Untitled
advertisement
BAKIR OKSİT VE SİLİKON DİOKSİT NANOPARTİKÜLLERİNİN ALLIUM CEPA’daki GENOTOKSİK ETKİLERİ Özlem ÇALBAY YÜKSEK LİSANS BİYOLOJİ ANABİLİM DALI GAZİ ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ EKİM 2014 iv BAKIR OKSİT VE SİLİKON DİOKSİT NANOPARTİKÜLLERİNİN ALLIUM CEPA’daki GENOTOKSİK ETKİLERİ (Yüksek Lisans Tezi) Özlem ÇALBAY GAZİ ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ Ekim 2014 ÖZET Bakır oksit nanopartikülleri (CuO NP) ve silikon dioksit nanopartikülleri (SiO2 NP) nanoteknolojide birçok üründe yaygın bir şekilde kullanılmaya başlanmıştır. Bu nedenle hem üretim, hem kullanım ve hem de çevreye salınmaları her geçen gün artış göstermektedir. Yapılan bazı çalışmalarda, nanopartiküllerin toksik ve özellikle genotoksik etkileri olduğu belirtilmektedir. Bu çalışmanın amacı, indikatör bir organizma olan Allium cepa kök ucu hücreleri kullanılarak CuO ve SiO2 nanopartiküllerinin genotoksik etkilerini incelemektir. Allium cepa kök uçları, CuO NP’lerinin 25, 50, 75 ve 100 µg/ml’lik ve SiO2 NP’lerinin 50, 250, 500 ve 1000 µg/ml’lik konsantrasyonları ile 24, 48 ve 72 saat muamele edilmiştir. CuO nanopartiküllerinin bütün konsantrasyonları ve uygulama süreleri, Allium cepa kök ucu hücrelerinde mitotik indekste kontrole kıyasla önemli düzeyde düşüşe sebep olmuştur. Özellikle en yüksek konsantrasyonda, mitotik indeks en düşük seviyeye ulaşmıştır. Bu nanopartiküller mitotik faz frekanslarında da değişikliklere sebep olmuştur. SiO2 NP’leri de Allium cepa kök uçlarında mitotik indekste düşüşe sebep olmuş ancak bu düşüş, kontrole kıyasla, 24 saatlik uygulamada sadece 50 ve 1000 µg/ml’de, 48 saatlik uygulamada sadece 1000 µg/ml’de ve 72 saatlik uygulamada ise 50 µg/ml’de anlamlı düzeydedir. CuO ve SiO2 NP’lerinin bütün konsantrasyonları her üç uygulama süresinde de kontrole göre kromozom anormalliklerinde önemli düzeyde artışa sebep olmuştur. Geçirmeli elektron mikroskobu analizleri, CuO ve SiO2 NP’lerinin hücre duvarına, sitoplazmaya, çekirdeğe, mitokondriye ve diğer bazı organellere alınabildiklerini göstermiştir. Bütün bu sonuçlar, CuO ve SiO2 NP’lerinin hücre içine, organellere ve genetik materyale ulaşabildiklerini ve hücre bölünmesinde C-metafaz, yapısı bozulmuş pro-, meta- ve ana-telofaz, kromozom kırığı, asenkron bölünme, multipolarlık, geri ve ileri kromozomlar, yıldız anafaz, mikronukleus ve genetik materyal kaybı gibi anormalliklere sebep olduğunu göstermektedir. Bu sonuçlar, CuO ve SiO2 NP’lerinin klastogenik/genotoksik ve sitotoksik ajanlar olabileceğini desteklemektedir. Bu bulgular aynı zamanda Allium cepa sitogenetik testinin, bir çok tüketici ürününde kullanılan yeni nanomateryallerin genotoksisite açısından değerlendirilmesinde kullanılabileceğini de desteklemektedir. Bilim Kodu : Anahtar Kelimeler : Sayfa Adedi Danışman : : 203.1.048 CuO nanopartikülleri, SiO2 nanopartikülleri, Allium cepa, Genotoksisite, TEM 98 Prof.Dr. Fatma ÜNAL v GENOTOXIC EFFECTS OF COPPER OXIDE AND SILICON DIOXIDE NANOPARTICLES IN ALLIUM CEPA (M. Sc. Thesis) Özlem ÇALBAY GAZİ UNIVERSITY GRADUATE SCHOOL OF NATURAL AND APPLIED SCIENCES October 2014 ABSTRACT Copper oxide nanoparticles (CuO NPs) and silicon dioxide nanoparticles (SiO2 NPs) are widely used in many nanotechnological products. So production, usage and release of these nanoparticles to the environment are increasing every day. It is reported in some studies that nanoparticles have toxic, particularly genotoxic effects. This study aims to investigate genotoxic impacts of CuO and SiO2 NPs using root tip cells of Allium cepa as an indicator organism. Allium cepa root tips were treated with 25, 50, 75 ve 100 µg/ml concentrations of CuO NPs and, 50, 250, 500 ve 1000 µg/ml concentration of SiO2 nanoparticles for 24, 48 and 72 hours. All the concentrations and treatment periods of CuO NP’s significantly decreased the mitotic index in Allium cepa root tip cells compared to the control. Especially at the highest concentration, mitotic index reached its lowest level. These nanoparticles induced changes in mitotic phase frequencies. SiO2 NPs also decreased the mitotic index in Allium cepa root tips cells however this decrease was significant at 50 ve 1000 µg/ml concentrations at 24 h, 1000 μg/ml concentration at 48 h and, 50 μg/ml concentration at 72 h treatment, compared to the control. All of the concentrations of CuO and SiO2 NPs increased the frequency of chromosome abnormalities at all the concentrations and three treatment periods compared to the control. Transmission electron microscopy analyses have shown that CuO and SiO2 NP’s can be taken into the cell wall, cytoplasm, cell nucleus, mitochondria and some other organelles. All of these results show that CuO and SiO2 NP’s can reach to the cell, organelles and genetic material and, may impair stages of cell division causing C-metaphase, disturbed pro-, meta- and ana-telophase, chromosomal breaks, asenkron division, multipolarity, lagging and vagrant chromosomes, star anaphase, micronuclei and loss of genetic material. These results indicated that CuO and SiO2 NPs can be clastogenic/genotoxic and cytotoxic agents. This finding also suggest that Allium cepa cytogenetic test can be used fort he genotoxicity monitoring of novel nanomaterials which are used in many consumer products. Science Code Key Words : : Page Number Supervisor : : 203.1.048 CuO nanoparticles, SiO2 nanoparticles, Allium cepa, Genotoxicity, TEM 98 Prof. Dr. Fatma ÜNAL vi TEŞEKKÜR Lisansüstü eğitimimi tamamlarken bu günlere gelmemde büyük emeği olan, bana her türlü konuda yardımını esirgemeyen, anlayış ve sabrıyla beni her zaman destekleyen Sayın hocam Prof. Dr. Fatma ÜNAL’a saygı ve sonsuz teşekkürlerimi sunarım. Ayrıca, her konuda bilgi ve tecrübelerini esirgemeden paylaşan değerli hocam Prof. Dr. Deniz YÜZBAŞIOĞLU’na, tez çalışmamın bir kısmında emeği geçen ve bana tecrübelerini aktararak bir adım daha yol almamı sağlayan değerli hocam Prof. Dr. Zekiye SULUDERE’ye, laboratuvar çalışmalarımda emekleri olan sevgili arkadaşlarım Uzman Damla AMUTKAN ve Uzman Nurcan ÖZYURT’a sonsuz teşekkürlerimi sunarım. Her türlü sıkıntımda bana desteklerini esirgemeyen tüm Yüksek Lisans ve Doktora öğrencisi sevgili arkadaşlarıma da sonsuz teşekkürlerimi sunarım. Ayrıca benden manevi desteklerini esirgemeyerek her zaman yanımda olan Mehmet ÇELEPKOLU’ ve canım kardeşim Özgür ÇALBAY’a çok teşekkür ederim. vii İÇİNDEKİLER Sayfa ÖZET ............................................................................................................................. iv ABSTRACT .................................................................................................................... v TEŞEKKÜR .................................................................................................................... vi İÇİNDEKİLER .............................................................................................................. vii ÇİZELGELERİN LİSTESİ ............................................................................................ ix ŞEKİLLERİN LİSTESİ .................................................................................................. x RESİMLERİN LİSTESİ ................................................................................................. xi SİMGELER VE KISALTMALAR ................................................................................ xiv 1. GİRİŞ....................................................................................................... 1 2. GENEL BİLGİLER................................................................................. 5 2.1. Nanopartiküller ve Nanoteknoloji....................................................................... 5 2.2. Nanoteknolojinin Kullanım Alanları ................................................................. 6 2.3. Nanopartiküllerin Biyosfer ile Etkileşimi .......................................................... 8 2.4. Nanopartiküllerin Bitkiler ile Etkileşimi ........................................................... 10 2.4.1. Nanopartiküllerin bitki sistemlerine alımı ........................................................... 11 2.4.2. Nanopartiküllerin bitki sistemlerine translokasyon ve birikimi............................ 12 2.5. Nanopartiküllerin Toksisitesi ............................................................................. 14 2.6. Nanopartiküllerin Genotoksisitesi ..................................................................... 17 2.7. Genotoksisiteyi Değerlendirmede Kullanılan Testler ......................................... 19 2.8. Bakır oksit ve Silika Nanopartikülleri ................................................................ 23 3. MATERYAL METOT ........................................................................................... 29 3.1. Materyal ............................................................................................................. 29 3.1.1. Bitki materyali ...................................................................................................... 29 viii Sayfa 3.1.2. Kullanılan test materyalleri ve diğer kimyasallar .................................... 29 3.2. Metot ................................................................................................................... 30 3.2.1. Test materyallerinin hazırlanması ............................................................ 30 3.2.2. Test materyallerinin Allium cepa ya uygulanması ................................... 31 3.3. Preparatların hazırlanması .................................................................................. 32 3.3.1. Işık mikroskobu ......................................................................................... 32 3.3.2. Elektron mikroskobu ................................................................................ 33 4. ARAŞTIRMA BULGULARI .............................................................................. 35 4.1. CuO Nanopartiküllerinin Allium cepa’daki Etkileri .......................................... 35 4.2. SiO2 Nanopartiküllerinin Allium cepa’daki Etkileri .......................................... 50 5. SONUÇ VE ÖNERİLER ..................................................................................... 65 KAYNAKLAR .............................................................................................................. 77 ÖZGEÇMİŞ .................................................................................................................... 98 ix ÇİZELGELERİN LİSTESİ Çizelge Sayfa Çizelge 4.1. Bakır oksit nanopartiküllerinin Allium cepa da mitotik fazların frekansı ve mitotik indeks (Mİ) üzerine etkisi ............................................ 35 Çizelge 4.2. Bakır oksit nanopartiküllerinin Allium cepa da kromozomal anormallikler üzerine etkisi........................................................................ 39 Çizelge 4.3. Silikon dioksit nanopartiküllerinin Allium cepa da mitotik fazların frekansı ve mitotik indeks (Mİ) üzerine etkisi ............................................ 51 Çizelge 4.4. Silikon dioksit nanopartiküllerinin Allium cepa da kromozomal anormallikler üzerine etkisi ........................................................................ 54 x ŞEKİLLERİN LİSTESİ Şekil Sayfa Şekil 2.1. Kategorilerine göre nanoteknolojik tüketici ürünleri ve oranları .................. 6 Şekil 2.2. Nanopartiküllerin bitkiye alım ve tranlokasyon yolları .................................. 11 Şekil 2.3. Mezofil, epidermis ve stomal hücrelerin şematik gösterimi ........................... 14 Şekil 4.1. CuO nanopartiküllerinin Allium cepa da anormallik frekansı üzerine etkisi .................................................................................................. 37 Şekil 4.2. SiO2 nanopartiküllerinin Allium cepa da anormallik frekansı üzerine etkisi................................................................................................... 52 xi RESİMLERİN LİSTESİ Resim Sayfa Resim 3.1. CuO nanopartiküllerinin Allium cepa’ya uygulanması ................................ 31 Resim 3.2. SiO2 nanopartiküllerinin Allium cepa’ya uygulanması ................................ 32 Resim 4.1. CuO nanopartiküllerinin Allium cepa da profazda meydana getirdiği anormallikler. A: Normal profaz, B: Yapısı bozulmuş profaz, C: Genetik materyal kaybı, D: Yapışıklık ....................................................................... 40 Resim 4.2. CuO nanopartiküllerinin Allium cepa da metafazda meydana getirdiği anormallikler. A: Normal metafaz, B-C: Metafazda kromozom gruplaşmaları, D: Yapısı bozulmuş metafaz ................................................. 40 Resim 4.3. CuO nanopartiküllerinin Allium cepa da anafaz-telofazda meydana getirdiği anormallikler. A: Normal telofaz , B: Yapısı bozulmuş anafaz, C:Geri kalmış kromozom, D: Multipolarite ..................................... 41 Resim 4.4. CuO nanopartiküllerinin Allium cepa da interfazda meydana getirdiği anormallikler. A: Binükleat, B: Tomurcuklanma, C: Halter şekilli çekirdek, D: Mikroçekirdek .......................................................................... 43 Resim 4.5. Kontrol grubundaki Allium cepa kök uçları. A: Genel görünüm, B: Bir hücrenin görüntüsü........................................................................................ 44 Resim 4.6. A: Allium cepa’da hücre duvarlarınnda CuO nanopartikülleri (25 µg/ml, 24 saat). B: A’nın büyütülmüş hali .............................................................. 45 Resim 4.7. A: Allium cepa’da plazmodezmalalarda CuO nanopartikülleri (25 µg/ml, 24 saat). B: A’nın büyütülmüş hali .............................................................. 45 Resim 4.8. Allium cepa’da mitokondri (M), golgi cisimciği (G), endoplazmik retikulum (ER) ve diğer yapılardaki (X) CuO nanopartikülleri (25 µg/ml, 24 saat) .......................................................................................................... 46 Resim 4.9. A: Allium cepa’da çekirdeğin heterokromatin bölgesinde CuO nanopartikülleri (100 µg/ml, 24 saat). B: A’nın büyütülmüş hali ................ 46 Resim 4.10. A: Allium cepa’da kofullarda CuO nanopartikülleri (25 µg/ml,72 saat). B: A’nın büyütülmüş hali........................................................................... 47 Resim 4.11. A: Allium cepa’da hücre dışı yapılarda CuO nanopartikülleri (25 µg/ml, 48 saat). B: A’nın büyütülmüş hali ............................................................ 47 Resim 4.12. A: Allium cepa’da mitokondrilerde CuO nanopartikülleri (25 µg/ml, 72 saat). B: A’nın büyütülmüş hali .................................................................. 48 xii Resim Sayfa Resim 4.13. A: Allium cepa’da mitokondri (M), endoplazmik retikulum (ER) ve sitoplazmada CuO nanopartikülleri (25µg/ml, 24 saat). B: A’nın büyütülmüş hali .......................................................................................... 48 Resim 4.14. A: Alium cepa’da CuO nanopartiküllerinin hücre membranında oluşturduğu hasar (100 µg/ml, 72 saat). B: A’nın büyütülmüş hali .......... 49 Resim 4.15. A: Allium cepa’da hücre duvarlarında CuO nanopartikülleri (100 µg/ml, 24 saat,). B: A’nın büyütülmüş hali ....................................... 49 Resim 4.16. SiO2 nanopartiküllerinin Allium cepa’da profazda meydana getirdiği anormallikler. A: Normal profaz, B: Genetik materyal kaybı, C: Yapısı bozulmuş profaz, D: Yapışıklık ................................................................. 55 Resim 4.17. SiO2 nanopartiküllerinin Allium cepa da metafazda meydana getirdiği anormallikler. A: Normal metafaz, B: Yapısı bozulmuş metafaz, C: Kromozom gruplaşması, D: C-Metafaz ..................................................... 55 Resim 4.18. SiO2 nanopartiküllerinin Allium cepa’da anafaz-telofazda meydana getirdiği anormallikler. A-B: Normal anafaz, C: Normal telofaz, D: Yapısı bozulmuş anafaz......................................................................................... 56 Resim 4.19. SiO2 nanopartiküllerinin Allium cepa da interfazda meydana getirdiği anormallikler. A: Binükleat, B-C: Tomurcuklanma, D: Mikroçekirdek ... 58 Resim 4.20. A: Allium cepa’da hücre dışı yapılardaki SiO2 nanopartikülleri (250 µg/ml, 24 saat). B:A’nın büyütülmüş hali ......................................... 59 Resim 4.21. Allium cepa’da çekirdekte SiO2 nanopartikülleri (50 µg/ml, 24 saat) ....................................................................................................... 59 Resim 4.22. Allium cepa’da farklı bir hücre çekirdeğinde SiO2 nanopartikülleri (50 µg/ml, 24 saat) ..................................................................................... 60 Resim 4.23. A: Allium cepa’da hücre duvarında biriken SiO2 nanopartikülleri (250 µg/ml, 24 saat). B: A’nın büyütülmüş hali ........................................ 60 Resim 4.24. Allium cepa’da kofullarda biriken SiO2 nanopartikülleri (250 µg/ml, 24 saat) ................................................................................... 61 Resim 4.25. A: Allium cepa’da hücre dışında SiO2 nanopartiküllerinin yoğunlaşması (500 µg/ml, 24 saat). B: A’nın büyütülmüş hali ................. 61 Resim 4.26. A: Allium cepa’da kofullarda biriken SiO2 nanopartikülleri (1000 µg/ml, 24 saat). B: A’nın büyütülmüş hali ...................................... 62 xiii Resim Sayfa Resim 4.27. A: Allium cepa’da plazmodezmada SiO2 nanopartikülleri (1000 µg/ml, 72 saat). B: A’nın büyütülmüş hali ........................................................... 62 Resim 4.28. A: Allium cepa’da sitoplazma, golgi cisimciği (G) ve mitokondride (M) SiO2 nanopartikülleri (500 µg/ml, 48 saat). B: A’nın büyütülmüş hali .......................................................................................... 63 Resim 4.29. A: Allium cepa’da çekirdekte SiO2 nanopartikülleri (1000 µg/ml, 48 saat). B: A’nın büyütülmüş hali ...................................... 63 xiv SİMGELER VE KISALTMALAR Bu çalışmada kullanılmış simgeler ve kısaltmalar, açıklamaları ile birlikte aşağıda sunulmuştur. Simgeler Açıklamalar % Yüzde µl Mikrolitre C Santigrat derece g/ml Mikrogram/ Mililitre M Mikromolar m Mikrometre mA Miliamper mg Miligram mL Mililitre mM Milimolar M Molar N Normal nm Nanometre rpm Devir sayısı V Volt Kısaltmalar Açıklamalar Ag Gümüş Au Altın Al Alüminyum Al2O3 Alüminyum oksit A549 Akciğer kanser hücre hattı CAT Katalaz CEN Avrupa Standardizasyon Komitesi xv Kısaltmalar Açıklamalar CNT Karbon Nanotüpleri Cu Bakır CuO Bakır oksit C60 Fulleren FAO Birleşmiş Milletler Gıda ve Tarım Örgütü Fe2O3 Demir oksit Fe2O4 Manyetit DNA Deoksiribonükleikasit HaCaT Keratinosit hücre hattı H2O2 Hidrojen Peroksit KA Kromozomal anormallik L-132 İnsan akciğer hücre hattı MDA Malondialdehit MgO Magnezyum oksit Mİ Mitotik indeks NA Nükleer anormallik MN Mikroçekirdek MWCNT Çok katmanlı karbon nanotüpleri NaYbEr4 Sodyum boro hidrid OH Hidroksil OHdG Hidroksi-deoksiguanozin OsO4 Ozmiyum tetroksit POD Fosfolipid hidroperoksit glutatyon RAW 264.7 Makrofaj hücre hattı ROT Reaktif oksijen türleri SiO2 Silikon dioksit SOD Süperoksit dismutaz SWCNT Tek katmanlı karbon nanotüpleri TEM Taramalı elektron mikroskobu TiO2 Titanyum dioksit Ye2O3 İtriyum oksit xvi Kısaltmalar Açıklamalar Zn Çinko ZnO Çinko oksit WHO Dünya Sağlık Örgütü 1 1. GİRİŞ Nanoteknoloji, nanometre (metrenin milyarda biri) boyutundaki partiküllerle çalışan multidisipliner bir bilim dalıdır. En azından bir ebatları 100 nm’nin altında olan nanomateryaller (NM) (nanopartiküller-NP), çok küçük ebatlarından dolayı bir çok yeni fiziksel ve kimyasal özellikler kazanırlar. Bu özelliklerinden dolayı NP’ler günümüzde her geçen gün sayıları artan çok farklı alanlarda kullanılmaya başlanmıştır. NP’ler elektronik, enerji, havacılık, uzay çalışmaları, savunma sanayii, biyoteknoloji, kozmetik, eczacılık, tıp ve gıda endüstrisi gibi birçok alanda kullanılmaktadır. Ayrıca otomotiv sanayiinde, inşaat sektöründe, cam ve seramik sanayiinde, boya ve plastik sanayiilerinde, tekstilde ve tarımda da bir çok amaçlar için kullanılmaktadır. İnsanlar nanopartiküllere hem kullanım, hem üretim ve hem de atık oluşumu sonucu doğaya salınmaları nedeniyle bilerek ya da bilmeden maruz kalmaktadır. Sadece insanlar değil, yeryüzünde neredeyse her canlı türü bu nano yapılara maruz kalmakta veya ileride maruz kalacak görünmektedir. Daha büyük ebatlı formlarına kıyasla nanopartiküllerin sahip olduğu biyolojik aktiviteler, bu materyallerin toksik etkilerinde, özellikle genetik materyalde oluşturdukları toksisitede artışlar oluşturabileceğini göstermektedir. Bütün bunlardan dolayı, nanotoksikoloji ve nanogenotoksikoloji, nanomateryallerin potansiyel risklerini ve bu riskin olası mekanizmalarını inceleyen yeni bir bilim dalı olarak gelişmeye ve genişlemeye başlamıştır. NP’lerin etkilerinin değerlendirildiği bazı çalışmalar bunların genotoksik riskler oluşturmadığını gösterirken, mikroorganizmalarda, çeşitli sucul türlerde, bitkilerde, çeşitli insan primer hücrelerinde ve hücre hatlarında, çeşitli hayvanlarda primer hücrelerde ve hücre hatlarında toksik ve genotoksik etkili olduklarını göstermektedir. Nanomateryallerden özellikle metal oksit nanopartikülleri yarı iletken, optik, piezoelektrik ve ultraviyoleden koruyucu özellikleri nedeniyle büyük ilgi uyandırmakta ve çok geniş kullanım alanı bulmaktadır. Bakır oksit (CuO) ve silikon dioksit (SiO2) gibi metal oksit nanopartikülleri, en fazla üretilen ve kullanılan nanomateryaller arasındadır. Bu nanopartiküller, sensörler, plastik, toner, boya, vernik, yapıştırıcı ve kurutucularda, diş macunu ve diğer kişisel bakım ürünlerinde, kataliz, arıtma, gıda paketlemesi, gıda filtrasyonu, gıda katkı maddeleri, ilaç yapımı, fotodermal terapi ve çevresel iyileştirme gibi daha pek çok uygulamada geniş kullanım alanına sahiptir. Ancak yapılan bazı çalışmalarda 2 bu metal oksitlerin toksik ve genotoksik riskler oluşturduğu belirlenmiştir. CuO nanopartiküllerinin farede böbrek, karaciğer ve dalak için toksik olduğu gözlenmiştir. Reaktif oksijen türlerinin artışına ve sonuçta DNA hasarına sebep olduğu belirlenmiştir. SiO2 yüksek toksisiteye sahip olup, akciğer kanseri etkenidir. Silikanın insan lenfoblast hücrelerinde genotoksik ve sitotoksik etkiler oluşturduğu rapor edilmiştir. Nanopartiküllerin çeşitli mekanizmalar ile hücre duvarına, hücre içine ve hatta çekirdek, mitokondri ve kloroplast gibi bir çok organele girebildiği ve lokalize olduğu gözlenmiştir. Geçirimli elektron mikroskobu (TEM) ile, nanopartiküllerin insan akciğer epitel hücrelerine ve lizozom, çekirdek ve mitokondri dahil çeşitli organellere girdiği gözlenmiştir. Bazı nanopartiküllerinin Allium cepa ve diğer bazı bitki türlerinde kök ucu hücrelerinde mitotik indekste azalma veya artışlara sebep olduğu, yapışık kromozom, anafaz-telofaz köprüleri, düzensiz anafaz-telofaz hücreleri, fragment, geri kalmış ve kalgın kromozomlar, mikronukleuslar gibi anormalliklere sebep oldukları rapor edilmiştir. Fagositozdan kaçabilecek kadar küçük olmaları nedeniyle hücrede depolanan nanopartiküller ya bölünmede görev yapan mekanizmaları etkileyerek veya bölünme sırasında serbest kalan genetik materyal ile direkt etkileşime girerek, bölünme işleminde veya DNA’da hasarlar oluşturmaktadır. Diğer taraftan NP’lerin kendileri veya serbest kalan iyonları da hücrelerde reaktif oksijen türlerinin oluşumunu indükler ve böylece oksidatif strese bağlı inflamasyona sebep olmaktadır. Ayrıca oksidatif stres lipid peroksidasyonunu indüklemektedir. Bütün bu olaylar, hem mitokondride ve hem de çekirdekteki genetik materyalde sekonder bir mekanizma ile hasarlar oluşturmaktadır. Bu hasarlar onarılamadığında çeşitli hastalıkların oluşmasına sebep olduğu gibi, programsız ve kontrolsüz bir şekilde bölünen hücrelerden kaynaklanan ve günümüzde ikinci derecede ölüm sebebi olan kanserlerin oluşmasını da tetiklemektedir. Bu tez çalışmasının amacı, daha önce farklı test sitemlerinde genotoksik risk taşıyabileceği belirlenmiş olan CuO NP’leri ve SiO2 NP’lerinin genotoksik etkilerini Allium cepa kök ucu hücrelerinde, mitotik indeks, mitotik faz frekansları ve mitoz bölünme sırasında oluşan anormallikler açısından incelemektir. Bu incelemeler ışık mikroskobu ile gerçekleştirilmiştir Bu çalışmanın bir başka amacı da, geçirimli elektron mikroskobu kullanılarak bu nanopartiküllerin hücreyle etkileşimlerini incelemek, nanopartiküllerin kök uçlarındaki hücrelere, hücre duvarına, çekirdeğe, hücresel organellere ve yapılara alınıp alınmadığını belirlemek ve olası etkilerini incelemektir. Allium cepa, kromozomlarının 3 büyük ve az sayıda olması nedeniyle uygun bir organizmadır. Allium testi, nanopartiküllerin ve diğer ekzojen kimyasalların risklerinin değerlendirilmesinde kullanılan ve yüksek hassasiyet gösteren genotoksisite testlerinden biridir. Bu test ucuz, kolay, hızlı sonuç vermesi, hem mitotik indekste ve hem de kromozomlarda meydana gelen anormalliklerin aynı anda belirlenmesine imkan vermesi nedeni ile çok kullanılan bir test sistemidir. Uygulamalar in vivo yapıldığı için, canlı sistemdeki etkilerin gözlenmesi açısından daha güvenilir sonuçlar vermektedir. Ökaryotik bir organizma olması ve bazı enzim sistemlerinin memelilerde de bulunması nedeniyle insandakine oldukça yakın bilgiler sağlamaktadır. En önemlisi de doğadaki atıkların toprak ve su yoluyla bitkiler tarafından alındığını ve bitkilerin de insan için vazgeçilmez besin maddesi olduğunu düşündüğümüzde, Allium cepa bu çalışma için en ideal organizma olması nedeni ile tercih edilmiştir. 