tc gazi üniversitesi sağlık bilimleri enstitüsü tıbbi biyoloji ve genetik

advertisement
T.C.
GAZİ ÜNİVERSİTESİ
SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ
TIBBİ BİYOLOJİ VE GENETİK ANABİLİM DALI
KOLON KANSER HÜCRE HATLARINDA RESEPTÖR TİROZİN KİNAZ
VE JAK-STAT İNHİBİTÖRLERİNİN APOPTOTİK VE ANTİPROLİFERATİF ETKİLERİNİN ARAŞTIRILMASI
DOKTORA TEZİ
Atiye Seda YAR
Tez Danışmanı
Prof. Dr. Sevda MENEVŞE
ANKARA
Kasım 2012
T.C.
GAZİ ÜNİVERSİTESİ
SAĞLIK BİLİMLERİ ENSTİTÜSÜ
TIBBİ BİYOLOJİ VE GENETİK ANABİLİM DALI
KOLON KANSER HÜCRE HATLARINDA RESEPTÖR TİROZİN KİNAZ
VE JAK-STAT İNHİBİTÖRLERİNİN APOPTOTİK VE ANTİPROLİFERATİF ETKİLERİNİN ARAŞTIRILMASI
DOKTORA TEZİ
Atiye Seda YAR
Tez Danışmanı
Prof. Dr. Sevda MENEVŞE
Bu tez Gazi Üniversitesi Bilimsel Araştırma Projeleri Birimi tarafından
01/2011-56 proje numarası ile desteklenmiştir.
ANKARA
Kasım 2012
I
İÇİNDEKİLER
Sayfa No
Kabul ve Onay
I
İçindekiler
II
Şekiller ve Grafikler
VIII
Tablolar
XII
Semboller, Kısaltmalar
XIII
Önsöz
XVII
1. GİRİŞ
1
2. GENEL BİLGİLER
4
2.1. Kanser
4
2.2. Kolonun anatomisi
6
2.3. Kolon Kanseri
7
2.4. Reseptör Tirozin Kinaz
9
2.4.1. Epidermal Büyüme Faktörü Reseptörü
11
2.4.1.1. EGFR ve Kolon Kanser İlişkisi
14
2.5. Tirozin Kinaz İnhibitörleri
15
2.6. Janus Kinaz / Sinyal Dönüştürücü ve Transkripsiyon Aktivatörü
Sinyal İleti Yolağı
17
2.6.1. JAK/STAT Sinyal Yolağı
20
2.6.2. JAK/STAT Sinyal Yolağı ve Kanser
23
2.7. Programlı Hücre Ölümü: Apoptoz
24
2.7.1. Apoptotik Sinyal Yolakları
24
2.7.1.1. Dışsal Yolak (Ölüm Reseptör Yolağı)
25
II
2.7.1.2. İçsel (Mitokondriyal) Yolak
26
2.7.2. Apoptozun Düzenlenmesi
28
2.7.2.1. Bcl-2 Protein Ailesi
28
2.7.2.2. p53
30
2.7.2.3. Kaspazlar
31
2.7.3. Apoptoz ve Kanser
32
2.8. Siklin D1
33
2.9. CDK İnhibitörü p27Kip1
34
2.10. Gefitinib
36
2.11. Kukurbitasin B
38
2.12. HT-29 Kolon Kanser Hücre Hattı
40
2.13. HCT-116 Kolon Kanser Hücre Hattı
41
3. GEREÇ VE YÖNTEM
43
3.1. Kullanılan Araç ve Gereçler
43
3.1.1. HT-29 ve HCT-116 Hücre Hattı
43
3.1.2. Kullanılan Cihazlar
43
3.1.3. Kullanılan Sarf Malzemeler
44
3.1.4. Kullanılan Kimyasal Maddeler
44
3.1.5. Kullanılan Kitler
47
3.2.
47
Besiyeri, Tampon ve Çözeltilerin Hazırlanışı
3.2.1. % 10’luk DMEM Besiyerinin Hazırlanması
47
3.2.2. % 1’lik DMEM Besiyerinin Hazırlanması
48
3.2.3. MTT Karışımının Hazırlanması
48
3.2.4. 0.2 M Na2HPO4 Çözeltisinin Hazırlanması
48
III
3.2.5. 0.1 M Sitrik Asit Çözeltisinin Hazırlanması
48
3.2.6. Fosfat-Sitrat Çözeltisinin (pH: 7.8) Hazırlanması
48
3.2.7. % 0.25 Nonidet P-40 (NP-40) Çözeltisinin Hazırlanması
49
3.2.8. 1 mg/ml Proteinaz K Çözeltisinin Hazırlanması
49
3.2.9. 1 mg/ml Ribonükleaz A (RNaz A) Çözeltisinin Hazırlanması
49
3.2.10. 10X Tris Borat EDTA (TBE) Stok Çözeltisinin Hazırlanması
49
3.2.11. 1X Tris Borat EDTA (TBE) Tamponunun Hazırlanması
49
3.2.12. 0.5 M EDTA Çözeltisinin Hazırlanması
50
3.2.13. Oranj G Jel Yükleme Tamponunun Hazırlanması
50
3.2.14. Stok Etidyum Bromür Boyasının Hazırlanması
50
3.2.15. Agaroz Jelin Hazırlanması
50
3.2.16. 1X PBS Çözeltisinin Hazırlanması
50
3.2.17. 56 mM Stok Gef Çözeltisinin Hazırlanması
51
3.2.18. 36 mM Stok Kukurbitasin B (CuB) Çözeltisinin Hazırlanması
51
3.2.19. 0,5 M Tris-HCl Çözeltisi (100 ml, 1,25M) (pH 6.8)
51
3.2.20. 1,5 M Tris-HCl Çözeltisi (100 ml, 1,25M) (pH 8.8)
51
3.2.21. Akrilamid / Bisakrilamid Stok Çözeltisi (100 ml, %30)
52
3.2.22. Amonyum Persülfat (APS) Stok Çözeltisi (100 ml, %10)
52
3.2.23. Sodyum Dodesil Sülfat (SDS) Stok Çözeltisi (100 ml, %10)
52
3.2.24. 2X Yükleme Tamponu (Laemmli - Sample Buffer) (10 ml)
52
3.2.25. 2X Protein Yükleme Tamponu İndirgeyici
53
3.2.26. Tris Baz Stok Çözeltisi (100 ml, 1,5 M)
53
3.2.27. 10X Jel Yürütme Tamponu (Running Buffer) (1000 ml)
53
3.2.28. 1X Jel Yürütme Tamponu (Running Buffer) (1000 ml)
53
IV
3.2.29. Jelden Membrana Proteinleri Transfer Tamponu (1000 ml)
53
3.2.30. Jel Boyama Çözeltisi – Coomassie Parlak Mavisi (1000 ml)
54
3.2.31.Ponceau S Çözeltisi (100 ml)
54
3.2.32. Jelden Boya Çıkartıcı Çözelti (1000 ml)
54
3.2.33. TBS (Tris-tuz) Çözeltisi (500 ml)
54
3.2.34. TBST (Tris-tuz-tween 20) Çözeltisi (300 ml) (pH: 7.4)
54
3.2.35. Bloklama Çözeltisi (%3 Süttozu içeren TBST) (10 ml)
55
3.2.36. PBS ( Fosfat-tuz tamponu)
55
3.2.37. Antikor Çözeltileri
55
3.2.38. Sodyum Azid (NaN3)
55
3.2.39. İmmünolojik Saptama için Kullanılan Çözelti
55
3.3. Yöntemler
56
3.3.1. Hücre Kültürü
56
3.3.2. Gef ve CuB Uygulanan HT-29 ve HCT-116 hücrelerinde Etkin
Dozun MTT Yöntemi ile Belirlenmesi
56
3.3.3. Canlı, Apoptotik ve Nekrotik Hücre Ayrımının Floresan
Mikroskobunda İncelenmesi
57
3.3.4. Besiyerine Salınan Laktat Dehidrojenaz (LDH) Miktarının
Ölçülerek Sitotoksik Etkinin Belirlenmesi
58
3.3.5. Hücre Çoğalmasının Bromodeoksiuridin (Brdu) ile Belirlenmesi
59
3.3.6. DNA Fragmentasyonunun ELISA Yöntemi ile Belirlenmesi
61
3.3.7. DNA Fragmentasyonunun Agaroz Jel Elektroforezi ile
Gösterilmesi
62
3.3.7.1 Agaroz Jel Elektroforezi
63
3.3.8. Aktif kaspaz-3 miktarının Sandwich ELISA yöntemi ile
Belirlenmesi
63
V
3.3.9. Hücre Kültüründen Total RNA’nın Elde Edilmesi
65
3.3.10. Komplementer DNA (cDNA) Sentezi (RT-PCR)
67
3.3.10.1 Reverse Transkriptaz PCR (RT-PCR) Programı
67
3.3.11. Gen İfadesinin Real-Time PCR ile Belirlenmesi
68
3.3.12. Bcl-2 Geninin İfade Düzeyinin Kantitatif Analizi
68
3.3.13. Bax Geninin İfade Düzeyinin Kantitatif Analizi
69
3.3.14. Bak Geninin İfade Düzeyinin Kantitatif Analizi
69
3.3.15. Bad Geninin İfade Düzeyinin Kantitatif Analizi
70
3.3.16. Siklin D1 Geninin İfade Düzeyinin Kantitatif Analizi
70
3.3.17. GAPDH Geninin İfade Düzeyinin Kantitatif Analizi
71
3.3.17.1 Bcl-2, Bax, Bak, Bad, siklin D1 ve GAPDH Genleri için RealTime PCR Tepkime Karışımı
72
3.3.17.2. Light Cycler (LC) Deney Programı
72
3.4. Western Blot Yöntemi
74
3.4.1. Hücreden Protein İzolasyonu
74
3.4.2. Protein Miktar Tayini
75
3.4.3. SDS-PAGE Jelin Hazırlanması
75
3.4.4. Proteinlerin SDS-PAGE’e Yüklenme Öncesi Hazırlanması
77
3.4.5. Proteinlerin SDS-PAGE’e Yüklenmesi ve Elektroforez İşlemi
77
3.4.6. Elektrotransfer İşlemi (Protein Örneklerinin Nitroselüloz
Membrana Aktarılması)
78
3.4.7. Bloklama
79
3.4.8. Membran Üzerindeki Proteinin İmmunolojik Gösterilmesi
79
3.4.9. Görüntüleme
80
3.5. İstatistiksel Analiz Yöntemleri
80
VI
4. BULGULAR
81
4.1. HT-29 ve HCT-116 Hücrelerinin Gef ve CuB’ye Duyarlılığının
MTT Hücre Canlılığı Yöntemi ile İncelenmesi
81
4.2. Canlı, Apoptotik ve Nekrotik Hücre Dağılımının Floresan
Mikroskobunda İncelemesi
85
4.3. Besiyerine Salınan Laktat Dehidrojenaz (LDH) Miktarının
Ölçülerek Sitotoksik Etkinin Belirlenmesi
88
4.4.
Hücre Çoğalmasının Bromodeoksiuridin (BrdU) ile Belirlenmesi
90
4.5.
DNA Fragmentasyonunun ELISA Yöntemi ile Belirlenmesi
92
4.6. DNA Fragmentasyonunun
Gösterilmesi
Agaroz
Jel
Elektroforezi
ile
93
4.7.
Aktif Kaspaz-3 Düzeyinin Belirlenmesi
95
4.8.
Gen İfade Düzeylerinin Kantitatif Değerlendirilmesi
97
4.9.
Gen İfade Düzeylerinin Karşılaştırması
102
4.9.1. CuB ve Gef’in Bcl-2, Bax, Bak, Bad, ve Siklin D1 Genlerinin
İfade Düzeylerine Etkisi
102
4.10. Protein İfade Düzeylerinin Karşılaştırması
104
4.10.1. Bcl-2, Bax, Bak, p27kip1 ve Siklin D1 proteinlerinin protein
düzeyinde ifade düzeylerinin Belirlenmesi
104
5. TARTIŞMA
106
6. SONUÇ
118
7. ÖZET
120
8. SUMMARY
122
9. KAYNAKLAR
124
10. EKLER
159
11. ÖZGEÇMİŞ
160
VII
ŞEKİLLER ve GRAFİKLER
Sayfa No
Şekil 1: Kalın bağırsağın başlıca bölümleri
6
Şekil 2: Kolonda ortaya çıkan polipler
7
Şekil 3: Kalın bağırsakta polipten kanser gelişimi
8
Şekil 4: EGFR’nün yapısı
12
Şekil 5: Monoklonal antikor ve Tirozin Kinaz İnhibitörleri’nin etki
mekanizması
16
Şekil 6: Janus Kinaz’ın yapısı
19
Şekil 7: STAT’ın yapısı
20
Şekil 8: JAK/STAT sinyal yolağı
22
Şekil 9: İçsel ve dışsal apoptotik yolaklar
27
Şekil 10: Bcl-2 protein ailesi üyelerinin şematik gösterimi
29
Şekil 11: Gef’in kimyasal yapısı
37
Şekil 12: Gef’in etki menizması
37
Şekil 13: Kukurbitasin B’nin kimyasal yapısı
39
Şekil 14: HT-29 hücrelerinin morfolojik görüntüsü
41
Şekil 15: HCT-116 hücrelerinin morfolojik görüntüsü
42
VIII
Şekil 16: Bcl-2 mRNA’sının belirlenmesinde kullanılan primerler
ve UPL probun cDNA dizisi üzerindeki yerleşimi
68
Şekil 17: Bax mRNA’sının belirlenmesinde kullanılan primerler ve 69
UPL probun cDNA dizisi üzerindeki yerleşimi
Şekil 18: Bak mRNA’sının belirlenmesinde kullanılan primerler ve 70
UPL probun cDNA dizisi üzerindeki yerleşimi
Şekil 19: Bad mRNA’sının belirlenmesinde kullanılan primerler ve
UPL probun cDNA dizisi üzerindeki yerleşimi
70
Şekil 20: Siklin D1 mRNA’sının belirlenmesinde kullanılan 71
primerler ve UPL probun cDNA dizisi üzerindeki yerleşimi
Şekil 21: GAPDH mRNA’sının belirlenmesinde kullanılan primerler 71
ve UPL probun cDNA dizisi üzerindeki yerleşimi
Şekil 22: HT-29 hücrelerinde apoptozun morfolojik olarak 86
gösterilmesi
Şekil 23: HCT-116 hücrelerinde apoptozun morfolojik olarak
gösterilmesi
86
Şekil 24: HT-29 hücrelerinin Gef, CuB ve bu ilaçların birlikte 94
kullanımı sonunda görülen DNA fragmentasyonunun %1.5’luk
agaroz jeldeki görüntüsü
Şekil 25: HCT-116 hücrelerinin Gef, CuB ve bu ilaçların birlikte 94
kullanımı sonunda görülen DNA fragmentasyonunun %1.5’luk
agaroz jeldeki görüntüsü
Şekil 26: Bcl-2 geninin mRNA düzeyinde ifadesini kantitatif olarak 97
gösteren amplifikasyon eğrileri
Şekil 27: Bax geninin mRNA düzeyinde ifadesini kantitatif olarak 98
gösteren amplifikasyon eğrileri
Şekil 28: Bak geninin mRNA düzeyinde ifadesini kantitatif olarak 99
IX
gösteren amplifikasyon eğrileri
Şekil 29: Bad geninin mRNA düzeyinde ifadesini kantitatif olarak 100
gösteren amplifikasyon eğrileri
Şekil 30: SiklinD geninin mRNA düzeyinde ifadesini kantitatif 100
olarak gösteren amplifikasyon eğrileri
Şekil 31: GAPDH geninin mRNA düzeyinde ifadesini kantitatif 101
olarak gösteren amplifikasyon eğrileri
Şekil 32: HT-29 ve HCT-116 hücrelerinde 24 saat süreyle belirli 105
dozlarda Gef, CuB ve bu ilaçların birlikte kullanılması sonucunda
Bcl-2, Bax, Bak, p27kip1 ve Siklin D1 protein düzeylerini gösteren
protein bantları
Grafik 1: HT-29 ve HCT-116 hücrelerinin (10.000 hücre/kuyu) Gef 82
ile 24 ve 48 saat inkübasyonu sonunda belirlenen hücre canlılık
oranları.
Grafik 2: HT-29 ve HCT-116 hücrelerinin (10.000 hücre/kuyu) 83
CuB ile 24 ve 48 saat inkübasyonu sonunda belirlenen hücre
canlılık oranları.
Grafik 3: HT-29 ve HCT-116 hücrelerinin (10.000 hücre/kuyu) Gef 84
ve CuB ile birlikte 24 ve 48 saat inkübasyonu sonunda belirlenen
hücre canlılık oranları.
Grafik 4: HT-29 hücrelerinin (106 hücre/kuyu) Gef, CuB ve bu 87
ajanların birlikteliğinin 24 saat inkübasyonu sonunda belirlenen
Canlı / Apoptotik / Nekrotik hücre oranları.
Grafik 5: HCT-116 hücrelerinin (106 hücre/kuyu) Gef, CuB ve bu 88
ajanların birlikteliğinin 24 saat inkübasyonu sonunda belirlenen
Canlı / Apoptotik / Nekrotik hücre oranları.
Grafik 6: HT-29 hücrelerinin Gef, CuB ve bu ajanların birlikteliğinin 89
24 saat inkübasyonu sonunda görülen LDH salınımı
X
Grafik 7: HCT-116 hücrelerinin Gef, CuB ve bu ajanların 90
birlikteliğinin 24 saat inkübasyonu sonunda görülen LDH salınımı
Grafik 8: HT-29 hücrelerine Gef, CuB ve bu ajanların birlikteliğinin 91
24 saat inkübasyonu sonunda görülen DNA sentez oranlarındaki
değişim
Grafik 9: HCT-116 hücrelerine Gef, CuB ve bu ajanların 91
birlikteliğinin 24 saat inkübasyonu sonunda görülen DNA sentez
oranlarındaki değişim
Grafik 10: HT-29 hücrelerine Gef, CuB ve bu ajanların 92
birlikteliğinin 24 saat inkübasyonu sonunda görülen DNA
fragmentasyon oranı
Grafik 11: HCT-116 hücrelerine Gef, CuB ve bu ajanların 93
birlikteliğinin 24 saat inkübasyonu sonunda görülen DNA
fragmentasyon oranları
Grafik 12: HT-29 hücrelerine Gef, CuB ve bu ajanların 96
birlikteliğinin 24 saat inkübasyonu sonunda görülen aktif kaspaz-3
oranları
Grafik 13: HCT-116 hücrelerine Gef, CuB ve bu ajanların 97
birlikteliğinin 24 saat inkübasyonu sonunda görülen aktif kaspaz 3
oranları
Grafik 14: HT-29 hücrelerinin doza bağlı olarak Gef, CuB ve bu 103
ajanların birlikte uygulanması sonrasında Bcl-2, Bad, Bax, Bak ve
SiklinD mRNA düzeylerindeki değişiklik
Grafik 15: HCT-116 hücrelerinin doza bağlı olarak Gef, CuB ve bu 104
ajanların birlikte uygulanması sonrasında Bcl-2, Bad, Bax, Bak ve
SiklinD mRNA düzeylerindeki değişiklik
XI
TABLOLAR
Sayfa No
Tablo 1: RT-PCR tepkime karışımı
67
Tablo 2: Otomatik ısı döngüsü cihazında uygulanan program
67
Tablo 3: Bcl-2, Bax, Bak, Bad, siklin D1 ve GAPDH Real-Time 72
PCR tepkime karışımı
Tablo 4: Bcl-2, Bax, Bak, Bad, siklin D1 ve GAPDH genlerinin 73
ifade düzeylerinin belirlenmesi için kullanılan Real Time PCR
tepkime program
Tablo 5: %10’luk SDS-PAGE için ayırma jelinin bileşenleri
76
Tablo 6: %12’lik SDS-PAGE için ayırma jelinin bileşenleri
76
Tablo 7: %5’lik SDS-PAGE için yığınlama jelinin bileşenleri
77
XII
SEMBOLLER ve KISALTMALAR
ºC
: Santigrad Derece
µl
: Mikrolitre
μg
: Mikrogram
μM
: Mikromolar
aa
: Aminoasit
AIF
: Apoptoz Uyarıcı Faktör
Apaf-1
: Apoptotik Proteaz Aktive Edici Faktör-1
APS
: Amonyum persülfat
ATP
: Adenozin trifosfat
Bax
: BCL2 İlişkili X Proteini
Bcl-2
: B hücresi lenfoma geni 2
bç
: Baz Çifti
BH
: Bcl-2 Homoloji Bölgesi
BrdU
: 5-bromo-2'-deoksiüridin
cDNA
: Komplementer DNA
Ca+2
: Kalsiyum
cDNA
: Komplementer DNA
CDK
: Siklin Bağımlı Kinaz
CDKI
: Siklin Bağımlı Kinaz İnhibitörleri
Cp
: Crossing point
CuB
: Kukurbitasin B
DEPC
: Dietilpirokarbonat
DISC
: Ölüm-Tetikleyici Sinyal Kompleksi
Dk
: Dakika
XIII
DNA
: Deoksiribonükleik asit
dNTP
: Deoksiribonükleotidtrifosfat
DMEM
: Dulbecco’s Modified Eagle Media
DMSO
: Dimetil Sülfoksit
EDTA
: Etilendiamintetraasetikasit
EGF
: Epidermal Büyüme Faktörü
EGFR
: Epidermal Büyüme Faktörü Reseptörü
FBS
: Fetal Sığır Serumu
FDA
: Amerikan Gıda ve İlaç Dairesi
FGF
: Fibroblast Büyüme Faktörü
GAPDH
: Gliseraldehit 3 Fosfat Dehidrojenaz
Gef
: Gefitinib
g
: Gram
IFN
: İnterferon
JAK
: Janus Kinaz
JH
: Janus Homoloji Domain
JNK
: c-Jun N-terminal Protein Kinaz
Kaspaz
: Sistein Bağımlı Aspartata Spesifik Proteaz
kDa
: Kilo dalton
KHDAK
: Küçük Hücreli Dışı Akciğer Kanseri
LC
: Light Cycler
LDH
: Laktat Dehidrojenaz
M
: Molar
mAb
: Monoklonal antikor
mg
: Miligram
MgCI2
: Magnezyum Klorür
XIV
ml
: Mililitre
mRNA
: Elçi RNA
MTT
: 3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-diphenyl tetrazolium
bromid
nM
: Nanomolar
NP-40
: Nonidet P-40
p53
: Protein 53
PBS
: Fosfat Tamponlu Tuz Çözeltisi
PCR
: Polimeraz Zincir Reaksiyonu
PDGF
: Trombosit Kaynaklı Büyüme Faktörü
PMSF
: Fenilmetilsülfonilflorid
Rb
: Retinoblastoma
REST
: Relatif Ekspresyon Software Tool
RNA
: Ribonükleik asit
RNaz A
: Ribonükleaz A
rpm
: Dakika Başına Dönme Sayısı
RTK
: Reseptör Tirozin Kinaz
RT-PCR
: Ters Transkriptaz-Polimeraz Zincir Tepkimesi
SH2
: Src-homology-2
S
: Saat
Sn
: Saniye
STAT
: Sinyal Dönüştürücü ve Transkripsiyon Aktivatörü
Taq
: Thermus aquaticus
TBE
: Tris Borat EDTA Tamponu
TGFβ
: Transforme Edici Büyüme Faktörü Beta
TNF
: Tümör Nekroz Faktörü
TNF- α
: Tümör Nekroz Faktörü-α
XV
TNFR
: Tümör Nekroz Faktör Reseptörü
TK
: Tirozin Kinaz
TKİ
: Tirozin Kinaz İnhibitörü
UPL
: Universal Prob Kütüphanesi
UV
: Ultraviyole
V
: Voltaj
WHO
: Dünya Sağlık Örgütü
XVI
ÖNSÖZ
“Kolon Kanser Hücre Hatlarında Reseptör Tirozin Kinaz Ve
JAK-STAT
İnhibitörlerinin
Araştırılması”
Saymanlığı’nca
konulu
bu
01/2011-56
Apoptotik
tez,
kod
ve
Gazi
no’lu
Anti-Proliferatif
Üniversitesi
proje
ile
Etkilerinin
Araştırma
Fon
desteklenmiştir.
