden olarak hücre içi Ca+2 konsantrasyonu artışına yol açar ve böylece damar düz kası kasılır. Bowman ve arkadaşları (18) yaptıkları çalışmada levosimendanın 80 mM KCl ile oluşan hücre içi Ca+2 artışını azaltmaksızın gevşeme oluşturduğunu bildirmişlerdir. Ancak Krassoi ve arkadaşlarının (80) çalışmalarında ise ekstraselüler Ca+2 artırıldığında levosimendan gevşemelerinin azaldığı hatta damarların bir kısmında kasılma oluştuğu bildirilmiştir. Ekstraselüler Ca+2 konsantrasyonu yükseldikçe uyarı halinde voltaja duyarlı Ca+2 kanallarından hücre içine daha fazla Ca+2 girmesi söz konusudur. Araştırmacıların gözlemlediklerine benzer şekilde çalışmamızda kullanılan yüksek KCl konsantrasyonunun oluşturacağı hücre içi Ca+2 konsantrasyon artışı nedeniyle levosimendanın kasılma yanıtlarını azaltıcı bir etkisinin gözlenmemiş olması olasıdır. Ayrıca sıçan mezenterik arterinde yapılan bir çalışmada (121) 30 mM KCl ile oluşan kasılma yanıtının 144 1-1000 µM levosimendan uygulaması sonrasında azalmış olması, bizim kullandığımız levosimendan dozunun kasılma yanıtlarını azaltmayacak kadar düşük bir doz olduğunu da göstermektedir. Çalışmamızda, α-adrenerjik reseptör agonisti olan fenilefrin maksimum kasılma yanıtları ve duyarlılığı üzerinde kronik levosimendan tedavisinin ve endotelsizleştirmenin bir etkisi olmadığı gösterilmiştir. Fenilefrin ile kasılma oluşturulan damarlar üzerinde kümülatif levosimendan uygulamasının etkilerinin incelendiği iki çalışmada (165,179) ilacın gevşetici etkisi gösterilmiştir. Bu çalışmalarda belirgin gevşeme etkisinin gözlendiği levosimendan konsantrasyonları olan 3 ve 10 µM konsantrasyonlar, klinikte kullanılan dozlarda ölçülen levosimendan plazma konsantrasyonundan (0.2 µM) oldukça yüksektir. Çalışmamızda levosimendan plazma konsantrasyonu ölçülmemiş olmasına rağmen kronik tedavi için seçilen ilaç dozunun klinikte kullanılana benzer ve önemli vasküler yan etkiler oluşturmayacak kadar düşük bir doz olmasına dikkat edilmiştir. 0.5 mg’lık tek bir oral levosimendan dozunun pik plazma konsantrasyonunun 20 ng/mL (0.07 µM) olduğu bildirilmiştir (145). Çalışmamızda 0.2 mg/kg/gün dozunda kullanılan levosimendan ile nispeten daha düşük plazma konsantrasyonu elde edilmesi ve bu nedenle fenilefrin kasılma yanıtlarının baskılanmamış olması mümkündür. Ayrıca, levosimendanın düz kas tonusunu azaltıcı etkisinin mekanizmasının ilacın konsantrasyonuna bağlı olduğu kadar kan damarının tipine ve incelenen türe de bağlı olabileceği bildirilmiştir (182). Bu nedenle, çalışmamızda fenilefrin maksimum kasılma yanıtları üzerinde kronik levosimendan ile tedavi ve endotelsizleştirmenin bir etki oluşturmamış 145 olmasının nedeni türe özgü yanıt farklılıkları ve çalışılan damarların farklı olması olabilir. Kronik levosimendan tedavisi endoteli sağlam olan damarlarda 5-HT maksimum kasılma yanıtlarının artmasına, duyarlılığının ise azalmasına neden olmuştur. 5-HT kasılma yanıtları üzerinde kümülatif olarak izole organ banyolarına eklenen levosimendanın etkilerinin incelendiği iki çalışmada (54,178) yaklaşık 3 µM levosimendan, 5-HT maksimum kasılma yanıtlarında %35’lik bir azalma oluşturmuştur. Çalışmamızda bu kontraktil ajan ile ilgili olarak gözlemlenen farklılık levosimendanın in vivo olarak verilişine, kullanılan ilaç konsantrasyonuna, damar tipinin farklılığına ve türler arası farklılığa bağlı olabilir. Kontrol ve ilaçlı gruplarda endotelsizleştirme işlemi sonucunda 5-HT maksimum kasılma yanıtı ve duyarlılığı değişmemiştir. Çalışmamızda kronik levosimendan uygulamasının gevşetici ajan yanıtları üzerindeki etkileri incelendiğinde levosimendanın asetilkolin duyarlılığını artırdığı ve endotelsiz damarlarda NG maksimum gevşeme yanıtlarını artırdığı bulunmuştur. Ayrıca, kronik levosimendan uygulamasının endoteli sağlam damarlarda da NG gevşeme yanıtını artırma eğilimi olduğu görülmüştür. Kronik levosimendan tedavisinin asetilkolin duyarlılığını artırması ve nitrogliserin gevşemelerini artırma eğiliminin olması vazodilatör ajanlarla aditif bir etkinliğin söz konusu olabileceğini düşündürmektedir. Vücutta NO’ya dönüştürülerek etkisini gösteren bir vazodilatör olan izosorbid-5-mononitrat ile sağlıklı deneklerde yapılan bir çalışmada levosimendan ve NO aracılığı ile etkisini gösteren bu ilaç arasında aditif bir etkileşme olmadığı gösterilmiştir (151). Döpfmer ve arkadaşlarının (24) bildirdiği vakada ise başarılı bir KABG ameliyatı sonrasında graft vazospazmı gelişen bir hastada NG, 146 diltiazem ve milrinon uygulamaları sonuç vermeyince sol ventriküler asist cihazı uygulanmış, tekrarlayan vazospazm nedeniyle belirtilen vazodilatörlerden yeterli sonuç alınamaması sonrasında hastaya sistemik olarak levosimendan verilmesine karar verilmiştir. Yazarlar bu vakada ancak levosimendan levosimendanın uygulaması erken sonrasında iyileşmeye stabilizasyonun katkısının olduğunu sağlandığını ve düşündüklerini belirtmişlerdir (24). Çalışmamızdan elde ettiğimiz veriler doğrultusunda anlatılan vaka yorumlandığında levosimendanın NG ile aditif vazodilatör etkinlik oluşturması sonucunda hastanın vazospazmının çözülmüş olabileceğini düşünebiliriz. Ortak etki mekanizmasına sahip olan NG ve izosorbid-5-mononitratın levosimendan ile etkileşimleri arasında gözlemlenen bu farklılığın nedeni ile vazodilatör ajanlar ve levosimendan arasındaki etkileşimler ileri araştırmalar ile değerlendirilmelidir. Baypas ameliyatlarında graft spazmı önemli bir problemdir ve nitrogliserinin kasılmış halde olan graftı gevşetmede en etkili ilaçlardan biri olduğu bilinmektedir (112). Kronik levosimendan tedavisinin klinikte çok kullanılmakta olan nitrogliserinin maksimum gevşeme yanıtlarını artırıcı yöndeki etkisi ileri çalışmalar ile kanıtlandığı takdirde levosimendanın profilaktik kullanımı açısından özellikle önemli olabilir. 