4 5 2. GENEL BİLGİLER 2.1. Nanopartiküller ve Nanoteknoloji ‘Nano’ teknik bir ölçü birimi olarak kullanılır ve herhangi bir birimin milyarda biri anlamını ifade eder. Nanopartikül ise en az bir boyutu 100 nanometre (nm)'nin altında olan malzemelerdir (Hoyt ve Mason, 2008). Nanopartiküller orijinlerine göre 3 ana gruba ayrılmaktadır. Bunlardan birincisi maden kaynaklı, erozyon kaynaklı ve volkanik patlamalar gibi doğal süreçlerlerle oluşan doğal nanopartiküller, ikincisi egzos gazları ve kömür yanması gibi insan faaliyetleri sonucu oluşan raslantısal veya antropojenik nanopartiküller, üçüncüsü ise endüstriyel amaçlı tasarlanmış nanopartiküllerdir (Monica ve Cremonini, 2009). Endüstriyel nanopartiküller temel olarak 4 grupta toplanabilir. Karbon bazlı materyaller; tek katmanlı (SWCNT) ve çok katmanlı (MWCNT) karbon nanotüpleri ile fullerenleri kapsar, Metal bazlı materyaller; kuantum noktaları, nano altın (Au), nano çinko (Zn), nano aliminyum (Al) gibi metal esaslı malzemeler ile nano ölçekli silikon dioksit/silika (SiO2), bakır oksit (CuO) ve alüminyum oksit (Al2O3) gibi metal oksitleri kapsar, Dendrimerler; dallanmış birimlerden yapılmış nano-boyutlu polimerlerdir, spesifik bir kimyasal fonksiyon için uygun hale dönüşme yeteneğindedir, Kompozitler; diğer nanopartiküllerle veya daha büyük kütleli materyallerle birleştirilmiş nanopartiküllerdir. Küre, tüp, çubuk ve prizma gibi farklı morfojiler de sergilerler (Lin ve Xing, 2007). Nanoteknoloji, endüstriyel nanopartiküllerle, mühendislik manüpülasyon ve uygulama tekniklerini kullanarak, tasarım, üretim, işleme ve yeniden düzenleme yoluyla, kullanışlı materyal, araç ve sistem oluşturma sanatı ve bilimidir (Colvin, 2003). Nanoteknolojide malzemenin geleneksel formülasyonundaki katalitik, manyetik, optik ve mekanik özellikleri geliştirilir ve eşsiz özellikli yeni malzemeler üretilir. Bu üretimlerin artmasıyla, nanoteknoloji hızlı bir şekilde büyüyerek pek çok alanda kullanım yolu açılmıştır (Arora, Rajwade ve Paknikar, 2012). 6 2.2. Nanoteknolojinin Kullanım Alanları Nanoteknolojik üretimler çok kısa bir süre içinde artarak 2005 yılında 54 olan ürün envanteri, 2013 yılında 1628 adete yükselmiştir. En büyük alan 788 ürünün bulunduğu kozmetik, giyim, spor ürünleri, güneş koruyucuları ve medikal uygulamaları içeren, sağlık ve kişisel bakım kategorisidir (Şekil 2.1). 5% Sağlık ve Kişisel Bakım 4% 3% 2% Ev ve Bahçe Ürünleri 13% Otomotiv 50% Gıda Ürünleri 9% Çok Fonkiyonlu Ürünler Elektronik 14% Cihazlar Çocuk Ürünleri Şekil 2.1. Kategorilerine göre nanoteknolojik tüketici ürünleri ve oranları (Woodrow Wilson veritabanı, 2014) Üretilen nano boyutlu malzemelerde belirtilen içerikler dikkate alındığında, en çok kullanılan malzeme 383 değişik uygulama alanı olan gümüştür (Ag). Nano gümüşten sonra sırasıyla titanyum dioksit (TiO2)'i de içeren titanyum (179), fullerenleri de içeren karbon (87), silika (52), çinko oksiti (ZnO) de içeren çinko (Zn) (36) ve altın (Au) (19)’dır (Woodrow Wilson veritabanı, 2014). Nanopartiküller günlük hayatımızda oldukça değişik alanlarda kullanım alanı bulmaktadır. Örneğin nano alüminyum oksit (AlO) şampuan ve deterjanlarda, nanoyapılı titanyum oksitler pencere camları ve seramik fayanslarında, nano titanyum dioksit ve nano çinko oksit kozmetik ve güneş koruyucularında, nano titanyum kağıt, boya, mürekkep, diş macunlarında, nano demir oksit rujlarda ve nano kalsiyum fosfat kristalleri tıbbi implantlarda kullanılmaktadır (Kiss ve diğerleri, 2008; Remedios, Rosario, ve Bastos, 2012). 7 Nanomateryaller, insan sağlığında magnetik rezonans görüntüleme ve terapötik ilaç iletiminde de kullanılmaktadır (Leary, Liu ve Apuzzo, 2006; Wu, Wang, Sun ve Xue, 2011). Nano boyutlarından dolayı tümörlü damarları kolayca geçip tümörlü dokulara ulaşabilirler. Bu amaçla kullanılan nano altın eşsiz optik ve fototermal özellikleri sebebiyle hem algılama sistemlerinde ve hem de fototermal terapide çokça kullanılmaktadır. Demir oksit ve magnetit gibi manyetik nanopartiküller, silika tabanlı SiO2 ve mezoporus silika, kuantum noktacıkları, tek katmanlı ve çok katmanlı karbon nanotüpleri ve bazı kompozitler de sıkça kullanılan diğer nano yapılı malzemelerdir (Wang, Chuang ve Ho, 2012). Gıda ve tarımda, nanoteknoloji kullanılarak besinlerde nano iletim sistemleri, nano boyutlu organik ve inorganik gıda katkı maddeleri, gıda yüzeylerinde nano kaplamalar ve nano filtrasyon gibi üretimler yapılmaktadır. Gıdalarda kullanılan nano objelerden, nano gümüş antimikrobiyal ajan olarak kullanılır. Silikanın geleneksel formu hali hazırda gıda katkı maddesi olarak kullanılmaktadır (SiO2 INS 551). Nano mezoporus silika, nano filtrasyonda (yiyecek ve içeceklerdeki, örneğin acı tat veren bazı bitki ekstraktları gibi istenmeyen bileşiklerin temizlenmesinde), amorf yapılı SiO2 toz çorbalardaki akışkanlışı sağlamada, bira ve şarap temizlenmesinde kullanılır. Nano kaplama yapmak amacıyla 50 nm veya daha küçük boyutlu TiO2, SiO2 ve MgO (Magnezyum oksit) ile birlikte madde yüzeyinde ince amorf bir film oluşturularak sürekli bir işlemde kullanılması sağlanır. Nano selenyum yeşil çaylarda katkı madesi olarak kullanılır. Böylece etkili bir antioksidan olan selenyumun vücuda alımı güçlendirilir. Nano kalsiyum sakızların içinde kullanılır. Nano kalsiyum, nano magnezyum ve nano demir sağlık takviyesi olarak da üretilmekte ve kullanılmaktadır (FAO/WHO, 2010). Tarımda, nano iletim araçları ile, uygulanan kimyasal miktarı azaltılırken etkinliği artırılmaktadır (Johnston, 2010). Ayrıca ekinin büyüme ve tarla koşulları gerçek zamanlı izlenebilir ve bu bilgiler göz önüne alınarak dikim, hasat ve gübreleme işlemleri yapılabilir (Scott ve Chen, 2013). Nano iletim araçları, bitki hücresi ve organelleri ile hastalık yapıcı patojen arasında, fiziksel, kimyasal ve biyolojik etkileşimin anlaşılmasını ve böylece bu patojenlere karşı önlem alınabilmesini sağlar (Cursino ve diğerleri, 2009; Zaini, De La Fuente, Hoch ve Burr, 2009). Bitkileri tuzluluk, kuraklık gibi çevresel streslere dayanıklı hale getirmek amacıyla kalsiyum fosfat, karbon nanotüpleri, mezoporus silika, magnetit, 8 altın, stronsiyum fosfat, magnezyum fosfat ve mangan fosfat gibi nano boyutlu malzemeler ile daha etkili gen aktarımı yapılmaktadır (Rai, Deshmukh ve Gade, 2012). Nano yapılı malzemeler çevresel sorunların giderilmesinde de kullanılmaktadır (Tratnyek ve Johnson, 2006; Johnston, 2010). Nanopartiküller daha az yoğun ve daha uygun maliyetli olduklarından hem kimyasal hem de biyolojik kontaminantların temizlenmesinde kullanılmaktadır (Tratnyek ve Johnson, 2006). Örnek olarak, suda bulunan bakırın ultra filtrasyonu (Diallo, Christie, Swaminathan, Johnson ve Goddard, 2005), kurşunun topraktan uzaklaştırılması ile toprağın yıkanması ve iyileştirilmesi (Farmen, 2009; Xu ve Zhao, 2006), sudaki asitliğe göre anyon ve katyon bağlayabilen dendrimerler (Diallo, 2009), fotokatalizör olan nano TiO2 (FAO/WHO, 2010), farklı yüzeylere kolay adapte olabilen nano gümüş (Liu, Xie ve Cui, 2012) kullanılarak yeraltı ve bazı yer üstü sularındaki mikrobiyal patojenlerin öldürülmesini verebiliriz (Quinn ve diğerleri, 2005). Karbon nanotüp membranlar ve ince film nanokompozitli membranlar gibi nano yapılarla, daha düşük enerjili ve etkili sistemler oluşturulur ve deniz suyunun tuzdan arındırılması sağlanır (Hoek ve Ghosh, 2009). Son yıllarda yapılan çalışmalar ile bitki ve ağaçlardan nano ölçekli selülozik materyallerin elde edilebileceği gösterilmiştir. Bu sayede selülozik nano kristaller, nano kompozit olarak polimerik matris içinde kullanılarak, ambalajlama, inşaat ve ulaşım araçlarının gövde yapılarında uygulanır (Laborie, 2009). Lignoselülozik nano kılsı yapıların geliştirilmesiyle, otomotiv parçaları dahil olmak üzere birçok uygulamada, fiber cam ve plastik yerine biyokompozitler kullanılmaktadır (Hodur, ve Leistritz, 2007). 2.3. Nanopartiküllerin Biyosfer ile Etkileşimi Nanoteknolojinin bu kadar gelişmesi ve kullanımı nedeniyle endüstriyel nanopartiküller önemli miktarlarda üretilmektedir. Bu nanopartiküller her ne kadar düşük konsantrasyonlarda kullanılsa da kullanım alanlarının artmasıyla çevreye salınan nanopartikül konsantrasyonu da giderek artmaktadır. Çevre, dünya yüzeyinde yaşayan canlılar ile yaşam için gerekli olan hava, su ve topraktan oluşan bir sistemdir (Şahin, 2009). 9 Atmosfer içinde bulunan nanopartiküllerin atmosferde kalma süreleri kısadır fakat birikme modunda olan partiküllere bağlanabilir ve daha uzun süre kalabilirler (Biswas, ve Wu, 2005). Atmosferde bulunan bu nanopartiküller sıcaklığa, karbon partiküllerinin konsantrasyonuna veya kalış süresine bağlı olarak fotokimyasal süreçlerden geçerek ikincil nanopartikül oluşumunu sağlar (Morawska, Ristovski, Jayaratne, Keogh ve Ling, 2008). Bunun sonucu atmosferde bulunan nanopartikül yoğunluğunun iyice artmasıyla koagülasyon ve buhar yoğunlaşması artarak iklim değişiklikleri, kirlilik ve atmosferik optik etkiler oluşur (Nowack ve Bucheli, 2007). Nanoteknolojik sanayi ürünleri ve atıklarının su yollarına karışmasıyla sulardaki nanopartikül kontaminasyonu hızla artar. Bu nanopartiküller sudaki kolloidlerle birleşme eğilimindedir. Kolloidler, 1 nm ile 1 μm aralığındaki organik ve inorganik maddeleri içeren makromoleküllerdir (Klaine ve diğerleri, 2008; Nowack ve Bucheli, 2007). Metal nanopartiküller ile kolloidler birleşme eğilimi gösterir. Aslında bu oluşumun su üzerinde pozitif ekileri de vardır. Suyun arıtılması bu yolla yapılır. Bununla beraber kolloidlerin nanopartiküllerle etkileşimi nanopartikül davranışlarını da etkiler. Bu etkileşim özellikle sucul canlılar üzerinde oluşabilecek etkilerin tahmin edilmesini daha da zorlaştırır (Auffan, Bottero, Chaneac ve Rose, 2010). Okyanuslarda derinlik, sıcaklık gibi fizikokimyasal özellikler değişeceğinden kolloid kimyası ve dolayısı ile nanopartiküllerle birleşme davranışı da değişir. Ayrıca tatlı sularla birleşmiş nanopartiküllerin okyanusa karışmasıyla, okyanuslarda bu nanopartiküller ya okyanus tabanına batmakta ya da soğuk ve sıcak su arasında bir arayüz oluşturmaktadır. Bu arayüz, bu tabakadan beslenen pelajik türler açısından bir tehlike oluştururken, okyanus tabanında sedimenlerde birikmesi ise bentik türleri etkileyebilir. Okyanus yüzeyinde biriken nanopartiküller ise deniz kuşları, memeliler ve yüzey alanda yaşayan canlıları etkileyebilir (Kennedy, Scott, ve Ferris, 2004; Simkiss, 1990). Oberdörster ve arkadaşları, C60 nanopartiküllerine maruz kalmış canlı türlerinden tatlı su kabuklusu Daphnia magna, deniz kopepodu Hyalella azteca, Pimephales promelas ve Oryzias latipes balıklarında toksik etki rapor etmişlerdir (Oberdörster, Zhu, Blickley, McClellan-Green ve Haasch, 2006). Arıtma tesislerinden, asmosferde birikme yoluyla veya atıkların geri dönüşümüyle doğrudan veya dolaylı olarak serbest kalan nanopartiküllerin en son durakları toprak ve 10 sedimenlerdir. Bu nedenle toprak maruziyeti çevresel risklerin tahmin edilmesinde çok önemli bir sistemdir (Unrine ve diğerleri, 2010). Biyojeokimyasal olaylarda önemli rol oynayan killer, demir oksitler ve diğer mineraller nanopartikül içermektedir. Bu nedenle endüstriyel üretilmiş nanopartiküller ekosistemdeki doğal nanopartikülleri değiştirebilir ve böylece toprak gelişmesini ve davranışlarını (dağılma gibi) etkileyebilir (Cameron, 1915; Klaine ve diğerleri, 2008). Nanopartiküllerin topraktaki olası etkileri, hayatını toprağa bağlı olarak sürdüren bütün canlılara etki etmektedir. Au nanopartiküllerine maruz kalmış Eisenia fetida toprak solucanlarında nanopartiküllerin vücut yüzeylerinden emildiği, biyodağılımın dokular aracılığıyla gerçekleştiği ve sonuçta üremelerinde istatistiksel olarak anlamlı bir azalış olduğu belirlenmiştir (Unrine ve diğerleri, 2010). Nanopartiküller antimikrobiyal ajan olarak patojenik bakterilere karşı kullanılmaktadır. Fakat bu kullanım bitki büyümesini teşvik eden, yaşam döngülerinde rol alan ve kirleticilerin bozulmasını sağlayan topraktaki yararlı mikroorganizmalarda olumsuz etkilere yol açmaktadır. Nano yapılardan gümüş, CuO ve ZnO partiküllerinin hem Escherichia coli ve Staphylococcus aureus gibi patojenik türlerde hem de köklerde kolonize olan ve biyo iyileştirme etkisi olan Pseudomonas putida gibi yararlı mikroorganizmalar üzerinde toksik etkili oldukları belirlenmiştir (Molina, Ramos ve Espinosa-Urgel, 2006; Ramos-Gonzalez, Campos ve Ramos, 2005). Nanopartiküllerin karakteristik özelliklerinin karasal ekosistemlerde ne tür etkileşimlere sebep olabileceği ve olası etkilerinin ne olabileceğini tahmin etmek zordur. Bitkilere girebilen nanopartiküllerin insanlara ulaşması endişe uyandıran önemli bir durumdur (Unrine ve diğerleri, 2010). 2.4. Nanopartiküllerin Bitkiler ile Etkileşimi Bitkiler, biyosfer ve canlılar arasındaki geçişi sağlayan çok önemli ara birimlerdir. Bitkiler su, toprak ve atmosferik çevre elemanlarıyla doğrudan etkileşim halinde olup bu etkileşimler nanopartiküllerin yayılmasında farklı yollar oluşturabilmektedir (Miralles, Church ve Harris, 2012). 11 2.4.1. Nanopartiküllerin bitki sistemlerine alımı Nanopartiküller bitki yüzeylerine tutunur ve doğal nano veya mikro ölçekli açıklıklardan bitki içine alınırlar (Dietz ve Herth 2011). Nanopartiküller hem sürgünler hem de kökler aracılığıyla bitkiye giriş yapabilirler (Zhu, Han, Xiao ve Jin 2008). Nanopartiküllerin bitki içine alımında tahmin edilen yollar Şekil.2.2’de gösterilmiştir. Şekil 2.2. Nanopartiküllerin bitkiye alım ve tranlokasyon yolları. Kalın çizgiler önemli olduğu düşünülen alım yollarını, kırık çizgiler ise düşük oranlı alım yollarını gösterir (Dietz ve Herth 2011) Sürgün yüzeyleri mumsu kutikula ile kaplı olduğundan lipofiliktir (Barthlott ve Neinhuis, 1997), bu nedenle çok küçük ve lipofilik nanopartiküller doğrudan kutikulanın apolar sıvı alanlarına katılır. Büyük nanopartiküllerin penetrasyonları hidatod, çiçeklerdeki stigmalar ve stomalar gibi kutikuladan bağımsız alanlardan gerçekleşir (Dietz ve Herth 2011). Trikomlar sürgün yüzeylerde bulunan epidermal çıkıntılar olup (Glover, 2000), nanopartikül alımını artıran yapılar olduğu düşünülmektedir (Dietz ve Herth 2011). Nanopartiküllerin epidermal hücrelerdeki kutikula, trikom veya stomalardaki geçirgenliği birbirinden farklıdır (Schreiber, 2010). Kök uçlarından nanopartikül alımının sürgünlerden daha etkili olabileceği bildirilmiştir (Zhu ve diğerleri, 2008). Kök ve yumru gibi yer altı organları arayüz olarak süberin tabakalar geliştirir (Schreiber, 2010). Süberin, hücre duvarı iç yüzeyinde bulunan tek veya çok katmanlı bir depolama tabakasıdır. Çoğunlukla birincil köklerde süberinli 12 ekzodermisin yanında süberinli endodermis de gelişir. Ekzodermis, eriyiklerin ve suyun topraktan merkezi silindire apoplastik geçişini önler (Steudle ve Peterson, 1998). Ancak bazal kök bölgesinde yan kökler gelişir, oluşan bu yan kökler rizodermis korteksini deler ve apoplastik geçiş mümkün olur. Böylece nanopartiküller bu alanlardan ksilemler ile korteks ve merkezi silindire geçebilir (Faiyue, Al-Azzawi ve Flowers, 2010). Nanopartiküllerin bitki içine alımı otçullardan kaynaklanan veya mekanik hasarlar sonucu oluşan yaralardan da olabilir. Bakteriler için de bir giriş yolu olan bu yol (James ve Olivares, 1998), partikül alımı için de oldukça elverişli bir yoldur (Dietz ve Herth 2011). Nanopartiküllerin alımları, nanopartikül çeşidine bağlı olduğu gibi, bitki türüne göre de farklılık gösterir (Lin ve diğerleri, 2009). 2.4.2. Nanopartiküllerin bitki sistemlerine translokasyon ve birikimi Bitkilere özgü olan hücre duvarının sınırlayıcı etkisine rağmen, bazı bitkilerde nanopartiküllerin transloke olabildikleri ve bir süre sonra uzak bölgelere kadar taşınabildikleri belirlenmiştir. Çim köklerine, ZnO nanopartiküllerinin (20 nm çaplı) sudaki 8-1000 mg/L aralığındaki değişik konsantrasyonları uygulandığında, en yüksek konsantrasyonda, bazı ZnO partiküllerinin endodermis ve stelar hücrelerine yerleşebildiği, kökte ciddi hasara ve hücrelerin çökmesine sebep olduğu görülmüştür (Lin ve Xing, 2008). Lüminesanslardan sodyum boro hidrid (NaYbEr4) (45 nm çaplı) nanopartikülleri %1 oranında olacak şekilde sulamayla toprak içindeki Arabidopsis thaliana ya verilmiştir. Bu nanopartiküllerin yaprak ve çiçek sapında bulunduğu ve 6 günün sonunda merkezi silindire kadar ulaşabildiği belirlenmiştir (Hischemöller, Nordmann, Ptacek, Mummenhoff ve Haase, 2009). Hücre duvarı, su molekülleri ve diğer eriyiklerin köke alınabilmesi için gözenekleri olan polisakkarit yapılı fiber matristir. Por boyutları genel olarak 3-8 nm aralığındadır ve bu aralık birçok endüstriyel nanopartikülden çok daha küçük bir boyuttur (Carpita ve Gibeaut, 1993). Navarro ve arkadaşlarının hipotezine göre, doğal elek olan hücre duvarı kalınlığı yaklaşık 5-20 nm arasındadır. Küçük boyutlu endüstriyel nanopartikül agregatlarının en büyük pordan kolayca geçebilmesi ve plazma membranına kadar ulaşması beklenir. Büyük partikül agregatları ise bitki içine giremeyecektir. Fakat bazı araştırıcılar porlardan geçebilen daha küçük boyutlu nanopartiküllerin yeni oluşumları uyarabileceği ve büyük 13 yapılı nanopartiküllerin hücre duvarından geçişini sağlayacak yeni ve büyük boyutlu gözenekler oluşturabileceğini ifade etmişlerdir (Navarro ve diğerleri 2008). Konfokal lazer taramalı mikroskopla, Au nanopartiküllerininin 10 nm ve yukarısının, turgor basıncı altında olmasına rağmen, hücre duvarını aşamadıkları belirlenmiştir (Proseus ve Boyer, 2005). Fakat birçok bitki türünde farklı boyut ve bileşimlerdeki endüstriyel nanopartiküllerin hücre duvarını geçebildikleri gösterilmiştir (Lin ve diğerleri, 2009; Liu ve diğerleri, 2009). Makro veya mikro ölçekli moleküller bitki hücre duvarına girdikten sonra plazmodesmalar yoluyla hücre içi organellere taşınırlar (Dashevskaya, Kopito, Friedman, Elbaum ve Epel, 2008). Plazmodezmalar interselüler sitoplazma kanallarıdır. Bitkiler interselüler etkileşimde 2 yol kullanmaktadır. Bunlardan biri, hücre duvarlarındaki ligand reseptör aracılı apoplastik yol (hücre duvarı yolu), diğeri ise plazmodesmalar aracılı simplastik yol (sitoplazma yolu). Bu simplastik yolda düzenleyici proteinler ve RNA’lar rol oynar (Kim, 2005). Maddeler apoplastik yolla hücre duvarına trasloke olabilirken, simplastik yolla sitoplazmik elemanlara kadar ulaşabilmektedir (Clarkson, 1974). Bitki türlerine göre translokasyonda farklılıklar ortaya çıkmaktadır (Zhu ve diğerleri, 2008). Mısırda 4.9 nm'den küçük nanopartiküller küçük ölçüde perfüze olabilirken, 20 nm'den büyük çaplı partiküller engellenmektedir. Yapılan bu araştırmada nanopartikül alım sınırı 3,5 nm olarak tahmin edilmektedir. Bu boyut sınırının Abies nordmanniana, Thuja plicata, Gingko biloba ve Eucalyptus regnans gibi türlerde daha büyük olduğu bildirilmiştir (Shane, McCully ve Canny, 2000). Şekil. 2.3’te gösterildiği gibi, hasarsız hücre duvarlarından sadece 5 nm çapından küçük nanopartiküller etkili bir şekilde geçebilmektedir. Yapılan bir çalışmada, yaklaşık 3 nm çapındaki nanopartiküllerin, hücre çeperini geçerek çeşitli epidermal hücrelere dağılabildikleri ve hatta vakuollere kadar ulaşabildikleri gösterilmiştir. Bu dağılma floemler aracılığı ile olmaktadır (Kurepa ve diğerleri, 2010). Hücre-hücre geçişi, bitişik hücreler arasındaki plasmodezmaların boyutu ve nanopartikül boyutuna bağlıdır (Imlau, Truernit ve Sauer, 1999). Genel olarak bitkilerde nanopartikül dağılım düzeyi düşüktür. Nanopartiküller, komşu hücreler arasındaki plazmodezmalarda veya hücre duvarı boşluklarında biriktirilebilmektedir (Birbaum ve diğerleri, 2010). 14 Şekil 2.3. Mezofil, epidermis ve stomal hücrelerin şematik gösterimi (Dietz ve Herth, 2011) 2.5. Nanopartiküllerin Toksisitesi Nanopartiküllerin şekli, büyüklüğü, yüzey alanı, yüzey özellikleri, yüzey yükü ve agregasyon eğilimi gibi temel bileşenleri hem nanopartiküllerin çok çeşitli amaçlar için kullanılmasında önemli bir parametre oluşturmakta ve hem de ekosisteme ve özellikle insan dahil tüm canlı sistemlere yayılmasında ve toksik potansiyellerinde önemli bir rol oynamaktadır (Hoshino ve diğerleri, 2004; Singh ve diğerleri, 2009). Bir partikülün şekli ve boyutu o partikülün yüzey alanı büyüklüğünü etkilemektedir. Yüzey alanı ise reaksiyona girme potansiyellerini değiştirmektedir. Bir molekülün partikül boyutu azaldıkça yüzey alanı artar ve sonuçta o molekülün reaksiyona girme potansiyeli artar (Buzea, Pacheco ve Robbie, 2007; Jiang, Oberdörster ve Biswas, 2009). Bu özellikleri nedeniyle nano boyutlu partiküllerin aynı konsantrasyondaki mikron boyutlu partiküllerden daha toksik olduğu belirlenmiştir (Lee ve diğerleri, 2010; Shi, Abid, Kennedy, Hristova ve Silk, 2011). Nanopartikülün yüzey özellikleri, agregasyon durumunu etkilemektedir. Nanopartiküller genelde içinde bulunduğu sulu ortamda agregasyon oluşturma eğilimindedir. Agregasyon durumu, nanopartikülün boyut ve yüzey alanı gibi özelliklerini değiştirmek suretiyle etkilerini de değiştirmektedir. Nanopartiküllerin yüzey yükü hücresel alımında önemli bir rol oynamaktadır (Buzea ve diğerleri, 2007; Jiang ve diğerleri, 2009). Nanopartiküller hücre içine endositik veya endositik olmayan yol ile giriş 15 yapar. Endositozda nanopartiküller hücre yüzeyindeki reseptörler aracılığıyla hücrelere girebilir (Peters ve diğerleri, 2006). Endositik olmayan yolda nanopartiküllerin hücrelere girişi Van der Waals kuvvetleri, elektrostatik yükler veya arayüzey gerilimi gibi etkileşimlerle olmaktadır (Geiser ve diğerleri, 2005). Doğal, antropojenik ve endüstriyel nanopartiküller, partikülün sahip olduğu özgün özellikleri ve biyolojik aktivitesi sebebiyle, deri, akciğer, mide ve bağırsak sistemi gibi çeşitli giriş noktalarından insan vücuduna ulaşabilirler. Nanopartiküller ince kılcal damarlar yoluyla dokulara derinlemesine nüfuz edebilir ve bu yolla doku, organ, hücre ve hücresel yapılarla kolayca etkileşime girebilir (Gajewicz ve diğerleri, 2012). Nanopartiküller hedef organ olarak çoğunlukla akciğer, karaciğer, dalak ve böbrek dokularında toksik etki oluşturur (Chen ve diğerleri, 2006; Wang ve diğerleri, 2009). Farmokokinetik çalışmalar sonucu farklı tipte nanopartiküllerin mitokondri (Xia ve diğerleri, 2006), lipit vezikülleri (Penn A, Murphy, Barker, Henk ve Penn, L. 2005), fibroblastlar (Tian, Cui, Schwarz, Estrada ve Kobayashi, 2006), çekirdek veya makrofajlar (Chen ve Mikecz, 2005) gibi çeşitli yapılarda bulunduğu da belirlenmiştir. Nanopartiküller fiziko-kimyasal özellikleri nedeniyle hücrelerde reaktif oksijen türlerinin (ROT) oluşumunu indükleyebilir ve böylece oksidatif stres veya oksidadif stres aracılı inflamasyon oluşturabilirler. Hücrede oksidatif stresin artışı ROT’lerinin oluşumunu artırır, bunun sonucunda hücre bütünlüğünü korumak amacıyla antioksidan savunma sistemleri devreye girer. Fakat bazı durumlarda bu sistemler yetersiz kalarak oksidan-antioksidan arasında dengesizlikler meydana gelir. Bunun sonucunda hücre hasarı ve hatta hücre ölümü gerçekleşebilir (Shvedova, Pietroiusti, Fadeel ve Kagan, 2012). Yapılan bazı çalışmalar nanomateryallerin sitotoksik (Auffan ve diğerleri, 2006; Asare ve diğerleri 2012; Nirmala ve diğerleri, 2011; Thill ve diğerleri 2006; Wiesner, Lowry, Alvarez, Dionysiou ve Biswas, 2006), nörotoksik (Long, Saleh, Tilton, Lowry, ve Veronesi, 2006; Win-Shwe ve Fujimaki, 2011; Wu ve diğerleri, 2011), genotoksik (Kumari, Khan, Pakrashi, Mukherjee ve Chandrasekaran, 2011; Sharma, Singh, Anderson, Tobin ve Dhawan, 2011), ekotoksik (Colvin, 2003; Ellegaard-Jensen, Jensen ve Johansen, 2012) ve bakteri öldürücü (Tran ve diğerleri, 2010; Yamakoshi ve diğerleri, 2003) olabileceğini göstermiştir. Örneğin, SWCNT ve MWCNT'nin insan hücreleri için toksik etkili olduğu (Tian ve diğerleri, 2006), nano yapılı SiO2 ve ZnO'in, insan ve kemirgenlerde 16 akciğer inflamasyonuna sebep olduğu (Chen Y, Chen J, Dong ve Jin, 2004), antibakteriyel olarak kullanılan gümüş nanopartiküllerinin çevreye salınmasıyla ekolojik dengeyi önemli derecede ekilediği (Parashar ve diğerleri, 2011) tespit edilmiştir. Nanopartiküllerin bitkilere olası toksik etkilerini değerlendirmede daha ziyade çimlenme indeksi ve kök uzaması gibi parametreler kullanılmaktadır. Manyetit (Fe3O4), TiO2 ve karbon nanopartiküllerinin Cucumis sativus bitkisinde, tohum çimlenme oranı ve özellikle kök uzaması üzerinde inhibitor etki oluşturduğu bildirilmiştir (Mushtaq, 2011). Arabidopsis thaliana bitkisinin kök uzaması, tohum çimlenmesi ve yaprak sayısı üzerine Al2O3, SiO2, Fe3O4 ve ZnO gibi metal oksit nanopartiküllerinin etkisinin anlaşılması için, her bir partikülün 400, 2000 ve 4000 mg/L konsantrasyonlarıyla muamele edilmiştir. Söz konusu parametreler bakımından ZnO en fitotoksik, Fe3O4 ve SiO2 toksik etkili, Al2O3 ise nontoksik olarak bulunmuştur (Lee ve diğerleri, 2010). Nanopartiküllerin klorofiller üzerinde de etkili olduğu tespit edilmiştir. CuO nanopartikülleri ve çözünebilen bakır (Cu)’ın, Landoltia punctata bitkisine uygulandığı bir çalışmada, her iki kimyasalın da büyümeyi % 50 oranında inhibe ettiği belirlenmiştir. Ayrıca 1.0 mg\L’lik CuO nanopartiküllerinin klorofil oranında anlamlı bir azalmaya yol açtığı gözlenmiştir. Bu azalmanın, CuO nanopartiküllerinin, çözünebilen Cu’a oranla yapraklarda 4 kat daha fazla birikmesinden kaynaklandığı belirtilmiştir (Shi ve diğerleri, 2011). Nanopartüküllerin etkileri uygulandıkları türlere göre de farklılıklar oluşturmaktadır. Cu nanopartiküllerinin farklı konsatrasyonlarına maruz bırakılan Phaseolus radiatus ve Triticum aestivum türlerinde büyüme inhibisyonu incelenmiştir. Cu nanopartiküllerinin Phaseolus radiatus ve Triticum aestivum da sırasıyla 336 ve 570 mg\L konsantrasyonlarının etkili olduğu ve buna göre Phaseolus radiatus un daha hassas olduğu belirtilmiştir. Transmisyon elektron mikroskobu kullanılarak yapılan incelemede, Cu nanopartiküllerinin artan konsantrasyonuyla biyoakümülasyonun artış gösterdiği gözlenmiştir (Lee, An, Yoon ve Kweon, 2008). Nanopartiküllerin bitkilerde oluşturdukları oksidatif stres sonucunda lipid peroksidasyonunu indüklediği belirlenmiştir. Nanopartiküllerin, mikro boyutlu formlarına kıyasla daha fazla birikebildiği ve bunların, katalaz ve süperoksit dismutaz antioksidan 17 enzim kapasitelerinde 1,5-2 kat daha fazla artışa sebep oldukları belirlenmiştir (Nekrasova, Ushakova, Ermakov, Uimin ve Byzov, 2011). Cumumis sativus bitkisi, CuO ve ZnO nanopartiküllerinin 1,000 mg/L konsatrasyon ile muamele edilmiş ve fidelerin biyokütlesinde kontrole kıyasla sırasıyla % 75 ve % 35 oranında azalma olduğu belirlenmiştir. CuO ve ZnO nanopartiküllerinin kök hücre duvarlarına büyük oranda yapıştığı ve süperoksit dismutaz (SOD), katalaz (CAT) ve fosfolipid hidroperoksit glutatyon (POD) aktivitelerinde anlamlı bir artışa yol açtıkları gözlenmiştir (Kim, Lee S ve Lee I, 2012). 