SÜTTEN İZOLE EDİLEN LAKTİK BAKTERİLER VE

advertisement
SÜTTEN İZOLE EDİLEN LAKTİK BAKTERİLER VE
STREPTOKOKLARIN ENZİM AKTİVİTELERİ
Elif ORHAN
YÜKSEK LİSANS TEZİ
BİYOLOJİ
GAZİ ÜNİVERSİTESİ
FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ
ARALIK 2013
ANKARA
ii
iii
iv
SÜTTEN İZOLE EDİLEN LAKTİK BAKTERİLER VE
STREPTOKOKLARIN ENZİM AKTİVİTELERİ
(Yüksek Lisans Tezi)
ELİF ORHAN
GAZİ ÜNİVERSİTESİ
FEN BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ
Aralık 2013
ÖZET
Araştırmada çiğ sütten izole edilen laktik asit bakterilerinin bazı enzim
özellikleri ve gıda patojeni bakteriler üzerine inhibitör aktivitelerinin
belirlenmesi amaçlanmıştır. Bu nedenle 30 çiğ süt örneğinden 74 laktik bakteri
izolatı izole edilip adlandırılmıştır. Adlandırılan türler; 10 Lactobacillus
delbrueckii ssp. lactis, 9 Lb. casei, 6 Lb. rhamnosus, 5 Lb. acidophilus, 5 Lb.
coryniformis ssp. tourquens, 3 Lb. plantarum ssp. plantarum, 5 Leuconostoc
mesenteroides ssp. mesenteroides, 3 Leu. mesenteroides ssp. dextranicum, 9
Pediococcus pentosaceus, 6 P. dextrinicus, 1 P. inopinatus, 1 P. acidilactici, 4
Streptococcus lactis, 1 S. cremoris, 2 Enterococcus faecalis, 1 E. faecium ve 3
Lactococcus lactis ssp. lactis olarak tespit edilmiştir. Çiğ sütten izole edilen
laktik bakterilerin proteaz, lipaz, elastaz, α-amilaz enzim özellikleri ve
hemolitik aktiviteleri araştırılmıştır. 74 izolatın 70’inde proteolitik aktivite
tespit edilmiştir. 36 izolat (%51,4) zayıf (+), 34 izolat (%48,6) orta (++)
proteolitik aktivite göstermiştir. İzole edilen laktik bakterilerin, Elastinli
Nutrient Agarda araştırılan elastaz enzim özellikleri saptanmamıştır. Trybutrin
Agarda lipolitik aktiviteleri araştırılan laktik bakterilerde, Leu. mesenteroides
ssp. dextranicum türünün zon çapı 4 mm olarak tespit edilmiştir. Diğer
suşlarda zon çapı gözlenmemiştir. α-amilaz enzim aktiviteleri Nişasta Agar
besiyerinde test edilmiştir. Lb. plantarum ssp. plantarum, Lb. casei, Lb.
coryniformis ssp. tourquens, Pediococcus pentosaceus ve Leu. mesenteroides
v
ssp. dextranicum türlerinde α-amilaz (+) aktivite göstermiştir. Kanlı Agarda
hemolitik aktiviteleri incelen laktik bakterilerden, S. lactis, Lactococcus lactis
ssp. lactis ve Enterococcus faecium türleri (+) aktivite gösterirken diğer türlerde
hemolitik aktivite gözlenmemiştir. Çiğ sütten izole edilen 17 farklı bakteri
türünün her birinden bir suş alınarak inhibitör etki çalışılmıştır. Bu
bakterilerin inhibitör etkisi kuyu difüzyon metoduyla Nutrient Agar ve %0,2
glikozlu Nutrient Agarda çalışılmıştır. Tüm inhibitör etkisi çalışılan bakteri
türleri, Staphylococcus aureus, Listeria Monocytogenes ve Salmonella
typhimurium üzerine inhibitör etki göstermiştir. Ancak E. coli ve Klebsiella
pneumoniae üzerine etki göstermemiştir. En büyük etkiyi Lb. delbrueckii ssp.
lactis Nütrient Agarda 12 mm, %0,2 glikozlu Nutrient Agarda 18 mm zon
çapıyla L. monocytogenes ve S. typhimurium üzerine göstermiştir. Bu koşullarda
%0,2 glikozlu ortamda zon çapları daha büyük gözlenmiştir. Çalışılan tüm
laktik bakteri türleri E. coli ve K. pneumoniae üzerine etki göstermemiştir.
Bilim Kodu
: 203.1.010
Anahtar Kelimeler : Laktik asit bakterileri, Enzim aktivitesi, İnhibitör aktivite
Sayfa Adedi
: 124
Tez Yöneticisi
: Prof. Dr. Güven Uraz
vi
ENZYME ACTIVITIES OF LACTIC BACTERIA AND
STREPTOCOCCUS ISOLATED FROM MILK
(M. Sc. Thesis)
ELİF ORHAN
GAZİ UNIVERSITY
GRADUATE SCHOOL OF NATURAL AND APPLIED SCIENCES
December 2013
ABSTRACT
The research of some enzyme characteristics and the inhibitory activity of
pathogenic bacteria in food aimed to determine of lactic acid bacteria isolated
from raw milk. Therefore, 74 isolates of lactic acid bacteria isolated was named
from
30 raw milk samples. Species named; has been identified as 10
Lactobacillus delbrueckii ssp. lactis, 9 Lb. casei, 6 Lb. rhamnosus, 5 Lb.
acidophilus, 5 Lb. coryniformis ssp. tourquens, 3 Lb. plantarum ssp. plantarum,
5 Leuconostoc mesenteroides ssp. mesenteroides, 3 Leu. mesenteroides ssp.
dextranicum, 9 Pediococcus pentosaceus, 6 P. dextrinicus, 1 P. inopinatus, 1 P.
acidilactici, 4 Streptococcus lactis, 1 S. cremoris, 2 Enterococcus faecalis, 1 E.
faecium ve 3 Lactococcus lactis ssp. lactis. Lactic bacteria were investigated
protease, lipase, elastase, α-amylase enzyme characteristics and hemolytic
activities isolated from raw milk. Proteolytic activity was determined of 74
isolates in 70 isolates. 36 isolates (51.4%), weak (+), 34 isolates (48.6%),
moderate (+ +) has shown proteolytic activity. The isolated from lactic bacteria,
elastase enzyme characteristics appeared to function on the nutrient Agar in
Elastin researched. Lactic bacteria investigated lipolytic activities on the
Tributyrin Agar, Leu. mesenteroides ssp. dextranicum species detected zone
diameter of 4 mm. The other strains was not observed zone diameter. αAmylase enzyme activities were tested on Starch Agar. Lb. plantarum ssp.
plantarum, Lb. casei, Lb. coryniformis ssp. tourquens, Pediococcus pentosaceus
vii
and Leu. mesenteroides ssp. dextranicum species demonstrated α-amylase (+)
activity. Lactic bacteria were examined hemolytic activity on Colombia blood
agar. S. lactis, Lactococcus lactis ssp. lactis ve Enterococcus faecium species
demonstrated hemolytic (+) activity. On the other hand the other species was
not observed hemolytic activity. Isolated from raw milk 17 different bacterial
species taking from each strain was studied inhibitory effect. These bacteria was
studied inhibitory effect in the well diffusion method Nutrient Agar and 0,2%
glucose Nutrient Agar. While Lactic bacteria strains were showed on the S.
aureus, L. Monocytogenes and S. typhimurium an inhibitory effect when they
showed no effect on the E. coli and K. pneumoniae. In these conditions a larger
zone diameters has been observed in glucose medium. In these circumstances
the most greatest impact,
Lb. delbrueckii ssp. lactis strain showed zone
diameter 18mm on the L. monocytogenes and S. typhimurium. In these
conditions a larger zone diameters has been observed in 0,2% glucose Nutrient
Agar medium. All species studied lactic bacteria had no effect on E. coli and K.
pneumoniae.
Science Code
: 203.1.010
Key Word
: Lactic acid bacteria, Enzyme activity , Inhibitory effects
Page Number
: 124
Supervisor
: Prof. Dr. Güven Uraz
viii
TEŞEKKÜR
Çalışmalarımda, öncelikle tez konumu belirlememde, konuyla ilgili literatür
araştırmalarımda ve laboratuvar çalışmalarımda maddi ve manevi desteklerini
benden esirgemeyen değerli hocam Prof. Dr. Güven URAZ’ a teşekkürlerimi
sunarım. Ayrıca yüksek lisans öğrenciliğim sürecinde maddi ve manevi
desteklerinden dolayı sevgili aileme ve laboratuvar çalışmalarımda değerli bilgileri
ve manevi desteklerinden dolayı Yrd. Doç. Dr. Ebru Yılmaz hocama ve çok değerli
laboratuvar arkadaşlarıma teşekkür ederim.
ix
İÇİNDEKİLER
Sayfa
ÖZET………………………………………………………………………..
iv
ABSTRACT…………………………………………………………………
vi
TEŞEKKÜR…………………………………………………………………
viii
ÇİZELGELERİN LİSTESİ………………………………………………….
xiii
ŞEKİLLERİN LİSTESİ……………………………………………………..
xvii
RESİMLERİN LİSTESİ…………………………………………………….
xx
1. GİRİŞ ……………………………………………………………………
1
2. LİTERATÜR ARAŞTIRMASI ..………………………………………..
3
2.1. Laktik Asit Bakterilerinde Proteolitik Aktivite ………………..……
6
2.2. Laktik Asit Bakterilerinde Lipolitik Aktivite…………….…….…...
8
2.3. Laktik Asit Bakterilerinde α-Amilaz Enzimi……..…………………
9
2.4. Laktik Asit Bakterilerinde Elastaz Enzimi…………….………..…...
10
2.5. Laktik Asit Bakterilerinde Hemolitik Aktivite………………………
11
2.6. Laktik Asit Bakterilerinin Sınıflandırılması…………………......…..
11
2.7. Laktik Asit Bakterilerinin Fizyolojik ve Biyokimyasal Özellikleri.....
12
2.8. Laktik Asit Bakterilerinin Morfolojik Özellikleri……...…………….
12
2.9. Laktik Asit Bakterileri Nerede Bulunur……………………………...
13
2.10. Laktik Asit Bakterilerinde İnhibitör Etki…………………………...
16
3. MATERYAL VE METOT……………………………………………….
22
3.1. Çiğ Süt Örneklerinden Laktik Asit Bakterilerinin İzolasyonunda
KullanılanYöntemler…………………………………………………
24
3.1.1. Örnek alma ve örneklerin analize hazırlanması ………………
24
x
Sayfa
3.1.2. Laktik asit bakterilerinin izolasyonu ve adlandırılması ……....
25
3.2. Çiğ Sütten İzole Edilen Laktik Asit Bakterilerinin Proteolitik Enzim
Aktivitelerinin Belirlenmesi………………………………………….
33
3.2.1. İzole edilen bakterilerin proteolitik aktivitelerinin
belirlenmesinde kullanılan besiyeri …..………………………
33
3.2.2. İzole edilen bakterilerin proteolitik aktivitelerinin
değerlendirilmesinde kullanılan yöntem...………………….....
33
3.3. Çiğ Sütten İzole Edilen Laktik Asit Bakterilerinin Lipolitik Enzim
Aktivitelerinin Belirlenmesi…………………….……………….…..
34
3.3.1. İzole edilen bakterilerin lipolitik aktivitelerinin
belirlenmesinde kullanılan besiyeri ………………………….
34
3.3.2. İzole edilen bakterilerin lipolitik aktivitelerinin
değerlendirilmesinde kullanılan yöntem ..………………...….
34
3.4. İzole Edilen Laktik Asit Bakterilerinde Elastaz Varlığının
Araştırılması …………………………………………….…………..
34
3.5. İzole Edilen Laktik Asit Bakterilerinde -Amilaz Varlığının
Araştırılması ……………………………………………………..…..
35
3.5.1. Yöntem ……………………………………………………..…
35
3.5.2. Kullanılan besiyerleri ……………………………………..…..
35
3.6. Laktik Asit Bakterilerinin Hemolitik Aktivitelerinin Belirlenmesi….
37
3.6.1. Yöntem..………………………………………………………
37
3.6.2. Kullanılan besiyerleri...………………………………………..
37
3.7. Laktik Asit Bakterilerinin Patojen Bakteriler Üzerine İnhibitör
Etkisi………………………………………………………………....
37
3.7.1. Nutrient agar da kuyu difüzyon yöntemi………………….…..
38
3.7.2. %0,2’lik glikoz içeren nutrient agar da kuyu difüzyon
yöntemi………………………………………………………..
38
3.7.3. Kuyu difüzyon yönteminde kullanılan besiyeri………..……...
39
xi
Sayfa
3.7.4. Laktik asit bakterileri ve indikatör patojen bakterilerin
aktifleştirilmesinde kullanılan besiyerleri ………………….....
39
3.8. Laktik Asit Bakterilerinin İzolasyonunda Kullanılan Temel
Besiyerleri ……………………………………………………….…..
40
3.9. Laktik Asit Bakterilerinin İdentifikayonunda Kullanılan Besiyerleri
ve Uygulanan Testler ………………………………………………..
41
3.9.1. Gram boyama ……………………………..…………………..
41
3.9.2. Katalaz testi …………………………………………………...
42
3.9.3. Vankomisin duyarlılık testi ………………………………..….
42
3.9.4. MRS broth’da gaz testi ……………………………………….
43
3.9.5. 100C ve 450C ‘ de üreme ……………………………………...
44
3.9.6. Arginin hidrolizi ……………………………………………....
45
3.9.7. Esculin hidrolizi ………………………………………………
46
3.9.8. %6,5 NaCl’de üreme ………………………………………….
47
3.9.9. Karbonhidrat fermentasyon besiyeri ………………………….
47
4. BULGULAR ……………………………………………………………..
49
4.1. Laktik Asit Bakterilerinin Proteolitik Aktivitelerinin
Değerlendirilmesi…………………………………………………….
55
4.1.1. Proteaz enzim varlığının araştırılması ………………………..
55
4.1.2. Elastaz enzim varlığının araştırılması ………………………...
59
4.2. Laktik Asit Bakterilerinin Lipolitik ve -Amilaz Aktivitelerinin
Değerlendirilmesi …………………………………………………...
59
4.3. Laktik Asit Bakterilerinde Hemolitik Aktivitelerinin
Değerlendirilmesi…………………………………………………….
64
4.4. Laktik Asit Bakterilerinin Bazı Patojen Bakteriler Üzerine İnhibitör
Etkilerinin Değerlendirilmesi………………………………………...
65
xii
Sayfa
4.4.1. Laktik asit bakterilerinin Staphylococcus Aureus üzerine
inhibitör etkilerinin değerlendirilmesi………………………...
65
4.4.2. Laktik asit bakterilerinin Listeria monocytogenes üzerine
inhibitör etkilerinin değerlendirilmesi………………………...
71
4.4.3. Laktik asit bakterilerinin Salmonella typhimurium üzerine
inhibitör etkilerinin değerlendirilmesi ………………………..
78
4.4.4. Laktik asit bakterilerinin Klebsiella pneumoniae üzerine
inhibitör etkilerinin değerlendirilmesi …….………………….
84
4.4.5. Laktik asit bakterilerinin E. coli üzerine inhibitör etkilerinin
değerlendirilmesi……………………………………………....
90
5. TARTIŞMA-SONUÇ ……………………………………………………
102
KAYNAKLAR …………………………………………………………….
115
ÖZGEÇMİŞ ………………………………………………………………..
124
xiii
ÇİZELGELERİN LİSTESİ
Çizelge
Sayfa
Çizelge 3.1
Çiğ süt örneklerinin toplandığı illere göre dağılımı…………
22
Çizelge 3.2
Gram pozitif katalaz negatif bakterilerin cins seviyesinde
adlandırılmalarında kullanılan testler………………………..
24
Obligat homofermentatif Lactobacillus türlerinin fizyolojik
karakterleri ………………………………………………….
25
Fakültatif heterofermentatif Lactobacillus türlerinin
fizyolojik karakterleri ……………………………………….
26
Pediococcus türlerinin identifikasyonunda kullanılan
fizyolojik testler …………………………………………….
26
Leuconostoc türlerinin adlandırılmasında kullanılan
fizyolojik testler …………………………………………….
27
Streptococcus türlerinin adlandırılmasında kullanılan
biyokimyasal testler ………………………………………...
28
Çizelge 3.3.
Çizelge 3.4.
Çizelge 3.5.
Çizelge 3.6.
Çizelge 3.7.
Çizelge 3.8.
Çizelge 3.9.
Çizelge 4.1.
Laktik asit bakteri izolatlarına uygulanan biyokimyasal
testler………………………………………………………..
BBL Crystal Gram Positive ID kit ile uygulanan testlerin
tablosu……………………………………………………….
29
32
Çiğ sütten izole edilen laktik asit bakterilerinin cinslere göre
dağılımı …………………………………………………..…
49
Çizelge 4.2.
Çiğ süt örneklerinin toplandığı illerin cinslere göre dağılımı.
50
Çizelge 4.3.
Çiğ sütten izole edilen laktik asit bakterilerinin türlere göre
dağılımı………………………………………………………
51
Çizelge 4.4.
Çizelge 4.5.
Çizelge 4.6.
Proteolitik aktivitesi araştırılan Laktik asit bakterilerinin
Kalsiyum Kazeinat agarda oluşturdukları zon çaplarının
değerleri………………………………………………………
.
Proteolitik aktivite gösteren laktik bakteri izolatlarının
cinslere göre dağılımı ………………………………………..
Lipolitik aktivitesi gözlenen laktik bakteri türlerinde lipaz
aktivite zon çapları (mm)…………………………………….
55
57
60
xiv
Çizelge
Sayfa
Çizelge 4.7.
Laktik asit bakterilerinde α-amilaz enzim aktivitesi………....
61
Çizelge 4.8.
Çiğ sütten izole edilen laktik asit bakterilerinin lipoliz zon
çapları ve – Amilaz aktiviteleri………………………………
62
Hemolitik aktivite gösteren laktik asit bakterilerinin türlere
göre dağılımı………………………………………………...
64
Lactobacillus türlerinin indikatör S. aureus üzerine
oluşturdukları zon çapları…………………………………..
66
Pediococcus türlerinin indikatör S. aureus üzerine
oluşturdukları zon Çapları…………………………………...
67
Leuconostoc türlerinin indikatör S. aureus üzerine
oluşturdukları zon çapları……………………………………
68
Streptococcus türlerinin indikatör S. aureus üzerine
oluşturdukları zon çapları……………………………………
69
Enterococcus türlerinin indikatör S. aureus üzerine
oluşturdukları zon çapları……………………………………
70
Lactobacillus türlerinin indikatör L. monocytogenes üzerine
oluşturdukları zon çapları…………………………………...
71
Pediococcus türlerinin indikatör L. monocytogenes üzerine
oluşturdukları zon çapları……………………………………
73
Leuconostoc türlerinin indikatör L. monocytogenes üzerine
oluşturdukları zon çapları……..……………………………..
74
Streptococcus türlerinin indikatör L. monocytogenes üzerine
oluşturdukları zon çapları……………………………………
75
Çizelge 4.9.
Çizelge 4.10.
Çizelge 4.11.
Çizelge 4.12.
Çizelge 4.13.
Çizelge 4.14.
Çizelge 4.15.
Çizelge 4.16.
Çizelge 4.17.
Çizelge 4.18.
Çizelge 4.19.
Enterococcus türlerinin indikatör L. monocytogenes üzerine
oluşturdukları zon çapları……………………………………
Çizelge 4.20.
Lactobacillus türlerinin indikatör S. typhimurium üzerine
oluşturdukları zon çapları……………………………………
78
Pediococcus türlerinin indikatör S. typhimurium üzerine
oluşturdukları zon çapları……………………………………
80
Çizelge 4.21.
77
xv
Çizelge
Çizelge 4.22
Çizelge 4.23.
Çizelge 4.24.
Çizelge 4.25.
Çizelge 4.26.
Çizelge 4.27.
Çizelge 4.28.
Çizelge 4.29.
Çizelge 4.30.
Çizelge 4.31.
Çizelge 4.32.
Çizelge 4.33
Çizelge 4.34.
Çizelge 4.35.
Çizelge 4.36.
Sayfa
Leuconostoc türlerinin indikatör S. typhimurium üzerine
oluşturdukları zon çapları……………………………………
81
Streptococcus türlerinin indikatör S. typhimurium üzerine
oluşturdukları zon çapları……………………………………
82
Enterococcus türlerinin indikatör S. typhimurium üzerine
oluşturdukları zon çapları……………………………………
83
Lactobacillus türlerinin indikatör K. pneumoniae üzerine
oluşturdukları zon çapları……………………………………
84
Pediococcus türlerinin indikatör K. pneumoniae üzerine
oluşturdukları zon çapları……………………………………
86
Leuconostoc türlerinin indikatör K. pneumoniae üzerine
oluşturdukları zon çapları……………………………………
87
Streptococcus türlerinin indikatör K. pneumoniae üzerine
oluşturdukları zon çapları……………………………………
88
Enterococcus türlerinin indikatör K. pneumoniae üzerine
oluşturdukları zon çapları……………………………………
89
Lactobacillus türlerinin indikatör E. coli üzerine
oluşturdukları zon çapları……………………………………
90
Pediococcus türlerinin indikatör E. coli üzerine
oluşturdukları zon Çapları…………………………………...
92
Leuconostoc türlerinin indikatör E. coli üzerine
oluşturdukları zon Çapları…………………………………...
93
Streptococcus türlerinin indikatör E. coli üzerine
oluşturdukları zon Çapları…………………………………...
94
Enterococcus türlerinin indikatör E. coli üzerine
oluşturdukları zon Çapları…………………………………...
95
Lactobacillus suşlarının tüm indikatör test bakterilerine karşı
inhibitör etkisi………………………………………………..
98
Pediococcus suşlarının tüm indikatör test bakterilerine karşı
inhibitör etkisi……………………………………………….
99
xvi
Çizelge
Çizelge 4.37.
Çizelge 4.38.
Çizelge 4.39.
Sayfa
Leuconostoc suşlarının tüm indikatör test bakterilerine karşı
inhibitör etkisi……………………………………………….
99
Streptococcus suşlarının tüm indikatör test bakterilerine karşı
inhibitör etkisi………………………………………………..
101
Enterococcus suşlarının tüm indikatör test bakterilerine karşı
inhibitör etkisi………………………………………………..
101
xvii
ŞEKİLLERİN LİSTESİ
Şekil
Şekil 4.1.
Sayfa
Çiğ sütten izole edilen laktik asit bakterilerinin cinslere göre
dağılımı ……………………………………………………….
50
Şekil 4.2. Çiğ sütten izole edilen laktik asit bakterilerinin tür
sayısına göre dağılımı ...………………………………………
52
Şekil 4.3.
İzole edilen Lactobacillus türlerinin %’lik dağılımı …………
53
Şekil 4.4.
İzole edilen Pediococcus türlerinin %’lik dağılımı …………..
53
Şekil 4.5.
İzole edilen Leuconostoc türlerinin %’lik dağılımı …………..
54
Şekil 4.6.
İzole edilen Streptococcus türlerinin %’lik dağılımı …………
54
Şekil 4.7.
Proteolitik aktivite gösteren laktik bakteri izolatlarının
cinslere göre dağılımı ………………………………………...
58
Lactobacillus türlerinin nutrient agar ve %0,2 glikozlu
nutrient agarda S. aureus üzerine inhibisyon zon çaplarının
karşılaştırılması…………………………………………….....
66
Pediococcus türlerinin nutrient agar ve %0,2 glikozlu nutrient
agarda S. aureus üzerine inhibisyon zon çaplarının
karşılaştırılması………………………………………………
67
Leuconostoc türlerinin nutrient agar ve %0,2 glikozlu nutrient
agarda S. aureus üzerine inhibisyon zon çaplarının
karşılaştırılması……………………………………………….
68
Streptococcus türlerinin nutrient agar ve %0,2 glikozlu
nutrient agarda S. aureus üzerine inhibisyon zon çaplarının
karşılaştırılması……………………………………………….
69
Enterococcus türlerinin nutrient agar ve %0,2 glikozlu
nutrient agarda S. aureus üzerine inhibisyon zon çaplarının
karşılaştırılması………………………………………………
70
Lactobacillus türlerinin nutrient agar ve %0,2 glikozlu
nutrient agarda L. monocytogenes üzerine inhibisyon zon
çaplarının karşılaştırılması………………………………….
72
Şekil 4.2.
Şekil 4.8.
Şekil 4.9.
Şekil 4.10.
Şekil 4.11.
Şekil 4.12.
Şekil 4.13.
xviii
Şekil
Şekil 4.14
Şekil 4.15.
Şekil 4.16.
Şekil 4.17.
Şekil 4.18.
Şekil 4.19.
Şekil 4.20.
Şekil 4.21.
Şekil 4.22.
Şekil 4.23.
Şekil 4.24.
Sayfa
Pediococcus türlerinin nutrient agar ve %0,2 glikozlu nutrient
agarda L. monocytogenes üzerine inhibisyon zon çaplarının
karşılaştırılması……………………………………………….
73
Leuconostoc türlerinin nutrient agar ve %0,2 glikozlu nutrient
agarda L. monocytogenes üzerine inhibisyon zon çaplarının
karşılaştırılması……………………………………………….
74
Streptococcus türlerinin nutrient agar ve %0,2 glikozlu
nutrient agarda L. monocytogenes üzerine inhibisyon zon
çaplarının karşılaştırılması……………………………………
76
Enterococcus türlerinin nutrient agar ve %0,2 glikozlu
nutrient agarda L. monocytogenes üzerine inhibisyon zon
çaplarının karşılaştırılması……………………………………
77
Lactobacillus türlerinin nutrient agar ve %0,2 glikozlu
nutrient agarda S. typhimurium üzerine inhibisyon zon
çaplarının karşılaştırılması……………………………………
79
Pediococcus türlerinin nutrient agar ve %0,2 glikozlu nutrient
agarda S. typhimurium üzerine inhibisyon zon çaplarının
karşılaştırılması……………………………………………….
80
Leuconostoc türlerinin nutrient agar ve %0,2 glikozlu nutrient
agarda S. typhimurium üzerine inhibisyon zon çaplarının
karşılaştırılması……………………………………………….
81
Streptococcus türlerinin nutrient agar ve %0,2 glikozlu
nutrient agarda S. typhimurium üzerine inhibisyon zon
çaplarının karşılaştırılması……………………………………
82
Enterococcus türlerinin nutrient agar ve %0,2 glikozlu
nutrient agarda S.typhimurium üzerine inhibisyon zon
çaplarının karşılaştırılması……………………………………
83
Lactobacillus türlerinin nutrient agar ve %0,2 glikozlu
nutrient agarda K. pneumoniae üzerine inhibisyon zon
çaplarının karşılaştırılması……………………………………
85
Pediococcus türlerinin nutrient agar ve %0,2 glikozlu nutrient
agarda K. pneumoniae üzerine inhibisyon zon çaplarının
karşılaştırılması………………………………………………
86
xix
Şekil
Şekil 4.25.
Şekil 4.26.
Şekil 4.27.
Şekil 4.28.
Şekil 4.29.
Şekil 4.30.
Şekil 4.31.
Şekil 4.32.
Sayfa
Leuconostoc türlerinin nutrient agar ve %0,2 glikozlu nutrient
agarda K. pneumoniae üzerine inhibisyon zon çaplarının
karşılaştırılması……………………………………………….
87
Streptococcus türlerinin nutrient agar ve %0,2 glikozlu
nutrient agarda K. pneumoniae üzerine inhibisyon zon
çaplarının karşılaştırılması……………………………………
88
Enterococcus türlerinin nutrient agar ve %0,2 glikozlu
nutrient agarda K. pneumoniae üzerine inhibisyon zon
çaplarının karşılaştırılması……………………………………
89
Lactobacillus türlerinin nutrient agar ve %0,2 glikozlu
nutrient agarda E. coli üzerine inhibisyon zon çaplarının
karşılaştırılması……………………………………………….
91
Pediococcus türlerinin nutrient agar ve %0,2 glikozlu nutrient
agarda E.coli üzerine inhibisyon zon çaplarının
karşılaştırılması……………………………………………….
92
Leuconostoc türlerinin nutrient agar ve %0,2 glikozlu nutrient
agarda E.coli üzerine inhibisyon zon çaplarının
karşılaştırılması……………………………………………….
93
Streptococcus türlerinin nutrient agar ve %0,2 glikozlu
nutrient agarda E.coli üzerine inhibisyon zon çaplarının
karşılaştırılması……………………………………………….
94
Enterococcus türlerinin nutrient agar ve %0,2 glikozlu
nutrient agarda E. coli üzerine inhibisyon zon çaplarının
karşılaştırılması……………………………………………….
95
xx
RESİMLERİN LİSTESİ
Resim
Sayfa
Resim 2.1.
Laktik bakteri cinslerinin morfolojik görüntüleri……………
13
Resim 3.1.
MRS broth’da gaz testi………………………………………
44
Resim 3.2.
Arginin hidrolizi……………………………………………..
45
Resim 3.3.
Esculin hidrolizi……………………………………………..
46
Resim3.4.
Karbonhidrat hidrolizi……………………………………….
48
Resim 4.1.
Calsium caseinate agarda proteolitik zon çapları……………
58
Resim 4.2.
Elastinli nutrient agar da elastaz enzimi varlığı……………..
59
Resim 4.3.
Luria Bertani-nişasta agar da -Amilaz enzim varlığı………..
61
Resim 4.4.
Kanlı agarda laktik asit bakterilerinin hemolitik aktivitesi….
64
1
1. GİRİŞ
Süt mikroflorasının doğal üyeleri olan laktik asit bakterileri; fermente süt ürünlerinin
elde edilmesinde, olgunlaşmasında, tat ve aroma oluşumunda görev alırlar. Ayrıca bu
ürünlerin üretim aşamasında starter suş kullanımı büyük önem taşımaktadır. Starter
suşların büyük bir kısmı laktik asit bakteri grubunda yer alan, özellikleri belirlenmiş
mikroorganizmalardır. Laktik bakteriler fermente ürün teknolojisinde kullanıldığında
proteaz, lipaz, elastaz, -amilaz gibi enzim aktivitelerinin varlığı önem taşımaktadır.
Ayrıca aroma oluşumunda bu özellikleri olan bakteriler tercihen ürüne ilave
edilmektedir. Proteaz enzim aktivitesinin varlığı süt proteinlerini etkileyen önemli bir
enzim aktivitesidir. Fermente ürün elde edilmesinde bu enzimi salgılayan bakteriler
gereklidir.
Bu nedenle araştırmada çiğ süt örneklerinden laktik asit bakterilerinin izolasyonu
yapılmıştır. Morfolojik, fizyolojik ve biyokimyasal özelliklerine göre çeşitli testlerle
tür bazında adlandırılmıştır. Özellikle süt endüstrisinde fermente ürünlerin
oluşumunda, aroma ve tekstürün oluşumunda önemli bir yeri olan enzim
aktivitelerinin, izole edilen bakterilerde varlığının araştırılması amaçlanmıştır.
Protez, lipaz, elastaz ve -amilaz enzimleri gıda fermentasyonunda, özellikle süt
ürünlerinin fermentasyonunda aktivite gösterirler. Fermente süt ürünlerinde
olgunlaşma, renk, koku ve lezzetin oluşumu laktik bakterilerin salgıladıkları bu
enzimler sayesinde gerçekleşir. Süt mikroflorasının önemli üyeleri olan laktik
bakterileri ( lactobacillus, pediococcus, leuconostoc ve streptococcus) izole edilerek,
adlandırılan türlerin enzimatik özellikleri belirlenmiştir.
Ayrıca laktik bakteriler metabolizmaları sonucu organik asit, hidrojen peroksit,
bakteriosin gibi ürünler salgılamaktadır. Ürettikleri bu ürünler laktik asit
bakterilerine inhibe edici özellik kazandırmaktadır. Bu özellik ile birçok patojen
bakteri üzerinde inhibitör etki göstermektedirler. Bu amaçla çiğ sütten izole edilip
adlandırılan laktik bakterilerin patojen özellikteki Staphylococcus aureus, Listeria
monocytogenes, Salmonella typhimurium, Klebsiella pneumoniae ve E.coli
2
bakterilerine karşı inhibitör etkisi araştırılmıştır. Gıda patojeni olan bu bakteriler süt
ve süt ürünlerinde bozulmalara, koku ve lezzet değişimlerine neden olmaktadırlar.
