SÜTTEN İZOLE EDİLEN LAKTİK BAKTERİLER VE
advertisement
SÜTTEN İZOLE EDİLEN LAKTİK BAKTERİLER VE STREPTOKOKLARIN ENZİM AKTİVİTELERİ Elif ORHAN YÜKSEK LİSANS TEZİ BİYOLOJİ GAZİ ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ ARALIK 2013 ANKARA ii iii iv SÜTTEN İZOLE EDİLEN LAKTİK BAKTERİLER VE STREPTOKOKLARIN ENZİM AKTİVİTELERİ (Yüksek Lisans Tezi) ELİF ORHAN GAZİ ÜNİVERSİTESİ FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ Aralık 2013 ÖZET Araştırmada çiğ sütten izole edilen laktik asit bakterilerinin bazı enzim özellikleri ve gıda patojeni bakteriler üzerine inhibitör aktivitelerinin belirlenmesi amaçlanmıştır. Bu nedenle 30 çiğ süt örneğinden 74 laktik bakteri izolatı izole edilip adlandırılmıştır. Adlandırılan türler; 10 Lactobacillus delbrueckii ssp. lactis, 9 Lb. casei, 6 Lb. rhamnosus, 5 Lb. acidophilus, 5 Lb. coryniformis ssp. tourquens, 3 Lb. plantarum ssp. plantarum, 5 Leuconostoc mesenteroides ssp. mesenteroides, 3 Leu. mesenteroides ssp. dextranicum, 9 Pediococcus pentosaceus, 6 P. dextrinicus, 1 P. inopinatus, 1 P. acidilactici, 4 Streptococcus lactis, 1 S. cremoris, 2 Enterococcus faecalis, 1 E. faecium ve 3 Lactococcus lactis ssp. lactis olarak tespit edilmiştir. Çiğ sütten izole edilen laktik bakterilerin proteaz, lipaz, elastaz, α-amilaz enzim özellikleri ve hemolitik aktiviteleri araştırılmıştır. 74 izolatın 70’inde proteolitik aktivite tespit edilmiştir. 36 izolat (%51,4) zayıf (+), 34 izolat (%48,6) orta (++) proteolitik aktivite göstermiştir. İzole edilen laktik bakterilerin, Elastinli Nutrient Agarda araştırılan elastaz enzim özellikleri saptanmamıştır. Trybutrin Agarda lipolitik aktiviteleri araştırılan laktik bakterilerde, Leu. mesenteroides ssp. dextranicum türünün zon çapı 4 mm olarak tespit edilmiştir. Diğer suşlarda zon çapı gözlenmemiştir. α-amilaz enzim aktiviteleri Nişasta Agar besiyerinde test edilmiştir. Lb. plantarum ssp. plantarum, Lb. casei, Lb. coryniformis ssp. tourquens, Pediococcus pentosaceus ve Leu. mesenteroides v ssp. dextranicum türlerinde α-amilaz (+) aktivite göstermiştir. Kanlı Agarda hemolitik aktiviteleri incelen laktik bakterilerden, S. lactis, Lactococcus lactis ssp. lactis ve Enterococcus faecium türleri (+) aktivite gösterirken diğer türlerde hemolitik aktivite gözlenmemiştir. Çiğ sütten izole edilen 17 farklı bakteri türünün her birinden bir suş alınarak inhibitör etki çalışılmıştır. Bu bakterilerin inhibitör etkisi kuyu difüzyon metoduyla Nutrient Agar ve %0,2 glikozlu Nutrient Agarda çalışılmıştır. Tüm inhibitör etkisi çalışılan bakteri türleri, Staphylococcus aureus, Listeria Monocytogenes ve Salmonella typhimurium üzerine inhibitör etki göstermiştir. Ancak E. coli ve Klebsiella pneumoniae üzerine etki göstermemiştir. En büyük etkiyi Lb. delbrueckii ssp. lactis Nütrient Agarda 12 mm, %0,2 glikozlu Nutrient Agarda 18 mm zon çapıyla L. monocytogenes ve S. typhimurium üzerine göstermiştir. Bu koşullarda %0,2 glikozlu ortamda zon çapları daha büyük gözlenmiştir. Çalışılan tüm laktik bakteri türleri E. coli ve K. pneumoniae üzerine etki göstermemiştir. Bilim Kodu : 203.1.010 Anahtar Kelimeler : Laktik asit bakterileri, Enzim aktivitesi, İnhibitör aktivite Sayfa Adedi : 124 Tez Yöneticisi : Prof. Dr. Güven Uraz vi ENZYME ACTIVITIES OF LACTIC BACTERIA AND STREPTOCOCCUS ISOLATED FROM MILK (M. Sc. Thesis) ELİF ORHAN GAZİ UNIVERSITY GRADUATE SCHOOL OF NATURAL AND APPLIED SCIENCES December 2013 ABSTRACT The research of some enzyme characteristics and the inhibitory activity of pathogenic bacteria in food aimed to determine of lactic acid bacteria isolated from raw milk. Therefore, 74 isolates of lactic acid bacteria isolated was named from 30 raw milk samples. Species named; has been identified as 10 Lactobacillus delbrueckii ssp. lactis, 9 Lb. casei, 6 Lb. rhamnosus, 5 Lb. acidophilus, 5 Lb. coryniformis ssp. tourquens, 3 Lb. plantarum ssp. plantarum, 5 Leuconostoc mesenteroides ssp. mesenteroides, 3 Leu. mesenteroides ssp. dextranicum, 9 Pediococcus pentosaceus, 6 P. dextrinicus, 1 P. inopinatus, 1 P. acidilactici, 4 Streptococcus lactis, 1 S. cremoris, 2 Enterococcus faecalis, 1 E. faecium ve 3 Lactococcus lactis ssp. lactis. Lactic bacteria were investigated protease, lipase, elastase, α-amylase enzyme characteristics and hemolytic activities isolated from raw milk. Proteolytic activity was determined of 74 isolates in 70 isolates. 36 isolates (51.4%), weak (+), 34 isolates (48.6%), moderate (+ +) has shown proteolytic activity. The isolated from lactic bacteria, elastase enzyme characteristics appeared to function on the nutrient Agar in Elastin researched. Lactic bacteria investigated lipolytic activities on the Tributyrin Agar, Leu. mesenteroides ssp. dextranicum species detected zone diameter of 4 mm. The other strains was not observed zone diameter. αAmylase enzyme activities were tested on Starch Agar. Lb. plantarum ssp. plantarum, Lb. casei, Lb. coryniformis ssp. tourquens, Pediococcus pentosaceus vii and Leu. mesenteroides ssp. dextranicum species demonstrated α-amylase (+) activity. Lactic bacteria were examined hemolytic activity on Colombia blood agar. S. lactis, Lactococcus lactis ssp. lactis ve Enterococcus faecium species demonstrated hemolytic (+) activity. On the other hand the other species was not observed hemolytic activity. Isolated from raw milk 17 different bacterial species taking from each strain was studied inhibitory effect. These bacteria was studied inhibitory effect in the well diffusion method Nutrient Agar and 0,2% glucose Nutrient Agar. While Lactic bacteria strains were showed on the S. aureus, L. Monocytogenes and S. typhimurium an inhibitory effect when they showed no effect on the E. coli and K. pneumoniae. In these conditions a larger zone diameters has been observed in glucose medium. In these circumstances the most greatest impact, Lb. delbrueckii ssp. lactis strain showed zone diameter 18mm on the L. monocytogenes and S. typhimurium. In these conditions a larger zone diameters has been observed in 0,2% glucose Nutrient Agar medium. All species studied lactic bacteria had no effect on E. coli and K. pneumoniae. Science Code : 203.1.010 Key Word : Lactic acid bacteria, Enzyme activity , Inhibitory effects Page Number : 124 Supervisor : Prof. Dr. Güven Uraz viii TEŞEKKÜR Çalışmalarımda, öncelikle tez konumu belirlememde, konuyla ilgili literatür araştırmalarımda ve laboratuvar çalışmalarımda maddi ve manevi desteklerini benden esirgemeyen değerli hocam Prof. Dr. Güven URAZ’ a teşekkürlerimi sunarım. Ayrıca yüksek lisans öğrenciliğim sürecinde maddi ve manevi desteklerinden dolayı sevgili aileme ve laboratuvar çalışmalarımda değerli bilgileri ve manevi desteklerinden dolayı Yrd. Doç. Dr. Ebru Yılmaz hocama ve çok değerli laboratuvar arkadaşlarıma teşekkür ederim. ix İÇİNDEKİLER Sayfa ÖZET……………………………………………………………………….. iv ABSTRACT………………………………………………………………… vi TEŞEKKÜR………………………………………………………………… viii ÇİZELGELERİN LİSTESİ…………………………………………………. xiii ŞEKİLLERİN LİSTESİ…………………………………………………….. xvii RESİMLERİN LİSTESİ……………………………………………………. xx 1. GİRİŞ …………………………………………………………………… 1 2. LİTERATÜR ARAŞTIRMASI ..……………………………………….. 3 2.1. Laktik Asit Bakterilerinde Proteolitik Aktivite ………………..…… 6 2.2. Laktik Asit Bakterilerinde Lipolitik Aktivite…………….…….…... 8 2.3. Laktik Asit Bakterilerinde α-Amilaz Enzimi……..………………… 9 2.4. Laktik Asit Bakterilerinde Elastaz Enzimi…………….………..…... 10 2.5. Laktik Asit Bakterilerinde Hemolitik Aktivite……………………… 11 2.6. Laktik Asit Bakterilerinin Sınıflandırılması…………………......….. 11 2.7. Laktik Asit Bakterilerinin Fizyolojik ve Biyokimyasal Özellikleri..... 12 2.8. Laktik Asit Bakterilerinin Morfolojik Özellikleri……...……………. 12 2.9. Laktik Asit Bakterileri Nerede Bulunur……………………………... 13 2.10. Laktik Asit Bakterilerinde İnhibitör Etki…………………………... 16 3. MATERYAL VE METOT………………………………………………. 22 3.1. Çiğ Süt Örneklerinden Laktik Asit Bakterilerinin İzolasyonunda KullanılanYöntemler………………………………………………… 24 3.1.1. Örnek alma ve örneklerin analize hazırlanması ……………… 24 x Sayfa 3.1.2. Laktik asit bakterilerinin izolasyonu ve adlandırılması …….... 25 3.2. Çiğ Sütten İzole Edilen Laktik Asit Bakterilerinin Proteolitik Enzim Aktivitelerinin Belirlenmesi…………………………………………. 33 3.2.1. İzole edilen bakterilerin proteolitik aktivitelerinin belirlenmesinde kullanılan besiyeri …..……………………… 33 3.2.2. İzole edilen bakterilerin proteolitik aktivitelerinin değerlendirilmesinde kullanılan yöntem...…………………..... 33 3.3. Çiğ Sütten İzole Edilen Laktik Asit Bakterilerinin Lipolitik Enzim Aktivitelerinin Belirlenmesi…………………….……………….….. 34 3.3.1. İzole edilen bakterilerin lipolitik aktivitelerinin belirlenmesinde kullanılan besiyeri …………………………. 34 3.3.2. İzole edilen bakterilerin lipolitik aktivitelerinin değerlendirilmesinde kullanılan yöntem ..………………...…. 34 3.4. İzole Edilen Laktik Asit Bakterilerinde Elastaz Varlığının Araştırılması …………………………………………….………….. 34 3.5. İzole Edilen Laktik Asit Bakterilerinde -Amilaz Varlığının Araştırılması ……………………………………………………..….. 35 3.5.1. Yöntem ……………………………………………………..… 35 3.5.2. Kullanılan besiyerleri ……………………………………..….. 35 3.6. Laktik Asit Bakterilerinin Hemolitik Aktivitelerinin Belirlenmesi…. 37 3.6.1. Yöntem..……………………………………………………… 37 3.6.2. Kullanılan besiyerleri...……………………………………….. 37 3.7. Laktik Asit Bakterilerinin Patojen Bakteriler Üzerine İnhibitör Etkisi……………………………………………………………….... 37 3.7.1. Nutrient agar da kuyu difüzyon yöntemi………………….….. 38 3.7.2. %0,2’lik glikoz içeren nutrient agar da kuyu difüzyon yöntemi……………………………………………………….. 38 3.7.3. Kuyu difüzyon yönteminde kullanılan besiyeri………..……... 39 xi Sayfa 3.7.4. Laktik asit bakterileri ve indikatör patojen bakterilerin aktifleştirilmesinde kullanılan besiyerleri …………………..... 39 3.8. Laktik Asit Bakterilerinin İzolasyonunda Kullanılan Temel Besiyerleri ……………………………………………………….….. 40 3.9. Laktik Asit Bakterilerinin İdentifikayonunda Kullanılan Besiyerleri ve Uygulanan Testler ……………………………………………….. 41 3.9.1. Gram boyama ……………………………..………………….. 41 3.9.2. Katalaz testi …………………………………………………... 42 3.9.3. Vankomisin duyarlılık testi ………………………………..…. 42 3.9.4. MRS broth’da gaz testi ………………………………………. 43 3.9.5. 100C ve 450C ‘ de üreme ……………………………………... 44 3.9.6. Arginin hidrolizi …………………………………………….... 45 3.9.7. Esculin hidrolizi ……………………………………………… 46 3.9.8. %6,5 NaCl’de üreme …………………………………………. 47 3.9.9. Karbonhidrat fermentasyon besiyeri …………………………. 47 4. BULGULAR …………………………………………………………….. 49 4.1. Laktik Asit Bakterilerinin Proteolitik Aktivitelerinin Değerlendirilmesi……………………………………………………. 55 4.1.1. Proteaz enzim varlığının araştırılması ……………………….. 55 4.1.2. Elastaz enzim varlığının araştırılması ………………………... 59 4.2. Laktik Asit Bakterilerinin Lipolitik ve -Amilaz Aktivitelerinin Değerlendirilmesi …………………………………………………... 59 4.3. Laktik Asit Bakterilerinde Hemolitik Aktivitelerinin Değerlendirilmesi……………………………………………………. 64 4.4. Laktik Asit Bakterilerinin Bazı Patojen Bakteriler Üzerine İnhibitör Etkilerinin Değerlendirilmesi………………………………………... 65 xii Sayfa 4.4.1. Laktik asit bakterilerinin Staphylococcus Aureus üzerine inhibitör etkilerinin değerlendirilmesi………………………... 65 4.4.2. Laktik asit bakterilerinin Listeria monocytogenes üzerine inhibitör etkilerinin değerlendirilmesi………………………... 71 4.4.3. Laktik asit bakterilerinin Salmonella typhimurium üzerine inhibitör etkilerinin değerlendirilmesi ……………………….. 78 4.4.4. Laktik asit bakterilerinin Klebsiella pneumoniae üzerine inhibitör etkilerinin değerlendirilmesi …….…………………. 84 4.4.5. Laktik asit bakterilerinin E. coli üzerine inhibitör etkilerinin değerlendirilmesi…………………………………………….... 90 5. TARTIŞMA-SONUÇ …………………………………………………… 102 KAYNAKLAR ……………………………………………………………. 115 ÖZGEÇMİŞ ……………………………………………………………….. 124 xiii ÇİZELGELERİN LİSTESİ Çizelge Sayfa Çizelge 3.1 Çiğ süt örneklerinin toplandığı illere göre dağılımı………… 22 Çizelge 3.2 Gram pozitif katalaz negatif bakterilerin cins seviyesinde adlandırılmalarında kullanılan testler……………………….. 24 Obligat homofermentatif Lactobacillus türlerinin fizyolojik karakterleri …………………………………………………. 25 Fakültatif heterofermentatif Lactobacillus türlerinin fizyolojik karakterleri ………………………………………. 26 Pediococcus türlerinin identifikasyonunda kullanılan fizyolojik testler ……………………………………………. 26 Leuconostoc türlerinin adlandırılmasında kullanılan fizyolojik testler ……………………………………………. 27 Streptococcus türlerinin adlandırılmasında kullanılan biyokimyasal testler ………………………………………... 28 Çizelge 3.3. Çizelge 3.4. Çizelge 3.5. Çizelge 3.6. Çizelge 3.7. Çizelge 3.8. Çizelge 3.9. Çizelge 4.1. Laktik asit bakteri izolatlarına uygulanan biyokimyasal testler……………………………………………………….. BBL Crystal Gram Positive ID kit ile uygulanan testlerin tablosu………………………………………………………. 29 32 Çiğ sütten izole edilen laktik asit bakterilerinin cinslere göre dağılımı …………………………………………………..… 49 Çizelge 4.2. Çiğ süt örneklerinin toplandığı illerin cinslere göre dağılımı. 50 Çizelge 4.3. Çiğ sütten izole edilen laktik asit bakterilerinin türlere göre dağılımı……………………………………………………… 51 Çizelge 4.4. Çizelge 4.5. Çizelge 4.6. Proteolitik aktivitesi araştırılan Laktik asit bakterilerinin Kalsiyum Kazeinat agarda oluşturdukları zon çaplarının değerleri……………………………………………………… . Proteolitik aktivite gösteren laktik bakteri izolatlarının cinslere göre dağılımı ……………………………………….. Lipolitik aktivitesi gözlenen laktik bakteri türlerinde lipaz aktivite zon çapları (mm)……………………………………. 55 57 60 xiv Çizelge Sayfa Çizelge 4.7. Laktik asit bakterilerinde α-amilaz enzim aktivitesi……….... 61 Çizelge 4.8. Çiğ sütten izole edilen laktik asit bakterilerinin lipoliz zon çapları ve – Amilaz aktiviteleri……………………………… 62 Hemolitik aktivite gösteren laktik asit bakterilerinin türlere göre dağılımı………………………………………………... 64 Lactobacillus türlerinin indikatör S. aureus üzerine oluşturdukları zon çapları………………………………….. 66 Pediococcus türlerinin indikatör S. aureus üzerine oluşturdukları zon Çapları…………………………………... 67 Leuconostoc türlerinin indikatör S. aureus üzerine oluşturdukları zon çapları…………………………………… 68 Streptococcus türlerinin indikatör S. aureus üzerine oluşturdukları zon çapları…………………………………… 69 Enterococcus türlerinin indikatör S. aureus üzerine oluşturdukları zon çapları…………………………………… 70 Lactobacillus türlerinin indikatör L. monocytogenes üzerine oluşturdukları zon çapları…………………………………... 71 Pediococcus türlerinin indikatör L. monocytogenes üzerine oluşturdukları zon çapları…………………………………… 73 Leuconostoc türlerinin indikatör L. monocytogenes üzerine oluşturdukları zon çapları……..…………………………….. 74 Streptococcus türlerinin indikatör L. monocytogenes üzerine oluşturdukları zon çapları…………………………………… 75 Çizelge 4.9. Çizelge 4.10. Çizelge 4.11. Çizelge 4.12. Çizelge 4.13. Çizelge 4.14. Çizelge 4.15. Çizelge 4.16. Çizelge 4.17. Çizelge 4.18. Çizelge 4.19. Enterococcus türlerinin indikatör L. monocytogenes üzerine oluşturdukları zon çapları…………………………………… Çizelge 4.20. Lactobacillus türlerinin indikatör S. typhimurium üzerine oluşturdukları zon çapları…………………………………… 78 Pediococcus türlerinin indikatör S. typhimurium üzerine oluşturdukları zon çapları…………………………………… 80 Çizelge 4.21. 77 xv Çizelge Çizelge 4.22 Çizelge 4.23. Çizelge 4.24. Çizelge 4.25. Çizelge 4.26. Çizelge 4.27. Çizelge 4.28. Çizelge 4.29. Çizelge 4.30. Çizelge 4.31. Çizelge 4.32. Çizelge 4.33 Çizelge 4.34. Çizelge 4.35. Çizelge 4.36. Sayfa Leuconostoc türlerinin indikatör S. typhimurium üzerine oluşturdukları zon çapları…………………………………… 81 Streptococcus türlerinin indikatör S. typhimurium üzerine oluşturdukları zon çapları…………………………………… 82 Enterococcus türlerinin indikatör S. typhimurium üzerine oluşturdukları zon çapları…………………………………… 83 Lactobacillus türlerinin indikatör K. pneumoniae üzerine oluşturdukları zon çapları…………………………………… 84 Pediococcus türlerinin indikatör K. pneumoniae üzerine oluşturdukları zon çapları…………………………………… 86 Leuconostoc türlerinin indikatör K. pneumoniae üzerine oluşturdukları zon çapları…………………………………… 87 Streptococcus türlerinin indikatör K. pneumoniae üzerine oluşturdukları zon çapları…………………………………… 88 Enterococcus türlerinin indikatör K. pneumoniae üzerine oluşturdukları zon çapları…………………………………… 89 Lactobacillus türlerinin indikatör E. coli üzerine oluşturdukları zon çapları…………………………………… 90 Pediococcus türlerinin indikatör E. coli üzerine oluşturdukları zon Çapları…………………………………... 92 Leuconostoc türlerinin indikatör E. coli üzerine oluşturdukları zon Çapları…………………………………... 93 Streptococcus türlerinin indikatör E. coli üzerine oluşturdukları zon Çapları…………………………………... 94 Enterococcus türlerinin indikatör E. coli üzerine oluşturdukları zon Çapları…………………………………... 95 Lactobacillus suşlarının tüm indikatör test bakterilerine karşı inhibitör etkisi……………………………………………….. 98 Pediococcus suşlarının tüm indikatör test bakterilerine karşı inhibitör etkisi………………………………………………. 99 xvi Çizelge Çizelge 4.37. Çizelge 4.38. Çizelge 4.39. Sayfa Leuconostoc suşlarının tüm indikatör test bakterilerine karşı inhibitör etkisi………………………………………………. 99 Streptococcus suşlarının tüm indikatör test bakterilerine karşı inhibitör etkisi……………………………………………….. 101 Enterococcus suşlarının tüm indikatör test bakterilerine karşı inhibitör etkisi……………………………………………….. 101 xvii ŞEKİLLERİN LİSTESİ Şekil Şekil 4.1. Sayfa Çiğ sütten izole edilen laktik asit bakterilerinin cinslere göre dağılımı ………………………………………………………. 50 Şekil 4.2. Çiğ sütten izole edilen laktik asit bakterilerinin tür sayısına göre dağılımı ...……………………………………… 52 Şekil 4.3. İzole edilen Lactobacillus türlerinin %’lik dağılımı ………… 53 Şekil 4.4. İzole edilen Pediococcus türlerinin %’lik dağılımı ………….. 53 Şekil 4.5. İzole edilen Leuconostoc türlerinin %’lik dağılımı ………….. 54 Şekil 4.6. İzole edilen Streptococcus türlerinin %’lik dağılımı ………… 54 Şekil 4.7. Proteolitik aktivite gösteren laktik bakteri izolatlarının cinslere göre dağılımı ………………………………………... 58 Lactobacillus türlerinin nutrient agar ve %0,2 glikozlu nutrient agarda S. aureus üzerine inhibisyon zon çaplarının karşılaştırılması……………………………………………..... 66 Pediococcus türlerinin nutrient agar ve %0,2 glikozlu nutrient agarda S. aureus üzerine inhibisyon zon çaplarının karşılaştırılması……………………………………………… 67 Leuconostoc türlerinin nutrient agar ve %0,2 glikozlu nutrient agarda S. aureus üzerine inhibisyon zon çaplarının karşılaştırılması………………………………………………. 68 Streptococcus türlerinin nutrient agar ve %0,2 glikozlu nutrient agarda S. aureus üzerine inhibisyon zon çaplarının karşılaştırılması………………………………………………. 69 Enterococcus türlerinin nutrient agar ve %0,2 glikozlu nutrient agarda S. aureus üzerine inhibisyon zon çaplarının karşılaştırılması……………………………………………… 70 Lactobacillus türlerinin nutrient agar ve %0,2 glikozlu nutrient agarda L. monocytogenes üzerine inhibisyon zon çaplarının karşılaştırılması…………………………………. 72 Şekil 4.2. Şekil 4.8. Şekil 4.9. Şekil 4.10. Şekil 4.11. Şekil 4.12. Şekil 4.13. xviii Şekil Şekil 4.14 Şekil 4.15. Şekil 4.16. Şekil 4.17. Şekil 4.18. Şekil 4.19. Şekil 4.20. Şekil 4.21. Şekil 4.22. Şekil 4.23. Şekil 4.24. Sayfa Pediococcus türlerinin nutrient agar ve %0,2 glikozlu nutrient agarda L. monocytogenes üzerine inhibisyon zon çaplarının karşılaştırılması………………………………………………. 73 Leuconostoc türlerinin nutrient agar ve %0,2 glikozlu nutrient agarda L. monocytogenes üzerine inhibisyon zon çaplarının karşılaştırılması………………………………………………. 74 Streptococcus türlerinin nutrient agar ve %0,2 glikozlu nutrient agarda L. monocytogenes üzerine inhibisyon zon çaplarının karşılaştırılması…………………………………… 76 Enterococcus türlerinin nutrient agar ve %0,2 glikozlu nutrient agarda L. monocytogenes üzerine inhibisyon zon çaplarının karşılaştırılması…………………………………… 77 Lactobacillus türlerinin nutrient agar ve %0,2 glikozlu nutrient agarda S. typhimurium üzerine inhibisyon zon çaplarının karşılaştırılması…………………………………… 79 Pediococcus türlerinin nutrient agar ve %0,2 glikozlu nutrient agarda S. typhimurium üzerine inhibisyon zon çaplarının karşılaştırılması………………………………………………. 80 Leuconostoc türlerinin nutrient agar ve %0,2 glikozlu nutrient agarda S. typhimurium üzerine inhibisyon zon çaplarının karşılaştırılması………………………………………………. 81 Streptococcus türlerinin nutrient agar ve %0,2 glikozlu nutrient agarda S. typhimurium üzerine inhibisyon zon çaplarının karşılaştırılması…………………………………… 82 Enterococcus türlerinin nutrient agar ve %0,2 glikozlu nutrient agarda S.typhimurium üzerine inhibisyon zon çaplarının karşılaştırılması…………………………………… 83 Lactobacillus türlerinin nutrient agar ve %0,2 glikozlu nutrient agarda K. pneumoniae üzerine inhibisyon zon çaplarının karşılaştırılması…………………………………… 85 Pediococcus türlerinin nutrient agar ve %0,2 glikozlu nutrient agarda K. pneumoniae üzerine inhibisyon zon çaplarının karşılaştırılması……………………………………………… 86 xix Şekil Şekil 4.25. Şekil 4.26. Şekil 4.27. Şekil 4.28. Şekil 4.29. Şekil 4.30. Şekil 4.31. Şekil 4.32. Sayfa Leuconostoc türlerinin nutrient agar ve %0,2 glikozlu nutrient agarda K. pneumoniae üzerine inhibisyon zon çaplarının karşılaştırılması………………………………………………. 87 Streptococcus türlerinin nutrient agar ve %0,2 glikozlu nutrient agarda K. pneumoniae üzerine inhibisyon zon çaplarının karşılaştırılması…………………………………… 88 Enterococcus türlerinin nutrient agar ve %0,2 glikozlu nutrient agarda K. pneumoniae üzerine inhibisyon zon çaplarının karşılaştırılması…………………………………… 89 Lactobacillus türlerinin nutrient agar ve %0,2 glikozlu nutrient agarda E. coli üzerine inhibisyon zon çaplarının karşılaştırılması………………………………………………. 91 Pediococcus türlerinin nutrient agar ve %0,2 glikozlu nutrient agarda E.coli üzerine inhibisyon zon çaplarının karşılaştırılması………………………………………………. 92 Leuconostoc türlerinin nutrient agar ve %0,2 glikozlu nutrient agarda E.coli üzerine inhibisyon zon çaplarının karşılaştırılması………………………………………………. 93 Streptococcus türlerinin nutrient agar ve %0,2 glikozlu nutrient agarda E.coli üzerine inhibisyon zon çaplarının karşılaştırılması………………………………………………. 94 Enterococcus türlerinin nutrient agar ve %0,2 glikozlu nutrient agarda E. coli üzerine inhibisyon zon çaplarının karşılaştırılması………………………………………………. 95 xx RESİMLERİN LİSTESİ Resim Sayfa Resim 2.1. Laktik bakteri cinslerinin morfolojik görüntüleri…………… 13 Resim 3.1. MRS broth’da gaz testi……………………………………… 44 Resim 3.2. Arginin hidrolizi…………………………………………….. 45 Resim 3.3. Esculin hidrolizi…………………………………………….. 46 Resim3.4. Karbonhidrat hidrolizi………………………………………. 48 Resim 4.1. Calsium caseinate agarda proteolitik zon çapları…………… 58 Resim 4.2. Elastinli nutrient agar da elastaz enzimi varlığı…………….. 59 Resim 4.3. Luria Bertani-nişasta agar da -Amilaz enzim varlığı……….. 61 Resim 4.4. Kanlı agarda laktik asit bakterilerinin hemolitik aktivitesi…. 64 1 1. GİRİŞ Süt mikroflorasının doğal üyeleri olan laktik asit bakterileri; fermente süt ürünlerinin elde edilmesinde, olgunlaşmasında, tat ve aroma oluşumunda görev alırlar. Ayrıca bu ürünlerin üretim aşamasında starter suş kullanımı büyük önem taşımaktadır. Starter suşların büyük bir kısmı laktik asit bakteri grubunda yer alan, özellikleri belirlenmiş mikroorganizmalardır. Laktik bakteriler fermente ürün teknolojisinde kullanıldığında proteaz, lipaz, elastaz, -amilaz gibi enzim aktivitelerinin varlığı önem taşımaktadır. Ayrıca aroma oluşumunda bu özellikleri olan bakteriler tercihen ürüne ilave edilmektedir. Proteaz enzim aktivitesinin varlığı süt proteinlerini etkileyen önemli bir enzim aktivitesidir. Fermente ürün elde edilmesinde bu enzimi salgılayan bakteriler gereklidir. Bu nedenle araştırmada çiğ süt örneklerinden laktik asit bakterilerinin izolasyonu yapılmıştır. Morfolojik, fizyolojik ve biyokimyasal özelliklerine göre çeşitli testlerle tür bazında adlandırılmıştır. Özellikle süt endüstrisinde fermente ürünlerin oluşumunda, aroma ve tekstürün oluşumunda önemli bir yeri olan enzim aktivitelerinin, izole edilen bakterilerde varlığının araştırılması amaçlanmıştır. Protez, lipaz, elastaz ve -amilaz enzimleri gıda fermentasyonunda, özellikle süt ürünlerinin fermentasyonunda aktivite gösterirler. Fermente süt ürünlerinde olgunlaşma, renk, koku ve lezzetin oluşumu laktik bakterilerin salgıladıkları bu enzimler sayesinde gerçekleşir. Süt mikroflorasının önemli üyeleri olan laktik bakterileri ( lactobacillus, pediococcus, leuconostoc ve streptococcus) izole edilerek, adlandırılan türlerin enzimatik özellikleri belirlenmiştir. Ayrıca laktik bakteriler metabolizmaları sonucu organik asit, hidrojen peroksit, bakteriosin gibi ürünler salgılamaktadır. Ürettikleri bu ürünler laktik asit bakterilerine inhibe edici özellik kazandırmaktadır. Bu özellik ile birçok patojen bakteri üzerinde inhibitör etki göstermektedirler. Bu amaçla çiğ sütten izole edilip adlandırılan laktik bakterilerin patojen özellikteki Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes, Salmonella typhimurium, Klebsiella pneumoniae ve E.coli 2 bakterilerine karşı inhibitör etkisi araştırılmıştır. Gıda patojeni olan bu bakteriler süt ve süt ürünlerinde bozulmalara, koku ve lezzet değişimlerine neden olmaktadırlar. Ayrıca süt ürünlerinden, bu patojenlerin insanlara kontaminasyonu sonucu çeşitli enfeksiyonlar oluşmaktadır ve bazı enfeksiyonlar ciddi sonuçlara neden olmaktadırlar. Laktik asit bakterilerinin fermentasyonu sonucu ortamda bulunan karbonhidratların miktarı azalır ve antimikrobiyal aktiviteye sahip organik moleküller ( laktik, asetik, formik, propiyonik asit) ve antimikrobiyal bileşikler ( hidrojen peroksit, diasetil ve bakteriyosin) oluşur. Oluşan bu organik moleküller ve antimikrobiyal bileşikler ile laktik bakteriler gıda patojeni bakteriler üzerinde inhibitör etki oluştururlar. Araştırmada laktik bakterilerin, Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes, Salmonella typhimurium Klebsiella pneumoniae ve E.coli üzerinde inhibitör etkileri belirlenmiştir. 