2.6. Nanopartiküllerin Genotoksisitesi Nanomateryallerin genotoksik mekanizması henüz tam olarak anlaşılamamıştır. Nanomateryallerin boyut, form, muamele süresi, kullanılan test organizması, agregasyon durumu, konsantrasyonu, uygulanan hücre tipi ve in vivo/in vitro uygulanması gibi parametrelere bağlı olarak gösterecekleri genotoksik etki de farklılık göstermektedir. Nanopartiküllerin genotoksik etkileri konusunda bitkilerde yapılmış sınırlı sayıda çalışma mevcuttur. Memeli hücrelerinde ise farklı boyut, form ve test organizmaları kullanılarak nanopartiküllerin etki potansiyelleri anlaşılmaya çalışılmaktadır. Örneğin, TiO2 nanopartiküllerinin farklı iki formu memeli hücre hattına muamele edildiğinde, anataz formun DNA zincir kırıkları ve kromozom hasarları oluşturduğu, rutil formun ise genotoksik etki göstermediği belirlenmiştir (Falck ve diğerleri, 2009; Petkovic ve diğerleri, 2011). TiO2 nanopartiküllerinin rutil formu transgenik farelere in vivo muamele edildiğinde epidermisten penetre olamadığı ve deri tümörlerinin oluşturulduğu dermise ulaşamadığı gözlenmiştir (Xu ve diğerleri, 2011). Fakat TiO2 nanopartiküllerinin anataz formunu da kapsayan kristal formunun genellikle genotoksik potansiyeli olduğu belirlenmiştir. TiO2 nanopartiküllerinin %75 anataz + %25 rutil formunun içme suyuna karıştırılarak verilmesiyle farelerin karaciğerlerinde 8-hidroksi-deoksiguanozin (8-OhdG) adductlarının, periferal kan hücrelerinde büyük kromozomal hasarların ve fetüsün maternal maruziyetiyle DNA delesyon frekansında artışların olduğu belirlenmiştir (Trouiller, Reliene, Westbrook, Solaimani ve Schiestl, 2009). Yapılan başka bir çalışmada rutil formun anataz formdan daha büyük olduğu ve bu nedenle oluşturdukları genotoksik cevabın da farklı olduğu sonucuna ulaşılmıştır (Gurr, Wang, Chen ve Jan, 2005). 18 Demir oksit (Fe2O3), itriyum oksit (Y2O3) ve ZnO nanopartiküllerinin 0,0001-50 µg/ml konsantrasyonları insan vasküler endotel hücrelerine 1-8 saat boyunca uygulandığında her üç nanopartikülün de endotel hücrelerine girebildikleri fakat oluşturdukları genetik cevapların farklı olduğu belirlenmiştir. Fe2O3 nanopartiküllerinin inflamasyon yanıtı oluşturamadığı fakat Y2O3 ve ZnO nanopartiküllerinin 10 µg/ml ve yukarısının akut maruziyet oluşturmasıyla inflamasyonu tetikleyebildikleri belirtilmiştir. İnflamasyon oluşumu nanopartikülün türü ve konsantrasyonuna göre farklılık göstermektedir. Endotel hücrelerdeki inflamasyon kardiyovasküler hastalıkların gelişiminde de kritik bir rol oynamaktadır (Gojova ve diğerleri, 2007). Silikanın genotoksisitesi komet analiziyle değerlendirildiğinde genellikle önemli derecede DNA hasarı oluşturmadığı fakat mikroçekirdek değerlendirmelerinde önemli genotoksik cevap oluşturduğu bildirilmiştir (Wang J, Sanderson ve Wang H, 2007). Aynı anda iki test sistemiyle yapılan bir başka çalışmada, silikanın mikroçekirdek frekansında önemli bir artışa sebep olduğu fakat komet kuyruk uzuluğunda bir artış oluşturmadığı belirtilmiştir (Gonzalez ve diğerleri, 2010). Bu sonuçlar genotoksisitenin araştırılmasında farklı test sistemlerinin kullanılmasının önemini göstermektedir. Manyetit nanopartiküllerinin, memeli hücrelerinde ROT'lerinin etkisiyle çift DNA kırıkları, kromozomlarda mikronükleus ve kardeş kromatit değişimi oluşturdukları bildirilmiştir (Kawanishi ve diğerleri, 2012) TiO2, sentetik amorf silika ve MWCNT'lerin insan lenfositleri üzerindeki olası genotoksik etkileri mikroçekirdek analizi kullanılarak değerlendirilmiştir. TiO2 ve MWCNT'lerin bazı formlarının genotoksik etki oluşturdukları, sentetik amorf silikanın mikroçekirdek oluşturmadığı bildirilmiştir. Genotoksisitenin değerlendirilmesinde mikroçekirdek oluşumlarının önemli bir parametre olduğu vurgulanmıştır (Tavares ve diğerleri, 2014). Mikroçekirdek oluşumları bitkilerde de önemli bir parametredir. Allium cepa’da mikronükleus ve kromozom anormallikleri ile kök büyümesi arasında ters bir korelasyon olduğu belirlenmiştir (Ghosh, Bandyopadhyay ve Mukherjee, 2010). Gümüş nanopartikülleri (25, 50, 75 ve 100 µg/ml konsantarsyonları) Allium cepa kök ucu hücrelerinde genotoksik ve sitotoksik etkiler oluşturmuş ve mitotik indekste kontrole kıyasla anlamlı bir azalmaya sebep olmuştur. Bu nanopartiküllerin kromatin köprüleri, yapışıklık ve yapısı bozulmuş metafazlara sebep olduğu, özellikle 75 µg/ml’lik konsantrasyonda kromozom kırıkları ve 100 µg/ml’lik konsantrasyonda ise hücre duvarında parçalanmalara sebep olduğu belirlenmiştir (Kumari, Mukherjee ve 19 Chandrasekaran, 2009). Gümüş nanopartikülerinin Vicia faba’da da genotoksik etkiler oluşturduğu, kromozomal aberasyonların kontrole kıyasla anlamlı bir artış gösterdiği belirlenmiştir (Patlolla, Berry, May ve Tchounwou, 2012). ZnO nanopartikülleri Allium sativum’da kromozom yapışmaları, köprüler, kırıklar ve geri kalmış kromozomlar oluşturmuştur. Bu hasarlı hücrelerin sayısı konsantrasyon ve muamele süresinin artışıyla beraber yükselmiştir (Shaymurat ve diğerleri, 2012). Nanopartiküllerin bitkilerde plazma membranlarını, memeli hücrelerine benzer şekilde endositik yollarla geçebildikleri tahmin edilmektedir (Etxeberria, Gonzalez, Baroja-Fernandez ve Romero, 2006). Demir oksit, aliminyum oksit ve seryum oksit gibi diğer bazı metal oksit nanopartiküllerinin de bazı in vivo ve in vitro çalışmalarda genetik değişiklikler oluşturdukları belirlenmiştir (Auffan ve diğerleri, 2009; Balasubramanyam ve diğerleri, 2009; Singh, Jenkins, Asadi, Doak, 2010). Bütün bu çalışmalar metal oksit nanopartiküllerinin genotoksik potansiyele sahip olduğunu göstermektedir. 2.7. Genotoksisiteyi Değerlendirmede Kullanılan Testler Çeşitli ekzojenlere maruz kalan canlılarda bazı toksik etkiler ortaya çıkmaktadır. Bu toksik etkilerin en önemlisi genetik materyalde oluşan değişikliklerdir. Genetik değişiklikler gametik hücrelerde meydana gelirse oluşan bu anormallikler direkt olarak yeni nesillere aktarılır. Genetik değişiklikler somatik hücrelerde gerçekleşirse, günümüzde kalp damar hastalıklarından sonra ikinci derecede ölüme sebebiyet veren kanser hastalığına sebep olmaktadır. Kanserli hücrelerde çok sayıda gende ve kromozomda mutasyonlar olduğu belirlenmiştir. Bu veriler, ekzojen bir maddenin genlerde ve/veya kromozomlarda mutasyon oluşturma potansiyeli ile kanser oluşturma potansiyeli arasında bir korelasyon olduğunu göstermektedir (Chandirasekar ve diğerleri, 2014; Madia, Phrakonkham, ve Corvi, 2014). Bu nedenle çeşitli ekzojen kimyasalların genetik materyalde hasar oluşturabilme risklerinin belirlenmesi amacıyla çeşitli testler geliştirilmiştir. Bu testler nanomateryallerin genotoksik risklerinin belirlenmesi amacı ile de kullanılmaktadır (Bolognesi, 2003; Garcia-Sagredo, 2008; Yüzbaşıoğlu, Zengin ve Ünal, 2014). Nanopartiküllerin genotoksik etkileri, in vitro ve in vivo olmak üzere iki farklı yolla incelenmektedir. In vitro modeller birincil genotoksisiteyi değerlendirmeye imkan tanırken, in vivo modeller ile birincil genotoksisteye ilave olarak, inflamasyon gibi ikincil 20 genotoksisite etkileri de değerlendirilebilmektedir (Dusinska ve Collins, 1996;.Kisin ve diğerleri, 2007; Vega-Villa ve diğerleri, 2008; Arora, ve diğerleri, 2012). Nanomateryallerin genotoksitesinin belirlenmesinde en sık kullanılan testlerden bazıları şunlardır: Ames testi (Bakteriyel geri mutasyon testi): Bu testte Salmonella typhimuriun bakterisinin histidin sentezleme yeteneğini kaybetmiş özel mutant suşları kullanılmaktadır. Söz konusu kimyasalın çeşitli konsatrasyonları ile belli sürelerde muamele edilen bu bakterilerden bazıları histidin sentezleme yeteneğini tekrar geri kazanırlar ve histidinsiz ortamlarda üreyebilirler. Üreyebilen bu kolonilerin yani geri mutasyon geçiren bakterilerin frekansı belirlenerek, incelenen kimyasalın mutajen olup olmadığı değerlendirilir. Ames testi, nanopartikülleri de kapsayan bir çok ekzojen maddenin mutajenitesini belirlemede kullanılan, kolay ve ucuz bir testtir (Ames, Mccann ve Yamasaki, 1975; Chen ve diğerleri, 2014; Li ve diğerleri, 2012; Mortelmans ve Zeiger, 2000;. Woodruff ve diğerleri, 2012). Kromozom anormalliği testi: Söz konusu kimyasalın etkisiyle kromozomlarda meydana gelen kırıkların tamir edilememesi sonucunda, hücrede çeşitli yapısal ve sayısal anormallikler oluşmaktadır. Test edilecek ekzojen maddeye maruz bırakılan çeşitli primer hücreler veya hücre hatları, metafaz safhasında durdurulur ve bu evrede kromozomlardaki anormallikler mikroskopla analiz edilir. Bunun için en sık kullanılan hücrelerden biri insan periferal lenfositleridir (Yılmaz S, Ünal, Yılmaz E, Yüzbaşıoğlu ve Erkal-İlhan 2014; Varshney, Chandra, Chauhan, ve Goel, 2014). Bu yöntem, oldukça zahmetli ve uzun zaman alıcı bir test olup, iyi bir sitogenetik deneyim gerektirmektedir (Aoshima, Yamana, Nakamura ve Mashino, 2010; Galloway ve diğerleri, 1987; Ginzkey ve diğerleri, 2014; Mosesso, Cinelli, Natarajan ve Palitti, 2013). Mikroçekirdek testi: Mikroçekirdekler, çekirdek bölünmesi sırasında oluşan, tüm bir kromozomdan ya da kromozom fragmanlarından köken alan ve ana çekirdeğe dahil olmayan küçük çekirdeklerdir. Bu testte bir aktin polimeraz inhibitörü olan sitokalasin B ile sitokinez durdurulur ve sonuçta bir hücre bölünmesi geçirmiş binükleat (iki çekirdekli) hücreler oluşur. Bu binükleat hücrelerde, uygulanan ekzojen maddenin etkisi ile oluşmuş mikroçekirdekler analiz edilir. Basit ve güvenilir bir yöntemdir. Mikroçekirdek frekansı ile kanser insidansı arasında bir korelasyon olduğu belirlenmiştir (Fenech ve diğerleri, 2011; 21 Ginzkey ve diğerleri, 2014; Jumagazieva ve diğerleri, 2011; Laingam, Froscio ve Humpage, 2008; Li ve diğerleri, 2012; Mosesso ve diğerleri, 2013; Shibai-Ogata ve diğerleri, 2014 ). Komet (tek hücreli jel elektroforezi) testi: Son yıllarda oldukça yaygın kullanılan genotoksisite testlerinden biridir. Bu testte mikroskop lamı üzerinde agaroza gömülen hücrelerdeki histonlar ve bazı hücre bileşenleri, yüksek tuz konsantrasyonu içeren bir deterjan ile temizlenir ve spesifik bir pH’da DNA sarmalı çözünerek elektroforez uygulanır. Takiben, preparatlara nötralizasyon uygulanır, DNA spesifik boyalarla (örneğin, etidyum bromür) boyanır ve sonunda bir floresan mikroskop ile incelenir. Muamele edilen ekzojen madde sonucu DNA’da hasar oluşmuşsa, çekirdekler mikroskopta kuyruklu yıldız görünümü oluşturur. Kuyruk momenti, kuyruktaki DNA yüzdesi ve kuyruk uzunluğu gibi parametreler kullanılarak DNA hasarı kantitatif olarak belirlenir. Bu teknik ile düşük seviyedeki hasarlar hızlı ve hassas bir şekilde tespit edilebilir. Bu test çok çeşitli doku ve hücre tiplerinde kullanılabilmektedir (Ginzkey ve diğerleri, 2014; Karlsson, 2010; Singh, McCoy, Tice ve Schneider, 1988; Woodruff ve diğerleri, 2012) Allium testi: Çevresel kirleticilerin genotoksik etkilerini değerlendirmede yüksek yapılı bitkiler de çokça kullanılmaktadır. Bitkilerin kullanılma amacı, sadece farklı çevrelerdeki mutajenlerin etkisine duyarlı olmalarından değil, aynı zamanda polen, kök, yaprak gibi farklı organlardaki kromozom anormalliklerini değerlendirme imkanı sağlamalarından da kaynaklanmaktadır. Genotoksik çalışmalarda en sık kullanılan bitki türleri Allium cepa, Vicia faba, Zea mays, Tradescantia, Nicotiana tabacum, Crepis capillaris, Hordeum vulgare’dir. Allium testi ile, mitotik indeks (Mİ), kromozom anormallikleri (KA), çekirdek anormallikleri (NA) ve mikroçekirdek (MN) gibi çeşitli parametreler aynı anda değerlendirilebilmektedir (Leme ve Marin-Morales, 2009; Michalska-Kacymirow, Kurek, Smolis, Wierzbicka ve Bulska, 2014). Allium cepa hücrelerinde mitotik indeksteki azalma ve artış, en çok kullanılan parametlerden biridir. Mİ’teki azalma, sitotoksisite belirteci olarak değerlendirilmektedir. Mİ’te gözlenen azalma, maruz kalınan ekzojen maddenin etkisiyle bitkide büyüme ve gelişmenin engellendiği sonucuna varılabilirken, Mİ’te gözlenen artış, düzensiz hücre bölünmeleri ve tümörlü bir doku anlamına gelmektedir (Fernandes, Mazzeo ve Marin- 22 Morales, 2007; Karaismailoglu, 2014; Konotop ve diğerleri, 2014; Paul, Nag, ve Sinha, 2013; Türkoğlu, 2012). Kromozomal anormallikler (KA), kromozom sayısı veya yapısındaki değişimler olup, spontan ya da maruz kalınan ekzojen maddenin etkisiyle oluşabilir. Yapısal kromozomal değişiklikler, DNA kırıkları, DNA sentezinin inhibisyonu ve DNA replikasyonundaki hatalar gibi birçok faktör tarafından indüklenebilir. Poliploidi gibi sayısal anormallikler ise anojenik ajanların mitotik iplikleri etkilemesi ve kromozomların düzensiz şekilde ayrılmasından kaynaklanır (Albertini ve diğerleri, 2000; Kaur, Singh, Batish ve Kohli, 2014; Türkoğlu, 2012). KA’lar hücre döngüsünün bütün fazlarında gözlenebilir. Bu nedenle değerlendirme yaparken bütün fazların göz önüne alınması daha sağlıklı sonuçlar vermektedir (Fiskesjo, 1985). Kromozom köprüleri, kromozom kırıkları, fragmentler klastojenik etkiyi gösterirken, kromozom kayıpları, yapışıklık, multipolarlık, C-metafaz ise anojenik etkiyi göstermektedir (Ateeq, Abul-Farah, Niamat-Ali ve Ahmad, 2002; Karaismailoglu, 2014; Kumari ve diğerleri, 2009, 2011). Nükleer anormallikler, maruz kalınan ajanın interfazdaki çekirdeklerde oluşturduğu morfolojik değişikliklerdir. Bu değişiklikler genellikle halter şekilli çekirdekler, nükleer tomurcuklanma taşıyan çekirdek, çok çekirdekli hücreler (binükleat gibi) ve mini hücreler gibi anormalliklerdir. Loblu çekirdekler ve çok çekirdekli hücreler, hücre ölüm sürecinin belirteçleridir. Nükleer tomurcuklar ise polipliodiden kaynaklanan genetik materyal fazlalığından oluşmaktadır (Arora, Singh, Srivastava ve Srivastava, 2014; Fernandes ve diğerleri, 2007; Leme, Angelis ve Marin-Morales, 2008; Tan ve diğerleri, 2014). Mikroçekirdekler, maruz kalınan ekzojen maddenin sebep olduğu hasarlar sonucu genetik materyalden ayrılan bütün kromozomlardan veya kromozom fragmentlerinden, yanlış tamir edilen veya tamir edilemeyen hasarlardan kaynaklanan, ana çekirdekten küçük çekirdeklerdir. Maruz kalınan ajanın anojenik veya klastojenik olmasına göre farklı yollarla oluşan anormallik tipidir. Anojenik etkiden oluşanlar daha büyük MN’ler oluştururken, klastojenik etkiden kaynaklananlar daha küçük yapılıdır (Fernandes ve diğerleri, 2007; Leme ve diğerleri, 2008; Pandey, Kumar, ve Roy, 2014; Pekol, 2014). 23 2.8. Bakır oksit (CuO) ve Silika (SiO2) Nanopartikülleri Bakır oksit nanopartikülleri, çok geniş uygulama alanı olan önemli nanopartikülerden biridir. Cam ve seramik sanayiinde, güneş enerjisi üretiminde, elektrik iletkenliğinde, termoelektrik ve algılama malzemelerinde, manyetik depolama ortamlarında, gaz sensörlerinde, roketlerde ve bazı teknik ürünlerde katalizör olarak kullanılmaktadır (Li ve diğerleri, 2008). Biyosidal madde olarak tekstilde (çoraplarda), yara bantlarında ve boyalarda tercih edilmektedir (Rubilar ve diğerleri, 2013). Anti mikrobiyal özelliklerinden dolayı mürekkeplere, plastiklere, madeni yağlara ve kozmetik ürünlerine katkı maddesi olarak eklenmektedir (Hanagata ve diğerleri, 2011). Antimikrobiyal ajan olarak kulanılan CuO nanopartikülleri, gümüş nanopartiküllerine kıyasla daha ucuzdur ve bakırın temel bir element olması nedeniyle biyomedikal uygulamalarda ve ayrıca sabun ve boyalarda daha fazla tercih edilmektedir. Çürümeyi önleme özelliklerinden dolayı tekne gövdelerini kaplamada da bu nanopartiküllerden faydalanılır (Jia, Mei, Cheng, Zhou, ve Zhang, 2012; Saison ve diğerleri, 2010). Tıpta, teşhis ve tedavi amacı ile yaygın bir şekilde kullanılmaya başlanmıştır (Ku ve diğerleri, 2012). CuO nanopartiküllerin farede, özellikle 23.5 nm boyutunun hedef organ olarak karaciğer, dalak ve böbrek dokularına ulaşabildikleri ve toksik etki oluşturdukları belirlenmiştir. Ayrıca birikimlerinin bazı hastalıklarla bağlantılı olduğu ifade edilmiştir (Chen ve diğerleri, 2006). Biriken bakır, oksidatif strese bağlı olarak hidroksil (OH) radikalleri oluşturabilen fenton tipi reaksiyonları katalize eder. Bu radikaller nükleik asit, membran lipitleri ve membran proteinleri gibi hücresel bileşenlere zarar verebilirler (Jomova, Baros ve Valko, 2012). Bakır canlı sistemlerinde geçiş metallerinden olan eser bir elementtir ve 30'dan fazla enzimin kofaktörüdür (Rana, 2008). Bu yüzden bakırın homeostazisteki dengesinin bozulması pek çok hastalıkla sonuçlanmaktadır. Bakır dengesinin bozulmasıyla insanlarda, kansere eğilim, hipertansiyon, Alzheimer ve Parkinson gibi nörodejeneratif rahatsızlıklar ortaya çıkmaktadır (Double, 2012; Hung, Bush ve La Fontaine, 2013). Diğer taraftan aşırı bakır birikimi ile Wilson hastalığı (Scheiber, Dringen ve Mercer, 2014) oluşmaktadır. Bakır, bitki büyüme ve gelişmesinde de hayati önemi olan bir mikro besindir. Fotosentezde elektron transferinde, mitokondriyal solunumda, hücre duvarı metabolizmasında, hormonal sinyalizasyonda, protein metabolizmasında ve demir mobilizasyonunda rol almaktadır 24 (Raven, Evans, ve Korb, 1999; Yruela, 2005, 2009). Fakat bakırın yüksek konsantrasyonları bitkide şiddetli toksik etkiyi uyararak; kloroz, nekroz, bodurluk ve kök gelişimi inhibisyonu oluşturduğu belirlenmiştir (Yruela, 2005; Xiong and Wang, 2005). CuO nanopartiküllerinin etkileri tam olarak bilinmemekle beraber, bitkilerde DNA lezyonları oluşturabileceği rapor edilmiştir (Atha ve diğerleri, 2012). DNA lezyonlarının bitkideki birikimi genomik kararsızlığa, bitki büyümesinde azalmaya ve bitki hastalıklarına yol açabilmektedir (Britt 1999). CuO nanopartiküllerinin küçük boyutlu ve geniş yüzey alanına sahip olmaları nedeniyle, bitkilerde, mikron boyutlu formlarından daha fazla birikebildiği, büyüme inhibisyonu oluşturduğu ve yapraklarda klorofil sayısında azalmaya sebep olduğu rapor edilmiştir (Kim ve diğerleri, 2012; Lee ve diğerleri, 2008; Shi ve diğerleri, 2011). Bakırın nanoformları, çeşitli organizmalarda farklı tipte toksik etkiler oluşturmaktadır (Bulcke, Thiel ve Dringen, 2014; Karlsson, Cronholm, Gustafsson ve Möller, 2009; Semisch, Ohle, Witt ve Hartwig, 2014). Örneğin, CuO nanopartiküllerinin teratojenik etkileri Fetaks testi ile değerlendirilmiş ve sonuçta bu nanopartiküllerin embriyoda teratojenik ve letal etkiler gösterdiği belirlenmiştir. CuO nanopartiküllerinin hedef organın bağırsaklar olduğu ifade edilmiştir (Bacchetta ve diğerleri, 2012). CuO nanopartiküllerinin mikro boyutlu CuO ile kıyaslandığı komet çalışmasında, nanopartiküllerin daha genotoksik olduğu gözlenmiştir (Karlsson ve diğerleri, 2009). CuO nanopartiküllerinin tekne gövdelerinin kaplanmasında kullanılması, sulardaki yoğunluğunu iyice artırarak sucul organizmalar üzerinde olumsuz etkilere de yol açar. Sucul bir organizma olan midyeler nano CuO'e 4 hafta boyunca maruz bırakılmış ve bakırın birikimi, kabuk gelişimi üzerine etkisi ve temizlenme oranı incelenmiştir. En yüksek konsantrasyonda (3 mg/L) kontrole kıyasla 60 kat daha fazla birikme, büyüme oranında % 68'lik ve temizlenme oranında % 48’lik bir azalma olduğu belirlenmiştir (Hanna, Miller ve Lenihan, 2014). CuO nanopartiküllerinden salınan bakır, çinko bağlayıcı proteinlere, genomik kararlılığı sağlayan bazı enzimlere, DNA hasarını belirleyen ve DNA tamirinde rol oynayan sinyalizasyon enzimlerine bağlanarak bu yapıların bozulmasına yol açmaktadır (Hartwig, 2013; Schwerdtle ve diğerleri, 2007). Silikon dioksit (özellikle amorf yapılı) nispeten düşük maliyetli, daha kolay üretildiği ve güvenilir bir madde olarak kabul edildiği için çok geniş kullanım alanı olan bir nanopartiküldür. Boyalarda, verniklerde, yapıştırıcılarda, kurutucularda, plastiklerde, diş macunlarında, ilaçlarda, gıda paketlemesinde, gıda filtrasyonunda, gıda katkı 25 maddelerinde, tıpta tanı ve tedavi yöntemlerinde, tarımda ve daha pek çok biyoteknolojik uygulamada geniş kullanım alanına sahiptir (Chang J, Chang K, Hwang ve Kong, 2007; Dekkers ve diğerleri 2011; FAO/WHO 2010; Ma, ve diğerleri, 2013). Silika nanopartiküllerinin düşük dozlarda toksik etkili olmadığı kabul edilmektedir. Ancak yüksek dozlarda olumsuz etkiler oluşturabildikleri belirlenmiştir. Silika nanopartiküllerinin fibroblastlarda oluşturduğu etkilerin değerlendirildiği bir çalışmada, yüksek dozlarda hücre canlılığını azalttığı belirlenmiştir. Laktat dehidrogenez testiyle (özellikle kalp ve karaciğer hastalıklarının tanısında kullanılan bir enzim testi olup, bu enzim hücre hasarının olduğu tüm durumlarda artış gösterir) yüksek dozlu silikanın hücrede membran hasarına yol açtığı gösterilmiştir. Bu iki test sonucuna göre, silikaya maruziyet fibroblastlarda hasara yatkınlığı artırmaktadır (Chang ve diğerleri, 2007). SiO2 nanopartiküllerinin hemolitik etkili oldukları ve özellikle inflamasyona sebep oldukları belirlenmiştir (Cho ve diğerleri, 2007). Silika nanopartiküllerinin fare ve makrofaj hücre hattına (RAW264.7) uygulanması sonucunda farede peritonal makrofajların aktive olduğu ve makrofajlardan salınan nitrik oksitlerin seviyesi ve inflamasyon yanıt göstergelerinin (TNF-α, IL-1 gibi) arttığı tespit edilmiştir. RAW264.7 hücre hattında ise ROT'lerinin oluştuğu ve nitrik oksit salınmasıyla hücre içi gulutatyon düzeyinin azaldığı belirlenmiştir. Kısaca silika nanopartikülleri hem in vivo hem de in vitro ortamlarda ROT'lerinin üretimine bağlı inflamasyon yanıtı oluşturmuştur (Park, E. J. ve Park, K. 2009). Amorf yapılı silika nanopartiküllerinin 0, 100, 200, 300, 400 and 500 μg/ml’lik konsantrasyonlarının etkileri sağlıklı insan akciğer hücre hattında (L-132) incelenmiş ve bu nanopartiküllerin konsantrasyona bağlı olarak hücre canlılığını azalttığı, antioksidan enzim aktivitesini azaltarak ROT'lerini artırdığı, iflamasyon belirteci olan interlökin-8 ve siklooksijenaz-2 ekspresyonunu artırdığı ve L-132 hücrelerinde DNA hasarına sebep oldukları belirlenmiştir (Sahu, Vijayaraghavan ve Kannan, 2014 ). Nanopartiküllerin etkisinde rol oynayan parametrelerden biri de yüzey alanlarıdır. Amorf silika nanopartiküllerinin endotelyal hücre kültürlerinde 14, 15 ve16 nm boyutlarının (3347 µg/cm2), 19 nm’lik partiküllerin (89 µg/cm2) ve 60 nm’lik partiküllerin (254 µg/cm2) uygulaması sonucunda, büyük nanopartiküllerin sitotoksik etkilerinin çok yavaş olduğu fakat küçük nanopartiküllerin bir kaç saat içinde nekroz yoluyla hücre ölümüne sebep oldukları gözlenmiştir (Napierska ve diğerleri, 2009). Silika nanopartikülleri, bulundukları hücre ortamına göre de faklı etki göstermektedir. Aynı özelliklerdeki silika 26 nanopartiküllerinin insan akciğer hücre hattı, endotel hücre hattı ve makrofaj-nötrofil hücre hattındaki etkileri aynı koşullarda olacak şekilde