Çalışmamız, Gazi Üniversitesi Tıp Fakültesi Tıbbi Biyoloji ve Genetik
Anabilim Dalı Laboratuvarı’nda gerçekleştirilmiştir.
XVII
1.
GİRİŞ
Kanser günümüzün en önemli sağlık problemlerinden biridir.
Kanser türleri arasında özellikle kolon kanseri, dünyada kadın ve
erkeklerde gözlenen en yaygın kanser tipi olup, kansere bağlı ölümlerde
erkeklerde ikinci, kadınlarda üçüncü sıradadır. Kolon kanseri gelişiminde
genetik ve çevresel faktörler önemli rol oynamaktadır.
Sinyal iletimi sırasında protein aktivasyonunu sağlayan
protein kinazlar membran yerleşimli ve sitoplazmik tirozin kinazlar olmak
üzere iki gruba ayrılır. Membran yerleşimli protein kinazlara reseptör
tirozin kinaz (RTK) adı verilir. RTK’lar, büyüme faktörlerinin sinyalinin
düzenlenmesinde önemli bir hedeftir. Kanserle ilişkili bulunan ilk hücre
yüzeyi reseptörü olan Epidermal Büyüme Faktörü Reseptörü (EGFR) aynı
zamanda bir RTK’dır. EGFR, hücre döngüsünün ilerlemesi, hücre
proliferasyonu, sağ kalımı, adezyon, invazyon ve damar oluşumu gibi
sağlıklı hücrelerin gelişimi ve homeostazisinde rol alır. Bununla birlikte
kanser hücresinin proliferasyonu, sağ kalımı ve metastaz yeteneği
kazanmasında da EGFR etkilidir.
EGFR, hem monoklonal antikorlar, hem de tirozin kinaz (TK)
inhibitörleri (TKİ) ile inhibe edilebilir. Kanser tedavisinde oral TKİ olarak
uygulanan ve EGFR seçici inhibitörü olan Gefitinib (Gef), EGFR’nün ATP
bağlanma
bölgesine
bağlanır
ve
EGFR’nün
dimerizasyonunu
ve
otofosforilasyonunu inhibe ederek moleküler sinyal iletimini baskılar. Gef’in
farklı kanser hücre hatlarında ve tümör ksenograft modellerinde, tek
başına veya çeşitli sitotoksik ilaçlarla birlikte kombine uygulandığı zaman
hücre proliferasyonunu ve metastazı inhibe ettiği, hücre döngüsünü
durdurduğu ve anjiyogenezi baskıladığı gözlenmiştir.
1
Sitokin dönüştürücü sinyallerin en iyi bilinen şekli bir enzim
olan janus kinazlar (JAK) ve sinyal dönüştürücü ve transkripsiyon
aktivatörü (STAT) olarak adlandırılan transkripsiyon faktörleridir. JAK
aktivasyonunu takiben aktive olan STAT’lar reseptörden ayrılıp nükleusa
göç eder ve hedef genlerin transkripsiyonunu aktive eder. JAK-STAT
sinyal ileti yolağı, sitokinlere ve büyüme faktörlerine hücresel yanıtın
düzenlenmesinde görev alarak, hücrelerdeki proliferasyon, farklılaşma, ve
apoptozun düzenlenmesini sağlar.
Kanser, yalnızca artmış bir hücre çoğalma hızıyla değil, aynı
zamanda azalmış bir hücre ölüm hızı sonucu oluşur. Programlanmış hücre
ölümü olan apoptoz, çok hücreli organizmalarda hem gelişim esnasında
hem
de
gelişimini
tamamlamış
organizmaların
homeostazisinin
sağlanmasında istenmeyen hücrelerin yok edilmesi için evrimleşmiş en
önemli mekanizmadır ve birçok farklı sinyal ileti mekanizmaları aracılığıyla
uyarılabilmektedir. Bu uyarı, mitokondri aracılı olarak hücre içinden
olabileceği gibi, ölüm reseptörleri aracılığıyla hücre dışından da olabilir.
Kanser hücresinin önemli bir özelliği apoptoza direnç
göstermesidir. Hücrelerin normal apoptotik süreçten kaçmalarını sağlayan
bir özellik kazanmaları hemen bütün kanser hücrelerinde gözlenen bir
özelliktir. Kanser hücreleri ya Bcl-2, Bcl-xL gibi anti-apoptotik proteinlerin
aşırı yapımıyla, ya da Bax, Bak, Bad gibi pro-apoptotik proteinlerin
yapımlarının azalmasıyla apoptoza dirençli özellik kazanır. Bu nedenle,
apoptotik yolakların aktifleştirilmesi kanser terapisinin temel ilkelerinden
biridir. Apoptozdan kaçmakta olan kanser hücreleri aynı zamanda, hücre
döngüsünün kontrolünde görev alan siklin D1 geninin aşırı ifade
edilmesine ve siklin bağımlı kinaz inhibitörü (CDKI) olan p27Kip1 geninin
baskılanmasına neden olarak sürekli bölünmekte ve çoğalmaktadırlar.
2
Geleneksel olarak uygulanan tedavilerde önemli gelişmeler
olmasına rağmen yeni terapötik yaklaşımların geliştirilmesi gerekmektedir.
Son yıllarda kanser hücrelerini yok etmek için yeni hedefler ortaya
çıkmıştır. Bu hedefler arasında yer alan en önemli sinyal yolaklarından biri
olan JAK-STAT yolağı, yeni ilaçların geliştirilmesinde hedef proteinler
olarak kanser tedavisinde yer almaktadır. JAK-STAT sinyal yolağının
kuvvetli
bir
inhibitörü
olan
kukurbitasin
B
(CuB),
iberis
amara
tohumlarından izole edilmiştir. CuB’nin, çeşitli kanser hücre hatlarında,
JAK-STAT fosforilasyonunu inhibe ederek apoptozu uyardığı ve hücre
proliferasyonunu baskıladığı, böylece tümör gelişimini inhibe ettiği
gözlenmiştir.
Bu bilgilerin ışığında, CuB’in tek başına ve Gef ile birlikte
belirli doz ve sürelerde uygulanması sonucunda p53 mutant HT-29 ile p53
yabanıl tip (wild type) HCT-116 insan kolon kanser hücre hatları üzerindeki
apoptotik ve anti-proliferatif etkilerinin araştırılması amaçlanmıştır. Bu
amaç kapsamında, apoptotik süreçte etkili olan Bcl-2, Bax, Bak, Bad
genleri ile hücre döngüsü ve çoğalmasında etkili olan siklin D1 ve p27kip1
genlerinin mRNA ve protein düzeyinde doğrulandı. Ayrıca kolon kanser
hücrelerinin Gef ve CuB’ye verdiği apoptotik ve sitotoksik yanıtlar da
araştırılarak ilaçların hücre ölümüne olan etkisi değerlendirildi.
3
2.
GENEL BİLGİLER
2.1.
Kanser
Ölüme en sık neden olan hastalıklar arasında yer alan
kanser, günümüzün en önemli sağlık problemlerinden biridir. Kanser,
hücrenin büyümesi ve bölünmesini kontrol eden genlerin (onkogenler ve
tümör baskılayıcı genler) mutasyonu, aşırı aktivasyonu veya fonksiyon
kaybı sonucunda hücrelerin kontrolsüz bir şekilde bölünerek sürekli
çoğalması ve hücre ölüm programının bozulması ile ortaya çıkan genetik
bir hastalıktır
1,2
. Kanserleşme çok faktörlü ve çok basamaklı bir olay olup,
normal bir hücrenin kanser hücresine dönüşebilmesi için çok sayıda
genetik değişikliğin olması gereklidir. Bu genetik değişiklikler arasında
nokta mutasyonları, translokasyonlar, gen amplifikasyonları, hücresel
onkogen aktivasyonu ve tümör baskılayıcı genlerin inaktivasyonu gibi
mekanizmalar yer alır. Bu değişimler, kanser hücrelerinin kontrolsüz
biçimde çoğalma ve bölünmeyi sürdürerek çevre doku ve organları istila
etmesine ve sonunda tüm vücuda yayılmasına (metastaz) neden olur 3,4.
Kanserleşen
hücreler,
çeşitli
kontrol
mekanizmaların
denetiminden kurtularak çoğalmaya devam ederler ve tümör ya da
neoplazma olarak adlandırılan anormal hücre kitlesinin oluşumuna neden
olurlar 5. Bu tümör hücreleri tek bir kitle içinde kümelenmiş bir şekilde
durdukları sürece iyi huylu (benin) olarak sınıflandırılırlar. İyi huylu kitleler
cerrahi müdahaleler ile çıkartılarak bireyin tam tedavisi sağlanabilirken,
tümör hücreleri kötü huylu (malin) olup etraflarındaki başka dokulara
sızma, yayılma ve yerleşme özelliği kazanmış kanser hücresi olarak kabul
edilir 5,6.
4
Kanser hücreleri iki önemli özelliğe sahiptir. Sağlıklı hücreler
belli bir kontrol altında, ihtiyaca göre bölünerek çoğalırken, kanser
hücreleri normal hücrelerin sahip olduğu hücre bölünme sınırlamalarına
karşı koyarak sürekli ve kontrolsüz bir şekilde çoğalırlar ve çoğalma hızları
çok yüksektir. İkinci özellik ise kanser hücrelerinin özgün mikroçevreden
bağımsız olarak yaşamlarını devam ettirme ve diğer hücrelerin yaşam
alanlarına yayılarak yerleşmeleridir 1-4. Normal hücreler ile kanser hücreleri
arasındaki bir başka fark da, sağlıklı hücreler bir taraftan apoptoz
(programlı hücre ölümü) denen olay ile yok olurken, diğer taraftan büyüme
faktörlerinin etkisiyle çoğalırlar, ancak kanser hücreleri hücre dışı büyüme
faktörlerine daha az gereksinim duyar ve bu hücrelerin çoğunda apoptoz
görülmez, bu nedenle sağlıklı hücrelerden daha uzun yaşarlar 1-3.
Tümörün köken aldığı dokunun tipine göre kanserin;
karsinoma, sarkoma, lenfoma ve lösemi gibi birkaç temel çeşidi vardır.
Karsinoma deri veya iç organları çevreleyen epitel hücrelerden türevlenen
malin tümörlerdir ve tüm kanser türlerinin %85’ini kapsarlar. En yaygın
görülen karsinoma türleri meme, kolon, prostat ve akciğer kanseridir.
Sarkoma kemik, kıkırdak, yağ, kas, kan damarları, veya diğer bağ ve
destek dokusunda görülen kanserdir. Lenfoma ve myeloma ise savunma
sistemi hücrelerinde görülen kanserdir. Lösemi kan oluşturan kemik iliği
gibi dokularda başlar ve çok sayıda anormal kan hücreleri üretilir ve
dolaşıma girer
6,7
. Bazı kanser türlerinin tanı ve tedavisinde son yıllardaki
ilerlemelere karşın, kanserin erken tanı ve tedavisi halen önemli bir
problem olmaya devam etmektedir 7-9.
5
2.2.
Kolonun anatomisi
Kalın bağırsak, sindirim sisteminde ince bağırsak ile anüs
arasındaki yaklaşık 1,5 - 2 m uzunluğundaki kısımdır. Kalın bağırsak;
çekum (kör bağırsak), kolon, rektum ve anüs bölümlerinden meydana
gelir. Kalın bağırsağın ilk ve en uzun bölümü kolondur. Yaklaşık 5 cm
kalınlığında kaslı bir tüp olan kolonda, besin maddelerinden su ve mineral
maddeler absorbe edilir
10,11
. Kolon; çekum aracılığıyla ince bağırsağın
ileumuna, sigmoid kolon üzerinden ise rektuma bağlanır. Kolon; çıkan
kolon, transvers kolon, inen kolon ve sigmoid kolon adı verilen
bölümlerden oluşmaktadır
10-12
. Kolon, karın içerisinde ters dönmüş U harfi
şeklinde karnın sağ alt tarafından çekum ile başlar ve yukarı doğru çıkar
(çıkan kolon), karaciğer altından keskin bir dönüşle karnı yatay olarak
(transvers kolon) geçer, sol üst köşede yerleşen dalağın altına geldiğinde
yine keskin bir dönüş yaparak sol taraftan aşağı doğru yönelir (inen kolon).
İnen kolon, kolonun son kısmı olan sigmoid kolon ile rektumla birleşir.
Sindirim sisteminin son kısmı olan rektum, kalın bağırsağın genişlemesi
sonucu oluşan son 15 cm'lik bölümüdür ve anüsle dışarı açılır (Şekil 1)
10,11
.
Şekil 1: Kalın bağırsağın başlıca bölümleri 13
6
2.3.
Kolon Kanseri
Kolon kanseri, bağırsak iç yüzeyini kaplayan epitel tabakayı
oluşturan hücrelerde gelişen bir kanser türüdür. Kalın bağırsağın iç
yüzeyini örten tabakadan bağırsak içine doğru gelişen kabartı ve şişliklere
polip adı verilir
12,14,15
. Kalın bağırsağın adenom yapılarının %90’dan
fazlası lümene uzanım göstererek polip oluşturur (Şekil 2)
14,15
. Bir
adenomatöz polipin kanserleşmesi için yaklaşık 8-10 yıl kadar bir süre
geçer. Polipler kanser öncüsü oldukları için kanserleşmeden önce
çıkarılması gerekir. Zamanla polipi oluşturan hücreler çeşitli sebeplerle
kanser hücrelerine dönüşerek çoğalır ve tümör kitlesini oluştururlar (Şekil
3). Oluşan kitle bağırsak duvarını işgal eder, böylece kontrolsüz büyümeye
ve çoğalmaya devam eden hücreler bağırsağı tıkar. Buradan vücudun
diğer hücrelerine ve organlarına metastaz yaparak ilerler 12,14.
Şekil 2: Kolonda ortaya çıkan polipler 16
Kanser türleri arasında özellikle kolon kanseri gelişmiş
ülkelerde ciddi morbidite ve mortalite gösteren en yaygın kanser
tiplerinden biridir
9,17,18
. Kolon kanseri, dünyada kadın ve erkeklerde
gastrointestinal sistemde oldukça sık görülen ve erişkin yaştaki toplumu
7
etkileyen bir kanser türü olması nedeni ile önemli onkolojik sorunlardan
biridir
9,17
. Kolon kanseri, görülme sıklığı bakımından tüm kanserler
arasında akciğer, meme ve prostat kanserlerinden sonra dördüncü sırada
yer alırken, kansere bağlı ölüm nedenleri arasında akciğer ve meme
kanserinden sonra üçüncü sırada yer almaktadır ve tüm kanser
ölümlerinin %10’nundan sorumludur
19-21
. Dünya Sağlık Örgütünün (WHO)
verilerine göre dünya genelinde her yıl 1 milyondan fazla kişi kolon
kanserine yakalanmakta ve yaklaşık 650.000 kişi kolon kanseri nedeniyle
ölmektedir
8,22,23
, bu nedenle bu hastalıkla ilgili çalışmalar toplum sağlığı
ve hasta açısından önemli bir yer tutmaktadır.
Şekil 3: Kalın bağırsakta polipten kanser gelişimi 24
Kolon kanseri gelişimi birçok faktörle ilişkili olduğu bilinen çok
basamaklı bir süreçtir. Kolon kanserinin kesin etiyolojisi bilinmemekle
birlikte,
bazı
genetik
düşünülmektedir
20,25,26
ve
çevresel
faktörlerin
önemli
rol
oynağı
. Genellikle DNA tamir mekanizmalarında, hücre
çoğalmasında, hücre farklılaşması ve kotrollü hücre ölümünde önemli
fonksiyonlara sahip genlerdeki değişikliklerle ortaya çıkmaktadır
20,27-29
.
Hücresel onkogenler, tümör baskılayıcı genler, DNA tamir genleri, büyüme
faktörleri ve reseptörleri gelişimde rol oynamaktadır
21,30,31
. Kolon kanseri,
8
yaşa bağlı olarak artmaktadır, orta yaşın üzerinde daha çok ortaya
çıkmakla birlikte, olguların %90’dan fazlası 50 yaş ve üzeridir 21,31,32.
2.4.
Reseptör Tirozin Kinaz
Sinyal iletimi sırasında protein fosforilasyonunu sağlayan
protein kinazlar, membran yerleşimli ve sitoplazmik tirozin kinaz (TK)’lar
olmak üzere iki ana gruba ayrılır. Bunun yanı sıra bu proteinler, katalitik
özelliklerine göre (fosforilasyona uğrayan aminoasit (aa) türü) tirozin ve
serin / treonin kinazlar olarak da 2 grupta sınıflandırılırlar
33,34
. TK enzimi,
protein fosforilasyonunu sağlayarak, ligandın reseptör ile etkileşmesini ve
hücre içine alınmasını ve bunların bir sonucu olarak da hücre içi biyolojik
aktivitelerin devamlılığını sağlayan protein kinaz ailesine ait bir enzimdir.
TK’lar, Adenozin trifosfatın (ATP) yapısında bulunan fosfat atomunun
polipeptitlerdeki tirozin birimlerine transfer edilmesinde rol oynarlar. Bunlar
hücresel proliferasyon, diferansiyasyon (farklılaşma), hücrenin canlılığı ve
hücre hareketi gibi önemli düzenleyici fonksiyonlarda rol alırlar. TK’ler
başlıca, reseptör yapıda olanlar ve reseptör yapıda olmayanlar olmak
üzere iki ana gruba ayrılırlar 33-35.
Sinyal ileti moleküllerine bağlanan ve substrat proteinleri
üzerindeki tirozin birimlerini fosforillemek üzere aktive edilen hücre yüzeyi
reseptörlerine reseptör tirozin kinazlar (RTK) adı verilir. RTK’lar hücre
dışından gelen sinyalin hücre içine iletilmesini sağlarlar. Bu reseptörler
arasında insülin reseptörü, büyüme faktörleri [(epidermal büyüme faktörü
(EGF), vasküler endotelyal büyüme faktörü (VEGF), platelet-türevli
büyüme faktörü (PDGF), fibroblast büyüme faktörü (FGF)] reseptörleri ve
ephrin (EphA, EphB) reseptörleri yer almaktadır
34,35
. RTK’lar, membranda
yerleşim gösteren hücre dışı ligand bağlanma bölgesi, transmembran
bölge ve oldukça iyi korunmuş hücre içi bölge kısımlarından oluşan
9
kinazlardır, sitozolik hücre içi bölgelerinde aktivasyondan sorumlu TK
bölgesi içerirler 35,36.
İstirahat halindeki hücrelerde, RTK’nın inaktif ve aktif
konformasyonları denge halindedir. Uygun ligandın olmadığı durumlarda
RTK’lar fosforile olmamış, monomerik durumdadırlar ve reseptörün kinaz
bölgeleri inaktiftir. Bu reseptörler, ligand (büyüme faktörleri veya sitokinler)
bağlanması, hücreler arası adezyon molekülleri ya da G-protein bağlı
reseptörlerin uyarılmasından sonra aktif hale geçerler ve sitoplazmadaki
hedef proteinleri ile etkileşerek sinyal iletimini gerçekleştirirler
34-36
. RTK
aktivasyonu sonucu, reseptör kendi kendini fosforile eder ve bu
fosforlanan bölgelere çeşitli adaptör proteinler bağlanır, böylece uyarının
hücre içine iletimini sağlar. Adaptör proteinlerin ortak yapısal özelliği SH2
(Src-homology-2) bölgeleri içermeleridir. Bu proteinler, SH2 bölgeleri
aracılığıyla
reseptöre
bağlanarak,
RTK
ile
proteinleri arasında köprü görevi yapmaktadır
sitoplazmadaki
37-39
efektör
. RTK aktivasyonunun
sonlandırılmasından fosfataz grubu proteinler sorumludur. Buna göre,
fizyolojik koşullarda sinyal iletimi tersinir özellik taşır ve RTK aracılı sinyal
iletimi kontrol altında tutulur 34,38,39.
Çoğu
RTK’ların
büyüme
faktörü
reseptörleri
olması
nedeniyle, reseptörün işlev kazandıran mutasyonları veya reseptör-ligand
aşırı ifadelenmesi gibi düzensizlikler çok çeşitli kanserlerin oluşumunda ve
gelişiminde etkin rol oynamaktadır. Bunun yanı sıra kanserleşme
sürecinde sürekli ve kontrolsüz RTK aktivasyonu, onkojenik sinyal iletimi,
transformasyon,
tümör
büyümesi,
motilite
ve
invazyon
artışı
ile
anjiyogenez gibi malin fenotipe özgü hücresel olayları hızlandırır. Bu
nedenle birçok kanserin tedavisinde RTK’ların inhibe edilmesinin etkili
olduğu görülmüştür
37-40
. Bu nedenle RTK’lar günümüzde, özellikle
kanserleşme sürecinde malin transformasyonda önemli araştırmaların
konusu olmuş ve anti-kanser ilaçların primer hedefi haline gelmişlerdir
40
.
10
Bugün 10 kadar Amerikan Gıda ve İlaç Dairesi (FDA) onaylı RTK
inhibitörü klinikte kemoterapötik amaçlı kullanılmaktadır 41,42.
2.4.1. Epidermal Büyüme Faktörü Reseptörü
Epidermal Büyüme Faktörü Reseptörü (EGFR), hücresel
büyüme, farklılaşma ve proliferasyonu etkileyen çeşitli sinyal ileti
sistemlerini içeren bir glikoproteindir. EGF, 1962 yılında keşfedilirken
EGFR, 1980 yılında keşfedilmiştir
44,45
43
,
. Reseptörün daha sonra ligand
bağımlı bir RTK olduğu ve ana formunun kuşlardaki viral onkogen v-erbB
ile homolog olduğu gösterilmiştir
46
. 170 kDa ağırlığında transmembran
hücre yüzey reseptörü olan EGFR, yapısal olarak birbirine benzeyen,
ancak fonksiyonel olarak farklı olan erbB1 (HER1, EGFR), erbB2
(HER2/neu), erbB3 (HER3) ve erbB4 (HER4) adı verilen 4 adet
reseptörden oluşan RTK ailesinin ilk üyesidir 46-48.
EGFR, üç bölgeden oluşur: Hücre dışı ligandların bağlandığı
N terminal bölge, hidrofobik transmembran bölge ve hücre içi yerleşimli
tirozin kinaz aktivitesine sahip C terminal bölge. Hücre içi C terminal
bölgenin özgün tirozin içeren aa dizilimleri fosforile olduklarında SH2
içeren sinyal proteinleri için bağlanma bölgeleri oluştururlar (şekil 4) 47-49.
11
Şekil 4: EGFR’nün yapısı 50
EGFR geni 7p12 kromozomunda lokalizedir ve 1186 aa’den
oluşan tek bir polipeptid zincirinden oluşmuştur. Bunun 622 aa’lik hücre
yüzey bölgesi, 11 ve 12. konumlarındaki asparajin’den glikolizlenmiştir ve
ligand bağlanma bölgesine sahiptir. 542 aa içeren hücre içi bölge fosforile
olabilme yetisindedir ve TK içerir. Bu kısım uyarımdan etkilenen ilk
bölümdür. Reseptörün TK bölgesi 694. aa’ten başlayarak 250 aa’lik
bölgeyi kapsar. ATP bağlanma bölgesi 694. aa’ten başlar ve 150 kDa ve
20 kDa molekül ağırlığında iki parçaya ayrılır. 150 kDa’luk bölüm ise 110
kDa ve 40 kDa’luk parçalara bölünür. 40 kDa’luk bölüm ATP bağlayabilen,
otofosforile olan tirozin aktivitesinin % 30’undan sorumludur. 1172
pozisyonundaki tirozin, EGF ile uyarılan önemli bir fosforilasyon bölgesidir.
Aynı zamanda 1068 ve 1148 pozisyonlarındaki tirozinler de fosforile olur
(şekil 4) 47-49,51.