147 5 SONUÇ VE ÖNERİLER İzole Langendorff perfüze sıçan kalplerine 30 dakika global iskemi uygulanması, kalp fonksiyonlarında bozulmaya neden olmuş ancak kardiyak enzim CK-MB düzeyini değiştirmemiş, nekroza neden olmamış ve hücrelerde orta şiddette yapısal bozukluğa neden olmuştur. Bu çalışmanın bulguları sıçan kalbinde 30 dakika global iskemi uygulamasının uygun bir miyokardiyal sersemleme modeli olduğunu göstermiştir. İzole perfüze sıçan kalplerinde preiskemik dönemde hem 0.1 µM akut levosimendan tedavisi hem de 7, 14 ve 21 gün süre ile oral yoldan 0.2 mg/kg/gün kronik levosimendan tedavisi, 30 dakika süreli iskemiye karşı kalbin mekanik işlevlerini korumuştur. Oral yoldan levosimendan uygulanmasının miyokardiyal iskemiye karşı kalbin kontraktil fonksiyonlarını koruduğu ilk kez tarafımızdan gösterilmiştir. Bu çalışmanın sonuçları, tekrarlanan ilaç uygulamasının gerektiği durumlarda, günümüzde klinikte kullanılan intravenöz levosimendan uygulamasının getirdiği zorlukları taşımayan oral yoldan kronik kullanımın tercih edilebileceğini göstermiştir. Çalışmamızda levosimendanın hem bir değerlendirilebileceğini akut hem farmakolojik düşündüren de kronik önkoşullayıcı bulgular elde olarak uygulanan ajan edilmiştir. olarak Klinikte anjiyoplasti, KABG ve diğer kardiyak girişimler gibi programlı iskemi uygulanan durumlar ile kalp transplantlarında donör kalbin önkoşullanması gibi durumlarda levosimendan kullanımının söz konusu olabileceği bu çalışmanın bulguları ile desteklenmiştir. Ayrıca çalışmamızda, iskemik önkoşullama ile birlikte akut ve kronik levosimendan uygulamasının iskemiye karşı koruyuculuğu değiştirmediği ve birlikte güvenle uygulanabileceği gösterilmiştir. Kronik levosimendan uygulamasının vasküler reaktivite üzerine etkileri ilk kez bu çalışmada incelenmiştir. İlacın kronik kullanımının gevşetici ajanların duyarlılık ve maksimum gevşeme yanıtlarını artırma yönündeki eğilimi baypas ameliyatları sonrasında sık karşılaşılan bir sorun olan graft spazmının tedavisi açısından ilacın profilaktik kullanımına yeni bir bakış açısı getirebilir. Levosimendanın vazodilatör ve kardiyoprotektif etkilerine ilişkin bu çalışmadan elde edilen bulguların ileri araştırmalar ile desteklenmesi planlanmaktadır. 149 6 ÖZET Levosimendanın kalp yetmezliğindeki akut kullanımına ilişkin bilgiler olmakla birlikte ilacın uzun süreli ve oral kullanımının miyokard iskemisi, iskemik önkoşullama ve sistemik damarlar üzerindeki etkileri hakkında yeterli bilgi bulunmamaktadır. İzole Langendorff perfüze sıçan kalplerine 30 dakika global iskemi uygulanması, kalp fonksiyonlarında bozulmaya neden olmuş ancak kardiyak enzim CK-MB düzeyini değiştirmemiş, nekroza neden olmamış ve ultrastrüktürel düzeyde hücrelerde orta şiddette yapısal bozukluğa neden olmuştur. Bu çalışmanın bulguları sıçan kalbinde 30 dakika global iskemi uygulamasının uygun bir miyokardiyal sersemleme modeli olduğunu göstermiştir. İzole perfüze sıçan kalplerinde preiskemik dönemde 0.1 µM akut levosimendan tedavisi ve 7, 14 ve 21 gün süre ile oral yoldan 0.2 mg/kg/gün kronik levosimendan tedavisi, 30 dakika süreli iskemiye karşı kalbin mekanik işlevlerini korumuştur. Bu nedenle, tekrarlanan levosimendan uygulamasının gerektiği durumlarda intravenöz uygulamanın getirdiği zorlukları taşımayan oral yoldan kronik tedavi tercih edilebilir. Çalışmamızda levosimendanın hem bir değerlendirilebileceğini akut hem farmakolojik düşündüren de kronik önkoşullayıcı bulgular elde olarak uygulanan ajan edilmiştir. olarak Klinikte anjiyoplasti, koroner arter baypas graftı ve diğer kardiyak girişimler gibi programlı iskemi uygulanan durumlar ile kalp transplantlarında donör kalbin önkoşullanması gibi durumlarda levosimendan kullanımının söz konusu olabileceği bu çalışmanın bulguları ile desteklenmiştir. Ayrıca iskemik önkoşullama ile birlikte akut ve kronik levosimendan uygulamasının iskemiye karşı koruyuculuğu değiştirmediği ve birlikte güvenle uygulanabileceği gösterilmiştir. Kronik levosimendan ile tedavinin vasküler etkileri ilk kez bu çalışmada incelenmiştir. Levosimendanın gevşetici ajanların duyarlılık ve maksimum gevşeme yanıtlarını artırma yönündeki eğilimi, ileri araştırmalar ile kanıtlandığı takdirde, baypas ameliyatları sonrasında sık karşılaşılan bir sorun olan graft spazmının tedavisi açısından ilacın profilaktik kullanımına yeni bir bakış açısı getirebilir. 151 ABSTRACT Short term efficacy of levosimendan in heart failure is well known, however there is insufficient information about the long term and oral administration of this drug on myocardial ischemia, systemic arteries and concomitant use with ischemic preconditioning. Our data shows that, in Langendorff perfused rat hearts 30 minutes of global ischemia is an appropriate stunning model as this duration of ischemia induces functional deterioration and mild ultrastructural changes without increasing CK-MB and necrosis. Levosimendan administered before ischemia acutely (0.1 µM) or chronically (0.2 mg/kg/day, p.o., 7, 14 or 21 days) protected the mechanical functions of isolated rat hearts from ischemic injury. These results show that in need of repetitive drug administration levosimendan can be used orally as oral route have advantages over intravenous route in terms of administration facility. Our data suggest that levosimendan can be considered as a pharmacological preconditioning agent and can be used both acutely and chronically in settings of programmed myocardial ischemia such as angioplasty or bypass surgery and preconditioning the donor heart in transplants. Additionally, concomitant use of acute or chronic levosimendan with ischemic preconditioning does not alter protection afforded by ischemic preconditioning and can be used safely. This is the first study to investigate the effects of chronic levosimendan therapy on vascular reactivity. If the trend of levosimendan to increase the sensitivity and maximum relaxation responses to vasorelaxant agents can be assured with further investigations this can be a novel strategy for administration of levosimendan prophlactically for relief of graft spasm after bypass surgery. 153 7 Yararlanılan Kaynaklar 1. Addison, P. D., Neligan, P. C., Ashrafpour, H. et al. (2003). Noninvasive remote ischemic preconditioning for global protection of skeletal muscle against infarction. Am J Physiol Heart Circ Physiol, 285: H1435-H1443. 