incelenmiştir. Bu 3 hücre hattında da sitotoksik etki oluştuğu ve oluşan bu cevabın nanopartikülün kütle/boyut/yüzey alanına ve konsantrasyona bağlı olduğu vurgulanmıştır (Lison ve diğerleri, 2008). Silikanın 15 nm ve 30 nm boyutlarının epidermal keratinosit hücre hattında (HaCaT), hücre canlılığı, hücre döngüsü, apoptozis ve protein ekspresyonlarını nasıl etkiledikleri değerlendirilmiştir. Hücre canlılığı doza bağlı bir azalış göstermiştir. Bu azalışın partikül boyutunun azalmasıyla ilişkili olabileceği düşünülmektedir. Apoptozis doza bağlı indüklenmiştir. Proteomik analizi ile oksidatif stres ve hücre iskeletiyle ilgili proteinlerin, moleküler şaperonların, apoptozis ve tümör-ilişkili proteinlerin ekspres edildiği ve bunların nanopartikül boyutuyla ilişkili olduğu rapor edilmiştir. (Yang ve diğerleri, 2010). Füme silika (toz halinde, amorf silikanın oldukça düşük kütle yoğunluklu ve yüksek yüzey alanlı bir türevi) ve porlu silikanın karşılaştırmalı etkileri, insan bronşiyal epitel hücre hatlarında değerlendirilmiştir. Bu hücre hatlarında silika nanopartiküllerinin oksadatif stres oluşturabildikleri, porlu silikaya maruz kalan hücrelerin, füme silikaya maruz kalanlardan daha fazla etkilendikleri belirlenmiştir (Eom ve Choi, 2009). Metal oksitlerden olan SiO2 nanopartikülleri özellikle karaciğer ve dalakta birikebilmektedir (Park E J ve Park K, 2009). Ticari olarak yaygın kullanılan bu NP’ler, in vitro genotoksik etkilerin araştırılmasında da oldukça çok kullanılan nanopartiküllerdendir. Yapılan çalımalarda, hem boyutuna göre ve hem de faklı hücre tiplerine göre, bu nanopartiküllerin farklı etkiler gösterdiği belirlenmiştir. Hatta, aynı nanopartikülün aynı hücre hattında faklı araştırıcılar tarafından yapılan çalışmalarda dahi farklı sonuçlar ortaya çıktığı gözlenmiştir Örneğin silika nanopartiküllerinin 3T3 fare fibroblastlarında genotoksisite oluşturmadığı bildirilmiştir (Barnes ve diğerleri, 2008). Fakat daha sonra aynı hücrelerde yapılmış başka bir çalışmada, pozitif genetik cevap oluşturabildiği rapor edilmiştir (Park ve diğerleri, 2011). Benzer bir çelişki A549 akciğer kanser hücre hatlarında da görülmüştür (Gonzalez ve diğerleri, 2010; Jin, Kannan, Wu ve Zhao, 2007). Ancak bu farklılığın kullanılan genotoksisite testinden de kaynaklanabileceği belirtilmiştir (Barnes ve diğerleri, 2008; Jin ve diğerleri, 2007). Farelerde silika nanopartiküllerinin 70 nm boyutunun karaciğer hasarı oluşturduğu, fakat makro boyutlu silikanın 300 nm hatta 1000 nm'lik uygulamalarının bir etkisinin olmadığı belirlenmiştir (Nishimori ve diğerleri, 2009). Silika nanopartiküllerinin hücre kültür ortamlarında çok hızlı aglomere olmalarına rağmen, küçük boyutlu nanopartiküllerin büyük olanlardan daha toksik oldukları 27 belirlenmiştir (Napierska ve diğerleri, 2009). Tıpta kullanılan silika nanopartiküllerinin ilaçların yan etkilerine sinerjik etkilerini araştırmak amacıyla 70 nm silika nanopartikülleri, inflamatuar bağırsak hastalığında kullanılan 5-aminosalisilik asit, antibiyotik etkisi için kullanılan tetrasiklin, ateş düşürücü olarak kullanılan asetaminofen ve antidepresan etkili trazodon ile birlikte farelere verilmiştir. Trazodon ile eş zamanlı uygulanan silika nanopartiküllerinin karaciğerdeki hasarı gösteren biyokimyasal belirteçlerde artış yapmadığı, fakat diğer ilaçların hepatoksisitesinde artış oluşturdukları, silika-tetrasiklin eş muamelesinin ise letal etkili olduğu belirlenmiştir (Lia ve diğerleri, 2011). Silikon, birçok bitki türünün büyümesinde, verimliliğinde ve biyotik/abiyotik direnci sağlamada çeşitli etkileri olan bir elementtir (Ma ve Yamaji, 2006; Pilon-Smits, Quinn, Tapken, Malagoli ve Schiavon, 2009). Silikon çok önemli bir fizikomekanik bariyer olup epidermisin duvarlarında ve özellikle tek çeneklilerde kök, gövde ve yaprak kılıflarının vasküler dokuları üzerinde birikmektedir (Ma ve Yamaji, 2006). Ayrıca bitkilerde fizyolojik faaliyetleri düzenlemede de rolü vardır (Bao-shan, Chun-hui, Li-jun, Shu-chun ve Min, 2004). Silikon elementinin stres koşulları altında bitki büyüme ve gelişmesini düzenleyici etkisi olduğu bilinmektedir (Liang, Sun, Zhu ve Christie, 2007). Bakır nanopartiküllerinde olduğu gibi, silikon dioksit nanopartiküllerinden gelen silikonun artmasıyla ne tür etkiler oluşturabileceği henüz bilinmemektedir. Bu nanopartiküllerin memeli hücre hatlarında ve in vivo koşullarda bazı toksik etkiler oluşturabildiklerine dair yukarıda birkaç örnek verilmiştir. Ancak, SiO2 nanopartiküllerinin bitkilerde toksik ve genotoksik etkileri konusunda her hangi bir çalışmaya rastlanmamıştır. Yukarıdaki kısaca özetlendiği gibi, nanopartiküller, son yıllarda bir çok nanoteknolojik üründe yaygın bir şekilde kullanılmaktadır. Bu nedenle insanlar, bu nanopartiküllere hem üretim ve hem de kullanımları sırasında maruz kalmaya başlamıştır. Diğer taraftan bu ürünler hem üretimleri sırasında ve hem de kullanımdan sonra doğaya atılmakta ve böylece dünyadaki tüm canlıların bu nanopartiküllerle teması zorunlu hale gelmektedir. En önemlisi ise, yapılan bir çok çalışmada nanopartiküllerin çok çeşitli hücrelerde ve canlılarda genotoksik riskler oluşturduğu belirlenmiştir. Bu çalışma, bütün bu anlatılanlar dikkate alınarak, insan yaşamında oldukça yaygın kullanım alanı bulmaya başlayan CuO ve SiO2 nanopartiküllerinin genotoksik etkilerini Allium cepa da incelemek amacıyla planlanmıştır. Allium cepa, ekzojen kimyasalların genotoksik risklerinin belirlenmesinde yaygın şekilde kullanılan bir bitkidir. Hem bir test materyali olması, hem ökaryotik bir 28 organizma olması, hem bundaki bazı enzim sistemlerinin memelilerde de bulunması, hem kromozom sayısının az ve hem de oldukça büyük olması ve en önemlisi de doğadaki atıkların toprak ve su yoluyla bitkiler tarafından alındığını düşündüğümüzde, Allium cepa bu çalışma için en ideal organizma olduğu için tercih edilmiştir. 29 3. MATERYAL VE METOT 3.1. Materyal 3.1.1. Bitki materyali Bu çalışmada canlı materyal olarak Allium cepa L. (mutfak soğanı) kullanılmıştır. Bu türde kromozom sayısının az (2n=16) ve kromozomların büyük olması mikroskobik gözlemlerde avantaj sağlamaktadır. Ucuz ve kolay elde edilebilir olması ve kolay çimlenmesi gibi diğer bazı avantajları da dikkate alındığında, genotoksisite çalışmalarında çokça tercih edilen bir organizmadır (Fiskesjo, 1985). Bütün bu sebeplerden dolayı, bu çalışmada da sitotoksik ve genotoksik risk değerlendirmesinde mükemmel bir biyoindikatör olan Allium cepa bitkisi tercih edilmiştir. 3.1.2. Kullanılan test materyalleri ve diğer kimyasallar Bakır oksit nanopartikülleri (CuO NP) Bu çalışmada kullanılan CuONP’leri (CuO nanopowder) Sigma-Aldrich’den (CAS-No: 1317-38-0) temin edilmiştir. Siyah renkli ve toz halinde olan bu partikülün boyutu <50 nm, yüzey alanı 29 m2/g, molekül ağırlığı: 79,54 g/mol, erime noktası 1.336°C’dir. Silika (Silikon dioksit) nanopartikülleri (SiO2NP) SiO2 NP’leri (Silica nanopowder) ortalama 12 nm olup, Sigma-Aldrich’den (CAS-No: 7631-86-9) temin edilmiştir. Toz halinde olan bu partikülün yoğunluğu 2.6 g/cm 3, molekül ağırlığı ise 60.09 g/mol’dür. Kullanılan diğer kimyasallardan bazik fuksin (CAS-No: 632-99-5) Carlo Erba’dan, potasyum metabisülfit (CAS-No: 16731-55-8) ve hidrojen peroksit (CAS-No:7722-84-1) Applichem’den, etanol (asbolu etanol) (CAS-No: 64-17-5) Sigma-Aldrich’ten; hidroklorik asit, glasial (asetik asit) asit, entellan ve charcoal Merck’ten temin edilmiştir. Monobazik sodyum fosfat, dibazik sodyum fosfat, gluteraldehit (CAS-No: 111-30-8), metilen boyası, 30 propilen oksit Fluka’dan, araldit Serva’dan, ozmiyum tetroksit (OsO4) ve DMP-30 (2,4,6 Tri Dimethylaminoethyl phenol) Electron Microscopy Science’tan, dibütil fitalat Agar Scientific’ten temin edilmiştir. 3.2. Metot 3.2.1. Test materyallerinin hazırlanması CuO NP’lerinin hazırlanması CuO NP’lerinin, deiyonize suda 100 µg/ml olacak şekilde hazırlanan stok süspansiyonu, ultrasonik banyoda (J.P. Selecta, v:50-60 Hz) 30 dakika sonike edilmiştir. Bu stok süspansiyon, deiyonize su ile 25, 50 ve 75 µg/ml’lik konsantrasyonlara seyreltilmiş ve takiben tüm süspansiyonlar 10 dk ekstra sonikasyona tabi tutulmuştur. Hazırlanan konsantrasyonların pH’ları ölçülerek, daha önceden kurulan deney düzeneğindeki tüplere ilave edilmeden önce 5 dakika vortekslenmiştir. Bu çalışmada, CuO NP’lerinin, 25, 50, 75 ve 100 µg/ml’lik konsantrasyonları, aynı laboratuvarda, daha önce Saygılı (Saygılı, 2014) tarafından, insan lenfositlerinde kullanılan konsantrasyonlar olmaları nedeniyle tercih edilmiştir. SiO2 NP’lerinin hazırlanması CuO NP’lerinde olduğu gibi, konsantrasyon seçiminde, yine Saygılı (Saygılı, 2014) tarafından insan lenfositlerinde kullanılan konsantrasyonlar tercih edilmiştir. 4 farklı konsantrasyon kullanılmış olup bunlar 50, 250, 500 ve 1000 µg/ml’dir. Stok olarak SiO2 NP’lerinin 1000 µg/ml’lik konsantrasyonu deiyonize suda süspanse edilmiş ve ultrasonik banyoda 30 dakika sonikasyon uygulanmıştır. Daha sonra ana stok gerekli oranlarda seyreltilerek diğer konsantrasyonlar elde edilmiştir. Tüm süspansiyonlar 10 dk daha sonike edilmiştir. Yine önceki uygulamada olduğu gibi, tüplere ilave edilmeden önce pH’ları ölçülen süspansiyonlar, 5 dakika vortekslenmiştir. Her iki uygulamada da, kontrol olarak musluk suyu (pH ~7.5) ve pozitif kontrol olarak 0.3 M hidrojen peroksit (H2O2) kullanılmıştır 31 3.2.2. Test materyallerinin Allium cepa’ya uygulanması Nanomateryaller ile muamele edilecek 2,6-6 gram ağırlığındaki ve 12-15 mm çapındaki soğanların dış kabukları ve kurumuş kökleri temizlenerek, musluk suyu içeren tüplerde, kök uzunluğu 2-3 cm olana kadar (2 gün) çimlendirilmiştir (Kumari ve diğerleri, 2011). Çimlenen soğanlar, CuO NP’lerinin 25, 50, 75 ve 100 µg/ml’lik, SiO2 NP’lerinin 50, 250, 500 ve 1000 µg/ml’lik konsantrasyonları ile, 24, 48 ve 72 saat boyunca oda sıcaklığında muamele edilmiştir. Her iki uygulamada da, negatif ve pozitif kontrol (0.3M H2O2) bulundurulmuştur. Tüplerdeki süspansiyonların buharlaşması ve azalması nedeniyle, her gün, sabah ve akşam eksilen miktarlar tamamlanmış ve nanopartiküllerin dağılmasını sağlamak amacı ile pipetaj yapılmıştır. Kurulan test düzeneği güneş ışığına doğrudan maruz kalmayacak şekilde konumlandırılmıştır. Her bir konsantrasyon ve kontrol grupları için toplam 7 soğan kullanılmıştır. Bunların 5 tanesinden 24., 48. ve 72. saatlerde kök uçları alınmıştır. Soğanlardan 2 tanesi, genel görünümün takip edilmesi için ayrılmış ve bunlardan kök ucu alınmamıştır. Bu soğanlardan hazırlanan düzenekler Resim 3.1 ve Resim 3.2’de gösterilmiştir. Resim 3.1. CuO nanopartiküllerinin Allium cepa’ya uygulanması 32 Resim 3.2. SiO2 nanopartiküllerinin Allium cepa’ya uygulanması Allium testinde kullanılmak üzere, her bir konsantrasyon ve muamele süresi sonunda, her soğandan 4-5 tane olmak üzere, rastgele seçilen toplam 15-20 adet kök ucu, 3:1 absolu alkol/glasiyal asetik asit karışımı içeren tüplere konularak buz dolabında bir gece bekletilmiştir. Tespit edilen kökler daha sonra %70’lik alkol karışımında kullanılana kadar muhafaza edilmiştir. Elektron mikroskobu incelemelerinde kullanılacak kökler de, rastgele seçilen 2 soğandan yukarıdakine benzer şekilde alınmış, fosfat tamponu (pH 7,2) içinde yıkanmış ve %2,5’luk gluteraldehit (pH 7,2) içeren farklı tüplerde buzdolabında saklanmıştır. 3.3. Preparatların hazırlanması 3.3.1. Işık mikroskobu Allium testi ile mitotik indeks, faz frekansları ve kromozomal anormalliklerin tipleri ve frekanslarının belirlenmesi için Allium cepa kök uçlarından preparatlar hazırlanmıştır (Fiskesjo, 1985). Bu amaçla, her bir konsantrasyonun her bir uygulama süresi için, 5 farklı kök ucu, 1N HCl içinde 12 dakika hidroliz edilmiştir. Kök uçları oda sıcaklığında Feulgende 1 saat boyanmıştır. Köklerin koyu boyanan yaklaşık 2 mm’lik uç kısımları lam üzerine alınarak %45’lik asetik asitte pirinç çubuk yardımıyla ezilmiş ve üzeri lamelle kapatılarak ezme preparatlar hazırlanmıştır. Bu preparatlar sıvı azotta dondurularak, lam ve lamel birbirinden ayrılmıştır. Bir gece oda sıcaklığında kurutulan lamların üzerine entellan 33 damlatılıp lamelle kapatılarak devamlı preparatlar elde edilmiştir (Rank ve Nielsen, 1993; Yüzbaşıoğlu, Ünal ve Sancak, 2009). Nanopartiküllerin uygulama ve kontrol gruplarında, her bir konsantrasyon ve uygulama süresi için hazırlanan her bir preparatta 1000 hücre olmak üzere toplam 5000 hücre incelenmiştir. Bu hücreler içinde bölünmekte olan hücreler tespit edilmiştir. Bölünen bu hücrelerin mitoz bölünmedeki fazları ve varsa anormallikleri tespit edilmiş ve kaydedilmiştir. Bölünmekte olan hücrelerin, incelenen tüm hücreler içindeki frekansından yararlanarak mitotik indeks elde edilmiş ve mitozun her bir safhasındaki hücrelerin frekansları belirlenmiştir. Ayrıca, bölünen hücrelerdeki anormallik frekansı ve hücre başına düşen anormallik sayısı belirlenmiştir. Uygulama ve kontrol gruplarında, Mİ bakımından farklılık olup olmadığı z-testi ile, kromozomal anormalliklerin frekansı χ2testi (Nielsen ve Rank, 1994) ile değerlendirilmiştir. İncelemeler Leica DMLB2 mikroskopta X1000 büyütmede yapılmış ve fotoğraflar Leica DFC320 kamera ile çekilmiştir. 3.3.2. Elektron mikroskobu Kök uçları gluteraldehitten çıkarılarak fosfat tamponunda 2-3 defa 5’er dakika yıkanmış ve takiben ikinci tespit için % 2’lik Ozmiyum tetroksit (OsO4) (pH 7,2, fosfat tampolu) ile 6 saat oda sıcaklığında bekletilmiştir. Tespitten çıkarılan kökler fosfat tamponunda 3 kez 15 dk yıkanmıştır. Yükselen etil alkol serilerinden 10’ar dk arayla geçirilerek dehidrasyon uygulanan kök uçları %100 etil alkolde yapılan iki değiştirmeden sonra propilen oksit içine alınmıştır. Propilen oksitte 30 dk bekletilen kök uçları daha sonra 1:3 ve 1:1 araldit:propilen oksit serilerinde 3’er saat, sonra 3:1 araldit:propilen oksitte 1 gece bekletilmiş ve en sonunda saf araldit içine gömülmüştür. Kök uçlarının gömüldüğü kalıplar, polimerizasyon amacıyla 60◦C'lik etüvde 1 gece bekletilmiştir. Kalıplardan çıkarılan örneklerden Leica Ultramikrotomda yarı ince ve ultra ince kesitler hazırlanmıştır. Yarı ince kesitler, Toluidin mavisi-Bazik fuksin ile boyanmıştır. Hazırlanan ultra ince kesitler gridin üstüne alınarak oda sıcaklığında kurutulduktan sonra incelenmiştir (Wierzbicka, 1998). İnce kesitlerden sadece birkaç örnek genel yapıyı görmek amacıyla ağır metal tuzları (Reynold’s Kurşun sitrat ve Uranil asetat) ile boyanmıştır. Yarı ince kesitler ışık mikroskobuyla incelenmiş ve fotoğrafları çekilmiştir. İnce kesitler 34 boyanmadan Jeol JEM 1400 Geçirimli Elektron Mikroskop (Transmission Electron Microscope-TEM) ile 80-100 kV de incelenmiştir. Görüntüler dijital ortamda alınmıştır. 35 4. ARAŞTIRMA BULGULARI 4.1. CuO Nanopartiküllerinin Allium cepa’daki Etkileri Mitotik indeks ve faz frekansları: CuO nanopartiküllerinin 25, 50, 75 ve 100 µg/ml’lik konsantrasyonlarına, 24, 48 ve 72 maruz bırakılan Allium cepa kök ucu hücrelerinde mitotik fazların frekansı ve mitotik indeks Çizelge 4.1’de, gözlenen anormallikler ve bunların frekansları da Çizelge 4.2'de gösterilmiştir. Çizelge 4.1. Bakır oksit nanopartiküllerinin Allium cepa da mitotik fazların frekansı ve mitotik indeks (Mİ) üzerine etkisi İncelenen Hücre Sayısı Bölünen Hücre Sayısı Profaz (%) Metefaz (%) Anafaz (%) Telofaz (%) Mİ %±SE 24h Kontrol Pozitif Kontrol 25 50 75 100 5000 5000 5000 5000 5000 5000 314 79 196 243 86 67 2,50 0,86 1,50 2,42 0,90 0,48 1,46 0,62 1,00 1,04 0,62 0,64 0,38 0,00 0,46 0,32 0,08 0,02 1,94 0,01 0,96 1,08 0,12 0,20 6,28±0,34 1,58±0,18*** 3,92±0,27*** 4,86±0,30** 48h Kontrol Pozitif Kontrol 25 50 75 100 5000 5000 5000 5000 5000 5000 379 90 311 285 240 96 3,22 1,08 2,42 2,82 1,96 1,08 1,76 0,66 1,84 1,36 2,14 0,38 0,88 0,06 0,80 0,48 0,32 0,10 1,72 0 1,16 1,04 0,38 0,36 7,58±0,37 1,80±0,19*** 6,22±0,34** 5,70±0,33*** 4,80±0,30*** 1,92±0,19*** 72h Kontrol Pozitif Kontrol 25 50 75 100 5000 5000 5000 5000 5000 5000 370 75 319 276 217 88 3,08 0,76 2,54 2,36 1,78 0,72 1,84 0,56 2,02 1,60 1,28 0,56 0,80 0 0,68 0,46 0,46 0,14 1,68 0,18 1,08 1,10 0,82 0,34 7,40±0,37 1,50±0,17*** 6,38±0,35* 5,52±0,32*** 4,34±0,29*** 1,76±0,19*** Konsantrasyon (µg\µl) 1,72±0,18*** 1,34±0,16*** * P < 0.05 (z test), ** P < 0.01 (z test), ***P < 0.001 (z test) CuO nanopartiküllerinin 24 saatlik uygulamasında, mitozun farklı evrelerinin (profaz, metafaz, anafaz ve telofaz) frekansında kontrole göre düşüşler olduğu belirlenmiştir. Bu düşüş 100 µg\µl’de kontrole kıyasla profazda yaklaşık olarak 1/5’e, metafazda 1/2’ye, anafazda 1/19’a, telofazda 1/10’a kadar inmiştir. 48 saatlik uygulamada bütün konsantrasyonların kontrole kıyasla profaz, anafaz ve telofaz frekanslarında azalmaya, metafaz frekansında ise özellikle 25 ve 75 µg\µl’lik konsantrasyonların artışa sebep olduğu, 100 µg\µl’lik konsantrasyonun ise 1/5 oranında düştüğü gözlenmiştir. 72 saatlik uygulamada, sadece 25 µg\µl’lik konsantrasyonun metafaz frekansında artışa sebep 36 olduğu, diğer tüm konsantrasyonların faz frekanslarını kontrole kıyasla azalttığı belirlenmiştir. CuO nanopartiküllerinin bütün konsantrasyonları ve uygulama süreleri Allium cepa’da mitotik indeksi kontrole göre anlamlı düzeyde düşürmüştür. Bu düşüş 48 ve 72 saatlik uygulamada doz artışına bağlı olarak gerçekleşmiştir. Kromozomal anormallikler: CuO nanopartiküllerinin 25, 50, 75 ve 100 µg\µl’lik konsantrasyonlarının Allium cepa kök ucu hücrelerinde 24, 48 ve 72 saat uygulaması sonucunda mitoz bölünmenin değişik fazlarında meydana getirdiği anormallikler, bunların frekansları, hücre başına düşen kromozom anormalliği sayısı (KA/Hücre) ve interfazdaki anormalliklerin frekansı Çizelge 4.2’de gösterilmiştir. CuO nanopartiküllerinin bütün konsantrasyonları, bütün uygulama sürelerinde kromozomal anormalliklerin frekansını kontrole göre anlamlı düzeyde artırmıştır (Şekil 4.1’de). CuO nanopartiküllerinin 24 saatlik muamelede oluşturduğu anormallik frekansları kontrole kıyasla 25 ve 50 µg\µl’lik konsantrasyonlarda yaklaşık 3 katı kadar artış gösterirken, 75 µg\µl’lik konsantrasyonda bu frekans 8 katına kadar yükselmiştir. 100 µg\µl’lik konsantrasyonda ise yaklaşık 6 kata varan düzeylerde artış göstermiştir. 48 saatlik muamele süresi sonunda, kontrole kıyasla, 25 ve 50 µg\µl’lik konsantrasyonlarda 2 katı kadar, 100 µg\µl’lik konsantrasyonda 3 katı kadar, 75 µg\µl’lik konsantrasyonda ise 7 katından daha fazla düzeyde kromozom anormalliği olduğu belirlenmiştir. CuO nanopartiküllerinin 24 ve 48 saatlik uygulamalar sonucunda en yüksek anormallik frekansı ve hücre başına düşen anormallik sayısının 75 µg\µl’lik konsantrasyonda olduğu gözlenmiştir. CuO nanopartiküllerinin 72 saatlik muamelesinde ise 25 ve 50 µg\µl’lik konsantrasyonların, kontrole kıyasla yaklaşık 3 katı kadar, 75 µg\µl’lik konsantrasyonun 2 katından daha fazla ve 100 µg\µl’lik konsantrasyonun ise 4 katından daha fazla etkili oldukları belirlenmiştir. Bu uygulamada KA/Hücre konsantrasyonda en yüksek düzeyde olduğu tespit edilmiştir. sayısının 100 µg\µl’lik 37 90 80 70 Frekans 60 50 24 40 48 30 72 20 10 0 Kontrol Kontrol H2O2 H2O2 2525 50 50 75 75 100 µg/m 100 Konsantrasyon (µg/ml) Şekil 4.1. CuO nanopartiküllerinin Allium cepa da anormallik frekansı üzerine etkisi CuO nanopartikülleri, profazda, sayılarına göre sırasıyla yapışıklık, yapısal bozulmalar ve genetik materyal kaybına sebep olmuştur (Resim 4.1). Metafazda en fazla anormallik Cmetafazda gözlenmiştir. Gözlenen diğer anormallikler ise miktarlarına göre sırasıyla, yapışıklık, kromozom gruplaşması, geri kalmış kromozom, yapısal olarak düzensiz metafazdır. Diğer olarak adlandırılan gruptaki hücrelerde birden fazla sayıda anormallik bulunmaktadır ve metafazda yapışıklık ve fragmentin bir arada olduğu hücreleri ifade etmektedir (Resim 4.2). Anafaz-telofazda en fazla gözlenen anormallik ileri gitmedir. Diğer anormallikler ise miktarlarına göre sırasıyla yapısal bozukluğu olan anafaz-telofaz, kutupsal sapma, köprü, yapışıklık, diğer anormallikler (köprü+yapışıklık, geri kalmış kromozom+ileri gitme, ileri gitme+kutupsal sapma), asenkron bölünme, star anafaz-geri kalmış kromozom, fragment-multipolarlık olarak belirlenmiştir (Resim 4.3). İnterfazdaki anormal hücre frekansları da, bazı uygulamalarda kontrole kıyasla artış göstermiştir. 24 saatlik uygulamada sırasıyla en yüksek 25, 75, 100 µg\µl konsantrasyonda gözlenmiştir. 50 µg\µl’de ise kontrolden daha az düzeydedir. 48 saatlik muamelede interfazdaki anormal hücre frekansları 75 ve 100 µg\µl’de kontroldeki ile aynı düzeyde olup %0.04’tür. 25 ve 50 µg\µl’lik konsantrasyonlarda ise sırasıyla % 0.13 ve % 0.12’dir. 72 saatlik uygulamada ise interfazdaki anormal hücre frekansı 75 µg\µl’lik konsantrasyonda en yüksek olup, %0.10’dur. En düşük frekans 100 µg/ml’de olup %0,04’tür. Diğerlerinde bu ikisi arasındadır. Ancak bu frekansların hiç biri kontrole göre anlamlı değildir. İnterfazda binükleat hücreler (28 hücrede), mikroçekirdekler (20 hücrede) 38 ve tomurcuklanma (1 hücrede) gözlenmiştir. En yüksek konsantrasyonda bunların dışında halter şekilli hücre (2 hücre) bulunmuştur (Resim 4.4). TEM analizi: CuO nanopartiküllerinin 25 µg/ml ve 100 µg/ml’lik konsantrasyonlarının 24, 48 ve 72 saatlik muamelelerinden sonra Allium cepa dan elde edilen kök uçlarında yapılan TEM analizlerine ait seçilen bazı görüntüler Resim 4.5-Resim 4.15’de verilmiştir. Bu analizlerde, nanopartikülleri kurşun sitrat ve uranil asetat gibi ağır metal tuzlarından ayırt edebilmek amacıyla ince kesitler boyanmamıştır. İncelemelerde, CuO nanopartiküllerinin her hücre duvarlarında biriktiği ve sitoplazmaya geçiş yaptığı belirlenmiştir. Sitoplazmada nanopartiküllerin tutundukları bazı yapılar veya organeller net seçilememiştir. Ancak, nanopartiküllerin golgi kompleklerine, mitokondrilere ve granüllü endoplazmik retikulumlara ve hatta vakuollere penetre olabildikleri belirlenmiştir. Sitoplazmadaki bazı nanopartiküllerin komşu hücreler arasında plazmodezmalar vasıtasıyla geçiş yaptıkları da net bir şekilde gözlenmiştir. Nanopartiküllerin çekirdeğe de geçiş yapabildikleri, genellikle kromatinlere tutunmuş halde bulundukları, özellikle heterokromatin bölgelerinde yoğunlaştıkları belirlenmiştir. Bu gözlemler tüm uygulama sürelerinde elde edilmiştir. 24 saatlik muamelede NP yoğunluğunun daha seyrek olduğu, 48 ve 72 saatlik uygulamalarda özellikle çekirdeğe, partiküllerin daha yoğun olarak geçiş yaptığı gözlenmiştir. 100 µg/ml’lik konsantrasyonun 72 saatlik muamelesinde partikül yoğunluğuna bağlı olarak hücre bütünlüğünde bozulmalar olduğu ve vakuollerin içinde, nanopartikülün etkisine bağlı olarak lifli bir oluşum gözlenmiştir. 