Ayrıca süt ürünlerinden, bu patojenlerin insanlara kontaminasyonu sonucu çeşitli
enfeksiyonlar
oluşmaktadır
ve
bazı
enfeksiyonlar
ciddi
sonuçlara
neden
olmaktadırlar. Laktik asit bakterilerinin fermentasyonu sonucu ortamda bulunan
karbonhidratların miktarı azalır ve antimikrobiyal aktiviteye sahip organik
moleküller ( laktik, asetik, formik, propiyonik asit) ve antimikrobiyal bileşikler (
hidrojen peroksit, diasetil ve bakteriyosin) oluşur. Oluşan bu organik moleküller ve
antimikrobiyal bileşikler ile laktik bakteriler gıda patojeni bakteriler üzerinde
inhibitör etki oluştururlar. Araştırmada laktik bakterilerin, Staphylococcus aureus,
Listeria monocytogenes, Salmonella typhimurium Klebsiella pneumoniae ve E.coli
üzerinde inhibitör etkileri belirlenmiştir.
3
2. LİTERATÜR ARAŞTIRMASI
Laktik asit bakterileri (LAB) endüstriyel açıdan önemli mikroorganizmalar olup,
endüstriyel gıda fermantasyonlarında çeşitli şekillerde kullanılmaktadırlar. Laktik
asit bakterileri özellikle süt ürünlerinin üretiminde starter kültür olarak kullanılan
bakterilerdir.
Starter kültür; belirli sayıda canlı mikroorganizmaların tek veya kombine
kültürlerinin taze, donmuş veya liyofilize formlarını içeren, fermente gıda ürünlerinin
imalatında kullanılan ve enzimatik özellikleri sayesinde, fermentasyon olaylarını
hızlandıran ve arzu edilen nitelikte ürünlerin elde edilmesine olanak sağlayan
mikroorganizmalardır [1].
Süt ve süt ürünlerinde fermente ürünlerde Laktik Asit Bakterilerinin starter kültür
özellikleri büyük önem taşır. Laktik Asit Bakterileri gıdalarda starter kültür olarak
kullanıldıklarında fermente ürünlerin tat, doku, besleyici değer gibi bazı ürün
karakteristiklerine de katkıda bulunmaktadırlar [2, 3]. Bu enzimatik karakterle
oluşmaktadır. Yani Süt ürünlerinde starter kültürlerin kullanılmalarında temel amaç
kendine özgü özellikler taşıyan ürünün elde edilmesidir [4, 5, 6, 7, 8].
Adıgüzel 2001 yılında çiğ sütten izole ettiği laktik asit bakterilerinin inhibitör
etkilerini incelediği bir çalışmasında, 110 çiğ süt örneğinden 249 laktik asit bakterisi
izole etmiştir. 144 S. faecalis, 14 S. durans, 22 S. lactis, 4 S. cremoris, 5 P. urinequi,
12 P. pentosaceus, 10 P. halophilus, 4 P. damnosus, 6 L. dextrinicus, 2 L.
pseudomesenteroides, 1 L. lactis ve 1 L. cremoris izole etmiştir [9].
2002 yılında Çetin’in yapmış olduğu araştırmada, 10 çiğ süt örneğinden 27 izolat
laktik asit bakterisi izole etmiştir. Bu 27 izolatın 5’i Lactococcus lactis ssp. lactis,
11’i Enterococcus ssp., 1’i Lactococcus raffinolactis ve 1’İ Lactococcus lactis ssp.
cremoris olarak tespit edilmiştir [10].
4
Akkuzu (2004), pastörize süt ve pastörize sütlerden hazırlanmış 60 kefir örneğinden
laktik asit bakterilerini izole etmiştir. İzole edilen bakteriler; 3 Pediococcus
acidilactici, 1 Lactobacillus helveticus, 1 Leuconostc lactis, 1 Leuconostoc cremoris,
22 Enterococcus faecalis, 5 Enterococcus faecium, 10 Enterococcus durans, 1
Enterococcus hirae, 4 Enterococcus dispar, 41 Streptococcus lactis, 3 Streptococcus
raffinolactis, 1 Streptococcus thermophilus ve 1 Streptococcus acidominimus olarak
belirlemiştir [11].
Yüksekdağ’ın 2005 yılında kefirden izole ettiği laktik asit bakterilerileriyle yaptığı
bir çalışmada, 21 Lactobacillus izole etmiştir. 1 Lb. acidophilus, 2 Lb. helveticus, 4
Lb. casei, 3 Lb. bulgaricus, 6 Lb. lactis, 3 Lb. plantarum ve 2 Lb. brevis’dir. İzole
ettiği 21 Streptococcus izolatı ise 4 S. lactis, 3 S. thermophilus, 3 S. durans ve 11 S.
cremoris’dir. Bu izolatların proteolitik aktivitelerine bakıldığında, maximum
proteolitik aktivite Lb. acidophilus türünde gözlenirken minimum aktivite Lb.
plantarum türünde gözlemlenmiştir [12].
Arslan ve Uraz’ın 2005 yılında yaptıkları bir çalışmada, 50 çiğ süt örneğinden 32
laktik asit bakteri izolasyonu yapılmıştır. Adlandırılan 32 bakterinin 14’ü
Lactobacillus, 9’u Pediococcus, 4’ü Leuconostoc ve 5’ini Streptococcus olarak tespit
etmişlerdir [13].
Coşkun’un 2006 yılında yaptığı çalışmasında, hem çiğ sütteki hem de çiğ sütten
üretilen 6 grup beyaz peynirlerdeki laktik asit bakterilerinin izolasyonu ve
identifikasyonu yapılmıştır. Çiğ sütten toplam 10 bakteri izole edilmiştir. 1
Pediococcus pentosaceus, 3 Streptococcus lactis, 1 Enterococcus hirae ve 5
Enterococcus faecalis adlandırılmıştır. 6 grup beyaz peynirde ise 90 gün olgunlaşma
süresinde toplam 144 laktik bakteri izole edilip adlandırılmıştır. 61 Lactococcus
lactis ssp. lactis, 23 E. faecalis, 11 Lb. plantarum, 9 Lb. paracasei ssp. paracasei, 4
S. avium, 7 E. hirae, 6 P. pentosaceus, 6 S. casseliflavus ve 13 E. faecium’dur [14].
2009 yılında Tatlı’nın yaptığı bir çalışmada; 50 geleneksel süt ürününden 72 adet
laktik asit bakterisi izole edilmiştir. Bu izolatların cinslere göre dağılımı; 46
5
Lactobacillus ssp. %64, 15 Bifidobacterium ssp. %21, 10 Streptococcus ssp. %14 ve
1 Enterococcus ssp. %1 olarak belirlenmiştir [15].
Gheytanchi ve arkadaşlarının 2010 yılında yapmış olduğu bir çalışmada; 50 süt ve
peynir örneğinden 41 Lactobacillus izole etmişlerdir. Bunlardan 3 Lb. acidophilus, 6
Lb. casei subsp. casei, 7 Lb. casei subsp. rhamnosus, 3 Lb. delbrueckii subsp. lactis,
ve 7 Lb. plantarum izole edilip adlandırılmıştır [16].
Karakuş
ve
arkadaşlarının
(1992),
yaptığı
bir
çalışmada,
olgunlaşmanın
başlangıcında peynir florasında L. lactis ssp. lactis baskın tür iken, E. faecalis ve
E.faecium bakterilerinin ikinci en önemli tür olduğunu tespit etmişlerdir. Peynir
olgunlaşmasında proteolitik ve lipolitik aktivitelerinin önemini vurgulamışlardır [17].
Uraz ve Gündoğan (1998), 10 haftalık olgunlaşma periyodu boyunca Beyaz peynir
florasında Bacillus, Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus, S. aureus ve koliform
grubu bakteri tespit ettiklerini ve Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus ve
Streptococcus cinsi bakterilerin olgunlaşma boyunca dominant mikroorganizmalar
olduğunu ve diğer bakteri türlerinden daha yüksek sayıda bulunduklarını
bildirmişlerdir [18].
Gürsoy ve ark. (2001) az yağlı Beyaz peynir üretiminde, olgunlaşmayı hızlandırmak
amacıyla ısıl işlem uygulanmış (65 °C’ de 20 dak.) starter kültür (Lb. helveticus veya
Lb. delbrueckii ssp. bulgaricus; 0.5 g/100g) başarıyla kullanılabileceklerini
bildirmişlerdir. Olgunlaşmanın 30. gününde proteoliz düzeyinin arzu edilen
seviyelere yükseldiğini ve Lb. helveticus kullanımının daha iyi sonuç verdiğini tespit
etmişlerdir [19].
Gürsel ve arkadaşları (2003), az yağlı Beyaz peynir üretiminde, olgunlaşmayı
hızlandırmak süretiyle tekstür, tad ve aromayı iyileştirmek amacıyla, -20º C’de 8 gün
süre ile muhafaza edilen Lb. helveticus ve Lb. delbrueckii ssp. bulgaricus
bakterilerini yardımcı kültür olarak kullanmışlardır. Yardımcı kültür kullanımının
peynirlerin genel bileşimini etkilemediğini, ancak olgunlaşmayı hızlandırdığını ve
6
özellikle Lb. helveticus’un az yağlı Beyaz peynir üretiminde herhangi bir
olumsuzluğa yol açmadığını bildirmişlerdir [20].
Topisirovic ve arkadaşları (2009), fermente ürünlerden elde ettikleri 26 enterokok
türünün proteolitik ve antimikrobiyel özellikleri üzerine yaptıkları çalışlmada (37) ßkazein’e karşı 25 enterokok türünün güçlü veya orta derecede proteolitik aktivite
gösterdiğini saptamışlardır [21].
Enterococcus faecalis, E. faecium ve bunların ortak kullanımıyla hazırlanmış
peynirlerde lipolize olan katkıları incelendiği bir araştırmada (Rasouli Pirouzan ve
arkadaşları 2010), olgunlaşma süresince lipoliz indeksinin önemli ölçüde kontrol
grubuna nazaran daha yüksek olduğu saptanmıştır. Bu peynirlerde serbest yağ asiti
miktarının daha fazla olduğu bildirilmiştir. Bu sonuç ilave enterokokların peynirde
lipolize katkıda bulunduğunu göstermektedir [22].
2010 yılında Yıldırım’ın yaptığı çalışmada; dört farklı Lactococcus lactis ssp. lactis
suşu kullanılarak üretilen beyaz peynirde, 90 gün boyunca proteoliz ve lipoliz
düzeyleri ile L. monocytogenes’in kalıcılığı incelenmiştir. Beyaz peynirde proteoliz
ve lipoliz düzeyinin suştan suşa bağlı olduğunu göstermiştir. L. lactis ssp. lactis
LL23 suşu ie yapılan peynirde kazein fraksiyonlarının proteoliz düzeyi daha yüksek
bulunurken, L. lactis ssp. lactis LL27 suşu ile yapılan peynirde serbest yağ asitleri
düzeyi çok daha yüksek saptanmıştır. 90 günlük depolama sonunda sadece LL27
suşunun Listeria monocytogenes’in gelişimini inhibe ettiği belirlenmiştir [23].
2.1. Laktik Asit Bakterilerinde Proteolitik Aktivite
Proteolitik aktivite, mikroorganizmalarca salgılanan proteolitik enzimler ile
proteinlerin hidrolize edilmesidir. Proteolitik aktivite, hem starter kültürlerin asit
oluşturma fonksiyonu hem de fermente ürünün özellikleri açısından önemlidir.
Süt proteinleri 20 aminoasitin karmaşık bir şekilde bağlanmasıyla meydana gelirler.
Vücut tarafından sentezlenemeyen tüm aminoasitleri içerirler. Bu fizyolojik ve
7
beslenme özellikleri yanı sıra süt teknolojisi bakımından da önemli özelliklere
sahiptir. Çünkü süt proteinleri süt ürünlerinin ya ana maddesidir veya önemli
bileşenlerindendir [24,25].
Proteoliz olayı özellikle sütün ana protein yapısı kazeinin polipeptid ve
oligopeptidler üzerinden serbest aminoasitlere kadar proteinlerin parçalanma olayıdır
[24,26,27].
Laktik bakterilere ait proteolitik enzimlerden proteaz enzimi, Streptococcus salivarus
ssp. thermophilus’un dışında tüm türlerde ortaya konulmuştur. Fakat sayıları ve
etkinlikleri oldukça farklılık göstermektedir [24].
Çeşitli çalışmalarda yoğurdun, Lb. bulgaricus ile S. thermophilus bakterilerinin
simbiyotik yaşamaları sonucu oluştuğu ortaya çıkarılmıştır [28,29].
Yoğurt ile yoğurt sütü karşılaştırıldığında da yoğurtta, proteolitik aktivitenin, yoğurt
bakterilerinin etkinliğiyle daha yüksek oluştuğu Tamime ve Deeth (1980) tarafından
tespit edilmiştir [30].
Laktik bakteriler diğer mikroorganizmalarla karşılaştırıldığında zayıf bir proteolitik
aktiviteye sahip olmasına karşın peynirin olgunlaşmasında önemli rol oynayan birçok
sayıda proteolitik sistemi yapılarında barındırmalarından ötürü olgunlaşmada önemli
mikroorganizmalardır [31].
Özellikle Streptococcus thermophilus, Lactococcus lactis, Lactobacillus helveticus
ve Lactobacillus delbrueckii subsp. bulgaricus adı geçen özelliklerinden ötürü süt
ürünü starteri olarak kullanılır ve büyük bir ekonomik öneme sahiptirler [32].
Proteolitik aktiviteye sahip bakterilerin etkinliğiyle; bakterilerin esansiyel azot ve
sülfür bağlarının karşılanmasıyla hem gelişmeleri teşvik edilir hem de glikoliz olayı
hızlanır, protein parçalanma ürünleriyle diğer bakterilerin metabolik gereksinimleri
karşılanır ve tipik aroma maddelerinin, tat bileşenlerinin oluşumu sağlanır [18,33].
8
Yapılan araştırmalarda, laktik asit bakterilerinde, laktik asit üretimi ve proteolitik
aktivitenin cins, tür ve suşlar arasında farklılık gösterdiği belirlenmiştir [34, 35].
Tekinşen ve Atasever (1994), Lb. bulgaricus türünün yüksek proteolitik aktivite
gösterdiğini belirtmişlerdir [36].
Perez ve arkadaşları (2003) tarafından yapılan bir çalışma sonucunda, çeşitli suşlar
arasında Lactococcus cinsinin Lactobacillus cinsine oranla daha yüksek proteolitik
aktivite gösterdiğini tespit etmişlerdir [37].
Herros ve ark. (2003), değişik inkübasyon sürelerinde lactobacillus cinsinin ve
enterococcus cinsinin yüksek proteolitik aktivite gösterdiğini tespit etmişlerdir [38].
2.2. Laktik Asit Bakterilerinde Lipolitik Aktivite
Süt içinde bulunan en önemli bileşenlerden birisi de süt lipitleridir. Süt yağı, lipaz
enziminin etkinliği ile yağ asidi ve gliserine parçalanır. Lipaz süte özgü, doğal ve
mikrobiyal kaynaklı olabilir.
Yıllarca laktik asit bakterilerinin lipaz aktivitesi olmadığı varsayılmıştır. Genetik
bilimindeki ilerlemelere bağlı olarak laktik asit bakterilerinin (LAB) genetiği üzerine
yapılan çalışmalar, spesifik bakteriyel enzimlerin fermente ürün oluşumundaki rolünü
açıklamaya imkan tanımıştır. Laktik asit bakterileri starter veya ilave kültür olarak süt
ürünlerinin fermentasyonunda kullanılır [39].
Süt endüstrisinde laktik asit bakterilerinin proteoliz ve lipoliz aktiviteleriyle, fermente
ürünlerde tekstür, aroma ve lezzet oluşumu sağlanır [37].
Laktik asit bakterilerinin lipaz aktivitesi tür ve cinslere göre farklılık gösterir.
Leuconostoc mesenteroides ssp. dextranicum en yüksek lipolitik aktiviteye sahip olurken
yoğurt kültürünü oluşturan (Lb. bulgaricus ile S. thermophilus) her iki türün lipolitik
aktivitesi oldukça sınırlıdır.
9
Süt trigliseridlerinin enzimatik hidrolizi (lipoliz) yüksek konsantrasyonlarda kısa ve orta
zincirli yağ asitlerini açığa çıkarır. Lipoliz, birçok peynirde, lezzet gelişimi için
gereklidir [40].
Sütte ve süt ürünlerinin birçoğunda serbest yağ asitlerinin oluşumu arzu edilmediği
halde, karakteristik peynir aromasını meydana getirdiklerinden bazı peynir çeşitlerinde
bu asitlerin oluşumu arzu edilir.
Collins ve ark. (2003) starter laktik asit bakterilerinin otolizi ile Cheddar peynirinin
olgunlaşması sırasında serbest yağ asitlerinin (SYA) artan birikimi arasında bir ilişki
gözlemlemişlerdir ve bunun peynirde intrasellüler lipolitik aktivitenin artan oranına bağlı
olabileceğini ifade etmişlerdir [41].
Laktik bakterilerin lipaz ve esterazının pastörize sütten yapılmış Cheddar ve Hollandatip peynirlerde başlıca lipolitik aktivitiye sahip ajan oldukları görülmüştür. Bu varsayım
kültür kullanılmadan üretilen peynirlerde, starter kültür kullanılanlara nazaran daha
düşük düzeyde serbest yağ asitlerinin bulunması ile açıklanmaktadır [42,43].
Enterococcus faecalis, E. faecium ve bunların ortak kullanımıyla hazırlanmış
peynirlerde lipolize olan katkıları incelendiği bir araştırmada, olgunlaşma süresince
lipoliz indeksinin önemli ölçüde kontrol grubuna nazaran daha yüksek olduğu
saptanmıştır. Bu peynirlerde serbest yağ asiti miktarının daha fazla olduğu
bildirilmiştir. Bu sonuç ilave enterokokların peynirde lipolize katkıda bulunduğunu
göstermektedir [22].
2.3. Laktik Asit Bakterilerinde α-Amilaz Enzimi
Bir karbohidraz olan alfa-amilaz enzimi ticari olarak kullanılan ilk enzimdir. Alfa-amilaz
enzimi, ham ve çözünür nişasta molekülündeki alfa-1,4 glikozidik bağlarını parçalayarak
glikoz, maltoz, maltotrioz ve alfa-limit dekstrinlerin oluşumunu katalize eden yaygın bir
grup enzimdir. Nişasta, çok sayıda glikoz molekülünün farklı şekillerde bağlanmasıyla
oluşmuş polisakkarit özellikte bir bileşiktir [44]. Bazı bakteriler ve mantarlar tarafından
10
üretilen alfa-amilaz, beta-amilaz, glikoamilaz ve glikoizomeraz gibi enzimler nişastayı
parçalama yeteneğine sahiptirler. Bu enzim günümüzde tekstil ve kağıt endüstrisinde,
nişastanın sıvılaştırılmasında, ekmek, glikoz ve fruktoz şurupları ve tutkal üretiminde,
alkol fermantasyonunda kullanılmaktadırlar [4]. Endüstriyel olarak üretilen ilk enzim
1894 yılında tedavi amaçlı kullanılan amilazdır. Şu an Bacillus, Aspergillus ve Rhizopus
türleri en önemli endüstriyel amilaz kaynakları olarak bilinmektedir. Bununla birlikte
son yıllarda mikrobiyal kaynaklı amilazlar da araştırılmaktadır. Laktik asit bakterilerinde
alfa amilaz enziminin varlığıyla ilgili bazı çalışmalar yapılmıştır. Laktik asit bakterileri
cins seviyesinde incelendiğinde özellikle Lactobacillus cinsinde bu enzimin varlığı tespit
edilmiştir [29].
Rodriguez-Sanoja ve arkadaşlarının 2005 yılında yapmış olduğu bir çalışmada,
Lactobacillus plantarum ve Lactobacillus amylovorus’un alfa amilaz enzim üretimleri
karşılaştırılmış. Her iki bakterinin -amilaz enzim kapasitesi, iyot-boyama gücü ve
nişastadan indirgeyici şekerlerin üretiminde azalma ölçülerek çözünür patates nişastası
üzerinde incelenmiştir. Lb. amylovorus ‘un alfa amilaz enziminin Lb. plantarum’a göre
10 kat daha fazla nişasta hidrolize ettiğini tespit etmişlerdir. Benzer şekilde, Lb.
amylovorus α-amilaz enzimi 10 kat daha fazla şeker azalttığını rapor etmişlerdir [45].
2.4. Laktik Asit Bakterilerinde Elastaz Enzimi
Elastaz
proteolitik
bir
enzimdir
ve
yapay tatlandırıcı
aspartamın
(
N-
benziloksikarbonil-L-aspartil fenilalanin metilesteri) sentezi için kullanılan bir
enzimdir. Metalloproteinazlardan olan elastaz, elastin ve diğer proteinlerin daha basit
moleküllere ayrılmasını katalize eden, genellikle aminoasitlerin karbonil gruplarının
bulunduğu bağlardaki polipeptit zincirini kıran, serin endopeptidazların bir grubudur.
Bu enzim birçok bakteriye virülans özellik kazandırmaktadır. Laktik asit
bakterilerinde elastaz enzimiyle ilgili araştırmalara rastlanmamıştır. Araştırmamızda
izole edip adlandırdığımız laktik asit bakterilerinde de elastaz enziminin varlığı
saptanmamıştır.
11
2.5. Laktik Asit Bakterilerinde Hemolitik Aktivite
Laktik asit bakterilerinde hemolitik aktivitenin belirlenmesi önemli bir kriterdir. Gıda
endüstrisinde starter kültür olarak kullanım potansiyeli olan miroorganizmaların,
hemolize neden olmayan -hemolitik suşlar olması gerekmektedir [46, 47]. Laktik
bakterilerinde hemolitik aktivite genellikle streptococcaceae familyasına ait
Streptococcus
ve
Lactococcus
cinsi
ve
Enterococcus
cinsi
bakterilerde
görülebilmektedir [24]. Hemolitik aktivite 3 şekilde gerçekleşmektedir. Kanlı agar
ortamında üretildiklerinde koloni etrafında şeffaf zon oluşturanlar -hemolitik,
koloni çevresinde tam olmayan, yeşilimsi bir hemoliz yapanlar -hemolitik ve
hemoliz yapmayan bakteriler -hemolitiktir.
2008 yılında Anas ve arkadaşlarının yaptığı bir çalışmada, Cezayirde çiğ keçi
sütünden
izole
edilen
64
Lactobacillus
suşunun
hemolitik
aktivitelerini
incelemişlerdir. Lactobacillus suşlarında hemolitik aktivitenin olmadığı rapor
etmişlerdir. Hemolitik aktivite yokluğu süt için kullanılan starter kültür seçiminde bir
kriter oluşturmaktadır [48].
2.6. Laktik Asit Bakterilerinin Sınıflandırılması
Mikrobiyoloji bilim dalının doğuşu ile birlikte, gıda endüstrisinde ekonomik öneme sahip
olarak bilinen laktik asit bakterileri ile ilgili çalışmalar da başlamıştır. İlk kez 19. yüzyıl
sonlarında süt ve süt ürünlerinde fermantasyona yol açan bakteriler; laktik asit bakterileri
olarak isimlendirilmiş ve daha sonraki yıllarda Lactobacillaceae familyası içinde
sınıflandırılmışlardır.
Beijerinck (1901), laktik asit bakterilerini Lactobacillales takımında incelemiştir.
Lactobacillales takımı 16S rRNA sekans birimleri temel alındığında filogenetik analizleri
sınırlı olmakla beraber, bu takım içinde Lactobacillaceae familyası ve yakın akrabaları
Aerococcaceae,
Carnobacteriaceae,
Enterococcaceae,
Streptococcaceae familyaları bulunmaktadır [49].
Leuconostocaceae
ve
12
Axelsson’un 1993’de yapmış olduğu sınıflandırmaya göre; laktik asit bakterileri grubuna
dahil birçok cins olduğu saptanmıştır. Genel olarak laktik asit bakterileri; Lactobacillus,
Pediococcus, Streptococcus ve Leuconostoc cinslerini içermektedir. Son yıllarda yapılan
genetik çalışmalar sonucunda ise Lactococcus, Carnobacterium, Enterococcus, Weissella ve
Vagococcus cinsleri de laktik asit bakterileri içinde yer almaktadır [16, 50, 53,54].
2.7. Laktik Asit Bakterilerinin Fizyolojik ve Biyokimyasal Özellikleri
Laktik bakteriler morfolojik açıdan değişken özellikler gösterirken fizyolojik açıdan benzer
özellikler göstermektedirler. Tüm üyeler; Gram pozitif, katalaz negatif, Sporolactobacillus
inulinus hariç spor oluşturmayan, fakültatif anaerobik, Pediococcus cinsi hariç yalnız tek
düzlemde bölünen ve bazı istisnalar hariç hareketsiz olan bakterilerdir. Gram- pozitif
bakteriler içerisinde guanin-sitozin (G+C) oranı en düşük olan bakterilerdir [16, 24, 51].
Glikozu katabolize ederek ana ürün olarak laktik asit oluşturmalarıyla karakterize edilirler.
Sütü asitleştirme yeteneğindedirler. Değişik sıcaklıklarda gelişebilirler. Oksijene ve farklı
NaCl konsantrasyonlarına karşı toleranslıdırlar. Arjininden amonyak oluşturabilme ve
eskülini hidrolize edebilme yeteneğine sahiptirler. Safra tuzlarına ve pH nın farklı
değerlerine karşı direnç gösterebilirler.
2.8. Laktik Asit Bakterilerinin Morfolojik Özellikleri
Laktik bakterilerin morfolojik özellikleri cins ve türlerine göre farklılıklar
göstermekle birlikte genel olarak kok, düzgün çubuk ve düzensiz çubuk olmak üzere
üç farklı formda görünümleri vardır (Resim 2.1) [24, 51, 52].
Streptokok, laktokok ve enterokok cinsi ikili veya zincir şeklinde sıralanmış ovoid
hücrelerden oluşurken, lökonostok cinsi ikili zincir şeklinde sıralanmış mercimek
formunda hücrelerden oluşmaktadır. Pediokok cinsinde ise tetrat şeklinde dizilmiş
yuvarlak hücre formu tipiktir.
Laktobasil cinsinde bulunan türler ise; tekli, ikili veya uzun zincir formunda düzgün
çubuk şeklindeki hücrelerden oluşmaktadır [24].
13
Lactobacillus sp
Leuconostoc sp
Pediococcus sp
Streptococcus sp
Resim 2.1. Laktik bakteri cinslerinin morfolojik görüntüleri
2.9. Laktik Asit Bakterileri Nerede Bulunur
Laktik asit bakterilerinin doğal bulunma ortamları genellikle besin içeriği
bakımından
zengin
olan
ortamlardır.
Örneğin
süt
ve
süt
ürünlerinde
bulunmaktadırlar. Sütün doğal florasını oluşturdukları için süt asidi bakterileri de
denilmektedir. Bazı üyeleri insan organizmasında, ağız florasında bulunup, intestinal
ve ürogenital sistemin mikroflorasını da oluşturmaktadır [53, 55].
Lactobacillus genusu:
Çubuk şeklinde olan bu bakteriler, düzgün çubuk, kokobasil veya uzun zincir
oluşturan çubuk şeklinde bulunabilirler. Çok az tür veya suşun dışında
hareketsizdirler. Katalaz enzimi üretmezler. Spor oluşturmazlar anaerob veya
mikroaerofildirler. Lactobacillus genusu türleri doğada oldukça fazla yaygındır.
Silajda, hayvan ve insan bağırsağında bulunurlar. Normal süt florasında yer alırlar.
14
Çiğ sütlerde bu genusa ait birçok bakteriyi belirlemek mümkündür. Süt asidi miktarı
%1-3 arasında değişir. Patojen özellik göstermezler. Aksine oluşturdukları
antibakteriyel özellikteki maddeler sayesinde saprofit ve patojen bakterilerin
gelişmelerini engellerler. Proteinleri parçalama özellikleri tür ve suşlara göre
değişiklik gösterir. Hücrenin iç kısmındaki hücre çeperi ve peptidaz aktivitesiyle
bağdaştırılan proteolitik aktivite, hücre çeperinin yüzeyindeki enzimlerin büyük
moleküllü proteinleri hidrolize ederek hücrenin içine taşıyabilecek derecede küçük
peptidlerin oluşumunu sağlamasıyla gerçekleşir. Hücre içi peptidazlar peptidleri
aminoasitlere kadar parçalar ve mikroorganizmanın gelişmesinde kullanılabilir şekle
sokar. Lactobacilluslar bu özellikleri nedeniyle yoğurt ve benzeri ürünlerin
yapımında ve sert peynirlerin olgunlaştırılmasında kültür olarak kullanılırlar. Bu
bakteriler süt ürünlerinde tat ve aroma oluşumunda önemli rol oynarlar [24, 56].
Laktik asit bakterileri, glukozu homofermentatif ve heterofermentatif yolla
katabolize etmelerine göre ikiye ayrılırlar.
Homofermentatif laktik asit bakterileri glukozu fruktozdifosfat yolu ile parçalayarak
sonuçta %90 oranında laktik asit oluştururlar.
Heterofermentatif laktik asit bakterileri ise glukozu hegzosmonofosfat yolu ile
parçalayarak laktik asit yanında etanol, asetik asit ve CO2 gibi yan ürünler meydana
getirirler [24].
Heterofermentatif
laktik
asit
bakterileri
Fruktozdifosfat
yolunun
önemli
enzimlerinden aldolaz ve trioz-fosfat izomeraz enzimine sahip olmadıkları için
Fruktozdifosfat yolunu kullanamamaktadır [24, 57].
Homofermetatif türler:
Lactobacillus acidophilus, Lactobacillus helveticus, Lactobacillus delbrueckii ile
bunun iki alt türü olan Lactobacillus delbruecki ssp. bulgaricus ve Lactobacillus
delbrueckii ssp. lactis’ tir. Bu bakteriler pentoz ve glukonatları fermente edemezler
ve glukozdan gaz oluşturamazlar.
15
Heterofermentatif türler:
Lactobacillus acetotolerans, Lactobacillus casei, Lactobacillus maltaromicus,
Lactobacillus plantarum, Lactobacilus rhamnosus, Lactobacillus coryniformis ssp.
torquens ve Lactobacillus sake örnek verilebilir. Bu bakteriler fermentasyon
sonucunda laktik asit, asetik asit ve CO2 üretebilirler.
Pediococcus genusu
Pediococcus cinsi bakteriler iki veya dörtlü kok şeklindedir, tekli hücre veye zincir
oluşturmaları
nadirdir.
Hareketsizdirler
ve
endospor
oluşturmazlar.
Kemoorganotrofturlar. Fermentasyon homolaktik olup DL-laktik asit üretirler.
Mikroaerofilik olup, yüzeyde gelişmeleri zayıftır. Bazı non-hem katalaz aktivitesine
sahip olmalarına rağmen genel olarak katalaz (-)’tirler. Glukoz, früktoz ve
mannozdan asit oluşturup gaz oluşturmazlar. Saprofitler özellikle bozulmuş birada ve
süt ürünlerinde bulunurlar [24, 57].
Leuconostoc genusu
Leuconostoc cinsi bakteriler yuvarlak veya çoğunlukla mercimek tanesi şeklinde
olup ikili veya zincir şeklinde bulunurlar. Hareketsizdirler ve spor oluşturmazlar.
Katalaz negatif olan genusun bazı türleri hem varlığında ve diğer H2O2 aktivite
varlığında, gelişme sırasında H2O2’i parçalayabilirler. Sitokrom sistemleri yoktur.
Arginin’i hidrolize etmezler. Sütü çok seyrek olarak asitleştirir ve pıhtılaştırırlar.
Proteolitik değillerdir. Fakültatif anaerobturlar. Patojen özellik göstermezler. Ayrıca
Leuconostoc mesenteroides ssp. dextranicum türü laktik asit bakterileri içerisinde en
yüksek lipolitik aktiviteyi gösteren bakteridir [24, 57].
Streptococcus genusu
Streptococcus cinsi bakteri hücreleri yuvarlaktan ovale kadar değişen şekilde olup
ikili veya zincir şeklinde bulunurlar. Hareketsizdirler. Ancak ara sıra hareketli suşları
mevcuttur.
Kemoorganotrof
yapıdadırlar.
Karbonhidratlardan
fermentatif
metabolizmaları sonucu laktik, asetik, formik asit ile alkol, karbonhidrattan ise CO2
oluştururlar. Besin gereksinimleri kompleks ve değişkendir. Katalaz testi genellikle
negatif olup değişken sonuç vermektedir. Fakültatif anaerobdurlar. O2 veya diğer H
16
akseptörleri karbonhidrat metabolizmasının son ürününü değiştirebilirler. Optimum
gelişme sıcaklığı 37 C0’ dir [24, 57].