3 2. LİTERATÜR ARAŞTIRMASI Laktik asit bakterileri (LAB) endüstriyel açıdan önemli mikroorganizmalar olup, endüstriyel gıda fermantasyonlarında çeşitli şekillerde kullanılmaktadırlar. Laktik asit bakterileri özellikle süt ürünlerinin üretiminde starter kültür olarak kullanılan bakterilerdir. Starter kültür; belirli sayıda canlı mikroorganizmaların tek veya kombine kültürlerinin taze, donmuş veya liyofilize formlarını içeren, fermente gıda ürünlerinin imalatında kullanılan ve enzimatik özellikleri sayesinde, fermentasyon olaylarını hızlandıran ve arzu edilen nitelikte ürünlerin elde edilmesine olanak sağlayan mikroorganizmalardır [1]. Süt ve süt ürünlerinde fermente ürünlerde Laktik Asit Bakterilerinin starter kültür özellikleri büyük önem taşır. Laktik Asit Bakterileri gıdalarda starter kültür olarak kullanıldıklarında fermente ürünlerin tat, doku, besleyici değer gibi bazı ürün karakteristiklerine de katkıda bulunmaktadırlar [2, 3]. Bu enzimatik karakterle oluşmaktadır. Yani Süt ürünlerinde starter kültürlerin kullanılmalarında temel amaç kendine özgü özellikler taşıyan ürünün elde edilmesidir [4, 5, 6, 7, 8]. Adıgüzel 2001 yılında çiğ sütten izole ettiği laktik asit bakterilerinin inhibitör etkilerini incelediği bir çalışmasında, 110 çiğ süt örneğinden 249 laktik asit bakterisi izole etmiştir. 144 S. faecalis, 14 S. durans, 22 S. lactis, 4 S. cremoris, 5 P. urinequi, 12 P. pentosaceus, 10 P. halophilus, 4 P. damnosus, 6 L. dextrinicus, 2 L. pseudomesenteroides, 1 L. lactis ve 1 L. cremoris izole etmiştir [9]. 2002 yılında Çetin’in yapmış olduğu araştırmada, 10 çiğ süt örneğinden 27 izolat laktik asit bakterisi izole etmiştir. Bu 27 izolatın 5’i Lactococcus lactis ssp. lactis, 11’i Enterococcus ssp., 1’i Lactococcus raffinolactis ve 1’İ Lactococcus lactis ssp. cremoris olarak tespit edilmiştir [10]. 4 Akkuzu (2004), pastörize süt ve pastörize sütlerden hazırlanmış 60 kefir örneğinden laktik asit bakterilerini izole etmiştir. İzole edilen bakteriler; 3 Pediococcus acidilactici, 1 Lactobacillus helveticus, 1 Leuconostc lactis, 1 Leuconostoc cremoris, 22 Enterococcus faecalis, 5 Enterococcus faecium, 10 Enterococcus durans, 1 Enterococcus hirae, 4 Enterococcus dispar, 41 Streptococcus lactis, 3 Streptococcus raffinolactis, 1 Streptococcus thermophilus ve 1 Streptococcus acidominimus olarak belirlemiştir [11]. Yüksekdağ’ın 2005 yılında kefirden izole ettiği laktik asit bakterilerileriyle yaptığı bir çalışmada, 21 Lactobacillus izole etmiştir. 1 Lb. acidophilus, 2 Lb. helveticus, 4 Lb. casei, 3 Lb. bulgaricus, 6 Lb. lactis, 3 Lb. plantarum ve 2 Lb. brevis’dir. İzole ettiği 21 Streptococcus izolatı ise 4 S. lactis, 3 S. thermophilus, 3 S. durans ve 11 S. cremoris’dir. Bu izolatların proteolitik aktivitelerine bakıldığında, maximum proteolitik aktivite Lb. acidophilus türünde gözlenirken minimum aktivite Lb. plantarum türünde gözlemlenmiştir [12]. Arslan ve Uraz’ın 2005 yılında yaptıkları bir çalışmada, 50 çiğ süt örneğinden 32 laktik asit bakteri izolasyonu yapılmıştır. Adlandırılan 32 bakterinin 14’ü Lactobacillus, 9’u Pediococcus, 4’ü Leuconostoc ve 5’ini Streptococcus olarak tespit etmişlerdir [13]. Coşkun’un 2006 yılında yaptığı çalışmasında, hem çiğ sütteki hem de çiğ sütten üretilen 6 grup beyaz peynirlerdeki laktik asit bakterilerinin izolasyonu ve identifikasyonu yapılmıştır. Çiğ sütten toplam 10 bakteri izole edilmiştir. 1 Pediococcus pentosaceus, 3 Streptococcus lactis, 1 Enterococcus hirae ve 5 Enterococcus faecalis adlandırılmıştır. 6 grup beyaz peynirde ise 90 gün olgunlaşma süresinde toplam 144 laktik bakteri izole edilip adlandırılmıştır. 61 Lactococcus lactis ssp. lactis, 23 E. faecalis, 11 Lb. plantarum, 9 Lb. paracasei ssp. paracasei, 4 S. avium, 7 E. hirae, 6 P. pentosaceus, 6 S. casseliflavus ve 13 E. faecium’dur [14]. 2009 yılında Tatlı’nın yaptığı bir çalışmada; 50 geleneksel süt ürününden 72 adet laktik asit bakterisi izole edilmiştir. Bu izolatların cinslere göre dağılımı; 46 5 Lactobacillus ssp. %64, 15 Bifidobacterium ssp. %21, 10 Streptococcus ssp. %14 ve 1 Enterococcus ssp. %1 olarak belirlenmiştir [15]. Gheytanchi ve arkadaşlarının 2010 yılında yapmış olduğu bir çalışmada; 50 süt ve peynir örneğinden 41 Lactobacillus izole etmişlerdir. Bunlardan 3 Lb. acidophilus, 6 Lb. casei subsp. casei, 7 Lb. casei subsp. rhamnosus, 3 Lb. delbrueckii subsp. lactis, ve 7 Lb. plantarum izole edilip adlandırılmıştır [16]. Karakuş ve arkadaşlarının (1992), yaptığı bir çalışmada, olgunlaşmanın başlangıcında peynir florasında L. lactis ssp. lactis baskın tür iken, E. faecalis ve E.faecium bakterilerinin ikinci en önemli tür olduğunu tespit etmişlerdir. Peynir olgunlaşmasında proteolitik ve lipolitik aktivitelerinin önemini vurgulamışlardır [17]. Uraz ve Gündoğan (1998), 10 haftalık olgunlaşma periyodu boyunca Beyaz peynir florasında Bacillus, Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus, S. aureus ve koliform grubu bakteri tespit ettiklerini ve Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus ve Streptococcus cinsi bakterilerin olgunlaşma boyunca dominant mikroorganizmalar olduğunu ve diğer bakteri türlerinden daha yüksek sayıda bulunduklarını bildirmişlerdir [18]. Gürsoy ve ark. (2001) az yağlı Beyaz peynir üretiminde, olgunlaşmayı hızlandırmak amacıyla ısıl işlem uygulanmış (65 °C’ de 20 dak.) starter kültür (Lb. helveticus veya Lb. delbrueckii ssp. bulgaricus; 0.5 g/100g) başarıyla kullanılabileceklerini bildirmişlerdir. Olgunlaşmanın 30. gününde proteoliz düzeyinin arzu edilen seviyelere yükseldiğini ve Lb. helveticus kullanımının daha iyi sonuç verdiğini tespit etmişlerdir [19]. Gürsel ve arkadaşları (2003), az yağlı Beyaz peynir üretiminde, olgunlaşmayı hızlandırmak süretiyle tekstür, tad ve aromayı iyileştirmek amacıyla, -20º C’de 8 gün süre ile muhafaza edilen Lb. helveticus ve Lb. delbrueckii ssp. bulgaricus bakterilerini yardımcı kültür olarak kullanmışlardır. Yardımcı kültür kullanımının peynirlerin genel bileşimini etkilemediğini, ancak olgunlaşmayı hızlandırdığını ve 6 özellikle Lb. helveticus’un az yağlı Beyaz peynir üretiminde herhangi bir olumsuzluğa yol açmadığını bildirmişlerdir [20]. Topisirovic ve arkadaşları (2009), fermente ürünlerden elde ettikleri 26 enterokok türünün proteolitik ve antimikrobiyel özellikleri üzerine yaptıkları çalışlmada (37) ßkazein’e karşı 25 enterokok türünün güçlü veya orta derecede proteolitik aktivite gösterdiğini saptamışlardır [21]. Enterococcus faecalis, E. faecium ve bunların ortak kullanımıyla hazırlanmış peynirlerde lipolize olan katkıları incelendiği bir araştırmada (Rasouli Pirouzan ve arkadaşları 2010), olgunlaşma süresince lipoliz indeksinin önemli ölçüde kontrol grubuna nazaran daha yüksek olduğu saptanmıştır. Bu peynirlerde serbest yağ asiti miktarının daha fazla olduğu bildirilmiştir. Bu sonuç ilave enterokokların peynirde lipolize katkıda bulunduğunu göstermektedir [22]. 2010 yılında Yıldırım’ın yaptığı çalışmada; dört farklı Lactococcus lactis ssp. lactis suşu kullanılarak üretilen beyaz peynirde, 90 gün boyunca proteoliz ve lipoliz düzeyleri ile L. monocytogenes’in kalıcılığı incelenmiştir. Beyaz peynirde proteoliz ve lipoliz düzeyinin suştan suşa bağlı olduğunu göstermiştir. L. lactis ssp. lactis LL23 suşu ie yapılan peynirde kazein fraksiyonlarının proteoliz düzeyi daha yüksek bulunurken, L. lactis ssp. lactis LL27 suşu ile yapılan peynirde serbest yağ asitleri düzeyi çok daha yüksek saptanmıştır. 90 günlük depolama sonunda sadece LL27 suşunun Listeria monocytogenes’in gelişimini inhibe ettiği belirlenmiştir [23]. 2.1. Laktik Asit Bakterilerinde Proteolitik Aktivite Proteolitik aktivite, mikroorganizmalarca salgılanan proteolitik enzimler ile proteinlerin hidrolize edilmesidir. Proteolitik aktivite, hem starter kültürlerin asit oluşturma fonksiyonu hem de fermente ürünün özellikleri açısından önemlidir. Süt proteinleri 20 aminoasitin karmaşık bir şekilde bağlanmasıyla meydana gelirler. Vücut tarafından sentezlenemeyen tüm aminoasitleri içerirler. Bu fizyolojik ve 7 beslenme özellikleri yanı sıra süt teknolojisi bakımından da önemli özelliklere sahiptir. Çünkü süt proteinleri süt ürünlerinin ya ana maddesidir veya önemli bileşenlerindendir [24,25]. Proteoliz olayı özellikle sütün ana protein yapısı kazeinin polipeptid ve oligopeptidler üzerinden serbest aminoasitlere kadar proteinlerin parçalanma olayıdır [24,26,27]. Laktik bakterilere ait proteolitik enzimlerden proteaz enzimi, Streptococcus salivarus ssp. thermophilus’un dışında tüm türlerde ortaya konulmuştur. Fakat sayıları ve etkinlikleri oldukça farklılık göstermektedir [24]. Çeşitli çalışmalarda yoğurdun, Lb. bulgaricus ile S. thermophilus bakterilerinin simbiyotik yaşamaları sonucu oluştuğu ortaya çıkarılmıştır [28,29]. Yoğurt ile yoğurt sütü karşılaştırıldığında da yoğurtta, proteolitik aktivitenin, yoğurt bakterilerinin etkinliğiyle daha yüksek oluştuğu Tamime ve Deeth (1980) tarafından tespit edilmiştir [30]. Laktik bakteriler diğer mikroorganizmalarla karşılaştırıldığında zayıf bir proteolitik aktiviteye sahip olmasına karşın peynirin olgunlaşmasında önemli rol oynayan birçok sayıda proteolitik sistemi yapılarında barındırmalarından ötürü olgunlaşmada önemli mikroorganizmalardır [31]. Özellikle Streptococcus thermophilus, Lactococcus lactis, Lactobacillus helveticus ve Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus adı geçen özelliklerinden ötürü süt ürünü starteri olarak kullanılır ve büyük bir ekonomik öneme sahiptirler [32]. Proteolitik aktiviteye sahip bakterilerin etkinliğiyle; bakterilerin esansiyel azot ve sülfür bağlarının karşılanmasıyla hem gelişmeleri teşvik edilir hem de glikoliz olayı hızlanır, protein parçalanma ürünleriyle diğer bakterilerin metabolik gereksinimleri karşılanır ve tipik aroma maddelerinin, tat bileşenlerinin oluşumu sağlanır [18,33]. 8 Yapılan araştırmalarda, laktik asit bakterilerinde, laktik asit üretimi ve proteolitik aktivitenin cins, tür ve suşlar arasında farklılık gösterdiği belirlenmiştir [34, 35]. Tekinşen ve Atasever (1994), Lb. bulgaricus türünün yüksek proteolitik aktivite gösterdiğini belirtmişlerdir [36]. Perez ve arkadaşları (2003) tarafından yapılan bir çalışma sonucunda, çeşitli suşlar arasında Lactococcus cinsinin Lactobacillus cinsine oranla daha yüksek proteolitik aktivite gösterdiğini tespit etmişlerdir [37]. Herros ve ark. (2003), değişik inkübasyon sürelerinde lactobacillus cinsinin ve enterococcus cinsinin yüksek proteolitik aktivite gösterdiğini tespit etmişlerdir [38]. 2.2. Laktik Asit Bakterilerinde Lipolitik Aktivite Süt içinde bulunan en önemli bileşenlerden birisi de süt lipitleridir. Süt yağı, lipaz enziminin etkinliği ile yağ asidi ve gliserine parçalanır. Lipaz süte özgü, doğal ve mikrobiyal kaynaklı olabilir. Yıllarca laktik asit bakterilerinin lipaz aktivitesi olmadığı varsayılmıştır. Genetik bilimindeki ilerlemelere bağlı olarak laktik asit bakterilerinin (LAB) genetiği üzerine yapılan çalışmalar, spesifik bakteriyel enzimlerin fermente ürün oluşumundaki rolünü açıklamaya imkan tanımıştır. Laktik asit bakterileri starter veya ilave kültür olarak süt ürünlerinin fermentasyonunda kullanılır [39]. Süt endüstrisinde laktik asit bakterilerinin proteoliz ve lipoliz aktiviteleriyle, fermente ürünlerde tekstür, aroma ve lezzet oluşumu sağlanır [37]. Laktik asit bakterilerinin lipaz aktivitesi tür ve cinslere göre farklılık gösterir. Leuconostoc mesenteroides ssp. dextranicum en yüksek lipolitik aktiviteye sahip olurken yoğurt kültürünü oluşturan (Lb. bulgaricus ile S. thermophilus) her iki türün lipolitik aktivitesi oldukça sınırlıdır. 9 Süt trigliseridlerinin enzimatik hidrolizi (lipoliz) yüksek konsantrasyonlarda kısa ve orta zincirli yağ asitlerini açığa çıkarır. Lipoliz, birçok peynirde, lezzet gelişimi için gereklidir [40]. Sütte ve süt ürünlerinin birçoğunda serbest yağ asitlerinin oluşumu arzu edilmediği halde, karakteristik peynir aromasını meydana getirdiklerinden bazı peynir çeşitlerinde bu asitlerin oluşumu arzu edilir. Collins ve ark. (2003) starter laktik asit bakterilerinin otolizi ile Cheddar peynirinin olgunlaşması sırasında serbest yağ asitlerinin (SYA) artan birikimi arasında bir ilişki gözlemlemişlerdir ve bunun peynirde intrasellüler lipolitik aktivitenin artan oranına bağlı olabileceğini ifade etmişlerdir [41]. Laktik bakterilerin lipaz ve esterazının pastörize sütten yapılmış Cheddar ve Hollandatip peynirlerde başlıca lipolitik aktivitiye sahip ajan oldukları görülmüştür. Bu varsayım kültür kullanılmadan üretilen peynirlerde, starter kültür kullanılanlara nazaran daha düşük düzeyde serbest yağ asitlerinin bulunması ile açıklanmaktadır [42,43]. Enterococcus faecalis, E. faecium ve bunların ortak kullanımıyla hazırlanmış peynirlerde lipolize olan katkıları incelendiği bir araştırmada, olgunlaşma süresince lipoliz indeksinin önemli ölçüde kontrol grubuna nazaran daha yüksek olduğu saptanmıştır. Bu peynirlerde serbest yağ asiti miktarının daha fazla olduğu bildirilmiştir. Bu sonuç ilave enterokokların peynirde lipolize katkıda bulunduğunu göstermektedir [22]. 2.3. Laktik Asit Bakterilerinde α-Amilaz Enzimi Bir karbohidraz olan alfa-amilaz enzimi ticari olarak kullanılan ilk enzimdir. Alfa-amilaz enzimi, ham ve çözünür nişasta molekülündeki alfa-1,4 glikozidik bağlarını parçalayarak glikoz, maltoz, maltotrioz ve alfa-limit dekstrinlerin oluşumunu katalize eden yaygın bir grup enzimdir. Nişasta, çok sayıda glikoz molekülünün farklı şekillerde bağlanmasıyla oluşmuş polisakkarit özellikte bir bileşiktir [44]. Bazı bakteriler ve mantarlar tarafından 10 üretilen alfa-amilaz, beta-amilaz, glikoamilaz ve glikoizomeraz gibi enzimler nişastayı parçalama yeteneğine sahiptirler. Bu enzim günümüzde tekstil ve kağıt endüstrisinde, nişastanın sıvılaştırılmasında, ekmek, glikoz ve fruktoz şurupları ve tutkal üretiminde, alkol fermantasyonunda kullanılmaktadırlar [4]. Endüstriyel olarak üretilen ilk enzim 1894 yılında tedavi amaçlı kullanılan amilazdır. Şu an Bacillus, Aspergillus ve Rhizopus türleri en önemli endüstriyel amilaz kaynakları olarak bilinmektedir. Bununla birlikte son yıllarda mikrobiyal kaynaklı amilazlar da araştırılmaktadır. Laktik asit bakterilerinde alfa amilaz enziminin varlığıyla ilgili bazı çalışmalar yapılmıştır. Laktik asit bakterileri cins seviyesinde incelendiğinde özellikle Lactobacillus cinsinde bu enzimin varlığı tespit edilmiştir [29]. Rodriguez-Sanoja ve arkadaşlarının 2005 yılında yapmış olduğu bir çalışmada, Lactobacillus plantarum ve Lactobacillus amylovorus’un alfa amilaz enzim üretimleri karşılaştırılmış. Her iki bakterinin -amilaz enzim kapasitesi, iyot-boyama gücü ve nişastadan indirgeyici şekerlerin üretiminde azalma ölçülerek çözünür patates nişastası üzerinde incelenmiştir. Lb. amylovorus ‘un alfa amilaz enziminin Lb. plantarum’a göre 10 kat daha fazla nişasta hidrolize ettiğini tespit etmişlerdir. Benzer şekilde, Lb. amylovorus α-amilaz enzimi 10 kat daha fazla şeker azalttığını rapor etmişlerdir [45]. 2.4. Laktik Asit Bakterilerinde Elastaz Enzimi Elastaz proteolitik bir enzimdir ve yapay tatlandırıcı aspartamın ( N- benziloksikarbonil-L-aspartil fenilalanin metilesteri) sentezi için kullanılan bir enzimdir. Metalloproteinazlardan olan elastaz, elastin ve diğer proteinlerin daha basit moleküllere ayrılmasını katalize eden, genellikle aminoasitlerin karbonil gruplarının bulunduğu bağlardaki polipeptit zincirini kıran, serin endopeptidazların bir grubudur. Bu enzim birçok bakteriye virülans özellik kazandırmaktadır. Laktik asit bakterilerinde elastaz enzimiyle ilgili araştırmalara rastlanmamıştır. Araştırmamızda izole edip adlandırdığımız laktik asit bakterilerinde de elastaz enziminin varlığı saptanmamıştır. 11 2.5. Laktik Asit Bakterilerinde Hemolitik Aktivite Laktik asit bakterilerinde hemolitik aktivitenin belirlenmesi önemli bir kriterdir. Gıda endüstrisinde starter kültür olarak kullanım potansiyeli olan miroorganizmaların, hemolize neden olmayan -hemolitik suşlar olması gerekmektedir [46, 47]. Laktik bakterilerinde hemolitik aktivite genellikle streptococcaceae familyasına ait Streptococcus ve Lactococcus cinsi ve Enterococcus cinsi bakterilerde görülebilmektedir [24]. Hemolitik aktivite 3 şekilde gerçekleşmektedir. Kanlı agar ortamında üretildiklerinde koloni etrafında şeffaf zon oluşturanlar -hemolitik, koloni çevresinde tam olmayan, yeşilimsi bir hemoliz yapanlar -hemolitik ve hemoliz yapmayan bakteriler -hemolitiktir. 2008 yılında Anas ve arkadaşlarının yaptığı bir çalışmada, Cezayirde çiğ keçi sütünden izole edilen 64 Lactobacillus suşunun hemolitik aktivitelerini incelemişlerdir. Lactobacillus suşlarında hemolitik aktivitenin olmadığı rapor etmişlerdir. Hemolitik aktivite yokluğu süt için kullanılan starter kültür seçiminde bir kriter oluşturmaktadır [48]. 2.6. Laktik Asit Bakterilerinin Sınıflandırılması Mikrobiyoloji bilim dalının doğuşu ile birlikte, gıda endüstrisinde ekonomik öneme sahip olarak bilinen laktik asit bakterileri ile ilgili çalışmalar da başlamıştır. İlk kez 19. yüzyıl sonlarında süt ve süt ürünlerinde fermantasyona yol açan bakteriler; laktik asit bakterileri olarak isimlendirilmiş ve daha sonraki yıllarda Lactobacillaceae familyası içinde sınıflandırılmışlardır. Beijerinck (1901), laktik asit bakterilerini Lactobacillales takımında incelemiştir. Lactobacillales takımı 16S rRNA sekans birimleri temel alındığında filogenetik analizleri sınırlı olmakla beraber, bu takım içinde Lactobacillaceae familyası ve yakın akrabaları Aerococcaceae, Carnobacteriaceae, Enterococcaceae, Streptococcaceae familyaları bulunmaktadır [49]. Leuconostocaceae ve 12 Axelsson’un 1993’de yapmış olduğu sınıflandırmaya göre; laktik asit bakterileri grubuna dahil birçok cins olduğu saptanmıştır. Genel olarak laktik asit bakterileri; Lactobacillus, Pediococcus, Streptococcus ve Leuconostoc cinslerini içermektedir. Son yıllarda yapılan genetik çalışmalar sonucunda ise Lactococcus, Carnobacterium, Enterococcus, Weissella ve Vagococcus cinsleri de laktik asit bakterileri içinde yer almaktadır [16, 50, 53,54]. 2.7. Laktik Asit Bakterilerinin Fizyolojik ve Biyokimyasal Özellikleri Laktik bakteriler morfolojik açıdan değişken özellikler gösterirken fizyolojik açıdan benzer özellikler göstermektedirler. Tüm üyeler; Gram pozitif, katalaz negatif, Sporolactobacillus inulinus hariç spor oluşturmayan, fakültatif anaerobik, Pediococcus cinsi hariç yalnız tek düzlemde bölünen ve bazı istisnalar hariç hareketsiz olan bakterilerdir. Gram- pozitif bakteriler içerisinde guanin-sitozin (G+C) oranı en düşük olan bakterilerdir [16, 24, 51]. Glikozu katabolize ederek ana ürün olarak laktik asit oluşturmalarıyla karakterize edilirler. Sütü asitleştirme yeteneğindedirler. Değişik sıcaklıklarda gelişebilirler. Oksijene ve farklı NaCl konsantrasyonlarına karşı toleranslıdırlar. Arjininden amonyak oluşturabilme ve eskülini hidrolize edebilme yeteneğine sahiptirler. Safra tuzlarına ve pH nın farklı değerlerine karşı direnç gösterebilirler. 2.8. Laktik Asit Bakterilerinin Morfolojik Özellikleri Laktik bakterilerin morfolojik özellikleri cins ve türlerine göre farklılıklar göstermekle birlikte genel olarak kok, düzgün çubuk ve düzensiz çubuk olmak üzere üç farklı formda görünümleri vardır (Resim 2.1) [24, 51, 52]. Streptokok, laktokok ve enterokok cinsi ikili veya zincir şeklinde sıralanmış ovoid hücrelerden oluşurken, lökonostok cinsi ikili zincir şeklinde sıralanmış mercimek formunda hücrelerden oluşmaktadır. Pediokok cinsinde ise tetrat şeklinde dizilmiş yuvarlak hücre formu tipiktir. Laktobasil cinsinde bulunan türler ise; tekli, ikili veya uzun zincir formunda düzgün çubuk şeklindeki hücrelerden oluşmaktadır [24]. 13 Lactobacillus sp Leuconostoc sp Pediococcus sp Streptococcus sp Resim 2.1. Laktik bakteri cinslerinin morfolojik görüntüleri 2.9. Laktik Asit Bakterileri Nerede Bulunur Laktik asit bakterilerinin doğal bulunma ortamları genellikle besin içeriği bakımından zengin olan ortamlardır. Örneğin süt ve süt ürünlerinde bulunmaktadırlar. Sütün doğal florasını oluşturdukları için süt asidi bakterileri de denilmektedir. Bazı üyeleri insan organizmasında, ağız florasında bulunup, intestinal ve ürogenital sistemin mikroflorasını da oluşturmaktadır [53, 55]. Lactobacillus genusu: Çubuk şeklinde olan bu bakteriler, düzgün çubuk, kokobasil veya uzun zincir oluşturan çubuk şeklinde bulunabilirler. Çok az tür veya suşun dışında hareketsizdirler. Katalaz enzimi üretmezler. Spor oluşturmazlar anaerob veya mikroaerofildirler. Lactobacillus genusu türleri doğada oldukça fazla yaygındır. Silajda, hayvan ve insan bağırsağında bulunurlar. Normal süt florasında yer alırlar. 14 Çiğ sütlerde bu genusa ait birçok bakteriyi belirlemek mümkündür. Süt asidi miktarı %1-3 arasında değişir. Patojen özellik göstermezler. Aksine oluşturdukları antibakteriyel özellikteki maddeler sayesinde saprofit ve patojen bakterilerin gelişmelerini engellerler. Proteinleri parçalama özellikleri tür ve suşlara göre değişiklik gösterir. Hücrenin iç kısmındaki hücre çeperi ve peptidaz aktivitesiyle bağdaştırılan proteolitik aktivite, hücre çeperinin yüzeyindeki enzimlerin büyük moleküllü proteinleri hidrolize ederek hücrenin içine taşıyabilecek derecede küçük peptidlerin oluşumunu sağlamasıyla gerçekleşir. Hücre içi peptidazlar peptidleri aminoasitlere kadar parçalar ve mikroorganizmanın gelişmesinde kullanılabilir şekle sokar. Lactobacilluslar bu özellikleri nedeniyle yoğurt ve benzeri ürünlerin yapımında ve sert peynirlerin olgunlaştırılmasında kültür olarak kullanılırlar. Bu bakteriler süt ürünlerinde tat ve aroma oluşumunda önemli rol oynarlar [24, 56]. Laktik asit bakterileri, glukozu homofermentatif ve heterofermentatif yolla katabolize etmelerine göre ikiye ayrılırlar. Homofermentatif laktik asit bakterileri glukozu fruktozdifosfat yolu ile parçalayarak sonuçta %90 oranında laktik asit oluştururlar. Heterofermentatif laktik asit bakterileri ise glukozu hegzosmonofosfat yolu ile parçalayarak laktik asit yanında etanol, asetik asit ve CO2 gibi yan ürünler meydana getirirler [24]. Heterofermentatif laktik asit bakterileri Fruktozdifosfat yolunun önemli enzimlerinden aldolaz ve trioz-fosfat izomeraz enzimine sahip olmadıkları için Fruktozdifosfat yolunu kullanamamaktadır [24, 57]. Homofermetatif türler: Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus delbrueckii ile bunun iki alt türü olan Lactobacillus delbruecki ssp. bulgaricus ve Lactobacillus delbrueckii ssp. lactis’ tir. Bu bakteriler pentoz ve glukonatları fermente edemezler ve glukozdan gaz oluşturamazlar. 