2 - 7 Kontrol Pozitif Kontrol 25 50 75 100 Kontrol Pozitif Kontrol 25 50 75 100 Kontrol Pozitif Kontrol 25 50 75 100 Toplam 24 48 72 20 8 2 2 - 14 1 2 3 4 8 7 3 - Yapışıklık *P < 0,01 (χ2 test), **P < 0,001 (χ2 test) 1 2 1 1 CuO Konsantrasyon (μg/ml) Genetik materyal Kaybı Süre (saat) Yapısı bozulmuş profaz 16 7 1 1 3 1 1 1 1 1 1 C-metafaz 120 21 2 1 3 - 1 22 2 7 72 1 1 24 1 1 22 8 Yapışıklık 46 3 2 12 5 3 4 2 5 7 3 2 2 4 3 5 2 Kromozom gruplaşması 8 - 4 1 1 - 1 1 14 4 1 1 1 2 2 2 2 Geri kalmış kromozom Gözlenen Anormallikler Yapısı bozulmuş metafaz 10 2 2 - 3 3 - Diğer 2 2 1 - - 1 - İleri gitme 102 6 2 10 25 12 8 4 6 9 10 4 3 2 7 8 1 2 Yapısı bozulmuş Anafaz-Telofaz 54 8 2 8 5 4 - 18 1 9 11 3 2 7 1 6 4 1 1 Multipolarite 2 - 1 - 1 - Köprü 10 1 1 - 2 1 - 3 1 1 - 3 2 - - 1 - 11 2 - 1 1 2 2 - 1 3 - Star anafaz 3 - 1 - 2 - Anafaz-Telofaz Geri kalmış kromozom Metafaz Kutupsal sapma Profaz 5 3 - 1 1 - - Asenkron bölünme Çizelge 4.2. Bakır oksit nanopartiküllerinin Allium cepa’da kromozomal anormallikler üzerine etkisi Fragment 2 2 - - - Yapışıklık 8 1 2 - 2 1 2 1 Diğer 7 1 - 1 1 1 1 2 1 - 4,59 56,67** 16,30** 15,94** 12,44** 18,18* 6,60 51,11** 12,22* 12,98** 38,75** 19,79** 5,41 81,90** 16,33** 14,81** 40,70** 28,36** Anormal Hücre (%) 0,05 0,52 0,17 0,17 0,13 0,18 0,07 0,51 0,13 0,13 0,40 0,21 0,05 0,53 0,17 0,16 0,43 0,28 KA/ Hüc re 0,02 0,08 0,09 0,08 0,10 0,04 0,04 0,02 0,13 0,11 0,04 0,04 Anormal İnterfaz Hücre (%) 0,11 0,12 0,21 0,04 0,10 0,08 39 39 40 A B C D Resim 4.1. CuO nanopartiküllerinin Allium cepa da profazda meydana getirdiği anormallikler. A: Normal profaz, B: Yapısı bozulmuş profaz, C: Genetik materyal kaybı, D: Yapışıklık A B C D Resim 4.2. CuO nanopartiküllerinin Allium cepa da metafazda meydana getirdiği anormallikler. A: Normal metafaz, B-C: Metafazda kromozom gruplaşmaları, D: Yapısı bozulmuş metafaz 41 E F G H Resim 4.2. (devam) CuO nanopartiküllerinin Allium cepa da metafazda meydana getirdiği anormallikler. E: C-Metafaz, F: Yapışıklık, G: Kromozom kaybı H: Kromozom kırığı A C B D Resim 4.3. CuO nanopartiküllerinin Allium cepa da anafaz-telofazda meydana getirdiği anormallikler. A: Normal telofaz , B: Yapısı bozulmuş anafaz, C:Geri kalmış kromozom, D: Multipolarite 42 E F G H I İ J K Resim 4.3. (devam) CuO nanopartiküllerinin Allium cepa da anafazda meydana getirdiği anormallikler. E:Fragment , F: Kutupsal sapma, G: Yapışıklık, H: Köprü, I: İleri gitme, İ: Asenkron bölünme, J: Star anafaz, K: Multipolarite 43 A B C D Resim 4.4. CuO nanopartiküllerinin Allium cepa da interfazda meydana getirdiği anormallikler. A: Binükleat, B: Tomurcuklanma, C: Halter Şekilli çekirdek, D: Mikroçekirdek 44 A B Resim 4.5. Kontrol grubundaki Allium cepa kök uçları. A: Genel görünüm, B: Bir hücrenin görüntüsü 45 A B Resim 4.6. A: Allium cepa’da hücre duvarlarınnda CuO nanopartikülleri (25 µg/ml, 24 saat). B: A’nın büyütülmüş hali A B Resim 4.7. A: Allium cepa’da plazmodezmalalarda CuO nanopartikülleri (25 µg/ml, 24 saat). B: A’nın büyütülmüş hali 46 M G ER X Resim 4.8. Allium cepa’da mitokondri (M), golgi cisimciği (G), endoplazmik retikulum (ER) ve diğer yapılardaki (X) CuO nanopartikülleri (25 µg/ml, 24 saat) B A Resim 4.9. A: Allium cepa’da çekirdeğin heterokromatin bölgesinde CuO nanopartikülleri (100 µg/ml, 24 saat). B: A’nın büyütülmüş hali 47 A B Resim 4.10. A: Allium cepa’da kofullarda CuO nanopartikülleri (25 µg/ml, 72 saat). B: A’nın büyütülmüş hali A B Resim 4.11. A: Allium cepa’da hücre dışı yapılarda CuO nanopartikülleri (25 µg/ml, 48 saat). B: A’nın büyütülmüş hali 48 B A Resim 4.12. A: Allium cepa’da mitokondrilerde CuO nanopartikülleri (25 µg/ml, 72 saat). B: A’nın büyütülmüş hali A M ER B Resim 4.13. A: Allium cepa’da mitokondri (M), endoplazmik retikulum (ER) ve sitoplazmada CuO nanopartikülleri (25µg/ml, 24 saat). B: A’nın büyütülmüş hali 49 A B Resim 4.14. A: Alium cepa’da CuO nanopartiküllerinin hücre membranında oluşturduğu hasar (100 µg/ml, 72 saat). B: A’nın büyütülmüş hali B A Resim 4.15. A: Allium cepa’da hücre duvarlarında CuO nanopartikülleri (100 µg/ml, 24 saat,). B: A’nın büyütülmüş hali 50 4.2. SiO2 Nanopartiküllerinin Allium cepa’daki Etkileri Mitotik indeks ve faz frekansları: SiO2 nanopartiküllerinin 50, 250, 500 ve 1000 µg\µl’lik konsantrasyonlarının 24, 48 ve 72 saatlik uygulamalarının Allium cepa kök ucu hücrelerinde mitotik indeks ve mitotik fazla frekanslarına etkisi Çizelge 4.3’te, gözlenen anormallikler ve frekansları ise Çizelge 4.4’te gösterilmiştir. Mitoz bölünme geçiren hücre sayısının toplam hücrelere yüzde cinsinden oranı ile belirlenen Mİ, SiO2 nanopartiküllerinin 24 saatlik muamelesi sonucunda 500 µg/ml’lik konsantrasyon dışındaki diğer konsantrasyonlarda kontrole kıyasla bir düşüş göstermiş fakat bu düşüş sadece 50 ve 1000 µg/ml’lik konsantrasyonlarda anlamlı düzeye ulaşmıştır. 48 saatlik uygulamada 500 µg/ml’lik konsantrasyon, kontrole kıyasla Mİ’te çok az bir artışa sebep olmuştur. Diğer tüm konsantrasyonlarda Mİ’te düşüş gözlenmiştir fakat bu düşüş sadece 1000 µg/ml’lik konsantrasyonda anlamlı bir düzeye ulaşmıştır. 24 ve 48 saatlik uygulamalarda 1000 µg/ml’lik konsantrasyonun Mİ’teki etkisinin pozitif kontrolden bile daha yüksek olduğu belirlenmiştir. 72 saatlik uygulamada ise 250 µg/ml’lik konsantrasyon dışındaki diğer tüm konsantrasyonlar Mİ’te bir miktar azalmaya sebep olmuştur ancak sadece 50 µg/ml’lik konsantrasyonda anlamlı bir farklılık olduğu belirlenmiştir. SiO2 nanopartikülleri Allium cepa da, 24 ve 48 saatlik uygulamalarda kontrole kıyasla sadece 1000 µg\µl konsantrasyonda tüm mitotik faz frekanslarında azalmaya sebep olmuştur. Bu azalmalar 24 saatlik uygulamada profazda yaklaşık 1/4, metafazda 1/2, anafazda 1/4, telofazda ise 1/3 oranındadır. 48 saatlik uygulamada faz frekanslarındaki azalmaların profaz, metafaz ve telofazda yaklaşık 1/2, anafazda ise 1/3 oranında olduğu belirlenmiştir. 72 saatlik uygulamada ise 50 ve 1000 µg\µl’lik konsantrasyonlar bütün fazlarda azalmalara sebep olmuştur. 250 ve 500 µg/ml’lik konsantrasyonlar anafazda bir miktar artışa sebep olmuştur. 51 Çizelge 4.3. Silikon dioksit nanopartiküllerinin Allium cepa da mitotik fazların frekansı ve mitotik indeks (Mİ) üzerine etkisi İncelenen Hücre Sayısı Bölünen Hücre Sayısı Profaz (%) Metefaz (%) Anafaz (%) Telofaz (%) MI (%)±SE 24h Kontrol Pozitif Kontrol 50 250 500 1000 5000 5000 5000 5000 5000 5000 238 125 175 200 259 88 2,46 1,56 1,52 1,76 2,06 0,74 1,10 0,54 0,68 1,06 1,38 0,64 0,48 0,20 0,44 0,30 0,54 0,14 0,72 0,20 0,86 0,88 1,20 0,24 4,76±0,30 2,50±0,22*** 3,50±0,26** 4,00±0,28 5,18±0,31 1,76±0,18*** 48h Kontrol Pozitif Kontrol 50 250 500 1000 5000 5000 5000 5000 5000 5000 255 233 245 237 267 137 2,30 2,52 1,62 1,78 2,04 1,16 1,40 1,68 1,56 1,20 1,38 0,66 0,50 0,04 0,44 0,36 0,64 0,20 0,90 0,42 1,28 1,40 1,28 0,72 5,10±0,31 4,66±0,30 4,90±0,31 4,74±0,30 5,34±0,32 2,74±0,23*** 349 134 250 352 313 310 2,40 1,38 1,96 2,40 1,58 2,30 2,50 0,62 1,64 2,22 2,28 2,08 0,56 0,12 0,52 0,94 1,04 0,48 1,52 0,56 0,88 1,48 1,36 1,34 6,98±0,36 2,68±0,23*** 5,00±0,31*** 7,04±0,36 6,26±0,34 6,20±0,34 Konsantrasyon (µg\µl) 72h Kontrol 5000 Pozitif Kontrol 5000 50 5000 250 5000 500 5000 1000 5000 ** P < 0.01, *** P < 0.001 Kromozomal anormallikler: SiO2 nanopartiküllerinin Allium cepa kök ucu hücrelerinde meydana getirdiği anormallikler, bunların frekansları, hücre başına düşen kromozom anormalliği sayısı (KA/Hücre) ve anormal interfaz hücrelerinin frekansı Çizelge 4.4’te gösterilmiştir. SiO2 nanopartiküllerinin bütün konsantrasyonları ve bütün uygulama süreleri, A. cepa kök uçlarında kromozomal anormallik frekansında, kontrole kıyasla anlamlı bir artış oluşturmuştur (Şekil 4.2). Bu artış, 24 ve 48 saatlik uygulamalarda doz artışına bağlıdır. Anormallik frekansı, 24 saatlik uygulamada en yüksek dozda kontrole kıyasla yaklaşık 3 kat, 48 saatlik uygulamada ise yaklaşık 5 kat artış göstermiştir. 72 saatlik uygulamada en yüksek anormallik frekansı 50 µg\µl’lik konsantrasyonda gerçekleşmiş ve kontrole kıyasla yaklaşık 4 kat artış göstermiştir. Anormal interfaz hücrelerinin frekansları 24 saatlik uygulamada 50 ve 1000 µg/ml’lik konsantrasyonlarda kontrole kıyasla artış göstermiştir. Bu frekans, 48 ve 72 saatlik uygulamalarda bütün konsantrasyonlarda kontrole kıyasla yükselmiştir. 48 saatlik uygulamada en yüksek anormal interfaz hücre frekansı 500 µg/ml’de, 72 saatlik uygulamada ise 250 µg/ml’de gözlenmiştir. Hücre başına düşen anormallik sayısı 24 ve 48 saatlik uygulamalarda kontrole kıyasla konsantrasyona bağlı bir artış göstermiştir. Bu artış kontrole kıyasla en yüksek konsantrasyonda 24 saatte 3 kat ve 52 48 saatte ise 5 kata kadar olmuştur. 72 saatlik uygulamada ise hücre başına düşen anormallik sayısı kontrole kıyasla tüm konsantrasyonlarda artmış ve en yüksek frekans 50 Frekans µg/ml’de elde edilmiştir. 50 45 40 35 30 25 20 15 10 5 0 24 48 72 Kontrol Kontrol H2O2 H2O2 5050 250 250 500 500 1000 1000 Konsantrasyon (µg/ml) Şekil 4.2. SiO2 nanopartiküllerinin Allium cepa da anormallik frekansı üzerine etkisi SiO2 nanopartiküllerinin A. cepa da, mitoz bölünmenin değişik fazlarında oluşturduğu anormallik çeşitleri Resim 4.3’te gösterilmiştir. Profaz safhasında, gözlenme sıklığına göre sırasıyla yapışıklık, yapısal bozukluklar ve genetik materyalde kayıplar meydana gelmiştir (Resim 4.16). Metafazda en çok gözlenen anormallikler sırasıyla yapışıklık, C-metafaz, yapısal bozukluklar, geri kalmış kromozomlar, fragment, kromozom gruplaşmaları, kromozom kırığı gibi yapısal anormalliklerin dışında, 48 saatlik uygulamada en yüksek konsantrasyonda sayısal anormalliklerden olan poliploidi de gözlenmiştir (Resim 4.17). Anafaz-telofazda en sık gözlenen anormallikler sırasıyla ileri gitme, bir kromozomda birden fazla hasarı temsil eden diğer kategorisi (multipolarlık+geri kalmış kromozom, köprü+ileri gitme, köprü+ileri gitme+geri kalmış kromozom, ileri gitme+kromozom kırığı, köprü+yapışıklık, ileri gitme+geri kalmış kromozom, köprü+kutupsal sapma), yapısı bozulmuş bölünme, geri kalmış kromozom, yapışıklık, köprü, multipolarlık, fragment ve star anafazdır (Resim 4.18). İnterfazdaki anormalliklerden en sık gözleneni binükleat hücrelerdir (42). Bunun dışında tomurcuklanma (15) ve mikroçekirdek (13) oluşumları da gözlenmiştir (Resim 4.19). 53 TEM analizi: Silika nanopartiküllerinin 50, 250, 500 ve 1000 µg/ml’lik konsantrasyonlarının 24, 48 ve 72 saatlik muamelelerinin Allium cepa kök uçlarındaki etkileri TEM ile incelenmiş ve bunlara ait seçilen bazı görüntüler Resim 4.20- Resim 4.29’da verilmiştir. Bu nanoapartiküllerin özellikle hücre duvarlarına ve plazma membranlarına yoğun olarak biriktiği ve bu birikimin muamele süresi ve konsantrasyon artışıyla doğru orantılı olduğu belirlenmiştir. Plazmodezmalarda da yoğunlaşan bu nanopartiküller, sitoplazmaya da ulaşabilmiştir. SiO2 nanopartiküllerinin koful, çekirdek ve mitokondriye de girebildikleri belirlenmiştir. Çekirdekte özellikle heterokromatin bölgelere tutundukları, koful ve hücre duvarlarında yoğun kümeler oluşturdukları ve mitokondrilere tutunabildikleri kolayca görülmektedir. Kontrol Pozitif Kontrol 50 250 500 1000 Kontrol Pozitif Kontrol 50 250 500 1000 Kontrol Pozitif Kontrol 50 250 500 1000 24 48 72 Toplam *P < 0,001 (χ2 test) SiO2 Konsantrasyon (µg/ml ) Süre (saat) Genetik materyl Kaybı 9 1 1 - 2 1 1 - 1 4 2 Yapışıklık 29 7 1 3 2 - 12 3 2 3 5 1 23 9 1 Yapısı bozulmuş profaz 15 1 6 1 2 1 - 1 1 4 1 - C-metafaz 29 2 3 1 1 1 52 - 2 14 9 6 8 Yapışıklık 70 10 10 14 5 8 1 14 2 3 12 6 5 6 2 2 6 - Krmozom gruplaşması 5 1 2 2 - - Geri kalmış kromozom 18 3 2 2 6 3 3 1 1 1 1 1 - 22 5 1 1 2 2 1 4 3 3 Yapısı bozulmuş metafaz Fragment 7 1 2 - 1 1 2 Kromozom kırığı 1 - 1 - Poliploidi 1 - 1 - Enderoduplikasyon - - 1 - - İleri gitme 99 9 5 6 8 9 8 5 5 11 14 9 5 5 2 7 3 16 3 Yapısı bozulmuş Aanafaz-Telofaz 59 7 2 10 8 10 8 4 4 5 6 2 9 1 4 1 - Multipolarite 6 1 1 1 1 - 1 - 1 1 14 4 2 1 1 2 1 1 1 2 1 1 3 2 3 1 1 Anafaz-Telofaz 40 3 3 9 7 7 1 1 1 4 2 2 2 3 1 Geri kalmış kromozom Metafaz 17 1 2 3 4 2 1 1 3 - 1 3 - Kutupsal sapma Gözlenen Anormallikler Profaz Köprü Çizelge 4.4. Silikon dioksit nanopartiküllerinin Allium cepa da kromozomal anormallikler üzerine etkisi 54 1 1 - - - Star anafaz Asenkron bölünme - 4 - - - Fragment 4 - 1 2 - 1 2 - Yapışıklık 15 1 3 2 1 1 1 1 - 2 6 1 Diğer 48 1 2 3 2 - 1 4 8 7 5 4 1 4 9 3 5,73 33,58* 20,40* 15,91* 15,02* 16,45* 5,10 40,34* 13,88* 16,46* 17,98* 24,09* 11,35 45,60* 16,57* 21,50* 22,78* 29,55* Anormal Hücre (%) 0,06 0,34 0,21 0,18 0,16 0,16 0,05 0,41 0,16 0,19 0,21 0,28 0,11 0,49 0,18 0,24 0,23 0,34 KA/ Hücre 0,09 0,06 0,04 0,26 0,13 0,17 0,06 0,21 0,19 0,15 0,25 0,21 Anormal İnterfaz Hücre (%) 0,08 0,14 0,15 0,00 0,00 0,14 54 55 A B C D Resim 4.16. SiO2 nanopartiküllerinin Allium cepa’da profazda meydana getirdiği anormallikler. A: Normal profaz, B: Genetik materyal kaybı, C: Yapısı bozulmuş profaz, D: Yapışıklık A B C D Resim 4.17. SiO2 nanopartiküllerinin Allium cepa da metafazda meydana getirdiği anormallikler. A: Normal metafaz, B: Yapısı bozulmuş metafaz, C: Kromozom gruplaşması, D: C-Metafaz 56 E F G H Resim 4.17. (devam) SiO2 nanopartiküllerinin Allium cepa da metafazda meydana getirdiği anormallikler. E: Kromozom kırığı, F: Yapışıklık, G: Fragment, H: Poliploidi A B C D Resim 4.18. SiO2 nanopartiküllerinin Allium cepa’da anafaz-telofazda meydana getirdiği anormallikler. A-B: Normal anafaz, C: Normal telofaz, D: Yapısı bozulmuş anafaz 57 E F G H I İ J K Resim 4.18. (devam). SiO2 nanopartiküllerinin Allium cepa’da anafaz-telofazda meydana getirdiği anormallikler. E:Yapısı bozulmuş anafaz-telofaz, F: Geri kalmış kromozom, G-H: Köprü, I: Fragment, İ:Yapışıklık, J: İleri gitme, K: Star anafaz 58 L N M O Resim 4.18.(devam) SiO2 nanopartiküllerinin Allium cepa’da anafaz-telofazda meydana getirdiği anormallikler. L: Kutupsal sapma, M: Kromozom kırığı, N- O: Multipolarite A B C D Resim 4.19. SiO2 nanopartiküllerinin Allium cepa da interfazda meydana getirdiği anormallikler. A: Binükleat, B-C: Tomurcuklanma, D: Mikroçekirdek 59 B A Resim 4.20. A: Allium cepa’da hücre dışı yapılardaki SiO2 nanopartikülleri (250 µg/ml, 24 saat). B:A’nın büyütülmüş hali Resim 4.21. Allium cepa’da çekirdekte SiO2 nanopartikülleri (50 µg/ml, 24 saat) 60 Resim 4.22. Allium cepa’da farklı bir hücre çekirdeğinde SiO2 nanopartikülleri (50 µg/ml, 24 saat). A B Resim 4.23. A: Allium cepa’da hücre duvarında biriken SiO2 nanopartikülleri (250 µg/ml, 24 saat). B: A’nın büyütülmüş hali 61 Resim 4.24. Allium cepa’da kofullarda biriken SiO2 nanopartikülleri (250 µg/ml, 24 saat). A B Resim 4.25. A: Allium cepa’da hücre dışında SiO2 nanopartiküllerinin yoğunlaşması (500 µg/ml, 24 saat). B: A’nın büyütülmüş hali 62 A B Resim 4.26. A: Allium cepa’da kofullarda biriken SiO2 nanopartikülleri (1000 µg/ml, 24 saat). B: A’nın büyütülmüş hali A B Resim 4.27. A: Allium cepa’da plazmodezmada SiO2 nanopartikülleri (1000 µg/ml, 72 saat). B: A’nın büyütülmüş hali 63 A M G B Resim 4.28. A: Allium cepa’da sitoplazma, golgi cisimciği (G) ve mitokondride (M) SiO2 nanopartikülleri (500 µg/ml, 48 saat). B: A’nın büyütülmüş hali A B Resim 4.29. A: Allium cepa’da çekirdekte SiO2 nanopartikülleri (1000 µg/ml, 48 saat). B: A’nın büyütülmüş hali 64 65 5. SONUÇ VE ÖNERİLER Nanoteknolojinin hızlı bir şekilde ilerlemesiyle ticari amaçlar için nano boyutlu partiküllerin kullanımı da hızla artmaktadır. Nanopartiküller, savunma sanayii, otomotiv sanayii, tarım, tıp, testil, gıda endüstrisi, kozmetik ve çevresel sorunların iyileştirilmesi gibi alanlarda kullanılmakta olup nanoteknolojinin yakında bir trilyon dolarlık bir endüstri haline geleceği ön görülmektedir. Nanoteknolojinin bu kadar gelişmesi ekonomi, sağlık ve çevre üzerinde de önemli etkiler oluşturmaktadır. Bu teknolojide kullanılan nanopartiküllerin özellikle çevre ve sağlık üzerindeki potansiyel etkilerinin, bunların ticari olarak yaygınlaştırılmasından önce değerlendirilmesi oldukça önemli bir husustur (Nel, Xia, Madler ve Li, 2006). Günümüzde nanopartiküllerin potansiyel etkileri konusunda çok çeşitli açılardan incelemeler yapılmaktadır fakat bunlar henüz yetersiz kalmaktadır. Daha büyük boyutlu olanlarına göre nano boyuttaki maddelerin kazandıkları yeni fizikokimyasal karakterler, bunların hücresel alımlarını, hücre içi lokalizasyonlarını, hücre ve dokularla etkileşimlerini ve toksisitelerini de etkilemektedir. Bunların dışında nanopartikülün büyüklüğü, şekli, yüzey alanı, yüzeyin kimyasal yapısı, aglomerasyon durumu, kullanılan hücre tipi, in vivo/in vitro koşullarda uygulanması, uygulama konsantrasyonu, uygulama süresi, kullanılan değerlendirme testleri gibi pek çok parametreler de nanopartiküllerin toksik etkilerini değiştirmektedir (Auffan ve diğerleri, 2006; Stone ve diğerleri,. 2010). Bütün bu parametreler nedeni ile nanopartiküllerin toksik ve genotoksik etkileri konusunda yapılan çalışmalarda çelişkili sonuçlar gözlenmekte ve bunların güvenliği konusunda farklı yorumlar yapılmaktadır. Nano malzemelerin toksikolojik reaksiyonları, ilgili malzemedeki iyonların ulaşacağı hücresel elemanlardaki (sitoplazma, çekirdek, mitokondri, lizozom) etkinliğine de bağlıdır (Hanagata ve diğerleri, 2011). Nano CuO ve mikron boyutlu CuO'ten salınan bakırın etkilerinin kıyaslandığı bir çalışmada, en belirgin çözünmenin lizozomal sıvıda olduğu ve nano boyutun mikro boyuttan daha fazla yayıldığı belirtilmiştir (Semisch ve diğerleri, 2014). Silikanın nano boyutunun mikron boyutuna kıyasla daha toksik olduğu ve lizozomlarda birikebildiği gözlenmiştir (Al-Rawi, Diabate ve Weiss, 2011). Silika nanopartiküllerinin 21 nm boyutunun insan karaciğer hücre hattında apoptozisi indüklediği belirlenmiştir (Ye ve diğerleri, 2010). Gümüş nanopartiküllerinin 18 nm boyutunun 66 ratlarda akciğer hasarına sebep olduğu ve kronik alveolar inflamasyon ve küçük akciğer lezyonları ortaya çıkardığı bildirilmiştir (Sung ve diğerleri, 2008). Karbon nanotüplerinin etkisiyle, mitokondri aracılı ROT’lerinin fagositik hücrelerde inflamasyona sebep olduğu rapor edilmiştir (Shvedova ve diğerleri, 2012). Bunun dışında nanopartiküllere maruziyetin artmasının ciddi sağlık sorunları oluşturabileceği de belirtilmektedir. Örneğin, SiO2 maruziyetinin silikozis ve akciğer kanseri başta olmak üzere, oto-immün hastalıklardan, skleroderma, romatizmal artrit, sistemik lupus eritematoz gibi hastalıklara katkı yaptığı düşünülmektedir (Noonan, Pfau, Larson ve Spence, 2006). Ayrıca çekirdeğe ulaşabilen silika nanaopartikülleri nörodejeneratif bozukluklar oluşturabilmektedir (Chen ve Mikecz, 2005). Yapılan literatür taramalarında nanopartiküller ile ilgili çalışmaların her geçen arttığı gözlenmektedir. Özellikle metal oksit nanopartikülleri çok değişik alanlarda kullanıldığı için, bunlarla ilgili toksisite, özellikle genotoksisite çalışmaları da giderek artış göstermektedir. Metal oksit nanopartikülleri, fizikokimyasal özelliklerine ek olarak oldukça farklı biyolojik etkinlikler de göstermektedir. Metal oksit nanopartiküllerinin genotoksik etkilerinin incelenmesinde genellikle fare, sıçan, çin hamster ovaryumu, insan lenfositleri, akciğer hücre hattı, endotel hücre hattı, makrofaj-nötrofil hücre hattı, epidermal keratinosit hücre hattı, embriyonik üreme hücre hattı, bazı mikroorganizmalar ve Vicia faba, Allium sativum ve Allium cepa gibi bazı bitki türleri kullanılmaktadır. Bu tez çalışmasında, bir çok kullanım alanı olan metal oksit nanopartiküllerinden CuO ve SiO2 nanopartiküllerinin Allium cepa’da oluşturabileceği genotoksik etkiler araştırılmıştır. Bu etkilerin değerlendirilmesinde Birleşik Devletler Çevre Koruma Ajansı Genetik Toksikoloji programı (US-EPA-Gene-Tox) tarafından çevresel risklerin değerlendirilmesinde en güvenilir test olarak seçilen Allium testi kullanılmıştır. Bu test, hem mitotik indeksteki değişikliklerin ve mitoz bölünmede oluşan anormalliklerin ve hem de kromozomal anormalliklerin aynı anda belirlenmesine imkan sağlamaktadır. Geçmişten günümüze doğaya salınan bir çok ekzojenin başta insan olmak üzere diğer canlılar ve çevre üzerindeki etkilerini değerlendirmek amacıyla pek çok test kullanılmaktadır. Allium testi bunlardan biri olup, pestisitlerin, gıda katkı maddelerinin, çeşitli ilaç etken maddelerinin ve günümüzde neredeyse her alanda kullanılmaya başlanan ve bitkilerin yaşam döngülerine de katılabilen mühendislik ürünü nanomalzemelerin etkilerinin değerlendirilmesi için de güvenilir bir yöntem olarak kullanılmaktadır. Son yıllarda Allium testi ile gümüş (Kumari ve diğerleri, 2009), ZnO (Kumari ve diğerleri, 2011), TiO2 (Ghosh ve diğerleri, 2010) ve 67 çok duvarlı karbon nanotüleri (Gosh, Chakraborty, Bandyopadhyay ve Mukherjee, 2011) gibi çeşitli nanopartiküllerin genotoksik etkileri incelenmiştir. Nanopartiküllerin bitkilerde veya diğer organizmalardaki genotoksik etkilerini araştırmak amacı ile kullanılan konsantrasyonların seçimi rastgele (Liman, 2013) yapılabildiği gibi, söz konusu nanopartiküle maruz bırakılan Allium cepa kök ucu hücrelerinde kontrole kıyasla büyümeyi %50 oranında azaltan konsantrasyon (EC50) dikkate alınarak da (Ghosh ve diğerleri, 2010) yapılmaktadır. Bu çalışmada kullanılan konsantrasyonlar, daha önce Saygılı (Saygılı, 2014) tarafından insan lenfositlerinde mitotik indeks üzerine etkileri dikkate alınarak belirlenen ve genotoksik etkilerini değerlendirmek amacı ile kullanılan konsantrasyonlardır. Bu konsantrasyonlar CuO nanopartikülleri için, 25, 50, 75 ve 100 µg/ml ve SiO2 nanopartikülleri için 50, 250, 500 ve 1000 µg/ml’lik konsantrasyonlardır. Literatürde Allium cepa da nanopartiküllerin farklı konsantrasyonları ile yapılmış çalışmalar mevcuttur. Örneğin, TiO2 NP’lerinin 2, 4, 6, 8 ve 10 mM (Ghosh ve diğerleri, 2010), MWCNT’lerinin 10, 20 ve 50 µg/ml (Gosh ve diğerleri, 2011), gümüş (Kumari ve diğerleri, 2009) ve ZnO NP’lerinin (Kumari ve diğerleri, 2011) 25, 50, 75 ve 100 µg/ml, bizmut (Liman, 2013) ve TiO2 NP’lerinin (Pakrashi ve diğerleri, 2014) 12,5, 25, 50, 75 ve 100 µg/ml’lik konsantrasyonları kullanılmıştır. Kullanılan nanopartiküllerin boyutları genellikle 100 nm’nin altında olmakla beraber, mikron boyutlu partiküller de değerlendirilmektedir (Ghosh ve diğerleri, 2010; Karlsson ve diğerleri, 2009; Kumari ve diğerleri, 2009; Semisch ve diğerleri, 2014). Bu tez çalışmasında kullanılan ve ticari olarak temin edilen CuO nanopartikülleri < 50 nm ve SiO2 nanopartikülleri ise ortalama 12 nm’dir. Yapılan araştırmalarda nanopartiküllerin sulu süspansiyonlarının hazırlanmasında genellikle deiyonize su (Kumari ve diğerleri, 2009), bidistile su (Ghosh ve diğerleri, 2010) veya distile su (Liman, 2013) kullanılmaktadır. Muamele işlemi ise genelde saksıda toprağa verilerek (Ghosh ve diğerleri, 2010) veya tüp içindeki nanopartiküllü süspansiyona soğan köklerinin direkt daldırılması yolu ile yapılmaktadır (Kumari ve diğerleri, 2009). Bitkilerin nanopartiküller ile muamelesinde genellikle 4, 12 ve 24 saatlik süreler kullanılmıştır (Ghosh ve diğerleri, 2010; Kumari ve diğerleri, 2009; Liman, 2013). Yapılan bir başka çalışmada muamele süresini takiben, 24 saatlik iyileştirme periyodu uygulanmıştır (Ghosh ve diğerleri, 2011). Bu tez çalışmasında hem CuO ve hem de SiO2 nanopartiküllerinin sulu süspansiyonlarının hazırlanmasında deiyonize su kullanılmıştır. 68 Deiyonize su, nanopartiküllerin dağılmasında daha homojen bir ortam oluşturduğu için tercih edilmiştir (Saygılı, 2014). Bir gece suda bekletilen ve kökleri yaklaşık 2 cm kadar uzayan Allium cepa yumruları, bu nanopartiküllerin sulu süspansiyonunu içeren tüplerde 24, 48 ve 72 saat muamele edilmiştir. Allium cepa da hücre çemberinin yaklaşık 24 saatte tamamlandığı (Rank ve Nielsen, 1997) göz önüne alınarak, uygulama süreleri 24 saat ve katları şeklinde seçilmiştir. Bu araştırmada CuO ve SiO2 nanopartiküllerinin Allium cepa daki genotoksik etkilerinin değerlendirilmesi amacı ile mitotik indeks, mitotik fazların frekansları, mitoz bölünmede ve kromozomlarda meydana gelen anormallikler ve interfazdaki anormallikler değerlendirilmiştir. Mitotik indeksin belirlenmesinde her bir preparatta 1000 hücre olmak üzere beş ayrı kök ucundan hazırlanan 5 preparatta toplam 5000 hücre incelenmiştir. CuO nanopartiküllerinin bütün konsantrasyonları ve uygulama süreleri Allium cepa kök ucu hücrelerinde mitotik indeksi kontrole göre anlamlı düzeyde düşürmüştür. Bu düşüş, 48 ile 72 saatlik uygulama sürelerinde doza bağlıdır. SiO2 nanopartiküllerine maruz kalan Allium cepa kök uçlarında da mitotik indekste, birkaç uygulama dışında, genellikle azalma gözlenmiştir. Ancak bu azalma, kontrole kıyasla, 24 saatlik uygulamada 50 ve 1000 µg/ml’de, 48 saatlik uygulamada sadece 1000 µg/ml’de, 72 saatlik uygulamada ise sadece 50 µg/ml’de anlamlı düzeydedir. 