Lactococcus genusu
Lactococcus bakteri hücreleri düzgün oval şekillidir. İkili formu kısa zincir formuna
göre daha çok görülür. Bazı suşları uzun zincir oluşturabilir. Mannitol, trehaloz,
sükroz, arabinoz, ksiloz, laktoz, maltoz ve glukozdan asit üretirler. Proteolitik
aktiviteye sahiptirler. Bazı suşları bir bakteriosin olan nisini üretirler. Birçok gram
(+) bakteriye karşı inhibitör etki gösterirler. Kanlı agarda α veya γ reaksiyon verirler.
Optimum gelişme sıcaklıkları 30 C0’dir. Süt ürünlerinde adil kontaminant olarak
bulunurlar [24,57].
2.10. Laktik Asit Bakterilerinde İnhibitör Etki
Laktik asit bakterilerinin en önemli özelliklerinden biri, ortamda bulunan gıda
kaynaklı, patojen ve kontaminant mikroorganizmaların ( Staphylococcus aureus, E.
coli, Salmonella, Listeria monocytogenes gibi) gelişimini engellemeleri ve
ölümlerine sebep olmalarıdır [58, 59, 60].
Gıdaların korunmasında laktik asit bakterilerinin antimikrobiyal madde üretim
yeteneklerinden
yararlanılır
[61].
Fermentasyon
sonucu
ortamda
bulunan
karbonhidratların miktarı azalır ve antimikrobiyal aktiviteye sahip organik
moleküller ( laktik, asetik, formik, propiyonik asit) ve antimikrobiyal bileşikler
(hidrojen peroksit, diasetil ve bakteriyosin) oluşur [62, 63, 64, 65, 66].
Süt ve süt ürünlerinde, gıdaların bozulmasına sebep olan ve patojen özellikteki
bakterilerin inhibisyonunda en önemli faktörlerden biri pH’ dır. Laktik asit
bakterilerinin üretmiş olduğu organik asitlerle bu mikroorganizmalar üzerinde
inhibitör etki oluşabilmektedir. Süt ve süt ürünlerinde pH dışında inhibitör etkiyi
oluşturan en önemli faktörlerden biri bakteriosinlerdir. Bakteriosinler protein veya
protein kompleksleri olup, laktik asit bakterileri tarafından da üretilen antimikrobiyal
17
maddelerdir. Laktik asit bakterilerinin bakteriosinleri bazı gram (+) ve gram (-)
bakteriler üzerinde inhibitör etki oluşturur [ 67, 68 ].
Çalışmamızda çiğ sütten izole edilen laktik asit bakterilerinin, gıda patojeni (S.
aureus, L. monocytogenes, Salmonella typhimurium, E. coli ve K. pneumoniae)
bakteriler üzerine inhibisyon etkileri araştırılmıştır.
Staphylococcus aureus enterotoksin üretebilen, dünyanın hemen her ülkesinde gıda
kaynaklı hastalıklara yol açan patojen bir bakteridir. Gram (+), katalaz (+) düzenli
veya düzensiz kümeler oluşturan kok şeklinde bakterilerdir. Bu bakteri mastitis, süt
hayvanlarında cilt hastalıkları ile süt ve mamülleri tüketicilerinde gıda kaynaklı
intoksikasyonlara neden olmaktadır. Bunların esas önemleri olası enterotoksin
üretebilme yetilerinden kaynaklanmaktadır [69].
Laktik bakterilerin gram (+) ve gram (-) patojenler üzerine inhibisyonu dahil olmak
üzere birçok yararları vardır. Çeşitli araştırmacılar Lactococcus lactis’in S. aureus’a
karşı antagonistik etki gösterdiğini bildirmişlerdir [ 64, 70, 71].
Çon ve Gökalp’in 2000 yılında kuyu difüzyon tekniği kullanarak yaptıkları bir
çalışmada, Lactobacillus plantarum’un S. aureus’a karşı inhibitör etki gösterdiğini
belirlemişlerdir. Aynı çalışmada Pediococcus pentosaceus suşlarının, E. coli’ ye
karşı inhibitör etkisinin bulunmadığını göstermişlerdir [29].
Adıgüzel 2001 yılında çiğ sütten izole ettiği laktik asit bakterilerinin inhibitör
etkilerini incelediği bir çalışmasında, 110 çiğ süt örneğinden 249 laktik asit bakterisi
izole etmiştir. 144 S. faecalis, 14 S. durans, 22 S. lactis, 4 S. cremoris, 5 P. urinequi,
12 P. pentosaceus, 10 P. halophilus, 4 P. damnosus, 6 L. dextrinicus, 2 L.
pseudomesenteroides, 1 L. lactis ve 1 L. cremoris izole etmiştir. İnhibitör etkisi
incelen Listeria monocytogenes ve S. aureus bakterilerinde Pediococcus pentosaceus
ve Leuconostoc dextrinicus etkili bulunmuştur [9].
18
Kılıç 2003 yılında insan vajinasından izole ettiği Lactobacillus suşlarının S. aureus’a
karşı inhibitör etkisini incelemiştir. Lactobacillus acidophilus suşunun S. aureus
üzerine etki oluşturduğunu ve zon çapının 14 mm olduğunu gözlemlemiştir [72].
Ammor ve arkadaşları (2006) bazı laktik asit bakteri suşlarının Biyofilm oluşturmada
etkili S. aureus üzerine antagonistik etki oluşturduğunu rapor etmişlerdir [73].
2008 yılında Anas ve arkadaşlarının yaptığı bir çalışmada, Cezayirde çiğ keçi
sütünden izole edilen 64 Lactobacillus suşunun S. aureus’a karşı inhibitör etkisini
incelemişlerdir. 64 suştan sadece 11’i inhibe edici etki göstermiştir. Bu suşlar tür
düzeyinde mikrobiyolojik ve biyokimyasal testlerle adlandırılmıştır. S. aureus’a etki
gösteren türler, Lb. plantarum, Lb. rhamnosus, Lb. acidophilus, Lb. sakei subsp.
sakei, Lb. casei ve Lb. paracasei. subsp. paracasei’ dir. Ancak en yüksek etkiyi Lb.
plantarum türünün gösterdiğini bildirmişlerdir [48].
Karska-Wysocki ve arkadaşları (2010), Lactobacillus acidophilus ve Lactobacillus
casei suşlarının metsilin dirençli S. aureus üzerinde antibakteriyel aktivitesini
incelemişlerdir. S. aureus üzerinde, Lb. casei 2cm, Lb. acidophilus 3 cm zon çapı
oluşturarak antibakteriyel aktivite gösterdiklerini rapor etmişlerdir [74].
Altuntaş ve arkadaşları 2010 yılında çiğ süt ve peynir örneklerinden izole ettiği laktik
asit bakterilerinin antimikrobiyel aktivitelerini incelemişlerdir. 3 çiğ süt ve 9 peynir
örneğinden 63 laktik asit bakterisi izole etmişlerdir. L. monocytogenes ve S. aureus
üzerine inhibitör etkilerine bakıldığında, Lactococcus lactis ssp. lactis, Lactobacillus
plantarum ve Lactobacillus paracasei ssp. paracasei suşlarının etki gösterdiğini
tespit etmişlerdir. Listeria monocytogenes üzerine en yüksek etkiyi Lactococcus
lactis ssp. lactis suşunun gösterdiğini rapor etmişlerdir [75].
Listeria monocytogenes, doğada çok yaygın bir şekilde bulunan hem insan hem
hayvanlarda çeşitli hastalıklara yol açan patojen bir bakteridir. Gram (+) düzgün,
sınırları belli kısa çubuk bakterisidir. Süt endüstrisindeki önemi, süt ve mamülleri
bazlı gıda zehirlenmelerine neden olarak sık sık karşılaşılması ve günümüzde süt ve
19
mamullerinin L. monocytogenes içermemesinin sağlanmasının bir kalite kriteri kabul
edilmesine gerek duyulmasından kaynaklanmaktadır [69].
Garcia ve arkadaşları 1993 yılında laktik asit bakterilerinin Listeria monocytogenes’e
karşı inhibitör etkilerinin tespit etmişlerdir. Çalışmalarında besiyerine %0,2 oranında
glikoz ilave etmişlerdir [76].
Garriga ve arkadaşlarının 1993 yılında yaptığı bir çalışmada da Lactobacillus
suşlarının Listeria monocytogenes üzerine inhibitör etkisini tespit etmek için
besiyerine %0,2 oranında glikoz ilave etmişlerdir. Araştırmaları sonucunda bu
suşların Listeria monocytogenes’e karşı inhibisyon oluşturduğu tespit edilmiştir. Bu
araştırmalarda inhibitör etknin tespiti için besiyerine %0,2 glikoz ilave edilmiştir.
Bizim çalışmamızda da inhibitör etkiyi saptamak için hem nutrient agar besiyeri hem
de %0,2 glikoz ilaveli nutrient agar besiyeri kullanılmıştır [77].
Schillinger ve arkadaşları (2001) çalışmalarında, laktik asit bakterilerinin Listeria
monocytogenes üzerine bakteriosin etkisini incelemişlerdir. Gıda patojeni olarak
bilinen L. monocytogenes üzerine gıdalara ilave edilen ve bakteriosin sentezleyen
laktik bakterilerin etkisi tespit edilmiştir [78].
Salmonella gıda kaynaklı enfeksiyonlara yol açan büyük bir problem teşkil eden
patojen bir bakteridir. Salmonella kümes ve kümes hayvanlarından elde edilen
mamüllerde, et ve et ürünlerinde, süt ve süt ürünlerinde iyi bilinen bir kontaminanttır.
Salmonella genusu gram (-), spor oluşturmayan, küçük, çubuk şeklinde bir
bakteridir. Gıda kaynaklı salmonellosis vakalarının çoğu süt ve süt ürünü kaynaklı
olmamasına rağmen süt ve mamülleri yine de salgılarda önemli bir kaynağı
oluşturmaktadır [69].
2003 yılında Çadırcı Lactobacillusların bazı gram (+) ve gram (-) bakteriler üzerine
inhibitör etkisini incelediği bir çalışmada; Lb. plantarum’un Salmonella üzerine
inhibitör etki gösterdiğini tespit etmiştir [79].
20
E. coli, ilk kez 1885’ te tanımlanan ve büyük ölçüde diyarenin bir nedeni olarak
ortaya çıkan patojen bir bakteridir. Enterobacteriacea familyasının bir üyesi olan E.
coli peritrik flagella içerebilen ya da hareketsiz olabilen gram (-), spor oluşturmayan
düz çubuk şeklinde bir bakteridir. Patojenitesine göre 4 gruptur; Enteropatojenik
(EPEC), Enterotoksijenik (ETEC), Enteroinvasiv (EIEC) ve Enterohaemorejenik E.
coli (EHEC)’ dir. ETEC suşları insanlarda ve hayvanlarda şiddetli diyareye yol
açmaktadır ve temel kaynağı süt ve süt mamulleridir [69].
Chuayana ve arkadaşları 2003 yılında, süt ürünlerinden izole ettikleri laktik asit
bakteri kültürlerinin S. aureus, E. coli ve Salmonella typhi üzerine antimikrobiyel
etkilerini araştırmışlardır. Streptococcus spp. ve Lactobacillus spp. suşları S.
aureus’a karşı bakterisidal etki gösterirken Salmonella typhi ve E. coli’ye karşı
bakteriostatik etki gösterdiğini rapor etmişlerdir [80].
2005 yılında Rodriguez ve arkadaşları yaptıkları bir çalışmada Lactococcus lactis
suşlarından elde edilen ve pediosin üreten iki transformatın peynirin olgunlaştırılması
sırasında L. monocytogenes, S. aureus ve E. coli 0157:H7 üzerindeki antimikrobiyel
aktivitesini araştırmışlardır. Pediosin üreten Lactococcus lactis’in L. monocytogenes,
S. aureus ve E. coli O157:H7’ nin gelişimini engellediğini tespit etmişlerdir [82].
Arslan’nın 2005 yılında yapmış olduğu bir çalışmada, çiğ sütten izole edilen
Lactobacillus, Pediococcus, Streptococcus ve Leuconostoc türlerinin, Listeria
monocytogenes, Staphylococcus aureus, Yersinia enterocolitica, Bacillus cereus ve
B. subtilis indikatör bakterileri üzerine inhibitör etkisini incelemiştir. Çiğ sütten izole
edilen laktik bakterilerin tüm indikatör bakterilere karşı etki oluşturduğunu
bildirmiştir [13].
Etöz 2006 yılında yapmış olduğu bir çalışmada, kefirden izole edilen Lb. casei, Lb.
delbrueckii ssp. bulgaricus, Leu. cremoris, Enterococcus faecalis ve Enterococcus
faecium
bakterilerinin,
Staphylococcus,
Salmonella,
Shigella,
Klebsiella,
Enterobacter, Listeria, Esherichia, Aeromonas, Pseudomonas ve Proteus indikatör
bakterilerine karşı antimikrobiyal aktiviteleri araştırılmıştır. Stapylococcus aureus,
21
Listeria monocytogenes, Salmonella typhimurium ve Klebsiella pneumoniae üzerine
en yüksek antimkrobiyal aktiviteyi Enterococcus faecium ve Enterococcus faecalis
göstermiştir. Lb. delbrueckii ssp. bulgaricus ve Leu. cremoris hepsinde etki
gösterirken, S. aureus ve Listeria monocytogenes üzerinde Lb. delbrueckii ssp.
bulgaricus en etkili tür olarak bildirilmiştir [83].
Gonzalez ve arkadaşlarının 2006 yılında yaptıkları çalışmada, 395 laktik asit bakteri
suşunun peynir yapımı ve olgunlaştırılması süresince antimikrobiyal aktivitelerini
araştırmışlardır. Lactococcus lactis ssp. lactis suşlarının S. aureus ve Listeria
monocytogenes üzerine antibakteriyel etki gösterdiğini bildirmişlerdir [81].
Tuncer ve arkadaşlarının 2008 yılında yaptığı bir çalışmada, bozadan izole ettikleri
laktik asit bakterilerinin antimikrobiyel etkisini incelemişleridir. E. coli’ de inhibitör
etki gözlenmezken, S. aureus üzerine L. lactis ssp. lactis suşunun etkili olduğunu
tespit etmişlerdir [84].
2008 yılında İşleroğlu ve arkadaşlarının yapmış olduğu bir çalışmada, Tokat yöresine
ait geleneksel bir peynirden antimikrobiyel aktiviteye sahip bir bakteri izole edilip
karakterize edilip adlandırılmıştır. Adlandırılan Enterococcus faecalis tarafından
üretilen antimikrobiyel maddenin L. monocytogenes ve E. coli üzerine etkisi
araştırılmıştır. L. monocytogenes’e karşı inhibitör etki gösteriken E. coli’ye etkili
olmadığını gözlemlemişlerdir [55].
Dixit ve arkadaşları 2013 yılında Lactobacillus acidophilus suşlarının Pseudomonas
aeruginosa, Klebsiella pneumoniae, S. aureus, E. coli ve Salmonella typhi üzerine
antibakteriyal etkilerini incelemişlerdir. 5 Lactobacillus acidophilus suşundan 3
tanesi etkili bulunmuştur. NCIM 2903 nolu suş tüm patojen bakterilerde etkili
bulunurken, NCIM 2285 nolu suş P. aeruginosa ve Salmonella typhi üzerine etkisiz
diğer bakterilerde etkili bulunmuştur. NCIM 2660 nolu suş ise, P. aeruginosa ve K.
pneumoniae üzerinde zayıf inhibitör etki gösterirken Salmonella typhi de inhibitör
etki göstermiştir [85].
22
3. MATERYAL VE METOD
Araştırmamızda Nisan 2011- Mart 2012 tarihleri arasında Ankara ve çeşitli illerden
toplanan 30 çiğ süt örneği materyal olarak kullanılmıştır. Alınan 30 çiğ süt
örneğinden laktik asit bakterileri ( Lactobacillus, Pediococcus, Leuconostoc,
Streptococcus) izole edilmiştir. Daha sonra izole edilen bakterilerin identifikasyonu
yapılmıştır. Toplam laktik asit bakterilerinin sayısı 74 olarak belirlenmiştir. Süt
örnekleri Ankara, Burdur, Kırıkkale, Konya ve Bursa illerinden toplanmıştır.
(Çizelge3.1.)
Çizelge 3.1. Çiğ süt örneklerinin toplandığı illere göre dağılımı
Çiğ Süt Örneklerinin
Toplandığı İller
ANKARA
BURDUR
KIRIKKALE
KONYA
BURSA
TOPLAM
Çiğ Süt Örneklerinin
Sayısı
13
5
4
4
4
30
İzole edilen laktik asit bakterilerinin adlandırılmasında manuel biyokimyasal testler
yapılmıştır. Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology’ e göre biyoşimik özellikler
karşılaştırılarak adlandırılması yapılmıştır. Ayrıca Pediococcus pentosaceus,
Enterococcus faecalis, E. faecium ve Lactococcus lactis ssp. lactis türlerinin
adlandırılmasında ilave olarak BBL™ Crystal™ Rapid Gram-Positive ID Kit
kullanılmıştır. Tür seviyesinde adlandırılması yapılan izolatların proteaz, lipaz,
elastaz, -amilaz ve hemoliz aktiviteleri araştırılmıştır. Bunun yanında bazı patojen
bakteriler (Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes, Klebsiella pneumoniae,
E. coli, Salmonella typhimurium) üzerine inhibitör etkileri araştırılmıştır.
Lactobacillus cinsine ait izole edilen türler; Lactobacillus delbrueckii ssp. lactis,
Lactobacillus casei,
Lb. rhamnosus,
Lb. acidophilus,
Lb. coryniformis ssp.
torquens, Lb. plantarum ssp. plantarum’dur. Pediococcus cinsine ait izole edilen
türler; Pediococcus pentosaceus, P. dextrinicus, P. inopinatus, P. acidilactici’ dir.
23
Leuconostoc cinsine ait izole edilen türler; Leuconostoc mesenteroides ssp.
mesenteroides, Leuconostoc mesenteroides ssp. dextranicum’dur.
Streptococcus’ lardan Streptococcus lactis,
Streptococcus cremoris türleri,
Enterococcus’ lardan Enterococcus faecalis, Enterococcus faecium ve Lactococcus
lactis ssp. lactis türleri izole edilmiştir.
Lactobacillus, Pediococcus, Leuconostoc ve Streptococcus bakterilerinin izolasyonu
amacıyla çiğ süt örnekleri steril şişelerle alınmıştır. Örnekler, zenginleştirme besiyeri
olan pepton water da 10-1, 10-2 ve 10-3 e kadar dilüsyon yapılarak sulandırılmıştır.
10-2 ve 10-3 dilüsyonlarından laktik asit bakterilerinin üretildiği selektif bir besiyeri
olan MRS (De Man Rogosa Sharp) agara ekim yapılmıştır [86]. MRS besiyerinde
üreyen bakteriler önce morfolojilerine göre ayrılmış ve çeşitli biyokimyasal testler
uygulanmıştır. Laktik asit bakterilerinin cins ve tür dağılımlarının belirlenebilmesi
amacıyla, izole edilen bakteriler Gram boyama ile morfolojik olarak tespit edildikten
sonra katalaz ve vankomisin testlerine tabi tutulmuştur. Laktik asit bakterileri katalaz
negatif özellik gösterirler. Katalaz negatif olan izolatlara vankomisin testi
yapılmıştır.
Vankomisine
dirençli
olanlar
Leuconostoc,
Pediococcus
ve
Lactobacillus, vankomisine duyarlı olanlar Streptococcus cinslerine ait bakterilerdir.
Vankomisine
dirençli
değerlendirilmiştir.
olan
MRS
bakterilerin
broth’da
gaz
MRS
broth’da
oluşturanlar
gaz
oluşumu
Leuconostoc,
gaz
oluşturmayanlar Pediococcus, değişken reaksiyon gösterenler ise Lactobacillus
cinsine ait kabul edilerek cins seviyesinde adlandırılmaları yapılmıştır (Çizelge 3.2).
24
Çizelge 3.2. Gram pozitif katalaz negatif bakterilerin cins seviyesinde
adlandırılmalarında kullanılan testler
Katalaz (Negatif)
Vankomisin(30 µg disk)
Duyarlı
Dirençli
Streptococcus
Leuconostoc, Pediococcus, Lactobacillus
MRS Broth' da gaz
Pozitif
Negatif
Leuconostoc
Lactobacillus
Pediococcus
Lactobacillus
Lactobacillus, Pediococcus, Leuconostoc ve Streptococcus şüphesi olan izolatların
tür seviyesinde identifikasyonu için, 10 0C ve 45 0C’de üreme, %6,5 NaCl’de üreme,
esculin
hidrolizi,
arginin
hidrolizi
ve
karbonhidrat
fermentasyon
testleri
kullanılmıştır.
3.1. Çiğ Süt Örneklerinden Laktik Asit Bakterilerinin İzolasyonunda
Kullanılan Yöntemler
3.1.1. Örnek alma ve örneklerin analize hazırlanması
Araştırmada Türk Standartları Ensitüsünde (TSE-1018) belirtilen esaslara göre çiğ
süt örnekleri 200 ml’lik steril şişelerle alınmıştır [87]. Analiz için laboratuara
getirilen örneklerin %0,1’lik Pepton water (Merck 1.07228) kullanılarak 10-1, 102
,10-3’lük dilüsyonları hazırlanmıştır [88, 89]. 10-2 ve 10-3’lük dilüsyonlardan 0,1 ml
alınarak MRS ve Standart Plate Count Agar (PCA)
yayma ekim yapılmıştır.
besiyerine dragalski özesiyle
25
3.1.2. Laktik asit bakterilerinin izolasyonu ve adlandırılması
Lactobacillus suşlarının izolasyonu ve adlandırılması
Araştırmada Lactobacillus’ların izolasyonu için MRS besiyerine ekim yapılarak
370C’ de 24-48 saat inkübasyona bırakılmıştır. İnkübasyondan sonra farklı
görünümdeki koloniler Gram boyama ile boyanarak, sporsuz zincir şeklinde basil
olan koloniler MRS besiyerine tekrar tek koloni ekimi ile ekilmiştir. MRS
besiyerinde üretilen bakteriler katalaz, vankomisin, MRS broth’da gaz testleri
yapılarak cins seviyesinde adlandırılmıştır [90].
Cins seviyesinde adlandırılan Lactobacillus’ lara 100C’de üreme, arginin, esculin ve
karbonhidrat
fermentasyon
testleri
uygulanmıştır.
Obligat
homoermentatif
Lactobacillus türleri için galaktoz, laktoz, maltoz, rafinoz, sükroz, mannitol, salisin
karbonhidratları, fakültatif heterofermentatif Lactobacillus türleri için mannitol,
rafinoz, sükroz, ksiloz, arabinoz ve sorbitol karbonhidratları kullanılmıştır [91, 92].
Tür seviyesinde adlandırmak amaçlı yapılan tüm bu testler sonucunda obligat
(zorunlu) homofermentatif Lactobacillus türlerinden 10 Lb. delbrueckii ssp. lactis, 5
Lb. acidophilus adlandırılmıştır (Çizelge 3.3).
Fakültatif heterofermentatif Lactobacillus türlerinden 9 Lb. casei, 6 Lb. rhamnosus, 5
Lb. coryniformis ssp. tourquens ve 3 Lb. plantarum ssp. plantarum izole edilip
adlandırılmıştır (Çizelge 3.4).
d: değişken 11-89%
Galaktoz
Laktoz
Maltoz
Rafinoz
Sükroz
Mannitol
Salisin
Lb.delbrueckii ssp.lactis
Lb.acidophilus
Arginin
Lactobacillus
Türleri
100C’de
üreme
Çizelge 3.3. Obligat homofermentatif Lactobacillus türlerinin fizyolojik karakterleri
-
d
-
d
+
+
+
+
+
d
+
+
-
+
+
26
100C’de
üreme
Esculin
Arabinoz
Mannitol
Rafinoz
Sükroz
Ksiloz
Sorbitol
Çizelge 3.4. Fakültatif heterofermentatif Lactobacillus türlerinin fizyolojik
karakterleri
Lb. casei
Lb. rhamnosus
+
+
+
+
d
+
+
-
+
+
-
+
+
Lb. coryniformis ssp. tourquens
Lb. plantarum ssp. plantarum
+
+
+
d
+
+
+
+
+
d
+
Lactobacillus
Türleri
d: değişken 11-89%
Pediococcus suşlarının izolasyonu ve adlandırılması
Çiğ süt örneklerinden Pediococcus’ ların izolasyonu için MRS besiyerine ekim yapılarak
370C’ de 24-48 saat inkübasyona bırakılmıştır. Besiyerinde üreyen farklı koloniler Gram
boyama ile boyanarak gram pozitif, iki boyutlu olarak bölündüklerinden çift halde veya
tetrat formda kok olan koloniler tekrar MRS besiyerine tek koloni olarak ekilmiştir.
Katalaz negatif, vankomisin dirençli ve MRS broth’da gaz oluşturmayanlar Pediococcus
cinsine ait olduğu düşünülerek adlandırmaya devam edilmiştir. Tür seviyesinde
adlandırmak için Pediococcus cinsine ait olarak belirlenen suşlara 450C’ de üreme, %6,5
NaCl’ de üreme, arginin hidrolizi ve arabinoz, ksiloz, galaktoz, maltoz, laktoz
karbonhidratlarının fermentasyon testleri uygulanmıştır [93, 94, 95]. Yapılan bu testler
sonucunda 9 Pediococcus pentosaceus, 6 Pediococcus dextrinicus, 1 Pediococcus
inopinatus, 1 Pediococcus acidilactici adlandırılmıştır (Çizelge 3.5).
d: değişken 11-89%
Maltoz
Arabinoz
Laktoz
d
+
Galaktoz
45 cC’de
üreme
+
+
+
0
+
+
Ksiloz
P. pentosaceus
P. dextrinicus
P. inopinatus
P. acidilactici
%6,5
NaCl’de
üreme
Pediococcus
Türleri
Arginin
hidrolizi
Çizelge 3.5. Pediococcus türlerinin identifikasyonunda kullanılan fizyolojik testler
d
+
+
d
+
+
+
+
+
-
+
d
+
d
+
d
27
Leuconostoc suşlarının izolasyonu ve adlandırılması
Çiğ süt örneklerinden Leuconostoc’ ların izolasyonu için MRS besiyerine ekim
yapılarak 370C’ de 24-48 saat inkübasyona bırakılmıştır. İnkübasyon sonunda üreyen
koloniler Gram boyama ile boyanarak mikroskopta gram pozitif, çift veya zincir
şeklinde kok morfolojisine sahip olup olmadığı gözlenmiştir. Leuconostoc olduğu
düşünülen koloniler tekrar MRS besiyerinde üretilip katalaz, vankomisin ve MRS
broth’ da gaz testine alınmıştır. Katalaz negatif, vankomisin dirençli ve MRS broth’
da gaz oluşturanlar Leuconostoc cinsine ait olarak tespit edilmiştir. Tür
adlandırmasında, esculin hidrolizi, rafinoz, sükroz, laktoz, mannitol, salisin ve ksiloz
karbonhidratlarının fermentasyon testleri yapılmıştır [95, 96].
Bu testlerin sonucunda 5 L. mesemteroides ssp. mesenteroides, 3 L. mesenteroides
ssp. dextranicum adlandırılmıştır (Çizelge 3.6).
Rafinoz
Sükroz
Laktoz
Salisin
Mannitol
L. mesemteroides ssp. mesenteroides +
L. mesenteroides ssp. dextranicum
+
Ksiloz
Leuconostoc
Türleri
Esculin
Çizelge 3.6. Leuconostoc türlerinin adlandırılmasında kullanılan fizyolojik testler
d
d
d
d
+
+
d
+
d
-
d
-
d: değişken 11-89%
Streptococcus suşlarının izolasyonu ve adlandırılması
Araştırmamızda çiğ süt örneklerinden Streptococcus’ ların izolasyonu için MRS
besiyerine ekim yapılıp 370C’ de 24-48 saat inkübasyona bırakılmıştır. Besiyerinde
üreyen koloniler Gram boyama ile boyanmıştır. Gram pozitif, çift, uzun veya kısa
zincirler oluşturan koklar MRS besiyerine tekrar tek koloni olarak ekilmiştir.
Bakterilere önce katalaz ve vankomisin testi uygulanmıştır. Katalaz negatif,
vankomisin duyarlı olanlar Streptococcus cinsine ait olarak tespit edilmiştir.
28
Streptococcus’ ların tür adlandırılmalarında 100C ve 450C’ de üreme, %6,5 NaCl’ de
üreme,
arginin
hidrolizi
esculin
hidrolizi,
sükroz,
mannitol,
rafinoz
karbonhidratlarından fermentasyon testleri yapılmıştır [97, 98].
Testlerin sonucunda ise 4 Streptococcus lactis, 1 Streptococcus cremoris izole edilip
adlandırılmıştır (Çizelge 3.7).
%6,5
NaCl’de
üreme
Arginin
Esculin
Sükroz
Mannitol
Rafinoz
Streptococcus lactis
Streptococcus cremoris
450C’de
üreme
Streptococcus
Türleri
100C’de
üreme
Çizelge 3.7. Streptococcus türlerinin adlandırılmasında kullanılan biyokimyasal
testler
+
+
-
-
+
-
+
-
d
d
-
-
d: değişken 11-89%
Enterococcus faecalis ve 1 Enterococcus faecium, Streptococcaceae familyasına ait 3
Lactococcus lactis ssp. lactis bakterileri de MRS besiyerinde üretilip cins
seviyesinde adlandırılmıştır. Daha sonra tür adlandırmasında 100C-450C’ de üreme,
%6,5 NaCl’ de üreme, arginin hidrolizi ve galaktoz, maltoz, laktoz, rafinoz
karbonhidratlarının fermentasyon testleri uygulanmıştır. İzole edilen tüm laktik
bakteri suşlarına uygulanan bioşimik testler Çizelge 3.8.’de gösterilmiştir.
İzole edilen Laktik asit bakterilerinin identifikasyonunda yapılan biyoşimik testler
kullanılarak manual adlandırılmaları yapılmıştır. Bununla beraber BBL Crystal Gram
Positive ID Kit, Pediococcus pentosaceus ve Lactococcus lactis ssp. lactis
bakterilerinin adlandırılmasında kullanılmıştır. BBL Crystal Gram Positive ID Kit;
Çizelge 3.9.’da gösterilen enzim ve biyokimyasal testlerin bir arada bulunduğu
kuyucuk sisteminden oluşur. Bu sisteme göre kuyucuklardaki renk değişimlerine
göre testler pozitif ve negatif değerlendirmeye alınarak, 10 basamaklı rakamsal bir
kod oluşturulur. Bilgisayar programında, hesaplanan kod ile bakteri izolatının
morfolojik (kok veya basil) şekline göre bakterilerin identifikasyonu yapılmaktadır.
29
30
31
32
33
3.2. Çiğ Sütten İzole Edilen Laktik Asit Bakterilerinin Proteolitik Enzim
Aktivitelerinin Belirlenmesi
3.2.1. İzole edilen bakterilerin proteolitik aktivitelerinin belirlenmesinde
kullanılan besiyeri
Calsium caseinate Agar (Merck 1.05409)
Bileşimi
gr/L
Pepton
4,0 gr
Et özütü
2,0 gr
Pepton from casein
2,0 gr
Calsium caseinate
3,5 gr
Kalsiyum klorid
0,2 gr
Tripotasyum sitrat monohidrat
0,35 gr
Disodyum hidrojen fosfat
0,105 gr
Potasyum dihidrojen fosfat
0,035 gr
Sodyum klorid
5,0 gr
Agar
13,0 gr
Yukarıda verilen maddeler 1000 ml distile su içerisinde çözdürülür. Bu maddelere
ilave olarak 5-7,5 gr/L Skim milk eklenir. 1210C’de 15 dakika otoklavda steril edilir,
steril petri kutularına 12,5’er ml taksim edilir.
3.2.2. İzole edilen bakterilerin proteolitik aktivitelerinin değerlendirilmesinde
kullanılan yöntem
Calsium Caseinate Agar besiyerine proteolitik aktivitesi test edilecek olan izolat,
nokta ekim yöntemiyle ekilir. 370C’de 24-48 saat inkübasyona bırakılır. İnkübasyon
sonrası etrafında berrak zon görülen koloniler proteolitik aktivitesi pozitif olarak
değerlendirilir. Zon çapları mm olarak ölçülür. 4 mm’ nin üzerinde zon çapı olan
bakteri izolatları proteolitik aktif olarak değerlendirilir.