15 Heterofermentatif türler: Lactobacillus acetotolerans, Lactobacillus casei, Lactobacillus maltaromicus, Lactobacillus plantarum, Lactobacilus rhamnosus, Lactobacillus coryniformis ssp. torquens ve Lactobacillus sake örnek verilebilir. Bu bakteriler fermentasyon sonucunda laktik asit, asetik asit ve CO2 üretebilirler. Pediococcus genusu Pediococcus cinsi bakteriler iki veya dörtlü kok şeklindedir, tekli hücre veye zincir oluşturmaları nadirdir. Hareketsizdirler ve endospor oluşturmazlar. Kemoorganotrofturlar. Fermentasyon homolaktik olup DL-laktik asit üretirler. Mikroaerofilik olup, yüzeyde gelişmeleri zayıftır. Bazı non-hem katalaz aktivitesine sahip olmalarına rağmen genel olarak katalaz (-)’tirler. Glukoz, früktoz ve mannozdan asit oluşturup gaz oluşturmazlar. Saprofitler özellikle bozulmuş birada ve süt ürünlerinde bulunurlar [24, 57]. Leuconostoc genusu Leuconostoc cinsi bakteriler yuvarlak veya çoğunlukla mercimek tanesi şeklinde olup ikili veya zincir şeklinde bulunurlar. Hareketsizdirler ve spor oluşturmazlar. Katalaz negatif olan genusun bazı türleri hem varlığında ve diğer H2O2 aktivite varlığında, gelişme sırasında H2O2’i parçalayabilirler. Sitokrom sistemleri yoktur. Arginin’i hidrolize etmezler. Sütü çok seyrek olarak asitleştirir ve pıhtılaştırırlar. Proteolitik değillerdir. Fakültatif anaerobturlar. Patojen özellik göstermezler. Ayrıca Leuconostoc mesenteroides ssp. dextranicum türü laktik asit bakterileri içerisinde en yüksek lipolitik aktiviteyi gösteren bakteridir [24, 57]. Streptococcus genusu Streptococcus cinsi bakteri hücreleri yuvarlaktan ovale kadar değişen şekilde olup ikili veya zincir şeklinde bulunurlar. Hareketsizdirler. Ancak ara sıra hareketli suşları mevcuttur. Kemoorganotrof yapıdadırlar. Karbonhidratlardan fermentatif metabolizmaları sonucu laktik, asetik, formik asit ile alkol, karbonhidrattan ise CO2 oluştururlar. Besin gereksinimleri kompleks ve değişkendir. Katalaz testi genellikle negatif olup değişken sonuç vermektedir. Fakültatif anaerobdurlar. O2 veya diğer H 16 akseptörleri karbonhidrat metabolizmasının son ürününü değiştirebilirler. Optimum gelişme sıcaklığı 37 C0’ dir [24, 57]. Lactococcus genusu Lactococcus bakteri hücreleri düzgün oval şekillidir. İkili formu kısa zincir formuna göre daha çok görülür. Bazı suşları uzun zincir oluşturabilir. Mannitol, trehaloz, sükroz, arabinoz, ksiloz, laktoz, maltoz ve glukozdan asit üretirler. Proteolitik aktiviteye sahiptirler. Bazı suşları bir bakteriosin olan nisini üretirler. Birçok gram (+) bakteriye karşı inhibitör etki gösterirler. Kanlı agarda α veya γ reaksiyon verirler. Optimum gelişme sıcaklıkları 30 C0’dir. Süt ürünlerinde adil kontaminant olarak bulunurlar [24,57]. 2.10. Laktik Asit Bakterilerinde İnhibitör Etki Laktik asit bakterilerinin en önemli özelliklerinden biri, ortamda bulunan gıda kaynaklı, patojen ve kontaminant mikroorganizmaların ( Staphylococcus aureus, E. coli, Salmonella, Listeria monocytogenes gibi) gelişimini engellemeleri ve ölümlerine sebep olmalarıdır [58, 59, 60]. Gıdaların korunmasında laktik asit bakterilerinin antimikrobiyal madde üretim yeteneklerinden yararlanılır [61]. Fermentasyon sonucu ortamda bulunan karbonhidratların miktarı azalır ve antimikrobiyal aktiviteye sahip organik moleküller ( laktik, asetik, formik, propiyonik asit) ve antimikrobiyal bileşikler (hidrojen peroksit, diasetil ve bakteriyosin) oluşur [62, 63, 64, 65, 66]. Süt ve süt ürünlerinde, gıdaların bozulmasına sebep olan ve patojen özellikteki bakterilerin inhibisyonunda en önemli faktörlerden biri pH’ dır. Laktik asit bakterilerinin üretmiş olduğu organik asitlerle bu mikroorganizmalar üzerinde inhibitör etki oluşabilmektedir. Süt ve süt ürünlerinde pH dışında inhibitör etkiyi oluşturan en önemli faktörlerden biri bakteriosinlerdir. Bakteriosinler protein veya protein kompleksleri olup, laktik asit bakterileri tarafından da üretilen antimikrobiyal 17 maddelerdir. Laktik asit bakterilerinin bakteriosinleri bazı gram (+) ve gram (-) bakteriler üzerinde inhibitör etki oluşturur [ 67, 68 ]. Çalışmamızda çiğ sütten izole edilen laktik asit bakterilerinin, gıda patojeni (S. aureus, L. monocytogenes, Salmonella typhimurium, E. coli ve K. pneumoniae) bakteriler üzerine inhibisyon etkileri araştırılmıştır. Staphylococcus aureus enterotoksin üretebilen, dünyanın hemen her ülkesinde gıda kaynaklı hastalıklara yol açan patojen bir bakteridir. Gram (+), katalaz (+) düzenli veya düzensiz kümeler oluşturan kok şeklinde bakterilerdir. Bu bakteri mastitis, süt hayvanlarında cilt hastalıkları ile süt ve mamülleri tüketicilerinde gıda kaynaklı intoksikasyonlara neden olmaktadır. Bunların esas önemleri olası enterotoksin üretebilme yetilerinden kaynaklanmaktadır [69]. Laktik bakterilerin gram (+) ve gram (-) patojenler üzerine inhibisyonu dahil olmak üzere birçok yararları vardır. Çeşitli araştırmacılar Lactococcus lactis’in S. aureus’a karşı antagonistik etki gösterdiğini bildirmişlerdir [ 64, 70, 71]. Çon ve Gökalp’in 2000 yılında kuyu difüzyon tekniği kullanarak yaptıkları bir çalışmada, Lactobacillus plantarum’un S. aureus’a karşı inhibitör etki gösterdiğini belirlemişlerdir. Aynı çalışmada Pediococcus pentosaceus suşlarının, E. coli’ ye karşı inhibitör etkisinin bulunmadığını göstermişlerdir [29]. Adıgüzel 2001 yılında çiğ sütten izole ettiği laktik asit bakterilerinin inhibitör etkilerini incelediği bir çalışmasında, 110 çiğ süt örneğinden 249 laktik asit bakterisi izole etmiştir. 144 S. faecalis, 14 S. durans, 22 S. lactis, 4 S. cremoris, 5 P. urinequi, 12 P. pentosaceus, 10 P. halophilus, 4 P. damnosus, 6 L. dextrinicus, 2 L. pseudomesenteroides, 1 L. lactis ve 1 L. cremoris izole etmiştir. İnhibitör etkisi incelen Listeria monocytogenes ve S. aureus bakterilerinde Pediococcus pentosaceus ve Leuconostoc dextrinicus etkili bulunmuştur [9]. 18 Kılıç 2003 yılında insan vajinasından izole ettiği Lactobacillus suşlarının S. aureus’a karşı inhibitör etkisini incelemiştir. Lactobacillus acidophilus suşunun S. aureus üzerine etki oluşturduğunu ve zon çapının 14 mm olduğunu gözlemlemiştir [72]. Ammor ve arkadaşları (2006) bazı laktik asit bakteri suşlarının Biyofilm oluşturmada etkili S. aureus üzerine antagonistik etki oluşturduğunu rapor etmişlerdir [73]. 2008 yılında Anas ve arkadaşlarının yaptığı bir çalışmada, Cezayirde çiğ keçi sütünden izole edilen 64 Lactobacillus suşunun S. aureus’a karşı inhibitör etkisini incelemişlerdir. 64 suştan sadece 11’i inhibe edici etki göstermiştir. Bu suşlar tür düzeyinde mikrobiyolojik ve biyokimyasal testlerle adlandırılmıştır. S. aureus’a etki gösteren türler, Lb. plantarum, Lb. rhamnosus, Lb. acidophilus, Lb. sakei subsp. sakei, Lb. casei ve Lb. paracasei. subsp. paracasei’ dir. Ancak en yüksek etkiyi Lb. plantarum türünün gösterdiğini bildirmişlerdir [48]. Karska-Wysocki ve arkadaşları (2010), Lactobacillus acidophilus ve Lactobacillus casei suşlarının metsilin dirençli S. aureus üzerinde antibakteriyel aktivitesini incelemişlerdir. S. aureus üzerinde, Lb. casei 2cm, Lb. acidophilus 3 cm zon çapı oluşturarak antibakteriyel aktivite gösterdiklerini rapor etmişlerdir [74]. Altuntaş ve arkadaşları 2010 yılında çiğ süt ve peynir örneklerinden izole ettiği laktik asit bakterilerinin antimikrobiyel aktivitelerini incelemişlerdir. 3 çiğ süt ve 9 peynir örneğinden 63 laktik asit bakterisi izole etmişlerdir. L. monocytogenes ve S. aureus üzerine inhibitör etkilerine bakıldığında, Lactococcus lactis ssp. lactis, Lactobacillus plantarum ve Lactobacillus paracasei ssp. paracasei suşlarının etki gösterdiğini tespit etmişlerdir. Listeria monocytogenes üzerine en yüksek etkiyi Lactococcus lactis ssp. lactis suşunun gösterdiğini rapor etmişlerdir [75]. Listeria monocytogenes, doğada çok yaygın bir şekilde bulunan hem insan hem hayvanlarda çeşitli hastalıklara yol açan patojen bir bakteridir. Gram (+) düzgün, sınırları belli kısa çubuk bakterisidir. Süt endüstrisindeki önemi, süt ve mamülleri bazlı gıda zehirlenmelerine neden olarak sık sık karşılaşılması ve günümüzde süt ve 19 mamullerinin L. monocytogenes içermemesinin sağlanmasının bir kalite kriteri kabul edilmesine gerek duyulmasından kaynaklanmaktadır [69]. Garcia ve arkadaşları 1993 yılında laktik asit bakterilerinin Listeria monocytogenes’e karşı inhibitör etkilerinin tespit etmişlerdir. Çalışmalarında besiyerine %0,2 oranında glikoz ilave etmişlerdir [76]. Garriga ve arkadaşlarının 1993 yılında yaptığı bir çalışmada da Lactobacillus suşlarının Listeria monocytogenes üzerine inhibitör etkisini tespit etmek için besiyerine %0,2 oranında glikoz ilave etmişlerdir. Araştırmaları sonucunda bu suşların Listeria monocytogenes’e karşı inhibisyon oluşturduğu tespit edilmiştir. Bu araştırmalarda inhibitör etknin tespiti için besiyerine %0,2 glikoz ilave edilmiştir. Bizim çalışmamızda da inhibitör etkiyi saptamak için hem nutrient agar besiyeri hem de %0,2 glikoz ilaveli nutrient agar besiyeri kullanılmıştır [77]. Schillinger ve arkadaşları (2001) çalışmalarında, laktik asit bakterilerinin Listeria monocytogenes üzerine bakteriosin etkisini incelemişlerdir. Gıda patojeni olarak bilinen L. monocytogenes üzerine gıdalara ilave edilen ve bakteriosin sentezleyen laktik bakterilerin etkisi tespit edilmiştir [78]. Salmonella gıda kaynaklı enfeksiyonlara yol açan büyük bir problem teşkil eden patojen bir bakteridir. Salmonella kümes ve kümes hayvanlarından elde edilen mamüllerde, et ve et ürünlerinde, süt ve süt ürünlerinde iyi bilinen bir kontaminanttır. Salmonella genusu gram (-), spor oluşturmayan, küçük, çubuk şeklinde bir bakteridir. Gıda kaynaklı salmonellosis vakalarının çoğu süt ve süt ürünü kaynaklı olmamasına rağmen süt ve mamülleri yine de salgılarda önemli bir kaynağı oluşturmaktadır [69]. 2003 yılında Çadırcı Lactobacillusların bazı gram (+) ve gram (-) bakteriler üzerine inhibitör etkisini incelediği bir çalışmada; Lb. plantarum’un Salmonella üzerine inhibitör etki gösterdiğini tespit etmiştir [79]. 20 E. coli, ilk kez 1885’ te tanımlanan ve büyük ölçüde diyarenin bir nedeni olarak ortaya çıkan patojen bir bakteridir. Enterobacteriacea familyasının bir üyesi olan E. coli peritrik flagella içerebilen ya da hareketsiz olabilen gram (-), spor oluşturmayan düz çubuk şeklinde bir bakteridir. Patojenitesine göre 4 gruptur; Enteropatojenik (EPEC), Enterotoksijenik (ETEC), Enteroinvasiv (EIEC) ve Enterohaemorejenik E. coli (EHEC)’ dir. ETEC suşları insanlarda ve hayvanlarda şiddetli diyareye yol açmaktadır ve temel kaynağı süt ve süt mamulleridir [69]. Chuayana ve arkadaşları 2003 yılında, süt ürünlerinden izole ettikleri laktik asit bakteri kültürlerinin S. aureus, E. coli ve Salmonella typhi üzerine antimikrobiyel etkilerini araştırmışlardır. Streptococcus spp. ve Lactobacillus spp. suşları S. aureus’a karşı bakterisidal etki gösterirken Salmonella typhi ve E. coli’ye karşı bakteriostatik etki gösterdiğini rapor etmişlerdir [80]. 2005 yılında Rodriguez ve arkadaşları yaptıkları bir çalışmada Lactococcus lactis suşlarından elde edilen ve pediosin üreten iki transformatın peynirin olgunlaştırılması sırasında L. monocytogenes, S. aureus ve E. coli 0157:H7 üzerindeki antimikrobiyel aktivitesini araştırmışlardır. Pediosin üreten Lactococcus lactis’in L. monocytogenes, S. aureus ve E. coli O157:H7’ nin gelişimini engellediğini tespit etmişlerdir [82]. Arslan’nın 2005 yılında yapmış olduğu bir çalışmada, çiğ sütten izole edilen Lactobacillus, Pediococcus, Streptococcus ve Leuconostoc türlerinin, Listeria monocytogenes, Staphylococcus aureus, Yersinia enterocolitica, Bacillus cereus ve B. subtilis indikatör bakterileri üzerine inhibitör etkisini incelemiştir. Çiğ sütten izole edilen laktik bakterilerin tüm indikatör bakterilere karşı etki oluşturduğunu bildirmiştir [13]. Etöz 2006 yılında yapmış olduğu bir çalışmada, kefirden izole edilen Lb. casei, Lb. delbrueckii ssp. bulgaricus, Leu. cremoris, Enterococcus faecalis ve Enterococcus faecium bakterilerinin, Staphylococcus, Salmonella, Shigella, Klebsiella, Enterobacter, Listeria, Esherichia, Aeromonas, Pseudomonas ve Proteus indikatör bakterilerine karşı antimikrobiyal aktiviteleri araştırılmıştır. Stapylococcus aureus, 21 Listeria monocytogenes, Salmonella typhimurium ve Klebsiella pneumoniae üzerine en yüksek antimkrobiyal aktiviteyi Enterococcus faecium ve Enterococcus faecalis göstermiştir. Lb. delbrueckii ssp. bulgaricus ve Leu. cremoris hepsinde etki gösterirken, S. aureus ve Listeria monocytogenes üzerinde Lb. delbrueckii ssp. bulgaricus en etkili tür olarak bildirilmiştir [83]. Gonzalez ve arkadaşlarının 2006 yılında yaptıkları çalışmada, 395 laktik asit bakteri suşunun peynir yapımı ve olgunlaştırılması süresince antimikrobiyal aktivitelerini araştırmışlardır. Lactococcus lactis ssp. lactis suşlarının S. aureus ve Listeria monocytogenes üzerine antibakteriyel etki gösterdiğini bildirmişlerdir [81]. Tuncer ve arkadaşlarının 2008 yılında yaptığı bir çalışmada, bozadan izole ettikleri laktik asit bakterilerinin antimikrobiyel etkisini incelemişleridir. E. coli’ de inhibitör etki gözlenmezken, S. aureus üzerine L. lactis ssp. lactis suşunun etkili olduğunu tespit etmişlerdir [84]. 2008 yılında İşleroğlu ve arkadaşlarının yapmış olduğu bir çalışmada, Tokat yöresine ait geleneksel bir peynirden antimikrobiyel aktiviteye sahip bir bakteri izole edilip karakterize edilip adlandırılmıştır. Adlandırılan Enterococcus faecalis tarafından üretilen antimikrobiyel maddenin L. monocytogenes ve E. coli üzerine etkisi araştırılmıştır. L. monocytogenes’e karşı inhibitör etki gösteriken E. coli’ye etkili olmadığını gözlemlemişlerdir [55]. Dixit ve arkadaşları 2013 yılında Lactobacillus acidophilus suşlarının Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae, S. aureus, E. coli ve Salmonella typhi üzerine antibakteriyal etkilerini incelemişlerdir. 5 Lactobacillus acidophilus suşundan 3 tanesi etkili bulunmuştur. NCIM 2903 nolu suş tüm patojen bakterilerde etkili bulunurken, NCIM 2285 nolu suş P. aeruginosa ve Salmonella typhi üzerine etkisiz diğer bakterilerde etkili bulunmuştur. NCIM 2660 nolu suş ise, P. aeruginosa ve K. pneumoniae üzerinde zayıf inhibitör etki gösterirken Salmonella typhi de inhibitör etki göstermiştir [85]. 22 3. MATERYAL VE METOD Araştırmamızda Nisan 2011- Mart 2012 tarihleri arasında Ankara ve çeşitli illerden toplanan 30 çiğ süt örneği materyal olarak kullanılmıştır. Alınan 30 çiğ süt örneğinden laktik asit bakterileri ( Lactobacillus, Pediococcus, Leuconostoc, Streptococcus) izole edilmiştir. Daha sonra izole edilen bakterilerin identifikasyonu yapılmıştır. Toplam laktik asit bakterilerinin sayısı 74 olarak belirlenmiştir. Süt örnekleri Ankara, Burdur, Kırıkkale, Konya ve Bursa illerinden toplanmıştır. (Çizelge3.1.) Çizelge 3.1. Çiğ süt örneklerinin toplandığı illere göre dağılımı Çiğ Süt Örneklerinin Toplandığı İller ANKARA BURDUR KIRIKKALE KONYA BURSA TOPLAM Çiğ Süt Örneklerinin Sayısı 13 5 4 4 4 30 İzole edilen laktik asit bakterilerinin adlandırılmasında manuel biyokimyasal testler yapılmıştır. Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology’ e göre biyoşimik özellikler karşılaştırılarak adlandırılması yapılmıştır. Ayrıca Pediococcus pentosaceus, Enterococcus faecalis, E. faecium ve Lactococcus lactis ssp. lactis türlerinin adlandırılmasında ilave olarak BBL™ Crystal™ Rapid Gram-Positive ID Kit kullanılmıştır. Tür seviyesinde adlandırılması yapılan izolatların proteaz, lipaz, elastaz, -amilaz ve hemoliz aktiviteleri araştırılmıştır. Bunun yanında bazı patojen bakteriler (Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes, Klebsiella pneumoniae, E. coli, Salmonella typhimurium) üzerine inhibitör etkileri araştırılmıştır. Lactobacillus cinsine ait izole edilen türler; Lactobacillus delbrueckii ssp. lactis, Lactobacillus casei, Lb. rhamnosus, Lb. acidophilus, Lb. coryniformis ssp. torquens, Lb. plantarum ssp. plantarum’dur. Pediococcus cinsine ait izole edilen türler; Pediococcus pentosaceus, P. dextrinicus, P. inopinatus, P. acidilactici’ dir. 23 Leuconostoc cinsine ait izole edilen türler; Leuconostoc mesenteroides ssp. mesenteroides, Leuconostoc mesenteroides ssp. dextranicum’dur. Streptococcus’ lardan Streptococcus lactis, Streptococcus cremoris türleri, Enterococcus’ lardan Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium ve Lactococcus lactis ssp. lactis türleri izole edilmiştir. Lactobacillus, Pediococcus, Leuconostoc ve Streptococcus bakterilerinin izolasyonu amacıyla çiğ süt örnekleri steril şişelerle alınmıştır. Örnekler, zenginleştirme besiyeri olan pepton water da 10-1, 10-2 ve 10-3 e kadar dilüsyon yapılarak sulandırılmıştır. 10-2 ve 10-3 dilüsyonlarından laktik asit bakterilerinin üretildiği selektif bir besiyeri olan MRS (De Man Rogosa Sharp) agara ekim yapılmıştır [86]. MRS besiyerinde üreyen bakteriler önce morfolojilerine göre ayrılmış ve çeşitli biyokimyasal testler uygulanmıştır. Laktik asit bakterilerinin cins ve tür dağılımlarının belirlenebilmesi amacıyla, izole edilen bakteriler Gram boyama ile morfolojik olarak tespit edildikten sonra katalaz ve vankomisin testlerine tabi tutulmuştur. Laktik asit bakterileri katalaz negatif özellik gösterirler. Katalaz negatif olan izolatlara vankomisin testi yapılmıştır. Vankomisine dirençli olanlar Leuconostoc, Pediococcus ve Lactobacillus, vankomisine duyarlı olanlar Streptococcus cinslerine ait bakterilerdir. Vankomisine dirençli değerlendirilmiştir. olan MRS bakterilerin broth’da gaz MRS broth’da oluşturanlar gaz oluşumu Leuconostoc, gaz oluşturmayanlar Pediococcus, değişken reaksiyon gösterenler ise Lactobacillus cinsine ait kabul edilerek cins seviyesinde adlandırılmaları yapılmıştır (Çizelge 3.2). 24 Çizelge 3.2. Gram pozitif katalaz negatif bakterilerin cins seviyesinde adlandırılmalarında kullanılan testler Katalaz (Negatif) Vankomisin(30 µg disk) Duyarlı Dirençli Streptococcus Leuconostoc, Pediococcus, Lactobacillus MRS Broth' da gaz Pozitif Negatif Leuconostoc Lactobacillus Pediococcus Lactobacillus Lactobacillus, Pediococcus, Leuconostoc ve Streptococcus şüphesi olan izolatların tür seviyesinde identifikasyonu için, 10 0C ve 45 0C’de üreme, %6,5 NaCl’de üreme, esculin hidrolizi, arginin hidrolizi ve karbonhidrat fermentasyon testleri kullanılmıştır. 3.1. Çiğ Süt Örneklerinden Laktik Asit Bakterilerinin İzolasyonunda Kullanılan Yöntemler 3.1.1. Örnek alma ve örneklerin analize hazırlanması Araştırmada Türk Standartları Ensitüsünde (TSE-1018) belirtilen esaslara göre çiğ süt örnekleri 200 ml’lik steril şişelerle alınmıştır [87]. Analiz için laboratuara getirilen örneklerin %0,1’lik Pepton water (Merck 1.07228) kullanılarak 10-1, 102 ,10-3’lük dilüsyonları hazırlanmıştır [88, 89]. 10-2 ve 10-3’lük dilüsyonlardan 0,1 ml alınarak MRS ve Standart Plate Count Agar (PCA) yayma ekim yapılmıştır. besiyerine dragalski özesiyle 25 3.1.2. Laktik asit bakterilerinin izolasyonu ve adlandırılması Lactobacillus suşlarının izolasyonu ve adlandırılması Araştırmada Lactobacillus’ların izolasyonu için MRS besiyerine ekim yapılarak 370C’ de 24-48 saat inkübasyona bırakılmıştır. İnkübasyondan sonra farklı görünümdeki koloniler Gram boyama ile boyanarak, sporsuz zincir şeklinde basil olan koloniler MRS besiyerine tekrar tek koloni ekimi ile ekilmiştir. MRS besiyerinde üretilen bakteriler katalaz, vankomisin, MRS broth’da gaz testleri yapılarak cins seviyesinde adlandırılmıştır [90]. Cins seviyesinde adlandırılan Lactobacillus’ lara 100C’de üreme, arginin, esculin ve karbonhidrat fermentasyon testleri uygulanmıştır. Obligat homoermentatif Lactobacillus türleri için galaktoz, laktoz, maltoz, rafinoz, sükroz, mannitol, salisin karbonhidratları, fakültatif heterofermentatif Lactobacillus türleri için mannitol, rafinoz, sükroz, ksiloz, arabinoz ve sorbitol karbonhidratları kullanılmıştır [91, 92]. Tür seviyesinde adlandırmak amaçlı yapılan tüm bu testler sonucunda obligat (zorunlu) homofermentatif Lactobacillus türlerinden 10 Lb. delbrueckii ssp. lactis, 5 Lb. acidophilus adlandırılmıştır (Çizelge 3.3). Fakültatif heterofermentatif Lactobacillus türlerinden 9 Lb. casei, 6 Lb. rhamnosus, 5 Lb. coryniformis ssp. tourquens ve 3 Lb. plantarum ssp. plantarum izole edilip adlandırılmıştır (Çizelge 3.4). d: değişken 11-89% Galaktoz Laktoz Maltoz Rafinoz Sükroz Mannitol Salisin Lb.delbrueckii ssp.lactis Lb.acidophilus Arginin Lactobacillus Türleri 100C’de üreme Çizelge 3.3. Obligat homofermentatif Lactobacillus türlerinin fizyolojik karakterleri - d - d + + + + + d + + - + + 26 100C’de üreme Esculin Arabinoz Mannitol Rafinoz Sükroz Ksiloz Sorbitol Çizelge 3.4. Fakültatif heterofermentatif Lactobacillus türlerinin fizyolojik karakterleri Lb. casei Lb. rhamnosus + + + + d + + - + + - + + Lb. coryniformis ssp. tourquens Lb. plantarum ssp. plantarum + + + d + + + + + d + Lactobacillus Türleri d: değişken 11-89% Pediococcus suşlarının izolasyonu ve adlandırılması Çiğ süt örneklerinden Pediococcus’ ların izolasyonu için MRS besiyerine ekim yapılarak 370C’ de 24-48 saat inkübasyona bırakılmıştır. Besiyerinde üreyen farklı koloniler Gram boyama ile boyanarak gram pozitif, iki boyutlu olarak bölündüklerinden çift halde veya tetrat formda kok olan koloniler tekrar MRS besiyerine tek koloni olarak ekilmiştir. Katalaz negatif, vankomisin dirençli ve MRS broth’da gaz oluşturmayanlar Pediococcus cinsine ait olduğu düşünülerek adlandırmaya devam edilmiştir. Tür seviyesinde adlandırmak için Pediococcus cinsine ait olarak belirlenen suşlara 450C’ de üreme, %6,5 NaCl’ de üreme, arginin hidrolizi ve arabinoz, ksiloz, galaktoz, maltoz, laktoz karbonhidratlarının fermentasyon testleri uygulanmıştır [93, 94, 95]. Yapılan bu testler sonucunda 9 Pediococcus pentosaceus, 6 Pediococcus dextrinicus, 1 Pediococcus inopinatus, 1 Pediococcus acidilactici adlandırılmıştır (Çizelge 3.5). d: değişken 11-89% Maltoz Arabinoz Laktoz d + Galaktoz 45 cC’de üreme + + + 0 + + Ksiloz P. pentosaceus P. dextrinicus P. inopinatus P. acidilactici %6,5 NaCl’de üreme Pediococcus Türleri Arginin hidrolizi Çizelge 3.5. Pediococcus türlerinin identifikasyonunda kullanılan fizyolojik testler d + + d + + + + + - + d + d + d 27 Leuconostoc suşlarının izolasyonu ve adlandırılması Çiğ süt örneklerinden Leuconostoc’ ların izolasyonu için MRS besiyerine ekim yapılarak 370C’ de 24-48 saat inkübasyona bırakılmıştır. İnkübasyon sonunda üreyen koloniler Gram boyama ile boyanarak mikroskopta gram pozitif, çift veya zincir şeklinde kok morfolojisine sahip olup olmadığı gözlenmiştir. Leuconostoc olduğu düşünülen koloniler tekrar MRS besiyerinde üretilip katalaz, vankomisin ve MRS broth’ da gaz testine alınmıştır. Katalaz negatif, vankomisin dirençli ve MRS broth’ da gaz oluşturanlar Leuconostoc cinsine ait olarak tespit edilmiştir. Tür adlandırmasında, esculin hidrolizi, rafinoz, sükroz, laktoz, mannitol, salisin ve ksiloz karbonhidratlarının fermentasyon testleri yapılmıştır [95, 96]. Bu testlerin sonucunda 5 L. mesemteroides ssp. mesenteroides, 3 L. mesenteroides ssp. dextranicum adlandırılmıştır (Çizelge 3.6). Rafinoz Sükroz Laktoz Salisin Mannitol L. mesemteroides ssp. mesenteroides + L. mesenteroides ssp. dextranicum + Ksiloz Leuconostoc Türleri Esculin Çizelge 3.6. Leuconostoc türlerinin adlandırılmasında kullanılan fizyolojik testler d d d d + + d + d - d - d: değişken 11-89% Streptococcus suşlarının izolasyonu ve adlandırılması Araştırmamızda çiğ süt örneklerinden Streptococcus’ ların izolasyonu için MRS besiyerine ekim yapılıp 370C’ de 24-48 saat inkübasyona bırakılmıştır. Besiyerinde üreyen koloniler Gram boyama ile boyanmıştır. Gram pozitif, çift, uzun veya kısa zincirler oluşturan koklar MRS besiyerine tekrar tek koloni olarak ekilmiştir. Bakterilere önce katalaz ve vankomisin testi uygulanmıştır. Katalaz negatif, vankomisin duyarlı olanlar Streptococcus cinsine ait olarak tespit edilmiştir. 28 Streptococcus’ ların tür adlandırılmalarında 100C ve 450C’ de üreme, %6,5 NaCl’ de üreme, arginin hidrolizi esculin hidrolizi, sükroz, mannitol, rafinoz karbonhidratlarından fermentasyon testleri yapılmıştır [97, 98]. Testlerin sonucunda ise 4 Streptococcus lactis, 1 Streptococcus cremoris izole edilip adlandırılmıştır (Çizelge 3.7). %6,5 NaCl’de üreme Arginin Esculin Sükroz Mannitol Rafinoz Streptococcus lactis Streptococcus cremoris 450C’de üreme Streptococcus Türleri 100C’de üreme Çizelge 3.7. Streptococcus türlerinin adlandırılmasında kullanılan biyokimyasal testler + + - - + - + - d d - - d: değişken 11-89% Enterococcus faecalis ve 1 Enterococcus faecium, Streptococcaceae familyasına ait 3 Lactococcus lactis ssp. lactis bakterileri de MRS besiyerinde üretilip cins seviyesinde adlandırılmıştır. Daha sonra tür adlandırmasında 100C-450C’ de üreme, %6,5 NaCl’ de üreme, arginin hidrolizi ve galaktoz, maltoz, laktoz, rafinoz karbonhidratlarının fermentasyon testleri uygulanmıştır. İzole edilen tüm laktik bakteri suşlarına uygulanan bioşimik testler Çizelge 3.8.’de gösterilmiştir. İzole edilen Laktik asit bakterilerinin identifikasyonunda yapılan biyoşimik testler kullanılarak manual adlandırılmaları yapılmıştır. Bununla beraber BBL Crystal Gram Positive ID Kit, Pediococcus pentosaceus ve Lactococcus lactis ssp. lactis bakterilerinin adlandırılmasında kullanılmıştır. BBL Crystal Gram Positive ID Kit; Çizelge 3.9.’da gösterilen enzim ve biyokimyasal testlerin bir arada bulunduğu kuyucuk sisteminden oluşur. Bu sisteme göre kuyucuklardaki renk değişimlerine göre testler pozitif ve negatif değerlendirmeye alınarak, 10 basamaklı rakamsal bir kod oluşturulur. Bilgisayar programında, hesaplanan kod ile bakteri izolatının morfolojik (kok veya basil) şekline göre bakterilerin identifikasyonu yapılmaktadır. 