Sağlıklı hücrenin proliferasyonu ve sağ kalımı için hücre
dışından gelen uyarılara gereksinim vardır. Büyüme faktörlerinin hücre
yüzeyindeki reseptörlere bağlanarak ilişkili sinyal ileti ağlarını uyarması, bu
bilgi iletimini sağlayan temel mekanizmalardan biridir
52,53
. EGFR sinyal
12
iletimi normal hücrelerde reseptör-ligand etkileşimi sonucu gelişen, çok
evreli bir yolak ile meydana gelir. Ligandın bağlanması ile aktive olan
EGFR sinyalinin; hücre döngüsünün ilerlemesi, hücre çoğalması, sağ
kalımı (motilite), hücre adezyonu, farklılaşması, hücre göçü, invazyon,
apoptoz ve damar oluşumu olgularında normal dokuların gelişimi ve
homeostazisinde önemli rolü vardır
52-54
. Reseptörler inaktif monomerler
şeklinde hücre membranında bulunurken, ligandın reseptörün hücre dışı
bölgesine
bağlanmasının
ardından
ya
başka
bir
homodimerizasyon ya da EGFR ailesinden başka
heterodimerizasyon ile aktive olur
55,56
bir
EGFR
ile
reseptörle
. Dimerizasyonun ardından, hücre içi
TK bölgesinin C-terminalindeki tirozin birimlerini çapraz fosforillemesi
(otofosforilasyon)
sonucu
TK
bölgesi
aktive
olarak
mitojenik
sinyalizasyonda rol alan sitoplazmik proteinlerin aktivasyonunu sağlar ve
hücre içi bir dizi olay zinciri başlar. Bu da nükleustaki gen ekspresyonlarını
aktive ederek hücresel cevabı indükler 47,54,57.
EGFR sinyal iletiminin normal hücrelerde reseptör-ligand
etkileşimi sonucu gelişmesinin ve TK aktivitesinin uyarılmasının yanı sıra,
EGFR'nün, ligand olmaksızın çapraz etkileşim veya transaktivasyon
aracılığıyla da kendiliğinden aktive olabildiği gösterilmiştir. Stres, membran
depolarizasyonu, radyasyon, oksidan ve alkilleyici ajanlar gibi çeşitli
fizyolojik olmayan uyarılara bağlı olarak ortaya çıkan transaktivasyon,
EGFR’nün tirozin birimlerini fosforilleyebilmektedir. Yine G protein
reseptörleri,
sitokin
reseptörleri
ve
integrinler
de
EGFR
tirozin
fosforilasyonunu indükleyerek sinyal ileti yolaklarını aktive edebilmektedir
48,49,54,58
.
13
2.4.1.1. EGFR ve Kolon Kanser İlişkisi
EGFR, kanserle ilişkili bulunan ilk hücre yüzey reseptörüdür
48,49,54
. EGFR sinyal ileti yolaklarının kontrolünün kaybı ve aşırı
aktivasyonu, kanserli hücre proliferasyonu artışı dışında, kanserli hücrenin
farklılaşması, göçü, apoptozun inhibisyonu, sağ kalımı, invazyonu ve
metastaz yeteneği kazanması gibi çeşitli hücresel tümörojenik süreçlerin
düzenlenmesi ile yakından ilişkilidir
52,59,60
. İnsan kanserlerinde en sık
görülen mekanizma, EGFR'nün aşırı ifadelenmesi, buna bağlı olarak gen
amplifikasyonu veya transkripsiyon anormallikleri ve otokrin uyarımı ile
artmış EGFR üretimidir 61. EGFR ekspresyonunda artışa yol açan bir diğer
mekanizma da, çeşitli mutasyonlar aracılığıyla EGFR aktivitesinde
meydana
gelen
tümörojenik
değişiklikler
sonucunda
bağlanmaksızın reseptörün kendiliğinden aktivasyonudur
kanserlerinde
mutasyonlar
çok
sayıda
reseptörün
EGFR
hücre
59-61
ekspresyonunu değiştirir
delesyonu
dışı
ligand
ligand
60,61
. İnsan
gösterilmiş
olup,
bu
bağlayan
bölgesinin
.
Preklinik çalışmalarda artmış EGFR ekspresyonu ile tümör
oluşumu arasında güçlü bir ilişki olduğu gösterilmiştir. Bazı vakalarda tek
başına EGFR düzeylerinin değişimi bile kanser gelişimini indüklemek için
yeterli olabilmektedir
60,61
. Kolon, meme, deri, baş-boyun, özofagus, mide,
pankreas, KHDAK, böbrek, mesane, serviks ve over gibi pek çok kanserde
hem EGFR hem de ligandlarının aşırı ekspresyonu in vivo olarak
gösterilmiştir
47,48,59,62-66
.
Normal
hücrelerde,
hücre
başına
EGFR
ekspresyonu 40-100 bin reseptör arasında iken, malin epitelyal tümörlü
hücrelerde bu sayı belirgin bir artış göstermektedir. Örneğin bazı meme
kanserlerinde
hücre
bahsedilmektedir
başına
48,60,62,67,68
2
milyon
EGFR
ekspresyonundan
. Bu aşırı ekspresyon kötü prognozla ve kısa
sağ kalımla paraleldir.
14
Kolorektal karsinomda EGFR ekspresyonu hem tümörün
evresi hem de tümörün derecesi ile ilişkilidir. Kolorektal kanserlerde EGFR
ailesi aracılığıyla sinyalizasyon sıklıkla bozulmuştur. EGFR’nün normal
kolon mukozasına göre tümörde daha yoğun ifade edildiği gözlenmiştir
52,53,56
.
EGFR, kolon kanserinin % 25-77’sinde ve özellikle metastatik
olanlarında saptanmıştır
52,59,60
. Yine preklinik çalışmalarda hem kimyasal
olarak indüklenmiş kolon kanser modellerinde, hem de farelerde adenom
gelişiminde aşırı EGFR ekspresyonunun rolü gösterilmiştir 52,67-69. Bununla
birlikte in vitro modellerde, EGFR aktivasyonu ve ekspresyonunun
kolorektal kanserin geç progresyonunda da etkisi gösterilmiştir
70
. EGFR,
yaygın olarak eksprese edilmesi nedeniyle, kolorektal kanser tedavisinde
hedef olarak seçilmiştir. Fazladan EGFR’ne sahip olmanın, kolon kanseri
hücrelerinde çoğalmada artış ve kolon kanserli hastalarda daha kısa
yaşam beklentisi ile bağlantılı bulunduğu bilinmektedir. Sonuç olarak bu
bulgular artmış EGFR ekspresyonunun kötü prognozla ilişkili olduğunu
destekler niteliktedir
53,56,68
. Kolorektal kanserin moleküler patogenezinin
belirgin olarak ortaya konmaya başlanmasından sonra, kolorektal kanser
tedavisinde son yıllarda spesifik hedefler ve bu hedeflere yönelik
tedavilerinin kullanımı giderek yaygınlaşmıştır. EGFR gibi hedefler ve
bunlara karşı geliştirilmiş tedavi yöntemleri ile ümit verici sonuçlar elde
edilmektedir 47,48,53,54,56,70.
2.5.
Tirozin Kinaz İnhibitörleri
Moleküler olarak hedeflenmiş tedavi yaklaşımlarında TK’ları
hem direk olarak inhibe eden küçük moleküller, hem de reseptör
düzeyinde etki göstererek TK yolaklarını indirek olarak inhibe eden
monoklonal antikor (mAb)’lar kullanılmaktadır
71,72
. Reseptöre bağlanan
mAb’lar ilgili ligandın bağlanmasına engel olarak TK’ın dimerizasyonu ve
aktivasyonunu engeller. Böylece mAb’lar ligand-reseptör etkileşimini bloke
ederek, ligand bağımlı sinyal iletimini durdururlar (şekil 5)
73-75
. mAb’ler,
15
RTK sinyalini inhibe etmek için sadece hücre yüzeyinde ifadelenen ve
salgılanan moleküller üzerinden etki gösterebilir, hücre membranı içinden
geçme yetenekleri yoktur. mAb’lere örnek olarak Rituximab, Trastuzumab,
Bevacuzimab, Cetuximab, Panitumomab, Alemtuzumab, Gemtuzumab,
İbritomumab ve Tositumomab verilebilir 73-76.
Şekil 5: Monoklonal antikor ve Tirozin Kinaz İnhibitörleri’nin etki mekanizması 77
Tirozin kinaz inhibitörleri (TKİ) ise sinyal iletim yolağının
aktivasyonundan sorumlu olan TK’ları inhibe eden, küçük molekül ağırlıklı
farmasötik maddelerdir
78,79
. TKİ, hem reseptör hem de reseptör yapıda
olmayan TK’ların hücre içi kinaz bölgesinin aktivitesini inhibe eder (şekil
5). TKİ’nin bazıları substrat ile geri dönüşümlü olarak yarışırken
(kompetitif), diğerleri ATP ile geri dönüşümlü olarak yarışan özelliktedir. Bu
nedenle, TK inhibisyonu iki şekilde olmaktadır; ATP-bağlanma bölgesinin
inhibisyonu ve substrat bağlanma bölgesinin inhibisyonu
79,80
. TKİ, RTK’ın
hücre içindeki TK bölgesindeki ATP bağlanma bölgesine yarışmalı olarak
bağlanarak
bu
bölgenin
otofosforilasyonu
inhibe
eder,
böylece
16
fosforilasyon tamamlanamaz ve hücre içi sinyal iletimi inhibe olur 78-80. TKİ,
hücre yüzey reseptörlerinin sitoplazmik parçaları ve hücre içi sinyal
molekülleri ile etkileşebilirler 79-81.
Günümüze kadar kanserde hedefe yönelik tedavide RTK
sinyalinin inhibisyonu en sık başarının sağlandığı alan olmuştur. TKİ,
hücre
içi
iletişimden
ve
buna
bağlı
olarak
hücrenin
büyüme
mekanizmasından sorumlu olan TK’ları inhibe ederek tümör gelişimini
engellerler. Bu aktiviteden yola çıkılarak TKİ’nin kanser tedavisinde önemli
bir yeri olabileceği düşünülmüştür. Bu amaçla geliştirilen pek çok TKİ
vardır ve kanser tedavisi için en önemli mekanizmalardan biri olan TKİ,
son yıllarda üzerinde en fazla çalışılan ajanlar olmuş ve tümör önleyici
etkileri klinik denemeler ile kanıtlanmıştır
71,72,79-82
. TK’lar arasında ATP
bağlanma bölgesi çok benzerlik göstermesine rağmen, kinaz bölgesinin
yapısındaki küçük farklılıklar, farklı TKİ’nin geliştirilmesine izin vermektedir.
Bu inhibitörler, Erlotinib, Gefitinib, İmatinib, Lapatinib, Lestaurtinib,
Canertinib, Nilotinib, Dasatinib, Semaxanib, Vatanalib, Sorafenib ve
Sunitinib’tir 71,72,79-82. Genel olarak bu maddelerin temel etki mekanizmaları
TK’ın katalitik bağlanma bölgesinde yarışmalı ATP inhibisyonu olmasına
rağmen her birinin hedeflediği kinaz spekturumu, farmakokinetikleri ve yan
etki profilleri birbirinden farklılık göstermektedir. TKİ genel olarak iyi tolere
edilen ilaç grupları arasındadır ve oral olarak kullanılmaktadırlar 79-83.
2.6.
Janus
Kinaz
/
Sinyal
Dönüştürücü
ve
Transkripsiyon Aktivatörü Sinyal İleti Yolağı
Hücre proliferasyonu ve farklılaşması interferon (IFN),
interlökin (IL) ve koloni uyarıcı faktör (CSF) olarak bilinen bir grup
polipeptid yapılı sitokinler tarafından kontrol edilmektedir. Bu sitokinler
reseptörlerine bağlanarak çeşitli sinyal ileti yolaklarını aktive ederler
84
.
17
Sitokin dönüştürücü sinyallerin en iyi bilinen şekli, bir enzim olan janus
kinaz (JAK) ve sinyal dönüştürücü ve transkripsiyon aktivatörü (STAT)
olarak adlandırılan transkripsiyon faktörleridir
84,85
. 1990’lı yıllarda IFN
sinyallerinin biyokimyasal ve genetik analizleri JAK/STAT yolağının keşfine
yol açmıştır
86,87
. Sonraları JAK/STAT yolağının büyüme hormonu,
eritropoetin, EGF gibi pek çok sitokin ve büyüme faktörü ile ilişkili oldukları
ve bu sitokinlerin sinyal iletimlerinde önemli rolleri olduğu gösterilmiştir
89
87-
.
JAK ailesi, sitokin aracılı sinyallerin dönüşümünü sağlayan
bir grup hücre içi reseptör olmayan TK’a verilen isimdir. Sitozolik TK’ların
JAK ailesi, JAK1, JAK2, JAK3 ve Tirozin kinaz 2 (TYK2) olmak üzere, 120140 kDa arasında değişen moleküler ağırlığa sahip dört üyeden
oluşmaktadır
84,85,90,91
. Bunlar, reseptörlerin hücre içi subunitlerine
bağlanarak onları fosforile eder ve adaptör proteinler için bağlanma
alanları oluştururlar. JAK proteinleri mRNA ekspresyonunun anahtar
mediyatörleridir ve “erken büyüme cevap genleri” olarak karakterize
edilmiştir
84,85,92
. JAK’ların yapısında birbiri ile neredeyse aynı, iki adet
fosfat transfer edici bölge vardır. Bu iki bölgeden bir tanesi kinaz aktivitesi
sergilerken, ikincisi bu kinaz aktivitesini negatif yönde regüle eder. Sadece
biri aktif olan bu iki kinaz ucu içerdikleri için eski Roma’da kapıların ve
başlangıçların tanrısı olan iki başlı Roma tanrısı Janus’dan esinlenerek
Januse Kinaz adını almışlardır 93,94.
JAK’lar, Janus homoloji domain 1-7 (JH 1-7) olarak
adlandırılan yedi alt birimden oluşmaktadır (Şekil 6). JH1, JAK’ın enzimatik
aktivitesi için önemli olan kinaz domaini olup, JAK aktivasyonu için gerekli
tirozinleri içerir. Dolayısıyla bir TK’ın tipik özelliklerine sahiptir. Bu tirozin
çiftlerinin fosforilasyonu JAK proteininde konformasyonel değişikliğe yol
açarak substratın bağlanmasını kolaylaştırır. JH2, tirozin kinaza benzer
yapıdaki psödokinaz domainidir. JH2, JH1’in aktivitesini düzenlemede
18
görev alan, normal bir kinaz aktivitesi için gerekli olan, fakat enzimatik
aktivitesi olmayan kısımdır. JAK’ların JH3-JH4 domaini SH2 domainler ile
benzerlik göstermektedir. Amino (NH2) terminal uç olan JH4-JH7 ise
FERM domain olarak adlandırılır ve JAK’ların sitokin reseptörleri ve diğer
kinazlar ile olan ilişkilerinde rol alır 84,85,90-92.
Şekil 6: Janus Kinaz’ın yapısı 95
JAK proteinleri, bir grup hücre içi sinyal proteinlerini aktive
eder. Bunlar içinde en iyi tanımlanmış transkripsiyon faktörleri STAT
grubudur
84,85
. Her bir reseptör alt ailesi tarafından tanınan STAT grubu,
spesifik biyolojik cevabın belirlenmesinde kritik basamağı oluşturur.
Memeli hücrelerinde yedi adet STAT proteini tanımlanmıştır. Bunlar;
STAT1-4, STAT5a, STAT5b ve STAT6 olarak adlandırılmaktadır 96.
Yapısı
oligomerizasyon
çok
bölgesi,
iyi
DNA
aydınlatılmış
bağlanma
olan
STAT
proteini,
SH2
bölgesi,
bölgesi,
transaktivasyondan sorumlu karboksil (COOH) terminal bölgesi ve çok iyi
korunmuş
NH2
terminal
bölgesinden
oluşmaktadır
(şekil
7)
97
.
Oligomerizasyon bölgesi, diğer proteinler ile etkileşir ve STAT tetrameri
oluşumunu sağlar. DNA bağlanma bölgesi, DNA’ya özgün bağlanmadan
sorumludur; ligand uyarısına özgül sinyal oluşumunu sağlar. SH2 bölgesi;
STAT-reseptör, STAT-JAK ve STAT-STAT etkileşimlerinden sorumlu
bölgedir. SH2 bölgesi tirozin fosforilasyona uğrayan kısım olup, STAT
moleküllerinin aktivasyonu için gereken temel kısımdır 96,97.
19
Şekil 7: STAT’ın yapısı 98
STAT proteinleri, JAK reseptörleri, src reseptörleri ve EGFR
başta olmak üzere çeşitli reseptörler aracılığıyla tirozin lokalizasyonundan
fosforlanıp aktive oluncaya kadar sitoplazmada inaktif durumdadır.
Transaktivasyondan sorumlu COOH terminal bölgesi ise, transkripsiyonel
aktivitenin özgünlüğü ve kontrolünden sorumludur. Tirozin, N-ucundan
yaklaşık 700 aa uzaklıktadır. Tirozin fosforilasyonu, bütün STAT
proteinlerinin DNA’ya bağlanma aktivitelerini düzenler
89,92,99
. STAT’lar,
hücre içinde bazen birbirine zıt olaylara aracılık ederler. Örneğin hem
hücre proliferasyonunu hem de apoptozu uyarabilirler 84-86.
2.6.1. JAK/STAT Sinyal Yolağı
JAK/STAT sinyal yolağı, sitokinlere ve büyüme faktörlerine
hücresel yanıtın düzenlenmesinde görev alarak, gen ekspresyonunu
düzenler. Diğer bir deyişle, aktive JAK/STAT proteinleri, hücre dışı
polipeptidlerde taşınan sinyallerin dönüşümü ve hücre çekirdeğine iletisine
olanak tanır. Bu proteinlerin vücuttaki işlevleri oldukça geniş bir
yelpazededir. Hücre büyümesi, çoğalması, farklılaşması, apoptoz, fetal
gelişim, inflamasyon, hematopoez ve immün yanıtın düzenlenmesini
sağlar 84,85,92.
CSF’ler, prolaktin, büyüme faktörleri ve IFN, IL gibi pek çok
sitokin JAK/STAT sinyal yolağını kullanan moleküllere örnek olarak
20
verilebilir. Her ligand kendi reseptörüne bağlandığı zaman, her iki reseptör
molekülü bir araya gelir ve reseptör ile ilişkili olan her iki JAK domaini
birbirlerini fosforile edecek şekilde yakınlaştıran bir konformasyonel
değişime
uğrar.
Bu
sayede
JAK’lar
spesifik
tirozin
motiflerinden
fosforlanarak aktive olurlar. Aktif JAK proteinleri, reseptörün de sitoplazmik
bölgelerindeki tirozin motiflerini fosforile eder ve reseptörde SH2 bölgesi
(fosfotirozin
bağlanma
bölgesi)
bulunduran
proteinlerle
etkileşime
girebilecek bölgeler ortaya çıkar. Bu fosfotirozin birimlerine bağlanabilen,
SH2 bölgesine sahip olan STAT’lar reseptörde birikir ve reseptör ile
etkileşerek JAK bağımlı tirozin fosforilasyonu ile aktive olurlar. STAT
proteinlerinin SH2 ucu başka bir STAT proteininin fosfotirozin birimine
bağlanma yeteneğine sahiptir. Sonuç olarak aktive olan ve homodimer
veya heterodimer formunu alan iki STAT proteini birbirine bağlanır ve
reseptörden ayrılır. Aktive ve dimerize olan STAT’lar hücre çekirdeğine
göç eder, DNA’ya bağlanır ve DNA üzerinde özgül cevap elemanı dizileri
ile etkileşerek hücre döngüsünü arttıran ve bölünmeyi hızlandıran genler
(siklin D, siklin E, myc, p21, p27) ile anti-apoptotik genler (survivin, Bcl-2,
Bcl-xL ve Mcl-1)
85-88,100,101
gibi çeşitli hedef genlerin transkripsiyonunu
uyararak gen aktivasyonunu başlatır
90-92,96,99,102
. STAT’ların direkt olarak
RTK’lar tarafından tirozin fosforillenmesi (örneğin EGFR) ve hatta reseptör
dışı TK’larla fosforillenmesi (örneğin c-src) de mümkündür
85,92,97
. Yani,
JAK-STAT yolağı hücre yüzey reseptörleri ile hücre büyümesine yol açan
nüklear transkripsiyonel olaylar arasında önemli bir bağlantıdır. Saatler
içinde ligandların stimüle ettiği sinyaller azalır ve STAT’lar tekrar
sitoplazmaya döner. Her bir döngüden sonra yeni STAT proteinleri sitokin
reseptörlerine bağlanabilir, fosforilize olabilir, dimerize olup tekrar
nükleusa göçebilir (Şekil 8) 101,102.
21
Şekil 8: JAK/STAT sinyal yolağı 96,103
JAK/STAT
yolağında,
kontrol
mekanizması
olarak,
aktivasyon hızlı ve geçicidir. JAK/STAT aktivasyonu pozitif yönde olduğu
kadar negatif yönde de düzenlenebilir. JAK/STAT yolağının çok sayıda
negatif regülasyon mekanizmaları belirlenmiştir
92
. Bunlardan bir tanesi
olan protein tirozin fosfatazlar, hem sitokin reseptörlerinden, hem de aktif
STAT’lardan fosfatları ayırır
84-86
. Bir tirozin fosfataz olan SH2 içeren
fosfatazlar (SHP), JAK moleküllerini defosforile ve deaktive edebilir ve aktif
STAT ailesinin inhibitör protein üyeleri fosforile STAT proteinlerine
bağlanır, onların DNA ile etkileşimini güçlendirir
102
. Proteozom aracılı
yıkım ve tirozin defosforilasyonu, inaktivasyonda önemli mekanizmalardır.
Bir başka mekanizma olan sitokin sinyali baskılayıcısı olarak bilinen
Sitokin Sinyal Baskılayıcıları (SOCS) sistemi JAK’ları bağlar, ya da
STAT’lar
ile
reseptör
bağlanma
fosforilasyonunu inhibe eder
104
bölgeleri
için
yarışarak
STAT
. Yine, STAT’ların, Aktive Edilmiş
22
STAT’ların Protein İnhibitörleri (PIAS) isimli negatif regülatörlerle hücre
çekirdeğinde inhibisyonu da mümkündür
105
. SOCS ve PIAS, inhibisyonun
en önemli mediatörleridir 104,105.
2.6.2. JAK/STAT Sinyal Yolağı ve Kanser
JAK/STAT aktivasyonu karsinogenez ile ilişkilidir. Sağlıklı
hücrelerde kısıtlı süre aktivasyon gösteren JAK/STAT yolağı, kanser
hücrelerinde bu özelliğini yitirerek sürekli aktif hale gelir
yolağının sürekli aktivasyonu lösemi
109
melanom
kolorektal
, akciğer
114
110
, over
99
ve meme kanseri
106
, lenfoma
, prostat
88
111
107
99-101
. JAK/STAT
, multiple myeloma
, baş-boyun
112
, mide
108
,
113
,
gibi çok çeşitli tümör hücrelerinde
saptanmıştır. STAT proteinleri iki mekanizma aracılığıyla karsinogenezde
etkili olur. Bunlardan biri STAT’ın sürekli aktivasyonu iken, diğeri proteinin
COOH ucunun mutasyona uğramasıdır. Devamlı olarak aktive olan STAT
proteini anti-apoptotik yolları uyararak malin süreçte etkili olabilir
114,115
.
STAT aracılı sinyal iletimi ile uyarılan hedef genlerin (örneğin c-myc, siklin
D1 ve Bcl-xL) hücre döngüsünün kontrolünü sağlayarak ve/veya apoptozu
önleyerek karsinogenez sürecinde etkili oldukları öne sürülmektedir.
Devamlı aktif STAT3 proteini ile hastalıksız sağ kalım süresi arasındaki
ters ilişki anlamlı bulunmuştur
107,115
. Ancak STAT aktivasyonu kötü
prognozun nedeni olabileceği gibi, bu sürecin kendisi de STAT
aktivasyonunu tetikleyebilir. STAT proteinlerinden bugüne kadar onkojenik
özellikleri en net ortaya konanlar, STAT-1, 3, 5 ve 6’dır. Örneğin STAT1,
STAT3
ve
STAT5
ekspresyonu
kanserin
neredeyse
her
tipinde
belirlenmiştir ve STAT3 ve STAT5 aktivitelerinin kontrolsüz işleyişi malin
transformasyonda rol oynamaktadır 85,92,99.