34
3.3. Çiğ Sütten İzole Edilen Laktik Asit Bakterilerinin Lipolitik Enzim
Aktivitelerinin Belirlenmesi
3.3.1. İzole edilen bakterilerin lipolitik aktivitelerinin belirlenmesinde
kullanılan besiyeri
Tributyrin Agar (Merck 1.01957)
Bileşimi
gr/L
Pepton
5,0 gr
Maya özütü
3,0 gr
Tributrin (Glycerol tributyrate)
10,0 gr
Agar
15,0 gr
Yukarıda verilen maddeler 1000 ml distile su içerisinde çözdürülür. 1210C’de 15
dakika otoklavda sterilize edilir. Steril petri kutularına 12,5’er ml taksim edilir.
3.3.2. İzole edilen bakterilerin lipolitik aktivitelerinin değerlendirilmesinde
kullanılan yöntem
İçeriği verilen Tributyrin Agar besiyerine lipolitik aktivitesi test edilecek olan izolat,
nokta ekim yöntemiyle iğne öze ile ekilir. 370C’de 24-48 saat inkübasyondan sonra
etrafında berrak zon oluşan koloniler lipolitik aktivitesi pozitif olarak değerlendirilir.
3.4. İzole Edilen Laktik Asit Bakterilerinde Elastaz Varlığının Araştırılması
Laktik asit bakterilerinde, elastaz varlığının araştırılmasında; elastinli nutrient agar
besiyeri hazırlanır.
Nutrient agarın hazırlanışı: 8 gr nutrient buyyon ve 20 gr noble agar 1000 ml distile
suda çözdürülerek, pH= 7,5’e ayarlanır. 1210C’de 15 dakika steril edildikten sonra
steril petrilere dağıtılmıştır. Sonra 40C’de saklanmıştır.
35
Elastinli tabakanın hazırlanışı: 2,4 gr nutrient buyon, 6 gr noble agar ve 1 gr elastin
300 ml distile suda çözdürülerek, pH= 7,5’e ayarlanmış ve buzdolabında bir gece
kurutulan nutrient agar üzerine ikinci bir tabaka olacak şekilde, her bir petri kabına,
ikinci tabak olarak, 5 ml kadar dökülmüştür.
Elastin-nutrient agara, bakteri kültürlerinden çizgi şeklinde ekim yapılarak önce 2448 saat 370C’de sonra 48 saat +40C’de inkübe edilmiştir. Ekim bölgelerinde şeffaf
zonların varlığı gözlenmiştir. Her izolatın elastolitik aktivitesi; aşağıda belirtilen
formüle göre değerlendirilmiştir.
Üreme Genişliği (mm) / (Üreme genişliği(mm) + şeffaf zon (mm))
Bu formüle göre, oran 1’den ne kadar küçükse bakteri suşunun enzim üretiminin o
kadar fazla olduğu belirtilmiştir. Oran 1’e eşit ise bakteri enzim üretmiyor, demektir
[99].
3.5. İzole Edilen Laktik Asit Bakterilerinde -Amilaz Varlığının Araştırılması
3.5.1. Yöntem
Laktik asit bakterileri, α-amilaz aktivitesinin belirlenebilmesi için önce Luria Bertani
broth’da 37 °C’de kültüre alınmıştır. Üreyen bakterilerden steril öze yardımıyla Luria
Bertani-Nişasta Agar besiyerine çizgi yöntemiyle ekim yapılarak, 37 °C’de 24 saat
inkübasyona bırakılmıştır. [100]. Bakteri kolonileri geliştikten sonra plak iyodin
boyasıyla boyanmıştır. İyodin boyası nişastalı zemini maviye boyayacağından,
maviye boyanmış zemin etrafında beyazımsı halka oluşturan koloniler α-amilaz
pozitif olarak değerlendirilmiştir.
3.5.2. Kullanılan besiyerleri
Luria Bertani Broth (Difco 244610)
Bileşimi
gr/L
36
Tryptone
10 gr
Yeast Extract
5 gr
Sodium chloride
10 gr
Besiyerinden 25 Gram tartılıp 1000 ml distile su içinde çözdürülür. Homojenize
olması için 1 dakika süre boyunca kaynatılır, 5’er ml olacak şekilde tüplere dağıtılır
ve 121°C'de otoklavda 15 dakika steril edilir.
Luria Bertani- Nişasta Agar
Bileşimi
gr/L
Tripton
10 gr
Maya Ekstraktı
5 gr
NaCl
10 gr
Agar
15 gr
Nişasta
5 gr
Yukarıda verilen maddeler 1000 ml distile su içerisinde çözdürülür. 1210C’de 15
dakika otoklavda sterilize edilir. Steril petri kutularına 12,5’er ml taksim edilir.
İyodin Boyası (100 ml)
Metanol
50 ml
Potasyum iyodid
10 gr
İyodin (iyot)
1 gr
Yukarıda belirtilen miktarlarda kimyasal malzemeler hazırlanarak bir erlenin
içerisine konur. Bir miktar saf su ilave edilerek manyetik karıştırıcıda çözdürülür.
Hacim saf su ile 100 ml’ye tamamlanır.
37
3.6. Laktik Asit Bakterilerinin Hemolitik Aktivitelerinin Belirlenmesi
3.6.1. Yöntem
İzole edilen laktik asit bakterilerinde hemolitik aktivitenin belirlemesi için 370C’de
18 saat geliştirilen bakteri kültürlerinden ticari olarak temin edilen ve %5 koyun kanı
içeren Tryptose Blood Agar Base ortamına çizgi yöntemiyle ekim yapılmıştır.
370C’de 24 saat inkübasyondan sonra kolonilerin etrafında parlak zon oluşumu
hemoliz pozitif olarak değerlendirilmiştir.
3.6.2. Kullanılan besiyerleri
Tryptose Blood Agar Base ( Oxoid CM233)
Bileşimi
gr/L
Tryptose
10,0 gr
Lab-lemco powder
3,0 gr
Sodyum klorid
5,0 gr
Agar
12,0 gr
Tryptose Blood Agar Base’den 30 gram tartılıp, 1000 ml distile su içinde çözdürülür.
1210C’de 15 dakika steril edilen besiyeri 470C’ye kadar soğutultuktan sonra içerisine
%5 oranında kan ilave edilip karıştırıldıktan sonra steril plaklara 12,5 ml taksim
edilir.
3.7. Laktik Asit Bakterilerinin Patojen Bakteriler Üzerine İnhibitör Etkisi
Araştırmamızın diğer bir aşamasında çiğ sütten izole edilerek adlandırılan laktik asit
bakterilerinin Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes, E.coli, Klebsiella
pneumoniae ve Salmonella typhimurium patojen bakteriler üzerine inhibitör etkileri
çalışılmıştır. Bu amaçla Nutrient agar, %0,2 glikoz ilave edilmiş Nutrient agar
besiyerleri kullanılmıştır. Bu besiyerlerinde kuyu difüzyon yöntemiyle inhibitör etki
38
araştırılmıştır. Kuyu difüzyon yöneminde test bakterisi olarak laktik asit bakterileri,
indikatör bakteri olarak da patojen bakteriler kullanılmıştır.
S. aureus, L.
monocytogenes, E.coli, K. pneumoniae ve S. typhimurium patojen bakterileri G.Ü,
Fen Fakültesi Biyoloji Bölümü, Mikrobiyoloji Laboratuarında izole edilip
adlandırılmış saf kültürler olup kontrol testleri yapılmıştır.
3.7.1. Nutrient agar da kuyu difüzyon yöntemi
Laktik asit bakterilerinin inhibitör etkileri agar kuyu difüzyon yöntemi kullanılarak
tespit edilmiştir. Bu yöntemde Nutrient Agar besiyeri kullanılmıştır [101].
Öncelikle
indikatör
olarak
kullanılan
patojen
bakteriler
(S.
aureus,
L.
0
monocytogenes, E.coli, K. pneumoniae ve S. typhimurium) 37 C’de Brain Heart
Infusion broth’da aktifleştirilmiştir. Nutrient agar besiyeri 1210C’de 15 dakika steril
edilmiştir. Besiyerinin ısısı 370C’ye düşünce aktifleştirilen patojen bakteriler steril
pipet ile 100 ml besiyerinde 1 ml olacak şekilde ilave edilmiştir. Besiyeri homojen
oluncaya kadar karıştırılıp steril petri kutularına 25’er ml taksim edilmiştir.
Besiyerinin donması için bir süre beklendikten sonra agar üzerinde 10 mm çapında
steril kuyu açar ile belirli aralıklarla kuyular açılmıştır. Açılan kuyulara dipleri
kapanacak şekilde steril Nutrient agar damlatılmıştır. MRS broth’ da aktifleştirilen
laktik asit bakteri kültürlerinden kuyulara 50-100 µl pipetlenmiştir. Laktik asit
bakterilerinin difüze olmaları için petri kutuları 2 saat buzdolabında bekletilmiştir.
Daha sonra buzdolabından alınarak 370C’de 24 saat inkübasyona bırakılmıştır.
İnkübasyon sonunda oluşan inhibisyon zon çapları ölçülmüştür. Ölçüm işlemi 10
mm’lik kuyu çapında dışında oluşan inhibisyon zonu ölçülerek yapılmıştır.
3.7.2. %0,2’lik glikoz içeren nutrient agar da kuyu difüzyon yöntemi
Laktik asit bakterilerinin indikatör bakteriler üzerine inhibitör etkilerinin organik
asitten kaynaklanıp kaynaklanmadığını saptamak için önce asit etkileri önlenmeden
yukarıda anlatıldığı gibi kuyu difüzyon yöntemi uygulanıp test sonuçları
gözlenmiştir. İkinci uygulamada organik asit etkileri önlenerek testler tekrar
39
edilmiştir. Organik asit etkisinin engellenmesi için Nutrient agar besiyerinin içerisine
%0,2 oranında glikoz ilave edilmiştir [77]. Böylece asit formu nötralize edilmiştir.
3.7.3. Kuyu difüzyon yönteminde kullanılan besiyeri
Nutrient Agar (LAB M -LAB8)
Bileşimi
gr/L
Lab-Lemco powder
1gr
Yeast extract
2 gr
Peptone
5 gr
Sodium chloride
5 gr
Agar
15 gr
Distile su
1000 ml
pH 7,4±0,2’ye ayarlanıp 1210C’de 15 dakika steril edilmiştir. Daha sonra petri
kutularına 25’er ml taksim edilmiştir.
3.7.4. Laktik asit bakterileri ve indikatör patojen bakterilerin
aktifleştirilmesinde kullanılan besiyerleri
MRS Broth ( LABM- LAB94)
Bileşimi
gr/L
Pepton
Yeast extract
Beef extract
Glucose
Di-potassium hydrogen phosphate
10 gr
5 gr
10 gr
20 gr
2 gr
Sodium asetate
Tri amonium citrate
Magnesium sulphate 7 H2O
Manganase sulphate 4 H2O
Tween 80
Distile su
5 gr
2 gr
0,02 gr
0,05 gr
1,08 ml
1000 ml
40
pH 6,2±0,2’ye ayarlanıp tüplere 10’ar ml taksim edilip, 1210C’de 15 dakika steril
edilmiştir.
BHI (Brain Heart Infusion ) (OXOİD CM 375)
Bileşimi
gr/L
Calf brain infusion solids
Beef heart infusion solids
Protease peptone
12,5 gr
5 gr
10 gr
Sodium chloride
Glucose
Disodium phosphate
Distile su
5 gr
2 gr
2,5 gr
1000 ml
pH 7,4±0,2’ye ayarlanıp tüplere 10’ar ml taksim edilip, 1210C’de 15 dakika steril
edilmiştir.
3.8. Laktik Asit Bakterilerinin İzolasyonunda Kullanılan Temel Besiyerleri
MRS (De Man Rogosa Sharpe) Agar (OXOID CM 361)
Bileşimi
gr/L
Peptone
10 gr
Yeast extract
8 gr
Beef extract
4 gr
Glucose
20 gr
Sorbitan mono-oleate
1 gr
Di-potasium hydrogen phosphate
2 gr
Sodium asetate 3 H2O
5 gr
Tri amonium citrate
2 gr
Magnesium sulphate 7 H2O
0,02 gr
Manganase sulphate 4 H2O
0,05 gr
Agar
10 gr
Distile su
1000 ml
41
pH 6,2±0,2’ye ayarlanıp 1210C’de 15 dakika steril edilir. Sonra petri kutularına
yaklaşık 25’er ml taksim edilir.
Standart Plate Count Agar (PCA) (LABM- LAB149)
Bileşimi
gr/L
Tripton
5 gr
Maya özütü
2,5 gr
Glikoz
1 gr
Agar
15gr
Distile su
1000 ml
pH:7,0 ±0,2 ayarlandıktan sonra 121°C de 15 dakika steril edilerek steril petri
kutularına dağıtılır.
Peptone Water (MERCK 1.07228)
Bileşimi
gr/L
Peptone
10 gr
Sodium chloride
5 gr
Distile su
1000 ml
pH 7,4±0,2’ye ayarlanıp tüplere 9’ar ml taksim edilip, 1210C’de 15 dakika steril
edilmiştir.
3.9. Laktik Asit Bakterilerinin İdentifikayonunda Kullanılan Besiyerleri ve
Uygulanan Testler
3.9.1. Gram boyama
Klasik Gram boyama yöntemindeki Kristal Viyole, Lügol, %70’lik Alkol ve Bazik
Fuksin hazırlanarak Gram boyama yapılmıştır. Mikroskopta 100x büyütmede,
immersiyon yağı kullanılarak inceleme yapılmıştır.
42
3.9.2. Katalaz testi
Lam üzerine saf laktik asit kültürü kolonilerinden bir öze dolusu alınıp, koloni
üzerine iki üç damla %3 hidrojen peroksit (H2O2) damlatılarak karıştırılmıştır. Lam
üzerinde gaz kabarcıklarının oluşmaması katalaz negatif olarak değerlendirilmiştir.
3.9.3. Vankomisin duyarlılık testi
Laktik asit bakterilerinin cins seviyesinde adlandırılmasında vankomisin (30µg disk)
antibiyotiğine karşı bakteri izolatlarının duyarlılığı test edilmiştir. Öncelikle Mueller
hinton agar besiyerine tek koloni ekimi yapılan izolatlar, 0,5 Mc farland
bulanıklığında serum fizyolojiğe inoküle edilmiştir. Daha sonra Mueller hinton agar
besiyerine steril eküvyon ile serum fizyolojikten yayma ekimi yapılarak vankomisin
antibiyotik diskleri yerleştirilmiştir. 370C’ de 24 saat inkübasyon sonunda antibiyotik
diski etrafında oluşan zon çapları ölçülerek değerlendirilmiştir. Clinical and
Laboratory Standards Institute (CLSI) kriterlerine göre laktik asit bakterilerinin
vankomisine duyarlılığı; zon çapı
≥17 ise duyarlı, ˂17 ise dirençli olarak
değerlendirilmiştir.
Mueller Hinton Agar (OXOID CM 0337)
Bileşimi
Beef dehydrated infusion from
gr/L
30,0 gr
Casein hydrolysate
17,5 gr
Strach
1,5 gr
Agar
17 gr
Mueller hinton agar besiyeri içeriğine göre tartılıp 1000 ml distile su içinde
çözdürülür. 1210C’ de 15 dakika steril edilir.
Serum Fizyolojik
Bileşimi
gr/L
43
Sodyum chloride (NaCl)
9 gr
Distile su
1000 ml
Hazırlanan bileşim tüplere 1 ml olarak aktarılıp, 1210C’ de 15 dakika otoklavda steril
edilir. Bakteri kültürlerinden 0,5 Mc farland bulanıklığında tüplere inoküle edilir.
3.9.4. MRS broth’da gaz testi
MRS Broth ( LABM- LAB94)
Bileşimi
gr/L
Pepton
10 gr
Yeast extract
5 gr
Beef extract
10 gr
Glucose
20 gr
Di-potassium hydrogen phosphate
2 gr
Sodium asetate
5 gr
Tri amonium citrate
2 gr
Magnesium sulphate 7 H2O
0,02 gr
Manganase sulphate 4 H2O
0,05 gr
Tween 80
1,08 ml
Distile su
1000 ml
pH 6,2±0,2’ye ayarlanıp, içinde durham tüpü bulunan tüplere 9’ar ml taksim edilip,
1210C’de 15 dakika steril edilmiştir.
Steril öze ile inoküle edilen laktik asit kültürleri 370C’de 24 saat inkübasyona
bırakılır. İnkübasyon sonunda durham tüplerinde hava kabarcığının gözlenmesi gaz
(+) olarak değerlendirilmiştir (Resim 3.1).
44
gaz (+)
gaz (-)
Resim 3.1. MRS broth’da gaz testi
3.9.5. 100C ve 450C ‘ de üreme
Laktik asit bakterilerinin saf kültüründen Todd Hewit Broth’a ekim yapılmıştır.
Tüpler 100C’ de 7 gün, 450C ‘ de 1 gün inkübasyona bırakılmıştır. İnkübasyon
sonucunda bulanıklığın görülmesi pozitif reaksiyon olarak değerlendirilmiştir.
Todd Hewit Broth ( LABM LAB75)
Bileşimi
gr/L
Infusion from 450 gr fat-free minced meat
10 gr
Tryptone
20 gr
Sodium bicarbonate
2 gr
Sodium chloride
2 gr
Di-potasium phosphate
0,4 gr
Distile su
1000 ml
pH 7,4±0,2’ye ayarlanıp tüplere 5’er ml taksim edilip, 1210C’de 15 dakika steril
edilmiştir.
45
3.9.6. Arginin hidrolizi
Bileşimi
gr/L
Peptone
1 gr
Sodium chloride
5 gr
Di-potasium hydrogen phosphate
0,3gr
Agar
3 gr
Phenol red
0,01 gr
L- arginine monohydrochloride
10 gr
Distile su
1000 ml
pH 7,4±0,2’ye ayarlanıp tüplere 4’er ml taksim edilip, 1210C’de 15 dakika steril
edilmiştir [90].
Arginin hidrolizi için laktik bakteri kültürlerinden 3-4 koloni, hazırlanan tüplere
inoküle edilip, 370C’ de 24-48 saat inkübasyona bırakılmıştır. İnkübasyon sonunda
besiyerinin portakal sarıdan mor renge dönüşmesi arginin pozitif olarak
değerlendirilmiştir (Resim 3.2).
Resim 3.2. Arginin hidrolizi
Pembe-mor arginin (+) / Portakal sarı arginin (-)
46
3.9.7. Esculin hidrolizi
Bile Esculin Agar ( DIFCO 0879-17)
Bileşimi
gr/L
Esculin
1 gr
Ferrik citrate
0,5 gr
Peptone
10 gr
NaCl
5 gr
Distile su
1000 ml
1210C’de 15 dakika steril edilip, yaklaşık 25’er ml petri kutularına taksim edilmiştir.
Laktik kültürlerin esculin hidrolizi, çizgi ekim yöntemiyle inkübasyon sonunda
besiyerinde siyaha doğru renk değişikliği ile kontrol edilmiştir (resim 3.3).
Resim 3.3. Esculin hidrolizi - Siyah (+)
47
3.9.8. %6,5 NaCl’de üreme
Bileşimi
gr/L
Peptone
10 gr
Lab- Lemco powder
10 gr
Glucose
10 gr
NaCl
65 gr
Distile su
1000 ml
pH 7,4±0,2’ye ayarlanıp tüplere 5’er ml taksim edilip, 1210C’de 15 dakika steril
edilmiştir [93].
Laktik bakteri kültürleri %6,5 NaCl içeren tüplere inoküle edilerek 370C’ de 24-72
saat inkübasyona bırakılmıştır. İnkübasyon sonunda bulanıklığın gözlenmesi pozitif
reaksiyon olarak değerlendirilmiştir.
3.9.9. Karbonhidrat fermentasyon besiyeri
Purple Broth Base
Bileşimi
gr/L
Protease peptone
10 gr
Beef extract
1 gr
Sodium chloride
5 gr
Brom cresol purple
0,02 gr
Distile su
1000 ml
pH 6,8±0,2’ye ayarlanıp, tüplere 9 ml pipetlenerek 1210C’de 15 dakika steril
edilmiştir.
Bakterilerin biyoşimik testlerinde kullanılmak üzere hazırlanmış temel besiyeridir.
Besiyerinin rengi indikatör maddeden dolayı koyu menekşe rengindedir.
48
Karbonhidrat Solüsyonu
Laktoz, galaktoz, maltoz, rafinoz, sükroz, salisin, mannitol, ksiloz, sorbitol, arabinoz.
Karbonhidrat
1 gr
Distile su
10 ml
Yukarıda adı geçen şeker solüsyonları 0,2-0,45 µm’lik membran filtreleriyle steril
edilmiştir. Steril şeker solüsyonu steril pipetle 1 ml, daha önce hazırlanmış temel
besiyeri üzerine ilave edilmiştir. Şeker içeren besiyerine aktif bakteri kültüründen
ekim yapılıp 7 gün 370C’de inkübe edilmiştir. Şekeri kullanarak asit üreten bakteri
türleri tüplerdeki indikatör koyu menekşe rengini sarıya dönüştürdüğü gözlenmiştir
(Resim 3.4).
Mor (-)
Resim 3.4. Karbonhidrat hidrolizi
sarı (+)
49
4. BULGULAR
Araştırmamızda Nisan 2011-Mart 2012 tarihleri arasında Ankara ili çevresi ve çeşitli
illerden toplanan 30 çiğ süt örneğinden Lactobacillales takımına ait 74 izolat izole
edilip adlandırılmıştır. 74 Laktik asit bakteri izolatının Lactobacillaceae familyasına
ait
38’i
Lactobacillus
(%51,4),
17’si
Pediococcus
(%23)
cinsine
aittir.
Leuconostocaceae familyasına ait 8 Leuconostoc (%10,8) izolatı, Streptococcaceae
familyasına ait 5 Streptococcus (%6,8), 3 Lactococcus (%4) izolatı ve
Enterococcaceae familyasından 3 Enterococcus (%4) izolatı tespit edilmiştir (Çizelge
4.1 ve Şekil 4.1). Çiğ sütten izole edilen laktik asit bakterilerinin adlandırılmasında
cins ve tür özelliklerine göre biyokimyasal testler yapılmış ve Bergey’s Manual of
Systematic Bacteriology referansına
göre adlandırılmıştır. Tür seviyesinde
identifikasyonu yapılan laktik asit bakterilerinin proteaz, lipaz, elastaz, -amilaz,
hemolitik enzim aktiviteleri çalışılmıştır. Ayrıca bu izolatların bazı patojen
bakterilere karşı inhibitör etkisi araştırılmıştır.
Çizelge 4.1.Çiğ sütten izole edilen laktik asit bakterilerinin cinslere göre dağılımı
İzole Edilen Bakteri Cinsi
İzolat Sayısı
%
Lactobacillus
38
51,4
Pediococcus
17
23
Leuconostoc
8
10,8
Streptococcus
5
6,8
Lactococcus
3
4
Enterococcus
3
4
Toplam
74
100
50
Şekil 4.1. Çiğ sütten izole edilen laktik asit bakterilerinin cinslere göre dağılımı
Araştırmada, çeşitli illerden çiğ süt örnekleri toplanmıştır. Ankara’dan toplanan 13
adet çiğ süt örneğinden 37 izolat elde edilmiştir. 37 izolatın 18’i Lactobacillus, 8’i
Pediococcus, 5’i Leuconostoc, 5’i Streptococcus ve 1 Lactococcus cinsi olarak izole
edilmiştir. Burdur’dan toplanan 5 adet çiğ süt örneğinden 13 izolat elde edilmiştir. 13
izolatın 8’i Lactobacillus, 4’ü Pediococcus ve 1 Leuconostoc cinsi olarak izole
edilmiştir. Kırıkkale’den toplanan 4 adet çiğ süt örneğinden 8 izolat elde edilmiştir. 8
izolatın 3’ü Lactobacillus, 3’ü Enterococcus, 1 Pediococcus ve 1 Leuconostoc cinsi
olarak izole edilmiştir. Konya’dan toplanan 4 çiğ süt örneğinden 11 izolat elde
edilmiştir. 11 izolatın 5’i Lactbacillus, 4’ü Pediococcus, 1 Leuconostoc ve 1
Lactococcus cinsi olarak izole edilmiştir. Bursa’dan toplanan 4 çiğ süt örneğinden 5
izolat elde edilmiştir. 5 izolatın 4’ü Lactobacillus ve 1 Lactococcus cinsi olarak izole
edilmiştir. Bu durumda tür çeşitliliği bakımından en fazla olan il Ankara olarak tespit
edilmiştir. Laktik asit bakterileri arasında en fazla izole edilen cins ise Lactobacillus
olarak belirlenmiştir (Çizelge 4.2).
Çizelge 4.2. Çiğ süt örneklerinin toplandığı illerin cinslere göre dağılımı
Çiğ sütten izole
edilen örnekler
Lactobacillus
Pediococcus
Leuconostoc
Streptococcus
Lactococcus
Enterococcus
Toplam
Çiğ süt örneklerinin toplandığı iller
Ankara
Burdur
Kırıkkale
Konya
Bursa
Toplam
18
8
5
5
1
37
8
4
1
13
3
1
1
3
8
5
4
1
1
11
4
1
5
38
17
8
5
3
3
74
51
Çiğ sütten izole edilen laktik asit bakterilerinin tür dağılımları çizelge 4.3.’de
gösterilmektedir. İzole edilen laktik asit bakterileri; 10 Lactobacillus delbrueckii ssp.
lactis, 9 Lactobacillus casei, 6 Lb. rhamnosus, 5 Lb. acidophilus, 5 Lb. coryniformis
ssp. torquens, 3 Lb. plantarum ssp. plantarum, 9 Pediococcus pentosaceus, 6 P.
dextrinicus, 1 P. inopinatus, 1 P. acidilactici, 5 Leuconostoc mesenteroides ssp.
mesenteroides, 3 Leuconostoc mesenteroides ssp. dextranicum, 4 Streptococcus
lactis, 1 Streptococcus cremoris, 3 Lactococcus lactis ssp. lactis, 2 Enterococcus
faecalis ve 1 Enterococcus faecium olarak belirlenmiştir.
Çizelge 4.3. Çiğ sütten izole edilen laktik asit bakterilerinin türlere göre dağılımı
CİNSLER
LACTOBACİLLUS
LEUCONOSTOC
ENTEROCOCCUS
STREPTOCOCCUS
PEDİOCOCCUS
LACTOCOCCUS
TOPLAM
İZOLAT
SAYISI
%
Lb. delbrueckii ssp. lactis
10
13,5
Lactobacillus casei
9
12,2
Lactobacillus rhamnosus
6
8,2
Lactobacillus acidophilus
5
6,8
Lb. coryniformis ssp. torquens
5
6,8
Lb. plantarum ssp. plantarum
3
4
Leu. mesenteroides ssp. mesenteroides
5
6,8
Leu. mesenteroides ssp. dextranicum
3
4
Enterococcus faecalis
2
2,7
Enterococcus faecium
1
1,3
Streptococcus lactis
4
5,4
Streptococcus cremoris
1
1,3
Pediococcus pentosaceus
9
12,2
Pediococcus dextrinicus
6
8,2
Pediococcus inopinatus
1
1,3
Pediococcus acidilactici
1
1,3
Lactococcus lactis ssp. lactis
3
4
74
100
TÜRLER
İzole edilen laktik asit bakterilerinin %’lik dağılımı; %13,5 Lactobacillus delbrueckii
ssp. lactis, %12,2 Lactobacillus casei, %8,2 Lactobacillus rhamnosus, %6,8
Lactobacillus acidophilus, %6,8 Lb. coryniformis ssp. torquens, %4 Lb. plantarum
52
ssp. plantarum,
%6,8 Leu. mesenteroides ssp. mesenteroides, %4 Leu.
mesenteroides ssp. dextranicum, %2,7 Enterococcus faecalis, %1,3 Enterococcus
faecium, %5,4 Streptococcus lactis, %1,3 Streptococcus cremoris, %12,2
Pediococcus pentosaceus, %8,2 Pediococcus dextrinicus, %1,3 Pediococcus
inopinatus, %1,3 Pediococcus acidilactici, %4 Lactococcus lactis ssp. lactis olarak
tespit edilmiştir (Şekil 4.2).
Şekil 4.2. Çiğ sütten izole edilen laktik asit bakterilerinin tür sayısına göre dağılımı
Çiğ sütten izole edilen 38 Lactobacillus bakterisi; 10’u(%26,3) Lactobacillus
delbrueckii ssp. lactis, 9’u(%23,7) Lactobacillus casei, 6’sı(%15,8) Lb. rhamnosus,
5’i(%13,1) Lb. acidophilus, 5’i(%13,1) Lb. coryniformis ssp. torquens, 3’ü(%8) Lb.
plantarum ssp. plantarum olarak tanımlanmıştır. Lactobacillus bakterilerinin tür
dağılımı şekil 4.3.’te gösterilmektedir.
53
Şekil 4.3. İzole edilen Lactobacillus türlerinin %’lik dağılımı
Çiğ sütten izole edilen 17 Pediococcus bakterisi; 9’u (%52,9) Pediococcus
pentosaceus, 6’sı (%35,3) Pediococcus dextrinicus, 1’i (%5,9) Pediococcus
inopinatus, 1’i (%5,9) Pediococcus acidilactici olarak tanımlanmıştır. (şekil 4.4.)
Şekil 4.4. İzole edilen Pediococcus türlerinin %’lik dağılımı
54
Çiğ sütten izole edilen 8 Leuconostoc bakterisi; 5’i (%62,5) Leu. mesenteroides ssp.
mesenteroides, 3’ü ( %37,5) Leu. mesenteroides ssp. dextranicum olarak
tanımlanmıştır. Şekil 4.5.’ te gösterilmektedir.
Şekil 4.5. İzole edilen Leuconostoc türlerinin %’lik dağılımı
Çiğ sütten izole edilen Streptococcus cinsi 5 izolatın; 4 (%80)’ ü Streptococcus lactis
ve 1 (%20)’ i Streptococcus cremoris olarak adlandırılmıştır. (Şekil 4.6.)
Şekil 4.6. İzole edilen Streptococcus türlerinin %’lik dağılımı
Ayrıca Enterococcus cinsine ait toplam 3 izolatın 2 (%66,6)’ si Enterococcus
faecalis ve 1 (%33,3)’ i Enterococcus faecium olarak tanımlanmış ve toplam 3
(%100) izolat Lactococcus lactis ssp. lactis türü izole edilip adlandırılmıştır.
55
4.1. Laktik Asit Bakterilerinin Proteolitik Enzim Aktivitelerinin
Değerlendirilmesi
4.1.1. Proteaz enzim varlığının araştırılması
Araştırmada, çiğ sütten izole edilen 74 laktik bakteri izolatının Calsiyum Kazeinat
Agar’ da 370C’de proteolitik aktiviteleri çalışılarak, Proteaz enzim aktivite zon çapları
belirlenmiştir.
Toplam 74 izolatın 70 (%94,6) ‘inde proteolitik aktivite gözlenirken, 4 (%5,4)
izolatta proteolitik aktivite gözlenmemiştir.
Laktik asit bakterilerinin proteolitik aktiviteleri cins bazında değerlendirildiğinde
izole edilen Lactobacillus, Leuconostoc, Pediococcus, Lactococcus, Streptococcus ve
Enterococcus cinsinin proteolitik aktivite gösterdiği tespit edilmiştir (Çizelge 4.4).