29 30 31 32 33 3.2. Çiğ Sütten İzole Edilen Laktik Asit Bakterilerinin Proteolitik Enzim Aktivitelerinin Belirlenmesi 3.2.1. İzole edilen bakterilerin proteolitik aktivitelerinin belirlenmesinde kullanılan besiyeri Calsium caseinate Agar (Merck 1.05409) Bileşimi gr/L Pepton 4,0 gr Et özütü 2,0 gr Pepton from casein 2,0 gr Calsium caseinate 3,5 gr Kalsiyum klorid 0,2 gr Tripotasyum sitrat monohidrat 0,35 gr Disodyum hidrojen fosfat 0,105 gr Potasyum dihidrojen fosfat 0,035 gr Sodyum klorid 5,0 gr Agar 13,0 gr Yukarıda verilen maddeler 1000 ml distile su içerisinde çözdürülür. Bu maddelere ilave olarak 5-7,5 gr/L Skim milk eklenir. 1210C’de 15 dakika otoklavda steril edilir, steril petri kutularına 12,5’er ml taksim edilir. 3.2.2. İzole edilen bakterilerin proteolitik aktivitelerinin değerlendirilmesinde kullanılan yöntem Calsium Caseinate Agar besiyerine proteolitik aktivitesi test edilecek olan izolat, nokta ekim yöntemiyle ekilir. 370C’de 24-48 saat inkübasyona bırakılır. İnkübasyon sonrası etrafında berrak zon görülen koloniler proteolitik aktivitesi pozitif olarak değerlendirilir. Zon çapları mm olarak ölçülür. 4 mm’ nin üzerinde zon çapı olan bakteri izolatları proteolitik aktif olarak değerlendirilir. 34 3.3. Çiğ Sütten İzole Edilen Laktik Asit Bakterilerinin Lipolitik Enzim Aktivitelerinin Belirlenmesi 3.3.1. İzole edilen bakterilerin lipolitik aktivitelerinin belirlenmesinde kullanılan besiyeri Tributyrin Agar (Merck 1.01957) Bileşimi gr/L Pepton 5,0 gr Maya özütü 3,0 gr Tributrin (Glycerol tributyrate) 10,0 gr Agar 15,0 gr Yukarıda verilen maddeler 1000 ml distile su içerisinde çözdürülür. 1210C’de 15 dakika otoklavda sterilize edilir. Steril petri kutularına 12,5’er ml taksim edilir. 3.3.2. İzole edilen bakterilerin lipolitik aktivitelerinin değerlendirilmesinde kullanılan yöntem İçeriği verilen Tributyrin Agar besiyerine lipolitik aktivitesi test edilecek olan izolat, nokta ekim yöntemiyle iğne öze ile ekilir. 370C’de 24-48 saat inkübasyondan sonra etrafında berrak zon oluşan koloniler lipolitik aktivitesi pozitif olarak değerlendirilir. 3.4. İzole Edilen Laktik Asit Bakterilerinde Elastaz Varlığının Araştırılması Laktik asit bakterilerinde, elastaz varlığının araştırılmasında; elastinli nutrient agar besiyeri hazırlanır. Nutrient agarın hazırlanışı: 8 gr nutrient buyyon ve 20 gr noble agar 1000 ml distile suda çözdürülerek, pH= 7,5’e ayarlanır. 1210C’de 15 dakika steril edildikten sonra steril petrilere dağıtılmıştır. Sonra 40C’de saklanmıştır. 35 Elastinli tabakanın hazırlanışı: 2,4 gr nutrient buyon, 6 gr noble agar ve 1 gr elastin 300 ml distile suda çözdürülerek, pH= 7,5’e ayarlanmış ve buzdolabında bir gece kurutulan nutrient agar üzerine ikinci bir tabaka olacak şekilde, her bir petri kabına, ikinci tabak olarak, 5 ml kadar dökülmüştür. Elastin-nutrient agara, bakteri kültürlerinden çizgi şeklinde ekim yapılarak önce 2448 saat 370C’de sonra 48 saat +40C’de inkübe edilmiştir. Ekim bölgelerinde şeffaf zonların varlığı gözlenmiştir. Her izolatın elastolitik aktivitesi; aşağıda belirtilen formüle göre değerlendirilmiştir. Üreme Genişliği (mm) / (Üreme genişliği(mm) + şeffaf zon (mm)) Bu formüle göre, oran 1’den ne kadar küçükse bakteri suşunun enzim üretiminin o kadar fazla olduğu belirtilmiştir. Oran 1’e eşit ise bakteri enzim üretmiyor, demektir [99]. 3.5. İzole Edilen Laktik Asit Bakterilerinde -Amilaz Varlığının Araştırılması 3.5.1. Yöntem Laktik asit bakterileri, α-amilaz aktivitesinin belirlenebilmesi için önce Luria Bertani broth’da 37 °C’de kültüre alınmıştır. Üreyen bakterilerden steril öze yardımıyla Luria Bertani-Nişasta Agar besiyerine çizgi yöntemiyle ekim yapılarak, 37 °C’de 24 saat inkübasyona bırakılmıştır. [100]. Bakteri kolonileri geliştikten sonra plak iyodin boyasıyla boyanmıştır. İyodin boyası nişastalı zemini maviye boyayacağından, maviye boyanmış zemin etrafında beyazımsı halka oluşturan koloniler α-amilaz pozitif olarak değerlendirilmiştir. 3.5.2. Kullanılan besiyerleri Luria Bertani Broth (Difco 244610) Bileşimi gr/L 36 Tryptone 10 gr Yeast Extract 5 gr Sodium chloride 10 gr Besiyerinden 25 Gram tartılıp 1000 ml distile su içinde çözdürülür. Homojenize olması için 1 dakika süre boyunca kaynatılır, 5’er ml olacak şekilde tüplere dağıtılır ve 121°C'de otoklavda 15 dakika steril edilir. Luria Bertani- Nişasta Agar Bileşimi gr/L Tripton 10 gr Maya Ekstraktı 5 gr NaCl 10 gr Agar 15 gr Nişasta 5 gr Yukarıda verilen maddeler 1000 ml distile su içerisinde çözdürülür. 1210C’de 15 dakika otoklavda sterilize edilir. Steril petri kutularına 12,5’er ml taksim edilir. İyodin Boyası (100 ml) Metanol 50 ml Potasyum iyodid 10 gr İyodin (iyot) 1 gr Yukarıda belirtilen miktarlarda kimyasal malzemeler hazırlanarak bir erlenin içerisine konur. Bir miktar saf su ilave edilerek manyetik karıştırıcıda çözdürülür. Hacim saf su ile 100 ml’ye tamamlanır. 37 3.6. Laktik Asit Bakterilerinin Hemolitik Aktivitelerinin Belirlenmesi 3.6.1. Yöntem İzole edilen laktik asit bakterilerinde hemolitik aktivitenin belirlemesi için 370C’de 18 saat geliştirilen bakteri kültürlerinden ticari olarak temin edilen ve %5 koyun kanı içeren Tryptose Blood Agar Base ortamına çizgi yöntemiyle ekim yapılmıştır. 370C’de 24 saat inkübasyondan sonra kolonilerin etrafında parlak zon oluşumu hemoliz pozitif olarak değerlendirilmiştir. 3.6.2. Kullanılan besiyerleri Tryptose Blood Agar Base ( Oxoid CM233) Bileşimi gr/L Tryptose 10,0 gr Lab-lemco powder 3,0 gr Sodyum klorid 5,0 gr Agar 12,0 gr Tryptose Blood Agar Base’den 30 gram tartılıp, 1000 ml distile su içinde çözdürülür. 1210C’de 15 dakika steril edilen besiyeri 470C’ye kadar soğutultuktan sonra içerisine %5 oranında kan ilave edilip karıştırıldıktan sonra steril plaklara 12,5 ml taksim edilir. 3.7. Laktik Asit Bakterilerinin Patojen Bakteriler Üzerine İnhibitör Etkisi Araştırmamızın diğer bir aşamasında çiğ sütten izole edilerek adlandırılan laktik asit bakterilerinin Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes, E.coli, Klebsiella pneumoniae ve Salmonella typhimurium patojen bakteriler üzerine inhibitör etkileri çalışılmıştır. Bu amaçla Nutrient agar, %0,2 glikoz ilave edilmiş Nutrient agar besiyerleri kullanılmıştır. Bu besiyerlerinde kuyu difüzyon yöntemiyle inhibitör etki 38 araştırılmıştır. Kuyu difüzyon yöneminde test bakterisi olarak laktik asit bakterileri, indikatör bakteri olarak da patojen bakteriler kullanılmıştır. S. aureus, L. monocytogenes, E.coli, K. pneumoniae ve S. typhimurium patojen bakterileri G.Ü, Fen Fakültesi Biyoloji Bölümü, Mikrobiyoloji Laboratuarında izole edilip adlandırılmış saf kültürler olup kontrol testleri yapılmıştır. 3.7.1. Nutrient agar da kuyu difüzyon yöntemi Laktik asit bakterilerinin inhibitör etkileri agar kuyu difüzyon yöntemi kullanılarak tespit edilmiştir. Bu yöntemde Nutrient Agar besiyeri kullanılmıştır [101]. Öncelikle indikatör olarak kullanılan patojen bakteriler (S. aureus, L. 0 monocytogenes, E.coli, K. pneumoniae ve S. typhimurium) 37 C’de Brain Heart Infusion broth’da aktifleştirilmiştir. Nutrient agar besiyeri 1210C’de 15 dakika steril edilmiştir. Besiyerinin ısısı 370C’ye düşünce aktifleştirilen patojen bakteriler steril pipet ile 100 ml besiyerinde 1 ml olacak şekilde ilave edilmiştir. Besiyeri homojen oluncaya kadar karıştırılıp steril petri kutularına 25’er ml taksim edilmiştir. Besiyerinin donması için bir süre beklendikten sonra agar üzerinde 10 mm çapında steril kuyu açar ile belirli aralıklarla kuyular açılmıştır. Açılan kuyulara dipleri kapanacak şekilde steril Nutrient agar damlatılmıştır. MRS broth’ da aktifleştirilen laktik asit bakteri kültürlerinden kuyulara 50-100 µl pipetlenmiştir. Laktik asit bakterilerinin difüze olmaları için petri kutuları 2 saat buzdolabında bekletilmiştir. Daha sonra buzdolabından alınarak 370C’de 24 saat inkübasyona bırakılmıştır. İnkübasyon sonunda oluşan inhibisyon zon çapları ölçülmüştür. Ölçüm işlemi 10 mm’lik kuyu çapında dışında oluşan inhibisyon zonu ölçülerek yapılmıştır. 3.7.2. %0,2’lik glikoz içeren nutrient agar da kuyu difüzyon yöntemi Laktik asit bakterilerinin indikatör bakteriler üzerine inhibitör etkilerinin organik asitten kaynaklanıp kaynaklanmadığını saptamak için önce asit etkileri önlenmeden yukarıda anlatıldığı gibi kuyu difüzyon yöntemi uygulanıp test sonuçları gözlenmiştir. İkinci uygulamada organik asit etkileri önlenerek testler tekrar 39 edilmiştir. Organik asit etkisinin engellenmesi için Nutrient agar besiyerinin içerisine %0,2 oranında glikoz ilave edilmiştir [77]. Böylece asit formu nötralize edilmiştir. 3.7.3. Kuyu difüzyon yönteminde kullanılan besiyeri Nutrient Agar (LAB M -LAB8) Bileşimi gr/L Lab-Lemco powder 1gr Yeast extract 2 gr Peptone 5 gr Sodium chloride 5 gr Agar 15 gr Distile su 1000 ml pH 7,4±0,2’ye ayarlanıp 1210C’de 15 dakika steril edilmiştir. Daha sonra petri kutularına 25’er ml taksim edilmiştir. 3.7.4. Laktik asit bakterileri ve indikatör patojen bakterilerin aktifleştirilmesinde kullanılan besiyerleri MRS Broth ( LABM- LAB94) Bileşimi gr/L Pepton Yeast extract Beef extract Glucose Di-potassium hydrogen phosphate 10 gr 5 gr 10 gr 20 gr 2 gr Sodium asetate Tri amonium citrate Magnesium sulphate 7 H2O Manganase sulphate 4 H2O Tween 80 Distile su 5 gr 2 gr 0,02 gr 0,05 gr 1,08 ml 1000 ml 40 pH 6,2±0,2’ye ayarlanıp tüplere 10’ar ml taksim edilip, 1210C’de 15 dakika steril edilmiştir. BHI (Brain Heart Infusion ) (OXOİD CM 375) Bileşimi gr/L Calf brain infusion solids Beef heart infusion solids Protease peptone 12,5 gr 5 gr 10 gr Sodium chloride Glucose Disodium phosphate Distile su 5 gr 2 gr 2,5 gr 1000 ml pH 7,4±0,2’ye ayarlanıp tüplere 10’ar ml taksim edilip, 1210C’de 15 dakika steril edilmiştir. 3.8. Laktik Asit Bakterilerinin İzolasyonunda Kullanılan Temel Besiyerleri MRS (De Man Rogosa Sharpe) Agar (OXOID CM 361) Bileşimi gr/L Peptone 10 gr Yeast extract 8 gr Beef extract 4 gr Glucose 20 gr Sorbitan mono-oleate 1 gr Di-potasium hydrogen phosphate 2 gr Sodium asetate 3 H2O 5 gr Tri amonium citrate 2 gr Magnesium sulphate 7 H2O 0,02 gr Manganase sulphate 4 H2O 0,05 gr Agar 10 gr Distile su 1000 ml 41 pH 6,2±0,2’ye ayarlanıp 1210C’de 15 dakika steril edilir. Sonra petri kutularına yaklaşık 25’er ml taksim edilir. Standart Plate Count Agar (PCA) (LABM- LAB149) Bileşimi gr/L Tripton 5 gr Maya özütü 2,5 gr Glikoz 1 gr Agar 15gr Distile su 1000 ml pH:7,0 ±0,2 ayarlandıktan sonra 121°C de 15 dakika steril edilerek steril petri kutularına dağıtılır. Peptone Water (MERCK 1.07228) Bileşimi gr/L Peptone 10 gr Sodium chloride 5 gr Distile su 1000 ml pH 7,4±0,2’ye ayarlanıp tüplere 9’ar ml taksim edilip, 1210C’de 15 dakika steril edilmiştir. 3.9. Laktik Asit Bakterilerinin İdentifikayonunda Kullanılan Besiyerleri ve Uygulanan Testler 3.9.1. Gram boyama Klasik Gram boyama yöntemindeki Kristal Viyole, Lügol, %70’lik Alkol ve Bazik Fuksin hazırlanarak Gram boyama yapılmıştır. Mikroskopta 100x büyütmede, immersiyon yağı kullanılarak inceleme yapılmıştır. 42 3.9.2. Katalaz testi Lam üzerine saf laktik asit kültürü kolonilerinden bir öze dolusu alınıp, koloni üzerine iki üç damla %3 hidrojen peroksit (H2O2) damlatılarak karıştırılmıştır. Lam üzerinde gaz kabarcıklarının oluşmaması katalaz negatif olarak değerlendirilmiştir. 3.9.3. Vankomisin duyarlılık testi Laktik asit bakterilerinin cins seviyesinde adlandırılmasında vankomisin (30µg disk) antibiyotiğine karşı bakteri izolatlarının duyarlılığı test edilmiştir. Öncelikle Mueller hinton agar besiyerine tek koloni ekimi yapılan izolatlar, 0,5 Mc farland bulanıklığında serum fizyolojiğe inoküle edilmiştir. Daha sonra Mueller hinton agar besiyerine steril eküvyon ile serum fizyolojikten yayma ekimi yapılarak vankomisin antibiyotik diskleri yerleştirilmiştir. 370C’ de 24 saat inkübasyon sonunda antibiyotik diski etrafında oluşan zon çapları ölçülerek değerlendirilmiştir. Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) kriterlerine göre laktik asit bakterilerinin vankomisine duyarlılığı; zon çapı ≥17 ise duyarlı, ˂17 ise dirençli olarak değerlendirilmiştir. Mueller Hinton Agar (OXOID CM 0337) Bileşimi Beef dehydrated infusion from gr/L 30,0 gr Casein hydrolysate 17,5 gr Strach 1,5 gr Agar 17 gr Mueller hinton agar besiyeri içeriğine göre tartılıp 1000 ml distile su içinde çözdürülür. 1210C’ de 15 dakika steril edilir. Serum Fizyolojik Bileşimi gr/L 43 Sodyum chloride (NaCl) 9 gr Distile su 1000 ml Hazırlanan bileşim tüplere 1 ml olarak aktarılıp, 1210C’ de 15 dakika otoklavda steril edilir. Bakteri kültürlerinden 0,5 Mc farland bulanıklığında tüplere inoküle edilir. 3.9.4. MRS broth’da gaz testi MRS Broth ( LABM- LAB94) Bileşimi gr/L Pepton 10 gr Yeast extract 5 gr Beef extract 10 gr Glucose 20 gr Di-potassium hydrogen phosphate 2 gr Sodium asetate 5 gr Tri amonium citrate 2 gr Magnesium sulphate 7 H2O 0,02 gr Manganase sulphate 4 H2O 0,05 gr Tween 80 1,08 ml Distile su 1000 ml pH 6,2±0,2’ye ayarlanıp, içinde durham tüpü bulunan tüplere 9’ar ml taksim edilip, 1210C’de 15 dakika steril edilmiştir. Steril öze ile inoküle edilen laktik asit kültürleri 370C’de 24 saat inkübasyona bırakılır. İnkübasyon sonunda durham tüplerinde hava kabarcığının gözlenmesi gaz (+) olarak değerlendirilmiştir (Resim 3.1). 44 gaz (+) gaz (-) Resim 3.1. MRS broth’da gaz testi 3.9.5. 100C ve 450C ‘ de üreme Laktik asit bakterilerinin saf kültüründen Todd Hewit Broth’a ekim yapılmıştır. Tüpler 100C’ de 7 gün, 450C ‘ de 1 gün inkübasyona bırakılmıştır. İnkübasyon sonucunda bulanıklığın görülmesi pozitif reaksiyon olarak değerlendirilmiştir. Todd Hewit Broth ( LABM LAB75) Bileşimi gr/L Infusion from 450 gr fat-free minced meat 10 gr Tryptone 20 gr Sodium bicarbonate 2 gr Sodium chloride 2 gr Di-potasium phosphate 0,4 gr Distile su 1000 ml pH 7,4±0,2’ye ayarlanıp tüplere 5’er ml taksim edilip, 1210C’de 15 dakika steril edilmiştir. 45 3.9.6. Arginin hidrolizi Bileşimi gr/L Peptone 1 gr Sodium chloride 5 gr Di-potasium hydrogen phosphate 0,3gr Agar 3 gr Phenol red 0,01 gr L- arginine monohydrochloride 10 gr Distile su 1000 ml pH 7,4±0,2’ye ayarlanıp tüplere 4’er ml taksim edilip, 1210C’de 15 dakika steril edilmiştir [90]. Arginin hidrolizi için laktik bakteri kültürlerinden 3-4 koloni, hazırlanan tüplere inoküle edilip, 370C’ de 24-48 saat inkübasyona bırakılmıştır. İnkübasyon sonunda besiyerinin portakal sarıdan mor renge dönüşmesi arginin pozitif olarak değerlendirilmiştir (Resim 3.2). Resim 3.2. Arginin hidrolizi Pembe-mor arginin (+) / Portakal sarı arginin (-) 46 3.9.7. Esculin hidrolizi Bile Esculin Agar ( DIFCO 0879-17) Bileşimi gr/L Esculin 1 gr Ferrik citrate 0,5 gr Peptone 10 gr NaCl 5 gr Distile su 1000 ml 1210C’de 15 dakika steril edilip, yaklaşık 25’er ml petri kutularına taksim edilmiştir. Laktik kültürlerin esculin hidrolizi, çizgi ekim yöntemiyle inkübasyon sonunda besiyerinde siyaha doğru renk değişikliği ile kontrol edilmiştir (resim 3.3). Resim 3.3. Esculin hidrolizi - Siyah (+) 47 3.9.8. %6,5 NaCl’de üreme Bileşimi gr/L Peptone 10 gr Lab- Lemco powder 10 gr Glucose 10 gr NaCl 65 gr Distile su 1000 ml pH 7,4±0,2’ye ayarlanıp tüplere 5’er ml taksim edilip, 1210C’de 15 dakika steril edilmiştir [93]. Laktik bakteri kültürleri %6,5 NaCl içeren tüplere inoküle edilerek 370C’ de 24-72 saat inkübasyona bırakılmıştır. İnkübasyon sonunda bulanıklığın gözlenmesi pozitif reaksiyon olarak değerlendirilmiştir. 3.9.9. Karbonhidrat fermentasyon besiyeri Purple Broth Base Bileşimi gr/L Protease peptone 10 gr Beef extract 1 gr Sodium chloride 5 gr Brom cresol purple 0,02 gr Distile su 1000 ml pH 6,8±0,2’ye ayarlanıp, tüplere 9 ml pipetlenerek 1210C’de 15 dakika steril edilmiştir. Bakterilerin biyoşimik testlerinde kullanılmak üzere hazırlanmış temel besiyeridir. Besiyerinin rengi indikatör maddeden dolayı koyu menekşe rengindedir. 48 Karbonhidrat Solüsyonu Laktoz, galaktoz, maltoz, rafinoz, sükroz, salisin, mannitol, ksiloz, sorbitol, arabinoz. Karbonhidrat 1 gr Distile su 10 ml Yukarıda adı geçen şeker solüsyonları 0,2-0,45 µm’lik membran filtreleriyle steril edilmiştir. Steril şeker solüsyonu steril pipetle 1 ml, daha önce hazırlanmış temel besiyeri üzerine ilave edilmiştir. Şeker içeren besiyerine aktif bakteri kültüründen ekim yapılıp 7 gün 370C’de inkübe edilmiştir. Şekeri kullanarak asit üreten bakteri türleri tüplerdeki indikatör koyu menekşe rengini sarıya dönüştürdüğü gözlenmiştir (Resim 3.4). Mor (-) Resim 3.4. Karbonhidrat hidrolizi sarı (+) 49 4. BULGULAR Araştırmamızda Nisan 2011-Mart 2012 tarihleri arasında Ankara ili çevresi ve çeşitli illerden toplanan 30 çiğ süt örneğinden Lactobacillales takımına ait 74 izolat izole edilip adlandırılmıştır. 74 Laktik asit bakteri izolatının Lactobacillaceae familyasına ait 38’i Lactobacillus (%51,4), 17’si Pediococcus (%23) cinsine aittir. Leuconostocaceae familyasına ait 8 Leuconostoc (%10,8) izolatı, Streptococcaceae familyasına ait 5 Streptococcus (%6,8), 3 Lactococcus (%4) izolatı ve Enterococcaceae familyasından 3 Enterococcus (%4) izolatı tespit edilmiştir (Çizelge 4.1 ve Şekil 4.1). Çiğ sütten izole edilen laktik asit bakterilerinin adlandırılmasında cins ve tür özelliklerine göre biyokimyasal testler yapılmış ve Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology referansına göre adlandırılmıştır. Tür seviyesinde identifikasyonu yapılan laktik asit bakterilerinin proteaz, lipaz, elastaz, -amilaz, hemolitik enzim aktiviteleri çalışılmıştır. Ayrıca bu izolatların bazı patojen bakterilere karşı inhibitör etkisi araştırılmıştır. Çizelge 4.1.Çiğ sütten izole edilen laktik asit bakterilerinin cinslere göre dağılımı İzole Edilen Bakteri Cinsi İzolat Sayısı % Lactobacillus 38 51,4 Pediococcus 17 23 Leuconostoc 8 10,8 Streptococcus 5 6,8 Lactococcus 3 4 Enterococcus 3 4 Toplam 74 100 50 Şekil 4.1. Çiğ sütten izole edilen laktik asit bakterilerinin cinslere göre dağılımı Araştırmada, çeşitli illerden çiğ süt örnekleri toplanmıştır. Ankara’dan toplanan 13 adet çiğ süt örneğinden 37 izolat elde edilmiştir. 37 izolatın 18’i Lactobacillus, 8’i Pediococcus, 5’i Leuconostoc, 5’i Streptococcus ve 1 Lactococcus cinsi olarak izole edilmiştir. Burdur’dan toplanan 5 adet çiğ süt örneğinden 13 izolat elde edilmiştir. 13 izolatın 8’i Lactobacillus, 4’ü Pediococcus ve 1 Leuconostoc cinsi olarak izole edilmiştir. Kırıkkale’den toplanan 4 adet çiğ süt örneğinden 8 izolat elde edilmiştir. 8 izolatın 3’ü Lactobacillus, 3’ü Enterococcus, 1 Pediococcus ve 1 Leuconostoc cinsi olarak izole edilmiştir. Konya’dan toplanan 4 çiğ süt örneğinden 11 izolat elde edilmiştir. 11 izolatın 5’i Lactbacillus, 4’ü Pediococcus, 1 Leuconostoc ve 1 Lactococcus cinsi olarak izole edilmiştir. Bursa’dan toplanan 4 çiğ süt örneğinden 5 izolat elde edilmiştir. 5 izolatın 4’ü Lactobacillus ve 1 Lactococcus cinsi olarak izole edilmiştir. Bu durumda tür çeşitliliği bakımından en fazla olan il Ankara olarak tespit edilmiştir. Laktik asit bakterileri arasında en fazla izole edilen cins ise Lactobacillus olarak belirlenmiştir (Çizelge 4.2). Çizelge 4.2. Çiğ süt örneklerinin toplandığı illerin cinslere göre dağılımı Çiğ sütten izole edilen örnekler Lactobacillus Pediococcus Leuconostoc Streptococcus Lactococcus Enterococcus Toplam Çiğ süt örneklerinin toplandığı iller Ankara Burdur Kırıkkale Konya Bursa Toplam 18 8 5 5 1 37 8 4 1 13 3 1 1 3 8 5 4 1 1 11 4 1 5 38 17 8 5 3 3 74 51 Çiğ sütten izole edilen laktik asit bakterilerinin tür dağılımları çizelge 4.3.’de gösterilmektedir. İzole edilen laktik asit bakterileri; 10 Lactobacillus delbrueckii ssp. lactis, 9 Lactobacillus casei, 6 Lb. rhamnosus, 5 Lb. acidophilus, 5 Lb. coryniformis ssp. torquens, 3 Lb. plantarum ssp. plantarum, 9 Pediococcus pentosaceus, 6 P. dextrinicus, 1 P. inopinatus, 1 P. acidilactici, 5 Leuconostoc mesenteroides ssp. mesenteroides, 3 Leuconostoc mesenteroides ssp. dextranicum, 4 Streptococcus lactis, 1 Streptococcus cremoris, 3 Lactococcus lactis ssp. lactis, 2 Enterococcus faecalis ve 1 Enterococcus faecium olarak belirlenmiştir. Çizelge 4.3. Çiğ sütten izole edilen laktik asit bakterilerinin türlere göre dağılımı CİNSLER LACTOBACİLLUS LEUCONOSTOC ENTEROCOCCUS STREPTOCOCCUS PEDİOCOCCUS LACTOCOCCUS TOPLAM İZOLAT SAYISI % Lb. delbrueckii ssp. lactis 10 13,5 Lactobacillus casei 9 12,2 Lactobacillus rhamnosus 6 8,2 Lactobacillus acidophilus 5 6,8 Lb. coryniformis ssp. torquens 5 6,8 Lb. plantarum ssp. plantarum 3 4 Leu. mesenteroides ssp. mesenteroides 5 6,8 Leu. mesenteroides ssp. dextranicum 3 4 Enterococcus faecalis 2 2,7 Enterococcus faecium 1 1,3 Streptococcus lactis 4 5,4 Streptococcus cremoris 1 1,3 Pediococcus pentosaceus 9 12,2 Pediococcus dextrinicus 6 8,2 Pediococcus inopinatus 1 1,3 Pediococcus acidilactici 1 1,3 Lactococcus lactis ssp. lactis 3 4 74 100 TÜRLER İzole edilen laktik asit bakterilerinin %’lik dağılımı; %13,5 Lactobacillus delbrueckii ssp. lactis, %12,2 Lactobacillus casei, %8,2 Lactobacillus rhamnosus, %6,8 Lactobacillus acidophilus, %6,8 Lb. coryniformis ssp. torquens, %4 Lb. plantarum 52 ssp. plantarum, %6,8 Leu. mesenteroides ssp. mesenteroides, %4 Leu. mesenteroides ssp. dextranicum, %2,7 Enterococcus faecalis, %1,3 Enterococcus faecium, %5,4 Streptococcus lactis, %1,3 Streptococcus cremoris, %12,2 Pediococcus pentosaceus, %8,2 Pediococcus dextrinicus, %1,3 Pediococcus inopinatus, %1,3 Pediococcus acidilactici, %4 Lactococcus lactis ssp. lactis olarak tespit edilmiştir (Şekil 4.2). Şekil 4.2. Çiğ sütten izole edilen laktik asit bakterilerinin tür sayısına göre dağılımı Çiğ sütten izole edilen 38 Lactobacillus bakterisi; 10’u(%26,3) Lactobacillus delbrueckii ssp. lactis, 9’u(%23,7) Lactobacillus casei, 6’sı(%15,8) Lb. rhamnosus, 5’i(%13,1) Lb. acidophilus, 5’i(%13,1) Lb. coryniformis ssp. torquens, 3’ü(%8) Lb. plantarum ssp. plantarum olarak tanımlanmıştır. Lactobacillus bakterilerinin tür dağılımı şekil 4.3.’te gösterilmektedir. 53 Şekil 4.3. İzole edilen Lactobacillus türlerinin %’lik dağılımı Çiğ sütten izole edilen 17 Pediococcus bakterisi; 9’u (%52,9) Pediococcus pentosaceus, 6’sı (%35,3) Pediococcus dextrinicus, 1’i (%5,9) Pediococcus inopinatus, 1’i (%5,9) Pediococcus acidilactici olarak tanımlanmıştır. (şekil 4.4.) Şekil 4.4. İzole edilen Pediococcus türlerinin %’lik dağılımı 54 Çiğ sütten izole edilen 8 Leuconostoc bakterisi; 5’i (%62,5) Leu. mesenteroides ssp. mesenteroides, 3’ü ( %37,5) Leu. mesenteroides ssp. dextranicum olarak tanımlanmıştır. Şekil 4.5.’ te gösterilmektedir. Şekil 4.5. İzole edilen Leuconostoc türlerinin %’lik dağılımı Çiğ sütten izole edilen Streptococcus cinsi 5 izolatın; 4 (%80)’ ü Streptococcus lactis ve 1 (%20)’ i Streptococcus cremoris olarak adlandırılmıştır. (Şekil 4.6.) Şekil 4.6. İzole edilen Streptococcus türlerinin %’lik dağılımı Ayrıca Enterococcus cinsine ait toplam 3 izolatın 2 (%66,6)’ si Enterococcus faecalis ve 1 (%33,3)’ i Enterococcus faecium olarak tanımlanmış ve toplam 3 (%100) izolat Lactococcus lactis ssp. lactis türü izole edilip adlandırılmıştır. 