23
2.7.
Programlı Hücre Ölümü: Apoptoz
Çok hücreli bir organizmanın hücreleri, oldukça organize
olmuş bir topluluğun üyeleridir. Bu topluluktaki hücrelerin sayısı, hücre
bölünmesi ve hücre ölüm oranının kontrol edilmesiyle düzenlenir. Yaşayan
her hücre yaşam ve ölüm için programlanmıştır. Hücrelere gereksinim
duyulmadığı zaman, hücre içi ölüm programının aktive olmasıyla hücreler
intihar etmektedir. Bu işlem programlanmış hücre ölümü veya apoptoz
olarak adlandırılır
1,116
. Apoptoz terimi ilk olarak 1972 yılında Kerr ve
arkadaşları tarafından tanımlanmıştır
117
ve Yunancada “yaprak dökümü”,
“ayrı düşme” ya da “sonbahar” gibi anlamlara gelmektedir 1,116,118.
Fizyolojik
şartlarda
ihtiyaç
duyulmayan
veya
patolojik
koşullarda fonksiyonları bozulan hücrelerin, çevreye zarar vermeden,
genetik faktörlerin kontrolünde programlı bir şekilde olan ölümüne apoptoz
denir
118,119
korunması
. Apoptoz, hücrelerin yaşam ve ölüm arasındaki dengesinin
için
esansiyeldir.
Apoptotik
hücre
ölümü,
çok
hücreli
organizmalarda, hem gelişim esnasında hem de gelişimini tamamlamış
organizmaların homeostazisinin sağlanmasında istenmeyen hücrelerin yok
edilmesi için evrimleşmiş en önemli mekanizmadır
119-121
. Apoptozun
işlevsel mekanizmaları hücrede bir denge unsuru oluşturmaktadır 1,116-118.
2.7.1. Apoptotik Sinyal Yolakları
Pek çok farklı molekül tarafından hassas bir şekilde kontrol
edilen
apoptoz,
genel
olarak
hücre
membranında bulunan ölüm
reseptörlerinin aktifleşmesi ile karakterize edilen dışsal (reseptör aracılı)
ve mitokondri-apoptozom sisteminin aktifleşmesi ile karakterize edilen
içsel (mitokondriyal) yolak olmak üzere iki yolla başlatılabilir. Bu iki yol
24
birbiriyle bağlantılıdır ve bir yolakta yer alan molekül diğer yolağı etkiler 117119,121
.
2.7.1.1. Dışsal Yolak (Ölüm Reseptör Yolağı)
Dışsal yolakta, hücre ölümünü başlatan sinyal, hücre
dışından gelir ve apoptozun başlaması hücre zarındaki reseptörler
aracılığıyla olur. Hücrelerin yüzeyinde yer alan ve “ölüm reseptörleri”
olarak adlandırılan moleküller, ölüm sinyallerinin varlığında sinyali
algılayarak hücrenin dışsal apoptoz yolağını tetiklemektedir
119-121
.
Apoptoz, birbiriyle yapısal olarak akraba olan ölüm reseptörleri tarafından
aktif olarak uyarılır. Ölüm reseptörleri, tümör nekroz faktörü (TNF) ailesinin
üyeleridir ve en iyi bilinen örnekleri Fas ve TNF reseptörleri (TNFR)’dir.
Ölüm reseptörleri hücre zarı içine tutunmuş, bir ucu hücre dışına, bir ucu
hücre içine bakan ve hücre içi tarafında prokaspaz-8’in aktifleşmesini
sağlayan oldukça iyi korunmuş 80 aa’lik bir ölüm bölgesi (DD) bulunan
hücre yüzey reseptörleridir ve bu reseptör ailesinin günümüze kadar 8
üyesi tanımlanmıştır 117-119,122.
Hücre zarında bulunan kendileri için özgün reseptörlere
bağlanan ligandlar, reseptör yapısında konformasyonel değişime neden
olarak reseptörün trimerik (üç bileşenden oluşan) bir yapıya dönüşmesine
yol açarlar. Konformasyonel değişim sonucu aktive olan reseptörler, hücre
içinde adaptör moleküller adı verilen bir dizi molekülle etkileşirler.
Reseptör ile adaptör proteinlerin etkileşimi sonucu ölüm-tetikleyici sinyal
kompleksi (DISC) adı verilen protein kompleksi oluşur
121-123
. Bu ölüm
kompleksi ise prokaspaz-8’i iki farklı büyüklükte parçaya bölerek başlatıcı
kaspaz denen aktif kaspaz-8 oluşumunu sağlarlar
123,124
. Aktif kaspaz-8,
inaktif durumdaki proenzimler olan kaspaz-3, kaspaz-6 ve kaspaz-7 nin bir
zincir biçiminde aktifleşmesine yol açar
123-125
. Aktifleşen tüm kaspazlar
25
hücre
makromoleküllerini
oluşumuna yol açarlar
parçalayarak
124,125
tipik
apoptoz
morfolojisinin
. Ayrıca aktif kaspaz-8, Bcl-2 ailesi
proteinlerinden Bid proteinini de keserek proteolitik olarak aktifleşmesine
yol açar. Kesilerek aktifleşen Bid (tBid), mitokondri dış membranının
geçirgenliğini tetikleyerek, mitokondriden sitokrom c ve kalsiyum (Ca+2)’un
sitoplazmaya salınmasına yol açar. Böylece ölüm reseptörleri yolağı
mitokondriyal yolağı da aktifleştirmiş olur (Şekil 9) 125-127.
2.7.1.2. İçsel (Mitokondriyal) Yolak
İçsel yolak, çeşitli sinyaller tarafından mitokondri dış
membranının geçirgenliğinde değişim olması sonucunda kaspaz-9’un
aktifleşmesi ile sonuçlanan apoptotik aktivasyon sürecidir. Bu yolak hücre
içinde oluşan apoptotik sinyaller ile başlar
121,123
. Apoptotik sinyallerin
hücre içinde oluşmasına neden olan faktörler; UV radyasyonu, ısı şoku,
osmotik şok ve hipoksi gibi fiziksel ve kimyasal hasarlar, c-myc, c-FOS,
p53, PTEN gbi hücresel onkogenlerin ve tümör baskılayıcı genlerin
ifadesindeki değişiklikler, hücre iskelet yapısının bozulması, mutajenik
ajanlar ve sitositatik ajanların neden olduğu DNA hasarı, büyüme faktörü
ve sitokin yetersizliği, nükleotid ve ATP yetersizliği, hatalı katlanmış
proteinlerin birikimi
1,116-120,128
ve oksidatif stres gibi faktörlerdir. Hücre
içinde oluşan bu sinyaller apoptozu mitokondri aracılığı ile başlatır
166-168
.
Mitokondri, apoptoz başlatan yolların kesişme noktasıdır ve geri
dönüşümsüz bir döneme girildiğine işaret eder. Bu süreçteki en kritik
basamak,
spesifik
polipeptidlerin
mitokondrideki
membranlar
arası
alandan sitoplazmaya salınmalarıdır 129,130.
Elektron transport sisteminin bir bileşeni olan sitokrom c,
normal koşullarda mitokondri iç ve dış zarları arasında yer alır
131
.
Apoptozu uyaran faktörlerin varlığında, mitokondriden sitoplazmaya
26
sitokrom c’nin salınması ile kaspaz kaskadı başlatılır
131-133
. Sitoplazmaya
salınan sitokrom c molekülü, bir sitoplazma proteini olan apoptotik proteaz
aktive edici faktör-1 (Apaf-1)’e ve inaktif prokaspaz-9'a bağlanarak aktive
eder ve apoptozom kompleksini oluşturur. Aktifleşen kaspaz-9, bir seri
kaspaz aktivasyonunu başlatır ve içsel yolak üzerinden apoptozun
tetiklenmesine neden olur
122,134-136
. Kaspazların ard arda aktive
olmalarıyla diğer proteolitik aktiviteye sahip yolaklar da aktive olacağından,
sitoplazmik proteinler ve kromozomal DNA yıkılır. Bunun sonucunda,
programlanmış hücre ölümünün son aşamaları olan, hücrenin düzenleyici
ve yapısal moleküllerinin parçalanması ile sonuçlanan apoptozun son
yıkım aşaması gerçekleşir. Daha sonra bu hücre artıkları ve apoptotik
hücreler fagositozla ortamdan uzaklaştırılır (Şekil 9) 134-136.
Şekil 9: İçsel ve dışsal apoptotik yolaklar 137
27
2.7.2. Apoptozun Düzenlenmesi
Aşırı miktarda apoptozun olması veya apoptoza karşı oluşan
direnç, hücresel homeostazisin dengesini bozarak hücre ve organ işlevini
değiştirir ve organizmanın yaşamını etkiler. Apoptoz fizyolojik olarak
hassas bir şekilde kontrol edilmekte ve dengede tutulmaktadır. Kontroldeki
başarısızlık
sonucu
nörodejenerasyon
ve
çıkmaktadır
128
baskılayıcı
şekilde
gelişimsel
kanser
kusurlar,
gibi
patolojik
hastalıklar,
koşullar
ortaya
. Çeşitli proteinler apoptozu uyarıcı veya apoptozu
apoptozu
düzenlemektedir
düzenlenmesinde Bcl-2 protein ailesi
166,167,174,179,180
çeşitli
otoimmün
131,132,135
, p53
118-120
.
1,116,117,121
Apoptozun
ve kaspaz
enzimleri gibi bazı hücresel moleküller görev almaktadır.
2.7.2.1. Bcl-2 Protein Ailesi
B hücresi lenfoma geni 2 (Bcl-2) protein ailesi, hem proapoptotik hem de anti-apoptotik proteinleri içerir ve bu proteinlerin göreceli
seviyelerinin yaşam ile ölüm arasındaki seçeneği belirleyerek hücre
kaderinin kararını verebileceği kabul edilmektedir
131,132
. Bcl-2 protein
ailesinin benzer homoloji gösteren 20’den fazla üyesi belirlenmiştir
131,132,135
. Bcl-2 ailesine üye olan proteinler taşıdıkları Bcl-2 homoloji (BH)
bölgelerine göre ve ayrıca fonksiyonel ve yapısal kriterler göz önünde
bulundurulduğunda, üç farklı grup halinde incelenebilir
1,131-135
: Anti-
apoptotik özellik gösteren grup I (Bcl-2, Bcl-xL, Bcl-w, Mcl-1, A1/Bfl1,
Boo/Diva, Nrf3 ve Bcl-B), pro-apoptotik özellik gösteren grup II (Bax, Bak,
Bok/Mtd) ve grup III (Bid, Bad, Bik, Bim, Blk, Bmf, Hrk, Bnip3, Nix, Noxa,
PUMA ve Bcl-G) (Şekil 10) 131-135,138.
28
Şekil 10: Bcl-2 protein ailesi üyelerinin şematik gösterimi 139
Anti-apoptotik grup I üyeleri genellikle oldukça korunmuş dört
BH bölgesini ve mitokondri dış membranı, endoplazmik retikulum
membranı gibi çeşitli hücre içi membran yüzeylerine bağlanabilmelerine
olanak sağlayan C terminal transmembran bölgesini içermektedirler. Proapoptotik grup II üyeleri ise N terminal BH4 bölgesi dışında tüm diğer BH
bölgelerini ve transmembran bölgesini içermektedirler. Son olarak grup III
üyeleri diğer gruplara göre oldukça heterojendir ve tek ortak homolojileri
15 aa’lik BH3 bölgesidir. (Şekil 13)
131,132,135
. Bcl-2 protein ailesinin grup I
üyeleri apoptozu inhibe ederken, grup II üyeleri apoptozu aktive eder.
Üçüncü sınıfa dahil olan grup III moleküller ise, anti-apoptotik üyelere
bağlanarak apoptozu inaktive eder 1,116-119,131-135.
Bcl-2 protein ailesi, apoptotik yolağın kontrolünde merkezi bir
rol oynar. Mitokondri dış membranında bulunan Bcl-2 protein ailesi,
mitokondriden sitokrom c salınmasını kontrol eder ve iyon transportunu
düzenleyerek mitokondri dış zar potansiyelinin değişimini düzenler. Ailenin
Bax, Bak gibi pro-apoptotik üyeleri normal koşullarda inaktif durumdadır,
bu nedenle mitokondriyal zar geçirgenliği Bcl-2, Bcl-xL gibi anti-apoptotik
proteinlerin etkisi sayesinde değişmez
132,135
. Bu anti-apoptotik proteinler,
apoptozu engelleme fonksiyonunu ya kaspazların öncü formlarını
durdurarak ya da aktif kaspaz akışını direkt olarak aktive eden
29
sitoplazmadaki apoptoz uyarıcı faktör (AIF) ve sitokrom c gibi apoptojenik
faktörlerin mitokondriden salınmasını engelleyerek gerçekleştirir
Ancak
apoptozu
uyaran
çeşitli
faktörler
pro-apoptotik
131,132,135
.
grubun
aktifleşmesine yol açar. Bu durumda anti-apoptotik proteinler, proapoptotik
aile
üyeleri
tarafından
baskılanır.
Apoptotik
sinyalin
alınmasından sonra, Bax, Bak gibi pro-apoptotik proteinler, hem
heterodimerizasyon yoluyla kaspaz serbestleşmesini uyarır hem de
mitokondri zarının geçiş porlarının açıklığını değiştirerek zar potansiyelinin
değişimine yol açar ve zardaki Ca+2 gibi iyonların geçirgenliğini arttırabilir.
Zardaki bu değişiklikler nedeniyle sitokrom c ve AIF gibi mitokondri zarı
içinde yer alan faktörler sitoplazmaya geçer. AIF doğrudan yoğunlaşan
kromatine ve parçalanan çekirdeğe yönelirken, sitoplazmaki sitokrom c
apoptozun en son basamağında görev alır
1,116-120,131-135,138
. Sonuç olarak
Bcl-2, Bcl-xL gibi anti-apoptotik üyelerin oranı fazla ise apoptoz
engellenerek hücre yaşamını sürdürürken, Bax, Bak gibi pro-apoptotik
üyelerin oranı fazla ise hücre apoptoza yönlendirilerek, hücre ölümü
gerçekleşir.
2.7.2.2. p53
Apoptozun düzenlenmesi, p53 ile başlayan ve kaspazlara
kadar devam eden bir süreçtir. Bu nedenle apoptozun diğer bir
düzenleyicisi olan ve tümör baskılayıcı bir gen olan p53 kritik bir öneme
sahiptir. p53 sitoplazmada bulunan ve DNA’nın ya da hücrenin ağır
biçimde hasar görmesi durumunda DNA da belli genlerin aktivasyonuna
(Bax, Bak, Bcl-Xs Apaf-1, Fas) belli genlerin de baskılanmasına (Bcl-2,
Bcl-xL, Mcl-1) yol açarak apoptozu tetikleyen bir moleküldür
120,138,140,141
1,117-
. p53, hücrede DNA hasarı oluştuğunda S fazına geçişi bloke
eder ve G1 duraklamasını sağlar. Böylece DNA tamiri için zaman
kazanılır. Bu şekilde DNA tamirine yardım etmekte ve DNA tamir genlerini
uyarmaktadır. DNA’sı hasarlanan ve tamir edilemeyen hasarlı hücre p53
30
tarafından apoptoza yönlendirilir
138,140,141
. p53, mutasyona uğradığı ya da
bulunmadığı zaman hücre yaşamı uzar. Yine p53’ün kaybında da DNA
hasarları onarılamamaktadır. İnsanlarda görülen pekçok kanser tipinde
p53 geninin normal fonksiyonlarını yapamadığı veya hasara uğradığı
saptanmıştır 120,138,140,141.
2.7.2.3. Kaspazlar
Apoptozun bir diğer düzenleyici ise kaspaz (CASPASE;
sistein bağımlı aspartata spesifik proteaz) enzimleridir
142-144
. Bunlar
sistein proteazlardır ve substratlarını aspartik asitten sonraki peptid bağını
kırarak keserler. Apoptotik hücre ölüm yolağının ana düzenleyicileri olan
kaspazlar, 400’den fazla substratı proteolitik olarak keserek görev yaparlar
124,133,134,142
. İç ve dış sinyallerle apoptoz tetiklendiğinde hücre içinde
kaspaz enzimleri aktive olur. Kaspaz aracılı protein yıkımı apoptotik
hücrelerde
gözlenen
bazı
biyokimyasal
olayların
da
temelini
oluşturmaktadır. Kaspazların ard arda aktive olmalarıyla diğer proteolitik
aktiviteye sahip yolaklar da aktive olur, sitoplazmik proteinler ve
kromozomal DNA yıkılır. Kaspaz enzimlerinin aktivitesi apoptozun
tetiklenmesinden
DNA
fragmentasyonuna,
plazma
membranının
tomurcuklanmasından, fosfolipid asimetrisinin bozulmasına kadar tüm
apoptoz sürecinde yer almaktadır 124,125,133,134,142.
İnsanlarda bilinen 12 kaspazdan 7’sinin (kaspaz -2, -3, -6, -7,
-8 , -9 ve -10) apoptotik süreçte rol oynadığı saptanmıştır. Kaspazlar,
öncül
formlarında
enzimatik
olarak
inaktif
zimojenler
sentezlenmekte ve apoptoz sırasında aktifleşmektedirler
olarak
124,125,133,142-144
.
Kaspaz enzimleri, apoptoz sürecindeki rolleri göz önünde bulundurularak
iki ana grupta incelenebilir. Başlatıcı kaspazlar (kaspaz-2, 8, 9, 10), çeşitli
hücre-içi ya da hücre-dışı sinyalleri proteolitik aktiviteye çevirerek kaspaz
31
kaskadının başlatılmasından sorumlu olan kaspazlardır. Effektör (cellat)
kaspazlar (kaspaz-3, 6, 7) ise hücre içerisindeki spesifik polipeptid
hedeflerini
proteolitik
olarak
keserek
tamamlanmasını sağlayan enzimlerdir
apoptoz
133,134,142-144
mekanizmasının
.
2.7.3. Apoptoz ve Kanser
Bir hücrenin DNA’sında oluşan hasar, tamir mekanizmaları
ile düzeltilemezse, bu hücre güvenli bir şekilde genetik kontrol
mekanizmalarının öncülüğünde apoptoza gider, çünkü hücrenin hasarlı
genetik materyalle mitoza girmesi genomik kararsızlığa yol açabilir
122,145
.
Fakat, genetik kontrol mekanizmalarını oluşturan proteinlerde (p53, Rb,
v.s.) bir hasar sözkonusu ise, hücre apoptoza gidemez ve hasarlı bir
şekilde
bölünür.
Aşırı
bölünen
bu
hücreler
başlangıcını tetikler ve kanser oluşumu başlar
neoplazik
146-148
oluşumun
. Apoptozun normal
mekanizmasının bozulmasının kanser oluşumunun önemli bir nedeni
olduğu düşünülmektedir. Apoptoz kanser hücrelerinin zararına çalışırken,
organizmanın
yararına
çalışır.
Kanser
hücreleri
ya
anti-apoptotik
proteinlerin aşırı yapımıyla ya da pro-apoptotik proteinlerin yapımlarının ya
da etkilerinin azalmasıyla apoptoza dirençli bir nitelik kazanırlar 146,147.
Hücrelerin normal apoptotik süreçten kaçmalarını sağlayan
bir özellik kazanmaları hemen bütün kanser hücrelerinde gözlenen bir
özelliktir. Apoptotik yolakların aktifleştirilmesi kanser terapisinin temel
ilkelerinden biridir. Hasarlanmış hücrelerin yok edilmesini hedefleyen
terapilerde çoğunlukla spesifik olarak apoptozun tetiklenmesi tercih
edilmektedir
122,145
mekanizmaları,
. Günümüzde, birçok anti-kanser ilacın olası etki
hedef
yetenekleriyle ilgilidir
kanser
149-151
hücrelerinde
apoptoza
neden
olma
. Çoğu kanser ilacı neden oldukları DNA hasarı
üzerinden etki göstermektedir ve kanser hücrelerinin DNA tamir
32
mekanizmalarındaki yetersizlikten yararlanarak hücreleri apoptotik sürece
sürüklemektedir
150
. Kanser ilaçlarının etkinliğini arttırabilmek ve olası
direnç mekanizmalarının önüne geçebilmek amacıyla anti-neoplastik
ajanların
aktifleştirdikleri
apoptotik
yolakların
tanımlanması
güncel
araştırma konusudur. Günümüzde farklı kanserlerin tedavisinde kanser
hücrelerini ölüme götürmek için radyoterapi ve kemoterapiden sıklıkla
yararlanılmaktadır
149-151
. Çeşitli tedaviler ile apoptozun uyarıldığı kanser
hücrelerinde, tedavinin hangi genlerin ekspresyon miktarını değiştirdiğinin
belirlenmesi, o kanser hücresinde apoptozun hangi düzeyde regüle
edildiğinin anlaşılmasını sağlar.
2.8.
Siklin D1
Ökaryotik canlılarda hücrenin çoğalması, hücre döngüsünü
de içine alan kompleks bir işlemdir. Ökaryot hücre döngüsü M (mitoz) G1,
S ve G2 fazlarından oluşmaktadır ve G1-S geçişinde, G2-M geçişinde ve
M-G1 geçişinde kontrol noktaları bulunmaktadır
noktaları,
hücrenin
içerisinde
bulunduğu
152-154
fazın
. Bu kontrol
tamamlanıp
tamamlanmadığı ve bir sonraki faza geçiş için koşulların uygunluğunun
kontrol edildiği süreçlerdir
153-157
. G1-S kontrol noktasında, hücrenin
replikasyon için hazır olup olmadığı, G2-M kontrol noktasında hücrenin
mitoz bölünme için uygun olup olmadığı, M-G1 kontrol noktasında ise
kromozomların yerleşimi kontrol edilir 152-155. Hücre döngüsü siklinler, siklin
bağımlı kinazlar (CDK) ve siklin bağımlı kinaz inhibitörleri (CDKI)
tarafından kontrol edilir
152,153
. Hücre döngüsü kontrol noktalarında iş
gören protein yapısındaki siklinlerin, protein kinaz aktivitesi için ortamda
mutlaka bulunmaları gereklidir. Siklinler, hücre döngüsünün belirli
evrelerinde sentez edilirler ve katalitik alt birim olan CDK’ı aktive ederek
bir arada heterodimer formunda aktivite gösterirler
158
. Bu heterodimerin
asıl görevi çeşitli hücre içi proteinlerin forforillenmesi ile hücre yaşam
33
döngüsünün devamlılığının sağlanmasıdır. Fonksiyonlarını yerine getiren
siklinlerin düzeyi hızla düşer 153-156.
Hücre döngüsünün sistematik biçimde düzenlenmesinde
işlevleri en iyi bilinen siklinler, siklin A, B, D ve E’dir
152-155
. D tipi siklinlerin
ise 3 alt grubu vardır. Bunlar; siklin D1, D2 ve D3’tür. D tipi siklinler, hücre
döngüsünde artan ilk siklinlerdir ve hücre döngüsünün G1 evresinde
CDK4 ve CDK6’ya bağlanarak aktive eder. Bu sayede retinoblastoma (Rb)
proteini fosforile olur ve hücre G1 fazından S fazına geçer 154,156-158.
Hücre döngüsünün düzenlenmesi ve kontrolü, normal
hücrelerin büyüme ve farklılaşması yanı sıra kanser gelişiminde de önemli
rol oynamaktadır
159,160
. Çeşitli kanser türlerinde siklinlerin ve CDK’ın aşırı
ekspresyonu söz konusudur
159-161
. Siklin D1, büyüme faktörü sinyal
iletiminin önemli hedeflerinden biri olduğundan, siklin D1 regülasyonundaki
bozukluklar, kanser hücrelerinin karakteristik özelliği olan kontrolsüz
çoğalmaya neden olur. Buna göre insan kanserlerinin çoğunun, hücre
döngüsü regülasyonundaki bozukluklar sonucu kaynaklandığı bulunmuştur
159-162
. Kanserin karakteristik özelliklerinden en önemlisinin kontrolsüz
hücre bölünmesi olduğu düşünüldüğünde ifadelenme profilindeki bu
değişimin önemi anlaşılmaktadır. Kolon kanseri de dahil olmak üzere
çeşitli insan kanser tiplerinde siklin D1’in aşırı ifadelenmesi hastalığın
agresif seyri ile ilişkilidir. Ayrıca siklin D1 ifadesinin engellenmesinin kolon
kanseri hücre hatlarında tümörün büyümesini durdurduğu bildirilmiştir
23,161,162
.