Çizelge 4.4. Proteolitik enzim aktivitesi araştırılan Laktik asit bakterilerinin
kalsiyum kazeinat agar da oluşturdukları zon çaplarının değerleri
İzolat
no
M1
M2
M3
M4
M5
M6
M7
M8
M9
M10
M11
M12
M13
M14
M15
M16
M17
M18
M19
M20
M21
M22
M23
M24
M25
Tür ismi
Lactobacillus casei
Lb. rhamnosus
Leu. mesenteroides ssp. dextranicum
Enterococcus faecalis
Lactobacillus casei
Lb. delbrueckii ssp. lactis
Enterococcus faecalis
Lb. rhamnosus
Leu. mesenteroides ssp. mesenteroides
Pediococcus pentosaceus
Pediococcus dextrinicus
Lb. plantarum ssp. plantarum
Lb. delbrueckii ssp. lactis
Lactobacillus casei
Lb. rhamnosus
Lactococcus lactis ssp. lactis
Lactobacillus casei
Lb. rhamnosus
Lactobacillus casei
Lb. coryniformis ssp. torquens
Lactococcus lactis ssp. lactis
Lactococcus lactis ssp. lactis
Leu. mesenteroides ssp. mesenteroides
Leu. mesenteroides ssp. mesenteroides
Leu. mesenteroides ssp. dextranicum
Proteaz enzim
aktivite zon çapı
(mm)
5
4
8
3
3
4
5
5
6
6
4
4
5
5
7
7
6
5
5
6
8
7
6
5
6
56
Çizelge 4.4. (Devam) Proteolitik enzim aktivitesi araştırılan Laktik asit bakterilerinin
kalsiyum kazeinat agar da oluşturdukları zon çaplarının değerleri
İzolat
no
M26
M27
M28
M29
M30
M31
M32
M33
M34
M35
M36
M37
M38
M39
M40
M41
M42
M43
M44
M45
M46
M47
M48
M49
M50
M51
M52
M53
M54
M55
M56
M57
M58
M59
M60
M61
M62
M63
M64
M65
M66
M67
M68
M69
M70
M71
M72
M73
M74
Tür ismi
Lb. plantarum ssp. plantarum
Lactobacillus casei
Pediococcus pentosaceus
Lb. coryniformis ssp. torquens
Enterococcus faecium
Lb. coryniformis ssp. torquens
Lb. delbrueckii ssp. lactis
Pediococcus pentosaceus
Lactobacillus acidophilus
Pediococcus pentosaceus
Lb. delbrueckii ssp. lactis
L. coryniformis ssp. torquens
Pediococcus inopinatus
Lb. delbrueckii ssp. lactis
Pediococcus dextrinicus
Lactobacillus acidophilus
Pediococcus dextrinicus
Pediococcus pentosaceus
Streptococcus cremoris
Lb. rhamnosus
Leu. mesenteroides ssp. mesenteroides
Pediococcus dextrinicus
Lb. plantarum ssp. plantarum
Lactobacillus acidophilus
Lb. delbrueckii ssp. lactis
Pediococcus dextrinicus
Pediococcus pentosaceus
Lb. delbrueckii ssp. lactis
Leu. mesenteroides ssp. mesenteroides
Leu. mesenteroides ssp. dextranicum
Lb. coryniformis ssp. torquens
Pediococcus acidilactici
Lb. rhamnosus
Streptococcus lactis
Lactobacillus acidophilus
Lb. delbrueckii ssp. lactis
Pediococcus pentosaceus
Pediococcus pentosaceus
Lactobacillus casei
Streptococcus lactis
Pediococcus pentosaceus
Lb. delbrueckii ssp. lactis
Pediococcus dextrinicus
Lactobacillus casei
Streptococcus lactis
Lactobacillus acidophilus
Lactobacillus casei
Streptococcus lactis
Lb. delbrueckii ssp. lactis
Proteaz enzim
aktivite zon çapı
(mm)
3
6
5
6
5
5
6
8
6
5
6
7
2
5
6
6
6
6
5
4
5
5
5
7
5
5
6
5
6
7
5
7
7
6
6
4
4
5
6
5
5
5
4
4
5
6
4
6
6
4mm (-) / 4-5mm: zayıf (+) / 6-8mm: orta kuvvetli (++) / 11mm ≥ kuvvetli (+++)
57
Araştırmada izole edilen Lactobacillus cinsine ait toplam 38 bakteri suşunun 20
(%52,6)’ sinde zayıf (+) proteolitik aktivite gözlenirken, 16 (%42,1)’ sında orta
kuvvetli (++) proteolitik aktivite gözlenmiştir ve 2 (%5,3) laktobasil izolatında
proteolitik aktivite gözlenmemiştir. İzole edilen 8 Leuconostoc cinsi izolatın 6
(%75)’ sında orta kuvvetli (++) proteolitik aktivite gözlenirken, 2 (%25)’ sinde zayıf
(+) proteolitik aktivite gözlenmiştir. Pediococcus cinsine ait 17 bakteri suşundan 7
(%41,2)’ sinde orta kuvvetli (++) proteolitik aktivite gözlenirken, 9 (%52,9) izolatta
zayıf (+) proteolitik aktivite gözlenmiştir ve 1 (%5,9) izolatta aktivite
gözlenmemiştir. 5 Streptococcus cinsi izolatın 2 (%40)’ sinde orta kuvvetli (++)
proteolitik aktivite gözlenirken, 3 (%60)’ ünde zayıf (+) proteolitik aktivite
gözlenmiştir. 3 Enterococcus cinsi izolatın 2 (%66,6)’sinde zayıf (+) proteolitik
aktivite gözlenirken, 1 (%33,3) izolatta aktivite gözlenmemiştir ve izole edilen
Lactococcus lactis ssp. lactis suşuna ait toplam 3 izolatın 3 (%100)’ ünde de orta
kuvvetli (++) proteolitik aktivite gözlenmiştir (Çizelge 4.5 ve Şekil 4.7).
Çizelge 4.5. Proteolitik enzim aktivitesi gösteren laktik bakteri
izolatlarının cinslere göre dağılımı
Laktik Bakteri
Cinsleri
Lactobacillus
Pediococcus
Leuconostoc
Streptococcus
Enterococcus
Lactococcus
Toplam
Zayıf(+)
Orta(++)
Toplam
izolat
sayısı
20
9
2
3
2
36
16
7
6
2
3
34
36
16
8
5
2
3
70
Proteolitik Aktivite
58
Şekil 4.7. Proteolitik aktivite gösteren laktik bakteri izolatlarının cinslere
göre dağılımı
Proteolitik aktivite gösteren 70 izolatın 36 (%51,4) ’sında zayıf (+) proteolitik
aktivite gözlenirken, 34 (%48,6)’ ünde orta kuvvetli aktivite gözlenmiştir. Laktik asit
bakteri türlerinden 5 Lb. acidophilus, 3 Leu. mesenteroides ssp. dextranicum ve 3
Lactococcus lactis ssp. lactis suşlarının izole edilen bütün suşlarında orta kuvvetli
proteolitik aktivite tespit edilmiştir. 8 mm’lik zon çapı ile en yüksek proteolitik
aktivite; Lactococcus lactis ssp. lactis, Leu. mesenteroides ssp. dextranicum ve
Pediococcus pentosaceus türlerine ait suşlarda olduğu gözlenmiştir. Resim 4.1 de
zon çaplarının değerlendirilmesine ait örnek görülmektedir.
Resim 4.1. Calsium caseinate agarda proteolitik zon çapları
59
4.1.2. Elastaz enzim varlığının araştırılması
Çalışmada, çiğ sütten izole edip adlandırdığımız laktik asit bakterilerinin Elastinli
Nutrient Agar da elastaz enziminin varlığı araştırılmıştır. Laktik bakteri
kültürlerinden çizgi ekimi yapılan elastinli nuttrient agar da ekim bölgelerinde şeffaf
zonların görülmesi beklenmiştir. Ancak 74 laktik asit bakteri suşunun hiç birisinde
şeffaf zon çapı gözlenememiştir. Araştırmamızda izole edilen Lactobacillus,
Pediococcus, Leuconostoc, Streptococcus, Lactococcus ve Enterococcus cinsi laktik
asit bakterilerinin elastaz enzim aktivitelerinin olmadığı gözlenmiştir (Resim 4.2).
Resim 4.2. Elastinli nutrient agar da elastaz enzimi varlığı
Elastaz (-)
4.2. Laktik Asit Bakterilerinin Lipolitik ve -Amilaz Enzim Aktivitelerinin
Değerlendirilmesi
Araştırmada çiğ sütten izole edilen 74 laktik asit bakterisinin Tributyrin Agar’ da
lipolitik aktiviteleri ve Luria Bertani-nişasta agar da -amilaz enzim aktiviteleri
çalışılmıştır.
74 laktik asit bakterisinin Tributyrin agar da lipolitik zon çapı ölçümleri
değerlendirilmiştir. 12 laktik bakteri suşunda zon çapı gözlenmiştir. 2 Lb.
acidophilus, 2 Lb. delbrueckii ssp. lactis, 2 P. pentosaceus, 2 P. dextrinicus, 2 Leu.
mesenteroides ssp. mesenteroides ve 1 E. faecalis türünde lipolitik zon çapı 2 mm
60
olarak ölçülmüştür. Bununla beraber 1 Leu. mesenteroides ssp. dextranicum suşunda
lipolitik zon çapı 4 mm olarak kaydedilip, lipolitik aktivite gösterdiği kabul
edilmiştir. Zon çapları 2 mm ve 4 mm olarak ölçülen laktik bakteri suşları Çizelge
4.6.’da gösterilmektedir.
Çizelge 4.6. Lipolitik enzim aktivitesi gözlenen laktik bakteri türlerinde lipaz
aktivite zon çapları (mm)
Cins ismi
Lactobacillus
Pediococcus
Leuconostoc
Enterococcus
Lipaz
enzim
İzolat
no
M49
M60
M39
M74
M10
M43
M11
M40
M9
M54
M25
M4
akivitesi
Tür ismi
Lb. acidophilus
Lb. acidophilus
Lb. delbrueckii ssp.lactis
Lb. delbrueckii ssp.lactis
P. pentosaceus
P. pentosaceus
P. dextrinicus
P. dextrinicus
L. mesenteroides ssp. mesenteroides
L. mesenteroides ssp. mesenteroides
L. mesenteroides ssp. dextranicum
E. faecalis
araştırılan
laktik
asit
Lipaz enzim
aktivite zon
çapı(mm)
2 mm
2 mm
2 mm
2 mm
2 mm
2 mm
2 mm
2 mm
2 mm
2 mm
4 mm
2 mm
bakterileri
cins
bazında
değerlendirildiğinde; Lactobacillus, Pediococcus, Leuconostoc ve Enterococcus
cinslerinde lipolitik enzim zon çapları gözenirken, Streptococcus ve Lactococcus
cinslerinde lipolitik enzim zon çapları gözlenmemiştir. 4 mm’lik zon çapıyla Leu.
mesenteroides ssp. dextranicum türünün bir suşunda lipolitik aktivite tespit
edilmiştir.
Çiğ sütten izole edilen laktik bakteri suşlarının Luria Bertani- nişasta agar da amilaz enzim aktiviteleri araştırılmıştır. 74 laktik asit bakterisinin 6 izolatında amilaz enzim varlığı tespit edilmiştir. -amilaz enzim aktivitesi Lactobacillus,
Pediococcus ve Leuconostoc cinslerinde gözlenirken, Streptococcus, Lactococcus ve
Enterococcus cinslerinde gözlenmemiştir. -amilaz enzim aktivitesi gözlenen laktik
bakteri türleri Çizelge 4.7.’de gösterilmiştir.
61
Çizelge 4.7. Laktik asit bakterilerinde -Amilaz enzim aktivitesi
Cins ismi
Lactobacillus
Pediococcus
Leuconostoc
İzolat
no
M26
M27
M56
M28
M33
M55
Tür ismi
Lb. plantarum ssp. plantarum
Lb. casei
Lb. coryniformis ssp. torquens
Pediococcus pentosaceus
Pediococcus pentosaceus
Leu. mesenteroides ssp. dextranicum
-Amilaz
enzim
aktivitesi
+
+
+
+
+
+
Laktik asit bakterilerinden -Amilaz enzim aktivitesi pozitif olan suşlar;
Lactobacillus cinsine ait 1 Lb. plantarum ssp. plantarum, 1 Lb. casei, 1 Lb.
coryniformis ssp. torquens olarak tespit edilmiştir. Pediococcus cinsinden 2
Pediococcus pentosaceus suşunda -amilaz enzim aktivitesi vardır. Leuconostoc
cinsinden 1 Leu. mesenteroides ssp. dextranicum da -amilaz enzim aktivitesi
belirlenmiştir. Resim 4.3 de -amilaz enzim aktivitesinin pozitif olduğu bir örnek
görülmektedir.
Resim 4.3. Luria Bertani-nişasta agar da -Amilaz enzim varlığı
62
Çiğ sütten izole edilip adlandırılan laktik asit bakterilerinin lipolitik ve -amilaz
enzim aktiviteleri değerlendirilmiştir. Lipaz ve -amilaz enzim zon çapları
gözlenmiştir. Tür seviyesinde bakıldığında hem lipaz hem -amilaz enzim aktivitesi
gördüğümüz örnekler olmuştur. Leu. mesenteroides ssp. dextranicum ve Pediococcus
pentosaceus türlerinde lipaz ve -amilaz enzim aktivitesi belirlenmiştir. Farklı suş
olmalarına rağmen aynı türde hem lipaz hem -amilaz enzim aktivitesi tespit
edilmiştir. Çizelge 4.8.’de laktik bakteri suşlarının lipolitik zon çapları ve -amilaz
aktiviteleri gösterilmektedir.
Çizelge 4.8. Çiğ sütten izole edilen laktik asit bakterilerinin lipoliz zon çapları
ve -Amilaz enzim aktiviteleri
İzolat
no
M1
M2
M3
M4
M5
M6
M7
M8
M9
M10
M11
M12
M13
M14
M15
M16
M17
M18
M19
M20
M21
M22
M23
M24
M25
M26
M27
M28
M29
Tür ismi
Lactobacillus casei
Lb. rhamnosus
Leu. mesenteroides ssp. dextranicum
Enterococcus faecalis
Lactobacillus casei
Lb. delbrueckii ssp. lactis
Enterococcus faecalis
Lb. rhamnosus
Leu. mesenteroides ssp. mesenteroides
Pediococcus pentosaceus
Pediococcus dextrinicus
Lb. plantarum ssp. plantarum
Lb. delbrueckii ssp. lactis
Lactobacillus casei
Lb. rhamnosus
Lactococcus lactis ssp. lactis
Lactobacillus casei
Lb. rhamnosus
Lactobacillus casei
Lb. coryniformis ssp. torquens
Lactococcus lactis ssp. lactis
Lactococcus lactis ssp. lactis
Leu. mesenteroides ssp. mesenteroides
Leu. mesenteroides ssp. mesenteroides
Leu. mesenteroides ssp. dextranicum
Lb. plantarum ssp. plantarum
Lactobacillus casei
Pediococcus pentosaceus
Lb. coryniformis ssp. torquens
Lipaz enzim
aktivite zon
çapı(mm)
-Amilaz
enzim
aktivitesi
2
2
2
2
4
+
+
+
63
Çizelge 4.8. (Devam) Çiğ sütten izole edilen laktik asit bakterilerinin lipoliz
zon çapları ve -Amilaz enzim aktiviteleri
İzolat
no
M30
M31
M32
M33
M34
M35
M36
M37
M38
M39
M40
M41
M42
M43
M44
M45
M46
M47
M48
M49
M50
M51
M52
M53
M54
M55
M56
M57
M58
M59
M60
M61
M62
M63
M64
M65
M66
M67
M68
M69
M70
M71
M72
M73
M74
Tür ismi
Enterococcus faecium
Lb. coryniformis ssp. torquens
Lb. delbrueckii ssp. lactis
Pediococcus pentosaceus
Lactobacillus acidophilus
Pediococcus pentosaceus
Lb. delbrueckii ssp. lactis
Lb. coryniformis ssp. torquens
Pediococcus inopinatus
Lb. delbrueckii ssp. lactis
Pediococcus dextrinicus
Lactobacillus acidophilus
Pediococcus dextrinicus
Pediococcus pentosaceus
Streptococcus cremoris
Lb. rhamnosus
Leu. mesenteroides ssp. mesenteroides
Pediococcus dextrinicus
Lb. plantarum ssp. plantarum
Lactobacillus acidophilus
Lb. delbrueckii ssp. lactis
Pediococcus dextrinicus
Pediococcus pentosaceus
Lb. delbrueckii ssp. lactis
Leu. mesenteroides ssp. mesenteroides
Leu. mesenteroides ssp. dextranicum
Lb. coryniformis ssp. torquens
Pediococcus acidilactici
Lb. rhamnosus
Streptococcus lactis
Lactobacillus acidophilus
Lb. delbrueckii ssp. lactis
Pediococcus pentosaceus
Pediococcus pentosaceus
Lactobacillus casei
Streptococcus lactis
Pediococcus pentosaceus
Lb. delbrueckii ssp. lactis
Pediococcus dextrinicus
Lactobacillus casei
Streptococcus lactis
Lactobacillus acidophilus
Lactobacillus casei
Streptococcus lactis
Lb. delbrueckii ssp. lactis
Lipaz enzim
aktivite zon
çapı(mm)
-Amilaz
enzim
aktivitesi
+
2
2
2
2
2
+
+
2
2
64
4.3. Laktik Asit Bakterilerinde Hemolitik Enzim Aktivitelerinin
Değerlendirilmesi
Çalışmada çiğ sütten izole edilen laktik asit bakterilerinin hemolitik aktivitesi kanlı
agar da araştırılmıştır (Resim 4.4).
74 laktik asit bakterisinin Streptococcus, Lactococcus ve Enterococcus cinsine ait 5
izolatta hemolitik aktivite gözlenirken 69 izolatta hemolitik aktivite gözlenmemiştir.
Hemolitik aktivite gösteren 5 izolatın 2 (%40)’ si Streptococcus lactis, 2 (%40)’ si
Lactococcus lactis ssp. lactis ve 1 (%20) izolatın Enterococcus faecium türüne ait
olduğu tespit edilmiştir. Çizelge 4.9.’da hemolitik aktivite gösteren laktik bakteri
türleri gösterilmiştir.
Çizelge 4.9. Hemolitik enzim aktivitesi gösteren laktik asit bakterilerinin
türlere göre dağılımı
Cins ismi
Streptococcus
Enterococcus
Lactococcus
İzolat
no
M65
M70
M44
M30
M16
M21
Tür ismi
Streptococcus lactis
Streptococcus lactis
Streptococcus cremoris
Enterococcus faecium
Lactococcus lactis ssp. lactis
Lactococcus lactis ssp. lactis
Hemolitik
enzim
aktivitesi
+
+
+
+
+
Resim 4.4. Kanlı agarda laktik asit bakterilerinin hemolitik aktivitesi
65
4.4. Laktik Asit Bakterilerinin Bazı Patojen Bakteriler Üzerine İnhibitör
Etkilerinin Değerlendirilmesi
Araştırmada laktik asit bakterilerinin bazı patojen bakterilere karşı, Nutrient Agar da
agar kuyu difüzyon yöntemiyle inhibitör etkileri incelenmiştir.
Laktik asit bakterilerinden 6 Lactobacillus, 4 Pediococcus, 2 Leuconostoc, 2
Streptococcus, 2 Enterococcus ve 1 Lactococcus suşu toplam 17 laktik bakteri
türünün patojen bakteriler üzerine inhibitör etkisi araştırılmıştır. Bu patojenler
Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes, Klebsiella pneumoniae, E. coli ve
Salmonella typhimurium türleridir.
Laktik bakteri suşlarının indikatör bakterilere inhibisyon etkileri nutrient agar ve
%0,2 glikoz ilave edilmiş nutrient agarda çalışılmıştır. Laktik asit bakterilerinin
patojen bakteriler üzerindeki inhibitör etkisi, inhibisyon zon çapları ölçülerek
değerlendirilmiştir.
4.4.1. Laktik asit bakterilerinin Staphylococcus aureus üzerine inhibitör
etkilerinin değerlendirilmesi
Lactobacillus türlerinin S. aureus üzerine inhibitör etkisi
Lactobacillus cinsi; Lactobacillus delbrueckii ssp. lactis, Lactobacillus casei, Lb.
rhamnosus, Lb. acidophilus, Lb. coryniformis ssp. torquens ve Lb. plantarum ssp.
plantarum türlerinin Nutrient Agarda indikatör S. aureus üzerine inhibisyon zon
çapları 2 mm ve 10 mm, %0,2 glikozlu Nutrient Agarda 6 mm ve 12 mm olarak
ölçülmüştür. Lactobacillusların S. aureus üzerine etkisi her iki ortamdaki zon çapları
ölçülerek karşılaştırılması yapılmıştır. Çizelge 4.10 ve Şekil 4.8’ de gösterilmiştir.
66
Çizelge 4.10. Lactobacillus türlerinin indikatör S. aureus üzerine
oluşturdukları zon çapları
Suş
no
M36
M19
M34
M58
M37
M48
Lactobacillus
Türleri
Lb. delbrueckii ssp. lactis
Lb. casei
Lb. acidophilus
Lb. rhamnosus
Lb. coryniformis ssp. tourquens
Lb. plantarum ssp. plantarum
%0,2 glikozlu
Nutrient agar
nutrient agar
İnhibisyon zon
inhibisyon zon
çapı(mm)
çapı(mm)
S. aureus
S. aureus
8
10
6
2
10
8
12
10
8
6
10
10
Şekil 4.8. Lactobacillus türlerinin nutrient agar ve %0,2 glikozlu nutrient agarda
S. aureus üzerine inhibisyon zon çaplarının karşılaştırılması
Lactobacillusların glikoz ilave edilen besiyeri ortamında S. aureus’u etkileyen
inhibisyon zon çapı daha büyük gözlenmiştir. Bu koşullarda Lb. delbrueckii ssp.
lactis 12 mm ile en büyük zon çapına sahiptir. Glikozlu ortamda en düşük etki 6 mm
zon çapıyla Lb. rhamnosus suşunda gözlenmiştir. Sonuç olarak Laktobasiller
S.aureus üzerine etkili bulunmuştur.
67
Pediococcus türlerinin S. aureus üzerine inhibitör etkisi
Pediococccus cinsi; Pediococcus inopinatus, Pediococcus acidilactici, Pediococcus
dextrinicus ve Pediococcus pentosaceus türü test bakterilerinin indikatör S. aureus
üzerine inhibitör etkilerine bakılmıştır. Nutrient Agarda S. aureus üzerine zon çapları
4-6 mm, glikoz ilave edilmiş Nutrient Agarda 6-8 mm olarak ölçülmüştür.
Pediococcus türlerinin S. aureus üzerine etkisi her iki ortamdaki zon çapları
ölçülerek karşılaştırılmıştır. Çizelge 4.11. ve Şekil 4.9.’da Pediococcus bakterilerinin
S. aureus üzerine oluşturdukları zon çapı ölçümleri gösterilmiştir.
Çizelge 4.11.Pediococcus türlerinin indikatör S. aureus üzerine oluşturdukları
zon çapları
Suş no
M38
M57
M40
M10
Pediococcus
Türleri
Pediococcus inopinatus
Pediococcus acidilactici
Pediococcus dextrinicus
Pediococcus pentosaceus
Nutrient agar
İnhibisyon zon
çapı(mm)
%0,2 glikozlu
nutrient agar
inhibisyon zon
çapı(mm)
S. aureus
S. aureus
4
6
6
4
6
8
8
6
Şekil 4.9. Pediococcus türlerinin nutrient agar ve %0,2 glikozlu nutrient agarda
S. aureus üzerine inhibisyon zon çaplarının karşılaştırılması
68
Pediococcus türlerinin S. aureus üzerine inhibitör etkisi %0,2 glikoz ilave edilmiş
Nutrient besiyeri ortamında daha yüksek oranda tespit edilmiştir. Glikozlu ortamda 8
mm zon çapı ile Pediococcus acidilactii ve P. dextrinicus S. aureus üzerine en
yüksek etkiyi göstermiştir. P. inopinatus ve P. pentosaceus türlerinin zon çapları ise
6 mm olarak ölçülmüştür. Sonuç olarak Pediococcus suşlarının S. aureus üzerine
etkili olduğu tespit edilmiştir.
Leuconostoc türlerinin S. aureus üzerine inhibitör etkisi
S. aureus bakterisine karşı inhibitör etkisi incelen Leu. mesenteroides ssp.
dextranicum ve Leu. mesenteroides ssp. mesenteroides suşlarının nutrient agarda zon
çapları 8 mm ve 9 mm olarak ölçülmüştür. %0,2 glikoz ilave edilmiş nutrient agarda
her iki suşun zon çapları 12 mm olarak belirlenmiştir. Çizelge 4.12. ve Şekil 4.10 da
her iki ortamdaki zon çapı ölçümleri gösterilmiştir.
Çizelge 4.12. Leuconostoc türlerinin indikatör S. aureus üzerine oluşturdukları
zon çapları
Suş no
M55
M25
Leuconostoc
Türleri
Leu. mesenteroides ssp. dextranicum
Leu. mesenteroides ssp. mesenteroides
Nutrient agar
İnhibisyon zon
çapı(mm)
S. aureus
8
9
%0,2 glikozlu
nutrient agar
inhibisyon zon
çapı(mm)
S. aureus
12
12
Şekil 4.10. Leuconostoc türlerinin nutrient agar ve %0,2 glikozlu nutrient
agarda S. aureus üzerine inhibisyon zon çaplarının karşılaştırılması
69
Glikoz ilave edilmiş ortamda Leu. mesenteroides ssp. dextranicum ve Leu.
mesenteroides ssp. mesenteroides suşlarının S. aureus üzerindeki inhibisyon zon
çapları 12 mm olarak ölçülmüştür. Sonuç olarak Leuconostoc suşlarının S. aureus’a
inhibitör etki gösterdiği tespit edilmiştir.
Streptococcus türlerinin S. aureus üzerine inhibitör etkisi
Streptococcus cinsi: Streptococcus lactis, Streptococcus cremoris ve Lactococcus
lactis ssp. lactis türlerinin S. aureus üzerine inhibitör etkisi nutrient agar ve glikozlu
nutrient agarda incelenmiştir. Nutrient agarda zon çapları 4 mm ve 8 mm olarak,
glikozlu nutrient agarda 6 mm ve 10 mm olarak ölçülmüştür. Streptococusların
indikatör S. aureus’a inhibitör etkisi her iki ortamda zon çapları ölçülerek
karşılaştırılması yapılmıştır. Çizelge 4.13. ve Şekil 4.11 de gösterilmiştir.
Çizelge 4.13. Streptococcus türlerinin indikatör S. aureus üzerine oluşturdukları
zon çapları
Suş no
M59
M44
M21
Streptococcus
Türleri
Streptococcus lactis
Streptococcus cremoris
Lactococcus lactis ssp. lactis
Nutrient agar
İnhibisyon zon
çapı(mm)
S. aureus
4
6
8
%0,2 glikozlu
nutrient agar
inhibisyon zon
çapı(mm)
S. aureus
6
6
10
Şekil 4.11. Streptococcus türlerinin nutrient agar ve %0,2 glikozlu nutrient
agarda S. aureus üzerine inhibisyon zon çaplarının karşılaştırılması
70
%0,2 glikoz ilave edilmiş Nutrient Agarda zon çapları daha yüksek gözlenmiştir. 10
mm zon çapıyla L. lactis ssp. lactis suşu S. aureus üzerine en yüksek inhibitör etkiyi
göstermiştir. Streptococcus lactis ve Streptococcus cremoris glikozlu ortamda S.
aureus üzerine zon çapları 6 mm olarak belirlenmiştir.
Enterococcus türlerinin S. aureus üzerine inhibitör etkisi
Enterococcus faecalis ve Enterococcus faecium suşlarının S. aureus üzerine inhibitör
etkisi incelenmiştir. Nutrient Agarda Enterococcus suşlarının zon çapları 2 mm, %0,2
glikoz ilave edilmiş Nutrient Agarda 4 mm ve 7 mm olarak ölçülmüştür.
Enterococcus türlerinin S. aureus’a etkisi her iki ortamdaki zon çapları ölçülerek
karşılaştırılmıştır. Zon çapı ölçümleri Çizelge 4.14. ve Şekil 4.12. de gösterilmiştir.
Çizelge 4.14. Enterococcus türlerinin indikatör S. aureus üzerine oluşturdukları
zon çapları
Suş no
M4
M30
Enterococcus
Türleri
Enterococcus faecalis
Enterococcus faecium
Nutrient agar
İnhibisyon zon
çapı(mm)
S. aureus
2
2
%0,2 glikozlu
nutrient agar
inhibisyon zon
çapı(mm)
S. aureus
4
7
Şekil 4.12. Enterococcus türlerinin nutrient agar ve %0,2 glikozlu nutrient agarda
S. aureus üzerine inhibisyon zon çaplarının karşılaştırılması
71
Glikoz ilave edilmiş ortamda S. aureus üzerine en yüksek etkiyi 7 mm zon çapıyla
Enterococcus faecium göstermiştir. Enterococcus faecalis’in zon çapı ise 4 mm
olarak ölçülmüştür. Sonuç olarak Enterococcus suşları S. aureus üzerine etkili
bulunmuştur.
4.4.2. Laktik asit bakterilerinin Listeria monocytogenes üzerine inhibitör
etkilerinin değerlendirilmesi
Lactobacillus türlerinin L. monocytogenes üzerine inhibitör etkisi
Lactobacillus cinsi; Lactobacillus delbrueckii ssp. lactis, Lactobacillus casei, Lb.
rhamnosus, Lb. acidophilus, Lb. coryniformis ssp. torquens ve Lb. plantarum ssp.
plantarum türlerinin Nutrient Agarda indikatör L. monocytogenes üzerine inhibisyon
zon çapları 8 mm ve 12 mm, %0,2 glikozlu Nutrient Agarda 10 mm ve 18 mm olarak
ölçülmüştür. Lactobacillusların L. monocytogenes üzerine etkisi her iki ortamdaki
zon çapları ölçülerek karşılaştırılması yapılmıştır. Çizelge 4.15 ve Şekil 4.13’ de
gösterilmiştir.
Çizelge 4.15. Lactobacillus türlerinin indikatör L. monocytogenes üzerine
oluşturdukları zon çapları
Suş no
M36
M19
M34
M58
M37
M48
Lactobacillus
Türleri
Lb. delbrueckii ssp. lactis
Lb. casei
Lb. acidophilus
Lb. rhamnosus
Lb. coryniformis ssp. tourquens
Lb. plantarum ssp. plantarum
Nutrient agar
İnhibisyon zon
çapı(mm)
L.monocytogenes
12
12
8
12
8
10
%0,2 glikozlu
nutrient agar
inhibisyon zon
çapı(mm)
L.monocytogenes
18
16
12
16
10
12
72
Şekil 4.13. Lactobacillus türlerinin nutrient agar ve %0,2 glikozlu nutrient agarda L.
monocytogenes üzerine inhibisyon zon çaplarının karşılaştırılması
Yapılan ölçümlerde, %0,2 glikoz ilave edilmiş Nutrient besiyerinde zon çapları daha
yüksek gözlenmiştir. Glikozlu ortamda indikatör L. monocytogenes üzerinde 18 mm
zon çapıyla Lactobacillus delbrueckii ssp. lactis en yüksek etkiyi oluşturmuştur. Lb.
coryniformis ssp. tourquens suşu ise 10 mm zon çapıyla L. monocytogenes üzerinde
en düşük etkiye sahip olduğu tespit edilmiştir.
Pediococcus türlerinin L. monocytogenes üzerine inhibitör etkisi
Pediococccus cinsi; Pediococcus inopinatus, Pediococcus acidilactici, Pediococcus
dextrinicus ve Pediococcus pentosaceus türü test bakterilerinin indikatör L.
monocytogenes üzerine etkisi Nutrient Agarda zon çapları 6-8 mm, glikoz ilave
edilmiş Nutrient Agarda 10-14 mm olarak ölçülmüştür. Pediococcus türlerinin L.
monocytogenes
üzerine
etkisi
her
iki
ortamdaki
zon
çapları
ölçülerek
karşılaştırılmıştır. Çizelge 4.16. ve Şekil 4.14.’de Pediococcus bakterilerinin L.
monocytogenes üzerine oluşturdukları zon çapı ölçümleri gösterilmiştir.
73
Çizelge 4.16. Pediococcus türlerinin indikatör L. monocytogenes üzerine
oluşturdukları zon çapları
Suş no
M38
M57
M40
M10
Pediococcus
Türleri
Nutrient agar
İnhibisyon zon
çapı(mm)
%0,2 glikozlu
nutrient agar
inhibisyon zon
çapı(mm)
Pediococcus inopinatus
Pediococcus acidilactici
Pediococcus dextrinicus
Pediococcus pentosaceus
L.monocytogenes
7
6
8
6
L.monocytogenes
14
10
12
14
Şekil 4.14. Pediococcus türlerinin nutrient agar ve %0,2 glikozlu nutrient agarda
L. onocytogenes üzerine inhibisyon zon çaplarının karşılaştırılması
%0,2 glikozlu Nutrient Agar ortamında Pediococcus suşlarının L. monocytogenes
üzerinde daha büyük zon çapları oluşturduğu gözlenmiştir. Bu koşullarda
Pediococcus inopinatus ve Pediococcus pentosaceus suşları 14 mm zon çapıyla en
yüksek etkiyi göstermiştir. Glikozlu ortamda en düşük zon çapı ölçümü 10 mm olup
Pediococcus acidilactici suşunda gözlenmiştir.