55 4.1. Laktik Asit Bakterilerinin Proteolitik Enzim Aktivitelerinin Değerlendirilmesi 4.1.1. Proteaz enzim varlığının araştırılması Araştırmada, çiğ sütten izole edilen 74 laktik bakteri izolatının Calsiyum Kazeinat Agar’ da 370C’de proteolitik aktiviteleri çalışılarak, Proteaz enzim aktivite zon çapları belirlenmiştir. Toplam 74 izolatın 70 (%94,6) ‘inde proteolitik aktivite gözlenirken, 4 (%5,4) izolatta proteolitik aktivite gözlenmemiştir. Laktik asit bakterilerinin proteolitik aktiviteleri cins bazında değerlendirildiğinde izole edilen Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus, Lactococcus, Streptococcus ve Enterococcus cinsinin proteolitik aktivite gösterdiği tespit edilmiştir (Çizelge 4.4). Çizelge 4.4. Proteolitik enzim aktivitesi araştırılan Laktik asit bakterilerinin kalsiyum kazeinat agar da oluşturdukları zon çaplarının değerleri İzolat no M1 M2 M3 M4 M5 M6 M7 M8 M9 M10 M11 M12 M13 M14 M15 M16 M17 M18 M19 M20 M21 M22 M23 M24 M25 Tür ismi Lactobacillus casei Lb. rhamnosus Leu. mesenteroides ssp. dextranicum Enterococcus faecalis Lactobacillus casei Lb. delbrueckii ssp. lactis Enterococcus faecalis Lb. rhamnosus Leu. mesenteroides ssp. mesenteroides Pediococcus pentosaceus Pediococcus dextrinicus Lb. plantarum ssp. plantarum Lb. delbrueckii ssp. lactis Lactobacillus casei Lb. rhamnosus Lactococcus lactis ssp. lactis Lactobacillus casei Lb. rhamnosus Lactobacillus casei Lb. coryniformis ssp. torquens Lactococcus lactis ssp. lactis Lactococcus lactis ssp. lactis Leu. mesenteroides ssp. mesenteroides Leu. mesenteroides ssp. mesenteroides Leu. mesenteroides ssp. dextranicum Proteaz enzim aktivite zon çapı (mm) 5 4 8 3 3 4 5 5 6 6 4 4 5 5 7 7 6 5 5 6 8 7 6 5 6 56 Çizelge 4.4. (Devam) Proteolitik enzim aktivitesi araştırılan Laktik asit bakterilerinin kalsiyum kazeinat agar da oluşturdukları zon çaplarının değerleri İzolat no M26 M27 M28 M29 M30 M31 M32 M33 M34 M35 M36 M37 M38 M39 M40 M41 M42 M43 M44 M45 M46 M47 M48 M49 M50 M51 M52 M53 M54 M55 M56 M57 M58 M59 M60 M61 M62 M63 M64 M65 M66 M67 M68 M69 M70 M71 M72 M73 M74 Tür ismi Lb. plantarum ssp. plantarum Lactobacillus casei Pediococcus pentosaceus Lb. coryniformis ssp. torquens Enterococcus faecium Lb. coryniformis ssp. torquens Lb. delbrueckii ssp. lactis Pediococcus pentosaceus Lactobacillus acidophilus Pediococcus pentosaceus Lb. delbrueckii ssp. lactis L. coryniformis ssp. torquens Pediococcus inopinatus Lb. delbrueckii ssp. lactis Pediococcus dextrinicus Lactobacillus acidophilus Pediococcus dextrinicus Pediococcus pentosaceus Streptococcus cremoris Lb. rhamnosus Leu. mesenteroides ssp. mesenteroides Pediococcus dextrinicus Lb. plantarum ssp. plantarum Lactobacillus acidophilus Lb. delbrueckii ssp. lactis Pediococcus dextrinicus Pediococcus pentosaceus Lb. delbrueckii ssp. lactis Leu. mesenteroides ssp. mesenteroides Leu. mesenteroides ssp. dextranicum Lb. coryniformis ssp. torquens Pediococcus acidilactici Lb. rhamnosus Streptococcus lactis Lactobacillus acidophilus Lb. delbrueckii ssp. lactis Pediococcus pentosaceus Pediococcus pentosaceus Lactobacillus casei Streptococcus lactis Pediococcus pentosaceus Lb. delbrueckii ssp. lactis Pediococcus dextrinicus Lactobacillus casei Streptococcus lactis Lactobacillus acidophilus Lactobacillus casei Streptococcus lactis Lb. delbrueckii ssp. lactis Proteaz enzim aktivite zon çapı (mm) 3 6 5 6 5 5 6 8 6 5 6 7 2 5 6 6 6 6 5 4 5 5 5 7 5 5 6 5 6 7 5 7 7 6 6 4 4 5 6 5 5 5 4 4 5 6 4 6 6 4mm (-) / 4-5mm: zayıf (+) / 6-8mm: orta kuvvetli (++) / 11mm ≥ kuvvetli (+++) 57 Araştırmada izole edilen Lactobacillus cinsine ait toplam 38 bakteri suşunun 20 (%52,6)’ sinde zayıf (+) proteolitik aktivite gözlenirken, 16 (%42,1)’ sında orta kuvvetli (++) proteolitik aktivite gözlenmiştir ve 2 (%5,3) laktobasil izolatında proteolitik aktivite gözlenmemiştir. İzole edilen 8 Leuconostoc cinsi izolatın 6 (%75)’ sında orta kuvvetli (++) proteolitik aktivite gözlenirken, 2 (%25)’ sinde zayıf (+) proteolitik aktivite gözlenmiştir. Pediococcus cinsine ait 17 bakteri suşundan 7 (%41,2)’ sinde orta kuvvetli (++) proteolitik aktivite gözlenirken, 9 (%52,9) izolatta zayıf (+) proteolitik aktivite gözlenmiştir ve 1 (%5,9) izolatta aktivite gözlenmemiştir. 5 Streptococcus cinsi izolatın 2 (%40)’ sinde orta kuvvetli (++) proteolitik aktivite gözlenirken, 3 (%60)’ ünde zayıf (+) proteolitik aktivite gözlenmiştir. 3 Enterococcus cinsi izolatın 2 (%66,6)’sinde zayıf (+) proteolitik aktivite gözlenirken, 1 (%33,3) izolatta aktivite gözlenmemiştir ve izole edilen Lactococcus lactis ssp. lactis suşuna ait toplam 3 izolatın 3 (%100)’ ünde de orta kuvvetli (++) proteolitik aktivite gözlenmiştir (Çizelge 4.5 ve Şekil 4.7). Çizelge 4.5. Proteolitik enzim aktivitesi gösteren laktik bakteri izolatlarının cinslere göre dağılımı Laktik Bakteri Cinsleri Lactobacillus Pediococcus Leuconostoc Streptococcus Enterococcus Lactococcus Toplam Zayıf(+) Orta(++) Toplam izolat sayısı 20 9 2 3 2 36 16 7 6 2 3 34 36 16 8 5 2 3 70 Proteolitik Aktivite 58 Şekil 4.7. Proteolitik aktivite gösteren laktik bakteri izolatlarının cinslere göre dağılımı Proteolitik aktivite gösteren 70 izolatın 36 (%51,4) ’sında zayıf (+) proteolitik aktivite gözlenirken, 34 (%48,6)’ ünde orta kuvvetli aktivite gözlenmiştir. Laktik asit bakteri türlerinden 5 Lb. acidophilus, 3 Leu. mesenteroides ssp. dextranicum ve 3 Lactococcus lactis ssp. lactis suşlarının izole edilen bütün suşlarında orta kuvvetli proteolitik aktivite tespit edilmiştir. 8 mm’lik zon çapı ile en yüksek proteolitik aktivite; Lactococcus lactis ssp. lactis, Leu. mesenteroides ssp. dextranicum ve Pediococcus pentosaceus türlerine ait suşlarda olduğu gözlenmiştir. Resim 4.1 de zon çaplarının değerlendirilmesine ait örnek görülmektedir. Resim 4.1. Calsium caseinate agarda proteolitik zon çapları 59 4.1.2. Elastaz enzim varlığının araştırılması Çalışmada, çiğ sütten izole edip adlandırdığımız laktik asit bakterilerinin Elastinli Nutrient Agar da elastaz enziminin varlığı araştırılmıştır. Laktik bakteri kültürlerinden çizgi ekimi yapılan elastinli nuttrient agar da ekim bölgelerinde şeffaf zonların görülmesi beklenmiştir. Ancak 74 laktik asit bakteri suşunun hiç birisinde şeffaf zon çapı gözlenememiştir. Araştırmamızda izole edilen Lactobacillus, Pediococcus, Leuconostoc, Streptococcus, Lactococcus ve Enterococcus cinsi laktik asit bakterilerinin elastaz enzim aktivitelerinin olmadığı gözlenmiştir (Resim 4.2). Resim 4.2. Elastinli nutrient agar da elastaz enzimi varlığı Elastaz (-) 4.2. Laktik Asit Bakterilerinin Lipolitik ve -Amilaz Enzim Aktivitelerinin Değerlendirilmesi Araştırmada çiğ sütten izole edilen 74 laktik asit bakterisinin Tributyrin Agar’ da lipolitik aktiviteleri ve Luria Bertani-nişasta agar da -amilaz enzim aktiviteleri çalışılmıştır. 74 laktik asit bakterisinin Tributyrin agar da lipolitik zon çapı ölçümleri değerlendirilmiştir. 12 laktik bakteri suşunda zon çapı gözlenmiştir. 2 Lb. acidophilus, 2 Lb. delbrueckii ssp. lactis, 2 P. pentosaceus, 2 P. dextrinicus, 2 Leu. mesenteroides ssp. mesenteroides ve 1 E. faecalis türünde lipolitik zon çapı 2 mm 60 olarak ölçülmüştür. Bununla beraber 1 Leu. mesenteroides ssp. dextranicum suşunda lipolitik zon çapı 4 mm olarak kaydedilip, lipolitik aktivite gösterdiği kabul edilmiştir. Zon çapları 2 mm ve 4 mm olarak ölçülen laktik bakteri suşları Çizelge 4.6.’da gösterilmektedir. Çizelge 4.6. Lipolitik enzim aktivitesi gözlenen laktik bakteri türlerinde lipaz aktivite zon çapları (mm) Cins ismi Lactobacillus Pediococcus Leuconostoc Enterococcus Lipaz enzim İzolat no M49 M60 M39 M74 M10 M43 M11 M40 M9 M54 M25 M4 akivitesi Tür ismi Lb. acidophilus Lb. acidophilus Lb. delbrueckii ssp.lactis Lb. delbrueckii ssp.lactis P. pentosaceus P. pentosaceus P. dextrinicus P. dextrinicus L. mesenteroides ssp. mesenteroides L. mesenteroides ssp. mesenteroides L. mesenteroides ssp. dextranicum E. faecalis araştırılan laktik asit Lipaz enzim aktivite zon çapı(mm) 2 mm 2 mm 2 mm 2 mm 2 mm 2 mm 2 mm 2 mm 2 mm 2 mm 4 mm 2 mm bakterileri cins bazında değerlendirildiğinde; Lactobacillus, Pediococcus, Leuconostoc ve Enterococcus cinslerinde lipolitik enzim zon çapları gözenirken, Streptococcus ve Lactococcus cinslerinde lipolitik enzim zon çapları gözlenmemiştir. 4 mm’lik zon çapıyla Leu. mesenteroides ssp. dextranicum türünün bir suşunda lipolitik aktivite tespit edilmiştir. Çiğ sütten izole edilen laktik bakteri suşlarının Luria Bertani- nişasta agar da amilaz enzim aktiviteleri araştırılmıştır. 74 laktik asit bakterisinin 6 izolatında amilaz enzim varlığı tespit edilmiştir. -amilaz enzim aktivitesi Lactobacillus, Pediococcus ve Leuconostoc cinslerinde gözlenirken, Streptococcus, Lactococcus ve Enterococcus cinslerinde gözlenmemiştir. -amilaz enzim aktivitesi gözlenen laktik bakteri türleri Çizelge 4.7.’de gösterilmiştir. 61 Çizelge 4.7. Laktik asit bakterilerinde -Amilaz enzim aktivitesi Cins ismi Lactobacillus Pediococcus Leuconostoc İzolat no M26 M27 M56 M28 M33 M55 Tür ismi Lb. plantarum ssp. plantarum Lb. casei Lb. coryniformis ssp. torquens Pediococcus pentosaceus Pediococcus pentosaceus Leu. mesenteroides ssp. dextranicum -Amilaz enzim aktivitesi + + + + + + Laktik asit bakterilerinden -Amilaz enzim aktivitesi pozitif olan suşlar; Lactobacillus cinsine ait 1 Lb. plantarum ssp. plantarum, 1 Lb. casei, 1 Lb. coryniformis ssp. torquens olarak tespit edilmiştir. Pediococcus cinsinden 2 Pediococcus pentosaceus suşunda -amilaz enzim aktivitesi vardır. Leuconostoc cinsinden 1 Leu. mesenteroides ssp. dextranicum da -amilaz enzim aktivitesi belirlenmiştir. Resim 4.3 de -amilaz enzim aktivitesinin pozitif olduğu bir örnek görülmektedir. Resim 4.3. Luria Bertani-nişasta agar da -Amilaz enzim varlığı 62 Çiğ sütten izole edilip adlandırılan laktik asit bakterilerinin lipolitik ve -amilaz enzim aktiviteleri değerlendirilmiştir. Lipaz ve -amilaz enzim zon çapları gözlenmiştir. Tür seviyesinde bakıldığında hem lipaz hem -amilaz enzim aktivitesi gördüğümüz örnekler olmuştur. Leu. mesenteroides ssp. dextranicum ve Pediococcus pentosaceus türlerinde lipaz ve -amilaz enzim aktivitesi belirlenmiştir. Farklı suş olmalarına rağmen aynı türde hem lipaz hem -amilaz enzim aktivitesi tespit edilmiştir. Çizelge 4.8.’de laktik bakteri suşlarının lipolitik zon çapları ve -amilaz aktiviteleri gösterilmektedir. Çizelge 4.8. Çiğ sütten izole edilen laktik asit bakterilerinin lipoliz zon çapları ve -Amilaz enzim aktiviteleri İzolat no M1 M2 M3 M4 M5 M6 M7 M8 M9 M10 M11 M12 M13 M14 M15 M16 M17 M18 M19 M20 M21 M22 M23 M24 M25 M26 M27 M28 M29 Tür ismi Lactobacillus casei Lb. rhamnosus Leu. mesenteroides ssp. dextranicum Enterococcus faecalis Lactobacillus casei Lb. delbrueckii ssp. lactis Enterococcus faecalis Lb. rhamnosus Leu. mesenteroides ssp. mesenteroides Pediococcus pentosaceus Pediococcus dextrinicus Lb. plantarum ssp. plantarum Lb. delbrueckii ssp. lactis Lactobacillus casei Lb. rhamnosus Lactococcus lactis ssp. lactis Lactobacillus casei Lb. rhamnosus Lactobacillus casei Lb. coryniformis ssp. torquens Lactococcus lactis ssp. lactis Lactococcus lactis ssp. lactis Leu. mesenteroides ssp. mesenteroides Leu. mesenteroides ssp. mesenteroides Leu. mesenteroides ssp. dextranicum Lb. plantarum ssp. plantarum Lactobacillus casei Pediococcus pentosaceus Lb. coryniformis ssp. torquens Lipaz enzim aktivite zon çapı(mm) -Amilaz enzim aktivitesi 2 2 2 2 4 + + + 63 Çizelge 4.8. (Devam) Çiğ sütten izole edilen laktik asit bakterilerinin lipoliz zon çapları ve -Amilaz enzim aktiviteleri İzolat no M30 M31 M32 M33 M34 M35 M36 M37 M38 M39 M40 M41 M42 M43 M44 M45 M46 M47 M48 M49 M50 M51 M52 M53 M54 M55 M56 M57 M58 M59 M60 M61 M62 M63 M64 M65 M66 M67 M68 M69 M70 M71 M72 M73 M74 Tür ismi Enterococcus faecium Lb. coryniformis ssp. torquens Lb. delbrueckii ssp. lactis Pediococcus pentosaceus Lactobacillus acidophilus Pediococcus pentosaceus Lb. delbrueckii ssp. lactis Lb. coryniformis ssp. torquens Pediococcus inopinatus Lb. delbrueckii ssp. lactis Pediococcus dextrinicus Lactobacillus acidophilus Pediococcus dextrinicus Pediococcus pentosaceus Streptococcus cremoris Lb. rhamnosus Leu. mesenteroides ssp. mesenteroides Pediococcus dextrinicus Lb. plantarum ssp. plantarum Lactobacillus acidophilus Lb. delbrueckii ssp. lactis Pediococcus dextrinicus Pediococcus pentosaceus Lb. delbrueckii ssp. lactis Leu. mesenteroides ssp. mesenteroides Leu. mesenteroides ssp. dextranicum Lb. coryniformis ssp. torquens Pediococcus acidilactici Lb. rhamnosus Streptococcus lactis Lactobacillus acidophilus Lb. delbrueckii ssp. lactis Pediococcus pentosaceus Pediococcus pentosaceus Lactobacillus casei Streptococcus lactis Pediococcus pentosaceus Lb. delbrueckii ssp. lactis Pediococcus dextrinicus Lactobacillus casei Streptococcus lactis Lactobacillus acidophilus Lactobacillus casei Streptococcus lactis Lb. delbrueckii ssp. lactis Lipaz enzim aktivite zon çapı(mm) -Amilaz enzim aktivitesi + 2 2 2 2 2 + + 2 2 64 4.3. Laktik Asit Bakterilerinde Hemolitik Enzim Aktivitelerinin Değerlendirilmesi Çalışmada çiğ sütten izole edilen laktik asit bakterilerinin hemolitik aktivitesi kanlı agar da araştırılmıştır (Resim 4.4). 74 laktik asit bakterisinin Streptococcus, Lactococcus ve Enterococcus cinsine ait 5 izolatta hemolitik aktivite gözlenirken 69 izolatta hemolitik aktivite gözlenmemiştir. Hemolitik aktivite gösteren 5 izolatın 2 (%40)’ si Streptococcus lactis, 2 (%40)’ si Lactococcus lactis ssp. lactis ve 1 (%20) izolatın Enterococcus faecium türüne ait olduğu tespit edilmiştir. Çizelge 4.9.’da hemolitik aktivite gösteren laktik bakteri türleri gösterilmiştir. Çizelge 4.9. Hemolitik enzim aktivitesi gösteren laktik asit bakterilerinin türlere göre dağılımı Cins ismi Streptococcus Enterococcus Lactococcus İzolat no M65 M70 M44 M30 M16 M21 Tür ismi Streptococcus lactis Streptococcus lactis Streptococcus cremoris Enterococcus faecium Lactococcus lactis ssp. lactis Lactococcus lactis ssp. lactis Hemolitik enzim aktivitesi + + + + + Resim 4.4. Kanlı agarda laktik asit bakterilerinin hemolitik aktivitesi 65 4.4. Laktik Asit Bakterilerinin Bazı Patojen Bakteriler Üzerine İnhibitör Etkilerinin Değerlendirilmesi Araştırmada laktik asit bakterilerinin bazı patojen bakterilere karşı, Nutrient Agar da agar kuyu difüzyon yöntemiyle inhibitör etkileri incelenmiştir. Laktik asit bakterilerinden 6 Lactobacillus, 4 Pediococcus, 2 Leuconostoc, 2 Streptococcus, 2 Enterococcus ve 1 Lactococcus suşu toplam 17 laktik bakteri türünün patojen bakteriler üzerine inhibitör etkisi araştırılmıştır. Bu patojenler Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes, Klebsiella pneumoniae, E. coli ve Salmonella typhimurium türleridir. Laktik bakteri suşlarının indikatör bakterilere inhibisyon etkileri nutrient agar ve %0,2 glikoz ilave edilmiş nutrient agarda çalışılmıştır. Laktik asit bakterilerinin patojen bakteriler üzerindeki inhibitör etkisi, inhibisyon zon çapları ölçülerek değerlendirilmiştir. 4.4.1. Laktik asit bakterilerinin Staphylococcus aureus üzerine inhibitör etkilerinin değerlendirilmesi Lactobacillus türlerinin S. aureus üzerine inhibitör etkisi Lactobacillus cinsi; Lactobacillus delbrueckii ssp. lactis, Lactobacillus casei, Lb. rhamnosus, Lb. acidophilus, Lb. coryniformis ssp. torquens ve Lb. plantarum ssp. plantarum türlerinin Nutrient Agarda indikatör S. aureus üzerine inhibisyon zon çapları 2 mm ve 10 mm, %0,2 glikozlu Nutrient Agarda 6 mm ve 12 mm olarak ölçülmüştür. Lactobacillusların S. aureus üzerine etkisi her iki ortamdaki zon çapları ölçülerek karşılaştırılması yapılmıştır. Çizelge 4.10 ve Şekil 4.8’ de gösterilmiştir. 66 Çizelge 4.10. Lactobacillus türlerinin indikatör S. aureus üzerine oluşturdukları zon çapları Suş no M36 M19 M34 M58 M37 M48 Lactobacillus Türleri Lb. delbrueckii ssp. lactis Lb. casei Lb. acidophilus Lb. rhamnosus Lb. coryniformis ssp. tourquens Lb. plantarum ssp. plantarum %0,2 glikozlu Nutrient agar nutrient agar İnhibisyon zon inhibisyon zon çapı(mm) çapı(mm) S. aureus S. aureus 8 10 6 2 10 8 12 10 8 6 10 10 Şekil 4.8. Lactobacillus türlerinin nutrient agar ve %0,2 glikozlu nutrient agarda S. aureus üzerine inhibisyon zon çaplarının karşılaştırılması Lactobacillusların glikoz ilave edilen besiyeri ortamında S. aureus’u etkileyen inhibisyon zon çapı daha büyük gözlenmiştir. Bu koşullarda Lb. delbrueckii ssp. lactis 12 mm ile en büyük zon çapına sahiptir. Glikozlu ortamda en düşük etki 6 mm zon çapıyla Lb. rhamnosus suşunda gözlenmiştir. Sonuç olarak Laktobasiller S.aureus üzerine etkili bulunmuştur. 67 Pediococcus türlerinin S. aureus üzerine inhibitör etkisi Pediococccus cinsi; Pediococcus inopinatus, Pediococcus acidilactici, Pediococcus dextrinicus ve Pediococcus pentosaceus türü test bakterilerinin indikatör S. aureus üzerine inhibitör etkilerine bakılmıştır. Nutrient Agarda S. aureus üzerine zon çapları 4-6 mm, glikoz ilave edilmiş Nutrient Agarda 6-8 mm olarak ölçülmüştür. Pediococcus türlerinin S. aureus üzerine etkisi her iki ortamdaki zon çapları ölçülerek karşılaştırılmıştır. Çizelge 4.11. ve Şekil 4.9.’da Pediococcus bakterilerinin S. aureus üzerine oluşturdukları zon çapı ölçümleri gösterilmiştir. Çizelge 4.11.Pediococcus türlerinin indikatör S. aureus üzerine oluşturdukları zon çapları Suş no M38 M57 M40 M10 Pediococcus Türleri Pediococcus inopinatus Pediococcus acidilactici Pediococcus dextrinicus Pediococcus pentosaceus Nutrient agar İnhibisyon zon çapı(mm) %0,2 glikozlu nutrient agar inhibisyon zon çapı(mm) S. aureus S. aureus 4 6 6 4 6 8 8 6 Şekil 4.9. Pediococcus türlerinin nutrient agar ve %0,2 glikozlu nutrient agarda S. aureus üzerine inhibisyon zon çaplarının karşılaştırılması 68 Pediococcus türlerinin S. aureus üzerine inhibitör etkisi %0,2 glikoz ilave edilmiş Nutrient besiyeri ortamında daha yüksek oranda tespit edilmiştir. Glikozlu ortamda 8 mm zon çapı ile Pediococcus acidilactii ve P. dextrinicus S. aureus üzerine en yüksek etkiyi göstermiştir. P. inopinatus ve P. pentosaceus türlerinin zon çapları ise 6 mm olarak ölçülmüştür. Sonuç olarak Pediococcus suşlarının S. aureus üzerine etkili olduğu tespit edilmiştir. Leuconostoc türlerinin S. aureus üzerine inhibitör etkisi S. aureus bakterisine karşı inhibitör etkisi incelen Leu. mesenteroides ssp. dextranicum ve Leu. mesenteroides ssp. mesenteroides suşlarının nutrient agarda zon çapları 8 mm ve 9 mm olarak ölçülmüştür. %0,2 glikoz ilave edilmiş nutrient agarda her iki suşun zon çapları 12 mm olarak belirlenmiştir. Çizelge 4.12. ve Şekil 4.10 da her iki ortamdaki zon çapı ölçümleri gösterilmiştir. Çizelge 4.12. Leuconostoc türlerinin indikatör S. aureus üzerine oluşturdukları zon çapları Suş no M55 M25 Leuconostoc Türleri Leu. mesenteroides ssp. dextranicum Leu. mesenteroides ssp. mesenteroides Nutrient agar İnhibisyon zon çapı(mm) S. aureus 8 9 %0,2 glikozlu nutrient agar inhibisyon zon çapı(mm) S. aureus 12 12 Şekil 4.10. Leuconostoc türlerinin nutrient agar ve %0,2 glikozlu nutrient agarda S. aureus üzerine inhibisyon zon çaplarının karşılaştırılması 69 Glikoz ilave edilmiş ortamda Leu. mesenteroides ssp. dextranicum ve Leu. mesenteroides ssp. mesenteroides suşlarının S. aureus üzerindeki inhibisyon zon çapları 12 mm olarak ölçülmüştür. Sonuç olarak Leuconostoc suşlarının S. aureus’a inhibitör etki gösterdiği tespit edilmiştir. Streptococcus türlerinin S. aureus üzerine inhibitör etkisi Streptococcus cinsi: Streptococcus lactis, Streptococcus cremoris ve Lactococcus lactis ssp. lactis türlerinin S. aureus üzerine inhibitör etkisi nutrient agar ve glikozlu nutrient agarda incelenmiştir. Nutrient agarda zon çapları 4 mm ve 8 mm olarak, glikozlu nutrient agarda 6 mm ve 10 mm olarak ölçülmüştür. Streptococusların indikatör S. aureus’a inhibitör etkisi her iki ortamda zon çapları ölçülerek karşılaştırılması yapılmıştır. Çizelge 4.13. ve Şekil 4.11 de gösterilmiştir. Çizelge 4.13. Streptococcus türlerinin indikatör S. aureus üzerine oluşturdukları zon çapları Suş no M59 M44 M21 Streptococcus Türleri Streptococcus lactis Streptococcus cremoris Lactococcus lactis ssp. lactis Nutrient agar İnhibisyon zon çapı(mm) S. aureus 4 6 8 %0,2 glikozlu nutrient agar inhibisyon zon çapı(mm) S. aureus 6 6 10 Şekil 4.11. Streptococcus türlerinin nutrient agar ve %0,2 glikozlu nutrient agarda S. aureus üzerine inhibisyon zon çaplarının karşılaştırılması 70 %0,2 glikoz ilave edilmiş Nutrient Agarda zon çapları daha yüksek gözlenmiştir. 10 mm zon çapıyla L. lactis ssp. lactis suşu S. aureus üzerine en yüksek inhibitör etkiyi göstermiştir. Streptococcus lactis ve Streptococcus cremoris glikozlu ortamda S. aureus üzerine zon çapları 6 mm olarak belirlenmiştir. Enterococcus türlerinin S. aureus üzerine inhibitör etkisi Enterococcus faecalis ve Enterococcus faecium suşlarının S. aureus üzerine inhibitör etkisi incelenmiştir. Nutrient Agarda Enterococcus suşlarının zon çapları 2 mm, %0,2 glikoz ilave edilmiş Nutrient Agarda 4 mm ve 7 mm olarak ölçülmüştür. Enterococcus türlerinin S. aureus’a etkisi her iki ortamdaki zon çapları ölçülerek karşılaştırılmıştır. Zon çapı ölçümleri Çizelge 4.14. ve Şekil 4.12. de gösterilmiştir. Çizelge 4.14. Enterococcus türlerinin indikatör S. aureus üzerine oluşturdukları zon çapları Suş no M4 M30 Enterococcus Türleri Enterococcus faecalis Enterococcus faecium Nutrient agar İnhibisyon zon çapı(mm) S. aureus 2 2 %0,2 glikozlu nutrient agar inhibisyon zon çapı(mm) S. aureus 4 7 Şekil 4.12. Enterococcus türlerinin nutrient agar ve %0,2 glikozlu nutrient agarda S. aureus üzerine inhibisyon zon çaplarının karşılaştırılması 71 Glikoz ilave edilmiş ortamda S. aureus üzerine en yüksek etkiyi 7 mm zon çapıyla Enterococcus faecium göstermiştir. Enterococcus faecalis’in zon çapı ise 4 mm olarak ölçülmüştür. Sonuç olarak Enterococcus suşları S. aureus üzerine etkili bulunmuştur. 4.4.2. Laktik asit bakterilerinin Listeria monocytogenes üzerine inhibitör etkilerinin değerlendirilmesi Lactobacillus türlerinin L. monocytogenes üzerine inhibitör etkisi Lactobacillus cinsi; Lactobacillus delbrueckii ssp. lactis, Lactobacillus casei, Lb. rhamnosus, Lb. acidophilus, Lb. coryniformis ssp. torquens ve Lb. plantarum ssp. plantarum türlerinin Nutrient Agarda indikatör L. monocytogenes üzerine inhibisyon zon çapları 8 mm ve 12 mm, %0,2 glikozlu Nutrient Agarda 10 mm ve 18 mm olarak ölçülmüştür. Lactobacillusların L. monocytogenes üzerine etkisi her iki ortamdaki zon çapları ölçülerek karşılaştırılması yapılmıştır. Çizelge 4.15 ve Şekil 4.13’ de gösterilmiştir. Çizelge 4.15. Lactobacillus türlerinin indikatör L. monocytogenes üzerine oluşturdukları zon çapları Suş no M36 M19 M34 M58 M37 M48 Lactobacillus Türleri Lb. delbrueckii ssp. lactis Lb. casei Lb. acidophilus Lb. rhamnosus Lb. coryniformis ssp. tourquens Lb. plantarum ssp. plantarum Nutrient agar İnhibisyon zon çapı(mm) L.monocytogenes 12 12 8 12 8 10 %0,2 glikozlu nutrient agar inhibisyon zon çapı(mm) L.monocytogenes 18 16 12 16 10 12 72 Şekil 4.13. Lactobacillus türlerinin nutrient agar ve %0,2 glikozlu nutrient agarda L. monocytogenes üzerine inhibisyon zon çaplarının karşılaştırılması Yapılan ölçümlerde, %0,2 glikoz ilave edilmiş Nutrient besiyerinde zon çapları daha yüksek gözlenmiştir. Glikozlu ortamda indikatör L. monocytogenes üzerinde 18 mm zon çapıyla Lactobacillus delbrueckii ssp. lactis en yüksek etkiyi oluşturmuştur. Lb. coryniformis ssp. tourquens suşu ise 10 mm zon çapıyla L. monocytogenes üzerinde en düşük etkiye sahip olduğu tespit edilmiştir. Pediococcus türlerinin L. monocytogenes üzerine inhibitör etkisi Pediococccus cinsi; Pediococcus inopinatus, Pediococcus acidilactici, Pediococcus dextrinicus ve Pediococcus pentosaceus türü test bakterilerinin indikatör L. monocytogenes üzerine etkisi Nutrient Agarda zon çapları 6-8 mm, glikoz ilave edilmiş Nutrient Agarda 10-14 mm olarak ölçülmüştür. Pediococcus türlerinin L. monocytogenes üzerine etkisi her iki ortamdaki zon çapları ölçülerek karşılaştırılmıştır. Çizelge 4.16. ve Şekil 4.14.’de Pediococcus bakterilerinin L. monocytogenes üzerine oluşturdukları zon çapı ölçümleri gösterilmiştir. 73 Çizelge 4.16. Pediococcus türlerinin indikatör L. monocytogenes üzerine oluşturdukları zon çapları Suş no M38 M57 M40 M10 Pediococcus Türleri Nutrient agar İnhibisyon zon çapı(mm) %0,2 glikozlu nutrient agar inhibisyon zon çapı(mm) Pediococcus inopinatus Pediococcus acidilactici Pediococcus dextrinicus Pediococcus pentosaceus L.monocytogenes 7 6 8 6 L.monocytogenes 14 10 12 14 Şekil 4.14. Pediococcus türlerinin nutrient agar ve %0,2 glikozlu nutrient agarda L. onocytogenes üzerine inhibisyon zon çaplarının karşılaştırılması %0,2 glikozlu Nutrient Agar ortamında Pediococcus suşlarının L. monocytogenes üzerinde daha büyük zon çapları oluşturduğu gözlenmiştir. Bu koşullarda Pediococcus inopinatus ve Pediococcus pentosaceus suşları 14 mm zon çapıyla en yüksek etkiyi göstermiştir. Glikozlu ortamda en düşük zon çapı ölçümü 10 mm olup Pediococcus acidilactici suşunda gözlenmiştir. 