2.9.
CDK İnhibitörü p27Kip1
CDK’ların hücre döngüsündeki işlevlerinin düzenlenmesi,
CDKI tarafından gerçekleştirilmektedir. CDKI, hücre döngüsünün negatif
34
kontrolünden sorumludurlar ve siklin-CDK komplekslerinin aktivitelerini sıkı
bir şekilde denetlemektedirler
155,156
. Büyümeyi inhibe edici sinyalden
sonra, CDK aktivitesini düzenleyen ve hücre döngüsü baskılanmasını
uyaran başlıca iki sınıf CDKI tanımlanmış olup, bunlar Cip/Kip (Cdk
Inhibitory protein / Kinase Inhibitory Protein) Ailesi ve INK4/ARF Ailesi’dir.
Cip/Kip ailesi üyeleri; p21Cip1 (CDKN1A), p27Kip1 (CDKN1B) ve p57Kip2
(CDKN1C) iken, INK4/ARF ailesi üyeleri p14 ve p16’dır
156,163,164
. CDKI
molekülleri; ya CDK’lar ile ilişki kurarak, ya da siklin - CDK kompleksi ile
ilişki kurarak kinaz aktivitesini baskılamaktadır. Cip/Kip ailesi inhibitörleri
siklin-CDK
kompleksine
bağlanarak
kinaz
aktivitesini
engellerken,
INK4/ARF ailesi inhibitörleri spesifik olarak CDK’ya bağlanarak siklinlere
bağlanmasını engeller 163-165.
Cip/Kip ailesinden p27Kip1 anti-mitojenik sinyallere karşı
oluşan cevapta, büyümeyi düzenleyen önemli bir moleküldür
164,165
. Hücre
döngüsünün inhibitör proteinlerinden olan p27Kip1 CDKI’nin siklin-CDK
kompleksine bağlanması için, sitoplazmadan hücre çekirdeğine yer
değiştirmesi
gerekir
165-167
.
Onkojenik
uyarı
halinde
bu
protein
fosforilasyona uğrar. Bunun sonucunda, p27Kip1 sitoplazmaya geri döner
168,169
ve hücre döngüsündeki inhibitör etkisi ortadan kalkar
. p27Kip1 geni
DNA hasarı sonucu hücre döngüsünün durdurulması ya da hücrelerin
apoptoza yönlendirilmesi sürecinin anahtar bileşenlerindendir. P27Kip1
miktarındaki artış, hücrelerin G1 fazından S fazına ya da S fazından G2
fazına
geçişlerini
engeller
ve
böylece
hücreler
genomik
onarım
tamamlanıncaya kadar G1 fazında durdurulur 170-172.
Hücre
döngüsünün
düzenlenmesindeki
hatalar,
hücre
döngüsü kontrol noktalarındaki değişimler hücre bölünmesinin kontrolünün
bozulmasına ve kanser gelişimine neden olabilir
163,164
. CDKI, hücre
döngüsünde ve tümör baskılayıcı fonksiyonlarından dolayı kanser
gelişiminde birer genetik değişiklik hedefidirler. Çeşitli kanser türlerinde bu
35
tümör baskılayıcı proteinlerin eksikliği, siklin ve CDK’ların ise aşırı
ekspresyonu
söz
konusudur
23,163,164,173,174
.
Bu
nedenle;
kanser
hücrelerinde, p21, p27 ve p57 CDKI’leri gibi hücre döngüsünün negatif
kontrolünden
ve
tümör
baskılanmasından
sorumlu
moleküllerin
fonksiyonlarının saptanması ve bu fonksiyonların neoplastik süreçteki
etkilerinin belirlenmesi, klinik tanı, tedavi ve prognozun belirlenmesinde
faydalı olmaktadır 23,172-174.
2.10. Gefitinib
Günümüzde, hedefe yönelik tedavi amacıyla pek çok ilaç
geliştirilmiştir ve geliştirilmeye devam edilmektedir. TK’ların ve TK hedefli
inhibitörlerin klinikte gelişimi kanser tedavisine yenilik getirmiştir
175,176
.
Örneğin EGFR, malin hastalıklara karşı yeni ilaçların geliştirilmesinde
önemli bir stratejik hedeftir. EGFR yolunu hedefleyen ajanlardan reseptör
düzeyinde etki gösteren mAb’lar ile hücre içi sinyal ileti yolağını bloke
eden TKİ son yıllarda üzerinde en fazla çalışılan ajanlar olmuştur 60,175,176.
Gefitinib (Gef) (IressaTM, ZD 1839), anilinoquinazolinler sınıfına dahil
olan, oral olarak aktif ve iyi bilinen bir EGFR-TKİ’dür (şekil 11)
60,177,178
.
Yapısal formülü C22H24ClFN4O3’dür ve 446,9 moleküler ağırlığa sahiptir.
Kimyasal adı 4-kinazolinamin ve sistematik adı N-(3-chloro-4-fluorophenyl)-7-methoxy-6-(3-morpholin-4-ylpropoxy)quinazolin-4-amine
olan
Gef, EGFR’nün TK aktivitesini inhibe eden anti-kanser yeni sınıf ilaçların
ilkidir ve günümüzde EGFR hedefli terapide klinikte kullanılmaktadır 179-181.
Gef, 2003 yılı Mayıs ayında FDA tarafından onaylanarak ileri evre küçük
hücreli dışı akciğer kanseri (KHDAK) tedavisinde tek ajan olarak
kullanılmaya başlanmıştır
182-184
. Günümüzde ise 64 ülkede pazarlanan
Gef’in, oral kullanımda biyoyararlanımı % 59’dur. Vücuttan atılımı fekal yol
ile olur. En çok görülen yan etkisi akne benzeri cilt reaksiyonlarıdır.
Hastaların % 1’inde ishal, bulantı, kusma ve dehidratasyon görülmüştür
178-181
.
36
Şekil 11: Gef’in kimyasal yapısı 185
Gef, kanser hücrelerinin büyümesi, çoğalması ve sağ
kalımlarını kontrol eden sinyal ileti yolaklarını durduran ilk seçici EGFRTKİ’dür. Gef, EGFR’nin sitozolik TK bölgesindeki ATP bağlanma bölgesine
bağlanarak EGFR-TK’ın otofosforilasyonunu ve hücre içi sinyal iletimini
inhibe eder (şekil 12)
179-181
. Böylece tümör büyümesini engelleyerek bir
anti-kanser ilaç gibi davranır.
Şekil 12: Gef’in etki menizması 186
Gef’in, tümör ksenogreft modellerinde ve baş-boyun, prostat,
meme, yumurtalık, mide, kolon, KHDAK gibi çeşitli insan kanser hücre
hatlarında EGFR otofosforilasyonunu önlediği ve çeşitli sitotoksik ilaçlarla
37
birlikte kombine uygulandığı zaman tümörlü hücrelerin büyümesini inhibe
ettiği, hücre döngüsünü durdurduğu, metastaz oluşumunu azaltma
yeteneğine sahip olduğu, pro-apoptotik etkiyi doza bağımlı olarak arttırdığı
gözlenmiştir. Bu nedenle Gef, kanser tedavisi için yeni tedavi edici
stratejiler sunmaktadır 175,187-190.
2.11. Kukurbitasin B
Bitki özleri, kanser tedavisinde geleneksel ilaç olarak
yüzyıllardır kullanılmaktadır. Doğal ürünlerden elde edilen tedavi edici
bitkisel kökenli ilaçlar ise kanser tedavisinde uzun yıllar önce yaygın olarak
kullanılmaya başlanmış ve kanser tedavisinde önem kazanmıştır
191-193
.
Fitokimyasallar, kolon kanseri sıklığını azaltmada önemli rol oynayan
biyoaktif bitkisel bileşiklerdir
194,195
. Fitokimyasalların bir grubu olan
kukurbitasinler, bitkiler aleminin Scrophulariaceae, Cruciferae gibi bazı
ailelerinde bulunmakla birlikte yaygın olarak Cucurbitaceae (Kabakgiller)
bitki ailesinden izole edilen ve yüksek yapısal farklılığı olan tetrasiklik
triterpenoidlerin bir grubudur
193,196,197
. Kukurbitasin, acı tadı ve toksik
etkisi iyi bilinen ve yüksek oranda oksijenlenmiş bir maddedir. Yapısal
olarak, tetrasiklik cucurbitane çekirdek iskeletinin 19-(10→9β)-abeo-10lanost-5-ene ile karakterize olan kukurbitasin, kimyasal olarak çok çeşitli
bir bileşik olup, yan zincir modifikasyonları ve stereokimya değerlerine
göre A’dan T’ye kadar olmak üzere 12 alt gruba ayrılır
193,196-198
. Serbest
veya glikozillenmiş formda bulunabilen bu bileşik ailesi ateş düşürücü, ağrı
kesici, anti-inflamatuar, anti-mikrobiyal, anti-diyabetik ve kanser önleyici
etkilerinden dolayı Çin ve Hindistan gibi Asya ülkelerinde yüzyıllardır
geleneksel tedavi yöntemi olarak kullanılmaktadır 199-203.
38
Şekil 13: Kukurbitasin B’nin kimyasal yapısı 204
Kukurbitasinlerden en bol olanı ve in vivo ve in vitro
çalışmalar için en yaygın olarak kullanılanı kukurbitasin B (CuB)’dir
193,197,203,205
düşük
. Önemli bir anti-inflamatuar, anti-oksidan, anti-diyabetik ve
ilacı
olarak
geleneksel
kullanılmakta olan CuB
tedavi
193,197,198,206,207
yönteminde
uzun
yıllardır
, gelecek vaat eden bir anti-kanser
ilaç adayıdır, buna rağmen etki mekanizması henüz tam olarak
anlaşılamamıştır (şekil 13) 208.
Günümüzde pek çok araştırma CuB’nin kanser üzerindeki
inhibe edici etkisine odaklanmaktadır. Son yıllarda yapılan çeşitli
çalışmalarda CuB’nin hepatoma, lösemi, lenfoma, multiple myeloma,
melanoma, glioblastoma, oral kavite kanserleri, nazofarinks, meme,
prostat, kolon, akciğer, pankreas, serviks ve merkezi sinir sistemi dahil
olmak üzere in vitro insan kanser hücre hatlarında ve in vivo tümör
ksenograft modellerinde kanserli hücre büyümesini inhibe edici etkisi
olduğu gösterilmiştir
193,205-207,209-214
. CuB’nin tümör önleyici mekanizması
çeşitli sinyal iletim yolaklarını durdurmasının yanı sıra, hücre iskeletinin
bozulması, hücre döngüsünün durması veya bozulması, apoptoz uyarımı
ve farklılaşma dahil olmak üzere çeşitli etkileri içerir
209-212,215
. CuB’in, anti-
tümörijenik aktivitesini önemli onkojenik yolaklardaki JAK/STAT sinyal
yolağını inhibe ederek tümör gelişimini baskıladığı gösterilmektedir
208,212,213
. CuB, kanserli hücre büyümesini baskılayıcı etkisini STAT3
39
fosforilasyonunu baskılaması sonucu JAK/STAT yolağını inhibe etmesi,
apoptoz uyarımı ve hücre döngüsünün bozulması veya durması ile
göstermektedir 214-216. CuB, STAT3 tirozin (Tyr705) fosforilasyonunu inhibe
ederek, JAK2 ve STAT3 aktivasyonunu, STAT3 DNA bağlanmasını ve
STAT3 aracılı gen ifadelenmesini baskılayarak kanserli hücre büyümesini
inhibe etmektedir
202,208,214-216
. CuB, apoptoz ile ilişkili genler ve hücre
döngüsünü düzenleyen genler gibi JAK-STAT yolağının downstream
genlerini düzenler ve JAK/STAT yolağını baskılar, sonuç olarak tümör
büyümesini inhibe ederek apoptozu uyarır 208,212,214,216.
CuB, fosfotirozin-STAT3’ü hücresel düzeyde baskılarken,
fosfo-ERK1/2, fosfo-JNK ve fosfo-AKT’yi baskılayamaz. CuB kanser
hücrelerinde Akt/PKB ve MAPK/ERK yolakları gibi diğer büyüme öncesi
sinyal yolaklarını inhibe etmez
196,212
. Bu nedenle STAT3 TK bölgesi, CuB
için olası moleküler bir hedeftir.
2.12. HT-29 Kolon Kanser Hücre Hattı
HT-29 hücre hattı, 1964 yılında Fogh ve ark. tarafından 44
yaşındaki kolorektal adenokarsinoma hastası olan Kafkas bir kadından
alınmış ve üretilmiştir
217,218
. Epitel benzeri morfolojiye sahip olan bu
hücreler, tümör baskılayıcı p53 geninde mutasyon taşırlar ve mutant p53
proteini üretirler. Ayrıca, HT-29 hücreleri abl, ros ve src genlerini
içermezler ve tümör hücrelerinin özelliklerini sergileyen HT-29 hücreleri cmyc, K-ras, H-ras, N-ras, myb, sis ve fos gibi çeşitli onkogenleri ifade
ederler. HT-29 hücreleri yaklaşık 40-60 saatte bir bölünerek çoğalırlar
(Şekil 14) 217-220.
40
Şekil 14: HT-29 hücrelerinin morfolojik görüntüsü 220
2.13. HCT-116 Kolon Kanser Hücre Hattı
HCT-116 hücre hattı, 1981 yılında Brattain ve ark. tarafından
kolorektal karsinoma hastası olan bir erkekten alınmış ve üretilmiştir 222,223.
Epitel benzeri küçük hücre morfolojisine sahip olan HCT-116 hücrelerinin,
Transforme edici büyüme faktörü beta-1 (TGFβ-1) ve beta-2 (TGFβ-2)
genlerinde amplifikasyon olduğu ve buna bağlı olarak TGFβ-1 ve TGFβ-2
mRNA düzeylerinin yüksek olduğu bildirilmiştir. Ayrıca bu hücreler ras
geninde de mutasyon taşırlar ve mutant ras proteini üretirler. HCT-116
hücreleri yaklaşık 25-48 saatte bir bölünerek çoğalırlar (şekil 15) 222-224.
41
Şekil 15: HCT-116 hücrelerinin morfolojik görüntüsü 224
42
3. GEREÇ VE YÖNTEM
3.1.
Kullanılan Araç ve Gereçler
3.1.1. HT-29 ve HCT-116 Hücre Hattı
Çalışmamızda, T.C. Tarım ve Köy İşleri Bakanlığı’na bağlı
Şap Enstitüsü Müdürlüğü, Hücre ve Virüs Bankası Bölümü’nden alınan
insan kolon karsinoma hücre hattı olan HT-29 hücreleri (HÜKÜK Kayıt No:
96041201) ile bir diğer insan kolon karsinoma hücre hattı, Amerikan Doku
Kültür Kolleksiyonu (ATCC)’ndan sağlanan insan kolon karsinoma hücre
hattı olan HCT-116 hücreleri (ATCC Kayıt No: CCL-247™) kullanıldı. Her
iki hücre hattı da Dulbecco’s Modified Eagle Media (DMEM)’lı besiyerinde
kültüre edildi.
3.1.2. Kullanılan Cihazlar
•
Biyogüvenlik kabini (DanLaf, Danimarka)
•
Buzdolabı (Arçelik, Türkiye)
•
Derin dondurucu, -30°C (Sanyo, Japonya)
•
Derin dondurucu, -86°C (Sanyo, Japonya)
•
Elektroforez tankı (Thermo Scientific, ABD)
•
Floresan ataçmanlı mikroskop (Olympus BX-50, Japonya)
•
Güç kaynağı (BIO-RAD)
•
Hassas terazi (AND-ER-182A, Japonya)
•
Hybaid PCR-Sprint otomatik ısı döngü cihazı (Thermo Scientific,
ABD)
•
Invert mikroskop (Zeiss, Almanya)
•
Işık mikroskobu (DCM 4000, Leicia, Almanya)
43
•
Jel görüntüleme sistemi (Kodak, ABD)
•
Karbondioksitli etüv (Sanyo, Japonya)
•
Küçük poliakrilamid jel sistemi (BIO-RAD)
•
LightCycler Real-Time PCR cihazı (Roche, Almanya)
•
Manyetik karıştırıcı (TMA 2071, Almanya)
•
Mikropipetler, 10μL, 100μL, 100μL (Bt10, Bt100, Bt1000 Biohit,
CLP, ABD)
•
Mikroplaka okuyucu (BioTek ELx800, ABD)
•
pH metre (WTW 422, Almanya)
•
Soğutmalı santrifüj (Hettich Mikro 22 R, Almanya)
•
SpectraMax M3 (Molecular Devices, ABD)
•
Spektrofotometre (NanoDrop ND-1000) (Thermo Scientific, ABD)
•
Spin vorteks (Biosan, Rusya)
•
Western Blot Sistemi (Bio-Rad, İngiltere)
3.1.3. Kullanılan Sarf Malzemeleri
•
Hücre kriyo (dondurma) ampülü (Greiner, Almanya)
•
Hücre kültür flaskları, 25 cm2 ve 75 cm2 (Corning, ABD)
•
Kültür tüpleri (Corning, ABD)
•
Mikrosantrifüj tüpleri (CLP, Almanya)
•
Petri kabı, 35mm, 60mm ve 100mm (Corning, ABD)
•
Pipet uçları (CLP, Almanya)
3.1.4. Kullanılan Kimyasal Maddeler
•
Agaroz (Peqlab, Erlangen, Almanya)
44
•
Amonyum persülfat (Thermo Fisher Scientific, Almanya)
•
Akridin Oranj (Sigma, ABD)
•
Akrilamid (Merck Millipore, Almanya)
•
Asetik asit (Thermo Fisher Scientific, Almanya)
•
Beta - Merkaptoethanol (Merck Millipore, Almanya)
•
Borik asit (Ambresco, ABD)
•
Bovin Serum Albümin (Pierce, ABD)
•
Bromfenol mavisi (Thermo Fisher Scientific, Almanya)
•
Coomasie parlak mavisi (Thermo Fisher Scientific, Almanya)
•
Cucurbitacin B (Tocris, ABD)
•
Diaminobenzidin (Thermo Fisher Scientific, Almanya)
•
Dimetil sülfoksit (DMSO) (Ambresco, ABD)
•
Disodyumhidrojenfosfat (Na2HPO4) (Sigma, ABD)
•
DMEM besiyeri (HyClone, Thermo, ABD)
•
DNA Markır (Thermo Fisher Scientific, Almanya)
•
Etanol (Sigma, ABD)
•
Etidyum Bromür (Sigma, ABD)
•
Etilendiamintetraasetik asit (EDTA) (Ambresco, ABD)
•
Fenilmetilsülfonilflorid (PMSF) (Roche, Almanya)
•
Fetal sığır serumu (FCS) (inaktif) (HyClone, Thermo, ABD)
•
Gefitinib (Gef) (Tocris, ABD)
•
Glisin (Thermo Fisher Scientific, Almanya)
•
Gliserol (Merck Millipore, Almanya)
•
Glutamin (HyClone, Thermo, ABD)
•
Hidrojen peroksit (H2SO4) (Thermo Fisher Scientific, Almanya)
•
Hidroklorik asit (HCl) (Thermo Fisher Scientific, Almanya)
45
•
İnaktive edilmiş fetal sığır serumu (FCS) (HyClone, Thermo, ABD)
•
Laemmli buffer (Sigma, ABD)
•
Metanol (Thermo Fisher Scientific, Almanya)
•
Moleküler ağırlık işaretleyici (Santa Cruz, Almanya)
•
Nitrosellüloz membran (Amersham Bioscience, ABD)
•
N’ N’-bis-metilen-akrilamid (Merck Millipore, Almanya)
•
Nonidet P-40 (NP-40) (Sigma, ABD)
•
Orange G (Sigma, ABD)
•
PBS (Tuzlu fosfat tamponu) (Thermo Fisher Scientific, Almanya)
•
Penisilin/Streptomisin (HyClone, Thermo, ABD)
•
Ponceau S (Ambresco, ABD)
•
Primerler (Alfa DNA, Almanya)
•
Protein Marker (New England Biolabs, Almanya)
•
Proteinaz K (Sigma, ABD)
•
Ribonükleaz A (Sigma, ABD)
•
Sitrik Asit (Sigma, ABD)
•
Sodyumdihidrojenfosfat (NaH2PO4) (Sigma, ABD)
•
Sodyum dodesil sülfat (SDS) (Thermo Fisher Scientific, Almanya)
•
Sodyum hidroksit (NaOH) (Thermo Fisher Scientific, Almanya)
•
Sodyum klorür (NaCl) (Merck Millipore, Almanya)
•
Sülfirik asit (H2SO4) (Merck Millipore, Almanya)
•
Tetrametilendiamin (TEMED) (Thermo Fisher Scientific, Almanya)
•
Tripsin-EDTA (HyClone, Thermo, ABD)
•
Tris (Ambresco, ABD)
•
Tween 20 (Thermo Fisher Scientific, Almanya)
•
Universal Probe Library (UPL) Probları (Roche, Almanya)
46
3.1.5. Kullanılan Kitler
•
Cell Death Detection ELISA Plus Kit (Roche, Almanya)
•
Cell
Proliferation
ELISA,
BrdU
(Kolorimetrik) (Roche, Almanya)
•
Cytotoxicity Detection Kit Plus LDH (Laktat Dehidrogenaz) (Roche,
Almanya)
•
High Pure PCR Template Preparation Kit (Roche, Almanya)
•
High Pure RNA İzolasyon Kiti (Roche, Almanya)
•
Hücre Canlılığı Kiti (MTT) (Roche, Almanya)
•
PathScan® Cleaved Kaspaz-3 (Asp175) Sandwich ELISA Kit (Cell
Signaling, ABD)
•
SuperSignal® WestPico Chemilumiscent Substrate (Pierce, ABD)
•
TaqMan Master Mix (Roche, Almanya)
•
Transcriptor First Strand cDNA Sentez Kiti (Roche, Almanya)
(5-bromo-2’-deoksiuridin)
3.2. Besiyeri, Tampon ve Çözeltilerin Hazırlanışı
3.2.1. % 10’luk DMEM Besiyerinin Hazırlanması
450 ml DMEM besiyeri içerisine, 50 ml fetal sığır serumu
(FCS), 200 mM L-glutaminden 10 ml ve son konsantrasyonu 100 IU/ml
penisilin ile 100 μg/ml streptomisin eklenerek %10’ luk DMEM besiyeri
hazırlandı.
47
3.2.2. % 1’lik DMEM Besiyerinin Hazırlanması
495 ml DMEM besiyeri içerisine, 5 ml FCS, 200 mM Lglutaminden 10 ml, 100 IU/ml penisilin, 100 μg/ml streptomisin eklenerek
%1’ lik DMEM besiyeri hazırlandı.
3.2.3. MTT Karışımının Hazırlanması
MTT
[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium
bromide] stok solüsyonu hazırlamak için toz halinde olan MTT 1 ml’de 5
mg olacak şekilde tartılarak distile suda çözüldü. Daha sonra filtreden
geçirilerek steril hale getirildi.
3.2.4. 0.2 M Na2HPO4 Çözeltisinin Hazırlanması
1.42 g Na2HPO4 tartılarak son hacim 50 ml olacak şekilde
distile su içinde çözüldü.
3.2.5. 0.1 M Sitrik Asit Çözeltisinin Hazırlanması
0.96 g sitrik asit tartılarak son hacim 50 ml olacak şekilde
distile su içinde çözüldü.
3.2.6. Fosfat-Sitrat Çözeltisinin (PH: 7.8) Hazırlanması
0.2 M Na2HPO4 çözeltisi ile 0.1 M sitrik asit çözeltisi 48:2
oranında karıştırılarak hazırlandı. Hazırlanan çözeltinin pH’sı 7.8’e
ayarlandı.
48
3.2.7. %.25 Nonidet P-40 (Np-40) Çözeltisinin Hazırlanması
25 μL NP-40 alınarak son hacmi 10 ml olacak şekilde distile
su içerisinde çözüldü.