2. Akar, F., Manavbasi, Y., Parlar, A. I. et al. (2007). The Gender Differences in the Relaxation to Levosimendan of Human Internal Mammary Artery. Cardiovasc Drugs Ther, 21: 331-338. 3. Alkhulaifi, A. M., Pugsley, W. B. and Yellon, D. M. (1993). The influence of the time period between preconditioning ischemia and prolonged ischemia on myocardial protection. Cardioscience, 4: 163-169. 4. Ambros, J. T., Herrero-Fresneda, I., Borau, O. G. et al. (2007). Ischemic preconditioning in solid organ transplantation: from experimental to clinics. Transpl Int, 20: 219-229. 5. Antila, S., Jarvinen, A., Akkila, J. et al. (1997). Studies on psychomotoric effects and pharmacokinetic interactions of the new calcium sensitizing drug levosimendan and ethanol. Arzneimittelforschung, 47: 816-820. 6. Antila, S., Pesonen, U., Lehtonen, L. et al. (2004). Pharmacokinetics of levosimendan and its active metabolite OR-1896 in rapid and slow acetylators. Eur J Pharm Sci, 23: 213-222. 7. Antoniades, C., Tousoulis, D., Koumallos, N. et al. (2007). Levosimendan: beyond its simple inotropic effect in heart failure. Pharmacol Ther, 114: 184-197. 8. Arnold, J. M., Howlett, J. G., Dorian, P. et al. (2007). Canadian Cardiovascular Society Consensus Conference recommendations on heart failure update 2007: Prevention, management during intercurrent illness or acute decompensation, and use of biomarkers. Can J Cardiol, 23: 21-45. 9. Avgeropoulou, C., Andreadou, I., Markantonis-Kyroudis, S. et al. (2005). The Ca2+sensitizer levosimendan improves oxidative damage, BNP and pro-inflammatory cytokine levels in patients with advanced decompensated heart failure in comparison to dobutamine. Eur J Heart Fail, 7: 882-887. 10. Baines, C. P., Goto, M. and Downey, J. M. (1997). Oxygen radicals released during ischemic preconditioning contribute to cardioprotection in the rabbit myocardium. J Mol Cell Cardiol, 29: 207-216. 11. Barbosa, V., Sievers, R. E., Zaugg, C. E. et al. (1996). Preconditioning ischemia time determines the degree of glycogen depletion and infarction size reduction in rat hearts. American Heart Journal, 131: 224-230. 12. Barisin, S., Husedzinovic, I., Sonicki, Z. et al. (2004). Levosimendan in off-pump coronary artery bypass: a four-times masked controlled study. J Cardiovasc Pharmacol, 44: 703-708. 13. Benezet-Mazuecos, J. and de la Hera, J. (2007). Peripartum cardiomyopathy: A new successful setting for levosimendan. Int J Cardiol, in press. 14. Boknik, P., Neumann, J., Kaspareit, G. et al. (1997). Mechanisms of the contractile effects of levosimendan in the mammalian heart. J Pharmacol Exp Ther, 280: 277283. 15. Bolli, R. (1992). Myocardial 'stunning' in man. Circulation, 86: 1671-1691. 16. Bolli, R. and Marban, E. (1999). Molecular and cellular mechanisms of myocardial stunning. Physiol Rev, 79: 609-634. 17. Bonventre, J. V. (2002). Kidney ischemic preconditioning. Curr Opin Nephrol Hypertens, 11: 43-48. 18. Bowman, P., Haikala, H. and Paul, R. J. (1999). Levosimendan, a calcium sensitizer in cardiac muscle, induces relaxation in coronary smooth muscle through calcium desensitization. J Pharmacol Exp Ther, 288: 316-325. 19. Brendt, P., Behrends, M. and Peters, J. (2008). Myocardial stunning following no flow ischaemia is diminished by levosimendan or cariporide, without benefits of combined administration. Resuscitation, 76: 95-102. 20. Das, B. and Sarkar, C. (2007). Pharmacological preconditioning by levosimendan is mediated by inducible nitric oxide synthase and mitochondrial KATP channel activation in the in vivo anesthetized rabbit heart model. Vascular Pharmacology, 47: 248-256. 21. De Luca L., Colucci, W. S., Nieminen, M. S. et al. (2006). Evidence-based use of levosimendan in different clinical settings. Eur Heart J, 27: 1908-1920. 22. De Witt, B. J., Ibrahim, I. N., Bayer, E. et al. (2002). An analysis of responses to levosimendan in the pulmonary vascular bed of the cat. Anesth Analg, 94: 1427-33. 23. Deutsch, E., Berger, M., Kussmaul, W. G. et al. (1990). Adaptation to ischemia during percutaneous transluminal coronary angioplasty. Clinical, hemodynamic, and metabolic features. Circulation, 82: 2044-2051. 24. Dopfmer, U. R., Braun, J. P., Grosse, J. et al. (2005). Temporary left ventricular assist and levosimendan for coronary artery spasm. Interact Cardiovasc Thorac Surg, 4: 316-318. 155 25. Dos Santos P., Kowaltowski, A. J., Laclau, M. N. et al. (2002). Mechanisms by which opening the mitochondrial ATP- sensitive K(+) channel protects the ischemic heart. Am J Physiol Heart Circ Physiol, 283: H284-H295. 26. Du Toit, E., Hofmann, D., McCarthy, J. et al. (2001). Effect of levosimendan on myocardial contractility, coronary and peripheral blood flow, and arrhythmias during coronary artery ligation and reperfusion in the in vivo pig model. Heart, 86: 81-87. 27. Du Toit, E. F., Muller, C. A., McCarthy, J. et al. (1999). Levosimendan: effects of a calcium sensitizer on function and arrhythmias and cyclic nucleotide levels during ischemia/reperfusion in the Langendorff-perfused guinea pig heart. J Pharmacol Exp Ther, 290: 505-514. 28. Edes, I., Kiss, E., Kitada, Y. et al. (1995). Effects of Levosimendan, a cardiotonic agent targeted to troponin C, on cardiac function and on phosphorylation and Ca2+ sensitivity of cardiac myofibrils and sarcoplasmic reticulum in guinea pig heart. Circ Res, 77: 107-113. 29. Edwards, R. J., Saurin, A. T., Rakhit, R. D. et al. (2000). Therapeutic potential of ischaemic preconditioning. Br J Clin Pharmacol, 50: 87-97. 30. Eisen, A., Fisman, E. Z., Rubenfire, M. et al. (2004). Ischemic preconditioning: nearly two decades of research. A comprehensive review. Atherosclerosis, 172: 201-210. 31. Ellger, B. M., Zahn, P. K., Van Aken, H. K. et al. (2006). Levosimendan: a promising treatment for myocardial stunning? Anaesthesia, 61: 61-63. 32. Endoh, M. (2001). Mechanism of action of Ca2+ sensitizers--update 2001. Cardiovasc Drugs Ther, 15: 397-403. 33. Endoh, M. (2002). Mechanisms of action of novel cardiotonic agents. J Cardiovasc Pharmacol, 40: 323-338. 