74 Leuconostoc türlerinin L. monocytogenes üzerine inhibitör etkisi Leuconostoc cinsi; Leu. mesenteroides ssp. dextranicum ve Leu. mesenteroides ssp. mesenteroides türlerinin Nutrient Agarda indikatör L. monocytogenes üzerine etkisi 10 mm zon çapı, %0,2 glikozlu Nutrient Agarda 12-14 mm zon çapı olarak gözlenmiştir. Leuconostocların L. monocytogenes üzerine etkisi her iki ortamdaki zon çapları ölçülerek karşılaştırılması yapılmıştır. Çizelge 4.17 ve Şekil 4.15’ de gösterilmiştir. Çizelge 4.17. Leuconostoc türlerinin indikatör L. monocytogenes üzerine oluşturdukları zon çapları Suş no Leuconostoc Türleri Leu. mesenteroides ssp. M55 dextranicum Leu. mesenteroides ssp. M25 mesenteroides L.monocytogenes %0,2 glikozlu nutrient agar inhibisyon zon çapı(mm) L.monocytogenes 10 12 10 14 Nutrient agar İnhibisyon zon çapı(mm) Şekil 4.15. Leuconostoc türlerinin nutrient agar ve %0,2 glikozlu nutrient agarda L.monocytogenes üzerine inhibisyon zon çaplarının karşılaştırılması 75 Leuconostoc suşlarının L. monocytogenes üzerine etkisi glikoz ilave edilen besiyeri ortamında daha yüksek gözlenmiştir. Leu. mesenteroides ssp. mesenteroides suşunun zon çapı 14 mm, Leu. mesenteroides ssp. dextranicum suşunun zon çapı ise 12 mm olarak tespit edilmiştir. Sonuç olarak Leuconostocların L. monocytogenes üzerinde inhibitör etki gösterdiği bulunmuştur. Streptococcus türlerinin L. monocytogenes üzerine inhibitör etkisi Streptococcus cinsi: Streptococcus lactis, Streptococcus cremoris ve Lactococcus lactis ssp. lactis türlerinin L. monocytogenes üzerine inhibitör etkisi nutrient agar ve glikozlu nutrient agarda incelenmiştir. Nutrient agarda zon çapları 6 mm ve 10 mm olarak, glikozlu nutrient agarda 10 mm ve 17 mm olarak ölçülmüştür. Streptococusların indikatör L. monocytogenes’e inhibitör etkisi her iki ortamda zon çapları ölçülerek karşılaştırılması yapılmıştır. Çizelge 4.18. ve Şekil 4.16 da gösterilmiştir. Çizelge 4.18. Streptococcus türlerinin indikatör L. monocytogenes üzerine oluşturdukları zon çapları Suş no M59 M44 M21 Streptococcus Türleri Streptococcus lactis Streptococcus cremoris Lactococcus lactis ssp. lactis Nutrient agar İnhibisyon zon çapı(mm) %0,2 glikozlu nutrient agar inhibisyon zon çapı(mm) L.monocytogenes L.monocytogenes 8 6 10 14 10 17 76 Şekil 4.16. Streptococcus türlerinin nutrient agar ve %0,2 glikozlu nutrient agarda L. monocytogenes üzerine inhibisyon zon çaplarının karşılaştırılması Yapılan ölçümler sonucunda Streptococcuslar glikoz ilave edilmiş besiyeri ortamında L. monocytogenes üzerinde daha büyük etki göstermiştir. Bu koşullarda glikozlu ortamda en yüksek inhibitör etki Lactococcus lactis ssp. lactis suşunda gözlenmiştir. L. monocytogenes üzerindeki etkisi 17 mm zon çapı olarak tespit edilmiştir. En düşük etki ise 10 mm zon çapı ile Streptococcus cremoris suşunda gözlenmiştir. Enterococcus türlerinin L. monocytogenes üzerine inhibitör etkisi Enterococcus faecalis ve Enterococcus faecium suşlarının indikatör L. monocytogenes üzerine inhibitör etkisi incelenmiştir. Nutrient Agarda Enterococcus suşlarının zon çapları 8 mm, %0,2 glikoz ilave edilmiş Nutrient Agarda 12 mm ve 16 mm olarak ölçülmüştür. Enterococcus türlerinin L. monocytogenes’e etkisi her iki ortamdaki zon çapları ölçülerek karşılaştırılmıştır. Zon çapı ölçümleri Çizelge 4.19. ve Şekil 4.17. ‘de gösterilmiştir. 77 Çizelge 4.19. Enterococcus türlerinin indikatör L. monocytogenes üzerine oluşturdukları zon çapları Suş no Enterococcus Türleri L.monocytogenes %0,2 glikozlu nutrient agar inhibisyon zon çapı(mm) L.monocytogenes Nutrient agar İnhibisyon zon çapı(mm) M4 Enterococcus faecalis 8 12 M30 Enterococcus faecium 8 16 Şekil 4.17. Enterococcus türlerinin nutrient agar ve %0,2 glikozlu nutrient agarda L.monocytogenes üzerine inhibisyon zon çaplarının karşılaştırılması Enterococcusların L. monocytogenes’e etkileri glikozlu besiyeri ortamında artış göstermiştir. Enterococcus faecium suşunun zon çapı 16 mm olarak tespit edilmiştir. L. monocytones üzerinde en büyük etkiyi oluşturmuştur. Enterococcus faecalis suşu ise L. monocytogenes’e oluşturduğu zon çapı 12 mm olarak belirlenmiştir. Sonuç olarak Enterococcus türleri L. monocytogenes’e etkili bulunmuştur. 78 4.4.3. Laktik asit bakterilerinin Salmonella typhimurium üzerine inhibitör etkilerinin değerlendirilmesi Lactobacillus türlerinin S. typhimurium üzerine inhibitör etkisi Lactobacillus cinsi; Lactobacillus delbrueckii ssp. lactis, Lactobacillus casei, Lb. rhamnosus, Lb. acidophilus, Lb. coryniformis ssp. torquens ve Lb. plantarum ssp. plantarum türlerinin Nutrient Agarda indikatör S. typhimurium üzerine etki ettiği zon çapları 4 mm ve 10 mm, %0,2 glikozlu Nutrient Agarda 6 mm ve 18 mm olarak ölçülmüştür. Lactobacillusların S. typhimurium üzerine etkisi her iki ortamdaki zon çapları ölçülerek karşılaştırılması yapılmıştır. (Çizelge 4.20. ve Şekil 4.18. ) Çizelge 4.20. Lactobacillus türlerinin indikatör S. typhimurium üzerine oluşturdukları zon çapları Suş no Lactobacillus Türleri Nutrient agar İnhibisyon zon çapı(mm) %0,2 glikozlu nutrient agar inhibisyon zon çapı(mm) S. typhimurium S. typhimurium M36 M19 M34 M58 M37 Lb. delbrueckii ssp. lactis Lb. casei Lb. acidophilus Lb. rhamnosus Lb. coryniformis ssp. tourquens 10 8 8 6 4 18 8 9 10 6 M48 Lb. plantarum ssp. plantarum 8 10 79 Şekil 4.18. Lactobacillus türlerinin nutrient agar ve %0,2 glikozlu nutrient agarda S.typhimurium üzerine inhibisyon zon çaplarının karşılaştırılması Nutrient Agar ve %0,2 glikozlu Nutrient Agar ortamı karşılaştırıldığında, Lactobacilluslar glikozlu ortamda S. typhimurium üzerine daha büyük etki göstermiştir. Bu koşullarda 18 mm zon çapıyla Lactobacillus delbrueckii ssp. lactis en yüksek etkili suş olarak belirlenmiştir. S. typhimurium üzerine en düşük etkiyi gösteren suş ise 6 mm zon çapıyla Lb. coryniformis ssp. torquens olarak tespit edilmiştir. Sonuç olarak Lactobacilluslar S. typhimurium’a etkili bulunmuştur. Pediococcus türlerinin S. typhimurium üzerine inhibitör etkisi Pediococccus cinsi; Pediococcus inopinatus, Pediococcus acidilactici, Pediococcus dextrinicus ve Pediococcus pentosaceus suşlarının indikatör S. typhimurium üzerine etkisi Nutrient Agarda zon çapları 4-6 mm, glikoz ilave edilmiş Nutrient Agarda 5-10 mm olarak ölçülmüştür. Pediococcus türlerinin S. typhimurium üzerine etkisi her iki ortamdaki zon çapları ölçülerek karşılaştırılmıştır. Çizelge 4.21. ve Şekil 4.19.’da Pediococcus bakterilerinin S. typhimurium üzerine oluşturdukları zon çapı ölçümleri gösterilmiştir. 80 Çizelge 4.21. Pediococcus türlerinin indikatör S. typhimurium üzerine oluşturdukları zon çapları Suş no Nutrient agar İnhibisyon zon çapı(mm) %0,2 glikozlu nutrient agar inhibisyon zon çapı(mm) S. typhimurium S. typhimurium Pediococcus Türleri M38 Pediococcus inopinatus 4 6 M57 M40 Pediococcus acidilactici Pediococcus dextrinicus 6 6 10 8 M10 Pediococcus pentosaceus 4 5 Şekil 4.19. Pediococcus türlerinin nutrient agar ve %0,2 glikozlu nutrient agarda S. typhimurium üzerine inhibisyon zon çaplarının karşılaştırılması Pediococccus türlerinin her iki ortamdaki zon çapı ölçümleri karşılaştırıldığında %0,2 glikozlu Nutrient Agarda zon çaplarında artış olduğu gözlenmiştir. Glikozlu ortamda Pediococcus acidilactici 10 mm zon çapıyla S. typhimurium üzerinde en yüksek etkiyi göstermiştir. En düşük etkiyi Pediococcus pentosaceus suşu göstermiş olup, zon çapı 5 mm olarak tespit edilmiştir. 81 Leuconostoc türlerinin S. typhimurium üzerine inhibitör etkisi Leuconostoc cinsi; Leu. mesenteroides ssp. dextranicum ve Leu. mesenteroides ssp. mesenteroides türlerinin Nutrient Agarda indikatör S. typhimurium üzerine etkisi 6mm ve 7mm, %0,2 glikozlu Nutrient Agarda 8-10 mm zon çapı olarak gözlenmiştir. Leuconostocların S. typhimurium üzerine etkisi her iki ortamdaki zon çapları ölçülerek karşılaştırılması yapılmıştır. Zon çapı ölçümleri Çizelge 4.22 ve Şekil 4.20’ de gösterilmiştir. Çizelge 4.22. Leuconostoc türlerinin indikatör S. typhimurium üzerine oluşturdukları zon çapları Suş no Leuconostoc Türleri Nutrient agar İnhibisyon zon çapı(mm) %0,2 glikozlu nutrient agar inhibisyon zon çapı(mm) S. typhimurium S. typhimurium M55 Leu. mesenteroides ssp. dextranicum 6 8 M25 Leu. mesenteroides ssp. mesenteroides 7 10 Şekil 4.20. Leuconostoc türlerinin nutrient agar ve %0,2 glikozlu nutrient agarda S.typhimurium üzerine inhibisyon zon çaplarının karşılaştırılması 82 Leuconostoc suşlarının S. typhimurium üzerine etkisi glikozlu besiyeri ortamında artış göstermiştir. Bu koşullarda Leu. mesenteroides ssp. mesenteroides suşunun zon çapı 10 mm, Leu. mesenteroides ssp. dextranicum suşunun zon çapı 8 mm olarak belirlenmiştir. Sonuç olarak Leuconostoclar indikatör S. typhimurium’a etkili bulunmuştur. Streptococcus türlerinin S. typhimurium üzerine inhibitör etkisi Streptococcus cinsi: Streptococcus lactis, Streptococcus cremoris ve Lactococcus lactis ssp. lactis türlerinin S. typhimurium üzerine inhibitör etkisi Nutrient Agar ve glikozlu Nutrient Agarda incelenmiştir. Nutrient agarda zon çapları 6 mm ve 8 mm olarak, glikozlu Nutrient Agarda 8 mm ve 10 mm olarak ölçülmüştür. Streptococusların indikatör S. typhimurium’a inhibitör etkisi her iki ortamda zon çapları ölçülerek karşılaştırılması yapılmıştır. Çizelge 4.23. ve Şekil 4.21 de gösterilmiştir. Çizelge 4.23. Streptococcus türlerinin indikatör S. typhimurium üzerine oluşturdukları zon çapları Suş no M59 M44 M21 Streptococcus Türleri Streptococcus lactis Streptococcus cremoris Lactococcus lactis ssp. lactis Nutrient agar İnhibisyon zon çapı(mm) %0,2 glikozlu nutrient agar inhibisyon zon çapı(mm) S. typhimurium 6 6 8 S. typhimurium 10 8 8 Şekil 4.21. Streptococcus türlerinin nutrient agar ve %0,2 glikozlu nutrient agarda S. typhimurium üzerine inhibisyon zon çaplarının karşılaştırılması 83 Yapılan ölçümler sonucunda Streptococcuslar glikoz ilave edilmiş besiyeri ortamında S. typhimurium üzerinde daha büyük etki göstermiştir. Bu koşullarda glikozlu ortamda en yüksek inhibitör etki 10 mm zon çapıyla Streptococcus lactis suşunda gözlenmiştir. Streptococcus cremoris ve Lactococcus lactis ssp. lactis suşlarının zon çapı ise 8 mm olarak belirlenmiştir. Enterococcus türlerinin S. typhimurium üzerine inhibitör etkisi Enterococcus faecalis ve Enterococcus faecium suşlarının S. typhimurium üzerine inhibitör etkisi Nutrient Agarda zon çapları 7 mm ve 8 mm olarak, %0,2 glikozlu Nutrient Agarda zon çapları 8 mm olarak ölçülmüştür. Enterococcusların indikatör S. typhimurium’a etkisi her iki ortamdaki zon çapı ölçümleri karşılaştırılarak yapılmıştır. Çizelge 4.24. ve Şekil 4.22. de zon çapı ölçümleri gösterilmiştir. Çizelge 4.24. Enterococcus türlerinin indikatör S. typhimurium üzerine oluşturdukları zon çapları Suş no M4 M30 Enterococcus Türleri Enterococcus faecalis Enterococcus faecium Nutrient agar İnhibisyon zon çapı(mm) S. typhimurium 7 8 %0,2 glikozlu nutrient agar inhibisyon zon çapı(mm) S. typhimurium 8 8 Şekil 4.22. Enterococcus türlerinin nutrient agar ve %0,2 glikozlu nutrient agarda S.typhimurium üzerine inhibisyon zon çaplarının karşılaştırılması 84 Nutrient Agar ve Glikozlu Nutrient Agar ortamı karşılaştırıldığında, Enterococcus faecalis suşunun S. typhimurium üzerindeki etkisinin glikozlu ortamda artış gösterdiği tespit edilmiştir. Glikozlu ortamda Enterococcus faecalis ‘in zon çapı 8 mm olarak belirlenmiştir. Enterococcus faecium suşunun S. typhimurium’a etkisi her iki ortamda eşit olduğu tespit edilmiştir ve zon çapı 8 mm olarak belirlemiştir. 4.4.4. Laktik asit bakterilerinin Klebsiella pneumoniae üzerine inhibitör etkilerinin değerlendirilmesi Lactobacillus türlerinin K. pneumoniae üzerine inhibitör etkisi Lactobacillus cinsi; Lactobacillus delbrueckii ssp. lactis, Lactobacillus casei, Lb. rhamnosus, Lb. acidophilus, Lb. coryniformis ssp. torquens ve Lb. plantarum ssp. plantarum türlerinin Nutrient Agarda indikatör K. pneumoniae üzerine etki ettiği zon çapları 2 mm, %0,2 glikozlu Nutrient Agarda 2 mm ve 4 mm olarak ölçülmüştür. Lactobacillusların K. pneumoniae üzerine etkisi her iki ortamdaki zon çapları ölçülerek karşılaştırılması yapılmıştır. (Çizelge 4.25. ve Şekil 4.23. ) Çizelge 4.25. Lactobacillus türlerinin indikatör K. pneumoniae üzerine oluşturdukları zon çapları Suş no M36 M19 M34 M58 M37 M48 Lactobacillus Türleri Lb. delbrueckii ssp. lactis Lb. casei Lb. acidophilus Lb. rhamnosus Lb. coryniformis ssp. tourquens Lb. plantarum ssp. plantarum Nutrient agar İnhibisyon zon çapı(mm) %0,2 glikozlu nutrient agar inhibisyon zon çapı(mm) K. pneumoniae K. pneumoniae 2 2 2 2 2 2 3 3 2 3 2 4 85 Şekil 4.23. Lactobacillus türlerinin nutrient agar ve %0,2 glikozlu nutrient agarda K.pneumoniae üzerine inhibisyon zon çaplarının karşılaştırılması Lactobacillus türlerinin indikatör K. pneumoniae üzerindeki etkisi Nutrient Agar ve glikozlu Nutrient Agar ortamında karşılaştırılmıştır. Glikozlu ortamda zon çaplarında artış gözlenmiştir. En yüksek zon çapı ölçümü Lb. plantarum ssp. plantarum suşuna ait olup, glikozlu ortamda zon çapı 4 mm olarak belirlenmiştir. Lb. rhamnosus, Lb. casei ve Lb. delbrueckii ssp. lactis suşlarının zon çapları 3 mm olarak tespit edilmiştir. Sonuç olarak Lactobacilluslar K. pneumoniae üzerine etkili bulunmamıştır. Bunun sebebinin K. pneumoniae’nin kapsüllü patojen bir bakteri olmasından kaynaklandığı düşünülmektedir. Pediococcus türlerinin K. pneumoniae üzerine inhibitör etkisi Pediococccus cinsi; Pediococcus inopinatus, Pediococcus acidilactici, Pediococcus dextrinicus ve Pediococcus pentosaceus suşlarının indikatör K. pneumoniae üzerine etkisi Nutrient Agarda zon çapları 2 mm, glikoz ilave edilmiş Nutrient Agarda 2-3 mm olarak ölçülmüştür. Pediococcus türlerinin K. pneumoniae üzerine etkisi her iki ortamdaki zon çapları ölçülerek karşılaştırılmıştır. Çizelge 4.26. ve Şekil 4.24.’te Pediococcus bakterilerinin K. pneumoniae üzerine oluşturdukları zon çapı ölçümleri gösterilmiştir. 86 Çizelge 4.26. Pediococcus türlerinin indikatör K. pneumoniae üzerine oluşturdukları zon çapları Pediococcus Türleri Suş no M38 M57 M40 M10 Pediococcus inopinatus Pediococcus acidilactici Pediococcus dextrinicus Pediococcus pentosaceus Nutrient agar İnhibisyon zon çapı(mm) %0,2 glikozlu nutrient agar inhibisyon zon çapı(mm) K. pneumoniae K. pneumoniae 2 2 2 3 2 2 2 2 Şekil 4.24. Pediococcus türlerinin nutrient agar ve %0,2 glikozlu nutrient agarda K. pneumoniae üzerine inhibisyon zon çaplarının karşılaştırılması Pediococcus türlerinin her iki ortamdaki zon çapı ölçümleri karşılaştırıldığında iki ortamda da benzer sonuçlar olduğu gözlenmiştir. Glikozlu ortamda sadece Pediococcus acidilactici suşunun zon çapında artış olduğu gözlenmiştir ve 3 mm olarak kaydedilmiştir. Sonuç olarak Pediococcus türleri K. pneumoniae üzerine etkili bulunmamıştır. 87 Leuconostoc türlerinin K. pneumoniae üzerine inhibitör etkisi Leuconostoc cinsi; Leu. mesenteroides ssp. dextranicum ve Leu. mesenteroides ssp. mesenteroides türlerinin Nutrient Agarda indikatör K. pneumoniae üzerine etkisi 1 mm ve 2 mm, %0,2 glikozlu Nutrient Agarda 2 mm zon çapı olarak gözlenmiştir. Leuconostocların K. pneumoniae üzerine etkisi her iki ortamdaki zon çapları ölçülerek karşılaştırılması yapılmıştır. Zon çapı ölçümleri Çizelge 4.27 ve Şekil 4.25’ de gösterilmiştir. Çizelge 4.27. Leuconostoc türlerinin indikatör K. pneumoniae üzerine oluşturdukları zon çapları Suş no M55 M25 Leuconostoc Türleri Leu. mesenteroides ssp. dextranicum Leu. mesenteroides ssp. mesenteroides Nutrient agar İnhibisyon zon çapı(mm) %0,2 glikozlu nutrient agar inhibisyon zon çapı(mm) K. pneumoniae K. pneumoniae 1 2 2 2 Şekil 4.25. Leuconostoc türlerinin nutrient agar ve %0,2 glikozlu nutrient agarda K. pneumoniae üzerine inhibisyon zon çaplarının karşılaştırılması 88 Yapılan ölçümler sonucunda Leuconostoc suşlarının Nutrient Agar ve Glikozlu Nutrient Agar da K. pneumoniae üzerine etkisi karşılaştırıldığında değişiklik olmadığı gözlenmiştir. Sonuç olarak Leu. mesenteroides ssp. dextranicum ve Leu. mesenteroides ssp. mesenteroides K. pneumoniae ‘ ye etkili bulunmamıştır. Streptococcus türlerinin K. pneumoniae üzerine inhibitör etkisi Streptococcus cinsi: Streptococcus lactis, Streptococcus cremoris ve Lactococcus lactis ssp. lactis türlerinin K. pneumoniae üzerine inhibitör etkisi Nutrient Agar ve glikozlu Nutrient Agarda incelenmiştir. Nutrient agarda zon çapları 2 mm olarak, glikozlu Nutrient Agarda 2 mm ve 4 mm olarak ölçülmüştür. Streptococusların indikatör K. pneumoniae’ye inhibitör etkisi her iki ortamda zon çapları ölçülerek karşılaştırılması yapılmıştır. Çizelge 4.28. ve Şekil 4.26 da gösterilmiştir. Çizelge 4.28. Streptococcus türlerinin indikatör K. pneumoniae üzerine oluşturdukları zon çapları Suş no M59 M44 M21 Streptococcus Türleri Streptococcus lactis Streptococcus cremoris Lactococcus lactis ssp. lactis Nutrient agar İnhibisyon zon çapı(mm) %0,2 glikozlu nutrient agar inhibisyon zon çapı(mm) K. pneumoniae 2 2 2 K. pneumoniae 4 3 2 Şekil 4.26. Streptococcus türlerinin nutrient agar ve %0,2 glikozlu nutrient agarda K. pneumoniae üzerine inhibisyon zon çaplarının karşılaştırılması 89 Nutrient Agar ve glikozlu Nutrient Agarda yapılan ölçümler sonucunda Streptococcus suşlarının K. pneumoniae’ye etkileri her iki ortamda da değişiklik göstermemiştir. Ancak Streptococcus lactis suşunun zon çapı glikozlu ortamda artış göstermiş olup 4 mm olarak tespit edilmiştir. Streptococcus cremoris’in zon çapı 3 mm ve Lactococcus lactis ssp. lactis suşunun zon çapı 2 mm olarak belirlenmiştir. Enterococcus türlerinin K. pneumoniae üzerine inhibitör etkisi Enterococcus faecalis ve Enterococcus faecium suşlarının K. pneumoniae üzerine inhibitör etkisi Nutrient Agarda zon çapları 2 mm ve 4 mm olarak, %0,2 glikozlu Nutrient Agarda zon çapları 3 mm ve 4 mm olarak ölçülmüştür. Enterococcusların indikatör K. pneumoniae’ye etkisi her iki ortamdaki zon çapı ölçümleri karşılaştırılarak yapılmıştır. Çizelge 4.29. ve Şekil 4.27. de zon çapı ölçümleri gösterilmiştir. Çizelge 4.29. Enterococcus türlerinin indikatör K. pneumoniae üzerine oluşturdukları zon çapları Suş no M4 M30 Enterococcus Türleri Enterococcus faecalis Enterococcus faecium Nutrient agar İnhibisyon zon çapı(mm) %0,2 glikozlu nutrient agar inhibisyon zon çapı(mm) K. pneumoniae K. pneumoniae 2 4 3 4 Şekil 4.27. Enterococcus türlerinin nutrient agar ve %0,2 glikozlu nutrient agarda K. pneumoniae üzerine inhibisyon zon çaplarının karşılaştırılması 90 Enterococcus türlerinin indikatör K. pneumoniae üzerindeki etkisi her iki ortamda karşılaştırıldığında zon çapı ölçümlerinde değişiklik gözlenmemiştir. Bu koşullarda Enterococcus faecalis suşunun zon çapı glikozlu ortamda 3 mm, Enterococcus faecium suşunun zon çapı ise 4 mm olarak tespit edilmiştir. 4.4.5. Laktik asit bakterilerinin E. coli üzerine inhibitör etkilerinin değerlendirilmesi Lactobacillus türlerinin E. coli üzerine inhibitör etkisi Lactobacillus cinsi; Lactobacillus delbrueckii ssp. lactis, Lactobacillus casei, Lb. rhamnosus, Lb. acidophilus, Lb. coryniformis ssp. torquens ve Lb. plantarum ssp. plantarum türlerinin Nutrient Agarda indikatör E. coli üzerine etki ettiği zon çapları 2 mm, %0,2 glikozlu Nutrient Agarda 2 mm ve 4 mm olarak ölçülmüştür. Lactobacillusların E. coli üzerine etkisi her iki ortamdaki zon çapları ölçülerek karşılaştırılması yapılmıştır. (Çizelge 4.30. ve Şekil 4.28. ) Çizelge 4.30. Lactobacillus türlerinin indikatör E. coli üzerine oluşturdukları zon Çapları Suş no M36 M19 M34 M58 M37 M48 Lactobacillus Türleri Lb. delbrueckii ssp. lactis Lb. casei Lb. acidophilus Lb. rhamnosus Lb.coryniformis ssp. tourquens Lb. plantarum ssp. plantarum E.coli %0,2 glikozlu nutrient agar inhibisyon zon çapı(mm) E.coli 2 2 2 2 2 2 2 2 2 4 Nutrient agar İnhibisyon zon çapı(mm) 91 Şekil 4.28. Lactobacillus türlerinin nutrient agar ve %0,2 glikozlu nutrient agarda E. coli üzerine inhibisyon zon çaplarının karşılaştırılması Lactobacillus türlerinin indikatör E.coli üzerindeki etkisi Nutrient Agar ve glikozlu Nutrient Agar ortamında karşılaştırılmıştır. her iki ortamda da değişiklik gözlenmemiştir. Ancak Lb. plantarum ssp. plantarum suşunun zon çapı glikozlu ortamda 4 mm olarak belirlenmiştir. Pediococcus türlerinin E. coli üzerine inhibitör etkisi Pediococccus cinsi; Pediococcus inopinatus, Pediococcus acidilactici, Pediococcus dextrinicus ve Pediococcus pentosaceus suşlarının indikatör E. coli üzerine etkisi Nutrient Agarda zon çapları 2 mm, glikoz ilave edilmiş Nutrient Agarda 2-3 mm olarak ölçülmüştür. Pediococcus türlerinin E. coli üzerine etkisi her iki ortamdaki zon çapları ölçülerek karşılaştırılmıştır. Çizelge 4.31. ve Şekil 4.29.’da Pediococcus bakterilerinin E. coli üzerine oluşturdukları zon çapı ölçümleri gösterilmiştir. 92 Çizelge 4.31. Pediococcus türlerinin indikatör E. coli üzerine oluşturdukları zon Çapları Suş no M38 M57 M40 M10 Pediococcus Türleri Pediococcus inopinatus Pediococcus acidilactici Pediococcus dextrinicus Pediococcus pentosaceus Nutrient agar İnhibisyon zon çapı(mm) %0,2 glikozlu nutrient agar inhibisyon zon çapı(mm) E.coli E.coli 2 2 2 3 2 3 2 Şekil 4.29. Pediococcus türlerinin nutrient agar ve %0,2 glikozlu nutrient agarda E. coli üzerine inhibisyon zon çaplarının karşılaştırılması Yapılan ölçümler sonucunda Pediococcus suşlarının indikatör E. coli’ye etkileri Nutrient Agar ve glikozlu Nutrient Agar ortamında karşılaştırılmıştır. Her iki ortamda da zon çapı ölçümleri değişiklik göstermemiştir. Pediococcus inopinatus ve Pediococcus dextrinicus suşlarının glikozlu ortamda zon çapları 3 mm, Pediococcus acidilactici ve Pediococcus pentosaceus suşlarının ise 2 mm olarak belirlenmiştir. 93 Leuconostoc türlerinin E. coli üzerine inhibitör etkisi Leuconostoc cinsi; Leu. mesenteroides ssp. dextranicum ve Leu. mesenteroides ssp. mesenteroides türlerinin Nutrient Agarda indikatör E. coli üzerine etkisi 2 mm, %0,2 glikozlu Nutrient Agarda 1 mm ve 3 mm zon çapı olarak gözlenmiştir. Leuconostocların E. coli üzerine etkisi her iki ortamdaki zon çapları ölçülerek karşılaştırılması yapılmıştır. Zon çapı ölçümleri Çizelge 4.32 ve Şekil 4.30’ da gösterilmiştir. Çizelge 4.32. Leuconostoc türlerinin indikatör E. coli üzerine oluşturdukları zon Çapları Suş no Leuconostoc Türleri Nutrient agar İnhibisyon zon çapı(mm) %0,2 glikozlu nutrient agar inhibisyon zon çapı(mm) E.coli E.coli M55 Leu. mesenteroides ssp. dextranicum - 1 M25 Leu. mesenteroides ssp. mesenteroides 2 3 Şekil 4.30. Leuconostoc türlerinin nutrient agar ve %0,2 glikozlu nutrient agarda E.coli üzerine inhibisyon zon çaplarının karşılaştırılması 94 Leuconostoc türlerinin E. coli üzerine inhibitör etkileri incelendiğinde, Nutrient Agar ve glikozlu Nutrient Agar ortamında zon çapı ölçümleri düşük oranda gözlenmiştir. Bu koşullarda Leu. mesenteroides ssp. mesenteroides glikozlu ortamda 3 mm, Leu. mesenteroides ssp. dextranicum suşu ise 1 mm zon çapı olarak tespit edilmiştir. Streptococcus türlerinin E. coli üzerine inhibitör etkisi Streptococcus cinsi: Streptococcus lactis, Streptococcus cremoris ve Lactococcus lactis ssp. lactis türlerinin E. coli üzerine inhibitör etkisi Nutrient Agar ve glikozlu Nutrient Agarda incelenmiştir. Nutrient agarda zon çapları 0-2 mm olarak, glikozlu Nutrient Agarda 2 mm olarak ölçülmüştür. Streptococusların indikatör E. coli’ye inhibitör etkisi her iki ortamda zon çapları ölçülerek karşılaştırılması yapılmıştır. Çizelge 4.33. ve Şekil 4.31 de gösterilmiştir. Çizelge 4.33. Streptococcus türlerinin indikatör E. coli üzerine oluşturdukları zon Çapları Suş no M59 M44 M21 Streptococcus Türleri Streptococcus lactis Streptococcus cremoris Lactococcus lactis ssp. lactis Nutrient agar İnhibisyon zon çapı(mm) E.coli 2 - %0,2 glikozlu nutrient agar inhibisyon zon çapı(mm) E.coli 2 2 2 Şekil 4.31. Streptococcus türlerinin nutrient agar ve %0,2 glikozlu nutrient agarda E. coli üzerine inhibisyon zon çaplarının karşılaştırılması 95 Yapılan ölçümler sonunda, Streptococcus suşlarının indikatör E. coli’ye etkileri Nutrient Agar ve glikozlu Nutrient Agar ortamlarında düşük etkili olarak gözlenmiştir. Glikozlu ortamda Streptococcus suşlarının zon çapları 2 mm olarak belirlenmiştir. Sonuç olarak Streptococcuslar E. coli üzerine etkisiz bulunmuştur. Enterococcus türlerinin E. coli üzerine inhibitör etkisi Enterococcus faecalis ve Enterococcus faecium suşlarının E. coli üzerine inhibitör etkisi Nutrient Agarda zon çapları 2 mm ve 3 mm olarak, %0,2 glikozlu Nutrient Agarda zon çapları 2 mm ve 4 mm olarak ölçülmüştür. Enterococcusların indikatör E. coli’ye etkisi her iki ortamdaki zon çapı ölçümleri karşılaştırılarak yapılmıştır. Çizelge 4.34. ve Şekil 4.32. de zon çapı ölçümleri gösterilmiştir. Çizelge 4.34. Enterococcus türlerinin indikatör E. coli üzerine oluşturdukları zon Çapları Suş no M4 M30 Enterococcus Türleri Enterococcus faecalis Enterococcus faecium Nutrient agar İnhibisyon zon çapı(mm) %0,2 glikozlu nutrient agar inhibisyon zon çapı(mm) E.coli 2 3 E.coli 2 4 Şekil 4.32. Enterococcus türlerinin nutrient agar ve %0,2 glikozlu nutrient agarda E.coli üzerine inhibisyon zon çaplarının karşılaştırılması 96 Enterococcus türlerinin indikatör E. coli üzerindeki etkisi her iki ortamda karşılaştırıldığında zon çapı ölçümlerinde değişiklik gözlenmemiştir. Bu koşullarda Enterococcus faecalis suşunun zon çapı glikozlu ortamda 2 mm, Enterococcus faecium suşunun zon çapı ise 4 mm olarak tespit edilmiştir. Lactobacillus suşlarının (Lb. delbrueckii ssp. lactis, Lb. casei, Lb. acidophilus, Lb. rhamnosus, Lb. coryniformis ssp. tourquens ve Lb. plantarum ssp. plantarum) tüm indikatör test bakterilerine (S.aureus, L.monocytogenes, S.typhimurium, K.pneumoniae ve E.coli) karşı inhibitör etkisi Nutrient Agar ve %0,2 glikozlu Nutrient Agarda incelenmiştir. Glikozlu ortamda zon çapları daha büyük gözlenmiştir. Bu koşullarda en büyük etkiyi Lb. delbrueckii ssp. lactis suşu 18 mm zon çapıyla L.monocytogenes ve Salmonella typhimurium üzerine göstermiştir. Genel olarak bakıldığında Lactobacillus suşlarının en etkili olduğu indikatör bakteri Listeria monocytogenes olarak tespit edilmiştir. E. coli ve K. pneumoniae bakterilerine karşı etki göstermediği belirlenmiştir (Çizelge 4.35). Pediococcus suşlarının Pediococcus dextrinicus (Pediococcus inopinatus, ve Pediococcus Pediococcus pentosaceus) tüm acidilactici, indikatör test bakterilerine (S.aureus, L.monocytogenes, S.typhimurium, K.pneumoniae ve E.coli) karşı inhibitör etkisi Nutrient Agar ve %0,2 glikozlu Nutrient Agarda incelenmiştir. Glikozlu ortamda zon çapları daha büyük gözlenmiştir. Genel olarak incelendiğinde, Pediococcuslar en büyük etkiyi L. monocytogenes üzerine göstermişlerdir. Bu koşullarda Pediococcus inopinatus ve Pediococcus pentosaceus suşları glikozlu ortamda 14 mm zon çapıyla L. monocytogenes üzerinde etkili olmuştur. Pediococcusların en düşük zon çapları indikatör K.pneumoniae ve E.coli üzerine olduğu belirlenmiştir. Bu iki bakteriye karşı Pediococcusların inhibitör etkisi gözlenmemiştir (Çizelge 4.36). Leuconostoc cinsi, Leu. mesenteroides ssp. dextranicum ve Leu. mesenteroides ssp. mesenteroides suşlarının tüm indikatör test bakterilerine (S.aureus, L.monocytogenes, 97 S.typhimurium, K.pneumoniae ve E.coli) karşı inhibitör etkisi incelendiğinde; glikoz ilave edilmiş ortamda daha büyük etki gösterdiği gözlenmiştir. Leuconostocların etkisi tüm indikatör bakterilerde incelendiğinde, en yüksek etkiyi Listeria monocytogenes üzerine gösterdiği tespit edilmiştir. Bu koşullarda Leu. mesenteroides ssp. mesenteroides, L. monocytogenes üzerinde 14 mm zon çapı oluşturmuştur. Leuconostoc suşları K.pneumoniae ve E.coli üzerine etkili bulunmamıştır (Çizelge 4.37). 