3.2.8. 1 mg/ml Proteinaz K Çözeltisinin Hazırlanması
1 mg Proteinaz K tartılıp son hacim 1 ml olacak şekilde distile
su içerisinde çözülerek hazırlandı.
3.2.9. 1 mg/ml Ribonükleaz A (RNaz A) Çözeltisinin
Hazırlanması
1 mg RNaz A enzimi tartılıp son hacim 1ml olarak şekilde
distile su içerisinde çözülerek hazırlandı.
3.2.10. 10X Tris Borik Asit EDTA (TBE) Stok Çözeltisinin
Hazırlanması
Öncelikle 54 g Tris bazı, 27.5 g Borik Asit ve 20 ml 0.5 M
EDTA (pH: 8) bir miktar distile suda çözündükten sonra son hacim 500 ml
olacak şekilde üzerine distile su eklendi.
3.2.11.
1X
Tris
Borat
EDTA
(TBE)
Tamponunun
Hazırlanması
100 ml 10X TBE, 900 ml distile su ile 1000 ml’ye
tamamlanarak hazırlandı ve istenilen konsantrasyona seyreltildi.
49
3.2.12. 0.5 M EDTA Çözeltisinin Hazırlanması
29.2 g EDTA, 160 ml distile su içerisinde çözündükten sonra
son hacim distile su ile 200 ml’ye tamamlandı ve pH = 8’e ayarlandı.
3.2.13. Oranj G Jel Yükleme Tamponunun Hazırlanması
55 ml Gliserol, 100 mg Orange G ve 45 ml 1X TBE tamponu
karıştırılarak hazırlandı.
3.2.14. Stok Etidyum Bromür Boyasının Hazırlanması
100 mg etidyum bromür son hacmi 10 ml olacak şekilde
distile suda çözülerek hazırlandı.
3.2.15. Agaroz Jelin Hazırlanması
% 1.5’ luk agaroz jel hazırlamak için, 1.52 g agaroz hassas
terazide tartıldıktan sonra üzerine son hacmi 100 ml olacak şekilde 1X
TBE çözeltisi koyuldu ve mikrodalga fırın kullanılarak kaynatıldı. Agarozun
homojen bir şekilde erimesinden sonra içine 4 μL etidyum bromür eklendi
ve yatay jel elektroforez tankına dökülerek jelin donması sağlandı. Sonra
jelin üzerini örtecek şekilde 1X TBE tamponundan eklendi.
3.2.16. 1X PBS Çözeltisinin Hazırlanması
1.09 g Na2HPO4, 0.32 g NaH2PO4 ve 9 g NaCl2 tartılıp 800
ml distile su içerisinde çözüldükten sonra pH’sı 7.4’e ayarlanıp son hacim
distile su ile 1 litreye tamamlandı.
50
3.2.17. 56 mM Stok Gef Çözeltisinin Hazırlanması
25 mg Gef tartılıp son hacmi 1 ml olacak şekilde saf
dimetilsülfoksit (DMSO) içerisinde çözüldü. Elde edilen stok çözeltisi 1 ve
0.5 ml’lik tüplere dağıtılarak -20 ºC’de saklandı.
3.2.18. 36 mM Stok Kukurbitasin B (CuB) Çözeltisinin
Hazırlanması
20 mg CuB tartılıp son hacmi 1 ml olacak şekilde saf
dimetilsülfoksit (DMSO) içerisinde çözüldü. Elde edilen stok çözeltisi 1 ve
0.5 ml’lik tüplere dağıtılarak -20 ºC’de saklandı.
3.2.19. 0,5 M Tris-HCl Çözeltisi (100 ml, 1,25M) (pH 6.8)
19,7 g Tris-HCl, 90 ml distile su içinde çözdürüldü. Çözelti,
sodyum hidroksit ve hidroklorik asitle pH 6.4’e ayarlandı ve distile su ile
100 ml tamamlanarak otoklavlandı. Çözelti oda ısısında muhafaza edildi.
3.2.20. 1,5 M Tris-HCl Çözeltisi (100 ml, 1,25M) (pH 8.8)
19,7 g Tris-HCl, 90 ml distile su içinde çözdürüldü. Çözelti,
sodyum hidroksit ve hidroklorik asitle pH 8.8’e ayarlandı ve distile su ile
100 ml tamamlanarak otoklavlandı. Çözelti oda ısısında muhafaza edildi.
51
3.2.21. Akrilamid / Bisakrilamid Stok Çözeltisi (100 ml, %30)
29 g akrilamid ve 1 g bisakrilamid distile su ile 100 ml’ye
tamamlanarak çözdürülerek filtreden geçirildi ve +4 °C’de koyu renkli cam
sise içerisinde muhafaza edildi.
3.2.22. Amonyum Persülfat (APS) Stok Çözeltisi (100 ml,
%10)
1 g APS tartılıp 10 ml distile su içinde çözdürüldü ve +4
°C’de muhafaza edildi.
3.2.23. Sodyum Dodesil Sülfat (SDS) Stok Çözeltisi (100 ml,
%10)
100 g SDS distile su ile 1000 ml’ye tamamlanarak
çözdürüldü ve 0,22 mikronluk filtreden geçirilerek sterilize edildi. Çözelti
oda ısısında muhafaza edildi.
3.2.24. 2X Yükleme Tamponu (Laemmli - Sample Buffer) (10
ml)
7 ml 4X Tris-HCI (4X yığınlama jeli çözeltisi), 3,6 ml gliserol,
1g SDS, 1,2 mg bromfenol mavisi distile su ile 10 ml’ye tamamlandı. 5-10
dk kaynatıldı.
52
3.2.25. 2X Protein Yükleme Tamponu İndirgeyici
100 µl tampon içine 4 µl β-merkapto etanol eklendi. 10 g
SDS hafifçe ısıtılan distile su içinde çözüldü.
3.2.26. Tris Baz Stok Çözeltisi (100 ml, 1,5 M)
18,165 g Tris baz distile su ile 90 ml’ye tamamlanarak
çözdürüldü. Çözelti, sodyum hidroksit ve hidroklorik asit kullanılarak pH
6.8’e ayarlandı ve distile su ile 100 ml’ye tamamlandı. Daha sonra çözelti
otoklavlanarak oda ısısında muhafaza edildi.
3.2.27. 10X Jel Yürütme Tamponu (Running Buffer) (1000
ml)
28,8 g Glisin, 6 g Tris baz ve 2 g SDS distile su ile 1000
ml’ye tamamlanarak çözdürüldü. Tampon +4°C’de muhafaza edildi.
3.2.28. 1X Jel Yürütme Tamponu (Running Buffer) (1000 ml)
100 ml 10X Elektroforez Yürütme Tamponu 10 ml %10 SDS
eklendi ve distile su ile 1000 ml’ye tamamlandı. Tampon +4°C’de
muhafaza edildi.
3.2.29. Jelden Membrana Proteinleri Transfer Tamponu
(1000 ml)
6 g Tris baz, 28,8 g Glisin ve 200 ml metanol distile su ile
1000 ml ‘ye tamamlanarak çözdürülerek hazırlandı.
53
3.2.30. Jel Boyama Çözeltisi – Coomassie Parlak Mavisi
(1000 ml)
5 g Coomasie blue R-250 tartılarak 450 ml distile su içinde
çözdürüldü. 450 ml metanol ve 100 ml glasiyal asetik asit ilave edilerek
1000 ml’ye tamamlandı. Çözelti oda ısısında muhafaza edildi.
3.2.31.Ponceau S Çözeltisi (100 ml)
0,5 g Ponceau S, % 0,1 asetik asit içinde çözdürüldü.
3.2.32. Jelden Boya Çıkartıcı Çözelti (1000 ml)
100 ml glasiyel asetik asit, 100 ml metanol, 800 ml distile su
ile 1000 ml’ye tamamlanarak hazırlandı. Her Western blot işleminde yeni
çözelti hazırlandı.
3.2.33. TBS (Tris-tuz) Çözeltisi (500 ml)
2,42 g Tris-HCl ile 9 g sodyum klorür (NaCI) tartılıp 800 ml
distile su içinde çözdürüldü. Çözelti, sodyum hidroksit ve hidroklorik asit
kullanılarak pH 7.4’e ayarlandı ve distile su ile 1000 ml’ye tamamlanarak
hazırlandı.
3.2.34. TBST (Tris-tuz-tween 20) Çözeltisi (300 ml) (pH: 7.4)
1000 ml TBS çözeltisi içine 100 μl Tween 20 eklenerek
hazırlandı. Her Western blot işleminde taze çözelti hazırlandı.
54
3.2.35. Bloklama Çözeltisi (%3 Süttozu içeren TBST) (10 ml)
0,3 g yağsız süt tozu tartılarak 10 ml TBST (% 0.1) çözeltisi
içinde çözdürülerek hazırlandı.
3.2.36. PBS ( Fosfat-tuz tamponu)
1 PBS tableti 100 ml distile su içinde çözdürülerek hazırlandı.
3.2.37. Antikor Çözeltileri
Hazır liyofilize şekildeki antikorlar belirtilen miktarda steril
distile su içinde çözdürüldü, 40 μl %2’lik sodyum azid eklendi ve -20 °C’de
muhafaza edildi.
3.2.38. Sodyum Azid (NaN3)
0.2 g NaN3 10 ml distile su içinde çözüldü.
3.2.39. İmmünolojik Saptama için Kullanılan Çözelti
6 mg diaminobenzidin, sodyum hidroksit ve hidroklorik asit
kullanılarak pH’sı 7.2’ye ayarlanmış olan 10 ml PBS içinde çözdürüldü.
Daha sonra 10 μl %30’luk hidrojen peroksit eklenerek kullanıma hazır hale
getirildi. Her Western blot işleminde yeni çözelti hazırlandı.
55
3.3. Yöntemler
3.3.1. Hücre Kültürü
HT-29 ve HCT-116 hücreleri, %10’luk DMEM besiyerinde
%95 nem ve %5 CO2 içeren ortamda 37 ºC’de kültüre edilerek çoğaltıldı.
3.3.2.
Gef
ve
CuB
Uygulanan
HT-29
ve
HCT-116
hücrelerinde Etkin Dozun MTT Yöntemi ile Belirlenmesi
HT-29 ve HCT-116 hücrelerinde Gef, CuB ve Gef+CuB
uygulamasının hücrelerin canlılığı üzerine olan etkilerinin belirlenmesi için
kolorimetrik MTT yöntemi kullanıldı. Hücreler, %10 FCS içeren DMEM
içerisinde homojen bir şekilde dağıtıldıktan sonra 96 kuyucuklu hücre
kültür kaplarına her kuyucuğa 10.000 hücre / 100 μL olacak şekilde ekildi.
Hücrelerin üzerine son konsantrasyonu 0,1-100 μM aralığında çeşitli
konsantrasyonlarda olacak şekilde %10’luk DMEM içerisinde seyreltilmiş
olan stok Gef ve CuB çözeltilerinden eklendi. DMSO çözücü kontrolü
olarak kullanıldı ve aynı süre için inkübe edildi. Daha sonra hücreler 24 ve
48 saat süreyle 37°C’de %5 CO2’li etüvde inkübe edildi. İnkübasyon süresi
bittikten sonra 10 μl MTT (5 mg/ml) her bir kuyucuğa eklendi ve 4 saat
süre ile inkübe edildi. Bu sürenin sonunda, her bir kuyucuğa 100 μl DMSO
eklendi ve formazan kristalleri çözündükten sonra 570 nm’ de Spectramax
M3 (Molecular Devices, ABD) cihazı ile ölçüldü. Her bir doz için deney 5
tekrarlı yapılarak ortalama absorbans değerleri belirlendi. Elde edilen
ortalama absorbans değerleri, madde uygulaması yapılmayan kontrole
oranlanarak hücre canlılığı üzerine ilaçların etkisi belirlendi.
Sadece
besiyeri
ve
MTT
karışımını
içeren
örnekler
absorbansların belirlenmesinde kör olarak kullanıldı. Hücre canlılığının
56
hesaplanması için örneklerin absorbans değerlerinden kör örneğin
absorbans değeri çıkartıldı. Daha sonra örneklere ait 5 farklı absorbans
değerinin ortalaması alındı. Sadece hücre içeren kontrol örneğinin
ortalama absorbansı %100 canlılığa karşılık gelen değer olarak kabul
edildi ve ilaç uygulanan hücrelerden elde edilen absorbans değerleri,
kontrol hücrelerine göre oranlanarak hücre canlılığı yüzde olarak
belirlendi.
3.3.3. Canlı, Apoptotik ve Nekrotik Hücre Ayrımının Floresan
Mikroskobunda İncelenmesi
Hücre kültürlerinin sonlandırılmasını takiben hücreler 3μL
akridin oranj (100µg/ml) ve 3μL etidyum bromür (100µg/ml) ile boyanarak
floresans mikroskobunda apoptoz açısından değerlendirildi. Akridin oranj
sadece canlı hücrelerin zarından içeri girip bu hücrelerin DNA’sına
bağlandığından canlı hücreler yeşil renkte görülür. Etidyum bromür ise ölü
hücrelerin zarından geçip DNA’ya bağlandığından, nekrotik hücrelerde
kırmızı rengin oluşmasına neden olur. Buna karşın her iki boya da
apoptotik hücre zarından içeri girebildiği için sarı-turuncu renkte ve
karakteristik apoptotik nükleus görünümünün görüntülenmesine olanak
sağlar 225.
Hücre kültürlerinin sonlandırılmasını takiben hücreler 3 μL,
100 μg/ml akridin oranj ve etidyum bromür içeren çözelti ile boyanarak
floresan mikroskobunda canlı, apoptotik ve nekrotik hücre oranlarının
belirlenmesi için değerlendirildi.
57
3.3.4.
Besiyerine
Salınan
Laktat
Dehidrojenaz
(LDH)
Miktarının Ölçülerek Sitotoksik Etkinin Belirlenmesi
Glikoliz sırasında laktatın pirüvata dönüşümünü sağlayan
LDH molekülü tüm hücrelerde bulunan stabil bir enzimdir. Hücre zarının
hasar görmesiyle birlikte hızlı bir şekilde besiyerine salınır. Ölü veya hücre
zarı hasarlı olan hücrelerin miktarındaki artış besiyerindeki LDH
aktivitesinin artması ile sonuçlanmaktadır. LDH aktivitesindeki bu artış da
deney sonunda oluşan renkli formazan kristalinin miktarının artmasına
dolayısı ile elde edilen absorbansın yüksek olmasına neden olmaktadır
226,227
.
1. HT-29 ve HCT-116 hücreleri 96’lık kültür kaplarına her bir
kuyucuğa 10.000 hücre gelecek şekilde ekildi. Bu enzimin besiyerindeki
aktivitesi Cytotoxicity Detection (LDH) kiti kullanılarak aşağıdaki protokole
göre ölçüldü.
2. Gef ve CuB’nin belirlenen dozlarının inkübasyon süreleri
dolduktan sonra kültür ortamından 100 μL besiyeri alınıp 96 kuyulu
mikroplağın her bir kuyucuğuna eklendi.
3. Kuyulara kit içerisinde bulunan 100 μL taze hazırlanmış
reaksiyon karışımı eklendi. Işıktan uzak bir ortamda, oda sıcaklığında 30
dk bekletildi.
4. Mikroplaka okuyucu cihazı ile 490 nm dalga boyundaki
absorbans değerleri okundu.
5. Deney protokolünde kullanılan kontroller:
58
ƒ
Kör kontrol: Besiyeri
ƒ
Düşük kontrol: Besiyeri+Hücre
ƒ
Yüksek kontrol: Triton X-100 solüsyonu+Besiyeri+Hücre
6. Elde edilen absorbans değerlerinden kör kontrolün
absorbansı çıkartıldıktan sonra, ilaçların sitotoksisite değerinin yüzdesi
aşağıdaki formül kullanılarak hesaplandı.
Sitotoksisite (%) = (örnek abs. – düşük kontrol abs. / yüksek
kontrol abs. – düşük kontrol abs.) x 100
3.3.5. Hücre Çoğalmasının Bromodeoksiuridin (Brdu) ile
Belirlenmesi
Bu
yöntem,
bir
primidin
analoğu
olan
5-bromo-2'-
deoksiüridinin (BrdU) DNA sentezi sırasında timin yerine DNA'ya katılması
esasına dayanır. BrdU'nun DNA'ya katılması immunolojik yöntem ile
belirlenir. Böylece DNA sentezi geçiren hücre döngüsünün S fazında olan
hücrelerin oranları belirlenmektedir 226.
HT-29 ve HCT-116 hücreleri Gef ve CuB ile muamele
edildikten sonra ilaçların hücre çoğalması üzerine olan etkisi “Cell
Proliferation ELISA, BrdU” kiti kullanılarak aşağıdaki protokole göre
araştırıldı.
1. HT-29 ve HCT-116 hücreleri 96’lık kültür kaplarına her bir
kuyucuğa 10.000 hücre gelecek şekilde ekildi.
59
2. Bir gece sonra belirtilen dozlarda Gef ve CuB ile muamele
edilerek aynı sürelerde bekletildi. Her bir konsantrasyon için deney üç
tekrarlı yapıldı.
3. İnkübasyon süreleri dolduktan sonra her bir kuyucuğa 10
μL BrdU çözeltisi eklendi. 37 °C’de 2 saat inkübe edildi ve besiyeri
uzaklaştırıldı.
4. 200 μL FixDenat çözeltisi eklendi ve 25 °C’de 30 dk inkübe
edildi.
5. FixDenat çözeltiside uzaklaştırıldıktan sonra her bir
kuyucuğa 100 μL peroksidaz enzimi ile konjuge BrdU antikorunu içeren
anti-BrdU-POD solüsyonu eklendi. 25 °C’de 90 dk inkübe edildi.
6. Antikor uzaklaştırıldıktan sonra her bir kuyucuk 300 μL 1X
PBS ile 3’er defa yıkandı.
7. Substrat olarak kit içerinde bulunan tetrametilbenzidin
(TMB) çözeltisinden 100 μL eklenerek yeterli renk değişimi gözlenene
kadar 25 °C’de 5-30 dk bekletildi.
8. Her bir kuyucuğa 25 μL 1M H2SO4 eklenerek karıştırıldı. 5
dakika içinde mikroplaka okuyucu ile 450 nm dalga boyundaki absorbans
değerleri belirlendi.
60
3.3.6.
DNA
Fragmentasyonunun
ELISA
Yöntemi
ile
Belirlenmesi
Belirtilen kültür sürelerinin dolmasıyla kullanılan ilaçların
neden
olduğu
hücre
ölümünü
ve
hücrelerde
görülen
DNA
fragmentasyonunu belirlemek için Cell Death Detection ELISA PLUS kiti
kullanılarak
ELISA
yöntemiyle
aşağıda
belirtilen
protokole
göre
belirlenmiştir;
1. HT-29 ve HCT-116 hücreleri 96 kuyulu kültür kaplarında
her bir kuyucuğa 10.000 hücre gelecek şekilde ekildi. Hücrelere daha önce
belirtilen miktarda Gef ve CuB verilerek uygun sürelerde inkübe edildi. Her
bir konsantrasyon için deney üç tekrarlı yapıldı.
2. İnkübasyon süreleri dolduktan sonra her kuyuya 200 μL
lizis tamponu eklendi. Oda sıcaklığında 30 dk bekletildi.
3. Mikrosantrifüj tüpüne alınan hücre lizatı oda sıcaklığında,
1000 rpm’de 10 dk santrifüj edildi.
4. Santrifüj sonrası üstte kalan sıvıdan 20 μL alınıp
streptavidin kaplı mikroplakaya aktarıldı.
5. 80 μL anti-histon biyotin ile anti-DNA POD eklendi ve oda
sıcaklığında çalkalayıcı üzerinde 2 saat süreyle inkübe edildi.
6. Örnekler 300 μL yıkama çözeltisi ile oda sıcaklığında 3
defa yıkandı.
61
7. Her bir kuyucuğa kit içerisinde bulunan peroksidaz
substrat
solüsyonundan
ABTS
100
μL
eklendi.
Renk
değişimi
gözleninceye kadar oda sıcaklığında 20 dk inkübe edildi.
8. 100 μL ABTS durdurucu solüsyonu eklendikten sonra
mikroplaka okuyucu cihazı ile 405 nm dalga boyundaki absorbans
değerleri okundu.
3.3.7. DNA Fragmentasyonunun Agaroz Jel Elektroforezi ile
Gösterilmesi
1. Her bir doz için 106 hücre olacak şekilde belirtilen miktarda
Gef ve CuB verilerek uygun sürelerde inkübe edildikten sonra hücreler 10
ml’lik tüplere alınıp santrifüj edildi.
2. Hücreler 1200 rpm’de 10 dk santrifüj edilip üstte kalan sıvı
atıldı. Çökelti üzerine 50 μL fosfat-sitrat tamponu (pH 7.8) eklenerek oda
sıcaklığında 1 saat bekletildi.
3. Karışım 1200 rpm’de 10 dk santrifüj edilerek süpernatan
1.5 ml’lik mikrosantrifüj tüpüne aktarıldı.
4. Süpernatan üzerine 3 μL RNaz A ve 3 μL NP-40
çözeltilerinden eklenerek 37 °C’de 1 saat inkübe edildi.
5. Bu süre sonunda 3 μL Proteinaz K çözeltisi eklenerek
tekrar 37 °C’de 1 saat inkübe edildi. İnkübasyon sonrasında örnekler
elektroforez yöntemi uygulanana kadar +4 °C’de saklandı.
62
3.3.7.1 Agaroz Jel Elektroforezi
Bunun için daha önceden hazırlanmış olan %1.5’luk agoroz
jele DNA örneklerinden 15 μL alınarak, 3 μL Orange G jel yükleme
tamponu karıştırılıp jeldeki kuyulara yüklendi. Aynı zamanda kuyulardan
birine de 100 baz çiftlik (bç) DNA moleküler ağırlık belirteci yüklenerek 90
dk dakika 75 volt sabit akımda yürütüldü. Süre sonunda “Kodak Gel Logic
100” görüntüleme sistemi kullanılarak jelin fotoğrafı çekildi.
3.3.8. Aktif kaspaz-3 miktarının Sandwich ELISA yöntemi ile
Belirlenmesi
1. HT-29 ve HCT-116 hücreleri 6 kuyulu kültür kaplarında her
bir kuyuya 106 hücre gelecek şekilde ekildi. Hücrelere daha önce belirtilen
miktarda Gef ve CuB verilerek uygun sürelerde inkübe edildi. Her bir
konsantrasyon için deney üç tekrarlı yapıldı.
2.
İnkübasyon
sürelerinin
dolmasından
sonra
kültür
ortamından Gef ve CuB içeren besiyeri uzaklaştırıldı ve hücreler soğuk 1X
PBS ile buz üzerinde bir defa yıkandı.
3. PBS uzaklaştırıldıktan sonra 1 mM PMSF içeren 0.5 ml
soğuk 1X lizis tamponu eklendi ve 5 dk buz üzerinde beklendi.
4. Hücreler kültür kabından hücre kazıyıcı ile kazınarak
uzaklaştırıldı ve mikrosantrifüj tüpüne alındı.
5. Hücre lizatı sonikatör cihazı ile 15 sn boyunca ses
dalgaları yardımıyla hücrelerin parçalanması sağlandı, ardından 10 dakika
63
+4 °C’de 15.500 rpm’de santrifüj edilip üstte kalan sıvı yeni bir
mikrosantrifüj tüpüne alındı.
6. Elde edilen hücre lizatlarından 100 μL antikor ile
kaplanmış mikroplaka kuyularına dağıtıldı.
7. Kuyuların üzeri bir bant yardımıyla sıkıca kapatılarak, 37
°C’de 2 saat süreyle bekletildi.
8. Kuyuların içeriği boşaltıldıktan sonra 4’er defa 200 μL 1X
yıkama tamponu ile yıkandı.
9. Her bir kuyucuğa 100 μL primer antikor eklendi.
Kuyucukların üzeri bir bant yardımıyla sıkıca kapatıldı. 37 °C’de 1 saat
süreyle bekletildi.
10. Dört defa 200 μL 1X yıkama tamponu ile yıkandı.
11. Örneklerin üzerine 100 μL yaban turpu peroksidazı
(HRP) bağlanmış ikincil antikor eklendi. Kuyucukların üzeri bir bant
yardımıyla sıkıca kapatıldıktan sonra 37 °C’de 30 dk süreyle inkübe edildi.