34. Erdei, N., Papp, Z., Pollesello, P. et al. (2006). The levosimendan metabolite OR1896 elicits vasodilation by activating the K(ATP) and BK(Ca) channels in rat isolated arterioles. Br J Pharmacol, 148: 696-702. 35. Figgitt, D. P., Gillies, P. S. and Goa, K. L. (2001). Levosimendan. Drugs, 61: 613-627. 36. Follath, F., Cleland, J. G. F., Just, H. et al. (2002). Efficacy and safety of intravenous levosimendan compared with dobutamine in severe low-output heart failure (the LIDO study): a randomised double-blind trial. The Lancet, 360: 196-202. 37. Galinanes, M. and Hearse, D. J. (1990). Assessment of ischemic injury and protective interventions: the Langendorff versus the working rat heart preparation. Can J Cardiol, 6: 83-91. 38. Garcia-Dorado, D., Rodriguez-Sinovas, A., Ruiz-Meana, M. et al. (2006). The endeffectors of preconditioning protection against myocardial cell death secondary to ischemia-reperfusion. Cardiovasc Res, 70: 274-285. 156 39. Gelpi, R. J., Morales, C., Cohen, M. V. et al. (2002). Xanthine oxidase contributes to preconditioning's preservation of left ventricular developed pressure in isolated rat heart: developed pressure may not be an appropriate end-point for studies of preconditioning. Basic Res Cardiol, 97: 40-46. 40. Ghadially, F. N., (1975). Ultrastructural pathology of the cell. In: London and Boston, pp. 406-415. Butterworths, 41. Ghosh, S., Standen, N. B. and Galinanes, M. (2000). Evidence for mitochondrial K ATP channels as effectors of human myocardial preconditioning. Cardiovasc Res, 45: 934-940. 42. Gowda, R. M., Khan, I. A., Vasavada, B. C. et al. (2004). Reversible myocardial dysfunction: basics and evaluation. Int J Cardiol, 97: 349-353. 43. Grippo, A. J., Santos, C. M., Johnson, R. F. et al. (2004). Increased susceptibility to ventricular arrhythmias in a rodent model of experimental depression. Am J Physiol Heart Circ Physiol, 286: H619-H626. 44. Gross, G. J. and Auchampach, J. A. (1992). Blockade of ATP-sensitive potassium channels prevents myocardial preconditioning in dogs. Circ Res, 70: 223-233. 45. Gross, G. J., Kersten, J. R. and Warltier, D. C. (1999). Mechanisms of postischemic contractile dysfunction. Ann Thorac Surg, 68: 1898-1904. 46. Grossini, E., Caimmi, P. P., Molinari, C. et al. (2005). Hemodynamic effect of intracoronary administration of levosimendan in the anesthetized pig. J Cardiovasc Pharmacol, 46: 333-342. 47. Grover, G. J. and Garlid, K. D. (2000). ATP-Sensitive potassium channels: a review of their cardioprotective pharmacology. J Mol Cell Cardiol, 32: 677-695. 48. Gruhn, N., Nielsen-Kudsk, J. E., Theilgaard, S. et al. (1998). Coronary vasorelaxant effect of levosimendan, a new inodilator with calcium-sensitizing properties. J Cardiovasc Pharmacol, 31: 741-749. 49. Haikala, H., Kaheinen, P., Levijoki, J. et al. (1997). The role of cAMP- and cGMPdependent protein kinases in the cardiac actions of the new calcium sensitizer, levosimendan. Cardiovasc Res, 34: 536-546. 50. Harjola, V. P., Peuhkurinen, K., Nieminen, M. S. et al. (1999). Oral levosimendan improves cardiac function and hemodynamics in patients with severe congestive heart failure. The American Journal of Cardiology, 83: 4-8. 51. Harkin, C. P., Pagel, P. S., Tessmer, J. P. et al. (1995). Systemic and coronary hemodynamic actions and left ventricular functional effects of levosimendan in conscious dogs. J Cardiovasc Pharmacol, 26: 179-188. 52. Heyndrickx, G. R. (2006). Early reperfusion phenomena. Semin Cardiothorac Vasc Anesth, 10: 236-241. 157 53. Heyndrickx, G. R., Millard, R. W., McRitchie, R. J. et al. (1975). Regional myocardial functional and electrophysiological alterations after brief coronary artery occlusion in conscious dogs. J Clin Invest, 56: 978-985. 54. Hohn, J., Pataricza, J., Petri, A. et al. (2004). Levosimendan interacts with potassium channel blockers in human saphenous veins. Basic Clin Pharmacol Toxicol, 94: 271273. 55. Holmuhamedov, E. L., Wang, L. and Terzic, A. (1999). ATP-sensitive K+ channel openers prevent Ca2+ overload in rat cardiac mitochondria. J Physiol, 519 Pt 2: 347360. 56. Hosenpud, J. D. (1999). Levosimendan, a novel myofilament calcium sensitizer, allows weaning of parenteral inotropic therapy in patients with severe congestive heart failure. The American Journal of Cardiology, 83: 9-11. 57. Huang, L., Weil, M. H., Tang, W. et al. (2005). Comparison between dobutamine and levosimendan for management of postresuscitation myocardial dysfunction. Crit Care Med, 33: 487-491. 58. Iliodromitis, E. K., Miki, T., Liu, G. S. et al. (1998). The PKC activator PMA preconditions rabbit heart in the presence of adenosine receptor blockade: is 5'nucleotidase important? J Mol Cell Cardiol, 30: 2201-2211. 59. Jamali, I. N., Kersten, J. R., Pagel, P. S. et al. (1997). Intracoronary levosimendan enhances contractile function of stunned myocardium. Anesth Analg, 85: 23-29. 60. Janssen, P. M., Datz, N., Zeitz, O. et al. (2000). Levosimendan improves diastolic and systolic function in failing human myocardium. Eur J Pharmacol, 404: 191-199. 61. Jenkins, D. P., Pugsley, W. B., Alkhulaifi, A. M. et al. (1997). Ischaemic preconditioning reduces troponin T release in patients undergoing coronary artery bypass surgery. Heart, 77: 314-318. 62. Jonsson, E. N., Antila, S., McFadyen, L. et al. (2003). Population pharmacokinetics of levosimendan in patients with congestive heart failure. Br J Clin Pharmacol, 55: 544551. 63. Kaheinen, P., Pollesello, P., Levijoki, J. et al. (2001). Levosimendan increases diastolic coronary flow in isolated guinea-pig heart by opening ATP-sensitive potassium channels. J Cardiovasc Pharmacol, 37: 367-374. 64. Kaheinen, P., Pollesello, P., Levijoki, J. et al. (2004). Effects of levosimendan and milrinone on oxygen consumption in isolated guinea-pig heart. J Cardiovasc Pharmacol, 43: 555-561. 65. Kersten, J. R., Montgomery, M. W., Pagel, P. S. et al. (2000). Levosimendan, a new positive inotropic drug, decreases myocardial infarct size via activation of K(ATP) channels. Anesth Analg, 90: 5-11. 66. Kitakaze, M., Weisfeldt, M. L. and Marban, E. (1988). Acidosis during early reperfusion prevents myocardial stunning in perfused ferret hearts. J Clin Invest, 82: 920-927. 