24 ve 48 saatlik uygulamada 500 µg/ml, 72 saatlik uygulamada 250 µg/ml’lik konsantrasyonlar, mitotik indekste küçük bir artışa sebep olmuştur. Mitotik indekste anlamlı azalmaların gözlendiği konsantrasyonlar, Allium cepa kök ucu hücrelerinde mitodepresif etki oluşturmuştur. CuO ve SiO2 nanopartiküllerinin mitotik indekste oluşturduğu düşüşün sebebi, bu nanopartiküllerin güçlü toksik etkisinden kaynaklanmaktadır. Mitotik indeks, hücre bölünme sıklığının tahminini sağlayan bir parametre olarak kabul edilmektedir (Goujon ve diğerleri, 2014). Nanomateryal kaynaklı toksik etki DNA’da ciddi hasarlar oluşturmuş ve hücre döngüsündeki geçişleri yavaşlatmış olabilir. Mitotik indeksteki azalma, hücre çoğalmasının azaldığının göstergesidir (Webster ve Davidson, 1969). Toksik etkili bir maddeye maruz kalan hücrelerde, DNA’da meydana gelen hasarın döngüdeki yerine göre, hücre döngüsü kontrol noktaları G1’den S fazına veya G2’den mitoza geçişi engeller. DNA’da meydana gelen bir hasar DNA sentezini ve dolayısıyla RNA ve protein sentezini de inhibe edebilir. DNA’sı replike olmamış hücrelerde kinaz komplekslerinin inaktivasyonu ile mitoza giriş engellenir (Vermeulen, Van Bockstaele ve Berneman, 2003). Gümüş nanopartiküllerinin Allium cepa hücrelerine muamelesiyle elde edilen mitotik indeks % 60.30’dan (kontrol) % 27.62’ye varan bir 69 azalma göstermiş ve bu azalmanın sebebinin hücrelerin S fazında birikmesi ve diğer fazlara geçişlerin engellenmesinden kaynaklandığı ifade edilmiştir (Kumari ve diğerleri, 2009). Gümüş nanopartiküllerinin normal insan akciğer fibroblast hücreleri ve insan glioblastoma hücrelerine uygulanması sonucunda, bu hücrelerin G2/M safhasında tutuklu kaldıkları gözlenmiştir. Hücrelerin bu evrede tutuklu kalmasının, DNA hasarından kaynaklandığı belirtilmiştir (Asharani, Low Kah Mun, Hande ve Valiyaveettil, 2008). DNA sentezindeki azalmanın bir başka sebebinin enerji üreten merkezin işlevinin baskılanarak ATP seviyesindeki azalma ile bağlantılı olabileceği bildirilmiştir (Epel, 1963). Bu çalışmada CuO ve SiO2 nanopartiküllerinin Allium cepa kök ucu hücrelerinde TEM ile yapılan analizlerde, nanopartiküllerin hem sitoplazma ve çekirdekte ve hem de mitokondrilerde bulundukları gözlenmiştir. Nanopartiküllerin bu birikiminin, ya direkt veya indirekt yollarla mitotik indekste azalmaya sebep olduğu görülmektedir. CuO ve SiO 2 nanopartiküllerinin Allium cepa hücrelerinde mitotik indekste oluşturduğu azalmalar, bu nanopartiküllerin büyüme ve gelişmeyi engelleyici etkili olduğunu göstermektedir. Nanopartiküller, mitotik indekste değişmelere sebep olduğu gibi, interfazda ve bölünmekte olan hücrelerde de bazı mitotik ve kromozomal anormalliklere de sebep olmaktadır. Kromozomal anormallikler, kendiliğinden veya maruz kalınan ekzojen maddenin etkisiyle oluşabilir. Kromozom sayısı ve/veya yapısındaki anormallikler, DNA kırıkları, DNA sentezinin inhibisyonu, DNA replikasyonundaki hatalar, RNA ve protein sentezinin inhibe olması, mitotik ipliklerin etkilenmesi ve kromozomların düzensiz ayrılması gibi mekanizmalardan kaynaklanmaktadır (Albertini ve diğerleri, 2000; Kaur ve diğerleri, 2014; Türkoğlu, 2012). Ekzojen maddelerin etkisiyle oluşabilecek anormalliklerin Allium testi ile incelenmesinde bazı araştırıcılar sadece anafaz-telofaz safhalarındaki anormallikleri dikkate almaktadır. Bu analizin yeterli, hızlı ve güvenilir sonuçlar verdiği düşünülmektedir (Rank ve Nielsen, 1994). Fiskesjo, kromozomal anormalliklerin hücre döngüsünün bütün fazlarında oluşabileceğinden yola çıkarak, bütün fazların göz önüne alınmasının daha sağlıklı ve güvenilir sonuçlar verdiğini vurgulamıştır. (Fiskesjo, 1985). Nanopartiküllerin genotoksik risklerinin belirlenmesinde sadece anafaz-telofaz safhalarında oluşabilecek anormallikleri değerlendiren (Ghosh ve diğerleri, 2010; Liman, 2013) veya tüm safhalarda oluşabilecek anormallikleri değerlendiren (Kumari ve diğerleri, 2009, 2010, 2011) çalışmalar yapılmaktadır. Bu tez çalışmasında kromozomal anormallik frekansları ve çeşitlerinin belirlenmesinde hücre bölünmesinin tüm safhaları göz önüne alınmıştır. CuO ve SiO2 nanopartikülleri Allium cepa kök ucu hücrelerinde kromozomal 70 anormalliklerin frekansını bütün konsantrasyonlarda ve bütün uygulama sürelerinde kontrole kıyasla önemli düzeyde artırmıştır. CuO ve SiO2 NP’leri hücre bölünmesinin değişik fazlarında çeşitli anormalliklerin oluşmasına sebep olmuştur. Bu iki nanopartikülün de etkisiyle Allium cepa kök ucu hücrelerinin bütün fazlarında (profaz, metafaz, anafaztelofaz evrelerinde) kromozomlarda yapışıklık ve mitotik fazlarda yapısal bozulmalar, metafaz ve anafaz-telofazda, fragment ve geri kalmış kromozomlar; metafazda kromozom kırıkları, C-metafaz, kromozom gruplaşmaları, poliploidi; anafaz-telofazda multipolarite, kromatin köprüleri, kutupsal sapma, star anafaz, asenkron bölünme ve ileri gitme gibi mitotik ve kromozomal anormalliklerin oluştuğu belirlenmiştir. İnterfaz evresini tamamlayıp mitoza girecek hücrelerde, kromozomların mitotik ipliklere düzgün tutunamamasına duyarlı olan kontrol noktası bulunur. Bu kontrol noktasının görevini tam olarak yapamaması sonucu bazı anormalliklerin ortaya çıkabileceği belirtilmiştir (Li ve diğerleri, 1998). Nanopartiküller bölünme sırasında ya mitotik olaylarla veya kromozomlar ile etkileşime girerek anojenik ve/veya klastojenik etkilere sebep olmaktadır. Nanopartiküller mekanik veya kimyasal bağlanmalarla, klastojenik etkiye yol açarak kromozomlar içinde kırıklara veya anojenik etki oluşturarak bütün bir kromozom kaybına veya mitoz bölünme safhalarında bozulmalara sebep olabilir (Magdolenova ve diğerleri, 2014). DNA kırıklarından kaynaklanan kromozomal anormallikler, DNA bütünlüğünü korumak amacı ile DNA tamir mekanizmaları tarafından onarılmaktadır (Vodicka ve diğerleri, 2004). Fakat bu tamir mekanizmalarının yetersiz kalması veya görevini yerine getirememesi sonucunda da bazı kromozomal anormallikler ortaya çıkmaktadır. Fragmentler, kromatit ve kromozom kırıkları sonucunda oluşan anormalliklerdir. Kromozom köprüleri, kırılan kromozomların yapışkan uçlarının birleşmesiyle meydana gelmektedir (Chauhan, Dikshith ve Sundararaman, 1986; Patil ve Bhat, 1992). C-mitoz, kolşisin etkisine benzer şekilde iğ ipliklerinin inhibisyonuna işaret eder (Badr, 1983; Shahin ve El-Amoodi, 1991; Njagi ve Gopalan, 1982). Multipolarite ve geri kalmış kromozomlar da iğ ipliklerinin etkilenmesinden oluşmaktadır. Multipolarite anafazdaki başarısız ayrılma veya eşit olmayan translokasyon sonucu oluşabileceği gibi, geri kalmış kromozomların kutuplara çekilememesinden de kaynaklanıyor olabilir (Pandey ve diğerleri, 2014). Geri kalmış kromozomlar (veya kalgın) ve star anafaz gibi anormalliklerin meydana gelişi, iğ ipliklerinin oluşumunda rol alan mikrotübül polimerizasyonunun yapılamadığının göstergesi de olabilir (Voutsinas, Zarani ve Kappas, 1997). Yapışıklık, kromozomlar arasındaki kromatin liflerinin dolaşmasıyla veya DNA 71 topoizomeraz gibi periferal proteinlerin etkilenmesiyle oluşabilir (Gaulden, 1987). Yapışıklık bir kromatid tipi anormallik olabilir ve maruz kalınan ajanın etkisiyle DNA'nın bozulması veya depolimerizasyonu olarak ifade edilir (Darlington ve McLeish, 1951). Yapışıklık DNA yoğunlaşması veya kromozomlar arasındaki yoğunlaşma olarak da ifade edilmektedir (Österberg, Persson ve Bjursell, 1984). Yapışkanlık geri dönüşü olmayan bir anormallik tipi olup, hücre ölümüne yol açmaktadır (Savage, 1975). İnterfazda ortaya çıkan binükleat hücreler, hücre plağının inhibe edilmesinden kaynaklanmış olabilir (Ma ve diğerleri, 1995). Loblu nükleus ve tomurcuklanma ise nanopartiküllerin soğan DNA'sında morfolojik değişiklikler oluşturabildiklerinin göstergesi olabilir (Tan ve diğerleri, 2014). İnterfazda gözlenen mikronükleuslar, bu nanopartiküllerin anojenik veya klastojenik etkilerle fragment ve kromozom kayıpları gibi kromozom aberasyonları oluşturabildiklerini göstermektedir (Arora ve diğerleri, 2014; Fernandes ve diğerleri, 2007; Leme ve diğerleri, 2008). DNA polimeraz için gerekli olan belirli iyonlarla rekabete giren metaller, DNA tamir mekanizmalarını önleyerek, dolaylı şekilde DNA hasarına sebep olabilir (CebulskaWasilewska, Panek, Zabinski, Moszczynski ve Au, 2005; Hartwig, 1994). CuO nanopartikülleri ile yapılan uygulamalar sonucunda anormalliklerin frekansındaki artışın, CuO nanopartiküllerinden salınan bakırın DNA polimeraz etkinliğini önleyerek, DNA tamirini aksatması sonucu olabileceği düşünülmektedir. Ayrıca düşük konsantrasyondaki kimyasallar, dolaylı yoldan genotoksik etkilere sebep olabilir ve kromozomal anormallik frekansında önemli artışlar oluşturabilir (Vodicka ve diğerleri, 2004). Kimyasal aracılı meydana gelen kromozom aberasyonlarının, klastojenitenin göstergesi olduğu belirtilmiştir (Topaktaş ve Rencüzogulları, 1993). Manyetit nanopartiküllerinin, memeli hücrelerinde oluşturduğu DNA çift zincir kırıklarının, ROT'lerinin etkisi ile doğrudan veya dolaylı şekilde indüklendiği, MN ve KKD oluşumlarının ise klastojenik etkinin belirteci olduğu ifade edilmiştir (Kawanishi ve diğerleri, 2012). Bu çalışmada, hem CuO ve hem de SiO2 nanopartiküllerinin Allium cepa hücrelerine ve hücresel elemanlarına olası geçişi TEM ile incelenmiştir. Muamele edilen nanopartiküllerin, boya olarak kullanılan maddeler ile karışıklığını önlemek için ince kesitler kurşun sitrat ve uranil asetat gibi ağır metal tuzları ile boyanmamıştır. Bu nedenle, hücre organelleri çok belirgin şekilde ayırt edilmemektedir. Ancak, çekirdek, mitokondri, granüllü endoplazmik retikulum, golgi kompleksi ve vakuollere nanopartiküllerin penetre 72 olabildikleri açıkça ayırt edilebilmektedir. Özellikle hücre duvarlarında ve plazmodezmalarda yoğun bir şekilde tutundukları gözlenmiştir. Gözlenen bu sonuçlara göre CuO ve SiO2 nanopartikülleri, hücre duvarı ve plazmodezmalar aracılığı ile hücre içine giriş yapmış olabilir. Ancak bazı çalışmalarda, nanopartiküllerin bitkilerdeki geçişlerinin, memelilerdeki gibi endositoz aracılığıyla olabileceği belirtilmektedir (Peters ve diğerleri, 2006). Nanopartiküllerin meydana getirdiği hasar nanopartikülün çekirdeğe ulaşması sonucu direkt DNA ile etkileşimiyle olabileceği gibi (Ghosh ve diğerleri, 2010), mitokondrilerin etkilenmesiyle oluşabileceği de belirlenmiştir. CuO ve SiO2 nanopartiküllerinin özellikle mitokondrilere girebildikleri açıkça görülmektedir. Bu nedenle, bu nanopartiküllerin meydana getirdiği genetik hasarların mitokondrilerle bağlantılı olabileceği de düşünülebilir. Son yıllarda yapılan çalışmalarda, nanopartiküllerin mitokondrilere ulaşabildikleri gösterilmiştir (Asharani, Low-Kah-Mun, Hande ve Valiyaveettil, 2009). Benzer şekilde ZnO nanopartiküllerinin Allium cepa hücre matriksine plazmodezmalar aracılığıyla girebildikleri belirlenmiştir. Apoptozis ve DNA fragmanlarının nanopartikül alımıyla bağlantılı olabileceği bildirilmiştir (Ghosh ve diğeleri, 2011). ZnO nanopartiküllerinin Allium cepa hücrelerinde yoğun birikimi sonucunda kromozomlarda ciddi hasarlar oluşturduğu belirlenmiştir (Ghodake, Seo ve Lee, 2011). CuO nanopartikülleri Oryza sativa cv. Swarna hücrelerinde hidroksil radikalleri ve H2O2 oluşumunu indükler. CuO nanopartiküllerinin oluşturduğu stres, antioksidan süpürücülerinin artmasına sebep olur. Koruyucu mekanizmalara rağmen, CuO nanopartiküllerinin sebep olduğu oksidatif hasar engellenememiştir (Shaw ve Hossain, 2013). TiO2 nanopartiküllerinin de hidroksil radikallerinin oluşumu tetiklediği ve sonuçta oksidatif stres oluşturarak DNA hasarına sebep olduğu belirlenmiştir (Ghosh ve diğerleri, 2010; Shaw ve Hossain, 2013). Abiyotik stresin de bitkilerde doğrudan ve dolaylı yolla DNA hasarı oluşturabileceği belirtilmiştir (Kumari ve diğerleri, 2009; Zhang ve diğerleri, 2005). Bitkilerdeki hidroksil radikallerinin lipit peroksidasyonunu tetikleyerek oksidatif stres oluşturdukları ve biyolojik membran hasarlarına sebep olduğu gözlenmiştir (Zhang ve diğerleri, 2005). Nanopartiküllerin genotoksik mekanizması konusunda bazı görüşler vardır. Nanomateryallerin primer (direkt, indirekt) ve sekonder olmak üzere iki ana mekanizma ile etkili oldukları düşünülmektedir (Magdolenova ve diğerleri, 2014). Nanopartiküller gibi ekzojenik ajanların hücresel internalizasyonu ile oluşturabilecekleri primer etki genetik materyalde ya direkt yada indirekt yolla oluşur. Direkt etkide nanopartiküller DNA ile 73 doğrudan temas haline geçerek, genetik materyalde fiziksel veya kimyasal hasarlar oluşturur. Nanopartiküller DNA molekülünde bazı alanlarda nükleotiti kararsızlaştırabilir. Bu nükleotitler DNA tamiri esnasında uzaklaştırılarak abazik alanlar oluşturulabilir. Replikasyon sırasında polimeraz enziminin nükleotitleri rastgele yerleştirmesinden kaynaklanan hatalı bazlar gözden kaçarak ifade edilir ve sonuçta nokta mutasyonları veya zincir kırıkları oluşabilir (Doak ve diğerleri, 2007; Jenkins ve diğerleri, 2005). Direkt etkili olan nanopartiküller çift heliks arasına yerleşerek DNA replikasyonu sırasında çift zincir kırıkları veya nükleotit eklemelerine de sebep olabilirler (Ferguson ve Denny, 2007). Nanomateryaller hücre çekirdeğine penetre olarak veya bölünme sırasında sitoplazmada serbest kalan DNA ile doğrudan temasa geçer (Berry, De La Fuente, Mullin, Chu ve Curtis, 2007). Titanyum dioksit, çinko oksit, silika ve kuantum noktaları gibi bazı nano maddelerle yapılan çalışmalarda bu partiküllerin nükleer bölgelere kadar girebildikleri gözlenmiştir (Chen ve Mikecz, 2005; Hackenberg ve diğerleri, 2010, 2011; Nabiev ve diğerleri, 2007; Shukla ve diğerleri, 2011) Buna rağmen nanomateryallerin DNA ile direkt etkileşim yoluyla hasar oluşturup oluşturmadıkları kesin değildir. Nanopartiküllerin bitkilerde de direkt olarak DNA ile etkileşime girebildikleri belirlenmiştir. SWCNT’lerin bitki hücreleri tarafından alınabildikleri ve SWCNT-DNA bileşimi oluşturdukları belirtilmiştir (Liu ve diğerleri, 2009). Mezoporus silikalarla yapılan bir çalışmada, bunların protoplastlara alınabildikleri ve DNA'ya ulaşabilme potansiyelleri olduğu gösterilmiştir (Vivero-Escoto, Slowing, Trewyn ve Lin, 2010). İndirekt etkili nanopartiküller hücre bölünmesinde rol alan biyomoleküllere etki ederek genetik hasara yol açarlar. DNA replikasyonu ve hücre bölünmesi gibi süreçler çok sayıda multifonksiyonlu protein taşıyan süreçlerdir. Bu proteinler dolaylı etki için hedef noktalardır. Örneğin sentriol, kinetekor ve mikrotübül gibi mekanik ayrılmayı sağlayan kromozomal yapılar; polimeraz, topoizomeraz gibi DNA replikasyon enzimleri; DNA tamir enzimleri veya kromozom replikasyonu ve bölünmesi süreçlerindeki hücre döngüsü kontrol noktalarını içeren sinyal trandüksiyon proteinleri dolaylı etkili ajanlara hedef olabilen bazı yapılardır (Ferguson ve Denny, 2007). Bu indirekt DNA hasarları oksidatif stresin indüklenmesiyle de oluşabilir. DNA, lipid veya protein gibi biyomoleküller kolayca oksidasyona uğrayarak, normal bir yan ürün olan reaktif oksijen türleri oluşturabilir. Oksidadif hasar, hücre içinde antioksidan düzeyi ile ROT'leri arasındaki dengesizlik sonucu oluşmaktadır. Bütün bu etkiler DNA lezyonlarına ve son olarak mutasyonlara sebep olabilir (Cooke, Evans, Dizdaroglu ve Lunec, 2003). Bazı çalışmalarda 74 nanomalzemelerin dolaylı etki ile DNA hasarı oluşturduğu vurgulanmaktadır. Örneğin, nanosilika özellikle topoizomeraz gibi önemli enzimleri de içeren protein agregasyonuna sebep olabilir (Chen ve Mikecz, 2005). Ayrıca oral yollu nanopartikül uygulanmasında karaciğer ve akciğerlerde oksidatif strese bağlı DNA lezyonları görülmüştür (Folkmann ve diğerleri, 2009). Bitkilerde indirekt etkileşime dair sınırlı sayıda çalışma bulunmaktadır. CuO nanopartikülleri ve Cu iyonlarının tarım ve çayır bitkilerinde DNA hasarına sebep olduğu rapor edilmistir. Turp (Raphanus sativus), çok yıllık çim (Lolium perenne) ve yıllık çimde (Lolium rigidum) CuO nanopartiküllerinin ve Cu iyonlarının sebep olduğu oksidatif artışların mutajenik DNA lezyonları (7,8-dihidro-8-OxoGuanine, 2,6-diamino-4-hidroksi5-formamidopyrimidine, 4,6 diamino-5-ormamidopyrimidine) oluşturduğu belirlenmiştir (Atha ve diğerleri, 2012). Hem direkt ve hem de indirekt etkiler sonucu ortaya çıkan hasarlı oluşumlar gen mutasyonlarına ve sayısal ve/veya yapısal kromozomal anormalliklere yol açmaktadır. Sekonder genotoksisite, in vivo olarak bir eksojen ajana/nanopartiküle maruziyet sonucu bu alandaki nötrofil ve makrofajlar tarafından üretilen ROT’nin indüklediği kronik inflamasyon cevabıdır. Bu akut iltihap genelikle bağışıklık hücreleri tarafından işgalci patojenlere karşı vücudu korumaya yönelik bir savunma mekanizmasıdır. Fakat ROT’leri sonucu oluşan oksidatif stresle serbest radikaller meydana gelir, DNA’yı da içeren biyomoleküllerde hasarlara yol açar ve sonuçta kronik inflamasyon oluşur (Federico, Morgillo, Tuccillo, Ciardiello ve Loguercio, 2007). Nanomalzemeler in vitro sistemlerde herhangi bir genotoksik potansiyel göstermeyebilir fakat bunların in vivo sistemlerde dokudaki hücrelerin içinde birikmesiyle oluşan ROT'leri tarafından kronik immün yanıt oluşabilmektedir. Bu tür ikincil genotoksisitenin klasik örneği asbest solunmasıdır. Bu asbest liflerinin bağışıklık hücreleri tarafından bozunamamaları ve boyutları (çok uzun ve ince olmaları) sebebiyle fagositozdan kaçarak ikincil genotoksisite oluştururlar. Asbest insan mesotelyal hücrelerinde nekroza sebep olur. Bunun sonucunda inflamasyon cevapları meydana gelir. Böylece mesotelyal hücreler kısmen korunmaya çalışılır. Fakat ikincil genotoksisite aracılı kronik inflamatuvar yanıt sonucunda fibrozis ve en sonda da mezotelyomaya sebep oldukları görülmüştür (Kane, Jean, Knuutila ve Jaurand, 2014).Yapılan çalışmalarla karbon nanotüpleri ile asbest arasında boy-en ve biyosüreklilik açısından paralellikler bulunmuştur. MWCNT'lerin periton içine verilmesiyle, asbeste benzer yanıtlarla inflamasyon oluşturduğu ve granülomaya sebep oldukları belirlenmiştir. 75 Meydana gelen kronik inflamasyon cevapları ile kanser arasında bir bağlantı olabileceği de düşünülmektedir (Wang ve diğerleri, 2014). Sonuç olarak nanopartiküllerin kullanım alanlarının bu kadar çok artması bu partiküllere maruziyeti kaçınılmaz hale getirmiştir. Özellikle metal oksit nanopartikülleri endüstride çok yaygın kullanım alanı olan nanopartiküllerdir ve benzersiz fizikokimyasal özelliklerinin yanında, çok farklı biyolojik etkileri de bulunmaktadır. Bu nedenle, metal oksit nanopartiküllerinin etkilerinin neler olabileceğinin anlaşılması büyük önem taşımaktadır. Bu amaçla bir çok çalışma yapılmaktadır ancak nanopartiküllerin etkilerinin neler olabileceğinin belirlenmesi çok zor olup, günümüzde yapılmış çalışmalar bu etkileri tam olarak açıklamakta yetersiz kalmaktadır. Çünkü nanopartikül çalışmaları çelişkili sonuçlar verebilmektedir. Gelecekte nanopartiküllerin etkilerinin anlaşılıp sınıflandırılmasını sağlamak amacıyla, nanopartiküller farklı test sistemlerinde ve farklı canlılarda çalışılmalıdır. Nanopartiküllere maruziyetin özellikle genetik materyalde oluşturabileceği etkilerin belirlenmesi çok önemlidir. Çünkü genetik materyalde meydana gelen değişimler mutasyonları ve hatta kanserli hücrelerin oluşumunu tetikleyebilir. Nanopartiküllerin doğrudan veya dolaylı etkilerle genetik materyalde riskler oluşturabildikleri görülmektedir. Bu nedenle nanopartiküllerin genotoksik riskleri, değişik test sitemleri ile ayrıntılı olarak incelenmeli ve belirlenmelidir. Bu çalışmalardan elde edilecek sonuçlar, hem bu partiküllerin genetik materyaldeki risklerinin ve hem de bunların çok geniş kullanım alanı bulan nanoteknolojideki risklerinin belirlenmesi açısından büyük önem taşımaktadır. Yapılan bu çalışmaya göre, hayatımızda yaygın kullanım alanı bulmaya başlayan CuO ve SiO2 nanopartikülleri, güvenilir bir test sitemi olan Allium cepa da hem mitotik indekste mitotik fazlarda değişimlere, hem de mitotik evrelerde kromozom anormallikler doğrudan veya dolaylı mekanizmalarla meydana getirmiştir. Ancak oluşan bu toksik cevaplarda hangi mekanizmaların etkili olduğunun net bir şekilde ortaya konulması yapılacak moleküler ve biyokimyasal çalışmalar ile gerçekleştirilebilecektir. Bu nedenle bizim yaptığımız çalışma sonuçlarından faydalanılarak ileride moleküler veya biyokimya çalışmaları da yapılabilecektir. Allium cepa’dan elde edilen sonuçların memeli test sitemlerinden elde edilen sonuçlarla oldukça yakınlık göstermesi nedeni ile, buradan elde edilen veriler diğer organizmalarda, özellikle insan için de zararlı olabileceğini göstermektedir. TEM analizi, CuO ve SiO2 nanopartiküllerinin bitkilere penetre olduğunu 76 göstermiştir. Nanopartiküllerin hücre içi komponentlere ulaşması, hücre bölünmesinde inhibitör etki oluşturduğu gibi yapışıklık, köprü, fragment, C-mitoz, geri-ileri kromozomlar ve kromatin köprüleri gibi anormalliklere de sebep olmuştur. Nanopartiküllerin bitki genetik materyalinde değişim oluşturabilmesi kötü huylu tümör oluşumunu veya bitki hastalıklarını tetikleyebilir. Hatta bitki mutasyonları oluşturarak gelecek nesillerdeki bireylerin de bundan etkilenmesine sebep olabilir. Bu etkiler direkt olarak bitki aracılı veya besin zinciri yoluyla diğer canlıları etkileyerek insanlara kadar ulaşabilir. Bu yüzden nanopartiküllerin zararlı etkilerinin en aza indirilmesi amacı ile daha fazla çalışma yapılarak bir sağlanmalıdır. an önce Bütün nanopartiküllerin bu bulgular, sınıflandırılarak nanomateryallerin bilinçli kullanılmaları genotoksik risklerinin belirlenmesinde, çevresel ve ekolojik sistemin bir parçası olan bitkilerin de değerlendirilmesi gerektiğini göstermektedir. Bu çalışmadan elde edilen veriler, nanopartiküllerin genotoksik riskleri konusunda hem kullanıcıların ve hem de üreticilerin bilgi sahibi olmasını sağlayacaktır. NP’lerin etkilerinin anlaşılması daha bilinçli ve daha güvenilir bir şekilde kullanılmalarını sağlayacaktır. NP’lerin özellikle genetik materyalde hasar oluşturup oluşturmadığının belirlenmesi, hem bu materyalleri kullanan bu gününün insanlarının ve hem de gelecek nesillerin sağlığı açısından büyük önem taşımaktadır. Genetik hasarlar vücut hücrelerinde gerçekleşirse, çeşitli hastalıklara ve en önemlisi de kanser oluşumuna sebep olurken, hasarın üreme hücrelerinde meydana gelmesi gelecek nesillerde büyük problemlere sebep olabilecektir. Kısaca bu tür çalışmalar hem nanopartiküllerin genotoksik risklerinin belirlenmesine ve hem de bunların gelecekte daha güvenli şekilde kullanımlarına imkan sağlayacaktır. 77 KAYNAKLAR Albertini, R. J., Anderson, D., Douglas, G. R., Hagmar, L., Hemminki, K., Merlo, F., Natarajan, A.T., Norppa, H., Shuker D. E. G., Tice, R., Waters, M. D., and Aitio, A. (2000). IPCS guidelines for the monitoring of genotoxic effects of carcinogens in humans. Mutation Research/Reviews in Mutation Research, 463(2), 111-172. Al-Rawi, M., Diabate, S., and Weiss, C. (2011). Uptake and intracellular localization of submicron and nano-sized SiO2 particles in HeLa cells. Archives of toxicology, 85(7), 813-826. Ames, B. N., McCann, J., and Yamasaki, E. (1975). Methods for detecting carcinogens and mutagens with the Salmonella/mammalian microsome mutagenicity test. Mutation Research/Environmental Mutagenesis and Related Subjects, 31(6), 347-363. Aoshima, H., Yamana, S., Nakamura, S., and Mashino, T. (2010). Biological safety of water-soluble fullerenes evaluated using tests for genotoxicity, phototoxicity, and pro-oxidant activity. The Journal of Toxicological Sciences, 35(3), 401-409. Arora, K., Singh, N., Srivastava, S., and Srivastava, A. (2014). Evaluation of genotoxic risks due to temporal changes in soil urea: using Allium cepa L. root rip bioassay. Cytologia, 79(1), 85-93. Arora, S., Rajwade, J. M., and Paknikar, K. M. (2012). Nanotoxicology and in vitro studies: The need of the hour. Toxicology and Applied Pharmacology, 258(2), 151165. Asare, N., Instanes, C., Sandberg, W. J., Refsnes, M., Schwarze, P., Kruszewski, M., and Brunborg, G. (2012). Cytotoxic and genotoxic effects of silver nanoparticles in testicular cells. Toxicology, 291(1), 65-72. Asharani, P. V., Hande, M. P., and, Valiyaveettil, S. (2009). Anti-proliferative activity of silver nanoparticles. BMC Cell Biology, 10(1), 65. AshaRani, P. V., Low Kah Mun, G., Hande, M. P., and Valiyaveettil, S. (2008). Cytotoxicity and genotoxicity of silver nanoparticles in human cells. ACS nano,3(2), 279-290. Ateeq, B., Abul-Farah, M., Niamat-Ali., M., and Ahmad, W. (2002). Clastogenicity of pentachlorophenol, 2, 4-D and butachlor evaluated by Allium root tip test. Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, 514(1), 105-113. Atha, D. H., Wang, H., Petersen, E. J., Cleveland, D., Holbrook, R. D., Jaruga, P., Dizdaroglu, M., Xing, B., and Nelson, B. C. (2012). Copper oxide nanoparticle mediated DNA damage in terrestrial plant models. Environmental Science and Technology, 46(3), 1819-1827. Auffan, M., Bottero, J. Y., Chaneac, C., and Rose, J. (2010). Inorganic manufactured nanoparticles: how their physicochemical properties influence their biological effects in aqueous environments. Nanomedicine, 5(6), 999-1007. 78 Auffan, M., Decome, L., Rose, J., Orsiere, T., De Meo, M., Briois, V., Chaneac, C., Olivi L., Berge-lefranc, J. L., Botta A., Wiesner M. R., and Bottero, J. Y., (2006). In vitro interactions between DMSA-coated maghemite nanoparticles and human fibroblasts: a physicochemical and cyto-genotoxical study. Environmental Science and Technology, 40(14), 4367-4373. Auffan, M., Rose, J., Orsiere, T., De Meo, M., Thill, A., Zeyons, O., Proux, O., Masion A., Perrine Chaurand, Olivier Spalla, Alain Botta, Mark R. Wiesner,and Bottero, J. Y. (2009). CeO2 nanoparticles induce DNA damage towards human dermal fibroblasts in vitro. Nanotoxicology, 3(2), 161-171. Bacchetta, R., Santo, N., Fascio, U., Moschini, E., Freddi, S., Chirico, G., Camatini, M., and Mantecca, P. (2012). Nano-sized CuO, TiO2 and ZnO affect Xenopus laevis development. Nanotoxicology, 6(4), 381-398. Badr, A. (1983). Mitodepressive and chromotoxic activities of two herbicides in Allium cepa. Cytologia, 48(3), 451-457. Balasubramanyam, A., Sailaja, N., Mahboob, M., Rahman, M. F., Hussain, S. M. and Grover, P. (2009). In vivo genotoxicity assessment of aluminium oxide nanomaterials in rat peripheral blood cells using the comet assay and micronucleus test. Mutagenesis, 24(3), 245-251. Bao-shan, L., Chun-hui, L., Li-jun, F., Shu-chun, Q. and Min, Y. (2004). Effect of TMS (nanostructured silicon dioxide) on growth of Changbai larch seedlings. Journal of Forestry Research, 15(2), 138-140. Barnes, C. A., Elsaesser, A., Arkusz, J., Smok, A., Palus, J., Lesniak, A., Salvati, A., Hanrahan, J. P., De Jong, W. H., Dziubałtowska, E., Stepnik, M., Rydzynski, M., McKerr,G., Lynch, I., Dawson, K. A., and Howard, C. V. (2008). Reproducible comet assay of amorphous silica nanoparticles detects no genotoxicity. Nano Letters, 8(9), 3069-3074. Barthlott, W., Neinhuis, C. (1997). Purity of the sacred lotus, or escape from contamination in biological surfaces. Planta, 202(1), 1-8. Berry, C. C., De La Fuente, J. M., Mullin, M., Chu, S. W. L., and Curtis, A. S. G. (2007). Notice of Violation of IEEE Publication Principles Nuclear Localization of HIV-1 Tat Functionalized Gold Nanoparticles. NanoBioscience, IEEE Transactions on, 6(4), 262-269. Birbaum, K., Brogioli, R., Schellenberg, M., Martinoia, E., Stark, W. J., Günther, D., and Limbach, L. K. (2010). No evidence for cerium dioxide nanoparticle translocation in maize plants. Environmental Science and Technology, 44(22), 8718-8723. Biswas, P., Wu, C. Y. (2005). Nanoparticles and the environment. Journal of the Air and Waste Management Association, 55(6), 708-746. Bolognesi, C. (2003). Genotoxicity of pesticides: a review of human biomonitoring studies. Mutation Research/Reviews in Mutation Research, 543(3), 251-272. 