98 99 100 Streptococcus suşlarının (Streptococcus lactis, Streptococcus cremoris ve Lactococcus lactis ssp. lactis) tüm indikatör test bakterilerine (S.aureus, L.monocytogenes, S.typhimurium, K.pneumoniae ve E.coli) karşı inhibitör etkisi Nutrient Agar ve %0,2 glikozlu Nutrient Agarda incelenmiştir. Glikozlu ortamda zon çapları daha büyük gözlenmiştir. Bu koşullarda en büyük etkiyi Lactococcus lactis ssp. lactis suşu 17 mm zon çapıyla L.monocytogenes üzerine göstermiştir. Genel olarak bakıldığında Streptococcus suşları S.aureus, L.monocytogenes ve S.typhimurium üzerine etkili, K.pneumoniae ve E.coli üzerine etkisiz bulunmuştur. Streptococcusların en etkili olduğu indikatör bakteri Listeria monocytogenes olarak tespit edilmiştir (Çizelge 4.38). Enterococcus faecalis ve Enterococcus faecium suşlarının tüm indikatör test bakterilerine (S.aureus, L.monocytogenes, S.typhimurium, K.pneumoniae ve E.coli) karşı inhibitör etkisi incelendiğinde; glikozlu ortamda zon çapları daha büyük gözlenmiştir. Bu koşullarda en büyük etkiyi Enterococcus faecium suşu 16 mm zon çapıyla L.monocytogenes üzerine göstermiştir. Genel olarak bakıldığında Enterococcus suşları, glikozlu ortamda S.aureus, L.monocytogenes ve S.typhimurium üzerine etkili bulunmuştur. K.pneumoniae ve E.coli üzerine etki göstremediği tespit edilmiştir. Ancak Enterococcus faecium suşunun gikozlu ortamda E.coli ve K.pneumoni üzerine oluşturduğu zon çapı 4 mm olarak belirlenmiştir. (Çizelge 4.39). 101 102 5. TARTIŞMA SONUÇ Gıda teknolojisinde laktik asit bakterilerinin metabolizmaları dolayısıyla enzim aktivitelerine bağlı olarak, uygun suşların starter kültür olarak kullanılması ürün kalitesi ve lezzet, renk, koku oluşumunda önem teşkil etmektedir. Bu sebeple laktik asit bakterilerinin enzimatik özelliklerinin belirlenmesine yönelik çalışmalar starter kültürlerin oluşturulmasına önemli ölçüde katkı sağlamaktadır. Bununla beraber son yıllarda gıdalarda doğal koruyucu olarak laktik asit bakterilerinin, patojen bakterilere karşı inhibitör aktiviteleri araştırma konusu olmaktadır. Gıda endüstrisinde laktik asit bakterileri inhibitör etkileriyle, gıdaların bozulmasına neden olan aynı zamanda patojen özellik gösteren bakterilerin üremesini inhibe edebilmektedir. Laktik bakteriler bu özellikleriyle gıdaların raf ömrünü uzatarak endüstriyel üretimlerde biyolojik korunmayı sağlamaktadır. Ayrıca insan sağlığı açısından gıda zehirlenmelerini ve patojenite riskini azaltmaktadır. İnsan beslenmesinde önemli bir yeri olan süt, zengin mikrofloraya sahip bir besin maddesidir. Sütün doğal mikroflorasını laktik asit bakterileri oluşturur. Bu bakterilerin çeşitli enzim özellikleri, fermente süt ürünlerinin oluşumunda önem taşımaktadır. Laktik bakteriler metabolizmaları sonucu ürettikleri laktik asit, proteaz, lipaz, α-amilaz gibi enzimler ile fermente süt ürünlerinin olgunlaşmasında, koku, renk ve tat oluşumunda görev alırlar. Bu özelliklerin laktik bakteri suşlarında değerlendirilmesi amacıyla; araştırmamızda 30 çiğ süt örneği çalışılmıştır. 30 süt örneğinden 74 laktik bakteri izolatı izole edilerek adlandırılmıştır. Araştırmada izole edilen laktik bakteri cinsleri; 38 Lactobacillus (%51,4), 17 Pediococcus (%23), 8 Leuconostoc (%10,8), 5 Streptococcus (%6,8), 3 Lactococcus (%4) ve 3 Enterococcus (%4)’ dur. İzole edilen bakteri cinslerinden adlandırılan türler; 10 Lb. delbrueckii ssp. lactis (%13,5), 9 Lb. casei (%12,2), 6 Lb. rhamnosus (%8,2), 5 Lb. acidophilus (%6,8) 5 Lb. coryniformis ssp. tourquens (%6,8), 3 Lb. plantarum ssp. plantarum (%4), 5 Leu. mesenteroides ssp. mesenteroides (%6,8), 3 Leu. mesenteroides ssp. dextranicum 103 (%4), 9 P. pentosaceus (%12,2), 6 P. dextrinicus (%8,2), 1 P.inopinatus (%1,3), P. acidilactici (%1,3), 4 S. lactis (%5,4), 1 S. cremoris (%1,3), 3 Lactococcus lactis ssp. lactis (%4), 2 E. faecalis (%2,7) ve 1 E. faecium (%1,3)’ dur. İzole edilip adlandırılan tüm laktik bakteri cinslerinden en sıklıkla izole edilen Lactobacillus bakterileridir. En sıklıkla izole edilen tür ise Lb. delbrueckii ssp. lactis olarak belirlenmiştir. Araştırmada 17 Pediococcus bakterisinden, 9 P. pentosaceus, 6 P. dextrinicus, 1 P. inopinatus ve 1 P. acidilactici izole edilmiştir. Pediococcus bakterilerinden en sıklıkla izole edilen tür P. pentosaceus olarak tespit edilmiştir. Adıgüzel 2001 yılında yaptığı bir çalışmada, 110 çiğ süt örneğinden 249 laktik asit bakterisi izole etmiştir. İzole edilen Pediococcus türleri 12 P. pentosaceus, 10 P. halophilus, 5 P. urinequi ve 4 P. damnosus olmakla beraber en sıklıkla izole edilen Pediococcus türü P. pentosaceus olarak belirlenmiştir 9. Bizim çalışmamızla paralellik göstermiştir. 2002 yılında Çetin’in yapmış olduğu araştırmada, 10 çiğ süt örneğinden 27 laktik bakteri izolatı izole edilmiştir. Bu 27 izolatın 5’i Lactococcus lactis ssp. lactis, 1’i Lactococcus lactis ssp. cremoris, 1’i Lactococccus raffinolactis ve 11’i Enterococcus ssp. olarak tespit edilmiştir. Lactococcus cinsi olarak en sıklıkla izole edilen tür Lactococcus lactis ssp. lactis’tir 10. Bizim araştırmamızda da Lactococcus lactis ssp. lactis izole edilmiştir. Araştırmada izole edilen Streptococcus ve Enterococcus türleri; 4 S. lactis, 1 S. cremoris, 2 E. faecalis ve 1 E. faecium olarak tespit edilmiştir. Streptococcus cinsi olarak S. lactis, Enterococcus cinsi olarak E. faecalis en sıklıkla izole edilen tür olmuştur. Akkuzu (2004), pastörize süt ve pastörize sütlerden hazırlanmış 60 kefir örneğinden laktik asit bakterilerini izole etmiştir. İzole edilen bakteriler; 3 P. acidilactici, 1 Lb. 104 helveticus, 1 Leu. lactis, 1 Leu. cremoris, 22 E. faecalis, 5 E. faecium, 10 E. durans, 1 E. hirae, 4 E. dispar, 41 S. lactis, 3 S raffinolactis, 1 S. thermophilus ve 1 S. acidominimus olarak belirlenmiştir. Enterococcus cinsinden en sıklıkla E. faecium, Streptococcus cinsinden S. lactis izole edilen türlerdir 11. Bizim araştırmamızla parallelik göstermiştir. Araştırmada 38 Lactobacillus bakterisinden (10 Lb. delbrueckii ssp. lactis, 9 Lb. casei, 6 Lb. rhamnosus, 5 Lb. acidophilus, 5 Lb. coryniformis ssp. tourquens, 3 Lb. plantarum ssp. plantarum) en sıklıkla izole edilen tür Lb. delbrueckii ssp. lactis olarak belirlenmiştir. Arslan’ın 2005 yılındaki bir çalışmasında 50 çiğ süt örneğinden 32 laktik bakteri izole edilip adlandırılmıştır. En sıklıkla izole edilen tür (%22) Lb. delbrueckii ssp. lactis olmakla beraber, %14 Lb. casei, %14 Lb. rhamnosus, %7 Lb. acidophilus ve %7 Lb. coryniformis ssp. tourquens izole edilmiştir 13. Bizim çalışmamızla paralellik gösterdiği tespit edilmiştir. Gheytanchi ve arkadaşlarının 2010 yılında yapmış olduğu bir çalışmada; 50 süt ve peynir örneğinden 41 Lactobacillus izole etmişlerdir. Bunlardan 3 Lb. acidophilus, 6 Lb. casei ssp. casei, 7 Lb. casei ssp rhamnosus, 3 Lb. delbrueckii ssp. lactis ve Lb. plantarum izole edilip adlandırılmıştır 16. Proteolitik aktivite, mikroorganizmalarca salgılanan proteolitik enzimler ile proteinlerin hidrolize edilmesidir. Proteolitik aktivite, hem starter kültürlerin asit oluşturma fonksiyonu hem de fermente ürünün özellikleri açısından önemlidir. Dolayısıyla sütün doğal mikroflorasını oluşturan ve starter kültür olarak kullanılan laktik asit bakterilerinin proteolitik aktiviteleri, fermente süt ürünlerinin olgunlaşmasında ve ürüne özgü özelliklerin belirlenmesinde önemli bir rol oynar. Araştırmada, izole edilen 74 laktik bakterinin proteolitik aktivitesi Calsiyum Caseinat Agar da zon çapları ölçülerek belirlenmiştir. Zon çapları, 4 mm’den küçük 105 olanlar etkisiz, 4–5 mm olanlar zayıf (+) ve 6–8 mm olanlar orta kuvvetli (++) proteolitik aktif olarak değerlendirilmiştir. 74 laktik bakterinin 70’inde proteolitik enzim aktivitesi olduğu tespit edilmiştir. Bu 70 bakterinin 36’sı (%51,4) zayıf (+), 34’ü orta (++) proteolitik aktif olarak saptanmıştır. İzole edilen laktik bakteri cinslerinin (Lactobacillus, Pediococcus, Leuconostoc, Streptococcus, Enterococcus ve Lactococcus) tümünde proteolitik enzim aktivitesi gözlenmiştir. En yüksek aktiviteye sahip türler, Lactococcus lactis ssp. lactis, Leu. mesenteroides ssp. dextranicum ve Pediococcus pentosaceus olmakla beraber zon çapları 8 mm olarak saptanmıştır. Karakuş ve arkadaşlarının (1992) yaptığı bir çalışmada, olgunlaşmanın başlangıcında peynir florasında L. lactis ssp. lactis baskın tür iken, E. faecalis ve E. faecium bakterilerinin ikinci en önemli tür olduğunu tespit etmişlerdir. Peynir olgunlaşmasında proteolitik ve lipolitik aktivitelerinin önemini vurgulamışlardır. Bizim çalışmamızda da L. lactis ssp. lactis türünde ve Enterococcus bakterilerinde proteolitik enzim aktivitesi tespit edilmiştir 17. Gürsoy ve arkadaşları (2001), az yağlı beyaz peynir üretiminde olgunlaşmayı hızlandırmak amacıyla ısıl işlem uygulanmış (65 0C’ de 20 dk.) starter kültür ( Lb. helveticus veya Lb. kullanılabileceklerini delbrueckii bildirmişlerdir. ssp. bulgaricus; Olgunlaşmanın 0.5 30. g/100g) başarıyla gününde proteoliz düzeyinin arzu dilen seviyelere yükseldiğini ve Lb. helveticus kullanımının daha iyi sonuç verdiğini tespit etmişlerdir 19. Araştırmada zon çapı ölçümlerine göre proteolitik enzim aktiviteleri değerlendirilen laktik bakterilerden, Lactococcus lactis ssp. lactis türü bakteriler Lactobacillus bakterilerine göre daha yüksek proteolitik aktivite gösterdiği tespit edilmiştir. 106 Perez ve arkadaşları (2003) tarafından yapılan bir çalışma sonucunda, çeşitli suşlar arasında Lactococcus cinsinin Lactobacillus cinsine oranla daha yüksek proteolitik aktivite gösterdiğini belirlemişlerdir 37. Bizim çalışmamızla paralellik göstermiştir. Çalışmada izole edilen Lactobacillus türlerinin proteolitik enzim aktiviteleri karşılaştırıldığında; Lb. acidophilus türünün zon çapı ölçümleri Lb. plantarum ssp. plantarum türüne oranla daha yüksek olduğu belirlenmiştir. Yüksekdağ’ın 2005 yılında kefirden izole ettiği laktik asit bakterileriyle yaptığı bir çalışmada, 21 Lactobacillus izole etmiştir. 1 Lb. acidophilus, 2 Lb. helveticus, 4 Lb. casei, 3 Lb. bulgaricus, 6 Lb. lactis, 3 Lb. plantarum ve 2 Lb. brevis’dir. Bu izolatların proteolitik aktivitelerine bakıldığında, maximum proteolitik aktivite Lb. acidophilus türünde gözlenirken minimum aktivite Lb. plantarum türünde gözlenmiştir 12. Bizim çalışmamızla paralellik göstermiştir. Araştırmada proteolitik aktivitesini incelediğimiz 3 Enterococcus bakterisinin 2’sinde zayıf kuvvetli proteolitik aktivite gözlenmiş olup, zon çapları 5 mm olarak tespit edilmiştir. Topisirovic ve arkadaşları (2009), fermente ürünlerden elde ettikleri 26 Enterokok türünün proteolitik ve antimikrobiyel özellikleri üzerine yaptıkları çalışmada βkazein’e karşı 25 enterokok türünün güçlü veya orta derecede proteolitik aktivite gösterdiğini saptamışlardır 21. Proteolitik bir enzim olan elastaz, elastin ve diğer proteinlerin daha basit moleküllere ayrılmasını katalize eder. Genellikle aminoasitlerin karbonil gruplarının bulunduğu bağlardaki polipeptit zincirini kıran, serin endopeptidazların bir grubudur. Elastaz birçok bakteriye virulans özellik kazandıran bir enzimdir. Araştırmada izole edilen laktik asit bakterilerinin elastaz enzim aktiviteleri Elastinli Nutrient Agar da çizgi ekim metoduyla incelenmiştir. Literatür araştırmalarında 107 laktik bakterilerin elastaz aktiviteleri ile ilgili çalışmalara rastlanmamıştır. Bizim çalışmamızda da laktik bakteri suşlarında elastaz enzim aktivitesi saptanmamıştır. Süt lipitleri, süt içinde bulunan en önemli bileşenlerden birisidir ve süt yağı lipaz enziminin etkinliğiyle yağ asidi ve gliserine parçalanır. Lipaz enzimi süt içinde doğal halde bulunabileceği gibi mikrobiyal kaynaklı da olabilir. Laktik asit bakterilerinin lipaz aktivitesi tür ve cinslere göre farklılık göstermektedir. Süt endüstrisinde laktik asit bakterilerinin proteoliz ve lipoliz enzim aktiviteleriyle, fermente ürünlerde tekstür, aroma ve lezzet oluşumu sağlanmakta olup, laktik bakterilerin lipolizi, birçok peynirde lezzet gelişimi için gereklidir. Çalışmada lipolitik enzim aktiviteleri araştırılan laktik bakteri suşlarının, Trybutrin Agarda oluşturdukları zon çapları ölçülmüştür. Zon çapı 4 mm ve 4 mm den fazla olan suşların lipolitik aktivitesi pozitif olarak değerlendirilmiştir. 74 laktik bakterinin 12’sinde zon çapı gözlenmiştir. Lactobacillus, Pediococcus, Leuconostoc ve Enteococcus cinslerinde zon çapı gözlenirken, Streptococcus ve Lactococcus cinslerinde gözlenmemiştir. Lb. acidophilus, Lb. delbrueckii ssp. lactis, P. pentosaceus, P. dextrinicus, Leu. mesenteroides ssp. mesenteroides ve E. faecalis türlerinde zon çapı 2 mm olarak saptanmıştır. 4 mm zon çapıyla Leu. mesenteroides ssp. dextranicum türünün lipolitik enzim aktivitesi gösterdiği tespit edilmiştir. Literatür çalışmalarında laktik asit bakterilerinin lipaz enzim aktivitesi tür ve cinslere göre farklılık gösterirken, Leu. mesenteroides ssp. dextranicum en yüksek lipolitik aktiviteye sahip olan türdür 24. Bizim araştırmamızla paralellik göstermiştir. Collins ve arkadaşları (2003) starter laktik asit bakterilerinin otolizi ile Cheddar peynirinin olgunlaşması sırasında serbest yağ asitlerinin (SYA) artan birikimi arasında bir ilişki gözlemlemişlerdir ve bunun peynirde intrasellüler lipolitik aktivitenin artan oranına bağlı olabileceğini ifade etmişlerdir 41. 108 Rasouli Pirouzan ve arkadaşları (2010) E. faecalis, E. faecium ve bunların ortak kullanımıyla hazırlanmış peynirlerde lipolize olan katkılarını inceledikleri bir çalışmada, olgunlaşma süresince lipoliz indeksinin önemli ölçüde kontrol grubuna nazaran daha yüksek olduğu saptanmıştır. Bu peynirlerde serbest yağ asidi miktarının daha fazla olduğu bildirilmiştir. Bu sonuç ilave enterokokların peynirde lipolize katkıda bulunduğunu göstermektedir 22. α-Amilaz enzimi, ham ve çözünür nişasta molekülündeki α-1,4glikozidik bağlarını parçalayarak, glikoz, maltoz, maltotrioz ve α-limit dekstrinlerin oluşumunu katalize eden bir enzimdir. Bu enzim tekstil ve kâğıt endüstrisinde, nişastanın sıvılaştırılmasında, ekmek, glikoz ve fruktoz şurupları ve tutkal üretiminde, alkol fermentasyonunda kullanılmaktadır. Laktik asit bakterilerinde α-amilaz enziminin varlığıyla ilgili bazı çalışmalar yapılmış olup, özellikle Lactobacillus cinsinde bu enzimin varlığı tespit edilmiştir. Çalışmada 74 laktik bakterinin α-amilaz enzim aktivitesi Luria Bertani Nişasta Agarda araştırılmıştır. İnkübe edilen bakterilerden iyodik boyama sonrası parlama yapan suşlar α-amilaz aktivitesi (+) olarak değerlendirilmiştir. 74 laktik bakterinin 6’sında α-amilaz enzim varlığı tespit edilmiştir. Lactobacillus, Pediococcus ve Leuconostoc cinsi bakterilerde α-amilaz enzim aktivitesi gözlenirken, Streptococcus, Lactococcus ve Enterococcus cinsinde gözlenmemiştir. Aktivite gösteren türler; Lb. plantarum ssp. plantarum, Lb. casei, Lb. coryniformis ssp. tourquens, P. pentosaceus ve Leu. mesenteroides ssp. dextranicum olarak saptanmıştır. Rodriguez-Sanoja ve arkadaşlarının 2005 yılında yapmış olduğu bir çalışmada, Lb. plantarum ve Lb. amylovorus’un α-amilaz enzim üretimleri karşılaştırılmış. Lb. amylovorus’un α-amilaz enzim üretiminin Lb. plantarum’a göre 10 kat daha fazla nişasta hidrolize ettiğini tespit etmişlerdir 45. 109 Laktik asit bakterilerinin starter kültür olarak seçilmelerinde enzim aktiviteleri önem teşkil etmektedir. Gıda endüstrisinde starter kültür olarak kullanım potansiyeli olan mikroorganizmaların γ-hemolitik suşlar olması gerekmektedir. Laktik bakterilerde hemolitik aktivite genellikle Streptococcus, Lactococcus ve Enterococcus cinslerinde görülebilmektedir. Araştırmada izole edilen laktik bakterilerin hemolitik enzim aktivitesi Colombia Blood Agar da incelenmiştir. Hemolitik aktivitesi pozitif olan türler; Streptococcus lactis, Lactococcus lactis ssp. lactis ve Enterococcus faecium’dur. Lactobacillus, Pediococus ve Leuconostoc cinslerinde hemolitik aktivite saptanmamıştır. Lactococcus cinsi üyeleri, genellikle hemolitik reaksiyon göstermezler. Ancak bazı L. lactis subsp. lactis suşlarında zayıf da olsa α-hemoliz görülebilir 23. Yine aynı şekilde Enterococcus faecium türünün bazı suşlarıda α-hemolitik olabilmektedir 56. 2008 yılında Anas ve arkadaşlarının yaptığı bir çalışmada, Cezayirde çiğ keçi sütünden izole edilen 64 Lactobacillus suşunun hemolitik aktivitelerini incelemişlerdir. Lactobacillus suşlarında hemolitik aktivitenin olmadığını rapor etmişlerdir 48. Hemolitik aktivitenin olmaması süt için kullanılan starter kültür seçiminde bir kriter oluşturmaktadır. Bizim çalışmamızda da Lactobacillus bakterilerinde hemolitik aktivite olmadığı tespit edilmiş olup, çalışmamızla paralellik göstermiştir. Laktik asit bakterilerinin en önemli özelliklerinden birisi de, aynı ortamda bulunan patojen ve kontaminant mikroorganizmaların gelişimini inhibe edebilmeleridir. Süt ve süt ürünlerinde bulunan bakterilerin inhibisyonunda, laktik bakterilerin ürettikleri organik moleküller (laktik, asetik, formik, propiyonik asit) ve antimikrobiyal bileşikler (hidrojen peroksit, diasetil ve bakteriosin) etkili olmaktadır. Araştırmada, izole edilen laktik bakterilerin inhibitör etkisi Nutrient Agar ve %0,2 glikozlu Nutrient Agarda kuyu difüzyon metoduyla incelenmiştir. Adlandırılan laktik 110 bakteri türlerinin her birinden bir örnek alınarak, 17 laktik bakteri türünün patojenlere inhibitör etkisi çalışılmıştır. İndikatör bakteri olarak; Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes, Salmonella typhimurium, Klebsiella pneumoniae ve E. coli patojenleri kullanılmıştır. Laktik asit bakterilerinin patojen bakteriler üzerindeki inhibitör etkisi zon çapları ölçülerek değerlendirilmiştir. Zon çapı 4 mm’nin üzerinde olanlar pozitif olarak rapor edilmiştir. Sonuç olarak 17 laktik bakteri türü Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes ve Salmonella typhimurium üzerine etkili bulunmuştur. Lactobacilluslar tüm indikatör bakterilere karşı inhibitör etki göstermiştir ve zon çapları 2-18 mm arasında ölçülmüştür. Yine çalışılan tüm laktik bakterilerin en etkili olduğu patojen bakteri L. monocytogenes’dir. En yüksek 18 mm zon çapı Lb. delbrueckii ssp. lactis de tespit edilmiştir. Araştırmada iki farklı besiyerinde inhibitör etki çalışılmıştır. Deney sonucunda %0,2 glikozlu Nutrient Agarda zon çapı ölçümlerinin daha büyük olduğu gözlenmiştir. Arslan’nın 2005 yılında yapmış olduğu bir çalışmada iki farklı ortamda inhibitör etki çalışılmıştır. Aynı şekide glikozlu Nutrient Agarda zon çaplarını daha büyük tespit etmiştir 13. Bizim araştırmamızın sonuçlarını doğrulamıştır. Garcia ve arkadaşları 1993 yılında laktik asit bakterilerinin Listeria monocytogenes’e karşı inhibitör etkilerini tespit etmişlerdir. Çalışmalarında besiyerine %0,2 oranında glikoz ilave etmişlerdir 76. Garriga ve arkadaşlarının 1993 yılında yaptığı bir çalışmada da Lactobacillus suşlarının Listeria monocytogenes üzerine inhibitör etkisini tespit etmek için besiyerine %0,2 oranında glikoz ilave etmişlerdir. Araştırmaları sonucunda bu 111 suşların Listeria monocytogenes’e karşı inhibisyon oluşturduğunu tespit etmişlerdir 77. Yaptığımız araştırmada, İnhibitör zon çapları incelen Lactobacillus bakterileri (Lb. delbrueckii ssp. lactis, Lb. casei, Lb. acidophilus, Lb. rhamnosus, Lb. coryniformis ssp. tourquens ve Lb. plantarum ssp. plantarum) S.aureus, L.monocytogenes, S.typhimurium’a etkili bulunmuştur. Lb. delbrueckii ssp. lactis’in en yüksek etkiyi indikatör bakterilerden L. monocytogenes ve S.typhimurium’a göstermiştir. Tüm laktik bakterilerin E. coli üzerinde oluşturdukları zon çapları 0 ile 4 mm arasında değişmektedir. Lb. plantarum ssp. plantarum ve E. faecium’ un zon çapı 4 mm ölçülmüştür ve E. coli’ye etkili bulunmuştur. Diğer laktik bakteri türleri E. coli’ye etki göstermemiştir. Aynı şekilde, Çon ve Gökalp 2000 yılında kuyu difüzyon tekniği kullanarak yaptıkları bir çalışmada, Pediococcus pentosaceus suşlarının, E. coli’ ye karşı inhibitör etkisinin bulunmadığını göstermişlerdir 29. Yaptığımız çalışma sonuçlarını doğrulayan bir diğer araştırma, Schillinger ve arkadaşları (2001)’nın ki olup, çalışmalarında, laktik asit bakterilerinin Listeria monocytogenes üzerine bakteriosin etkisini incelemişler, L. monocytogenes üzerine gıdalara ilave edilen ve bakteriosin sentezleyen laktik bakterilerinin etkisini tespit etmişlerdir 78. Bir diğer çalışmada, Kılıç 2003 yılında Lactobacillus suşlarının S. aureus’a karşı inhibitör etkisini incelemiş ve Lactobacillus acidophilus suşunun S. aureus üzerine etki oluşturduğunu belirtmiştir 72. 2003 yılında Çadırcı Lb. plantarum’un Salmonella üzerine inhibitör etki gösterdiğini tespit etmiştir 79. 112 Chuayana ve arkadaşları 2003 yılında, laktik asit bakterilerinin S. aureus, E. coli ve Salmonella typhi üzerine antimikrobiyel etkilerini araştırmışlardır. Streptococcus spp. ve Lactobacillus spp. suşları S. aureus’a etki gösterirken Salmonella typhi ve E. coli’ye karşı etki göstermediğini rapor etmişlerdir 80. Yukarıda anlatılan çalışmalar, bizim çalışmamızın sonuçlarını desteklemekte olup, araştırmamızda da, Lb. acidophilus ve Lb. plantarumm ssp. plantarum bakterileri S. aureus, L. monocytogenes ve S. typhimurium üzerine etki gösterdiği tespit edilmiştir. Dixit ve arkadaşları 2013 yılında Lactobacillus acidophilus suşlarının Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae, S. aureus, E. coli ve Salmonella typhi üzerine antibakteriyal etkilerini incelemişlerdir. P. aeruginosa ve K. pneumoniae etkisiz bulunurken, Salmonella typhi’ye etkili bulunmuştur 85. Araştırmada Lb. acidophilus bakterisi K. pneumoniae’ye etki göstermemiştir. Lb. acidophilus’un zon çapı hem Nutrient Agarda hem de %0,2 glikozlu Nutrient Agarda 2 mm ölçülmüştür. Yapılan çalışma sonuçlarımızı doğrulamaktadır. Araştırmada, Lactococcus lactis ssp. lactis bakterisi L. monocytogenes, S. aureus ve S. typhimurium’a etkili bulunmuştur. Zon çapı ölçümleri 2 ile 17 mm arasında değişmiştir. En yüksek etkiyi L. monocytogenes üzerine göstermiştir. Lactococcus lactis ssp. lactis’in zon çapı 17 mm ölçülmüştür. 