158 67. Kivikko, M., Antila, S., Eha, J. et al. (2002). Pharmacodynamics and safety of a new calcium sensitizer, levosimendan, and its metabolites during an extended infusion in patients with severe heart failure. J Clin Pharmacol, 42: 43-51. 68. Kivikko, M. and Lehtonen, L. (2005). Levosimendan: a new inodilatory drug for the treatment of decompensated heart failure. Curr Pharm Des, 11: 435-455. 69. Kivikko, M., Lehtonen, L. and Colucci, W. S. (2003). Sustained hemodynamic effects of intravenous levosimendan. Circulation, 107: 81-86. 70. Kloner, R. A., Bolli, R., Marban, E. et al. (1998). Medical and cellular implications of stunning, hibernation, and preconditioning: an NHLBI workshop. Circulation, 97: 1848-1867. 71. Kloner, R. A. and Jennings, R. B. (2001). Consequences of brief ischemia: stunning, preconditioning, and their clinical implications: part 1. Circulation, 104: 2981-2989. 72. Kloner, R. A. and Jennings, R. B. (2001). Consequences of brief ischemia: stunning, preconditioning, and their clinical implications: part 2. Circulation, 104: 3158-3167. 73. Kloner, R. A. and Rezkalla, S. H. (2006). Preconditioning, postconditioning and their application to clinical cardiology. Cardiovasc Res, 70: 297-307. 74. Kloner, R. A., Shook, T., Antman, E. M. et al. (1998). Prospective Temporal Analysis of the Onset of Preinfarction Angina Versus Outcome An Ancillary Study in TIMI-9B. Circulation, 97: 1042-1045. 75. Kloner, R. A., Shook, T., Przyklenk, K. et al. (1995). Previous angina alters in-hospital outcome in TIMI 4. A clinical correlate to preconditioning? Circulation, 91: 37-45. 76. Koppel, H., Holzmann, S., Pilger, E. et al. (1999). Minimal effects of levosimendan on coronary artery smooth muscle tone. Cardiovasc Drugs Ther, 13: 357-358. 77. Kopustinskiene, D. M., Pollesello, P. and Saris, N. E. (2001). Levosimendan is a mitochondrial K(ATP) channel opener. Eur J Pharmacol, 428: 311-314. 78. Kopustinskiene, D. M., Pollesello, P. and Saris, N. E. (2004). Potassium-specific effects of levosimendan on heart mitochondria. Biochem Pharmacol, 68: 807-812. 79. Kortejarvi, H., Mikkola, J., Backman, M. et al. (2002). Development of level A, B and C in vitro-in vivo correlations for modified-release levosimendan capsules. Int J Pharm, 241: 87-95. 80. Krassoi, I., Pataricza, J., Kun, A. et al. (2000). Calcium-dependent vasorelaxant capacity of levosimendan in porcine and human epicardial coronary artery preparations. Cardiovasc Drugs Ther, 14: 691-693. 81. Kristof, E., Szigeti, G., Papp, Z. et al. (1999). The effects of levosimendan on the left ventricular function and protein phosphorylation in post-ischemic guinea pig hearts. Basic Res Cardiol, 94: 223-230. 159 82. Krum, H. and Liew, D. (2003). New and emerging drug therapies for the management of acute heart failure. Intern Med J, 33: 515-520. 83. Laclau, M. N., Boudina, S., Thambo, J. B. et al. (2001). Cardioprotection by ischemic preconditioning preserves mitochondrial function and functional coupling between adenine nucleotide translocase and creatine kinase. J Mol Cell Cardiol, 33: 947-956. 84. Lancaster, M. K. and Cook, S. J. (1997). The effects of levosimendan on [Ca2+]i in guinea-pig isolated ventricular myocytes. Eur J Pharmacol, 339: 97-100. 85. Leather, H. A., Ver, E. K., Segers, P. et al. (2003). Effects of levosimendan on right ventricular function and ventriculovascular coupling in open chest pigs. Crit Care Med, 31: 2339-2343. 86. Lehmann, A., Lang, J., Boldt, J. et al. (2004). Levosimendan in patients with cardiogenic shock undergoing surgical revascularization: a case series. Med Sci Monit, 10: MT89-MT93. 87. Lehtonen, L. and Poder, P. (2007). The utility of levosimendan in the treatment of heart failure. Ann Med, 39: 2-17. 88. Lehtonen, L. A., Antila, S. and Pentikainen, P. J. (2004). Pharmacokinetics and pharmacodynamics of intravenous inotropic agents. Clin Pharmacokinet, 43: 187203. 89. Lepran, I. and Papp, J. G. (2003). Effect of long-term oral pretreatment with levosimendan on cardiac arrhythmias during coronary artery occlusion in conscious rats. Eur J Pharmacol, 464: 171-176. 90. Lepran, I., Pollesello, P., Vajda, S. et al. (2006). Preconditioning effects of levosimendan in a rabbit cardiac ischemia-reperfusion model. J Cardiovasc Pharmacol, 48: 148-152. 91. Levijoki, J., Pollesello, P., Kaivola, J. et al. (2000). Further evidence for the cardiac troponin C mediated calcium sensitization by levosimendan: structure-response and binding analysis with analogs of levosimendan. J Mol Cell Cardiol, 32: 479-491. 92. Lilleberg, J., Nieminen, M. S., Akkila, J. et al. (1998). Effects of a new calcium sensitizer, levosimendan, on haemodynamics, coronary blood flow and myocardial substrate utilization early after coronary artery bypass grafting. Eur Heart J, 19: 660668. 93. Lilleberg, J., Sundberg, S. and Nieminen, M. S. (1995). Dose-range study of a new calcium sensitizer, levosimendan, in patients with left ventricular dysfunction. J Cardiovasc Pharmacol, 26 Suppl 1: S63-S69. 94. Lilleberg, J., Ylonen, V., Lehtonen, L. et al. (2004). The calcium sensitizer levosimendan and cardiac arrhythmias: an analysis of the safety database of heart failure treatment studies. Scand Cardiovasc J, 38: 80-84. 95. Liu, G. S., Thornton, J., Van Winkle, D. M. et al. (1991). Protection against infarction afforded by preconditioning is mediated by A1 adenosine receptors in rabbit heart. Circulation, 84: 350-356. 160 96. Lochner, A., Genade, S. and Moolman, J. A. (2003). Ischemic preconditioning: infarct size is a more reliable endpoint than functional recovery. Basic Res Cardiol, 98: 337346. 97. Louhelainen, M., Vahtola, E., Kaheinen, P. et al. (2007). Effects of levosimendan on cardiac remodeling and cardiomyocyte apoptosis in hypertensive Dahl/Rapp rats. Br J Pharmacol, 150: 851-861. 98. Marin, J., Marin, E., Gutierrez-Iniguez, M. A. et al. (2000). Mechanisms involved in the hemodynamic alterations in congestive heart failure as a basis for a rational pharmacological treatment. Pharmacol Ther, 88: 15-31. 