79 Britt, A. B. (1999). Molecular genetics of DNA repair in higher plants. Trends in Plant Science, 4(1), 20-25. Bulcke, F., Thiel, K., and Dringen, R. (2014). Uptake and toxicity of copper oxide nanoparticles in cultured primary brain astrocytes. Nanotoxicology, 8(7), 775-785. Buzea, C., Pacheco, I. I., and Robbie, K. (2007). Nanomaterials and nanoparticles: sources and toxicity. Biointerphases, 2(4), 17-71. Cameron, F. K. (1915). Soil colloids and the soil solution. The Journal of Physical Chemistry, 19(1), 1-13. Carpita, N. C., Gibeaut, D. M. (1993). Structural models of primary cell walls in flowering plants: consistency of molecular structure with the physical properties of the walls during growth. The Plant Journal, 3(1), 1-30. Cebulska-Wasilewska, A., Panek, A., Żabinski, Z., Moszczynski, P. and Au, W. W. (2005). Occupational exposure to mercury vapour on genotoxicity and DNA repair. Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, 586(2), 102-114. Chandirasekar, R., Kumar, B. L., Sasikala, K., Jayakumar, R., Suresh, K., Venkatesan, R., Jacob, R., Krishnapriya, E.K., Kavitha, H., Ganesh, G. K. (2014). Assessment of genotoxic and molecular mechanisms of cancer risk in smoking and smokeless tobacco users. Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, 767, 21-27. Chang, J. S., Chang, K. L. B., Hwang, D. F., and Kong, Z. L. (2007). In vitro cytotoxicitiy of silica nanoparticles at high concentrations strongly depends on the metabolic activity type of the cell line. Environmental Science and Technology, 41(6), 20642068. Chauhan, L. K. S., Dikshith, T. S. S., and Sundararaman, V. (1986). Effect of deltamethrin on plant cells cytological effects on the root meristems of Allium cepa Mutation Research/Genetic Toxicology, 171(1), 25-30. Chen, M., Mikecz, A. (2005). Formation of nucleoplasmic protein aggregates impairs nuclear function in response to SiO2 nanoparticles. Experimental Cell Research, 305(1), 51-62. Chen, Y. T., Wu, J. H., Tsai, F. J., Chang, Y. W., Hsu, S. H., Lin, J. J., and Liao, J. W. (2014). Genotoxicity tests of polystyrene comaleic anhydride-coated silver nanoparticles in vivo and in vitro. Journal of Experimental Nanoscience, 1-9. Chen, Y., Chen, J., Dong, J., and Jin, Y. (2004). Comparing study of the effect of nanosized silicon dioxide and microsized silicon dioxide on fibrogenesis in rats. Toxicology and İndustrial Health, 20(1-5), 21-27. 80 Chen, Z., Meng, H., Xing, G., Chen, C., Zhao, Y., Jia, G., Wang, T., Yuan, H., Ye, C., Zhao, F., Chai, Z., Zhu, C., Fang, X., Ma, B.,and Wan, L. (2006). Acute toxicological effects of copper nanoparticles in vivo. Toxicology Letters, 163(2), 109-120. Cho, W. S., Choi, M., Han, B. S., Cho, M., Oh, J., Park, K., Kim, S. J., Kim, S. H., Jeong, J., and Jeong, J. (2007). Inflammatory mediators induced by intratracheal instillation of ultrafine amorphous silica particles. Toxicology Letters, 175(1), 24-33. Clarkson, D. T. (1974). Ion transport and cell structure in plants. Biochemical Society Transactions, 3, 202–204. Colvin, V. L. (2003). The potential environmental impact of engineered nanomaterials. Nature biotechnology, 21(10), 1166-1170. Cooke, M. S., Evans, M. D., Dizdaroglu, M., and Lunec, J. (2003). Oxidative DNA damage: mechanisms, mutation, and disease. The FASEB Journal, 17(10), 11951214. Cursino, L., Li, Y., Zaini, P. A., De La Fuente, L., Hoch, H. C., and Burr, T. J. (2009). Twitching motility and biofilm formation are associated with tonB1 in Xylella fastidiosa. FEMS Microbiology Letters, 299(2), 193-199. Darlington, C. D., McLeish, J. (1951). Action of maleic hydrazide on the cell. Nature, 167, 407-408. Dashevskaya, S., Kopito, R. B., Friedman, R., Elbaum, M., and Epel, B. L. (2008). Diffusion of anionic and neutral GFP derivatives through plasmodesmata in epidermal cells of Nicotiana benthamiana. Protoplasma, 234(1-4), 13-23. Dekkers, S., Krystek, P., Peters, R. J., Lankveld, D. P., Bokkers, B. G., van HoevenArentzen, P. H., Bouwmeester, H., and Oomen, A. G. (2011). Presence and risks of nanosilica in food products. Nanotoxicology, 5(3), 393-405. Diallo, M. S. (2009). 11 Water Treatment by Dendrimer-Enhanced Filtration: Principles and Applications. Nanotechnology Applications for Clean Water: Solutions for Improving Water Quality, 143-155. Diallo, M. S., Christie, S., Swaminathan, P., Johnson, J. H., and Goddard, W. A. (2005). Dendrimer enhanced ultrafiltration. 1. Recovery of Cu (II) from aqueous solutions using Pamam dendrimers with ethylene diamine core and terminal NH 2 groups. Environmental Science and Technology, 39(5), 1366-1377. Dietz, K. J., Herth, S. (2011). Plant nanotoxicology. Trends in Plant Science, 16(11), 582589. Doak, S. H., Jenkins, G. J., Johnson, G. E., Quick, E., Parry, E. M., and Parry, J. M. (2007). Mechanistic influences for mutation induction curves after exposure to DNA-reactive carcinogens. Cancer Research, 67(8), 3904-3911. 81 Double, K. L. (2012). Neuronal vulnerability in Parkinson's disease. Parkinsonism and Related Disorders, 18, 52-54. Dusinska, M., Collins, A. (1996). Detection of oxidised purines and UV-induced photoproducts in DNA of single cells, by inclusion of lesion specific enzymes in the comet assay. Alternatives to Laboratory Animals, 24(3), 405-411. Ellegaard-Jensen, L., Jensen, K. A., and Johansen, A. (2012). Nano-silver induces doseresponse effects on the nematode Caenorhabditis elegan. Ecotoxicology and Environmental Safety, 80, 216-223. Eom, H. J., Choi, J. (2009). Oxidative stress of silica nanoparticles in human bronchial epithelial cell, Beas-2B. Toxicology in Vitro, 23(7), 1326-1332. Epel, D. (1963). The effects of carbon monoxide inhibition on ATP level and the rate of mitosis in the sea urchin egg. The Journal of Cell Biology, 17(2), 315-319. Etxeberria, E., Gonzalez, P., Baroja-Fernandez, E., and Romero, J. P. (2006). Fluid phase endocytic uptake of artificial nano-spheres and fluorescent quantum dots by sycamore cultured cells: evidence for the distribution of solutes to different intracellular compartments. Plant Signaling and Behavior, 1(4), 196. Faiyue, B., Al Azzawi, M. J., and Flowers, T. J. (2010). The role of lateral roots in bypass flow in rice (Oryza sativa L.). Plant, Cell and Environment, 33(5), 702-716. Falck, G. C. M., Lindberg, H. K., Suhonen, S., Vippola, M., Vanhala, E., Catalan, J., and Norppa, H. (2009). Genotoxic effects of nanosized and fine TiO2. Human and Experimental Toxicology, 28(6-7), 339-352. Farmen, L. (2009). Commercialization of nanotechnology for removal of heavy metals in drinking water. Nanotechnology Applications for Clean Water: Solutions for Improving Water Quality, 115-130. Federico, A., Morgillo, F., Tuccillo, C., Ciardiello, F., and Loguercio, C. (2007). Chronic inflammation and oxidative stress in human carcinogenesis.International Journal of Cancer, 121(11), 2381-2386. Fenech, M., Kirsch-Volders, M., Natarajan, A. T., Surralles, J., Crott, J. W., Parry, J., Norppa, H., Eastmond, D. A., Tucker, J. D., and Thomas, P. (2011). Molecular mechanisms of micronucleus, nucleoplasmic bridge and nuclear bud formation in mammalian and human cells. Mutagenesis, 26(1), 125-132. Ferguson, L. R., Denny, W. A. (2007). Genotoxicity of non-covalent interactions: DNA intercalators. Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis, 623(1), 14-23. Fernandes, T. C., Mazzeo, D. E. C., and Marin-Morales, M. A. (2007). Mechanism of micronuclei formation in polyploidizated cells of Allium cepa exposed to trifluralin herbicide. Pesticide Biochemistry and Physiology, 88(3), 252-259. 82 Fiskesjö, G. (1985). The Allium test as a standard in environmental monitoring. Hereditas, 102(1), 99-112. Folkmann, J. K., Risom, L., Jacobsen, N. R., Wallin, H., Loft, S., and Moller, P. (2009). Oxidatively damaged DNA in rats exposed by oral gavage to C60 fullerenes and single-walled carbon nanotubes. Environmental Health Perspectives, 117 (5),703708 Gajewicz, A., Rasulev, B., Dinadayalane, T. C., Urbaszek, P., Puzyn, T., Leszczynska, D., and Leszczynski, J. (2012). Advancing risk assessment of engineered nanomaterials: application of computational approaches. Advanced Drug Delivery Reviews, 64(15), 1663-1693. Galloway, S. M., Armstrong, M. J., Reuben, C., Colman, S., Brown, B., Cannon, C., Bloom, A. D., Nakamura, F., Ahmed, M., Duk, S., Rimpo, J., Margolin, B. H., Resnick, M. A., Anderson B., and Zeiger, E. (1987). Chromosome aberrations and sister chromatid exchanges in Chinese hamster ovary cells: evaluations of chemicals. Environmental and Molecular Mutagenesis, 10(10), 1-35. Garcia-Sagredo, J. M. (2008). Fifty years of cytogenetics: a parallel view of the evolution of cytogenetics and genotoxicology. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Gene Regulatory Mechanisms, 1779(6), 363-375. Gaulden, M. E. (1987). Hypothesis: some mutagens directly alter specific chromosomal proteins (DNA topoisomerase II and peripheral proteins) to produce chromosome stickiness, which causes chromosome aberrations. Mutagenesis, 2(5), 357-365. Geiser, M., Rothen-Rutishauser, B., Kapp, N., Schürch, S., Kreyling, W., Schulz, H., Semmler, M., Hof, V. I., Heyder, J., and Gehr, P. (2005). Ultrafine particles cross cellular membranes by nonphagocytic mechanisms in lungs and in cultured cells. Environmental Health Perspectives, 1555-1560. Goujon, E., Sta, C., Trivella, A., Goupil, P., Richard, C., and Ledoigt, G. (2014). Genotoxicity of sulcotrione pesticide and photoproducts on Allium cepa root meristem. Pesticide biochemistry and physiology, 113, 47-54. Ghodake, G., Seo, Y. D., and Lee, D. S. (2011). Hazardous phytotoxic nature of cobalt and zinc oxide nanoparticles assessed using Allium cepa. Journal of hazardous materials, 186(1), 952-955. Ghosh, M., Bandyopadhyay, M., and Mukherjee, A. (2010). Genotoxicity of titanium dioxide (TiO2) nanoparticles at two trophic levels: Plant and human lymphocytes. Chemosphere, 81(10), 1253-1262. Ghosh, M., Chakraborty, A., Bandyopadhyay, M., and Mukherjee, A. (2011). Multi-walled carbon nanotubes (MWCNT): Induction of DNA damage in plant and mammalian cells. Journal of Hazardous Materials, 197, 327-336. 83 Ginzkey, C., Steussloff, G., Koehler, C., Burghartz, M., Scherzed, A., Hackenberg, S., Hagen, R., and Kleinsasser, N. H. (2014). Nicotine derived genotoxic effects in human primary parotid gland cells as assessed in vitro by comet assay, cytokinesisblock micronucleus test and chromosome aberrations test. Toxicology in Vitro, 28(5), 838-846. Glover, B. J. (2000). Differentiation in plant epidermal cells. Journal of Experimental Botany, 51(344), 497-505. Gojova, A., Guo, B., Kota, R. S., Rutledge, J. C., Kennedy, I. M., and Barakat, A. I. (2007). Induction of inflammation in vascular endothelial cells by metal oxide nanoparticles: effect of particle composition. Environmental Health Perspectives, 115(31), 403-409. Gonzalez, L., Thomassen, L. C., Plas, G., Rabolli, V., Napierska, D., Decordier, I., Roelants, M., Hoet, P. H., Kirschhock, C. E. A., Martens, J. A., Lison, D., and Kirsch-Volders, M. (2010). Exploring the aneugenic and clastogenic potential in the nanosize range: A549 human lung carcinoma cells and amorphous monodisperse silica nanoparticles as models. Nanotoxicology, 4(4), 382-395. Gurr, J. R., Wang, A. S., Chen, C. H., and Jan, K. Y. (2005). Ultrafine titanium dioxide particles in the absence of photoactivation can induce oxidative damage to human bronchial epithelial cells. Toxicology, 213(1), 66-73. Hackenberg, S., Friehs, G., Froelich, K., Ginzkey, C., Koehler, C., Scherzed, A., Koehler, C., Marc Burghartz, Rudolf Hagen and Kleinsasser, N. (2010). Intracellular distribution, geno-and cytotoxic effects of nanosized titanium dioxide particles in the anatase crystal phase on human nasal mucosa cells. Toxicology Letters, 195(1), 9-14. Hackenberg, S., Scherzed, A., Technau, A., Kessler, M., Froelich, K., Ginzkey, C., Burghartz, M., Hagen, R., and Kleinsasser, N. (2011). Cytotoxic, genotoxic and proinflammatory effects of zinc oxide nanoparticles in human nasal mucosa cells in vitro. Toxicology in vitro, 25(3), 657-663. Hanagata, N., Zhuang, F., Connolly, S., Li, J., Ogawa, N., and Xu, M. (2011). Molecular responses of human lung epithelial cells to the toxicity of copper oxide nanoparticles inferred from whole genome expression analysis. ACS nano, 5(12), 9326-9338. Hanna, S. K., Miller, R. J., and Lenihan, H. S. (2014). Accumulation and toxicity of copper oxide engineered nanoparticles in a Marine Mussel. Nanomaterials, 4(3), 535-547. Hartwig, A. (1994). Role of DNA repair inhibition in lead and cadmium induced genotoxicity: a review. Environmental Health Perspectives, 102 (3), 45. Hartwig, A. (2013). Metal interaction with redox regulation: an integrating concept in metal carcinogenesis. Free Radical Biology and Medicine, 55, 63-72. Hischemöller, A., Nordmann, J., Ptacek, P., Mummenhoff, K., and Haase, M. (2009). Invivo imaging of the uptake of up conversion nanoparticles by plant roots. Journal of Biomedical Nanotechnology, 5(3), 278-284. 84 Hodur, N. M., Leistritz, F. L. (2007). Estimating the economic impact of event tourism: a review of issues and methods. Journal of Convention and Event Tourism, 8(4), 6379 Hoek, E. M., Ghosh, A. K. (2009). Nanotechnology-based membranes for water purification. Nanotechnology Applications for Clean Water, 5, 47. Hoshino, A., Fujioka, K., Oku, T., Suga, M., Sasaki, Y. F., Ohta, T., Ohta, T., Yasuhara, M., Suzuki, K., and Yamamoto, K. (2004). Physicochemical properties and cellular toxicity of nanocrystal quantum dots depend on their surface modification. Nano Letters,4(11), 2163-2169. Hoyt, V. W., Mason, E. (2008). Nanotechnology: emerging health issues. Journal of Chemical Health and Safety, 15(2), 10-15. Hung, Y. H., Bush, A. I., and La Fontaine, S. (2013). Links between copper and cholesterol in Alzheimer's disease. Frontiers in Physiology, 4, 111. Imlau, A., Truernit, E., and Sauer, N. (1999). Cell to cell and long-distance trafficking of the green fluorescent protein in the phloem and symplastic unloading of the protein into sink tissues. The Plant Cell Online, 11(3), 309-322. İnternet: Food and Agriculture Organization of the United Nations and World Health Organization.URL:http://www.webcitation.org/query?url=http%3A%2Fwhqlibdoc.c ho.int%2Fpublications%2F2010%2F9789241563932_eng.pdf&date=2014-11-05, Son Erişim Tarihi: 18.08.2014. İnternet:WoodrowWilsonURL:http://webcitation.org/query?url=http%3A%2F%2Fwww.n anotechproject.org%2Fcpi%2F8&date=2014-11-05, Son erişim tarihi: 18.08.2014. James, E. K., Olivares, F. L. (1998). Infection and colonization of sugar cane and other graminaceous plants by endophytic diazotrophs. Critical Reviews in Plant Sciences, 17(1), 77-119. Jenkins, G. J. S., Doak, S. H., Johnson, G. E., Quick, E., Waters, E. M., and Parry, J. M. (2005). Do dose response thresholds exist for genotoxic alkylating agents?. Mutagenesis, 20(6), 389-398. Jia, B., Mei, Y., Cheng, L., Zhou, J., and Zhang, L. (2012). Preparation of copper nanoparticles coated cellulose films with antibacterial properties through one-step reduction. ACS Applied Materials and İnterfaces, 4(6), 2897-2902. Jiang, J., Oberdörster, G., and Biswas, P. (2009). Characterization of size, surface charge, and agglomeration state of nanoparticle dispersions for toxicological studies. Journal of Nanoparticle Research, 11(1), 77-89. Jin, Y., Kannan, S., Wu, M., and Zhao, J. X. (2007). Toxicity of luminescent silica nanoparticles to living cells. Chemical Research in Toxicology, 20(8), 1126-1133. Johnston, C. T. (2010). Probing the nanoscale architecture of clay minerals. Clay Minerals, 45(3), 245-279. 85 Jomova, K., Baros, S. ve Valko, M. (2012). Redox active metal-induced oxidative stress in biological systems. Transition Metal Chemistry, 37(2), 127-134. Jumagazieva, D. S., Maslyakova, G. N., Suleymanova, L. V., Bucharskaya, A. B., Firsova, S. S., Khlebtsov, B. N., Terentyuk, G. S., Kong, S. M., Khlebtsov, N. G., and Khlebtsov, N. G. (2011). Mutagenic effect of gold nanoparticles in the micronucleus assay. Bulletin of Experimental Biology and Medicine, 151(6), 731-733. Kane, A. B., Jean, D., Knuutila, S., and Jaurand, M. C. (2014). Malignant mesothelioma: mechanism of carcinogenesis. In Occupational Cancers, 299-319. Karaismailoglu, M. C. (2014). Investigation of the Cytotoxic and genotoxic effects of Artemisia annua Methanol extract with the Allium test. Ekoloji, 23(91), 64-74. Karlsson, H. L. (2010). The comet assay in nanotoxicology research. Analytical and Bioanalytical Chemistry, 398(2), 651-666. Karlsson, H. L., Cronholm, P., Gustafsson, J., and Moller, L. (2008). Copper oxide nanoparticles are highly toxic: a comparison between metal oxide nanoparticles and carbon nanotubes. Chemical Research in Toxicology, 21(9), 1726-1732. Karlsson, H. L., Gustafsson, J., Cronholm, P., and Möller, L. (2009). Size-dependent toxicity of metal oxide particles a comparison between nano and micrometer size. Toxicology Letters, 188(2), 112-118. Kaur, G., Singh, H. P., Batish, D. R. ve Kohli, R. K. (2014). Pb-inhibited mitotic activity in onion roots involves DNA damage and disruption of oxidative metabolism. Ecotoxicology, 23(7), 1292-1304. Kawanishi, M., Ogo, S., Ikemoto, M., Totsuka, Y., Ishino, K., Wakabayashi, K., and Yagi, T. (2012). Genotoxicity and reactive oxygen species production induced by magnetite nanoparticles in mammalian cells. The Journal of Toxicological Sciences, 38(3), 503-511. Kennedy, C. B., Scott, S. D., and Ferris, F. G. (2004). Hydrothermal phase stabilization of 2-line ferrihydrite by bacteria. Chemical Geology, 212(3), 269-277. Kim, J. Y. (2005). Regulation of short-distance transport of RNA and protein. Current Opinion in Plant Biology, 8(1), 45-52. Kim, S., Lee, S., and Lee, I. (2012). Alteration of phytotoxicity and oxidant stress potential by metal oxide nanoparticles in Cucumis sativus. Water, Air, and Soil Pollution, 223(5), 2799-2806. Kisin, E. R., Murray, A. R., Keane, M. J., Shi, X. C., Schwegler-Berry, D., Gorelik, O., Arepalli, S., Castranova, V., Wallace, W. E., Kagan, V. E., and Shvedova, A. A. (2007). Single-walled carbon nanotubes: geno and cytotoxic effects in lung fibroblast V79 cells. Journal of Toxicology and Environmental Health, Part A, 70(24), 20712079. 86 Kiss, B., Biro, T., Czifra, G., Toth, B. I., Kertesz, Z., Szikszai, Z., and Hunyadi, J. (2008). Investigation of micronized titanium dioxide penetration in human skin xenografts and its effect on cellular functions of human skinderived cells. Experimental Dermatology, 17(8), 659-667. Klaine, S. J., Alvarez, P. J., Batley, G. E., Fernandes, T. F., Handy, R. D., Lyon, D. Y., Mahendra, S., McLaughlin, M. J., and Lead, J. R. (2008). Nanomaterials in the environment: behavior, fate, bioavailability, and effects. Environmental Toxicology and Chemistry, 27(9), 1825-1851. Konotop, Y. O., Kovalenko, M. S., Ulynets, V. Z., Meleshko, A. O., Batsmanova, L. M., and Taran, N. Y. (2014). Phytotoxicity of colloidal solutions of metal containing nanoparticles. Cytology and Genetics, 48(2), 99-102. Ku, G., Zhou, M., Song, S., Huang, Q., Hazle, J., and Li, C. (2012). Copper sulfide nanoparticles as a new class of photoacoustic contrast agent for deep tissue imaging at 1064 nm. ACS Nano, 6(8), 7489-7496. Kumari, M., Khan, S. S., Pakrashi, S., Mukherjee, A., and Chandrasekaran, N. (2011). Cytogenetic and genotoxic effects of zinc oxide nanoparticles on root cells of Allium cepa Journal of Hazardous Materials, 190(1), 613-621. Kumari, M., Mukherjee, A., and Chandrasekaran, N. (2009). Genotoxicity of silver nanoparticles in Allium cepa Science of the Total Environment, 407(19), 52435246. Kurepa, J., Paunesku, T., Vogt, S., Arora, H., Rabatic, B. M., Lu, J., Wanzer, M. B., Woloschak, G. E., and Smalle, J. A. (2010). Uptake and distribution of ultrasmall anatase TiO2 alizarin red S nanoconjugates in Arabidopsis thaliana. Nano letters, 10(7), 2296-2302. Laborie, M. P. (2009). Bacterial cellulose and its polymeric nanocomposites. The nanoscience and technology of renewable biomaterials. Wiley, Chichester, 231271. Laingam, S., Froscio, S. M., and Humpage, A. R. (2008). Flow-cytometric analysis of in vitro micronucleus formation: Comparative studies with WIL2-NS human lymphoblastoid and L5178Y mouse lymphoma cell lines. Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, 656(1), 19-26. Leary, S. P., Liu, C. Y., and Apuzzo, M. L. (2006). Toward the emergence of nanoneurosurgery: Part III Nanomedicine: Targeted nanotherapy, nanosurgery, and progress toward the realization of nanoneurosurgery. Neurosurgery, 58(6), 10091026. Lee, C. W., Mahendra, S., Zodrow, K., Li, D., Tsai, Y. C. Braam, J., and Alvarez, P. J. (2010). Developmental phytotoxicity of metal oxide nanoparticles to Arabidopsis thaliana. Environmental Toxicology and Chemistry, 29(3), 669-675. 87 Lee, W. M., An, Y. J., Yoon, H., and Kweon, H. S. (2008). Toxicity and bioavailability of copper nanoparticles to the terrestrial plants mung bean (Phaseolus radiatus) and wheat (Triticum aestivum): Plant agar test for water insoluble nanoparticles. Environmental Toxicology and Chemistry, 27(9), 1915-1921. Leme, D. M., Marin-Morales, M. A. (2009). Allium cepa test in environmental monitoring: A review on its application. Mutation Research/Reviews in Mutation Research, 682(1), 71-81. Leme, D. M., Angelis, D. D. F. D., and Marin-Morales, M. A. (2008). Action mechanisms of petroleum hydrocarbons present in waters impacted by an oil spill on the genetic material of Allium cepa root cells. Aquatic Toxicology, 88(4), 214-219. Li, C., Wang, Z., Wang, P. I., Peles, Y., Koratkar, N., and Peterson, G. P. (2008). Nanostructured copper interfaces for enhanced boiling. Small, 4(8), 1084-1088. Li, F., Ambrosini, G., Chu, E. Y., Plescia, J., Tognin, S., Marchisio, P. C., and Altieri, D. C. (1998). Control of apoptosis and mitotic spindle checkpoint by survivin. Nature, 396(6711), 580-584. Li, Y., Chen, D. H., Yan, J., Chen, Y., Mittelstaedt, R. A., Zhang, Y., Biris, A. S., Heflich, R. H., and Chen, T. (2012). Genotoxicity of silver nanoparticles evaluated using the Ames test and in vitro micronucleus assay. Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, 745(1), 4-10. Lia, X., Kondoh, M., Watari, A., Hasezaki, T., Isoda, K., Tsutsumi, Y., and Yagi, K. (2011). Effect of 70-nm silica particles on the toxicity of acetaminophen, tetracycline, trazodone, and 5-aminosalicylic acid in mice. Die Pharmazie-An International Journal of Pharmaceutical Sciences, 66(4), 282-286. Liang, Y., Sun, W., Zhu, Y. G., and Christie, P. (2007). Mechanisms of silicon-mediated alleviation of abiotic stresses in higher plants: a review. Environmental Pollution, 147(2), 422-428. Lin, D., Xing, B. (2007). Phytotoxicity of nanoparticles: inhibition of seed germination and root growth. Environmental Pollution, 150(2), 243-250. Lin, D. ve Xing, B. (2008). Root uptake and phytotoxicity of ZnO nanoparticles. Environmental Science and Technology, 42(15), 5580-5585. Lin, S., Reppert, J., Hu, Q., Hudson, J. S., Reid, M. L., Ratnikova, T. A., Rao, A. M., Luo H., and Ke, P. C. (2009). Uptake, translocation, and transmission of carbon nanomaterials in rice plants. Small, 5(10), 1128-1132. Liman, R. (2013). Genotoxic effects of bismuth (III) oxide nanoparticles by Allium and comet assay. Chemosphere, 93(2), 269-273. Lison, D., Thomassen, L. C., Rabolli, V., Gonzalez, L., Napierska, D., Seo, J. W., KirschVolders, M., Hoet, P., Kirschhock C. E. A., and Martens, J. A. (2008). Nominal and effective dosimetry of silica nanoparticles in cytotoxicity assays. Toxicological Sciences, 104(1), 155-162. 