74
Leuconostoc türlerinin L. monocytogenes üzerine inhibitör etkisi
Leuconostoc cinsi; Leu. mesenteroides ssp. dextranicum ve Leu. mesenteroides ssp.
mesenteroides türlerinin Nutrient Agarda indikatör L. monocytogenes üzerine etkisi
10 mm zon çapı, %0,2 glikozlu Nutrient Agarda 12-14 mm zon çapı olarak
gözlenmiştir. Leuconostocların L. monocytogenes üzerine etkisi her iki ortamdaki
zon çapları ölçülerek karşılaştırılması yapılmıştır. Çizelge 4.17 ve Şekil 4.15’ de
gösterilmiştir.
Çizelge 4.17. Leuconostoc türlerinin indikatör L. monocytogenes üzerine
oluşturdukları zon çapları
Suş
no
Leuconostoc
Türleri
Leu. mesenteroides ssp.
M55
dextranicum
Leu. mesenteroides ssp.
M25
mesenteroides
L.monocytogenes
%0,2 glikozlu
nutrient agar
inhibisyon zon
çapı(mm)
L.monocytogenes
10
12
10
14
Nutrient agar
İnhibisyon zon
çapı(mm)
Şekil 4.15. Leuconostoc türlerinin nutrient agar ve %0,2 glikozlu nutrient agarda
L.monocytogenes üzerine inhibisyon zon çaplarının karşılaştırılması
75
Leuconostoc suşlarının L. monocytogenes üzerine etkisi glikoz ilave edilen besiyeri
ortamında daha yüksek gözlenmiştir. Leu. mesenteroides ssp. mesenteroides suşunun
zon çapı 14 mm, Leu. mesenteroides ssp. dextranicum suşunun zon çapı ise 12 mm
olarak tespit edilmiştir. Sonuç olarak Leuconostocların L. monocytogenes üzerinde
inhibitör etki gösterdiği bulunmuştur.
Streptococcus türlerinin L. monocytogenes üzerine inhibitör etkisi
Streptococcus cinsi: Streptococcus lactis, Streptococcus cremoris ve Lactococcus
lactis ssp. lactis türlerinin L. monocytogenes üzerine inhibitör etkisi nutrient agar ve
glikozlu nutrient agarda incelenmiştir. Nutrient agarda zon çapları 6 mm ve 10 mm
olarak, glikozlu nutrient agarda 10 mm ve 17 mm olarak ölçülmüştür.
Streptococusların indikatör L. monocytogenes’e inhibitör etkisi her iki ortamda zon
çapları ölçülerek karşılaştırılması yapılmıştır. Çizelge 4.18. ve Şekil 4.16 da
gösterilmiştir.
Çizelge 4.18. Streptococcus türlerinin indikatör L. monocytogenes üzerine
oluşturdukları zon çapları
Suş no
M59
M44
M21
Streptococcus
Türleri
Streptococcus lactis
Streptococcus cremoris
Lactococcus lactis ssp. lactis
Nutrient agar
İnhibisyon zon
çapı(mm)
%0,2 glikozlu
nutrient agar
inhibisyon zon
çapı(mm)
L.monocytogenes
L.monocytogenes
8
6
10
14
10
17
76
Şekil 4.16. Streptococcus türlerinin nutrient agar ve %0,2 glikozlu nutrient agarda
L. monocytogenes üzerine inhibisyon zon çaplarının karşılaştırılması
Yapılan ölçümler sonucunda Streptococcuslar glikoz ilave edilmiş besiyeri
ortamında L. monocytogenes üzerinde daha büyük etki göstermiştir. Bu koşullarda
glikozlu ortamda en yüksek inhibitör etki Lactococcus lactis ssp. lactis suşunda
gözlenmiştir. L. monocytogenes üzerindeki etkisi 17 mm zon çapı olarak tespit
edilmiştir. En düşük etki ise 10 mm zon çapı ile Streptococcus cremoris suşunda
gözlenmiştir.
Enterococcus türlerinin L. monocytogenes üzerine inhibitör etkisi
Enterococcus
faecalis
ve
Enterococcus
faecium
suşlarının
indikatör
L.
monocytogenes üzerine inhibitör etkisi incelenmiştir. Nutrient Agarda Enterococcus
suşlarının zon çapları 8 mm, %0,2 glikoz ilave edilmiş Nutrient Agarda 12 mm ve 16
mm olarak ölçülmüştür. Enterococcus türlerinin L. monocytogenes’e etkisi her iki
ortamdaki zon çapları ölçülerek karşılaştırılmıştır. Zon çapı ölçümleri Çizelge 4.19.
ve Şekil 4.17. ‘de gösterilmiştir.
77
Çizelge 4.19. Enterococcus türlerinin indikatör L. monocytogenes üzerine
oluşturdukları zon çapları
Suş no
Enterococcus
Türleri
L.monocytogenes
%0,2 glikozlu
nutrient agar
inhibisyon zon
çapı(mm)
L.monocytogenes
Nutrient agar
İnhibisyon zon
çapı(mm)
M4
Enterococcus faecalis
8
12
M30
Enterococcus faecium
8
16
Şekil 4.17. Enterococcus türlerinin nutrient agar ve %0,2 glikozlu nutrient agarda
L.monocytogenes üzerine inhibisyon zon çaplarının karşılaştırılması
Enterococcusların L. monocytogenes’e etkileri glikozlu besiyeri ortamında artış
göstermiştir. Enterococcus faecium suşunun zon çapı 16 mm olarak tespit edilmiştir.
L. monocytones üzerinde en büyük etkiyi oluşturmuştur. Enterococcus faecalis suşu
ise L. monocytogenes’e oluşturduğu zon çapı 12 mm olarak belirlenmiştir. Sonuç
olarak Enterococcus türleri L. monocytogenes’e etkili bulunmuştur.
78
4.4.3. Laktik asit bakterilerinin Salmonella typhimurium üzerine inhibitör
etkilerinin değerlendirilmesi
Lactobacillus türlerinin S. typhimurium üzerine inhibitör etkisi
Lactobacillus cinsi; Lactobacillus delbrueckii ssp. lactis, Lactobacillus casei, Lb.
rhamnosus, Lb. acidophilus, Lb. coryniformis ssp. torquens ve Lb. plantarum ssp.
plantarum türlerinin Nutrient Agarda indikatör S. typhimurium üzerine etki ettiği zon
çapları 4 mm ve 10 mm, %0,2 glikozlu Nutrient Agarda 6 mm ve 18 mm olarak
ölçülmüştür. Lactobacillusların S. typhimurium üzerine etkisi her iki ortamdaki zon
çapları ölçülerek karşılaştırılması yapılmıştır. (Çizelge 4.20. ve Şekil 4.18. )
Çizelge 4.20. Lactobacillus türlerinin indikatör S. typhimurium üzerine
oluşturdukları zon çapları
Suş no
Lactobacillus
Türleri
Nutrient agar
İnhibisyon zon
çapı(mm)
%0,2 glikozlu
nutrient agar
inhibisyon zon
çapı(mm)
S. typhimurium
S. typhimurium
M36
M19
M34
M58
M37
Lb. delbrueckii ssp. lactis
Lb. casei
Lb. acidophilus
Lb. rhamnosus
Lb. coryniformis ssp. tourquens
10
8
8
6
4
18
8
9
10
6
M48
Lb. plantarum ssp. plantarum
8
10
79
Şekil 4.18. Lactobacillus türlerinin nutrient agar ve %0,2 glikozlu nutrient agarda
S.typhimurium üzerine inhibisyon zon çaplarının karşılaştırılması
Nutrient Agar ve %0,2 glikozlu Nutrient Agar ortamı karşılaştırıldığında,
Lactobacilluslar glikozlu ortamda S. typhimurium üzerine daha büyük etki
göstermiştir. Bu koşullarda 18 mm zon çapıyla Lactobacillus delbrueckii ssp. lactis
en yüksek etkili suş olarak belirlenmiştir. S. typhimurium üzerine en düşük etkiyi
gösteren suş ise 6 mm zon çapıyla Lb. coryniformis ssp. torquens olarak tespit
edilmiştir. Sonuç olarak Lactobacilluslar S. typhimurium’a etkili bulunmuştur.
Pediococcus türlerinin S. typhimurium üzerine inhibitör etkisi
Pediococccus cinsi; Pediococcus inopinatus, Pediococcus acidilactici, Pediococcus
dextrinicus ve Pediococcus pentosaceus suşlarının indikatör S. typhimurium üzerine
etkisi Nutrient Agarda zon çapları 4-6 mm, glikoz ilave edilmiş Nutrient Agarda 5-10
mm olarak ölçülmüştür. Pediococcus türlerinin S. typhimurium üzerine etkisi her iki
ortamdaki zon çapları ölçülerek karşılaştırılmıştır. Çizelge 4.21. ve Şekil 4.19.’da
Pediococcus bakterilerinin S. typhimurium üzerine oluşturdukları zon çapı ölçümleri
gösterilmiştir.
80
Çizelge 4.21. Pediococcus türlerinin indikatör S. typhimurium üzerine
oluşturdukları zon çapları
Suş no
Nutrient agar
İnhibisyon zon
çapı(mm)
%0,2 glikozlu
nutrient agar
inhibisyon zon
çapı(mm)
S. typhimurium
S. typhimurium
Pediococcus
Türleri
M38
Pediococcus inopinatus
4
6
M57
M40
Pediococcus acidilactici
Pediococcus dextrinicus
6
6
10
8
M10
Pediococcus pentosaceus
4
5
Şekil 4.19. Pediococcus türlerinin nutrient agar ve %0,2 glikozlu nutrient agarda S.
typhimurium üzerine inhibisyon zon çaplarının karşılaştırılması
Pediococccus türlerinin her iki ortamdaki zon çapı ölçümleri karşılaştırıldığında
%0,2 glikozlu Nutrient Agarda zon çaplarında artış olduğu gözlenmiştir. Glikozlu
ortamda Pediococcus acidilactici 10 mm zon çapıyla S. typhimurium üzerinde en
yüksek etkiyi göstermiştir. En düşük etkiyi Pediococcus pentosaceus suşu göstermiş
olup, zon çapı 5 mm olarak tespit edilmiştir.
81
Leuconostoc türlerinin S. typhimurium üzerine inhibitör etkisi
Leuconostoc cinsi; Leu. mesenteroides ssp. dextranicum ve Leu. mesenteroides ssp.
mesenteroides türlerinin Nutrient Agarda indikatör S. typhimurium üzerine etkisi
6mm ve 7mm, %0,2 glikozlu Nutrient Agarda 8-10 mm zon çapı olarak gözlenmiştir.
Leuconostocların S. typhimurium üzerine etkisi her iki ortamdaki zon çapları
ölçülerek karşılaştırılması yapılmıştır. Zon çapı ölçümleri Çizelge 4.22 ve Şekil 4.20’
de gösterilmiştir.
Çizelge 4.22. Leuconostoc türlerinin indikatör S. typhimurium üzerine
oluşturdukları zon çapları
Suş no
Leuconostoc
Türleri
Nutrient agar
İnhibisyon zon
çapı(mm)
%0,2 glikozlu
nutrient agar
inhibisyon zon
çapı(mm)
S. typhimurium
S. typhimurium
M55
Leu. mesenteroides ssp. dextranicum
6
8
M25
Leu. mesenteroides ssp. mesenteroides
7
10
Şekil 4.20. Leuconostoc türlerinin nutrient agar ve %0,2 glikozlu nutrient agarda
S.typhimurium üzerine inhibisyon zon çaplarının karşılaştırılması
82
Leuconostoc suşlarının S. typhimurium üzerine etkisi glikozlu besiyeri ortamında
artış göstermiştir. Bu koşullarda Leu. mesenteroides ssp. mesenteroides suşunun zon
çapı 10 mm, Leu. mesenteroides ssp. dextranicum suşunun zon çapı 8 mm olarak
belirlenmiştir. Sonuç olarak Leuconostoclar indikatör S. typhimurium’a etkili
bulunmuştur.
Streptococcus türlerinin S. typhimurium üzerine inhibitör etkisi
Streptococcus cinsi: Streptococcus lactis, Streptococcus cremoris ve Lactococcus
lactis ssp. lactis türlerinin S. typhimurium üzerine inhibitör etkisi Nutrient Agar ve
glikozlu Nutrient Agarda incelenmiştir. Nutrient agarda zon çapları 6 mm ve 8 mm
olarak, glikozlu Nutrient Agarda 8 mm ve 10 mm olarak ölçülmüştür.
Streptococusların indikatör S. typhimurium’a inhibitör etkisi her iki ortamda zon
çapları ölçülerek karşılaştırılması yapılmıştır. Çizelge 4.23. ve Şekil 4.21 de
gösterilmiştir.
Çizelge 4.23. Streptococcus türlerinin indikatör S. typhimurium üzerine
oluşturdukları zon çapları
Suş no
M59
M44
M21
Streptococcus
Türleri
Streptococcus lactis
Streptococcus cremoris
Lactococcus lactis ssp. lactis
Nutrient agar
İnhibisyon zon
çapı(mm)
%0,2 glikozlu nutrient
agar inhibisyon zon
çapı(mm)
S. typhimurium
6
6
8
S. typhimurium
10
8
8
Şekil 4.21. Streptococcus türlerinin nutrient agar ve %0,2 glikozlu nutrient agarda
S. typhimurium üzerine inhibisyon zon çaplarının karşılaştırılması
83
Yapılan ölçümler sonucunda Streptococcuslar glikoz ilave edilmiş besiyeri
ortamında S. typhimurium üzerinde daha büyük etki göstermiştir. Bu koşullarda
glikozlu ortamda en yüksek inhibitör etki 10 mm zon çapıyla Streptococcus lactis
suşunda gözlenmiştir. Streptococcus cremoris ve Lactococcus lactis ssp. lactis
suşlarının zon çapı ise 8 mm olarak belirlenmiştir.
Enterococcus türlerinin S. typhimurium üzerine inhibitör etkisi
Enterococcus faecalis ve Enterococcus faecium suşlarının S. typhimurium üzerine
inhibitör etkisi Nutrient Agarda zon çapları 7 mm ve 8 mm olarak, %0,2 glikozlu
Nutrient Agarda zon çapları 8 mm olarak ölçülmüştür. Enterococcusların indikatör S.
typhimurium’a etkisi her iki ortamdaki zon çapı ölçümleri karşılaştırılarak
yapılmıştır. Çizelge 4.24. ve Şekil 4.22. de zon çapı ölçümleri gösterilmiştir.
Çizelge 4.24. Enterococcus türlerinin indikatör S. typhimurium üzerine
oluşturdukları zon çapları
Suş no
M4
M30
Enterococcus
Türleri
Enterococcus faecalis
Enterococcus faecium
Nutrient agar
İnhibisyon zon
çapı(mm)
S. typhimurium
7
8
%0,2 glikozlu nutrient
agar inhibisyon zon
çapı(mm)
S. typhimurium
8
8
Şekil 4.22. Enterococcus türlerinin nutrient agar ve %0,2 glikozlu nutrient agarda
S.typhimurium üzerine inhibisyon zon çaplarının karşılaştırılması
84
Nutrient Agar ve Glikozlu Nutrient Agar ortamı karşılaştırıldığında, Enterococcus
faecalis suşunun S. typhimurium üzerindeki etkisinin glikozlu ortamda artış
gösterdiği tespit edilmiştir. Glikozlu ortamda Enterococcus faecalis ‘in zon çapı 8
mm olarak belirlenmiştir. Enterococcus faecium suşunun S. typhimurium’a etkisi her
iki ortamda eşit olduğu tespit edilmiştir ve zon çapı 8 mm olarak belirlemiştir.
4.4.4. Laktik asit bakterilerinin Klebsiella pneumoniae üzerine inhibitör
etkilerinin değerlendirilmesi
Lactobacillus türlerinin K. pneumoniae üzerine inhibitör etkisi
Lactobacillus cinsi; Lactobacillus delbrueckii ssp. lactis, Lactobacillus casei, Lb.
rhamnosus, Lb. acidophilus, Lb. coryniformis ssp. torquens ve Lb. plantarum ssp.
plantarum türlerinin Nutrient Agarda indikatör K. pneumoniae üzerine etki ettiği zon
çapları 2 mm, %0,2 glikozlu Nutrient Agarda 2 mm ve 4 mm olarak ölçülmüştür.
Lactobacillusların K. pneumoniae üzerine etkisi her iki ortamdaki zon çapları
ölçülerek karşılaştırılması yapılmıştır. (Çizelge 4.25. ve Şekil 4.23. )
Çizelge 4.25. Lactobacillus türlerinin indikatör K. pneumoniae üzerine
oluşturdukları zon çapları
Suş no
M36
M19
M34
M58
M37
M48
Lactobacillus
Türleri
Lb. delbrueckii ssp. lactis
Lb. casei
Lb. acidophilus
Lb. rhamnosus
Lb. coryniformis ssp. tourquens
Lb. plantarum ssp. plantarum
Nutrient agar
İnhibisyon zon
çapı(mm)
%0,2 glikozlu nutrient
agar inhibisyon zon
çapı(mm)
K. pneumoniae
K. pneumoniae
2
2
2
2
2
2
3
3
2
3
2
4
85
Şekil 4.23. Lactobacillus türlerinin nutrient agar ve %0,2 glikozlu nutrient agarda
K.pneumoniae üzerine inhibisyon zon çaplarının karşılaştırılması
Lactobacillus türlerinin indikatör K. pneumoniae üzerindeki etkisi Nutrient Agar ve
glikozlu Nutrient Agar ortamında karşılaştırılmıştır. Glikozlu ortamda zon çaplarında
artış gözlenmiştir. En yüksek zon çapı ölçümü Lb. plantarum ssp. plantarum suşuna
ait olup, glikozlu ortamda zon çapı 4 mm olarak belirlenmiştir. Lb. rhamnosus, Lb.
casei ve Lb. delbrueckii ssp. lactis suşlarının zon çapları 3 mm olarak tespit
edilmiştir.
Sonuç
olarak
Lactobacilluslar
K.
pneumoniae
üzerine
etkili
bulunmamıştır. Bunun sebebinin K. pneumoniae’nin kapsüllü patojen bir bakteri
olmasından kaynaklandığı düşünülmektedir.
Pediococcus türlerinin K. pneumoniae üzerine inhibitör etkisi
Pediococccus cinsi; Pediococcus inopinatus, Pediococcus acidilactici, Pediococcus
dextrinicus ve Pediococcus pentosaceus suşlarının indikatör K. pneumoniae üzerine
etkisi Nutrient Agarda zon çapları 2 mm, glikoz ilave edilmiş Nutrient Agarda 2-3
mm olarak ölçülmüştür. Pediococcus türlerinin K. pneumoniae üzerine etkisi her iki
ortamdaki zon çapları ölçülerek karşılaştırılmıştır. Çizelge 4.26. ve Şekil 4.24.’te
Pediococcus bakterilerinin K. pneumoniae üzerine oluşturdukları zon çapı ölçümleri
gösterilmiştir.
86
Çizelge 4.26. Pediococcus türlerinin indikatör K. pneumoniae üzerine
oluşturdukları zon çapları
Pediococcus
Türleri
Suş no
M38
M57
M40
M10
Pediococcus inopinatus
Pediococcus acidilactici
Pediococcus dextrinicus
Pediococcus pentosaceus
Nutrient agar
İnhibisyon zon
çapı(mm)
%0,2 glikozlu
nutrient agar
inhibisyon zon
çapı(mm)
K. pneumoniae
K. pneumoniae
2
2
2
3
2
2
2
2
Şekil 4.24. Pediococcus türlerinin nutrient agar ve %0,2 glikozlu nutrient agarda
K. pneumoniae üzerine inhibisyon zon çaplarının karşılaştırılması
Pediococcus türlerinin her iki ortamdaki zon çapı ölçümleri karşılaştırıldığında iki
ortamda da benzer sonuçlar olduğu gözlenmiştir. Glikozlu ortamda sadece
Pediococcus acidilactici suşunun zon çapında artış olduğu gözlenmiştir ve 3 mm
olarak kaydedilmiştir. Sonuç olarak Pediococcus türleri K. pneumoniae üzerine etkili
bulunmamıştır.
87
Leuconostoc türlerinin K. pneumoniae üzerine inhibitör etkisi
Leuconostoc cinsi; Leu. mesenteroides ssp. dextranicum ve Leu. mesenteroides ssp.
mesenteroides türlerinin Nutrient Agarda indikatör K. pneumoniae üzerine etkisi 1
mm ve 2 mm, %0,2 glikozlu Nutrient Agarda 2 mm zon çapı olarak gözlenmiştir.
Leuconostocların K. pneumoniae üzerine etkisi her iki ortamdaki zon çapları
ölçülerek karşılaştırılması yapılmıştır. Zon çapı ölçümleri Çizelge 4.27 ve Şekil 4.25’
de gösterilmiştir.
Çizelge 4.27. Leuconostoc türlerinin indikatör K. pneumoniae üzerine
oluşturdukları zon çapları
Suş
no
M55
M25
Leuconostoc
Türleri
Leu. mesenteroides ssp. dextranicum
Leu. mesenteroides ssp. mesenteroides
Nutrient agar
İnhibisyon zon
çapı(mm)
%0,2 glikozlu
nutrient agar
inhibisyon zon
çapı(mm)
K. pneumoniae
K. pneumoniae
1
2
2
2
Şekil 4.25. Leuconostoc türlerinin nutrient agar ve %0,2 glikozlu nutrient agarda K.
pneumoniae üzerine inhibisyon zon çaplarının karşılaştırılması
88
Yapılan ölçümler sonucunda Leuconostoc suşlarının Nutrient Agar ve Glikozlu
Nutrient Agar da K. pneumoniae üzerine etkisi karşılaştırıldığında değişiklik
olmadığı gözlenmiştir. Sonuç olarak Leu. mesenteroides ssp. dextranicum ve Leu.
mesenteroides ssp. mesenteroides K. pneumoniae ‘ ye etkili bulunmamıştır.
Streptococcus türlerinin K. pneumoniae üzerine inhibitör etkisi
Streptococcus cinsi: Streptococcus lactis, Streptococcus cremoris ve Lactococcus
lactis ssp. lactis türlerinin K. pneumoniae üzerine inhibitör etkisi Nutrient Agar ve
glikozlu Nutrient Agarda incelenmiştir. Nutrient agarda zon çapları 2 mm olarak,
glikozlu Nutrient Agarda 2 mm ve 4 mm olarak ölçülmüştür. Streptococusların
indikatör K. pneumoniae’ye inhibitör etkisi her iki ortamda zon çapları ölçülerek
karşılaştırılması yapılmıştır. Çizelge 4.28. ve Şekil 4.26 da gösterilmiştir.
Çizelge 4.28. Streptococcus türlerinin indikatör K. pneumoniae üzerine
oluşturdukları zon çapları
Suş no
M59
M44
M21
Streptococcus
Türleri
Streptococcus lactis
Streptococcus cremoris
Lactococcus lactis ssp. lactis
Nutrient agar
İnhibisyon zon
çapı(mm)
%0,2 glikozlu nutrient
agar inhibisyon zon
çapı(mm)
K. pneumoniae
2
2
2
K. pneumoniae
4
3
2
Şekil 4.26. Streptococcus türlerinin nutrient agar ve %0,2 glikozlu nutrient agarda
K. pneumoniae üzerine inhibisyon zon çaplarının karşılaştırılması
89
Nutrient Agar ve glikozlu Nutrient Agarda yapılan ölçümler sonucunda
Streptococcus suşlarının K. pneumoniae’ye etkileri her iki ortamda da değişiklik
göstermemiştir. Ancak Streptococcus lactis suşunun zon çapı glikozlu ortamda artış
göstermiş olup 4 mm olarak tespit edilmiştir. Streptococcus cremoris’in zon çapı 3
mm ve Lactococcus lactis ssp. lactis suşunun zon çapı 2 mm olarak belirlenmiştir.
Enterococcus türlerinin K. pneumoniae üzerine inhibitör etkisi
Enterococcus faecalis ve Enterococcus faecium suşlarının K. pneumoniae üzerine
inhibitör etkisi Nutrient Agarda zon çapları 2 mm ve 4 mm olarak, %0,2 glikozlu
Nutrient Agarda zon çapları 3 mm ve 4 mm olarak ölçülmüştür. Enterococcusların
indikatör K. pneumoniae’ye etkisi her iki ortamdaki zon çapı ölçümleri
karşılaştırılarak yapılmıştır. Çizelge 4.29. ve Şekil 4.27. de zon çapı ölçümleri
gösterilmiştir.
Çizelge 4.29. Enterococcus türlerinin indikatör K. pneumoniae üzerine
oluşturdukları zon çapları
Suş no
M4
M30
Enterococcus
Türleri
Enterococcus faecalis
Enterococcus faecium
Nutrient agar
İnhibisyon zon
çapı(mm)
%0,2 glikozlu nutrient
agar inhibisyon zon
çapı(mm)
K. pneumoniae
K. pneumoniae
2
4
3
4
Şekil 4.27. Enterococcus türlerinin nutrient agar ve %0,2 glikozlu nutrient agarda
K. pneumoniae üzerine inhibisyon zon çaplarının karşılaştırılması
90
Enterococcus türlerinin indikatör K. pneumoniae üzerindeki etkisi her iki ortamda
karşılaştırıldığında zon çapı ölçümlerinde değişiklik gözlenmemiştir. Bu koşullarda
Enterococcus faecalis suşunun zon çapı glikozlu ortamda 3 mm, Enterococcus
faecium suşunun zon çapı ise 4 mm olarak tespit edilmiştir.
4.4.5. Laktik asit bakterilerinin E. coli üzerine inhibitör etkilerinin
değerlendirilmesi
Lactobacillus türlerinin E. coli üzerine inhibitör etkisi
Lactobacillus cinsi; Lactobacillus delbrueckii ssp. lactis, Lactobacillus casei, Lb.
rhamnosus, Lb. acidophilus, Lb. coryniformis ssp. torquens ve Lb. plantarum ssp.
plantarum türlerinin Nutrient Agarda indikatör E. coli üzerine etki ettiği zon çapları
2 mm, %0,2 glikozlu Nutrient Agarda 2 mm ve 4 mm olarak ölçülmüştür.
Lactobacillusların E. coli üzerine etkisi her iki ortamdaki zon çapları ölçülerek
karşılaştırılması yapılmıştır. (Çizelge 4.30. ve Şekil 4.28. )
Çizelge 4.30. Lactobacillus türlerinin indikatör E. coli üzerine oluşturdukları
zon Çapları
Suş no
M36
M19
M34
M58
M37
M48
Lactobacillus
Türleri
Lb. delbrueckii ssp. lactis
Lb. casei
Lb. acidophilus
Lb. rhamnosus
Lb.coryniformis ssp. tourquens
Lb. plantarum ssp. plantarum
E.coli
%0,2 glikozlu
nutrient agar
inhibisyon zon
çapı(mm)
E.coli
2
2
2
2
2
2
2
2
2
4
Nutrient agar
İnhibisyon zon
çapı(mm)
91
Şekil 4.28. Lactobacillus türlerinin nutrient agar ve %0,2 glikozlu nutrient agarda
E. coli üzerine inhibisyon zon çaplarının karşılaştırılması
Lactobacillus türlerinin indikatör E.coli üzerindeki etkisi Nutrient Agar ve glikozlu
Nutrient Agar ortamında karşılaştırılmıştır. her iki ortamda da değişiklik
gözlenmemiştir. Ancak Lb. plantarum ssp. plantarum suşunun zon çapı glikozlu
ortamda 4 mm olarak belirlenmiştir.
Pediococcus türlerinin E. coli üzerine inhibitör etkisi
Pediococccus cinsi; Pediococcus inopinatus, Pediococcus acidilactici, Pediococcus
dextrinicus ve Pediococcus pentosaceus suşlarının indikatör E. coli üzerine etkisi
Nutrient Agarda zon çapları 2 mm, glikoz ilave edilmiş Nutrient Agarda 2-3 mm
olarak ölçülmüştür. Pediococcus türlerinin E. coli üzerine etkisi her iki ortamdaki
zon çapları ölçülerek karşılaştırılmıştır. Çizelge 4.31. ve Şekil 4.29.’da Pediococcus
bakterilerinin E. coli üzerine oluşturdukları zon çapı ölçümleri gösterilmiştir.
92
Çizelge 4.31. Pediococcus türlerinin indikatör E. coli üzerine oluşturdukları
zon Çapları
Suş no
M38
M57
M40
M10
Pediococcus
Türleri
Pediococcus inopinatus
Pediococcus acidilactici
Pediococcus dextrinicus
Pediococcus pentosaceus
Nutrient agar
İnhibisyon zon
çapı(mm)
%0,2 glikozlu
nutrient agar
inhibisyon zon
çapı(mm)
E.coli
E.coli
2
2
2
3
2
3
2
Şekil 4.29. Pediococcus türlerinin nutrient agar ve %0,2 glikozlu nutrient agarda
E. coli üzerine inhibisyon zon çaplarının karşılaştırılması
Yapılan ölçümler sonucunda Pediococcus suşlarının indikatör E. coli’ye etkileri
Nutrient Agar ve glikozlu Nutrient Agar ortamında karşılaştırılmıştır. Her iki
ortamda da zon çapı ölçümleri değişiklik göstermemiştir. Pediococcus inopinatus ve
Pediococcus dextrinicus suşlarının glikozlu ortamda zon çapları 3 mm, Pediococcus
acidilactici ve Pediococcus pentosaceus suşlarının ise 2 mm olarak belirlenmiştir.
93
Leuconostoc türlerinin E. coli üzerine inhibitör etkisi
Leuconostoc cinsi; Leu. mesenteroides ssp. dextranicum ve Leu. mesenteroides ssp.
mesenteroides türlerinin Nutrient Agarda indikatör E. coli üzerine etkisi 2 mm, %0,2
glikozlu Nutrient Agarda 1 mm ve 3 mm zon çapı olarak gözlenmiştir.
Leuconostocların E. coli üzerine etkisi her iki ortamdaki zon çapları ölçülerek
karşılaştırılması yapılmıştır. Zon çapı ölçümleri Çizelge 4.32 ve Şekil 4.30’ da
gösterilmiştir.
Çizelge 4.32. Leuconostoc türlerinin indikatör E. coli üzerine oluşturdukları
zon Çapları
Suş no
Leuconostoc
Türleri
Nutrient agar
İnhibisyon zon
çapı(mm)
%0,2 glikozlu
nutrient agar
inhibisyon zon
çapı(mm)
E.coli
E.coli
M55
Leu. mesenteroides ssp. dextranicum
-
1
M25
Leu. mesenteroides ssp. mesenteroides
2
3
Şekil 4.30. Leuconostoc türlerinin nutrient agar ve %0,2 glikozlu nutrient agarda
E.coli üzerine inhibisyon zon çaplarının karşılaştırılması
94
Leuconostoc türlerinin E. coli üzerine inhibitör etkileri incelendiğinde, Nutrient Agar
ve glikozlu Nutrient Agar ortamında zon çapı ölçümleri düşük oranda gözlenmiştir.
Bu koşullarda Leu. mesenteroides ssp. mesenteroides glikozlu ortamda 3 mm, Leu.
mesenteroides ssp. dextranicum suşu ise 1 mm zon çapı olarak tespit edilmiştir.
Streptococcus türlerinin E. coli üzerine inhibitör etkisi
Streptococcus cinsi: Streptococcus lactis, Streptococcus cremoris ve Lactococcus
lactis ssp. lactis türlerinin E. coli üzerine inhibitör etkisi Nutrient Agar ve glikozlu
Nutrient Agarda incelenmiştir. Nutrient agarda zon çapları 0-2 mm olarak, glikozlu
Nutrient Agarda 2 mm olarak ölçülmüştür. Streptococusların indikatör E. coli’ye
inhibitör etkisi her iki ortamda zon çapları ölçülerek karşılaştırılması yapılmıştır.
Çizelge 4.33. ve Şekil 4.31 de gösterilmiştir.
Çizelge 4.33. Streptococcus türlerinin indikatör E. coli üzerine oluşturdukları
zon Çapları
Suş no
M59
M44
M21
Streptococcus
Türleri
Streptococcus lactis
Streptococcus cremoris
Lactococcus lactis ssp. lactis
Nutrient agar
İnhibisyon zon
çapı(mm)
E.coli
2
-
%0,2 glikozlu nutrient
agar inhibisyon zon
çapı(mm)
E.coli
2
2
2
Şekil 4.31. Streptococcus türlerinin nutrient agar ve %0,2 glikozlu nutrient agarda
E. coli üzerine inhibisyon zon çaplarının karşılaştırılması
95
Yapılan ölçümler sonunda, Streptococcus suşlarının indikatör E. coli’ye etkileri
Nutrient Agar ve glikozlu Nutrient Agar ortamlarında düşük etkili olarak
gözlenmiştir. Glikozlu ortamda Streptococcus suşlarının zon çapları 2 mm olarak
belirlenmiştir. Sonuç olarak Streptococcuslar E. coli üzerine etkisiz bulunmuştur.