99. Mathew, L. and Katz, S. D. (1998). Calcium sensitising agents in heart failure. Drugs Aging, 12: 191-204. 100. Maxwell, S. R. and Lip, G. Y. (1997). Reperfusion injury: a review of the pathophysiology, clinical manifestations and therapeutic options. Int J Cardiol, 58: 95117. 101. McBride, B. F. and White, C. M. (2003). Levosimendan: implications for clinicians. J Clin Pharmacol, 43: 1071-1081. 102. Mebazaa, A., Barraud, D. and Welschbillig, S. (2005). Randomized clinical trials with levosimendan. Am J Cardiol, 96: 74G-79G. 103. Mebazaa, A., Nieminen, M. S., Packer, M. et al. (2007). Levosimendan vs dobutamine for patients with acute decompensated heart failure: the SURVIVE Randomized Trial. JAMA, 297: 1883-1891. 104. Mentzer, R. M., Jr., Birjiniuk, V., Khuri, S. et al. (1999). Adenosine myocardial protection: preliminary results of a phase II clinical trial. Ann Surg, 229: 643-649. 105. Michaels, A. D., McKeown, B., Kostal, M. et al. (2005). Effects of intravenous levosimendan on human coronary vasomotor regulation, left ventricular wall stress, and myocardial oxygen uptake. Circulation, 111: 1504-1509. 106. Mitchell, M. B., Meng, X., Ao, L. et al. (1995). Preconditioning of isolated rat heart is mediated by protein kinase C. Circ Res, 76: 73-81. 107. Miyawaki, H., Zhou, X. and Ashraf, M. (1996). Calcium preconditioning elicits strong protection against ischemic injury via protein kinase C signaling pathway. Circ Res, 79: 137-146. 108. Moens, A. L., Claeys, M. J., Timmermans, J. P. et al. (2005). Myocardial ischemia/reperfusion-injury, a clinical view on a complex pathophysiological process. Int J Cardiol, 100: 179-190. 109. Moertl, D. (2006). Response to Letters to the Editor: Short-term effects of levosimendan and prostaglandin E1 on haemodynamic parameters and B-type natriuretic peptide levels in patients with decompensated chronic heart failure. Eur J Heart Fail, 8: 218. 161 110. Moertl, D., Berger, R., Huelsmann, M. et al. (2005). Short-term effects of levosimendan and prostaglandin E1 on hemodynamic parameters and B-type natriuretic peptide levels in patients with decompensated chronic heart failure. Eur J Heart Fail, 7: 1156-1163. 111. Moiseyev, V. S., Poder, P., Andrejevs, N. et al. (2002). Safety and efficacy of a novel calcium sensitizer, levosimendan, in patients with left ventricular failure due to an acute myocardial infarction. A randomized, placebo-controlled, double-blind study (RUSSLAN). Eur Heart J, 23: 1422-1432. 112. Montes, F. R., Echeverri, D., Buitrago, L. et al. (2006). The vasodilatory effects of levosimendan on the human internal mammary artery. Anesth Analg, 103: 10941098. 113. Morelli, A., Teboul, J. L., Maggiore, S. M. et al. (2006). Effects of levosimendan on right ventricular afterload in patients with acute respiratory distress syndrome: a pilot study. Crit Care Med, 34: 2287-2293. 114. Murry, C. E., Jennings, R. B. and Reimer, K. A. (1986). Preconditioning with ischemia: a delay of lethal cell injury in ischemic myocardium. Circulation, 74: 11241136. 115. Namachivayam, P., Crossland, D. S., Butt, W. W. et al. (2006). Early experience with Levosimendan in children with ventricular dysfunction. Pediatr Crit Care Med, 7: 445448. 116. Nanas, J. N., Papazoglou, P., Tsagalou, E. P. et al. (2005). Efficacy and safety of intermittent, long-term, concomitant dobutamine and levosimendan infusions in severe heart failure refractory to dobutamine alone. Am J Cardiol, 95: 768-771. 117. Nicklas, J. M., Monsur, J. C. and Bleske, B. E. (1999). Effects of intravenous levosimendan on plasma neurohormone levels in patients with heart failure: relation to hemodynamic response. The American Journal of Cardiology, 83: 12-15. 118. Nieminen, M. S., Akkila, J., Hasenfuss, G. et al. (2000). Hemodynamic and neurohumoral effects of continuous infusion of levosimendan in patients with congestive heart failure. J Am Coll Cardiol, 36: 1903-1912. 119. Nijhawan, N., Nicolosi, A. C., Montgomery, M. W. et al. (1999). Levosimendan enhances cardiac performance after cardiopulmonary bypass: a prospective, randomized placebo-controlled trial. J Cardiovasc Pharmacol, 34: 219-228. 120. Ottani, F., Galvani, M., Ferrini, D. et al. (1995). Prodromal angina limits infarct size. A role for ischemic preconditioning. Circulation, 91: 291-297. 121. Ozdem, S. S., Yalcin, O., Meiselman, H. J. et al. (2006). The role of potassium channels in relaxant effect of levosimendan in rat small mesenteric arteries. Cardiovasc Drugs Ther, 20: 123-127. 122. Packer, M. (2005). REVIVE II: multicenter placebo-controlled trial of levosimendan on clinical status in acutely decompensated heart failure. Program and abstracts from the American Heart Assocation Scientific Sessions, Dallas, Texas (Late Breaking Clinical Trials II). 162 123. Packer, M., Colucci, W. S., Fisher, L. et al. (2003). Development of a comprehensive new endpoint for the evaluation of new treatments for acute decompensated heart failure: results with levosimendan in the REVIVE 1 study. Journal of Cardiac Failure, 9: S61. 124. Pagel, P. S., McGough, M. F., Hettrick, D. A. et al. (1997). Levosimendan enhances left ventricular systolic and diastolic function in conscious dogs with pacing-induced cardiomyopathy. J Cardiovasc Pharmacol, 29: 563-573. 125. Palmer, B. S., Hadziahmetovic, M., Veci, T. et al. (2004). Global ischemic duration and reperfusion function in the isolated perfused rat heart. Resuscitation, 62: 97-106. 126. Papp, J. G., Pollesello, P., Varro, A. F. et al. (2006). Effect of levosimendan and milrinone on regional myocardial ischemia/reperfusion-induced arrhythmias in dogs. J Cardiovasc Pharmacol Ther, 11: 129-135. 127. Paraskevaidis, I. A., Parissis, J. T. and Th, K. D. (2005). Anti-inflammatory and antiapoptotic effects of levosimendan in decompensated heart failure: a novel mechanism of drug-induced improvement in contractile performance of the failing heart. Curr Med Chem Cardiovasc Hematol Agents, 3: 243-247. 