88 Liu, C., Xie, X., and Cui, Y. (2012). Antimicrobial nanomaterials for water disinfection. Nano-Antimicrobials, 465-494. Liu, Q., Chen, B., Wang, Q., Shi, X., Xiao, Z., Lin, J., and Fang, X. (2009). Carbon nanotubes as molecular transporters for walled plant cells. Nano letters, 9(3), 10071010. Long, T. C., Saleh, N., Tilton, R. D., Lowry, G. V., and Veronesi, B. (2006). Titanium dioxide (P25) produces reactive oxygen species in immortalized brain microglia (BV2): implications for nanoparticle neurotoxicity. Environmental Science and Technology, 40(14), 4346-4352. Ma, F., Chen, R., Li, P., Zhang, Q., Zhang, W., and Hu, X. (2013). Preparation of an immunoaffinity column with amino-silica gel microparticles and its application in sample cleanup for aflatoxin detection in agri products. Molecules, 18(2), 22222235. Ma, J. F., Yamaji, N. (2006). Silicon uptake and accumulation in higher plants. Trends in Plant Science, 11(8), 392-397. Ma, T. H., Xu, Z., Xu, C., McConnell, H., Valtierra Rabago, E., Adriana Arreola, G., and Zhang, H. (1995). The improved Allium/Vicia root tip micronucleus assay for clastogenicity of environmental pollutants. Mutation Research/Environmental Mutagenesis and Related Subjects, 334(2), 185-195. Madia, F., Phrakonkham, P., and Corvi, R. (2014). Current and Emerging In Vitro Methods for Genotoxicity and Carcinogenicity. In Vitro Toxicology Systems , 307332. Magdolenova, Z., Collins, A., Kumar, A., Dhawan, A., Stone, V., and Dusinska, M. (2014). Mechanisms of genotoxicity. A review of in vitro and in vivo studies with engineered nanoparticles. Nanotoxicology, 8(3), 233-278. Michalska-Kacymirow, M., Kurek, E., Smolis, A., Wierzbicka, M., and Bulska, E. (2014). Biological and chemical investigation of Allium cepa L. response to selenium inorganic compounds. Analytical and Bioanalytical Chemistry, 406(15), 3717-3722. Miralles, P., Church, T. L., and Harris, A. T. (2012). Toxicity, uptake, and translocation of engineered nanomaterials in vascular plants. Environmental Science and Technology, 46(17), 9224-9239. Molina, M. A., Ramos, J. L., and Espinosa‐Urgel, M. (2006). A two partner secretion system is involved in seed and root colonization and iron uptake by Pseudomonas putida KT2440. Environmental Microbiology, 8(4), 639-647. Monica, R. C., Cremonini, R. (2009). Nanoparticles and higher plants. Caryologia, 62(2), 161-165. 89 Morawska, L., Ristovski, Z., Jayaratne, E. R., Keogh, D. U., and Ling, X. (2008). Ambient nano and ultrafine particles from motor vehicle emissions: characteristics, ambient processing and implications on human exposure. Atmospheric Environment, 42(35), 8113-8138. Mortelmans, K., Zeiger, E. (2000). The Ames Salmonella microsome mutagenicity assay. Mutation Research/Fundamental and Molecular Mechanisms of Mutagenesis, 455(1), 29-60. Mosesso, P., Cinelli, S., Natarajan, A. T., and Palitti, F. (2013). In Vitro cytogenetic assays: Chromosomal aberrations and micronucleus tests. Genotoxicity Assessment Humana Press, 123-146. Mushtaq ,Y.K. (2011). Effect of nanoscale Fe3O4, TiO2 and carbon particles on cucumber seed germination. Journal of Environmental Science and Health, Part A, 46(14), 1732-1735. Nabiev, I., Mitchell, S., Davies, A., Williams, Y., Kelleher, D., Moore, R., Gunko, Y, K.,Byrne, S., Rakovich, Y. P.,Donegan, J. F., Sukhanova, A., Conroy, J., Cottell, D., Gaponik, N., Rogach, A., and Volkov, Y. (2007). Nonfunctionalized nanocrystals can exploit a cells active transport machinery delivering them to specific nuclear and cytoplasmic compartments. Nano Letters, 7(11), 3452-3461. Napierska, D., Thomassen, L. C., Rabolli, V., Lison, D., Gonzalez, L., Kirsch-Volders, M., Martens, J. A., and Hoet, P. H. (2009). Size Dependent Cytotoxicity of Monodisperse Silica Nanoparticles in Human Endothelial Cells. Small, 5(7), 846853. Navarro, E., Baun, A., Behra, R., Hartmann, N. B., Filser, J., Miao, A. J., Quigg, A., Santschi, P. H., and Sigg, L. (2008). Environmental behavior and ecotoxicity of engineered nanoparticles to algae, plants, and fungi. Ecotoxicology, 17(5), 372-386. Nekrasova, G. F., Ushakova, O. S., Ermakov, A. E., Uimin, M. A., and Byzov, I. V. (2011). Effects of copper (II) ions and copper oxide nanoparticles on Elodea densa Planch. Russian Journal of Ecology, 42(6), 458-463. Nel, A., Xia, T., Mädler, L., and Li, N. (2006). Toxic potential of materials at the nanolevel. Science, 311(5761), 622-627. Nielsen, M. H., Rank, J. (1994). Screening of Toxicity and genotoxicity in wastewater by the use of the use of the Allium test. Hereditas, 121(3), 249-254. Nirmala, R., Park, H. M., Kalpana, D., Kang, H. S., Navamathavan, R., Lee, Y. S., and Kim, H. Y. (2011). Bactericidal activity and in vitro cytotoxicity assessment of hydroxyapatite containing gold nanoparticles. Journal of Biomedical Nanotechnology, 7(3), 342-350. Nishimori, H., Kondoh, M., Isoda, K., Tsunoda, S. I., Tsutsumi, Y., and Yagi, K. (2009). Silica nanoparticles as hepatotoxicants. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics, 72(3), 496-501. 90 Njagi, G. D. E., and Gopalan, H. N. B. (1982). Cytogenetic effects of the food preservatives sodium benzoate and sodium sulphite on Vicia faba root meristems. Mutation Research/Genetic Toxicology, 102(3), 213-219. Noonan, C. W., Pfau, J. C., Larson, T. C., and Spence, M. R. (2006). Nested case-control study of autoimmune disease in an asbestos-exposed population. Environmental Health Perspectives, 1243-1247. Nowack, B., Bucheli, T. D. (2007). Occurrence, behavior and effects of nanoparticles in the environment. Environmental Pollution, 150(1), 5-22. Oberdörster, E., Zhu, S., Blickley, T. M., McClellan-Green, P., and Haasch, M. L. (2006). Ecotoxicology of carbon-based engineered nanoparticles: Effects of fullerene on aquatic organisms. Carbon, 44(6), 1112-1120. Österberg, R., Persson, D., and Bjursell, G. (1984). The condensation of DNA by chromium (III) ions. Journal of Biomolecular Structure and Dynamics, 2(2), 285290. Pakrashi, S., Jain, N., Dalai, S., Jayakumar, J., Chandrasekaran, P. T., Raichur, A. M., Chandrasekaran, N., and Mukherjee, A. (2014). In Vivo genotoxicity assessment of titanium dioxide nanoparticles by Allium cepa root tip assay at high exposure concentrations. PloS one, 9(2), 87789. Pandey, H., Kumar, V., and Roy, B. K. (2014). Assessment of genotoxicity of some common food preservatives using Allium cepa L. as a test plant. Toxicology Reports, 1, 300-308. Parashar, U. K., Kumar, V., Bera, T., Saxena, P. S., Nath, G., Srivastava, S. K., Giri, R., and Srivastava, A. (2011). Study of mechanism of enhanced antibacterial activity by green synthesis of silver nanoparticles. Nanotechnology, 22(41), 415104. Park, E. J., Park, K. (2009). Oxidative stress and pro-inflammatory responses induced by silica nanoparticles in vivo and in vitro. Toxicology Letters, 184(1), 18-25. Park, M. V., Verharen, H. W., Zwart, E., Hernandez, L. G., van Benthem, J., Elsaesser, A., Barnes, C., McKerr, G., Howard, C. V., Salvati, A., Lynch, I., Dawson, K. A., and de Jong, W. H. (2011). Genotoxicity evaluation of amorphous silica nanoparticles of different sizes using the micronucleus and the plasmid lacZ gene mutation assay. Nanotoxicology, 5(2), 168-181. Patil, B. C., Bhat, G. I. (1992). A comparative study of MH and EMS in the induction of chromosomal aberrations on lateral root meristem in Clitoria ternatea L. Cytologia, 57(2), 259-264. Patlolla, A. K., Berry, A., May, L., and Tchounwou, P. B. (2012). Genotoxicity of silver nanoparticles in Vicia faba: a pilot study on the environmental monitoring of nanoparticles. International Journal of Environmental Research and Public Health, 9(5), 1649-1662. 91 Paul, A., Nag, S., and Sinha, K. (2013). Cytological effects of blitox on root mitosis of Allium cepa. International Journals of Scientific Research Publications, 3(5), 1-7. Pekol, S. (2014). Ecotoxicological assessment of metalworking fluids using the Allium cepa test procedure. Chemistry and Ecology, 30(1), 66-75. Penn, A., Murphy, G., Barker, S., Henk, W., and Penn, L. (2005). Combustion-derived ultrafine particles transport organic toxicants to target respiratory cells. Environmental Health Perspectives, 113(8), 956-963. Peters, A., Veronesi, B., Calderón-Garciduenas, L., Gehr, P., Chen, L. C., Geiser, M., Reed, W., Rothen-Rutishauser, B., Schürch, S., and Schulz, H. (2006). Translocation and potential neurological effects of fine and ultrafine particles a critical update. Particle and Fibre Toxicology, 3(13), 1-13. Petkovic, J., Zegura, B., Stevanovic, M., Drnovsek, N., Uskokovic, D., Novak, S., and FilipiC, M. (2011). DNA damage and alterations in expression of DNA damage responsive genes induced by TiO2 nanoparticles in human hepatoma HepG2 cells. Nanotoxicology, 5(3), 341-353. Pilon-Smits, E. A., Quinn, C. F., Tapken, W., Malagoli, M., and Schiavon, M. (2009). Physiological functions of beneficial elements. Current Opinion in Plant Biology, 12(3), 267-274. Proseus, T. E., Boyer, J. S. (2005). Turgor pressure moves polysaccharides into growing cell walls of Chara corallina. Annals of Botany, 95(6), 967-979. Quinn, J., Geiger, C., Clausen, C., Brooks, K., Coon, C., O Hara, S., and Holdsworth, T. (2005). Field demonstration of DNAPL dehalogenation using emulsified zero-valent iron. Environmental Science and Technology, 39(5), 1309-1318. Rai, M., Deshmukh, S. and Gade, A. (2012). Strategic nanoparticle mediated gene Transfer in plants and animals a novel approach. Current Nanoscience, 8(1), 170-179. Ramos-Gonzalez, M. I., Campos, M. J., and Ramos, J. L. (2005). Analysis of Pseudomonas putida KT2440 gene expression in the maize rhizosphere: in vitro expression technology capture and identification of root-activated promoters. Journal of Bacteriology, 187(12), 4033-4041. Rana, S. V. S. (2008). Metals and apoptosis: recent developments. Journal of Trace Elements in Medicine and Biology, 22(4), 262-284. Rank, J., Nielsen, M. H. (1993). A modified Allium test as a tool in the screening of the genotoxicity of complex mixtures. Hereditas, 118(1), 49-53. Rank, J., Nielsen, M. H. (1994). Evaluation of the Allium anaphase-telophase test in relation to genotoxicity screening of industrial wastewater. Mutation Research/Environmental Mutagenesis and Related Subjects, 312(1), 17-24. 92 Rank, J., Nielsen, M. H. (1997). Allium cepa anaphase–telophase root tip chromosome aberration assay on N-methyl-N-nitrosourea, maleic hydrazide, sodium azide, and ethyl methanesulfonate. Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, 390(1), 121-127. Raven, J. A., Evans, M. C., and Korb, R. E. (1999). The role of trace metals in photosynthetic electron transport in O2 evolving organisms. Photosynthesis Research, 60(2-3), 111-150. Remedios, C., Rosario, F., and Bastos, V. (2012). Environmental nanoparticles interactions with plants: morphological, physiological, and genotoxic aspects. Journal of Botany, 2012, 8. Rubilar, O., Rai, M., Tortella, G., Diez, M. C., Seabra, A. B., and Durán, N. (2013). Biogenic nanoparticles: copper, copper oxides, copper sulphides, complex copper nanostructures and their applications. Biotechnology Letters, 35(9), 1365-1375. Sahu, D., Vijayaraghavan, R., and Kannan, G. M. (2014). Silica nanoparticle induces oxidative stress and provokes inflammation in human lung cells. Journal of Experimental Nanoscience, (Baskıda), 1-18. Saison, C., Perreault, F., Daigle, J. C., Fortin, C., Claverie, J., Morin, M., and Popovic, R. (2010). Effect of core shell copper oxide nanoparticles on cell culture morphology and photosynthesis (photosystem II energy distribution) in the green alga, Chlamydomonas reinhardti. Aquatic Toxicology, 96(2), 109-114. Savage, J., R., (1975), Classification and relationships of induced structural changes Journal of Medical Genetics, 12, 103–122 Saygılı, Y. (2014). Bazı Nanopartiküllerin (CuO, Fe2O3, SiO2) İnvitro Periferal İnsan Lenfositlerinde Genotoksik Etkileri, Devam eden Doktora Tezi, Gazi Üniversitesi Eğitim Bilimleri Enstitüsü, Ankara. Scheiber, I. F., Mercer, J. F., and Dringen, R. (2014). Metabolism and functions of copper in brain. Progress in Neurobiology, 116, 33-57. Schreiber, L. (2010). Transport barriers made of cutin, suberin and associated waxes. Trends in Plant Science, 15(10), 546-553. Schwerdtle, T., Hamann, I., Jahnke, G., Walter, I., Richter, C., Parsons, J. L., Dianov, G., and Hartwig, A. (2007). Impact of copper on the induction and repair of oxidative DNA damage, poly (ADP ribosyl) ation and PARP1 activity. Molecular Nutrition and Food Research, 51(2), 201-210. Scott, N., Chen, H. (2013). Nanoscale science and engineering for agriculture and food systems. Industrial Biotechnology, 9(1), 17-18. Semisch, A., Ohle, J., Witt, B., and Hartwig, A. (2014). Cytotoxicity and genotoxicity of nano-and microparticulate copper oxide: role of solubility and intracellular bioavailability. Particle and Fibre Toxicology, 11(10). 93 Shahin, S. A., and El-Amoodi, K. H. (1991). Induction of numerical chromosomal aberrations during DNA synthesis using the fungicides nimrod and rubigan-4 in root tips of Vicia faba L. Mutation Research/Genetic Toxicology, 261(3), 169-176. Shane, M. W., McCully, M. E., and Canny, M. J. (2000). The vascular system of maize stems revisited: Implications for water transport and xylem safety. Annals of Botany, 86(2), 245-258. Sharma, V., Singh, S. K., Anderson, D., Tobin, D. J., and Dhawan, A. (2011). Zinc oxide nanoparticle induced genotoxicity in primary human epidermal keratinocytes. Journal of Nanoscience and Nanotechnology, 11(5), 3782-3788. Shaw, A. K., Hossain, Z. (2013). Impact of nano-CuO stress on rice (Oryza sativa L.) seedlings. Chemosphere, 93(6), 906-915. Shaymurat, T., Gu, J., Xu, C., Yang, Z., Zhao, Q., Liu, Y., and Liu, Y. (2012). Phytotoxic and genotoxic effects of ZnO nanoparticles on garlic (Allium sativum L.): A morphological study. Nanotoxicology, 6(3), 241-248. Shi, J., Abid, A. D., Kennedy, I. M., Hristova, K. R., and Silk, W. K. (2011). To duckweeds (Landoltia punctata), nanoparticulate copper oxide is more inhibitory than the soluble copper in the bulk solution. Environmental Pollution, 159(5), 12771282. Shibai-Ogata, A., Tahara, H., Yamamoto, Y., Fujita, M., Satoh, H., Yuasa, A., and Kasahara, T. (2014). An automated new technique for scoring the in vivo micronucleus assay with image analysis. Mutagenesis, 29(1), 63-71. Shukla, R. K., Sharma, V., Pandey, A. K., Singh, S., Sultana, S., and Dhawan, A. (2011). ROS-mediated genotoxicity induced by titanium dioxide nanoparticles in human epidermal cells. Toxicology in Vitro, 25(1), 231-241. Shvedova, A. A., Pietroiusti, A., Fadeel, B., and Kagan, V. E. (2012). Mechanisms of carbon nanotube-induced toxicity: focus on oxidative stress. Toxicology and Applied Pharmacology, 261(2), 121-133. Simkiss, K. (1990). Surface effects in ecotoxicology. Functional Ecology, 303-308. Singh, N. P., McCoy, M. T., Tice, R. R., and Schneider, E. L. (1988). A simple technique for quantitation of low levels of DNA damage in individual cells. Experimental Cell Research, 175(1), 184-191. Singh, N., Jenkins, G. J., Asadi, R., and Doak, S. H. (2010). Potential toxicity of super paramagnetic iron oxide nanoparticles (SPION). Nano Reviews, 1. Singh, N., Manshian, B., Jenkins, G. J., Griffiths, S. M., Williams, P. M., Maffeis, T. G., Wright, C. J., and Doak, S. H. (2009). NanoGenotoxicology: the DNA damaging potential of engineered nanomaterials. Biomaterials, 30(23), 3891-3914. Steudle, E., Peterson, C. A. (1998). How does water get through roots?. Journal of Experimental Botany, 49(322), 775-788. 94 Stone, V., Nowack, B., Baun, A., van den Brink, N., von der Kammer, F., Dusinska, M., Handy, R., Hankin, S., Hassellöv, M., Joner, E., and Fernandes, T. F. (2010). Nanomaterials for environmental studies: classification, reference material issues, and strategies for physico-chemical characterisation. Science of the Total Environment, 408(7), 1745-1754. Sung, J. H., Ji, J. H., Yoon, J. U., Kim, D. S., Song, M. Y., Jeong, J., Han, B. S., Han, J. H., Chung, Y. H., Kim, J., Kim, T. S., Chang, H. K., Lee, E. J., Lee, J. H., and Yu, I. J. (2008). Lung function changes in Sprague-Dawley rats after prolonged inhalation exposure to silver nanoparticles. Inhalation Toxicology, 20(6), 567-574. Şahin, S. Su arıtma teknolojisindeki kolloidlerin kararlılık esasları. (2008)., Fen Bilimleri Enstitüsü Dergisi, 1(2). Tan, D., Bai, B., Jiang, D., Shi, L., Cheng, S., Tao, D., and Ji, S. (2014). Rhodamine B induces long nucleoplasmic bridges and other nuclear anomalies in Allium cepa root tip cells. Environmental Science and Pollution Research, 21(5), 3363-3370. Tavares, A. M., Louro, H., Antunes, S., Quarre, S., Simar, S., De Temmerman, P. J., Verleysen, E., Mast, J., Keld A. Jensen, K. A., Norppa, H., Nesslany, F., and Silva, M. J. (2014). Genotoxicity evaluation of nanosized titanium dioxide, synthetic amorphous silica and multi-walled carbon nanotubes in human lymphocytes. Toxicology in Vitro, 28(1), 60-69. Thill, A., Zeyons, O., Spalla, O., Chauvat, F., Rose, J., Auffan, M., and Flank, A. M. (2006). Cytotoxicity of CeO2 nanoparticles for Escherichia coli. Physico-chemical insight of the cytotoxicity mechanism. Environmental Science and Technology, 40(19), 6151-6156. Tian, F., Cui, D., Schwarz, H., Estrada, G. G., and Kobayashi, H. (2006). Cytotoxicity of single-wall carbon nanotubes on human fibroblasts. Toxicology in Vitro, 20(7), 1202-1212. Topaktaş, M., Rencüzoğullar, E. (1993). Chromosomal aberrations in cultured human lymphocytes treated with Marshal and its effective ingredient carbosulfan. Mutation Research/Genetic Toxicology, 319(2), 103-111. Tran, N., Mir, A., Mallik, D., Sinha, A., Nayar, S., and Webster, T. J. (2010). Bactericidal effect of iron oxide nanoparticles on Staphylococcus aureus. International Journal of Nanomedicine, 5, 277. Tratnyek, P. G., and Johnson, R. L. (2006). Nanotechnologies for environmental cleanup. Nano Today, 1(2), 44-48. Trouiller, B., Reliene, R., Westbrook, A., Solaimani, P., and Schiestl, R. H. (2009). Titanium dioxide nanoparticles induce DNA damage and genetic instability in vivo in mice. Cancer Research, 69(22), 8784-8789. 95 Türkoğlu, Ş. (2012). Determination of genotoxic effects of chlorfenvinphos and fenbuconazole in Allium cepa root cells by mitotic activity, chromosome aberration, DNA content, and comet assay. Pesticide Biochemistry and Physiology, 103(3), 224-230. Unrine, J. M., Hunyadi, S. E., Tsyusko, O. V., Rao, W., Shoults-Wilson, W. A., and Bertsch, P. M. (2010). Evidence for bioavailability of Au nanoparticles from soil and biodistribution within earthworms (Eisenia fetida). Environmental Science and Technology, 44(21), 8308-8313. Varshney, M., Chandra, A., Chauhan, L. K. S., and Goel, S. K. (2014). In vitro cytogenetic assessment of trichloroacetic acid in human peripheral blood lymphocytes. Environmental Science and Pollution Research, 21(2), 843-850. Vega-Villa, K. R., Takemoto, J. K., Yánez, J. A., Remsberg, C. M., Forrest, M. L., and Davies, N. M. (2008). Clinical toxicities of nanocarrier systems. Advanced Drug Delivery Reviews, 60(8), 929-938. Vermeulen, K., Van Bockstaele, D. R., and Berneman, Z. N. (2003). The cell cycle: a review of regulation, deregulation and therapeutic targets in cancer. Cell Proliferation, 36(3), 131-149. Vivero-Escoto, J. L., Slowing, I. I., Trewyn, B. G., and Lin, V. S. Y. (2010). Mesoporous silica nanoparticles for intracellular controlled drug delivery. Small, 6(18), 19521967. Vodicka, P., Kumar, R., Stetina, R., Sanyal, S., Soucek, P., Haufroid, V., Maria Dusinska, M., Kuricova, M., Zamecnikova, M., Musak, L., Buchancova, J., Norppa, H., Hirvonen, A., Vodickova, L., Naccarati1, A., Matousu Z., and Hemminki, K. (2004). Genetic polymorphisms in DNA repair genes and possible links with DNA repair rates, chromosomal aberrations and single-strand breaks in DNA. Carcinogenesis, 25(5), 757-763. Voutsinas, G., Zarani, F. E., and Kappas, A. (1997). The Effect of Environmental Aneuploidy Inducing Agents on The Microtubule Architecture of Mitotic Meristematic Root Cells in Hordeum Vulgare. Cell Biology İnternational, 21(7), 411-418. Wang, C., Ma, Q., Dou, W., Kanwal, S., Wang, G., Yuan, P., and Su, X. (2009). Synthesis of aqueous CdTe quantum dots embedded silica nanoparticles and their applications as fluorescence probes. Talanta, 77(4), 1358-1364. Wang, J. J., Sanderson, B. J., and Wang, H. (2007). Cytotoxicity and genotoxicity of ultrafine crystalline SiO2 particulate in cultured human lymphoblastoid cells. Environmental and Molecular Mutagenesis, 48(2), 151-157. Wang, L. S., Chuang, M. C., and Ho, J. A. A. (2012). Nanotheranostics a review of recent publications. International Journal of Nanomedicine, 7, 4679. 96 Wang, L., Stueckle, T. A., Mishra, A., Derk, R., Meighan, T., Castranova, V., and Rojanasakul, Y. (2014). Neoplastic-like transformation effect of single-walled and multi-walled carbon nanotubes compared to asbestos on human lung small airway epithelial cells. Nanotoxicology, 8(5), 485-507. Webster, P. L., and Davidson, D. (1969). Changes in the duration of the mitotic cycle induced by colchicine and indol-3yl-acetic acid in Vicia faba roots. Journal of Experimental Botany, 20(3), 671-685. Wierzbicka, M. (1998). Lead in the apoplast of Allium cepa L. root tips ultrastructural studies. Plant Science, 133(1), 105-119. Wiesner, M. R., Lowry, G. V., Alvarez, P., Dionysiou, D., and Biswas, P. (2006). Assessing the risks of manufactured nanomaterials. Environmental Science and Technology, 40(14), 4336-4345. Win-Shwe, T. T., and Fujimaki, H. (2011). Nanoparticles and neurotoxicity. International Journal of Molecular Sciences, 12(9), 6267-6280. Woodruff, R. S., Li, Y., Yan, J., Bishop, M., Jones, M. Y., Watanabe, F., Biris, A. S., Rice, P., Zhou, T., and Chen, T. (2012). Genotoxicity evaluation of titanium dioxide nanoparticles using the ames test and comet assay. Journal of Applied Toxicology, 32(11), 934-943. Wu, J., Wang, C., Sun, J., and Xue, Y. (2011). Neurotoxicity of silica nanoparticles: brain localization and dopaminergic neurons damage pathways. ACS nano, 5(6), 44764489. Xia, T., Kovochich, M., Brant, J., Hotze, M., Sempf, J., Oberley, T., Sioutas, C., Yeh, J. I., Wiesner, M. R., and Nel, A. E. (2006). Comparison of the abilities of ambient and manufactured nanoparticles to induce cellular toxicity according to an oxidative stress paradigm. Nano Letters, 6(8), 1794-1807. Xiong, Z. T., Wang, H. (2005). Copper toxicity and bioaccumulation in Chinese cabbage (Brassica pekinensis Rupr.). Environmental Toxicology, 20(2), 188-194. Xu, J., Sagawa, Y., Futakuchi, M., Fukamachi, K., Alexander, D. B., Furukawa, F., Ikarashi, Y., Uchino, T., Nishimura, T., Morita, A., Suzui, M., and Tsuda, H. (2011). Lack of promoting effect of titanium dioxide particles on ultraviolet B-initiated skin carcinogenesis in rats. Food and Chemical Toxicology, 49(6), 1298-1302. Xu, Y., Zhao, D. (2006). Removal of lead from contaminated soils using poly (amidoamine) dendrimers. Industrial and Engineering Chemistry Research, 45(5), 1758-1765. Yamakoshi, Y., Umezawa, N., Ryu, A., Arakane, K., Miyata, N., Goda, Y., Masumizu, T., and Nagano, T. (2003). Active oxygen species generated from photoexcited fullerene (C60) as potential medicines: O2-versus O2. Journal of the American Chemical Society, 125(42), 12803-12809. 97 Yang, X., Liu, J., He, H., Zhou, L., Gong, C., Wang, X., Yang, L., Yuan J., Huang H., He L., Zhang, B., and Zhuang, Z. (2010). SiO2 nanoparticles induce cytotoxicity and protein expression alteration in HaCaT cells. Part Fibre Toxicology, 7(1), 1. Ye, Y., Liu, J., Xu, J., Sun, L., Chen, M. and Lan, M. (2010). Nano-SiO2 induces apoptosis via activation of p53 and Bax mediated by oxidative stress in human hepatic cell line. Toxicology in Vitro, 24(3), 751-758. Yilmaz, S., Ünal, F., Yilmaz, E., Yüzbaşioğlu, D. and Erkal İlhan, S. (2014). Evaluation of the genotoxicity of clomiphene citrate. Mutation Research/Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis, 759, 21-27. Yruela, I. (2005). Copper in plants. Brazilian Journal of Plant Physiology, 17(1), 145156. Yruela, I. (2009). Copper in plants: acquisition, transport and interactions. Functional Plant Biology, 36(5), 409-430. Yüzbaşıoğlu, D., Ünal, F., and Sancak, C. (2009). Genotoxic effects of herbicide Illoxan (Diclofop-Methyl) on Allium cepa L. Turkish Journal of Biology, 33(4), 283-290. Yüzbaşıoğlu, D., Zengin, N. ve Ünal, F. (2014). Gıda Koruyucuları ve Genotoksisite Testleri. Gıda/The Journal of Food, 39(3). Zaini, P. A., De La Fuente, L., Hoch, H. C., and Burr, T. J. (2009). Grapevine xylem sap enhances biofilm development by Xylella fastidiosa. FEMS Microbiology Letters, 295(1), 129-134. Zhang, H., Jiang, Y., He, Z., and Ma, M. (2005). Cadmium accumulation and oxidative burst in garlic (Allium sativum). Journal of Plant Physiology,162(9), 977-984. Zhu, H., Han, J., Xiao, J. Q., and Jin, Y. (2008). Uptake, translocation, and accumulation of manufactured iron oxide nanoparticles by pumpkin plants. Journal Environment Monitoring, 10(6), 713-717. 98 ÖZGEÇMİŞ Kişisel Bilgiler Soyadı, adı : ÇALBAY, Özlem Uyruğu : T.C. Doğum tarihi ve yeri : 25.10.1988, Tunceli Medeni hali : Bekâr Telefon : 0 (312) 362 43 29 e-mail : calbay.ozlem@gazi.edu.tr Eğitim Derece Okul/Program Mezuniyet tarihi Lise Mobil Anadolu Lisesi 2005 Lisans Gazi Üniversitesi/ Biyoloji 2011 Yabancı Dil İngilizce Yayınlar Çalbay Ö., Ünal F., Yüzbaşıoğlu D., (2014) Bakır oksit Nanopartiküllerinin Allium cepa’daki Genotoksik Etkileri. Eskişehir Osmangazi Üniversitesi 22. Ulusal Biyoloji Kongresi, 23-27 Haziran. Hobiler Buz pateni, Dans GAZİ GELECEKTİR...