Enterococcus türlerinin E. coli üzerine inhibitör etkisi
Enterococcus faecalis ve Enterococcus faecium suşlarının E. coli üzerine inhibitör
etkisi Nutrient Agarda zon çapları 2 mm ve 3 mm olarak, %0,2 glikozlu Nutrient
Agarda zon çapları 2 mm ve 4 mm olarak ölçülmüştür. Enterococcusların indikatör
E. coli’ye etkisi her iki ortamdaki zon çapı ölçümleri karşılaştırılarak yapılmıştır.
Çizelge 4.34. ve Şekil 4.32. de zon çapı ölçümleri gösterilmiştir.
Çizelge 4.34. Enterococcus türlerinin indikatör E. coli üzerine oluşturdukları
zon Çapları
Suş
no
M4
M30
Enterococcus
Türleri
Enterococcus faecalis
Enterococcus faecium
Nutrient agar
İnhibisyon zon
çapı(mm)
%0,2 glikozlu nutrient
agar inhibisyon zon
çapı(mm)
E.coli
2
3
E.coli
2
4
Şekil 4.32. Enterococcus türlerinin nutrient agar ve %0,2 glikozlu nutrient agarda
E.coli üzerine inhibisyon zon çaplarının karşılaştırılması
96
Enterococcus türlerinin indikatör E. coli üzerindeki etkisi her iki ortamda
karşılaştırıldığında zon çapı ölçümlerinde değişiklik gözlenmemiştir. Bu koşullarda
Enterococcus faecalis suşunun zon çapı glikozlu ortamda 2 mm, Enterococcus
faecium suşunun zon çapı ise 4 mm olarak tespit edilmiştir.
Lactobacillus suşlarının (Lb. delbrueckii ssp. lactis, Lb. casei, Lb. acidophilus, Lb.
rhamnosus, Lb. coryniformis ssp. tourquens ve Lb. plantarum ssp. plantarum) tüm
indikatör
test
bakterilerine
(S.aureus,
L.monocytogenes,
S.typhimurium,
K.pneumoniae ve E.coli) karşı inhibitör etkisi Nutrient Agar ve %0,2 glikozlu
Nutrient Agarda incelenmiştir. Glikozlu ortamda zon çapları daha büyük
gözlenmiştir. Bu koşullarda en büyük etkiyi Lb. delbrueckii ssp. lactis suşu 18 mm
zon çapıyla L.monocytogenes ve Salmonella typhimurium üzerine göstermiştir.
Genel olarak bakıldığında Lactobacillus suşlarının en etkili olduğu indikatör bakteri
Listeria monocytogenes olarak tespit edilmiştir. E. coli ve K. pneumoniae
bakterilerine karşı etki göstermediği belirlenmiştir (Çizelge 4.35).
Pediococcus
suşlarının
Pediococcus
dextrinicus
(Pediococcus
inopinatus,
ve Pediococcus
Pediococcus
pentosaceus) tüm
acidilactici,
indikatör test
bakterilerine (S.aureus, L.monocytogenes, S.typhimurium, K.pneumoniae ve E.coli)
karşı inhibitör etkisi Nutrient Agar ve %0,2 glikozlu Nutrient Agarda incelenmiştir.
Glikozlu ortamda zon çapları daha büyük gözlenmiştir.
Genel olarak incelendiğinde, Pediococcuslar en büyük etkiyi L. monocytogenes
üzerine göstermişlerdir. Bu koşullarda Pediococcus inopinatus ve Pediococcus
pentosaceus suşları glikozlu ortamda 14 mm zon çapıyla L. monocytogenes üzerinde
etkili olmuştur. Pediococcusların en düşük zon çapları indikatör K.pneumoniae ve
E.coli üzerine olduğu belirlenmiştir. Bu iki bakteriye karşı Pediococcusların inhibitör
etkisi gözlenmemiştir (Çizelge 4.36).
Leuconostoc cinsi, Leu. mesenteroides ssp. dextranicum ve Leu. mesenteroides ssp.
mesenteroides suşlarının tüm indikatör test bakterilerine (S.aureus, L.monocytogenes,
97
S.typhimurium, K.pneumoniae ve E.coli) karşı inhibitör etkisi incelendiğinde; glikoz
ilave edilmiş ortamda daha büyük etki gösterdiği gözlenmiştir. Leuconostocların
etkisi tüm indikatör bakterilerde incelendiğinde, en yüksek etkiyi Listeria
monocytogenes üzerine gösterdiği tespit edilmiştir. Bu koşullarda Leu. mesenteroides
ssp. mesenteroides, L. monocytogenes üzerinde 14 mm zon çapı oluşturmuştur.
Leuconostoc suşları K.pneumoniae ve E.coli üzerine etkili bulunmamıştır (Çizelge
4.37).
98
99
100
Streptococcus
suşlarının
(Streptococcus
lactis,
Streptococcus
cremoris
ve
Lactococcus lactis ssp. lactis) tüm indikatör test bakterilerine (S.aureus,
L.monocytogenes, S.typhimurium, K.pneumoniae ve E.coli) karşı inhibitör etkisi
Nutrient Agar ve %0,2 glikozlu Nutrient Agarda incelenmiştir. Glikozlu ortamda zon
çapları daha büyük gözlenmiştir. Bu koşullarda en büyük etkiyi Lactococcus lactis
ssp. lactis suşu 17 mm zon çapıyla L.monocytogenes üzerine göstermiştir.
Genel olarak bakıldığında Streptococcus suşları S.aureus, L.monocytogenes ve
S.typhimurium üzerine etkili, K.pneumoniae ve E.coli üzerine etkisiz bulunmuştur.
Streptococcusların en etkili olduğu indikatör bakteri Listeria monocytogenes olarak
tespit edilmiştir (Çizelge 4.38).
Enterococcus faecalis ve Enterococcus faecium suşlarının tüm indikatör test
bakterilerine (S.aureus, L.monocytogenes, S.typhimurium, K.pneumoniae ve E.coli)
karşı inhibitör etkisi incelendiğinde; glikozlu ortamda zon çapları daha büyük
gözlenmiştir. Bu koşullarda en büyük etkiyi Enterococcus faecium suşu 16 mm zon
çapıyla L.monocytogenes üzerine göstermiştir.
Genel olarak bakıldığında Enterococcus suşları, glikozlu ortamda S.aureus,
L.monocytogenes ve S.typhimurium üzerine etkili bulunmuştur. K.pneumoniae ve
E.coli üzerine etki göstremediği tespit edilmiştir. Ancak Enterococcus faecium
suşunun gikozlu ortamda E.coli ve K.pneumoni üzerine oluşturduğu zon çapı 4 mm
olarak belirlenmiştir. (Çizelge 4.39).
101
102
5. TARTIŞMA SONUÇ
Gıda teknolojisinde laktik asit bakterilerinin metabolizmaları dolayısıyla enzim
aktivitelerine bağlı olarak, uygun suşların starter kültür olarak kullanılması ürün
kalitesi ve lezzet, renk, koku oluşumunda önem teşkil etmektedir. Bu sebeple laktik
asit bakterilerinin enzimatik özelliklerinin belirlenmesine yönelik çalışmalar starter
kültürlerin oluşturulmasına önemli ölçüde katkı sağlamaktadır. Bununla beraber son
yıllarda gıdalarda doğal koruyucu olarak laktik asit bakterilerinin, patojen bakterilere
karşı inhibitör aktiviteleri araştırma konusu olmaktadır. Gıda endüstrisinde laktik asit
bakterileri inhibitör etkileriyle, gıdaların bozulmasına neden olan aynı zamanda
patojen özellik gösteren bakterilerin üremesini inhibe edebilmektedir. Laktik
bakteriler bu özellikleriyle gıdaların raf ömrünü uzatarak endüstriyel üretimlerde
biyolojik
korunmayı
sağlamaktadır.
Ayrıca
insan
sağlığı
açısından
gıda
zehirlenmelerini ve patojenite riskini azaltmaktadır.
İnsan beslenmesinde önemli bir yeri olan süt, zengin mikrofloraya sahip bir besin
maddesidir. Sütün doğal mikroflorasını laktik asit bakterileri oluşturur. Bu
bakterilerin çeşitli enzim özellikleri, fermente süt ürünlerinin oluşumunda önem
taşımaktadır. Laktik bakteriler metabolizmaları sonucu ürettikleri laktik asit, proteaz,
lipaz, α-amilaz gibi enzimler ile fermente süt ürünlerinin olgunlaşmasında, koku,
renk ve tat oluşumunda görev alırlar. Bu özelliklerin laktik bakteri suşlarında
değerlendirilmesi amacıyla; araştırmamızda 30 çiğ süt örneği çalışılmıştır. 30 süt
örneğinden 74 laktik bakteri izolatı izole edilerek adlandırılmıştır.
Araştırmada izole edilen laktik bakteri cinsleri; 38 Lactobacillus (%51,4), 17
Pediococcus (%23), 8 Leuconostoc (%10,8), 5 Streptococcus (%6,8), 3 Lactococcus
(%4) ve 3 Enterococcus (%4)’ dur.
İzole edilen bakteri cinslerinden adlandırılan türler; 10 Lb. delbrueckii ssp. lactis
(%13,5), 9 Lb. casei (%12,2), 6 Lb. rhamnosus (%8,2), 5 Lb. acidophilus (%6,8) 5
Lb. coryniformis ssp. tourquens (%6,8), 3 Lb. plantarum ssp. plantarum (%4), 5 Leu.
mesenteroides ssp. mesenteroides (%6,8), 3 Leu. mesenteroides ssp. dextranicum
103
(%4), 9 P. pentosaceus (%12,2), 6 P. dextrinicus (%8,2), 1 P.inopinatus (%1,3), P.
acidilactici (%1,3), 4 S. lactis (%5,4), 1 S. cremoris (%1,3), 3 Lactococcus lactis ssp.
lactis (%4), 2 E. faecalis (%2,7) ve 1 E. faecium (%1,3)’ dur. İzole edilip
adlandırılan tüm laktik bakteri cinslerinden en sıklıkla izole edilen Lactobacillus
bakterileridir. En sıklıkla izole edilen tür ise Lb. delbrueckii ssp. lactis olarak
belirlenmiştir.
Araştırmada 17 Pediococcus bakterisinden, 9 P. pentosaceus, 6 P. dextrinicus, 1 P.
inopinatus ve 1 P. acidilactici izole edilmiştir. Pediococcus bakterilerinden en
sıklıkla izole edilen tür P. pentosaceus olarak tespit edilmiştir.
Adıgüzel 2001 yılında yaptığı bir çalışmada, 110 çiğ süt örneğinden 249 laktik asit
bakterisi izole etmiştir. İzole edilen Pediococcus türleri 12 P. pentosaceus, 10 P.
halophilus, 5 P. urinequi ve 4 P. damnosus olmakla beraber en sıklıkla izole edilen
Pediococcus türü P. pentosaceus olarak belirlenmiştir 9. Bizim çalışmamızla
paralellik göstermiştir.
2002 yılında Çetin’in yapmış olduğu araştırmada, 10 çiğ süt örneğinden 27 laktik
bakteri izolatı izole edilmiştir. Bu 27 izolatın 5’i Lactococcus lactis ssp. lactis, 1’i
Lactococcus lactis ssp. cremoris, 1’i Lactococccus raffinolactis ve 11’i Enterococcus
ssp. olarak tespit edilmiştir. Lactococcus cinsi olarak en sıklıkla izole edilen tür
Lactococcus lactis ssp. lactis’tir 10. Bizim araştırmamızda da Lactococcus lactis
ssp. lactis izole edilmiştir.
Araştırmada izole edilen Streptococcus ve Enterococcus türleri; 4 S. lactis, 1 S.
cremoris, 2 E. faecalis ve 1 E. faecium olarak tespit edilmiştir. Streptococcus cinsi
olarak S. lactis, Enterococcus cinsi olarak E. faecalis en sıklıkla izole edilen tür
olmuştur.
Akkuzu (2004), pastörize süt ve pastörize sütlerden hazırlanmış 60 kefir örneğinden
laktik asit bakterilerini izole etmiştir. İzole edilen bakteriler; 3 P. acidilactici, 1 Lb.
104
helveticus, 1 Leu. lactis, 1 Leu. cremoris, 22 E. faecalis, 5 E. faecium, 10 E. durans,
1 E. hirae, 4 E. dispar, 41 S. lactis, 3 S raffinolactis, 1 S. thermophilus ve 1 S.
acidominimus olarak belirlenmiştir. Enterococcus cinsinden en sıklıkla E. faecium,
Streptococcus cinsinden S. lactis izole edilen türlerdir 11. Bizim araştırmamızla
parallelik göstermiştir.
Araştırmada 38 Lactobacillus bakterisinden (10 Lb. delbrueckii ssp. lactis, 9 Lb.
casei, 6 Lb. rhamnosus, 5 Lb. acidophilus, 5 Lb. coryniformis ssp. tourquens, 3 Lb.
plantarum ssp. plantarum) en sıklıkla izole edilen tür Lb. delbrueckii ssp. lactis
olarak belirlenmiştir.
Arslan’ın 2005 yılındaki bir çalışmasında 50 çiğ süt örneğinden 32 laktik bakteri
izole edilip adlandırılmıştır. En sıklıkla izole edilen tür (%22) Lb. delbrueckii ssp.
lactis olmakla beraber, %14 Lb. casei, %14 Lb. rhamnosus, %7 Lb. acidophilus ve
%7 Lb. coryniformis ssp. tourquens izole edilmiştir 13. Bizim çalışmamızla
paralellik gösterdiği tespit edilmiştir.
Gheytanchi ve arkadaşlarının 2010 yılında yapmış olduğu bir çalışmada; 50 süt ve
peynir örneğinden 41 Lactobacillus izole etmişlerdir. Bunlardan 3 Lb. acidophilus, 6
Lb. casei ssp. casei, 7 Lb. casei ssp rhamnosus, 3 Lb. delbrueckii ssp. lactis ve Lb.
plantarum izole edilip adlandırılmıştır 16.
Proteolitik aktivite, mikroorganizmalarca salgılanan proteolitik enzimler ile
proteinlerin hidrolize edilmesidir. Proteolitik aktivite, hem starter kültürlerin asit
oluşturma fonksiyonu hem de fermente ürünün özellikleri açısından önemlidir.
Dolayısıyla sütün doğal mikroflorasını oluşturan ve starter kültür olarak kullanılan
laktik
asit
bakterilerinin
proteolitik
aktiviteleri,
fermente
süt
ürünlerinin
olgunlaşmasında ve ürüne özgü özelliklerin belirlenmesinde önemli bir rol oynar.
Araştırmada, izole edilen 74 laktik bakterinin proteolitik aktivitesi Calsiyum
Caseinat Agar da zon çapları ölçülerek belirlenmiştir. Zon çapları, 4 mm’den küçük
105
olanlar etkisiz, 4–5 mm olanlar zayıf (+) ve 6–8 mm olanlar orta kuvvetli (++)
proteolitik aktif olarak değerlendirilmiştir. 74 laktik bakterinin 70’inde proteolitik
enzim aktivitesi olduğu tespit edilmiştir. Bu 70 bakterinin 36’sı (%51,4) zayıf (+),
34’ü orta (++) proteolitik aktif olarak saptanmıştır.
İzole edilen laktik bakteri cinslerinin (Lactobacillus, Pediococcus, Leuconostoc,
Streptococcus, Enterococcus ve Lactococcus) tümünde proteolitik enzim aktivitesi
gözlenmiştir. En yüksek aktiviteye sahip türler, Lactococcus lactis ssp. lactis, Leu.
mesenteroides ssp. dextranicum ve Pediococcus pentosaceus olmakla beraber zon
çapları 8 mm olarak saptanmıştır.
Karakuş ve arkadaşlarının (1992) yaptığı bir çalışmada, olgunlaşmanın başlangıcında
peynir florasında L. lactis ssp. lactis baskın tür iken, E. faecalis ve E. faecium
bakterilerinin
ikinci
en
önemli
tür
olduğunu
tespit
etmişlerdir.
Peynir
olgunlaşmasında proteolitik ve lipolitik aktivitelerinin önemini vurgulamışlardır.
Bizim çalışmamızda da L. lactis ssp. lactis türünde ve Enterococcus bakterilerinde
proteolitik enzim aktivitesi tespit edilmiştir 17.
Gürsoy ve arkadaşları (2001), az yağlı beyaz peynir üretiminde olgunlaşmayı
hızlandırmak amacıyla ısıl işlem uygulanmış (65 0C’ de 20 dk.) starter kültür ( Lb.
helveticus
veya
Lb.
kullanılabileceklerini
delbrueckii
bildirmişlerdir.
ssp.
bulgaricus;
Olgunlaşmanın
0.5
30.
g/100g)
başarıyla
gününde
proteoliz
düzeyinin arzu dilen seviyelere yükseldiğini ve Lb. helveticus kullanımının daha iyi
sonuç verdiğini tespit etmişlerdir 19.
Araştırmada zon çapı ölçümlerine göre proteolitik enzim aktiviteleri değerlendirilen
laktik bakterilerden, Lactococcus lactis ssp. lactis türü bakteriler Lactobacillus
bakterilerine göre daha yüksek proteolitik aktivite gösterdiği tespit edilmiştir.
106
Perez ve arkadaşları (2003) tarafından yapılan bir çalışma sonucunda, çeşitli suşlar
arasında Lactococcus cinsinin Lactobacillus cinsine oranla daha yüksek proteolitik
aktivite gösterdiğini belirlemişlerdir 37. Bizim çalışmamızla paralellik göstermiştir.
Çalışmada izole edilen Lactobacillus türlerinin proteolitik enzim aktiviteleri
karşılaştırıldığında; Lb. acidophilus türünün zon çapı ölçümleri Lb. plantarum ssp.
plantarum türüne oranla daha yüksek olduğu belirlenmiştir.
Yüksekdağ’ın 2005 yılında kefirden izole ettiği laktik asit bakterileriyle yaptığı bir
çalışmada, 21 Lactobacillus izole etmiştir. 1 Lb. acidophilus, 2 Lb. helveticus, 4 Lb.
casei, 3 Lb. bulgaricus, 6 Lb. lactis, 3 Lb. plantarum ve 2 Lb. brevis’dir. Bu
izolatların proteolitik aktivitelerine bakıldığında, maximum proteolitik aktivite Lb.
acidophilus türünde gözlenirken minimum aktivite Lb. plantarum türünde
gözlenmiştir 12. Bizim çalışmamızla paralellik göstermiştir.
Araştırmada proteolitik aktivitesini incelediğimiz 3 Enterococcus bakterisinin
2’sinde zayıf kuvvetli proteolitik aktivite gözlenmiş olup, zon çapları 5 mm olarak
tespit edilmiştir.
Topisirovic ve arkadaşları (2009), fermente ürünlerden elde ettikleri 26 Enterokok
türünün proteolitik ve antimikrobiyel özellikleri üzerine yaptıkları çalışmada βkazein’e karşı 25 enterokok türünün güçlü veya orta derecede proteolitik aktivite
gösterdiğini saptamışlardır 21.
Proteolitik bir enzim olan elastaz, elastin ve diğer proteinlerin daha basit moleküllere
ayrılmasını katalize eder. Genellikle aminoasitlerin karbonil gruplarının bulunduğu
bağlardaki polipeptit zincirini kıran, serin endopeptidazların bir grubudur. Elastaz
birçok bakteriye virulans özellik kazandıran bir enzimdir.
Araştırmada izole edilen laktik asit bakterilerinin elastaz enzim aktiviteleri Elastinli
Nutrient Agar da çizgi ekim metoduyla incelenmiştir. Literatür araştırmalarında
107
laktik bakterilerin elastaz aktiviteleri ile ilgili çalışmalara rastlanmamıştır. Bizim
çalışmamızda da laktik bakteri suşlarında elastaz enzim aktivitesi saptanmamıştır.
Süt lipitleri, süt içinde bulunan en önemli bileşenlerden birisidir ve süt yağı lipaz
enziminin etkinliğiyle yağ asidi ve gliserine parçalanır. Lipaz enzimi süt içinde doğal
halde bulunabileceği gibi mikrobiyal kaynaklı da olabilir. Laktik asit bakterilerinin
lipaz aktivitesi tür ve cinslere göre farklılık göstermektedir. Süt endüstrisinde laktik
asit bakterilerinin proteoliz ve lipoliz enzim aktiviteleriyle, fermente ürünlerde
tekstür, aroma ve lezzet oluşumu sağlanmakta olup, laktik bakterilerin lipolizi, birçok
peynirde lezzet gelişimi için gereklidir.
Çalışmada lipolitik enzim aktiviteleri araştırılan laktik bakteri suşlarının, Trybutrin
Agarda oluşturdukları zon çapları ölçülmüştür. Zon çapı 4 mm ve 4 mm den fazla
olan suşların lipolitik aktivitesi pozitif olarak değerlendirilmiştir. 74 laktik bakterinin
12’sinde zon çapı gözlenmiştir. Lactobacillus, Pediococcus, Leuconostoc ve
Enteococcus cinslerinde zon çapı gözlenirken, Streptococcus ve Lactococcus
cinslerinde gözlenmemiştir.
Lb. acidophilus, Lb. delbrueckii ssp. lactis, P. pentosaceus, P. dextrinicus, Leu.
mesenteroides ssp. mesenteroides ve E. faecalis türlerinde zon çapı 2 mm olarak
saptanmıştır. 4 mm zon çapıyla Leu. mesenteroides ssp. dextranicum türünün
lipolitik enzim aktivitesi gösterdiği tespit edilmiştir.
Literatür çalışmalarında laktik asit bakterilerinin lipaz enzim aktivitesi tür ve cinslere
göre farklılık gösterirken, Leu. mesenteroides ssp. dextranicum en yüksek lipolitik
aktiviteye sahip olan türdür 24. Bizim araştırmamızla paralellik göstermiştir.
Collins ve arkadaşları (2003) starter laktik asit bakterilerinin otolizi ile Cheddar
peynirinin olgunlaşması sırasında serbest yağ asitlerinin (SYA) artan birikimi
arasında bir ilişki gözlemlemişlerdir ve bunun peynirde intrasellüler lipolitik
aktivitenin artan oranına bağlı olabileceğini ifade etmişlerdir 41.
108
Rasouli Pirouzan ve arkadaşları (2010) E. faecalis, E. faecium ve bunların ortak
kullanımıyla hazırlanmış peynirlerde lipolize olan katkılarını inceledikleri bir
çalışmada, olgunlaşma süresince lipoliz indeksinin önemli ölçüde kontrol grubuna
nazaran daha yüksek olduğu saptanmıştır. Bu peynirlerde serbest yağ asidi miktarının
daha fazla olduğu bildirilmiştir. Bu sonuç ilave enterokokların peynirde lipolize
katkıda bulunduğunu göstermektedir 22.
α-Amilaz enzimi, ham ve çözünür nişasta molekülündeki α-1,4glikozidik bağlarını
parçalayarak, glikoz, maltoz, maltotrioz ve α-limit dekstrinlerin oluşumunu katalize
eden bir enzimdir. Bu enzim tekstil ve kâğıt endüstrisinde, nişastanın
sıvılaştırılmasında, ekmek, glikoz ve fruktoz şurupları ve tutkal üretiminde, alkol
fermentasyonunda kullanılmaktadır. Laktik asit bakterilerinde α-amilaz enziminin
varlığıyla ilgili bazı çalışmalar yapılmış olup, özellikle Lactobacillus cinsinde bu
enzimin varlığı tespit edilmiştir.
Çalışmada 74 laktik bakterinin α-amilaz enzim aktivitesi Luria Bertani Nişasta
Agarda araştırılmıştır. İnkübe edilen bakterilerden iyodik boyama sonrası parlama
yapan suşlar α-amilaz aktivitesi (+) olarak değerlendirilmiştir. 74 laktik bakterinin
6’sında α-amilaz enzim varlığı tespit edilmiştir. Lactobacillus, Pediococcus ve
Leuconostoc cinsi bakterilerde α-amilaz enzim aktivitesi gözlenirken, Streptococcus,
Lactococcus ve Enterococcus cinsinde gözlenmemiştir.
Aktivite gösteren türler; Lb. plantarum ssp. plantarum, Lb. casei, Lb. coryniformis
ssp. tourquens, P. pentosaceus ve Leu. mesenteroides ssp. dextranicum olarak
saptanmıştır.
Rodriguez-Sanoja ve arkadaşlarının 2005 yılında yapmış olduğu bir çalışmada, Lb.
plantarum ve Lb. amylovorus’un α-amilaz enzim üretimleri karşılaştırılmış. Lb.
amylovorus’un α-amilaz enzim üretiminin Lb. plantarum’a göre 10 kat daha fazla
nişasta hidrolize ettiğini tespit etmişlerdir 45.
109
Laktik asit bakterilerinin starter kültür olarak seçilmelerinde enzim aktiviteleri önem
teşkil etmektedir. Gıda endüstrisinde starter kültür olarak kullanım potansiyeli olan
mikroorganizmaların γ-hemolitik suşlar olması gerekmektedir. Laktik bakterilerde
hemolitik aktivite genellikle Streptococcus, Lactococcus ve Enterococcus cinslerinde
görülebilmektedir.
Araştırmada izole edilen laktik bakterilerin hemolitik enzim aktivitesi Colombia
Blood Agar da incelenmiştir. Hemolitik aktivitesi pozitif olan türler; Streptococcus
lactis, Lactococcus lactis ssp. lactis ve Enterococcus faecium’dur. Lactobacillus,
Pediococus ve Leuconostoc cinslerinde hemolitik aktivite saptanmamıştır.
Lactococcus cinsi üyeleri, genellikle hemolitik reaksiyon göstermezler. Ancak bazı
L. lactis subsp. lactis suşlarında zayıf da olsa α-hemoliz görülebilir 23. Yine aynı
şekilde Enterococcus faecium türünün bazı suşlarıda α-hemolitik olabilmektedir 56.
2008 yılında Anas ve arkadaşlarının yaptığı bir çalışmada, Cezayirde çiğ keçi
sütünden
izole
edilen
64
Lactobacillus
suşunun
hemolitik
aktivitelerini
incelemişlerdir. Lactobacillus suşlarında hemolitik aktivitenin olmadığını rapor
etmişlerdir 48. Hemolitik aktivitenin olmaması süt için kullanılan starter kültür
seçiminde bir kriter oluşturmaktadır. Bizim çalışmamızda da Lactobacillus
bakterilerinde hemolitik aktivite olmadığı tespit edilmiş olup, çalışmamızla paralellik
göstermiştir.
Laktik asit bakterilerinin en önemli özelliklerinden birisi de, aynı ortamda bulunan
patojen ve kontaminant mikroorganizmaların gelişimini inhibe edebilmeleridir. Süt
ve süt ürünlerinde bulunan bakterilerin inhibisyonunda, laktik bakterilerin ürettikleri
organik moleküller (laktik, asetik, formik, propiyonik asit) ve antimikrobiyal
bileşikler (hidrojen peroksit, diasetil ve bakteriosin) etkili olmaktadır.
Araştırmada, izole edilen laktik bakterilerin inhibitör etkisi Nutrient Agar ve %0,2
glikozlu Nutrient Agarda kuyu difüzyon metoduyla incelenmiştir. Adlandırılan laktik
110
bakteri türlerinin her birinden bir örnek alınarak, 17 laktik bakteri türünün
patojenlere inhibitör etkisi çalışılmıştır. İndikatör bakteri olarak; Staphylococcus
aureus, Listeria monocytogenes, Salmonella typhimurium, Klebsiella pneumoniae ve
E. coli patojenleri kullanılmıştır. Laktik asit bakterilerinin patojen bakteriler
üzerindeki inhibitör etkisi zon çapları ölçülerek değerlendirilmiştir. Zon çapı 4
mm’nin üzerinde olanlar pozitif olarak rapor edilmiştir.
Sonuç olarak 17 laktik bakteri türü Staphylococcus aureus, Listeria monocytogenes
ve Salmonella typhimurium üzerine etkili bulunmuştur.
Lactobacilluslar tüm indikatör bakterilere karşı inhibitör etki göstermiştir ve zon
çapları 2-18 mm arasında ölçülmüştür.
Yine çalışılan tüm laktik bakterilerin en etkili olduğu patojen bakteri L.
monocytogenes’dir. En yüksek 18 mm zon çapı Lb. delbrueckii ssp. lactis de tespit
edilmiştir.
Araştırmada iki farklı besiyerinde inhibitör etki çalışılmıştır. Deney sonucunda %0,2
glikozlu Nutrient Agarda zon çapı ölçümlerinin daha büyük olduğu gözlenmiştir.
Arslan’nın 2005 yılında yapmış olduğu bir çalışmada iki farklı ortamda inhibitör etki
çalışılmıştır. Aynı şekide glikozlu Nutrient Agarda zon çaplarını daha büyük tespit
etmiştir 13. Bizim araştırmamızın sonuçlarını doğrulamıştır.
Garcia ve arkadaşları 1993 yılında laktik asit bakterilerinin Listeria monocytogenes’e
karşı inhibitör etkilerini tespit etmişlerdir. Çalışmalarında besiyerine %0,2 oranında
glikoz ilave etmişlerdir 76.
Garriga ve arkadaşlarının 1993 yılında yaptığı bir çalışmada da Lactobacillus
suşlarının Listeria monocytogenes üzerine inhibitör etkisini tespit etmek için
besiyerine %0,2 oranında glikoz ilave etmişlerdir. Araştırmaları sonucunda bu
111
suşların Listeria monocytogenes’e karşı inhibisyon oluşturduğunu tespit etmişlerdir
77.
Yaptığımız araştırmada, İnhibitör zon çapları incelen Lactobacillus bakterileri (Lb.
delbrueckii ssp. lactis, Lb. casei, Lb. acidophilus, Lb. rhamnosus, Lb. coryniformis
ssp. tourquens ve Lb. plantarum ssp. plantarum) S.aureus, L.monocytogenes,
S.typhimurium’a etkili bulunmuştur. Lb. delbrueckii ssp. lactis’in en yüksek etkiyi
indikatör bakterilerden L. monocytogenes ve S.typhimurium’a göstermiştir.
Tüm laktik bakterilerin E. coli üzerinde oluşturdukları zon çapları 0 ile 4 mm
arasında değişmektedir. Lb. plantarum ssp. plantarum ve E. faecium’ un zon çapı 4
mm ölçülmüştür ve E. coli’ye etkili bulunmuştur. Diğer laktik bakteri türleri E.
coli’ye etki göstermemiştir.
Aynı şekilde, Çon ve Gökalp 2000 yılında kuyu difüzyon tekniği kullanarak
yaptıkları bir çalışmada, Pediococcus pentosaceus suşlarının, E. coli’ ye karşı
inhibitör etkisinin bulunmadığını göstermişlerdir 29.
Yaptığımız çalışma sonuçlarını doğrulayan bir diğer araştırma, Schillinger ve
arkadaşları (2001)’nın ki olup, çalışmalarında, laktik asit bakterilerinin Listeria
monocytogenes üzerine bakteriosin etkisini incelemişler, L. monocytogenes üzerine
gıdalara ilave edilen ve bakteriosin sentezleyen laktik bakterilerinin etkisini tespit
etmişlerdir 78.
Bir diğer çalışmada, Kılıç 2003 yılında Lactobacillus suşlarının S. aureus’a karşı
inhibitör etkisini incelemiş ve Lactobacillus acidophilus suşunun S. aureus üzerine
etki oluşturduğunu belirtmiştir 72.
2003 yılında Çadırcı Lb. plantarum’un Salmonella üzerine inhibitör etki gösterdiğini
tespit etmiştir 79.
112
Chuayana ve arkadaşları 2003 yılında, laktik asit bakterilerinin S. aureus, E. coli ve
Salmonella typhi üzerine antimikrobiyel etkilerini araştırmışlardır. Streptococcus
spp. ve Lactobacillus spp. suşları S. aureus’a etki gösterirken Salmonella typhi ve E.
coli’ye karşı etki göstermediğini rapor etmişlerdir 80.
Yukarıda anlatılan çalışmalar, bizim çalışmamızın sonuçlarını desteklemekte olup,
araştırmamızda da, Lb. acidophilus ve Lb. plantarumm ssp. plantarum bakterileri S.
aureus, L. monocytogenes ve S. typhimurium üzerine etki gösterdiği tespit edilmiştir.