128. Parissis, J. T., Adamopoulos, S., Farmakis, D. et al. (2006). Effects of serial levosimendan infusions on left ventricular performance and plasma biomarkers of myocardial injury and neurohormonal and immune activation in patients with advanced heart failure. Heart, 92: 1768-1772. 129. Parissis, J. T., Andreadou, I., Markantonis, S. L. et al. (2007). Effects of Levosimendan on circulating markers of oxidative and nitrosative stress in patients with advanced heart failure. Atherosclerosis, 195: e210-e215. 130. Parissis, J. T., Karavidas, A., Bistola, V. et al. (2007). Effects of levosimendan on flow-mediated vasodilation and soluble adhesion molecules in patients with advanced chronic heart failure. Atherosclerosis, in press. 131. Parissis, J. T., Panou, F., Farmakis, D. et al. (2005). Effects of levosimendan on markers of left ventricular diastolic function and neurohormonal activation in patients with advanced heart failure. Am J Cardiol, 96: 423-426. 132. Parissis, J. T., Papadopoulos, C., Nikolaou, M. et al. (2007). Effects of levosimendan on quality of life and emotional stress in advanced heart failure patients. Cardiovasc Drugs Ther, 21: 263-268. 133. Parissis, J. T., Paraskevaidis, I., Bistola, V. et al. (2006). Effects of levosimendan on right ventricular function in patients with advanced heart failure. Am J Cardiol, 98: 1489-1492. 134. Pataricza, J., Hohn, J., Petri, A. et al. (2000). Comparison of the vasorelaxing effect of cromakalim and the new inodilator, levosimendan, in human isolated portal vein. J Pharm Pharmacol, 52: 213-217. 135. Pataricza, J., Krassoi, I., Hohn, J. et al. (2003). Functional role of potassium channels in the vasodilating mechanism of levosimendan in porcine isolated coronary artery. Cardiovasc Drugs Ther, 17: 115-121. 163 136. Petaja, L. M., Sipponen, J. T., Hammainen, P. J. et al. (2006). Levosimendan reversing low output syndrome after heart transplantation. Ann Thorac Surg, 82: 1529-1531. 137. Pitcher, J. M., Wang, M., Tsai, B. M. et al. (2005). Preconditioning: gender effects. J Surg Res, 129: 202-220. 138. Poder, P., Eha, J., Sundberg, S. et al. (2004). Pharmacodynamics and pharmacokinetics of oral levosimendan and its metabolites in patients with severe congestive heart failure: a dosing interval study. J Clin Pharmacol, 44: 1143-1150. 139. Przyklenk, K., Bauer, B., Ovize, M. et al. (1993). Regional ischemic 'preconditioning' protects remote virgin myocardium from subsequent sustained coronary occlusion. Circulation, 87: 893-899. 140. Raja, S. G. and Rayen, B. S. (2006). Levosimendan in cardiac surgery: current best available evidence. Ann Thorac Surg, 81: 1536-1546. 141. Rauch, H., Motsch, J. and Bottiger, B. W. (2006). Newer approaches to the pharmacological management of heart failure. Curr Opin Anaesthesiol, 19: 75-81. 142. Rivera, J., Romero, K. A., Gonzalez-Chon, O. et al. (2007). Severe stunned myocardium after lightning strike. Crit Care Med, 35: 280-285. 143. Rocco, M., Carbone, I., Morelli, A. et al. (2006). The calcium sensitizer levosimendan improves carbon monoxide poisoning related stunned myocardium: a cardiac magnetic resonance study. Acta Anaesthesiol Scand, 50: 897-898. 144. Sakai, K., Yamagata, T., Teragawa, H. et al. (2002). Nicorandil enhances myocardial tolerance to ischemia without progressive collateral recruitment during coronary angioplasty. Circ J, 66: 317-322. 145. Sandell, E. P., Hayha, M., Antila, S. et al. (1995). Pharmacokinetics of levosimendan in healthy volunteers and patients with congestive heart failure. J Cardiovasc Pharmacol, 26 Suppl 1: S57-S62. 146. Singh, B. N., Lilleberg, J., Sandell, E. P. et al. (1999). Effects of levosimendan on cardiac arrhythmia: electrophysiologic and ambulatory electrocardiographic findings in phase II and phase III clinical studies in cardiac failure. The American Journal of Cardiology, 83: 16-20. 147. Slawsky, M. T., Colucci, W. S., Gottlieb, S. S. et al. (2000). Acute hemodynamic and clinical effects of levosimendan in patients with severe heart failure. Study Investigators. Circulation, 102: 2222-2227. 148. Sorsa, T., Pollesello, P. and Solaro, R. J. (2004). The contractile apparatus as a target for drugs against heart failure: interaction of levosimendan, a calcium sensitiser, with cardiac troponin c. Mol Cell Biochem, 266: 87-107. 149. Speechly-Dick, M. E., Grover, G. J. and Yellon, D. M. (1995). Does ischemic preconditioning in the human involve protein kinase C and the ATP-dependent K+ channel? Studies of contractile function after simulated ischemia in an atrial in vitro model. Circ Res, 77: 1030-1035. 164 150. Steenbergen, C., Perlman, M. E., London, R. E. et al. (1993). Mechanism of preconditioning. Ionic alterations. Circ Res, 72: 112-125. 151. Sundberg, S. and Lehtonen, L. (2000). Haemodynamic interactions between the novel calcium sensitiser levosimendan and isosorbide-5-mononitrate in healthy subjects. Eur J Clin Pharmacol, 55: 793-799. 152. Tachibana, H., Cheng, H. J., Ukai, T. et al. (2005). Levosimendan improves LV systolic and diastolic performance at rest and during exercise after heart failure. Am J Physiol Heart Circ Physiol, 288: H914-H922. 153. Tasdemir, O., Katircioglu, S. F., Kucukaksu, D. S. et al. (1993). Warm blood cardioplegia: ultrastructural and hemodynamic study. Ann Thorac Surg, 56: 305-311. 154. The IONIA Study Group (2002). Effect of nicorandil on coronary events in patients with stable angina: the Impact Of Nicorandil in Angina (IONA) randomised trial. Lancet, 359: 1269-1275. 155. Toivonen, L., Viitasalo, M., Sundberg, S. et al. (2000). Electrophysiologic effects of a calcium sensitizer inotrope levosimendan administered intravenously in patients with normal cardiac function. J Cardiovasc Pharmacol, 35: 664-669. 156. Toller, W. G. and Metzler, H. (2005). Acute perioperative heart failure. Curr Opin Anaesthesiol, 18: 129-135. 157. Toller, W. G. and Stranz, C. (2006). Levosimendan, a new inotropic and vasodilator agent. Anesthesiology, 104: 556-569. 158. Trikas, A., Antoniades, C., Latsios, G. et al. (2006). Long-term effects of levosimendan infusion on inflammatory processes and sFas in patients with severe heart failure. Eur J Heart Fail, 8: 804-809. 