2005 yılında Rodriguez ve arkadaşları yaptıkları bir çalışmada pediosin üreten Lactococcus lactis’in L. monocytogenes, S. aureus ve E. coli O157:H7’ nin gelişimini engellediğini tespit etmişlerdir 82. Gonzalez ve arkadaşlarının 2006 yılında yaptıkları çalışmada, Lactococcus lactis ssp. lactis suşlarının S. aureus ve Listeria monocytogenes üzerine antibakteriyel etki gösterdiğini bildirmişlerdir 81. 113 Yaptığımız araştırma sonuçlarıyla Rodriguez ve Gonzalez’in çalışması karşılaştırıldığında L. lactis ssp. lactis’in S. aureus ve L. monocytogenes’e etkili bulunması paralellik göstermiştir. Tuncer ve arkadaşlarının 2008 yılında yaptığı bir çalışmada, E. coli’ de inhibitör etki gözlenmezken, S. aureus üzerine L. lactis ssp. lactis suşunun etkili olduğunu tespit etmişlerdir 68. Çalışmamızda E. coli bakterisine karşı E. faecium zayıf etki gösterirken, diğer laktik bakteri türleri etki göstermemiştir. L. lactis ssp. lactis de etkili bulunmamıştır. Tuncer’in çalışması sonuçlarımızı doğrulamaktadır. Araştırmada, Pediococcus ve Leuconostoc bakterilerinin etkisi değerlendirildiğinde, tüm üyeler S. aureus, L. monocytogenes ve S.typhimurium’a etkili bulunurken E. coli ve K. pneumoniae’ye etki göstermemiştir. P. inopinatus, P. pentosaceus ve L. mesentereoides ssp. mesenteroides 14 mm zon çapıyla en yüksek etkiyi L. monocytogenes üzerinde göstermişlerdir. Adıgüzel’in 2001 yılında yaptığı çalışmasında da, Listeria monocytogenes ve S. aureus bakterilerinde Pediococcus pentosaceus ve Leuconostoc dextranicum türleri etkili bulunmuştur 9. Yapılan çalışma sonuçlarında Enterococcus faecalis suşu S. aureus, L. monocytogenes ve S. typhimurium’ a etki gösterirken, E. coli ve K. pneumoniae’ye etki göstermemiştir. E. faecium ise tüm indikatör bakterilere etki göstermiştir. Etöz 2006 yılında yapmış olduğu bir çalışmada, Enterococcus faecalis ve Enterococcus faecium bakterilerinin, S. aureus ve Listeria monocytogenes üzerinde etkisini gözlemlemiştir 83. 2008 yılında İşleroğlu ve arkadaşlarının yapmış olduğu bir çalışmada, Enterococcus faecalis’in L. monocytogenes’e karşı inhibitör etki gösteriken E. coli’ye etkili olmadığını gözlemlemişlerdir 55. Bizim çalışmamızla paralellik göstermiştir. 114 Sonuç olarak; laktik asit bakterilerinin enzimatik özellikleri süt endüstrisinde fermente ürün oluşumunda önemlidir. Aynı zamanda starter kültür olarak kullanılmaktadırlar. Fermente ürünün tat ve aromasının oluşumunu laktik bakterilerin enzimleri etkilemektedir. Bu nedenle laktik bakterilerin enzim özelliklerinin belirlenmesi gıda endüstrisinde fermente ürünlerin üretimleri açısından önem kazanmaktadır. Proteaz enzim aktivitesi en yüksek tespit edilen laktik bakteri türleri; Lactococcus lactis ssp. lactis, Leu. mesenteroides ssp. dextranicum ve Pediococcus pentosaceus’dur. Lipaz enzim aktivitesi tespit edilen tür; Leu. mesenteroides ssp. dextranicum’dur. -amilaz enzim aktivitesi belirlenen türler; Lb. plantarum ssp. plantarum, Lb. casei, Lb. coryniformis ssp. torquens, Pediococcus pentosaceus ve Leu. mesenteroides ssp. dextranicum’dur. Hemolitik enzim aktivitesi saptanan türler; Streptococcus lactis, Lactococcus lactis ssp. lactis ve Enterococcus faecium’dur. Laktik asit bakterilerinin proteolitik ve lipolitik enzim aktivitesi fermente ürünlerin lezzet ve aromasında etkili olmakla beraber özellikle süt endüstrisinde peynirlerin olgunlaşmasını, tereyağının lezzet ve aromasının oluşumunu sağlar. Bu sebeple enzim aktivitelerini tespit ettiğimiz laktik bakteri türlerinin gıda endüstrisinde starter kültür çalışmalarına katkı sağladığı düşünülmektedir. Bu bakterilerin bir diğer önemli özelliği olan inhibitör etkileri sayesinde ise; gıdalardaki patojen mikroorgizmalar inhibe olmaktadır. Laktik bakteriler bu özellikleri ile, patojen mikroorganizmaların zararlı etkilerinden gıdaları koruyarak, raf ömrünü uzatmaktadırlar. Ayrıca insan sağlığı açısından, gıda zehirlenmelerine ve patojen bakterilerin olumsuz etkilerine karşı koruyucu etki oluşturmaktadırlar. 115 KAYNAKLAR 1. Toksoy A., “Lactobacillus plantarum ve Pediococcus pentosaceus suşlarının metabolik ve antimikrobiyal aktivitelerinin incelenmesi”, Gazi Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü, Doktora Tezi, 5-15 (1996) 2. Kleerebezem, M., Hugenholtz, J., “Metabolic pathway engineering in lactic acid bacteria”, Current Opinion in Biotechnology, 14: 232-237 (2003). 3. Hylckama, Vlieg van J. E. T., Hugenholtz, J., “Mining natural diversity of lactic acid bacteria for flavour and health benefits”, Internatıonal Dairy Journal, 17: 1290-1297 (2007). 4. Aslım, B., Beyatlı, Y. and Halkman, K., “ Yoğurt starter kültür metabolitlerinin inhibisyon etkisi”, Turk J. Biol., 24 65-78 (2000). 5. Hugenholtz, J., “The lactic acid bacterium as a cell factory for food ingredient production”, International Dairy Journal, 18: 466-475 (2008). 6. Caplice, E., Fitzgerald, G. F., “Food fermentations: Role of microorganisms in food production and preservation”, International Journal of Food microbiology, 50: 131-149 (1999). 7. Lücke, F. K., “Lactic acid bacteria involved in food fermentations and their present and future uses in food industry”, NATO ASI Series, Series H: Cell Biology, New York 98: 81-99 (1996). 8. Egan, A. F., “Lactic acid bacteria of meat and meat products”, Antonie van Leeuwenhoek , 49: 327- 336 (1983). 9. Adıgüzel, S., “Çiğ Sütlerden İzole Edilen Streptococcus, Leuconostoc, Pediococcus Türlerinin Değişik Tuz Konsantrasyonlarında Staphylococcus aureus, Bacillus subtilis ve Bacillus cereus Türleri Üzerine İnhibitör Etkilerinin Araştırılması”, Gazi Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Yüksek lisans Tezi, 25-47 (2001). 10. Çetin, A.E., “ Isolation and Molecular Characterization of Lactic Acid Bacteria From Raw Milk”, İzmir Institute of Technology, Master of Science 3-15 (2002). 11. Akkuzu, S., “Kefir mikroflorası içerisinde çeşitli patojenlerin yaşam süreleri”, Yüksek Lisans Tezi, Gazi Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü, Ankara,124-127 (2005). 12. Yüksekdağ, Z.N., “Bazı laktik asit bakterilerinin fizyolojik, biyokimyasal, plazmid-DNA ve protein profil özelliklerinin incelenmesi” Gazi Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü, Doktora Tezi 1-12 (2005). 116 13. Arslan, S., Uraz, G., “Inhibitory activity of natural isolates of lactic acid bacteria from raw milk againts”, Hazardousmicrobes, Milcwissenschaft., 60(1) : 31-33 (2005). 14. Coşkun, S., “ Beyaz peynirde 90 gün olgunlaşma süresi boyunca Listeria monocytogenes varlığı”, Gazi Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü, Doktora Tezi, 44-50 (2006). 15. Tatlı, D., “ Geleneksel süt ürünlerinden izole edilen laktik asit bakterilerinin antibiyotik dirençlerinin belirlenmesi”, Çukurova Üniversitei Fen Bilimleri Enstitüsü, Yüksek Lisans Tezi, 1-10 (2009). 16. Gheytanci E. et al., “Study on beta-galaktosidase enzyme produced by isolated lactobacilli from milk and cheese” African journal of microbiology Research, vol 4(6), pp. 454-458 (2010). 17. Karakuş, M., Borçaklı, M., Alperden, I., “Beyaz peynirin olgunlaşması sürecinde laktik asit bakterileri”. Gıda, 17; 363-369 (1992). 18. Uraz, G., Gündoğan, N., “Beyaz peynirlerin mezofil mikroflorasında Koliform, Streptokok, Laktobasil, Leukonostok, Pediokok, Stafilakok ve Basillusların bulunma sıklıkları”. Gıda, 23; 391-401 (1998). 19. Gürsoy, A., Gürsel, A., Şenel, E., Deveci, O., Karademir, E., “Yağ içeriği azaltılmış Beyaz peynir üretiminde Lactobacillus helveticus ve Lactobacillus delbrueckii ssp. bulgaricus kültürlerinin kullanımı”, GAP II. Tarım Kongresi, Şanlıurfa, Ekim 24-26, s. 269-278 (2001). 20. Gürsel, A., Gürsoy, A., Şenel, E., Deveci, O., Karademir, E., “The use of freeze-shocked lactic starters in low-fat White pickled cheese.”, Milchwissenschaft, 58(5/6); 279-282 (2003). 21. Topisirovic L, Veljovic K, Fira D, Terzic-Vidojevic A, Abriouel H, Galvez, A., “Evaluation of antimicrobial and proteolytic activity of enterococci isolated from fermented products”, Eure Food Res Technol, 230 (1), 63-70 (2009). 22. Rasouli Pirouzian H., Hesari J., Farajnia S., Moghaddam M., Ghiassifar S., Manafi M., “Inclusion of Enterococcus faecalis and Enterococcus faecium to UF White Cheese”, WASET, 66, 850-854 (2010). 23. Yıldırım, R., “ Nisin Üreticisi Lactococcus lactis subsp. lactis LL27 Suşunun Beyaz Peynirde Listeria monocytogenes’in gelişiminin engellenmesi üzerine etkisi”, Ankara Üniversitesi Biyoteknoloji Enstitüsü, Yüksek Lisans Tezi, 4–7, 39-46 (2010). 117 24. Kılıç S., “ Süt endüstrisinde laktik asit bakterileri” I. Baskı. Ege Üniv. Ziraat. Fak. Yayınları, No: 542. Bornova, İzmir (2004). 25. Gonzalez L. et al, “Enzymatic activity of lactic acid bacteria isolated from a traditional Spanish cheese”, Food Microbiology, 27, 592-597 (2010). 26. Arslan S., “ Çiğ süt, pastörize süt ve beyaz peynirde üreyen bakterilerde beta-laktamaz araştırılması”, Gazi Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü, Yüksek Lisans Tezi, Temmuz, 3-10 (1994). 27. Tamime Ay and Robinson RK, Microbiology of yoghurt and “bio” cultures, in: Tamime Ay and Robinson RK (eds.), “ Yoghurt science and technology”, Cambridge, Woodhead, 2nd edn, pp. 389-431, (1999). 28. Yaygın, H., Toklu G.Ş., “Süt Ürünleri Üretiminde Starter Kültürler”, VI. Süt ve Süt Ürünleri Sempozyumu, Tekirdağ (2000). 29. Çon A., Gökalp H.Y., “ Laktik asit bakterilerinin antimikrobiyal metabolitleri ve etki şekilleri”, Türk Mikrobiyol Cem Derg, 30:180-190 (2000). 30. Tamime, A. Y. and Deeth, H. C., “Yoghurt: Technology and biochemistry”, J. Food Prot., 43(12), 939-977, (1980). 31. Oneca M, Ortigosa M, Irigoyen A, Torre P, “Proteolytic activity of some Lactobacillusparacasei strains in a model ovine-milk curd system: Determination of free amino acids by RP-HPLC”, Food Chem, 100 (4), 1602-1610) .(2007). 32. Milesi MM, Bergamini CV, Hynes E., “Production of peptides and free amino acids in asterile extract describes peptidolysis in hardcookedcheeses”, Food Res Int, 44 (3), 765-773 (2011). 33. Kıran E. Ö. et al., “Bazı mikrobiyal enzimler ve endüstrideki kullanım alanları”, Journal of science and engineering, 9(1), (2006). 34. Rajagopal, S. N., Sandine, W. E., “Assocative growth and proteolysis of Streptococus thermophilus and Lactobacillus bulgaricus in skim milk”, J. Dairy Sci., 73, 894-899 (1990). 35. Aslım, B., “L. bulgaricus ve S. thermophilus Bakterilerinin Metabolik ve Antimikrobiyal Aktiviteleri Üzerine Bazı Fiziksel ve Kimyasal Mutagenlerin Etkisi”, Doktora Tezi, G. Ü. Fen Bil. Enst., Ankara 12-23 (1994). 36. Tekinşen, O.C. ve Atasever, M., “Süt ürünleri üretiminde Starter Kültür” Selçuk üniv. Veteriner Fakültesi Yayın ünitesi, Konya (1994). 118 37. Perez, G., Cardell, E., Zarate, V., “Technological characterization of lactic acid bacteria from Tenerife cheese”, Int.J. Food Sci. Tech, 38, 537-546 (2003). 38. Herreros, M.A., Fresno, J.M., Gonzalez Prieto, M.J., Tornadjio, M.E., “Technological characterization of lactic acid bacteria isolated from Armada cheese ( a Spanish goats’ milk cheese)”, Int. Dairy J., 13. 469-479 (2003). 39. Pitas RE., Jensen RG., “Action of pregastric esterase on synthetic triglycerides combining butyric acid”, J Dairy Sci, 53, 1083 (1970). 40. Marilley, L. and M.G. Casey., “Flavours of cheese products: metabolic pathways, analytical tools and identification of producing strains”, Int. J. Food Microbiol., 90:139–159 (2004). 41. Collins YF., McSweeney PLH., Wilkinson MG., “Evidence of a relationship between autolysis of starter bacteria and lipolysis in Cheddar cheese during ripening”, J. Dairy Res., 70, 105–113 (2003). 42. Reiter B., Fryer TF., Pickering A., Chapman HR., Lawrence RC., Sharpe ME., “The effect of the microbial flora on the flavour and free fatty acid composition of Cheddar cheese”, J. Dairy Sci., 34, 257–271 (1967). 43. Kilcawley KN., Hickey DK., Beresford TP., Wilkinson MG., “Starter bacteria are the prime agents of lipolysis in cheddar cheese”, J. Agric. Food Chem., 54, 8229-8235 (2006). 44. Güven, R.G., “Termofilik Bakteriler ve Biyoteknolojik Açıdan Önemli Bazı Enzimleri”, Elektronik Mikrobiyoloji Dergisi, TR, cilt:09, sayı:1, sayfa:1-10 (2011). 45. Rodriguez-Sanoja, “Starch-binding domain affects catalysis in two Lactobacillus alpha-amylases” Departamento de Biologia Molecular Biotecnologia, Instituto de Investigaciones Biomedicas, UNAM A P 70228, 04510 Mexico City, Mexico Appl Environ Microbiol, 71:297-302 (2005). 46. Maragkoudakis, P.A., Zoumpopoulou, G., Miaris, C., Kalantzopoulos, G., Pot, B. and Tsakalidou, E., “ Probiotic potential of Lactobacillus strains isolated from dairy products.”, Int. Dairy J., 16;189-199 (2006). 47. Mourad, K. and Nour-Eddine, K., “Microbiological study of naturally fermented Algerian green olives: Isolation and identification of lactic bacteria and yeasts along with the effects of brine solutions obtained at the end of olive fermentation on Lactobacillus plantarum.”, Grasas Y Aceites, 57:292300 (2006). 119 48. Anas, M., Eddine, H.J., Mebrouk, K., “Antimicrobial Activity of Lactobacillus Species Isolated from Algerian Raw Goat’s Milk Against Staphylocccus aureus”, World Journal of Dairy, Food Sciences,3(2): 39-49 (2008). 49. Beijerinck, M.W., “Sur les ferments lactiques de l’industrie”, Arch. Néer. Sci., (sect. 2) 6: 212–243 (1901). 50. Axelsson, L.T., “ Lactic acid bacteria: classification and physiology”, In: Salminen S., von Wright, A., editors. Lactic acid bacteria. New York: Marcel Dekker, Inc., 1-72 (1993). 51. Buckenhüskes H.J., “Selection criteria for lactic acid bacteria to be used as starter cultures for various food commodities”, FEMS, Microbiol. Rev., 12, 253-71 (1993). 52. Vandenbergh P.A., “Lactic acid bacteria their metabolic products and interference with microbial growth”, FEMS Microbiol. Rev., 12, 221-37 (1993). 53. Axelsson L., “Lactic acid bacteria: classification and physiology”, in: Salmion S. and Von Wright A. (eds.) “ Lactic acid bacteria”, New York, Marcel Dekker, 2nd edn pp. 1-72 (1998). 54. Choisy C., Desmazeaud M., Gueguen M. et al., “Microbial phenomera”, in: Eck A and Gillis J. (eds.) cheesemaking: From science to Quality Assurance, Paris, Lovoisier, 2nd edn, pp. 353-417 (2000). 55. İşleroğlu, H. Yıldırım, Z. ve Yıldırım, M., “ Yöresel peynirden antimikrobiyal aktiviteye sahip laktik asit bakterisinin izolasyonu ve tanısı”, Gazi Osmanpaşa Üniversitesi Ziraat Fakültesi Dergisi, 25 (1), 1-6 (2008). 56. Vos, P.; Garrity, G.; Jones, D.; Krieg, N.R.; Ludwig, W.; Rainey, F.A.; Schleifer, K.-H.; Whitman, W.B. (Eds.). Bergey’s of manual systematic Bacteriology, 460-480 (2009). 57. Orhan S., “ Çiğ süt ve peynir örneklerinde Enterococcus’ ların izole edilmesi ve proteolitik aktivitelerinin araştırılması”, Gazi Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü, Yüksek Lisans Tezi, Eylül, 27-31 (2003). 58. Kılıç, S., “Yoğurt kültürünü oluşturan L. bulgaricus ve S. thermophilus bakterilerinin antibakteriyal özellikleri üzerine bir araştırma”, Gıda, 15(6), 333-338 (1990). 59. Blandino, A., Al-Aseeri, M.E., Pandiella, S.S., Cantero, D., Webb, C., “Cereal-Based Fermented Foods and Beverages”, Food Research International, 36, 527-543 (2003). 120 60. Ham, J.S., Kim, H.S., Hong, K.H., Kim, J.G., Jeong, S.G., Chae, H.S., Ahn, J.N., Kang, D.K., and Kim, H.U., “ Inhibitory activity of lactic bacteria againts hazardous microbes”, Asian-Aust. J. Animal Sci., 16: 1550-1554 (2003). 61. Rodriguez, J.M., Martinez, M.I., Horn, N. and Dodd, H.M., “ Heterologous production of bacteriocins by lactic acid bacteria”, Int. J. Microbiol., 80: 101-116 (2003). 62. Attaie, R., Whalen, P.J., Shalani, K.M. and Amer. M.A., “ Inhibition of growth of Staphylococcus aureus during production of acidophilus yoğurt”, J. Food Prot., 50: 224-228 (1987). 63. Okereke, A. and Montville, T.J., “ Bacteriocin inibition of Clostridium botulinum spores by lactic acid bacteria”, J. Food Prot., 54: 349-353 (1991). 64. C. Charlier, S. Even, M. Gautier, Y. Le Loir, “Acidification is not involved in the early inhibition of Staphylococcus aureus growth by Lactococcus lactis in milk”, International Dairy Journal, 18 (2008), pp. 197–203 (2008). 65. D. Hernandez, E. Cardell, V. Zarate “Antimicrobial activity of lactic acid bacteria isolated from Tenerife cheese: initial characterization of plantaricin TF711, a bacteriocin-like substance produced by Lactobacillus plantarum TF711”, Journal of Applied Microbiology, 99, pp. 77–84 (2005). 66. W.-H. Lin, Ch.-F. Hwang, L.-W. Chen, H.-Y. Tsen, “Variable counts characteristic evaluation for commercial lactic acid bacteria products”, Food Microbiology, 23, pp. 74–81 (2006). 67. Fuller, R., “Probiotics in Man and Animals”, J. Appl. Bacteriol. 66: 365-378 (1989). 68. Tuncer, Y., Akçelik, M., “Preliminary Biochemical and Genetic Characterization of the Bacteriocins Produced by Three Lactococcus lactis subsp. lactis Strains”, Australian Journal of Dairy Technology, 62, 19-25 (2007). 69. Kınık, Ö., Gönç, S., Akalın, S., “Çiğ sütte patojen mikroorganizmalar”, Ege Üniversitesi Ziraat Fakültesi Süt Teknolojisi Bölümü, (1998). 70. P.A. Maragkoudakis, G. Zoumpopoulou, Gh Miaris, G. Kalantzopoulos, B. Pot, E. Tsakalidou, “Probiotic potential of Lactobacillus strains isolated from dairy products”, International Dairy Journal., 16, pp. 189–199 (2006). 71. Koji Nomoto, “Prevention of Infection by Probiotics”, Journal of Bioscience and Bioengineering, 100, pp. 583–592 (2005). 121 72. Kılıç, E., “ İnsan Vajinasından İzole Edilen Lactobacillus Cinsi Bakterilerin Bazı Probiyotik Özelliklerinin İncelenmesi”, Gazi Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü, Yüksek lisans Tezi, 3-8 (2003). 73. S. Ammor, G. Tauveron, E. Dufour, I. Chevallier, “Antibacterial activity of lactic acid bacteria against spoilage and pathogenic bacteria isolated from the same meat small-scale facility. 1. Screening and characterization of the antibacterial compounds”, Food Control, 17, pp. 454–461 (2006). 74. Karska-Wysocki. B., Bazo. M., Smoragiewicz. W., “ Antibacterial activity of Lactobacillus acidophilus and Lactobacillus casei againts methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA)”, Microbiological Research,165, 674-686 (2010). 75. Altuntaş, E.G., Ayhan K., Okcu, G., Erkanlı, K., Balcı, M.H., Sonakın, Ş.S., “ Çiğ Süt ve Peynir Örneklerinden İzole Edilen Laktik Asit Bakterilerinin Antimikrobiyel Aktiviteleri” , Gıda, 35(3) 197-203 (2010). 76. Garcia, M.R., Prieto, M., Alonso, C., Lopez, M.L.G., Fernandez, M.C.G.and otero., A., “ Numerical taxonomy of psychotrophic bacteria isolated from raw ewes milk”, Journal of Dairy Research, 60,371-383 (1993). 77. Garriga, M., Hugas, M. and Aymerich, T., “ Bacteriocinogenic activity of Lactobaacillus from fermented sausages”, J. Of Applied Bacteriology, 75,(2),142-148 (1993). 78. Schillinger, U., Becker, B., Vignolo, G. and Holzapfel, W.H., “Efficacy of nisin in combination with protective cultures against Listeria monocytogenes Scott A in tofu”, International Journal of Food Microbiology, 71, 159–168 (2001). 79. Çadırcı, B.H., “Bazı Lactobacillus Cinsi Bakterilerin Çeşitli Gram(+) ve Gram (-) Bakteriler Üzerine Antagonistik Etkisi”, Gazi Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü, Yüksek lisans Tezi, 32-38 (2003). 80. Chuayana JR., E.L., Ponce, C.V., Rivera, M.R.B., Cabrera, E.C., “Antimicrobial Activity of Probiotics From Milk Products”, Phil. J. Microbiol. Dis., 32(2); 71-74 (2003). 81. Gonzalez, L., Sandovel, H., Sacristan, N., Castro, J.M., Fresno, J.M., Tornadijo, M.E., “ Identification of Lactic Bacteria Isolated from Genestoso Cheese Throughout Ripening and Study of Their Antimicrobial Activity”, Food Control, Article in pres (2006). 82. Rodriguez, E., Calzada, J., Arquezj, L., Nuiiez, M., Medina, M., “Antimicrobial Activity of Pediocin-Producing Lactococcus lactis on Listeria 122 monocytogenes, Staphylococcus aureus and Escherichia coli 0157:H7 in Cheese”, International Dairy Journal, 15: 51-57 (2005). 83. Etöz, D., “Kefirden izole edilen maya ve bakterilerin bazı patojen mikroorganizmalar üzerine inhibitör etkisi”, Gazi Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü, Yüksek Lisans Tezi, 41-50 (2006). 84. Tuncer, Y., Özden, B., Avşaroğlu, M. D., “Bozanın Bazı Mikrobiyolojik Özelliklerinin ve Laktik Asit Bakterisi İzolatlarının Antibakteriyel Aktivitelerinin Belirlenmesi “, Süleyman Demirel Üniversitesi, Fen Bilimleri Enstitüsü Dergisi, 12-1,19-25 (2008). 85. Dixit, G., Samarth, D., Tale, V., Bhadekar, R., “ Comparative Studies on Potential Probiotic Characteristics of Lactobacillus acidophilus Strains”, Eurasia J Biosci. 7, 1-9 (2013). 86. De Man, J. C., Rogosa, M. & Sharpe, M. E., “A medium for the cultivation of lactobacilli”, J Appl Bacteriol. 23, 130–135 (1960). 87. Anonymous, “Çiğ Süt”, Türk Standartları Enstitüsü, TS 1018, Udc 673.141 (1981). 88. Sharpe, M.E., “Identification of the Lactic Acid Bacteria. In: Identification Methods for Microbiologists”, Skinner, F.A. and D.W. Lovelock (Eds.), Academic Press, London, pp: 233-259 (1979). 89. Gilliland, S.E, Staley, T.E., and Bush, L.J., “Importance of bile tolerance of Lactobacillus acidophilus used as dietary adjunct”, J. Dairy Sci. 67 30453051 (1984). 90. Koneman E.W., Allen S.D., Janda W.M., Schreckernberger P.C., Winn W.C. Jr., “Color Atlas and Testbook of Diagnostic Microbiology”, Lippincott Comp. Philadelpia, 4:(1992). 91. Kandler, O., and Weiss, N., Genus Lactobacillus Beijerinck 1901. In Sneath, P. H. A., Mair, N. S., Sharpe, M. E., Holt. J., G. eds. Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology. Vol. 2. The Williams and Wilkins Co. Baltimore, MD, pp 1209-1234. (1986). 92. Hammes, W.P., N. Weiss and W.H. Holzapfel, “The Genera Lactobacillus and Carnobacterium”, In: The Prokaryotes, Barlows A., H.G. Truper, M. Dworkin, W. Harder and K. H. Schleifer (Eds.). Springer, Berlin, pp: 15341593 (1992). 93. Clark, S., Brazis, R. and Fowler, L., “ Standart Plate Count Method”, Standart methods for the Examination of Dairy Products” , 14 th Edition, (A.P.H.A.), Washington, 77-94 (1978). 123 94. Türk Standartları Enstitüsü, Çiğ Süt TS1018, (1981). 95. Rouof, K., “ Leuconostoc, Pediococcus, Stomatococcus and Miscellaneous gram positive cocci that grow aerobiocally”, Manual of Clinical Microbiology. Sixt edition, Williams and Wilkins, Washington, 309-311 (1995). 96. Garvie, E.I., “Genus Leuconostoc. In: Bergey`s Manual of Systematic Bacteriology”, Sneath, P.H.A. and J.G. Hold (Eds.). Vol. 2, Williams and Wilkins Co., Baltimore, pp: 1071-1075 (1986). 97. Rotta, J., R. M. Krause, R. C. Lancefield, W. Everly, and H. Lackland, “New approaches for the laboratory recognition of M types of group A streptococci”, J. Exp. Med. 134:1298-1315 (1971). 98. Washington, J.A., “ Laboratory Procedures in Clinical Microbiology”, 2 nd Edition United States of America, 150., (1985). 99. Morihara, K., Tsuzuki, H., Oda, K., “Protease and elastase of Pseudomonas aeruginosa: Inactivation of human plasma 1-proteinase inhibitor”, Infect Immun 24, 188-193, (1979). 100. Sambrook, J., Russell, D.W., “Molecular Cloning: A Laboratory Manual”, Cold Spring Harbor Laboratory. Press Cold Spring Harbor, New York. (2001). 101. Harrigan, W.F. and M.E. McCance, “Laboratory Methods in Food and Dairy Microbiology”, 1st Edn., Academic Press, London, pp: 25-29 (1976). 124 ÖZGEÇMİŞ Kişisel Bilgiler Soyadı, adı : ORHAN, Elif Uyruğu : T.C Doğum Tarihi ve Yeri : 27/02/1987 ANKARA/ Yenimahalle İletişim Bilgileri Telefon : 05415675263 e-mail : elif.orhan1@gmail.com Eğitim bilgileri Derece Eğitim Birimi Mezuniyet Tarihi Lisans Gazi Üniversitesi / Biyoloji Bölümü 2008 Lise Eryaman Lisesi 2004 Yabancı Dil İngilizce Yayınlar (Bildiriler): - Uraz, G., Yılmaz, E., Akkuzu, S., Orhan, E., “Life span of Listeria monocytogenes in the Kefir microflora” Eurobiotech Agriculture Symposium (Kayseri 12-14 Nisan 2012) - Uraz, G., Akkuzu, S., Orhan, E., “Kefir mikroflorasında bulunan maya ve laktik asit bakterilerinin Staphylococcus aureus üzerine inhibitör etkisi” Türkiye EKMUD Kongresi (9-12 Mayıs 2012 İstanbul) - Uraz, G., Aytop, P., Orhan, E., “Sütten izole edilen Candidalarda Slime faktör üretimi” 21. Uusal Biyoloji Kongresi Ege Üniversitesi (İzmir 3-7 Eylül 2012) - Uraz, G., Akkuzu, S., Orhan, E., “Kefir mikroflorasında Aeromonas hydrophilia’nın yaşam süresi” Türkiye 11. Gıda Kongresi (Hatay 10-12 Ekim 2012)