Dixit ve arkadaşları 2013 yılında Lactobacillus acidophilus suşlarının Pseudomonas
aeruginosa, Klebsiella pneumoniae, S. aureus, E. coli ve Salmonella typhi üzerine
antibakteriyal etkilerini incelemişlerdir. P. aeruginosa ve K. pneumoniae etkisiz
bulunurken, Salmonella typhi’ye etkili bulunmuştur 85.
Araştırmada Lb. acidophilus bakterisi K. pneumoniae’ye etki göstermemiştir. Lb.
acidophilus’un zon çapı hem Nutrient Agarda hem de %0,2 glikozlu Nutrient Agarda
2 mm ölçülmüştür. Yapılan çalışma sonuçlarımızı doğrulamaktadır.
Araştırmada, Lactococcus lactis ssp. lactis bakterisi L. monocytogenes, S. aureus ve
S. typhimurium’a etkili bulunmuştur. Zon çapı ölçümleri 2 ile 17 mm arasında
değişmiştir. En yüksek etkiyi L. monocytogenes üzerine göstermiştir. Lactococcus
lactis ssp. lactis’in zon çapı 17 mm ölçülmüştür.
2005 yılında Rodriguez ve arkadaşları yaptıkları bir çalışmada pediosin üreten
Lactococcus lactis’in L. monocytogenes, S. aureus ve E. coli O157:H7’ nin
gelişimini engellediğini tespit etmişlerdir 82.
Gonzalez ve arkadaşlarının 2006 yılında yaptıkları çalışmada, Lactococcus lactis ssp.
lactis suşlarının S. aureus ve Listeria monocytogenes üzerine antibakteriyel etki
gösterdiğini bildirmişlerdir 81.
113
Yaptığımız
araştırma
sonuçlarıyla
Rodriguez
ve
Gonzalez’in
çalışması
karşılaştırıldığında L. lactis ssp. lactis’in S. aureus ve L. monocytogenes’e etkili
bulunması paralellik göstermiştir.
Tuncer ve arkadaşlarının 2008 yılında yaptığı bir çalışmada, E. coli’ de inhibitör etki
gözlenmezken, S. aureus üzerine L. lactis ssp. lactis suşunun etkili olduğunu tespit
etmişlerdir 68.
Çalışmamızda E. coli bakterisine karşı E. faecium zayıf etki gösterirken, diğer laktik
bakteri türleri etki göstermemiştir. L. lactis ssp. lactis de etkili bulunmamıştır.
Tuncer’in çalışması sonuçlarımızı doğrulamaktadır.
Araştırmada, Pediococcus ve Leuconostoc bakterilerinin etkisi değerlendirildiğinde,
tüm üyeler S. aureus, L. monocytogenes ve S.typhimurium’a etkili bulunurken E.
coli ve K. pneumoniae’ye etki göstermemiştir. P. inopinatus, P. pentosaceus ve L.
mesentereoides ssp. mesenteroides 14 mm zon çapıyla en yüksek etkiyi L.
monocytogenes üzerinde göstermişlerdir.
Adıgüzel’in 2001 yılında
yaptığı
çalışmasında da, Listeria monocytogenes ve S. aureus bakterilerinde Pediococcus
pentosaceus ve Leuconostoc dextranicum türleri etkili bulunmuştur 9.
Yapılan
çalışma
sonuçlarında
Enterococcus
faecalis
suşu
S.
aureus,
L.
monocytogenes ve S. typhimurium’ a etki gösterirken, E. coli ve K. pneumoniae’ye
etki göstermemiştir. E. faecium ise tüm indikatör bakterilere etki göstermiştir.
Etöz 2006 yılında yapmış olduğu bir çalışmada, Enterococcus faecalis ve
Enterococcus faecium bakterilerinin, S. aureus ve Listeria monocytogenes üzerinde
etkisini gözlemlemiştir 83.
2008 yılında İşleroğlu ve arkadaşlarının yapmış olduğu bir çalışmada, Enterococcus
faecalis’in L. monocytogenes’e karşı inhibitör etki gösteriken E. coli’ye etkili
olmadığını gözlemlemişlerdir 55. Bizim çalışmamızla paralellik göstermiştir.
114
Sonuç olarak; laktik asit bakterilerinin enzimatik özellikleri süt endüstrisinde
fermente ürün oluşumunda önemlidir. Aynı zamanda starter kültür olarak
kullanılmaktadırlar. Fermente ürünün tat ve aromasının oluşumunu laktik bakterilerin
enzimleri etkilemektedir. Bu nedenle laktik bakterilerin enzim özelliklerinin
belirlenmesi gıda endüstrisinde fermente ürünlerin üretimleri açısından önem
kazanmaktadır.
Proteaz enzim aktivitesi en yüksek tespit edilen laktik bakteri türleri; Lactococcus
lactis
ssp.
lactis,
Leu.
mesenteroides
ssp.
dextranicum
ve
Pediococcus
pentosaceus’dur.
Lipaz enzim aktivitesi tespit edilen tür; Leu. mesenteroides ssp. dextranicum’dur.
-amilaz enzim aktivitesi belirlenen türler; Lb. plantarum ssp. plantarum, Lb. casei,
Lb. coryniformis ssp. torquens, Pediococcus pentosaceus ve Leu. mesenteroides ssp.
dextranicum’dur.
Hemolitik enzim aktivitesi saptanan türler; Streptococcus lactis, Lactococcus lactis
ssp. lactis ve Enterococcus faecium’dur.
Laktik asit bakterilerinin proteolitik ve lipolitik enzim aktivitesi fermente ürünlerin
lezzet ve aromasında etkili olmakla beraber özellikle süt endüstrisinde peynirlerin
olgunlaşmasını, tereyağının lezzet ve aromasının oluşumunu sağlar. Bu sebeple
enzim aktivitelerini tespit ettiğimiz laktik bakteri türlerinin gıda endüstrisinde starter
kültür çalışmalarına katkı sağladığı düşünülmektedir.
Bu bakterilerin bir diğer önemli özelliği olan inhibitör etkileri sayesinde ise;
gıdalardaki patojen mikroorgizmalar inhibe olmaktadır. Laktik bakteriler bu
özellikleri ile, patojen mikroorganizmaların zararlı etkilerinden gıdaları koruyarak,
raf ömrünü uzatmaktadırlar. Ayrıca insan sağlığı açısından, gıda zehirlenmelerine ve
patojen bakterilerin olumsuz etkilerine karşı koruyucu etki oluşturmaktadırlar.
115
KAYNAKLAR
1. Toksoy A., “Lactobacillus plantarum ve Pediococcus pentosaceus suşlarının
metabolik ve antimikrobiyal aktivitelerinin incelenmesi”, Gazi Üniversitesi
Fen Bilimleri Enstitüsü, Doktora Tezi, 5-15 (1996)
2. Kleerebezem, M., Hugenholtz, J., “Metabolic pathway engineering in lactic
acid bacteria”, Current Opinion in Biotechnology, 14: 232-237 (2003).
3. Hylckama, Vlieg van J. E. T., Hugenholtz, J., “Mining natural diversity of
lactic acid bacteria for flavour and health benefits”, Internatıonal Dairy
Journal, 17: 1290-1297 (2007).
4. Aslım, B., Beyatlı, Y. and Halkman, K., “ Yoğurt starter kültür
metabolitlerinin inhibisyon etkisi”, Turk J. Biol., 24 65-78 (2000).
5. Hugenholtz, J., “The lactic acid bacterium as a cell factory for food ingredient
production”, International Dairy Journal, 18: 466-475 (2008).
6. Caplice, E., Fitzgerald, G. F., “Food fermentations: Role of microorganisms
in food production and preservation”, International Journal of Food
microbiology, 50: 131-149 (1999).
7. Lücke, F. K., “Lactic acid bacteria involved in food fermentations and their
present and future uses in food industry”, NATO ASI Series, Series H: Cell
Biology, New York 98: 81-99 (1996).
8. Egan, A. F., “Lactic acid bacteria of meat and meat products”, Antonie van
Leeuwenhoek , 49: 327- 336 (1983).
9. Adıgüzel, S., “Çiğ Sütlerden İzole Edilen Streptococcus, Leuconostoc,
Pediococcus Türlerinin Değişik Tuz Konsantrasyonlarında Staphylococcus
aureus, Bacillus subtilis ve Bacillus cereus Türleri Üzerine İnhibitör
Etkilerinin Araştırılması”, Gazi Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü Yüksek
lisans Tezi, 25-47 (2001).
10. Çetin, A.E., “ Isolation and Molecular Characterization of Lactic Acid
Bacteria From Raw Milk”, İzmir Institute of Technology, Master of Science
3-15 (2002).
11. Akkuzu, S., “Kefir mikroflorası içerisinde çeşitli patojenlerin yaşam
süreleri”, Yüksek Lisans Tezi, Gazi Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü,
Ankara,124-127 (2005).
12. Yüksekdağ, Z.N., “Bazı laktik asit bakterilerinin fizyolojik, biyokimyasal,
plazmid-DNA ve protein profil özelliklerinin incelenmesi” Gazi Üniversitesi
Fen Bilimleri Enstitüsü, Doktora Tezi 1-12 (2005).
116
13. Arslan, S., Uraz, G., “Inhibitory activity of natural isolates of lactic acid
bacteria from raw milk againts”, Hazardousmicrobes, Milcwissenschaft.,
60(1) : 31-33 (2005).
14. Coşkun, S., “ Beyaz peynirde 90 gün olgunlaşma süresi boyunca Listeria
monocytogenes varlığı”, Gazi Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü, Doktora
Tezi, 44-50 (2006).
15. Tatlı, D., “ Geleneksel süt ürünlerinden izole edilen laktik asit bakterilerinin
antibiyotik dirençlerinin belirlenmesi”, Çukurova Üniversitei Fen Bilimleri
Enstitüsü, Yüksek Lisans Tezi, 1-10 (2009).
16. Gheytanci E. et al., “Study on beta-galaktosidase enzyme produced by
isolated lactobacilli from milk and cheese” African journal of microbiology
Research, vol 4(6), pp. 454-458 (2010).
17. Karakuş, M., Borçaklı, M., Alperden, I., “Beyaz peynirin olgunlaşması
sürecinde laktik asit bakterileri”. Gıda, 17; 363-369 (1992).
18. Uraz, G., Gündoğan, N., “Beyaz peynirlerin mezofil mikroflorasında
Koliform, Streptokok, Laktobasil, Leukonostok, Pediokok, Stafilakok ve
Basillusların bulunma sıklıkları”. Gıda, 23; 391-401 (1998).
19. Gürsoy, A., Gürsel, A., Şenel, E., Deveci, O., Karademir, E., “Yağ içeriği
azaltılmış Beyaz peynir üretiminde Lactobacillus helveticus ve Lactobacillus
delbrueckii ssp. bulgaricus kültürlerinin kullanımı”, GAP II. Tarım
Kongresi, Şanlıurfa, Ekim 24-26, s. 269-278 (2001).
20. Gürsel, A., Gürsoy, A., Şenel, E., Deveci, O., Karademir, E., “The use of
freeze-shocked lactic starters in low-fat White pickled cheese.”,
Milchwissenschaft, 58(5/6); 279-282 (2003).
21. Topisirovic L, Veljovic K, Fira D, Terzic-Vidojevic A, Abriouel H, Galvez,
A., “Evaluation of antimicrobial and proteolytic activity of enterococci
isolated from fermented products”, Eure Food Res Technol, 230 (1), 63-70
(2009).
22. Rasouli Pirouzian H., Hesari J., Farajnia S., Moghaddam M., Ghiassifar S.,
Manafi M., “Inclusion of Enterococcus faecalis and Enterococcus faecium to
UF White Cheese”, WASET, 66, 850-854 (2010).
23. Yıldırım, R., “ Nisin Üreticisi Lactococcus lactis subsp. lactis LL27 Suşunun
Beyaz Peynirde Listeria monocytogenes’in gelişiminin engellenmesi üzerine
etkisi”, Ankara Üniversitesi Biyoteknoloji Enstitüsü, Yüksek Lisans Tezi,
4–7, 39-46 (2010).
117
24. Kılıç S., “ Süt endüstrisinde laktik asit bakterileri” I. Baskı. Ege Üniv.
Ziraat. Fak. Yayınları, No: 542. Bornova, İzmir (2004).
25. Gonzalez L. et al, “Enzymatic activity of lactic acid bacteria isolated from a
traditional Spanish cheese”, Food Microbiology, 27, 592-597 (2010).
26. Arslan S., “ Çiğ süt, pastörize süt ve beyaz peynirde üreyen bakterilerde
beta-laktamaz araştırılması”, Gazi Üniversitesi Fen Bilimleri Enstitüsü,
Yüksek Lisans Tezi, Temmuz, 3-10 (1994).
27. Tamime Ay and Robinson RK, Microbiology of yoghurt and “bio” cultures,
in: Tamime Ay and Robinson RK (eds.), “ Yoghurt science and technology”,
Cambridge, Woodhead, 2nd edn, pp. 389-431, (1999).
28. Yaygın, H., Toklu G.Ş., “Süt Ürünleri Üretiminde Starter Kültürler”, VI. Süt
ve Süt Ürünleri Sempozyumu, Tekirdağ (2000).
29. Çon A., Gökalp H.Y., “ Laktik asit bakterilerinin antimikrobiyal
metabolitleri ve etki şekilleri”, Türk Mikrobiyol Cem Derg, 30:180-190
(2000).
30. Tamime, A. Y. and Deeth, H. C., “Yoghurt: Technology and biochemistry”,
J. Food Prot., 43(12), 939-977, (1980).
31. Oneca M, Ortigosa M, Irigoyen A, Torre P, “Proteolytic activity of some
Lactobacillusparacasei strains in a model ovine-milk curd system:
Determination of free amino acids by RP-HPLC”, Food Chem, 100 (4),
1602-1610) .(2007).
32. Milesi MM, Bergamini CV, Hynes E., “Production of peptides and free
amino acids in asterile extract describes peptidolysis in hardcookedcheeses”,
Food Res Int, 44 (3), 765-773 (2011).
33. Kıran E. Ö. et al., “Bazı mikrobiyal enzimler ve endüstrideki kullanım
alanları”, Journal of science and engineering, 9(1), (2006).
34. Rajagopal, S. N., Sandine, W. E., “Assocative growth and proteolysis of
Streptococus thermophilus and Lactobacillus bulgaricus in skim milk”, J.
Dairy Sci., 73, 894-899 (1990).
35. Aslım, B., “L. bulgaricus ve S. thermophilus Bakterilerinin Metabolik ve
Antimikrobiyal Aktiviteleri Üzerine Bazı Fiziksel ve Kimyasal Mutagenlerin
Etkisi”, Doktora Tezi, G. Ü. Fen Bil. Enst., Ankara 12-23 (1994).
36. Tekinşen, O.C. ve Atasever, M., “Süt ürünleri üretiminde Starter Kültür”
Selçuk üniv. Veteriner Fakültesi Yayın ünitesi, Konya (1994).
118
37. Perez, G., Cardell, E., Zarate, V., “Technological characterization of lactic
acid bacteria from Tenerife cheese”, Int.J. Food Sci. Tech, 38, 537-546
(2003).
38. Herreros, M.A., Fresno, J.M., Gonzalez Prieto, M.J., Tornadjio, M.E.,
“Technological characterization of lactic acid bacteria isolated from Armada
cheese ( a Spanish goats’ milk cheese)”, Int. Dairy J., 13. 469-479 (2003).
39. Pitas RE., Jensen RG., “Action of pregastric esterase on synthetic
triglycerides combining butyric acid”, J Dairy Sci, 53, 1083 (1970).
40. Marilley, L. and M.G. Casey., “Flavours of cheese products: metabolic
pathways, analytical tools and identification of producing strains”, Int. J.
Food Microbiol., 90:139–159 (2004).
41. Collins YF., McSweeney PLH., Wilkinson MG., “Evidence of a relationship
between autolysis of starter bacteria and lipolysis in Cheddar cheese during
ripening”, J. Dairy Res., 70, 105–113 (2003).
42. Reiter B., Fryer TF., Pickering A., Chapman HR., Lawrence RC., Sharpe
ME., “The effect of the microbial flora on the flavour and free fatty acid
composition of Cheddar cheese”, J. Dairy Sci., 34, 257–271 (1967).
43. Kilcawley KN., Hickey DK., Beresford TP., Wilkinson MG., “Starter
bacteria are the prime agents of lipolysis in cheddar cheese”, J. Agric. Food
Chem., 54, 8229-8235 (2006).
44. Güven, R.G., “Termofilik Bakteriler ve Biyoteknolojik Açıdan Önemli Bazı
Enzimleri”, Elektronik Mikrobiyoloji Dergisi, TR, cilt:09, sayı:1, sayfa:1-10
(2011).
45. Rodriguez-Sanoja, “Starch-binding domain affects catalysis in two
Lactobacillus alpha-amylases” Departamento de Biologia Molecular
Biotecnologia, Instituto de Investigaciones Biomedicas, UNAM A P 70228,
04510 Mexico City, Mexico Appl Environ Microbiol, 71:297-302 (2005).
46. Maragkoudakis, P.A., Zoumpopoulou, G., Miaris, C., Kalantzopoulos, G.,
Pot, B. and Tsakalidou, E., “ Probiotic potential of Lactobacillus strains
isolated from dairy products.”, Int. Dairy J., 16;189-199 (2006).
47. Mourad, K. and Nour-Eddine, K., “Microbiological study of naturally
fermented Algerian green olives: Isolation and identification of lactic bacteria
and yeasts along with the effects of brine solutions obtained at the end of
olive fermentation on Lactobacillus plantarum.”, Grasas Y Aceites, 57:292300 (2006).
119
48. Anas, M., Eddine, H.J., Mebrouk, K., “Antimicrobial Activity of
Lactobacillus Species Isolated from Algerian Raw Goat’s Milk Against
Staphylocccus aureus”, World Journal of Dairy, Food Sciences,3(2): 39-49
(2008).
49. Beijerinck, M.W., “Sur les ferments lactiques de l’industrie”, Arch. Néer.
Sci., (sect. 2) 6: 212–243 (1901).
50. Axelsson, L.T., “ Lactic acid bacteria: classification and physiology”, In:
Salminen S., von Wright, A., editors. Lactic acid bacteria. New York: Marcel
Dekker, Inc., 1-72 (1993).
51. Buckenhüskes H.J., “Selection criteria for lactic acid bacteria to be used as
starter cultures for various food commodities”, FEMS, Microbiol. Rev., 12,
253-71 (1993).
52. Vandenbergh P.A., “Lactic acid bacteria their metabolic products and
interference with microbial growth”, FEMS Microbiol. Rev., 12, 221-37
(1993).
53. Axelsson L., “Lactic acid bacteria: classification and physiology”, in:
Salmion S. and Von Wright A. (eds.) “ Lactic acid bacteria”, New York,
Marcel Dekker, 2nd edn pp. 1-72 (1998).
54. Choisy C., Desmazeaud M., Gueguen M. et al., “Microbial phenomera”, in:
Eck A and Gillis J. (eds.) cheesemaking: From science to Quality
Assurance, Paris, Lovoisier, 2nd edn, pp. 353-417 (2000).
55. İşleroğlu, H. Yıldırım, Z. ve Yıldırım, M., “ Yöresel peynirden
antimikrobiyal aktiviteye sahip laktik asit bakterisinin izolasyonu ve tanısı”,
Gazi Osmanpaşa Üniversitesi Ziraat Fakültesi Dergisi, 25 (1), 1-6 (2008).
56. Vos, P.; Garrity, G.; Jones, D.; Krieg, N.R.; Ludwig, W.; Rainey, F.A.;
Schleifer, K.-H.; Whitman, W.B. (Eds.). Bergey’s of manual systematic
Bacteriology, 460-480 (2009).
57. Orhan S., “ Çiğ süt ve peynir örneklerinde Enterococcus’ ların izole edilmesi
ve proteolitik aktivitelerinin araştırılması”, Gazi Üniversitesi Fen Bilimleri
Enstitüsü, Yüksek Lisans Tezi, Eylül, 27-31 (2003).
58. Kılıç, S., “Yoğurt kültürünü oluşturan L. bulgaricus ve S. thermophilus
bakterilerinin antibakteriyal özellikleri üzerine bir araştırma”, Gıda, 15(6),
333-338 (1990).
59. Blandino, A., Al-Aseeri, M.E., Pandiella, S.S., Cantero, D., Webb, C.,
“Cereal-Based Fermented Foods and Beverages”, Food Research
International, 36, 527-543 (2003).
120
60. Ham, J.S., Kim, H.S., Hong, K.H., Kim, J.G., Jeong, S.G., Chae, H.S., Ahn,
J.N., Kang, D.K., and Kim, H.U., “ Inhibitory activity of lactic bacteria
againts hazardous microbes”, Asian-Aust. J. Animal Sci., 16: 1550-1554
(2003).
61. Rodriguez, J.M., Martinez, M.I., Horn, N. and Dodd, H.M., “ Heterologous
production of bacteriocins by lactic acid bacteria”, Int. J. Microbiol., 80:
101-116 (2003).
62. Attaie, R., Whalen, P.J., Shalani, K.M. and Amer. M.A., “ Inhibition of
growth of Staphylococcus aureus during production of acidophilus yoğurt”, J.
Food Prot., 50: 224-228 (1987).
63. Okereke, A. and Montville, T.J., “ Bacteriocin inibition of Clostridium
botulinum spores by lactic acid bacteria”, J. Food Prot., 54: 349-353 (1991).
64. C. Charlier, S. Even, M. Gautier, Y. Le Loir, “Acidification is not involved in
the early inhibition of Staphylococcus aureus growth by Lactococcus lactis in
milk”, International Dairy Journal, 18 (2008), pp. 197–203 (2008).
65. D. Hernandez, E. Cardell, V. Zarate “Antimicrobial activity of lactic acid
bacteria isolated from Tenerife cheese: initial characterization of plantaricin
TF711, a bacteriocin-like substance produced by Lactobacillus plantarum
TF711”, Journal of Applied Microbiology, 99, pp. 77–84 (2005).
66. W.-H. Lin, Ch.-F. Hwang, L.-W. Chen, H.-Y. Tsen, “Variable counts
characteristic evaluation for commercial lactic acid bacteria products”, Food
Microbiology, 23, pp. 74–81 (2006).
67. Fuller, R., “Probiotics in Man and Animals”, J. Appl. Bacteriol. 66: 365-378
(1989).
68. Tuncer, Y., Akçelik, M., “Preliminary Biochemical and Genetic
Characterization of the Bacteriocins Produced by Three Lactococcus lactis
subsp. lactis Strains”, Australian Journal of Dairy Technology, 62, 19-25
(2007).
69. Kınık, Ö., Gönç, S., Akalın, S., “Çiğ sütte patojen mikroorganizmalar”, Ege
Üniversitesi Ziraat Fakültesi Süt Teknolojisi Bölümü, (1998).
70. P.A. Maragkoudakis, G. Zoumpopoulou, Gh Miaris, G. Kalantzopoulos, B.
Pot, E. Tsakalidou, “Probiotic potential of Lactobacillus strains isolated from
dairy products”, International Dairy Journal., 16, pp. 189–199 (2006).
71. Koji Nomoto, “Prevention of Infection by Probiotics”, Journal of
Bioscience and Bioengineering, 100, pp. 583–592 (2005).
121
72. Kılıç, E., “ İnsan Vajinasından İzole Edilen Lactobacillus Cinsi Bakterilerin
Bazı Probiyotik Özelliklerinin İncelenmesi”, Gazi Üniversitesi Fen Bilimleri
Enstitüsü, Yüksek lisans Tezi, 3-8 (2003).
73. S. Ammor, G. Tauveron, E. Dufour, I. Chevallier, “Antibacterial activity of
lactic acid bacteria against spoilage and pathogenic bacteria isolated from the
same meat small-scale facility. 1. Screening and characterization of the
antibacterial compounds”, Food Control, 17, pp. 454–461 (2006).
74. Karska-Wysocki. B., Bazo. M., Smoragiewicz. W., “ Antibacterial activity of
Lactobacillus acidophilus and Lactobacillus casei againts methicillin-resistant
Staphylococcus aureus (MRSA)”, Microbiological Research,165, 674-686
(2010).
75. Altuntaş, E.G., Ayhan K., Okcu, G., Erkanlı, K., Balcı, M.H., Sonakın, Ş.S.,
“ Çiğ Süt ve Peynir Örneklerinden İzole Edilen Laktik Asit Bakterilerinin
Antimikrobiyel Aktiviteleri” , Gıda, 35(3) 197-203 (2010).
76. Garcia, M.R., Prieto, M., Alonso, C., Lopez, M.L.G., Fernandez, M.C.G.and
otero., A., “ Numerical taxonomy of psychotrophic bacteria isolated from raw
ewes milk”, Journal of Dairy Research, 60,371-383 (1993).
77. Garriga, M., Hugas, M. and Aymerich, T., “ Bacteriocinogenic activity of
Lactobaacillus from fermented sausages”, J. Of Applied Bacteriology,
75,(2),142-148 (1993).
78. Schillinger, U., Becker, B., Vignolo, G. and Holzapfel, W.H., “Efficacy of
nisin in combination with protective cultures against Listeria monocytogenes
Scott A in tofu”, International Journal of Food Microbiology, 71, 159–168
(2001).
79. Çadırcı, B.H., “Bazı Lactobacillus Cinsi Bakterilerin Çeşitli Gram(+) ve
Gram (-) Bakteriler Üzerine Antagonistik Etkisi”, Gazi Üniversitesi Fen
Bilimleri Enstitüsü, Yüksek lisans Tezi, 32-38 (2003).
80. Chuayana JR., E.L., Ponce, C.V., Rivera, M.R.B., Cabrera, E.C.,
“Antimicrobial Activity of Probiotics From Milk Products”, Phil. J.
Microbiol. Dis., 32(2); 71-74 (2003).
81. Gonzalez, L., Sandovel, H., Sacristan, N., Castro, J.M., Fresno, J.M.,
Tornadijo, M.E., “ Identification of Lactic Bacteria Isolated from Genestoso
Cheese Throughout Ripening and Study of Their Antimicrobial Activity”,
Food Control, Article in pres (2006).
82. Rodriguez, E., Calzada, J., Arquezj, L., Nuiiez, M., Medina, M.,
“Antimicrobial Activity of Pediocin-Producing Lactococcus lactis on Listeria
122
monocytogenes, Staphylococcus aureus and Escherichia coli 0157:H7 in
Cheese”, International Dairy Journal, 15: 51-57 (2005).
83. Etöz, D., “Kefirden izole edilen maya ve bakterilerin bazı patojen
mikroorganizmalar üzerine inhibitör etkisi”, Gazi Üniversitesi Fen Bilimleri
Enstitüsü, Yüksek Lisans Tezi, 41-50 (2006).
84. Tuncer, Y., Özden, B., Avşaroğlu, M. D., “Bozanın Bazı Mikrobiyolojik
Özelliklerinin ve Laktik Asit Bakterisi İzolatlarının Antibakteriyel
Aktivitelerinin Belirlenmesi “, Süleyman Demirel Üniversitesi, Fen
Bilimleri Enstitüsü Dergisi, 12-1,19-25 (2008).
85. Dixit, G., Samarth, D., Tale, V., Bhadekar, R., “ Comparative Studies on
Potential Probiotic Characteristics of Lactobacillus acidophilus Strains”,
Eurasia J Biosci. 7, 1-9 (2013).
86. De Man, J. C., Rogosa, M. & Sharpe, M. E., “A medium for the cultivation
of lactobacilli”, J Appl Bacteriol. 23, 130–135 (1960).
87. Anonymous, “Çiğ Süt”, Türk Standartları Enstitüsü, TS 1018, Udc 673.141
(1981).
88. Sharpe, M.E., “Identification of the Lactic Acid Bacteria. In: Identification
Methods for Microbiologists”, Skinner, F.A. and D.W. Lovelock (Eds.),
Academic Press, London, pp: 233-259 (1979).
89. Gilliland, S.E, Staley, T.E., and Bush, L.J., “Importance of bile tolerance of
Lactobacillus acidophilus used as dietary adjunct”, J. Dairy Sci. 67 30453051 (1984).
90. Koneman E.W., Allen S.D., Janda W.M., Schreckernberger P.C., Winn W.C.
Jr., “Color Atlas and Testbook of Diagnostic Microbiology”, Lippincott
Comp. Philadelpia, 4:(1992).
91. Kandler, O., and Weiss, N., Genus Lactobacillus Beijerinck 1901. In Sneath,
P. H. A., Mair, N. S., Sharpe, M. E., Holt. J., G. eds. Bergey’s Manual of
Determinative Bacteriology. Vol. 2. The Williams and Wilkins Co.
Baltimore, MD, pp 1209-1234. (1986).
92. Hammes, W.P., N. Weiss and W.H. Holzapfel, “The Genera Lactobacillus
and Carnobacterium”, In: The Prokaryotes, Barlows A., H.G. Truper, M.
Dworkin, W. Harder and K. H. Schleifer (Eds.). Springer, Berlin, pp: 15341593 (1992).
93. Clark, S., Brazis, R. and Fowler, L., “ Standart Plate Count Method”,
Standart methods for the Examination of Dairy Products” , 14 th Edition,
(A.P.H.A.), Washington, 77-94 (1978).
123
94. Türk Standartları Enstitüsü, Çiğ Süt TS1018, (1981).
95. Rouof, K., “ Leuconostoc, Pediococcus, Stomatococcus and Miscellaneous
gram positive cocci that grow aerobiocally”, Manual of Clinical
Microbiology. Sixt edition, Williams and Wilkins, Washington, 309-311
(1995).
96. Garvie, E.I., “Genus Leuconostoc. In: Bergey`s Manual of Systematic
Bacteriology”, Sneath, P.H.A. and J.G. Hold (Eds.). Vol. 2, Williams and
Wilkins Co., Baltimore, pp: 1071-1075 (1986).
97. Rotta, J., R. M. Krause, R. C. Lancefield, W. Everly, and H. Lackland, “New
approaches for the laboratory recognition of M types of group A
streptococci”, J. Exp. Med. 134:1298-1315 (1971).
98. Washington, J.A., “ Laboratory Procedures in Clinical Microbiology”, 2 nd
Edition United States of America, 150., (1985).
99. Morihara, K., Tsuzuki, H., Oda, K., “Protease and elastase of Pseudomonas
aeruginosa: Inactivation of human plasma 1-proteinase inhibitor”, Infect
Immun 24, 188-193, (1979).
100. Sambrook, J., Russell, D.W., “Molecular Cloning: A Laboratory Manual”,
Cold Spring Harbor Laboratory. Press Cold Spring Harbor, New York.
(2001).
101. Harrigan, W.F. and M.E. McCance, “Laboratory Methods in Food and
Dairy Microbiology”, 1st Edn., Academic Press, London, pp: 25-29 (1976).
124
ÖZGEÇMİŞ
Kişisel Bilgiler
Soyadı, adı
: ORHAN, Elif
Uyruğu
: T.C
Doğum Tarihi ve Yeri
: 27/02/1987 ANKARA/ Yenimahalle
İletişim Bilgileri
Telefon
: 05415675263
e-mail
: elif.orhan1@gmail.com
Eğitim bilgileri
Derece
Eğitim Birimi
Mezuniyet Tarihi
Lisans
Gazi Üniversitesi / Biyoloji Bölümü
2008
Lise
Eryaman Lisesi
2004
Yabancı Dil
İngilizce
Yayınlar (Bildiriler):
-
Uraz, G., Yılmaz, E., Akkuzu, S., Orhan, E., “Life span of Listeria
monocytogenes in the Kefir microflora” Eurobiotech Agriculture Symposium
(Kayseri 12-14 Nisan 2012)
-
Uraz, G., Akkuzu, S., Orhan, E., “Kefir mikroflorasında bulunan maya ve
laktik asit bakterilerinin Staphylococcus aureus üzerine inhibitör etkisi”
Türkiye EKMUD Kongresi (9-12 Mayıs 2012 İstanbul)
-
Uraz, G., Aytop, P., Orhan, E., “Sütten izole edilen Candidalarda Slime faktör
üretimi” 21. Uusal Biyoloji Kongresi Ege Üniversitesi (İzmir 3-7 Eylül 2012)
-
Uraz, G., Akkuzu, S., Orhan, E., “Kefir mikroflorasında Aeromonas
hydrophilia’nın yaşam süresi” Türkiye 11. Gıda Kongresi (Hatay 10-12 Ekim
2012)
Download