159. Tritapepe, L., De, S., V, Vitale, D. et al. (2006). Preconditioning effects of levosimendan in coronary artery bypass grafting--a pilot study. Br J Anaesth, 96: 694700. 160. Tritto, I., D'Andrea, D., Eramo, N. et al. (1997). Oxygen radicals can induce preconditioning in rabbit hearts. Circ Res, 80: 743-748. 161. Turanlahti, M., Boldt, T., Palkama, T. et al. (2004). Pharmacokinetics of levosimendan in pediatric patients evaluated for cardiac surgery. Pediatr Crit Care Med, 5: 457-462. 162. Tziakas, D. N., Chalikias, G. K., Hatzinikolaou, H. I. et al. (2005). Levosimendan use reduces matrix metalloproteinase-2 in patients with decompensated heart failure. Cardiovasc Drugs Ther, 19: 399-402. 163. Tzivoni, D. and Maybaum, S. (1997). Attenuation of severity of myocardial ischemia during repeated daily ischemic episodes. J Am Coll Cardiol, 30: 119-124. 164. Ukkonen, H., Saraste, M., Akkila, J. et al. (2000). Myocardial efficiency during levosimendan infusion in congestive heart failure. Clin Pharmacol Ther, 68: 522-531. 165 165. Usta, C., Eksert, B., Golbasi, I. et al. (2006). The role of potassium channels in the vasodilatory effect of levosimendan in human internal thoracic arteries. Eur J Cardiothorac Surg, 30: 329-332. 166. Valjakka-Koskela, R., Hirvonen, J., Monkkonen, J. et al. (2000). Transdermal delivery of levosimendan. Eur J Pharm Sci, 11: 343-350. 167. Van Eyk, J. E., Powers, F., Law, W. et al. (1998). Breakdown and release of myofilament proteins during ischemia and ischemia/reperfusion in rat hearts: identification of degradation products and effects on the pCa-force relation. Circ Res, 82: 261-271. 168. Vegh, A., Komori, S., Szekeres, L. et al. (1992). Antiarrhythmic effects of preconditioning in anaesthetised dogs and rats. Cardiovasc Res, 26: 487-495. 169. Wang, Q. D., Pernow, J., Sjoquist, P. O. et al. (2002). Pharmacological possibilities for protection against myocardial reperfusion injury. Cardiovasc Res, 55: 25-37. 170. Wang, Q. D., Swardh, A. and Sjoquist, P. O. (2001). Relationship between ischaemic time and ischaemia/reperfusion injury in isolated Langendorff-perfused mouse hearts. Acta Physiol Scand, 171: 123-128. 171. Wasir, H., Bhan, A., Choudhary, S. K. et al. (2001). Pretreatment of human myocardium with adenosine. Eur J Cardiothorac Surg, 19: 41-46. 172. Wienen, W., Jungling, E. and Kammermeier, H. (1994). Enzyme release into the interstitial space of the isolated rat heart induced by changes in contractile performance. Cardiovasc Res, 28: 1292-1298. 173. Woods, J., Monteiro, P. and Rhodes, A. (2007). Right ventricular dysfunction. Curr Opin Crit Care, 13: 532-540. 174. Yellon, D. M., Alkhulaifi, A. M. and Pugsley, W. B. (1993). Preconditioning the human myocardium. Lancet, 342: 276-277. 175. Yellon, D. M. and Baxter, G. F. (2000). Protecting the ischaemic and reperfused myocardium in acute myocardial infarction: distant dream or near reality? Heart, 83: 381-387. 176. Yellon, D. M. and Downey, J. M. (2003). Preconditioning the myocardium: from cellular physiology to clinical cardiology. Physiol Rev, 83: 1113-1151. 177. Yildiz, O. (2007). Vasodilating mechanisms of levosimendan: involvement of K+ channels. J Pharmacol Sci, 104: 1-5. 178. Yildiz, O., Nacitarhan, C. and Seyrek, M. (2006). Potassium channels in the vasodilating action of levosimendan on the human umbilical artery. J Soc Gynecol Investig, 13: 312-315. 179. Yildiz, O., Seyrek, M., Yildirim, V. et al. (2006). Potassium channel-related relaxation by levosimendan in the human internal mammary artery. Ann Thorac Surg, 81: 17151719. 166 180. Yokoshiki, H., Katsube, Y., Sunagawa, M. et al. (1997). Levosimendan, a novel Ca2+ sensitizer, activates the glibenclamide-sensitive K+ channel in rat arterial myocytes. Eur J Pharmacol, 333: 249-259. 181. Yokoshiki, H., Katsube, Y., Sunagawa, M. et al. (1997). The novel calcium sensitizer levosimendan activates the ATP-sensitive K+ channel in rat ventricular cells. J Pharmacol Exp Ther, 283: 375-383. 182. Yokoshiki, H. and Sperelakis, N. (2003). Vasodilating mechanisms of levosimendan. Cardiovasc Drugs Ther, 17: 111-113. 183. Yoshida, K., Inui, M., Harada, K. et al. (1995). Reperfusion of rat heart after brief ischemia induces proteolysis of calspectin (nonerythroid spectrin or fodrin) by calpain. Circ Res, 77: 603-610. 184. Zairis, M. N., Apostolatos, C., Anastassiadis, F. et al. (2004). 273 Comparison of the effect of levosimendan, or dobutamin or placebo in chronic low output decompensated heart failure. CAlcium sensitizer or Inotrope or NOne in low output heart failure (CASINO) study. European Journal of Heart Failure Supplements, 3: 66. 185. Zaugg, M., Schaub, M. C. and Foex, P. (2004). Myocardial injury and its prevention in the perioperative setting. Br J Anaesth, 93: 21-33. 167 EKLER Ek 1: İzole Langendorff perfüze kalp deney düzeneği A: MP35 veri kayıt sistemi, B: Perfüzyon pompası, C: Sirkülatörlü su banyosu, D: Langendorff perfüzyon sistemi A C B D Ek 2: İzole Langendorff perfüze sıçan kalbi, veri kaydında kullanılan transdusır ve elektrodlar A: Aort perfüzyon basıncı ölçümünde kullanılan transdusır, B: Sol ventrikül içi basıncı ölçümünde kullanılan transdusır, C: Bipolar elektrogram kaydında kullanılan iğne elektrodlar A B C Ek 3: Bipolar elektrogram kayıtlarında gözlenen çeşitli artimi tiplerinin temsili görüntüleri. 169 170 ÖZGEÇMİŞ 1976 yılında Erzincanda doğdum. İlköğrenimimi Ankara Hamdullah Suphi İlkokulunda tamamladım. Ortaokul ve lise öğrenimimi Ankara Atatürk Anadolu Lisesinde tamamladım. 1994 yılında Ege Üniversitesi Eczacılık Fakültesinde lisans eğitimime başladım ve 1998 yılında mezun oldum. 1999 yılında Ege Üniversitesi Sağlık Bilimleri Enstitüsü Farmakoloji Yüksek Lisans Programına kabul edildim ve 2001 yılında programı tamamladım. Aynı yıl Ege Üniversitesi Sağlık Bilimleri Enstitüsü Farmakoloji Doktora Programına kabul edildim. 1999 yılında, Ege Üniversitesi Eczacılık Fakültesi Farmakoloji Anabilim Dalı’nda araştırma görevlisi olarak göreve başladım. Halen aynı görevi sürdürmekteyim. 171