12. Örnekler 4 defa 200 μL 1X yıkama tamponu ile yıkandı.
13. Her bir kuyuya 100 μL TMB substratı eklendi.
Kuyucukların üzeri bir bant yardımıyla sıkıca kapatılıp 37 °C’de 10 dk
süreyle inkübe edildi.
64
14. Renksiz olan TMB eklendikten sonra peroksidaz
tepkimesinin belirteci olan mavi renk dönüşümü gerçekleşti.
15. Her bir kuyucuğa 100 μL durdurucu solüsyon eklendi.
Durdurucu solüsyonun eklenmesinden bir süre sonra mavi olan rengin sarı
renge dönüştüğü gözlendi.
16. Sarı renk oluşumu görüldükten sonra mikroplaka
okuyucu ile 450 nm dalga boyundaki absorbans değerleri okundu.
17. İlaç uygulanmamış hücrelerden elde edilen absorbans
değeri bir olarak kabul edilip ilaç uygulanan hücrelerdeki aktif CASP3
miktarı belirlendi.
3.3.9. Hücre Kültüründen Total RNA’nın Elde Edilmesi
Gef
ve
CuB
ile
inkübasyon
sürelerinin
dolmasıyla,
hücrelerden RNA izolasyonu, “High Pure RNA Isolation Kiti” kullanılarak,
aşağıda yazılı olan protokole göre biyogüvenlik kabininin içinde yapıldı.
1. Hücrelerin üzerine 200 μL soğuk PBS ve 400 μL Lizis
tamponu eklenip 15 saniye vortekslendi.
2. Filtre, toplama tüpüne yerleştirilip tüm karışım filtre üstüne
aktarıldı.
3. Tüp 9000 rpm’de 15 saniye santrifüj edildi.
65
4. Toplama tüpünde toplanan sıvı atılıp filtre aynı tüpe tekrar
yerleştirildi.
5. Her bir örnek için 90 μL DNaz inkübasyon tamponu steril
tüpe alındı ve 10μL DNaz I eklendi. Pipetaj ile karıştırıldıktan sonra
karışım filtrenin ortasına bırakıldı. 15 dakika oda sıcaklığında bekletildi.
6. 500 μL’lik 1. yıkama çözeltisi filtre üzerine eklendi ve 9000
rpm’de 15 saniye santrifüj edildi. Filtre altında toplanan kısım atıldıktan
sonra aynı toplama tüpü içerisine yerleştirildi.
7. 500 μL’lik 2. yıkama çözeltisi filtre üzerine eklendi ve 15
saniye 9000 rpm’de santrifüj edildi. Filtre altında toplanan kısım atıldıktan
sonra aynı toplama tüpü içerisine yerleştirildi.
8. 200 μL’lik 3. yıkama çözeltisi filtre üzerine eklendi ve 3 dk
13500 rpm’de santrifüj edildi.
9. Toplama tüpü atıldı. Filtre, steril 1.5 ml’lik mikrosantrifüj
tüpüne yerleştirildi.
10. Filtre üzerine 20 μL örnek seyreltme çözeltisi eklendi ve
9000 rpm’de 1 dk santrifüj edildi.
11. Elde edilen RNA’ların miktarları ve saflığı “NanoDrop ND1000 Spektrofotometre” cihazında ölçülerek RT-PCR’da kullanılana kadar
-80 °C derin dondurucuda saklandı.
66
3.3.10. Komplementer DNA (cDNA) Sentezi (RT-PCR)
Elde edilen RNA’lar spektrofotometrede 260 nm dalga
boyunda ölçülerek mikrolitredeki mikrogram değerleri belirlendi. Primer
olarak random hekzamerler kullanılarak cDNA sentez kiti ile total RNA’dan
cDNA sentezi yapıldı. cDNA sentezi sırasında kullanılan kimyasallar ve
miktarları Tablo 1’de verilmiştir.
Tablo 1: RT-PCR tepkime karışımı
Steril H2O-PCR Grade
Reaksiyon Tamponu
dNTP
Random hekzamer primeri
RNaz inhibitörü
Transkriptor Ters Transkriptaz
Total RNA
Son Konsantrasyon
1x (8mM MgCl2)
1mM
60μM
20 ünite
10 ünite
1μg
Hacim
RNA miktarına göre değişken
4μL
2μL
2μL
0.5μL
0.5μL
1μg olacak şekilde
cDNA için PCR karışımı ince çeperli 0.2 ml’lik tüplere
dağıtıldıktan sonra elde edilen total RNA eklendi.
3.3.10.1 Reverse Transkriptaz PCR (RT-PCR) Programı
Otomatik ısı döngüsü cihazı, Tablo 2’de belirtilen programa
ayarlanarak cDNA sentezi yapıldı.
Tablo 2: Otomatik ısı döngüsü cihazında uygulanan program
Primer Bağlanması
Ters Transkripsiyon
İnaktivasyon
Soğutma
Sıcaklık
25°C
50°C
85°C
4°C
Zaman
10dk
60dk
5dk
-
Döngü sayısı
1
1
1
1
67
Reaksiyon sonucunda elde edilen cDNA örnekleri Real-Time
PCR’da kullanılana kadar -20 °C’lik derin dondurucuda saklandı.
3.3.11. Gen İfadesinin Real-Time PCR ile Belirlenmesi
Bcl-2, Bax, Bak, Bad ve siklin D1 mRNA miktarları, RealTime PCR yöntemi ile Light CyclerTM cihazı kullanılarak belirlendi.
Amplifikasyonlar 20 μL toplam tepkime hacmi içerisinde; cDNA, mRNA’ya
özgü primerler, UPL probu, LightCycler TaqMan Master karışımı ve distile
su kullanılarak gerçekleştirildi. Bcl-2, Bax, Bak, Bad ve siklin D1 ifade
miktarlarını normalize etmek için GAPDH mRNA düzeyi referans olarak
alındı.
3.3.12. Bcl-2 Geninin İfade Düzeyinin Kantitatif Analizi
Bcl-2 genine ait UPL prob ve primerlerin özellikleri ve gen
bölgesindeki yerleşimleri şekil 16’da gösterilmiştir.
Bcl-2 Forward primer: 5’- AGTACCTGAACCGGCACCT -3’
Bcl-2 Reverse primer: 5’- GCCGTACAGTTCCACAAAGG -3’
75 numaralı prob dizisi: 5’- GGAGGCTG -3’
Şekil 16: Bcl-2 mRNA’sının belirlenmesinde kullanılan primerler ve UPL probun
cDNA dizisi üzerindeki yerleşimi (Referans: ENST00000398117 giriş no’lu dizi)
Translasyon başlangıç nükleotidine göre numaralandırılmıştır.
68
3.3.13. Bax Geninin İfade Düzeyinin Kantitatif Analizi
Bax genine ait UPL prob ve primerlerin özellikleri ve gen
bölgesindeki yerleşimleri şekil 17’de gösterilmiştir.
Bax Forward primer: 5’- ATGTTTTCTGACGGCAACTTC -3’
Bax Reverse primer: 5’- ATCAGTTCCGGCACCTTG -3’
57 numaralı prob dizisi: 5’- CTGGGGCC -3’
Şekil 17: Bax mRNA’sının belirlenmesinde kullanılan primerler ve UPL probun
cDNA dizisi üzerindeki yerleşimi (Referans: ENST00000293288 giriş no’lu dizi)
Translasyon başlangıç nükleotidine göre numaralandırılmıştır.
3.3.14. Bak Geninin İfade Düzeyinin Kantitatif Analizi
Bak genine ait UPL prob ve primerlerin özellikleri ve gen
bölgesindeki yerleşimleri şekil 18’de gösterilmiştir.
Bak Forward primer: 5’- AAACTGGGCTCCCACTCA -3’
Bak Reverse primer: 5’- CAGTGGAGGACGGGATCA -3’
66 numaralı prob dizisi: 5’- CAGCAGCC -3’
69
Şekil 18: Bak mRNA’sının belirlenmesinde kullanılan primerler ve UPL probun
cDNA dizisi üzerindeki yerleşimi (Referans: ENST00000374467 giriş no’lu dizi)
Translasyon başlangıç nükleotidine göre numaralandırılmıştır.
3.3.15. Bad Geninin İfade Düzeyinin Kantitatif Analizi
Bad genine ait UPL prob ve primerlerin özellikleri ve gen
bölgesindeki yerleşimleri şekil 19’da gösterilmiştir.
Bad Forward primer: 5’- CAGTCACCAGCAGGAGCA -3’
Bad Reverse primer: 5’- CGACTCCGGATCTCCACA -3’
46 numaralı prob dizisi: 5’- GCAGCCAT -3’
Şekil 19: Bad mRNA’sının belirlenmesinde kullanılan primerler ve UPL probun
cDNA dizisi üzerindeki yerleşimi (Referans: ENST00000309032 giriş no’lu dizi)
Translasyon başlangıç nükleotidine göre numaralandırılmıştır.
3.3.16. Siklin D1 Geninin İfade Düzeyinin Kantitatif Analizi
Siklin D1 genine ait UPL prob ve primerlerin özellikleri ve gen
bölgesindeki yerleşimleri şekil 20’de gösterilmiştir.
70
Siklin D1 Forward primer: 5’- GCCGAGAAGCTGTGCATC -3’
Siklin D1 Reverse primer: 5’- CCACTTGAGCTTGTTCACCA -3’
58 numaralı prob dizisi: 5’- CTCCATCC -3’
Şekil 20: Siklin D1 mRNA’sının belirlenmesinde kullanılan primerler ve UPL probun
cDNA dizisi üzerindeki yerleşimi (Referans: ENST00000227507 giriş no’lu dizi)
Translasyon başlangıç nükleotidine göre numaralandırılmıştır.
3.3.17. GAPDH Geninin İfade Düzeyinin Kantitatif Analizi
GAPDH genine ait UPL prob ve primerlerin özellikleri ve gen
bölgesindeki yerleşimleri şekil 21’de gösterilmiştir.
GAPDH Forward primer: 5’- AGCCACATCGCTCAGACAC -3’
GAPDH Reverse primer: 5’- GCCCAATACGACCAAATCC -3’
60 numaralı prob dizisi: 5’- TGGGGAAG -3’
Şekil 21: GAPDH mRNA’sının belirlenmesinde kullanılan primerler ve UPL probun
cDNA dizisi üzerindeki yerleşimi (Referans: ENST00000229239 giriş no’lu dizi)
Translasyon başlangıç nükleotidine göre numaralandırılmıştır.
71
3.3.17.1 Bcl-2, Bax, Bak, Bad, siklin D1 ve GAPDH Genleri
için Real-Time PCR Tepkime Karışımı
Bcl-2, Bax, Bak, Bad, siklin D1 ve GAPDH genlerine uygun
verilen primer ve problar kullanılarak Real-time PCR tepkimesi LC
cihazında gerçekleştirildi. Tepkime karışımını hazırlamak için kullanılan
bileşenlerin miktarları tablo 3’te verilmiştir.
Tablo 3: Bcl-2, Bax, Bak, Bad, siklin D1 ve GAPDH Real-Time PCR tepkime karışımı
Son Konsantrasyon
Hacim
-
6.2μL
4mM
1.2μL
Primer F (10pmol/μL)
2.5pmol
0.25μL
Primer R (10pmol/μL)
2.5pmol
0.25μL
TaqMan prob (100pmol/μL)
10pmol
0.1μL
1x
1μL
-
1μL
dH2O
MgCI2 (25mM)
TaqMan karışımı (10x)
cDNA
3.3.17.2. Light Cycler (LC) Deney Programı
Real-time PCR karışımları hazırlandıktan sonra kapiller
tüplere dağıtıldı ve üzerine cDNA’lar eklendi. Kapiller tüpler 3000 rpm’de
10 sn santrifüj edildi. Tüpler cihaza yerleştirildikten sonra Tablo 4’te
belirtilen
amplifikasyon
programı
kullanılarak
PCR
tepkimesi
gerçekleştirildi. Bcl-2, Bax, Bak, Bad, siklin D1 ve GAPDH genleri için aynı
program kullanıldı.
72
Tablo 4: Bcl-2, Bax, Bak, Bad, siklin D1 ve GAPDH genlerinin ifade düzeylerinin
belirlenmesi için kullanılan Real Time PCR tepkime programı
Program 1. Ayrılma (Denatürasyon)
Program Verisi
Değer
Döngüler
Analiz Modu
Sıcaklık Hedefleri
1
Kısım 1
Hedef Sıcaklık (°C)
İnkübasyon zamanı (s:dk:sn)
Sıcaklık Geçiş Hızı (°C/sn)
95
10:00dk
20.0
Program 2. Primer Bağlanması ve Uzama (Hibridizasyon ve Polimerizasyon)
Program Verisi
Değer
Döngüler
Analiz Modu
Sıcaklık Hedefleri
50
Çoğalma
Kısım 1
Kısım 2
Hedef Sıcaklık (°C)
İnkübasyon zamanı (s:dk:sn)
Sıcaklık Geçiş Hızı (°C/sn)
95
10sn
20.0
60
20sn
10.0
Program 3. Soğutma
Program Verisi
Değer
Döngüler
Analiz Modu
Sıcaklık Hedefleri
1
Kısım 1
Hedef Sıcaklık (°C)
İnkübasyon zamanı (s:dk:sn)
Sıcaklık Geçiş Hızı (°C/sn)
40
30sn
20.0
Reaksiyon sonucu deney gruplarına ait Bcl-2, Bax, Bak, Bad,
siklin D1 ve GAPDH genlerinin mRNA ifade düzeylerini gösteren Crossing
point (Cp) değerleri belirlendi. Bcl-2, Bax, Bak, Bad ve siklin D1 gen ifade
düzeyleri GAPDH ifade düzeyine göre normalize edildi.
73
3.4. Western Blot Yöntemi
HT-29 ve HCT-116 kolon kanser hücre hatlarına belirlenen
doz ve sürelerde CuB, Gef ve CuB+Gef uygulandıktan sonra bu
hücrelerden protein izole edildi. Bcl-2, Bax, Bak, siklin D1 ve p27kip1
proteinlerinin ifadelerinin varlığı Western Blot (WB) yöntemiyle belirlendi.
housekeeping olarak beta-aktin (ACTB) proteini kullanıldı.
Çalışmamızda tespit edilmek istenilen Bcl-2 proteininin
molekül ağırlığı 29 kiloDalton (kDa), Bax proteininin molekül ağırlığı 20
kDa, Bak proteininin molekül ağırlığı 25 kDa, siklin D1 proteininin molekül
ağırlığı 36 kDa ve p27 proteininin molekül ağırlığı 27 kDa olması nedeniyle
%12’lik poliakrilamid jel kullanılarak SDS-Page jeli hazırlandı 228,229 :
3.4.1. Hücreden Protein İzolasyonu
1. HT-29 ve HCT-116 kolon kanser hücreleri 6 kuyulu kültür
kaplarında her bir kuyuya 106 hücre gelecek şekilde ekildi. Hücrelere daha
önce belirtilen miktarda CuB, Gef ve CuB+Gef verilerek uygun sürelerde
inkübe edildi. Her bir konsantrasyon için deney üç tekrarlı yapıldı.
2.
İnkübasyon
sürelerinin
dolmasından
sonra
kültür
ortamından CuB, Gef ve CuB+Gef içeren besiyeri uzaklaştırıldı ve hücreler
soğuk 1X PBS ile buz üzerinde bir defa yıkandı.
3. PBS uzaklaştırıldıktan sonra 1 mM PMSF içeren 0.5 ml
soğuk 1X lizis tamponu eklendi ve 5 dk buz üzerinde beklendi.
4. Hücreler kültür kabından hücre kazıyıcı ile kazınarak
uzaklaştırıldı ve mikrosantrifüj tüpüne alındı.
74
5. Hücre lizatı sonikatör cihazı ile 15 sn boyunca ses
dalgaları yardımıyla hücreler parçalandı. Daha sonra 10 dakika +4 °C’de
15.500 rpm’de santrifüj edildi ve üstte kalan süpernatan yeni bir
mikrosantrifüj tüpüne alınarak protein miktar tayini yapılana kadar -80
°C’de saklandı.
3.4.2. Protein Miktar Tayini
Elde edilen total protein miktarı BCA Protein Assay kiti
kullanılarak
ölçüldü.
Kit
protokolüne
uygun
olacak
şekilde
konsantrasyonları 25 µg ile 2000 µg arasında değişen 7 adet Bovine
Serum Albumin (BSA) dilüsyonları oluşturuldu. Kit içerisinde bulunan A ve
B çözeltileri 50:1 oranında karıştırılarak elde edilen karışım standart
protein dilüsyonlarına eklendi ve 30 dk 37 ºC’de inkübe edildi. Süre
sonunda standartların konsantrasyonları SpectraMax M3 (Molecular
Devices, ABD) cihazında 562 nm dalga boyunda ölçülerek standart eğri
hazırlandı. Hücreden izole edilen protein örnekleri de benzer şekilde
hazırlandıktan sonra absorbans değerleri ölçülüp oluşturulan standart eğri
yardımıyla protein miktarları belirlendi.
3.4.3. SDS-PAGE Jelin Hazırlanması
Jelin dökülmesi sırasında kullanılacak olan camlar alkol ile
temizlenip iki camın arasına ayıraçlar yerleştirildikten sonra jel kasetine
yerleştirildi. Camlar kasete konulduktan sonra ayırma jeli için 50 ml % 8’lik
akrilamid jel karışımı hazırlandı. Tablo 5 ve 6’da belirtilen miktarlarda
Akrilamid, Tris bazı, SDS bir miktar distile suda çözüldükten sonra karışım
Whatman kağıdından geçirilerek süzüldü ve son hacim 50 ml’ye
tamamlandı. Bu karışım içine jel dökülmeden hemen önce yine tablo 5 ve
6’da belirtilen miktarlarda APS ve TEMED eklendi. Ayırıcı jel karışımı
75
tarağın bir miktar alt kısmında işaretlenen düzeye kadar döküldü. Jel
döküldükten hemen sonra bütanol veya izopropanol ilave edilerek jelin
polimerizasyonu beklendi. Ayırma jeli polimerize olduktan sonra bütanol
veya izopropanol uzaklaştırıldı. Yığınlama jeli (stacking gel) tablo 7’ de
belirlenen oranlarda kimyasalların karıştırılmasıyla hazırlanarak ayırıcı
jelin üzerine döküldü.
Tablo 5: %10’luk SDS-PAGE için ayırma jelinin bileşenleri
%10’luk Ayırma Jeli
%30’luk Akrilamid / Bisakrilamid karışımı
Hacim (mL)
5 mL
1,5 M Tris Bazı (pH 8.8)
3.8 mL
%10 SDS
0.15 mL
%10 APS
0.15 mL
TEMED
0.006 mL
dH2O
5.9 mL
Tablo 6: %12’lik SDS-PAGE için ayırma jelinin bileşenleri
%12’lik Ayırma Jeli
%30’luk Akrilamid / Bisakrilamid karışımı
Hacim (mL)
6 mL
1,5 M Tris Bazı (pH 8.8)
3.8 mL
%10 SDS
0.15 mL
%10 APS
0.15 mL
TEMED
0.006 mL
dH2O
4.9 mL
76
Tablo 7: %5’lik SDS-PAGE için yığınlama jelinin bileşenleri
%5’lik Yığınlama Jeli
Hacim (mL)
%30’luk Akrilamid / Bisakrilamid karışımı
1.005 mL
1,5 M Tris Bazı (pH 6.8)
1.875 mL
%10 SDS
0.075 mL
%10 APS
0.0375 mL
TEMED
0.0075 mL
dH2O
4.6125 mL
3.4.4.
Proteinlerin
SDS-PAGE’e
Yüklenme
Öncesi
Hazırlanması
Daha önceden içerdikleri toplam protein miktarları belirlenmiş
olan örneklerin her birinden 30 µg/ml olacak şekilde protein karışımı alındı
ve protein miktarları distile su, numune ve yükleme tamponu oranları ile
eşitlenen
numuneler
5
dakika
95
ºC’de
kaynatılarak
proteinlerin
denatürasyonu sağlandıktan sonra, SDS-PAGE’e yükleninceye kadar +4
ºC’de bekletildi.
3.4.5. Proteinlerin SDS-PAGE’e Yüklenmesi ve Elektroforez
İşlemi
Jelin polimerleşmesinin ardından jel kaseti dikey elektroforez
tankına yerleştirildi. Hazırlanan 10X yürütme tamponundan 1X yürütme
tamponu hazırlanarak anot-katot boşluklarından jel tankına döküldü ve
tarak dikkatlice çıkartıldı. Oluşan kuyucukların içi enjektör yardımıyla 1X
yürütme tamponu ile iyice yıkanarak kuyucuklardaki akrilamid kalıntıları
temizlendi. Her kuyucuğa 50 μg/ml oranında protein içeren numuneler ve
boyalı peroksidaz işaretli protein moleküler ağırlık belirteci kuyucuklara
yüklenerek elektroforez işlemi başlatıldı. Elektroforez tankı güç kaynağına
77
bağlandı. Jelin yığınlama kısmında 100 V, 300 mA akım uygulanırken,
örnekler ayırma jeline geçtiğinde ise voltaj 150’ye çıkartıldı ve yükleme
boyası jelin alt kısmına gelince işlem sonlandırıldı.
3.4.6. Elektrotransfer İşlemi (Protein Örneklerinin Nitroselüloz
Membrana Aktarılması)
Çalışmamızda proteinlerin jelden nitroselüloz membrana
elektrotransfer işlemi için ıslak transfer yöntemi kullanıldı. Elektroforez
işlemi bittikten sonra camlar ayrılarak jel ortaya çıkartıldı ve jelin protein
bulunmayan yığınlama kısmı kesilip atıldı. Nitroselüloz membran, jel ile
aynı büyüklükte kesilerek sırasıyla ilk olarak 10 sn %100 metanol, 2 dk
distile su ve son olarak 1X transfer tamponu içerisinde 15 dk süreyle
ıslatıldı. Bu sırada jel 1X transfer tamponu içeren kabın içerisine alındı.
Başka bir kabın içine de 4 adet 3 mm kalınlığındaki Whatman kağıtları ve
2 adet sünger ped konularak 1X transfer tamponu içerisinde ıslatıldı.
Transfer kasedinin katot (-) elektrot kısmına bir adet 1X transfer tamponu
içerisinde ıslatılmış olan sünger yerleştirildi, sünger ped’in üstüne 2 adet
Whatman kağıdı konularak üzerine 15 dk transfer tamponunda bekletilmiş
jel yerleştirildi. Jelin üstüne de daha önceden distile su içerisinde ıslatılıp
15 dk 1X transfer tamponunda bekletilen nitroselüloz membran dikkatlice
konulduktan sonra, membran ile jel arasında hava kabarcığı kalmaması
için bir cam tüp ile üzerinden geçildi. Membranın üstüne yine sırayla iki
adet Whatman kağıdı ve bir sünger ped konuldu. Transfer kasetinin anot
(+) ve katot (-)
kısımları plastik “clamp” ile kapatılarak elektroblotting
tankına yerleştirildi ve tank 1X transfer tamponu ile dolduruldu. Transfer
işlemi 250 mA’ de 100 V akımda 1,5 saat süreyle gerçekleştirildi.
Uygulanan akım nedeniyle tamponun ısınmasını engellemek için ve
transfer
işleminin
soğuk
ortamda
gerçekleştirilmesi
elektroblotting işlemi +4 ºC’de gerçekleştirildi
228,229
gerektiği
için,
. Transfer sonunda,
transfer sandviçi tankın içerisinden çıkartılarak açıldı, membran dikkatlice
78
alındı ve proteinlerin elektrotransfer ile jelden nitroselüloz membrana
aktırılıp aktarılmadığı Ponceau S boyası ile boyanarak kontrol edildi. Yine,
SDS-PAGE işleminden sonra jelde protein kalıp kalmadığını kontrol etmek
amacıyla, Coomassie Parlak Mavisi kullanıldı. Jel üzerindeki proteinler
nitroselüloz
membrana
aktarıldıktan
sonra
proteinlerin
immünolojik
saptanması işlemini yapıldı.
3.4.7. Bloklama
Membran yüzeyine antikorun özgül olmayan bağlanma
yapmasını engellemek için StartingBlockTM (TBS) Bloklama tamponu
kullanıldı. Bu tamponu kullanmadan hemen önce % 0.1 oranında Tween20 eklendi. TBS-T tamponu ve % 5’lik yağsız süt tozu içeren kapatma
solüsyonunda bloklama işlemi 1 saat oda ısısında otomatik yatay
çalkalayıcı üzerinde gerçekleştirildi.
3.4.8.
Membran
Üzerindeki
Proteinin
İmmunolojik
Gösterilmesi
Membran, bloklama amaçlı kullanılan tamponun içerisinde
Bcl-2, Bax, Bak, siklin D1 ve p27kip1 için her bir antikor 1:1000 oranında
seyreltilerek +4 ºC’de bir gece otomatik yatay çalkalayıcı üzerinde inkübe
edildi. Süre sonunda membran, TBS-T tamponu içerisinde 3 kez 10’ar dk
otomatik yatay çalkalayıcı üzerinde çalkalanarak yıkandı. Yıkama işlemi
sonunda proteinleri görünür hale getirebilmek için, primer antikorları
tanıyacak olan 1:2000 oranında sulandırılan HRP konjuge anti-rabbit IgG
sekonder antikoru ile oda sıcaklığında 1 saat otomatik yatay çalkalayıcı
üzerinde inkübe edildi. Sekonder antikor döküldükten sonra membran,
tekrar TBS-T tamponu içerisinde 3 kez 10’ar dk otomatik yatay çalkalayıcı
üzerinde çalkalanarak yıkandı ve film çekimine geçildi.
79
3.4.9. Görüntüleme
İnkübasyon
Chemiluminescent
sonunda
Substrate
kiti
Super
kullanılarak
Signal®
WestPico
HRP’nin
substratını
parçalayarak floresan sinyal oluşturması sağlandı. Substratla inkübasyon
için; membran üzerine üretici firma talimatına uygun olarak reaktifleri 1 : 1
oranında karıştırılan Super Signal Chemiluminisans (Super Signal®
WestPico Chemiluminescent Substrate, Pierce, Katalog No: 34080T) ile
kaplandı ve 5 dakika bekletildi. Elde edilen floresan sinyal ile bantların,
Kodak Gel Logic 2200 Carestream görüntüleme sisteminde fotoğrafı
çekilerek protein bantları analiz edildi.
3.5. İstatistiksel Analiz Yöntemleri
Doza ve zamana bağlı olarak değişen, Bcl-2, Bax, Bak, ve
siklin D1 mRNA ifade düzeylerindeki farklılıklar “REST (2009 V2.0.13)”
istatistik programı ile karşılaştırıldı
230
. Hücre canlılığı, apoptoz ve nekrotik
oranlardaki değişimler ise “tek yönlü Anova” testiyle karşılaştırıldı. Veriler
“SPSS 15.0” istatistik programı kullanılarak değerlendirildi. 0.05’den küçük
olan p değerleri istatistiksel açıdan anlamlı olarak kabul edildi.
80
4. BULGULAR
Çalışmamızda, p53 mutant HT-29 ile p53 yabanıl tip HCT116 insan kolon kanseri hücre hatlarında, çeşitli doz ve inkübasyon
sürelerinde CuB’nin tek başına ve Gef ile birlikte uygulanması sonucunda
sitotoksik ve apoptotik etkileri hem morfolojik hem de DNA, mRNA ve
protein düzeylerinde araştırıldı.
4.1.
HT-29 ve HCT-116 Hücrelerinin Gef ve CuB’ye
Duyarlılığının MTT Hücre Canlılığı Yöntemi ile İncelenmesi
CuB ve Gef’nin HT-29 ve HCT-116 hücrelerinin canlılığı
üzerine etkisini belirlemek için öncelikle MTT yöntemi uygulandı. CuB ve
Gef’in ayrı ayrı ve birlikte kullanımlarının hücre canlılığı üzerine etkisinin
belirlenmesinde MTT kullanılarak ilaçların hücre canlılığı üzerine olan
etkisi araştırılmıştır. Buradan elde edilen canlılık oranlarından, kullanılan
ilacın hücre canlılığı üzerine etkisinin belirlenmesi amaçlandı.
HT-29 ve HCT-116 hücrelerinin 24 ve 48 saat Gef ile
muamelesine verdiği cevabı belirlemek için 96 kuyulu hücre kültür
kaplarına 104 hücre/kuyu olacak şekilde hücreler ekildi. Öncelikle HT-29
hücreleri, son konsantrasyon 70 μM olacak şekilde ve HCT-116 hücreleri,
son konsantrasyon 80 μM olacak şekilde Gef ile 24 ve 48 saat süre ile
inkübe edildi. Süre sonunda MTT analizi yapıldı.
81
Grafik 1: HT-29 ve HCT-116 hücrelerinin (10.000 hücre/kuyu) Gef ile 24 ve 48 saat
inkübasyonu sonunda belirlenen hücre canlılık oranları.
Grafik 1’ de 24 ve 48 saat inkübasyon sonucunda hücrelerin
Gef’e olan cevabı hücre canlılık oranları ile gösterilmektedir. Buna göre
HT-29 ve HCT-116 hücrelerinin canlılık oranlarının artan Gef dozuna bağlı
olarak düştüğü belirlendi. HT-29 hücrelerinde kullandığımız en yüksek Gef
konsantrasyonu olan 70 μM’da hücre canlılığının 24 saatte yaklaşık % 33
48 saatte ise yaklaşık %23 olduğu görülmektedir. HCT-116 hücrelerinde
kullandığımız en yüksek Gef konsantrasyonu olan 80 μM’da ise hücre
canlılığının 24 saatte yaklaşık %35, 48 saatte ise yaklaşık %19 olduğu
belirlendi. Sonuçlarımıza göre Gef için IC50 dozunun HT-29 ve HCT-116
hücrelerinde 24 saat inkübasyon sonunda yaklaşık 50 μM olduğu gözlendi.
48 saat inkübasyon sonucunda ise HT-29 hücrelerinde IC50 dozu 40 μM
iken HCT-116 hücrelerinde IC50 dozunun yaklaşık 30 μM olduğu belirlendi.
HT-29 ve HCT-116 hücrelerinin 24 ve 48 saat CuB ile
muamelesine verdiği cevabı belirlemek için yine 96 kuyulu hücre kültür
kaplarına 104 hücre/kuyu olacak şekilde hücreler ekildi. Öncelikle her iki
hücre hattına, son konsantrasyon 100 μM olacak şekilde CuB ile 24 ve 48
saat süre ile inkübe edildi ve süre sonunda MTT analizi yapıldı.
82
Grafik 2: HT-29 ve HCT-116 hücrelerinin (10.000 hücre/kuyu) CuB ile 24 ve 48 saat
inkübasyonu sonunda belirlenen hücre canlılık oranları.
Grafik 2’ de 24 ve 48 saat inkübasyon sonucunda hücrelerin
CuB’e olan cevabı hücre canlılık oranları ile gösterilmektedir. Buna göre
HT-29 ve HCT-116 hücrelerinin canlılık oranlarının artan CuB dozuna
bağlı olarak düştüğü belirlendi. HT-29 hücrelerinin, HCT-116 hücrelerine
göre daha düşük konsantrasyonlardaki CuB dozlarından etkilendiği
gözlendi.
HT-29
hücrelerinde
kullandığımız
en
yüksek
CuB
konsantrasyonu olan 100 μM’da, hücre canlılığının 24 saatte yaklaşık
%31, 48 saatte ise yaklaşık %17 olduğu görülmektedir. Sonuçlarımıza
göre CuB için IC50 dozunun HT-29 hücrelerinde 24 saat inkübasyon
sonunda yaklaşık 10 μM, 48 saat inkübasyon sonunda 5 μM olduğu
gözlendi.
HCT-116
hücrelerinde
kullandığımız
en
yüksek
CuB
konsantrasyonu olan 100 μM’ da, hücre canlılığının 24 saatte yaklaşık
%41, 48 saatte ise %19 olduğu gözlendi. HCT-116 hücrelerinde 24 saat
inkübasyon sonucunda IC50 dozunun yaklaşık 80 μM, 48 saat inkübasyon
sonucunda ise IC50 dozunun yaklaşık 50 μM olduğu belirlendi. Bu
sonuçlara göre CuB’nin HT-29 hücrelerine göre HCT-116 hücrelerinin
canlılığını daha yüksek konsantrasyonlarda etkilediği gözlendi.
83
Kültür ortamındaki HT-29 hücrelerine, 5 μM ve 10 μM
dozlarındaki Gef’e ilave olarak, 0,0125 μM - 20 μM doz aralığında olacak
şekilde CuB eklenerek 24 ve 48 saat sonunda MTT analizi yapıldı. Yine
kültür ortamındaki HCT-116 hücrelerine, 5 μM ve 10 μM dozlarındaki Gef’e
ilave olarak, 0,5 μM - 80 μM doz aralığında olacak şekilde CuB eklenerek
24 ve 48 saat sonunda MTT analizi yapıldı.
Grafik 3: HT-29 ve HCT-116 hücrelerinin (10.000 hücre/kuyu) Gef ve CuB ile birlikte
24 ve 48 saat inkübasyonu sonunda belirlenen hücre canlılık oranları.
Grafik 3’ te 24 ve 48 saat inkübasyon sonucunda hücrelerin
CuB ve Gef birlikteliğine olan cevabı hücre canlılık oranları ile
gösterilmektedir. Buna göre HT-29 ve HCT-116 hücrelerinin canlılık
oranlarının CuB ve Gef‘in birlikte kullanımı sonucu doza bağlı olarak
düştüğü belirlendi. HT-29 hücrelerinde kullandığımız en yüksek Gef + CuB
konsantrasyonu olan 10 μM Gef + 20 μM CuB’de, hücre canlılığının 24 ve
48 saatte yaklaşık % 35 olduğu görülmektedir. HCT-116 hücrelerinde ise
kullandığımız en yüksek Gef + CuB konsantrasyonu olan 10 μM Gef + 80
μM CuB’de hücre canlılığının 24 saat sonunda yaklaşık %34, 48 saat
sonunda ise yaklaşık %18 olarak bulundu. Sonuçlarımıza göre HT-29
hücrelerinde 24 ve 48 saat inkübasyon sonunda IC50 dozunun yaklaşık 10
84
μM Gef + 0,5 μM CuB olduğu belirlendi. HCT-116 hücrelerinde ise 24 saat
inkübasyon sonucunda IC50 dozunun yaklaşık 10 μM Gef + 10 μM CuB
olduğu gözlendi.
4.2.
Canlı, Apoptotik ve Nekrotik Hücre Dağılımının
Floresan Mikroskobunda İncelemesi
CuB ve Gef’in HT-29 ve HCT-116 hücrelerine olan etkilerinin
belirlenmesi amacıyla kullandığımız MTT hücre canlılığı yönteminden elde
edilen bulgular, ajanların uygulanmasını takiben gözlenen canlı hücrelerin
oranını göstermektedir. CuB ve Gef’in, HT-29 ve HCT-116 hücreleri
üzerine olan apoptotik ve nekrotik etkilerinin belirlenmesi amacıyla, CuB
ve Gef’in ayrı ayrı ve birlikte uygulanmasından sonra hücreler, akridin
oranj / etidyum bromür ile boyanıp, floresan ataçmanlı mikroskopta
hücrelerin analizi yapılarak, canlılık, apoptoz ve nekroz açısından
değerlendirildi. Bunun için yaptığımız MTT hücre canlılık deneyi
sonucunda elde edilen hücre canlılık oranları dikkate alınarak, hücrelerin
canlılığının
belirgin
bir
düşüş
gösterdiği belirlendi. Böylece MTT
yönteminden elde edilen hücre canlılık oranlarının doğrulanması sağlandı.
Hücrelerin floresan mikroskobundaki görünümleri Şekil 22 ve 23’te
gösterilmiştir.
85
B
A
Şekil 22: HT-29 hücrelerinde apoptozun morfolojik olarak gösterilmesi. A: Kontrol,
B: 10μMGef+0,05μMCuB. Yeşil renkte görülen hücreler canlı hücreleri (1), kırmızı
renkte
görülen
hücreler
nekrotik hücreleri göstermektedir (3). Apoptozun
aşamasına göre değişik şekillerde boyanmış olan apoptotik hücreler ise 2 numara
ile gösterildi (MB: 400x).
B
A
2
2
3
1
3
1
1
1
2
Şekil 23: HCT-116 hücrelerinde apoptozun morfolojik olarak gösterilmesi. A:
Kontrol, B: 10μMGef+10μMCuB. Yeşil renkte görülen hücreler canlı hücreleri (1),
kırmızı renkte görülen hücreler nekrotik hücreleri göstermektedir (3). Apoptozun
aşamasına göre değişik şekillerde boyanmış olan apoptotik hücreler ise 2 numara
ile gösterildi (MB: 400x).
86
Floresan mikroskobunda yapılan analizlere göre, 24 saat
sonunda HT-29 hücre hattında CuB ve Gef uygulaması sonrasında
hücrelerde doza bağlı olarak apoptozun arttığı, hücre canlılığının ise
azaldığı gözlendi. Kullanılan en yüksek Gef konsantrasyonu olan 50 µM
dozunda apoptotik oranın %26.6, 0,5 µM CuB konsantrasyonunda ise
apoptotik oranın %26,3 olduğu bulundu. Ayrıca 10 μM Gef + 0,5 μM CuB
birlikteliğinde apoptotik oran %32,2 olarak bulundu (Grafik 4).
Grafik 4: HT-29 hücrelerinin (106 hücre/kuyu) Gef, CuB ve bu ajanların birlikteliğinin
24 saat inkübasyonu sonunda belirlenen Canlı / Apoptotik / Nekrotik hücre oranları.
*; p<0.05 (ilaç uygulaması yapılmayan kontrol hücreleri ile ilaç uygulanan
hücrelerde belirlenen apoptotik hücrelerin karşılaştırılması)
24 saat sonunda HCT-116 hücre hattında benzer şekilde
CuB ve Gef uygulaması sonrasında hücrelerde doza bağlı olarak
apoptozun arttığı, hücre canlılığının ise azaldığı gözlendi. Kullanılan en
yüksek Gef konsantrasyonu olan 50 µM Gef dozunda apoptotik oranın
%29.4, 40 µM CuB konsantrasyonunda ise apoptotik oranın %28,1 olduğu
bulundu. Ayrıca 10 μM Gef + 10 μM CuB birlikteliğinde apoptotik oran
%29,7 olarak bulundu. (Grafik 5).
87
Grafik 5: HCT-116 hücrelerinin (106 hücre/kuyu) Gef, CuB ve bu ajanların
birlikteliğinin 24 saat inkübasyonu sonunda belirlenen Canlı / Apoptotik / Nekrotik
hücre oranları. *; p<0.05 (ilaç uygulaması yapılmayan kontrol hücreleri ile ilaç
uygulanan hücrelerde belirlenen apoptotik hücrelerin karşılaştırılması)
Floresan
mikroskobu
deneyimizin
sonuçlarını
dikkate
aldığımızda her bir doz ve süre için elde ettiğimiz hücre canlılık oranlarının
MTT sonuçlarımızla uyumlu olduğu belirlendi.
4.3.
Besiyerine Salınan Laktat Dehidrojenaz (LDH)
Miktarının Ölçülerek Sitotoksik Etkinin Belirlenmesi
HT-29 hücrelerine 24 sat süreyle CuB, Gef ve birlikte
uygulanmaları sonrasında ilaçların hücreler üzerine olan sitotoksik
etkilerini belirlemek için besi yeri ortamına salınan LDH miktarı ölçüldü.
CuB ve Gef’in neden olduğu sitotoksik etkinin yüzdesel değeri, LDH
analizinden elde edilen verilerin kontrol grubu ile karşılaştırılması ile
hesaplandı.
Elde
sitotoksisite
değeri
edilen
yüzde
veriler
olarak
kontrol
grubu
hesaplandı.
ile
karşılaştırılarak
Sonuçlarımıza
göre
konsantrasyona bağlı olarak besiyerine salınan LDH miktarının arttığı
belirlendi. Özellikle HT-29 hücrelerinde, 25 µM Gef ile 0,05 µM CuB
88
uygulamasında 24 saat sonunda sitotoksisite oranlarında istatistiksel
olarak anlamlı bir artış gözlendi (p<0.05). Buna göre MTT hücre canlılığı
testinin sonuçları ve floresan mikroskobunda yapılan hücre sayması
analizleri ile uyumlu olacak şekilde en yüksek sitotoksik değerin 10 µM Gef
+ 0,5 µM CuB konsantrasyonunda olduğu görüldü (Grafik 6).
Grafik 6: HT-29 hücrelerinin Gef, CuB ve bu ajanların birlikteliğinin 24 saat
inkübasyonu sonunda görülen LDH salınımı. *; p<0.05.
HCT-116 hücrelerine 24 saat süreyle CuB, Gef ve birlikte
uygulanmaları sonrasında, özellikle 50 µM Gef ile 10 µM CuB
uygulamasında 24 saat sonunda sitotoksisite oranlarında istatistiksel
olarak anlamlı bir artış gözlendi (p<0.05). MTT hücre canlılığı testinin
sonuçları ve floresan mikroskobunda yapılan hücre sayımı analizleri ile
uyumlu olacak şekilde, sitotoksik etkinin en fazla görüldüğü konsantrasyon
10 µM Gef+10 µM CuB konsantrasyonunda olduğu görüldü (Grafik 7).
89
Grafik 7: HCT-116 hücrelerinin Gef, CuB ve bu ajanların birlikteliğinin 24 saat
inkübasyonu sonunda görülen LDH salınımı. *; p<0.05.
4.4.
Hücre Çoğalmasının Bromodeoksiuridin (BrdU) ile
Belirlenmesi
CuB ve Gef’in ayrı ayrı ve birlikte uygulamasının hücre
çoğalması
(DNA
sentezi)
üzerine
etkisinin
belirlenmesinde
hücre
çoğalması ELISA, BrdU yöntemi kullanıldı. HT-29 hücre hattında 24.
saatte apoptoz açısından en etkili doz olan 10 μM Gef + 0,5 μM CuB
konsantrasyonundaki hücre çoğalması %57 olarak belirlendi (p<0.05)
(Grafik 8).
90
Grafik 8: HT-29 hücrelerine Gef, CuB ve bu ajanların birlikteliğinin 24 saat
inkübasyonu sonunda görülen DNA sentez oranlarındaki değişim. *; p<0.05.
HCT-116 hücre hattında ise 24. saatte apoptoz açısından en
etkili doz olan 10 μM Gef + 40 μM CuB konsantrasyonundaki hücre
çoğalması %53,2 olarak belirlendi (p<0.05) (Grafik 9).
Grafik 9: HCT-116 hücrelerine Gef, CuB ve bu ajanların birlikteliğinin 24 saat
inkübasyonu sonunda görülen DNA sentez oranlarındaki değişim. *; p<0.05.
91
4.5.
DNA
Fragmentasyonunun
ELISA
Yöntemi
ile
Belirlenmesi
CuB ve Gef uygulanmış HT-29 ve HCT-116 hücrelerinde
gözlenen DNA fragmentasyonunun belirlenmesinde, sitoplazmik mono ve
oligo nükleozomların miktarlarının ELISA yöntemi ile saptanmasını temel
alan kit kullanıldı. Buna göre doza bağlı olarak hücrelerde görülen DNA
fragmentasyon miktarının arttığı belirlendi. En yüksek artış HT-29 hücreleri
için 10 μM Gef + 0,5 μM CuB konsantrasyonunda kontrole göre yaklaşık 6
kat artmış olduğu gözlendi (p<0.05). Bu veri bu dozda belirlenen yüksek
apoptoz oranları ile uyumluluk göstermektedir (Grafik 10).
Grafik 10: HT-29 hücrelerine Gef, CuB ve bu ajanların birlikteliğinin 24 saat
inkübasyonu sonunda görülen DNA fragmentasyon oranı. *; p<0.05.
HCT-116
hücrelerinde
ise
fragmentasyon
oranlarının
konsantrasyona bağlı olarak arttığı belirlendi (p<0.05). En yüksek
fragmentasyon oranı 10 µM Gef + 40 µM CuB uygulamasında kontrole
göre yaklaşık 5.3 kat artmış olduğu gözlendi (p<0.05). Bu veri bu dozda
92
belirlenen yüksek apoptoz oranları ile uyumluluk göstermektedir (Grafik
11).
Grafik 11: HCT-116 hücrelerine Gef, CuB ve bu ajanların birlikteliğinin 24 saat
inkübasyonu sonunda görülen DNA fragmentasyon oranları. *; p<0.05.
4.6.
DNA Fragmentasyonunun Agaroz Jel Elektroforezi
ile Gösterilmesi
Agaroz
jel
elektroforezi
ile
DNA
fragmentasyonun
gösterilmesine dayanan yöntemde daha çok yüksek oranda apoptoz
gözlendiği takdirde ve DNA fragmentasyonunun fazla olduğu durumlarda
jelde belirgin düzeyde fragmentasyon görülür. Bu deneyde, CuB ve Gef’in
tek başına ayrı ayrı ve birlikte uygulanması sonucu hücrelerde gözlenen
DNA fragmentasyonu, agaroz jel elektroforezi ile de gösterilerek hücre
ölümü belirleyici ELISA deney sonuçları ile uyumlu olup olmadığı
araştırıldı. Deney sonucunda ajanların tek başına ve birlikte uygulandığı
zaman hem HT-29 hem de HCT-116 hücrelerinde doza bağımlı olarak
93
kontrole göre ilgili dozlarda DNA fragmentasyonunun olduğu gözlendi
(Şekil 24 ve 25).
Şekil 24: HT-29 hücrelerinin Gef, CuB ve bu ilaçların birlikte kullanımı sonunda
görülen DNA fragmentasyonunun %1.5’luk agaroz jeldeki görüntüsü
Şekil 25: HCT-116 hücrelerinin Gef, CuB ve bu ilaçların birlikte kullanımı sonunda
görülen DNA fragmentasyonunun %1.5’luk agaroz jeldeki görüntüsü
94
4.7.
Aktif Kaspaz-3 Düzeyinin Belirlenmesi
HT-29 ve HCT-116 hücreleri 24 saat süre ile farklı
konsantrasyonlarda CuB, Gef ve bu ajanların birlikte uygulanması ile
inkübe edildikten sonra, hücrelerde ilaca verilen apoptotik cevap sırasında
oluşan aktif kaspaz-3 düzeyi ELISA yöntemi kullanılarak belirlendi.
HT-29 hücrelerine Gef tek başına uygulandığı zaman, aktif
kaspaz-3 miktarını kontrole göre 2 katın üstünde arttıran doz 24. saatte 50
μM iken, CuB tek başına uygulandığı zaman, aktif kaspaz-3 miktarını
kontrole göre 2 katın üstünde arttıran doz yine aynı sürede 0,5 μM olduğu
belirlendi. CuB+Gef kombinasyonu uygulandığı zaman, bu artışın 24.
saatte 10 μM Gef + 0,0125 μM CuB konsantrasyonuna düştüğü bulundu.
Sonuç olarak, CuB+Gef kombinasyonu uygulandığında belirlenen aktif
kaspaz-3 miktarlarının, tek başına CuB ve tek başına Gef uygulandığı
duruma göre daha yüksek olduğu gözlendi. Buna göre, HT-29
hücrelerinde, belirlenen aktif kaspaz-3 miktarının doza bağlı olarak artma
eğiliminde olduğu belirlendi (p<0.05) (Grafik 12).
95
Grafik 12: HT-29 hücrelerine Gef, CuB ve bu ajanların birlikteliğinin 24 saat
inkübasyonu sonunda görülen aktif kaspaz-3 oranları. *; p<0.05.
HCT-116 hücrelerine, Gef tek başına uygulandığı zaman,
aktif kaspaz-3 miktarını kontrole göre 2 katın üstünde arttıran doz 24.
saatte 50 μM iken, CuB tek başına uygulandığı zaman, aktif kaspaz-3
miktarını kontrole göre 2 katın üstünde arttıran doz yine aynı sürede 10
μM olduğu belirlendi. CuB+Gef kombinasyonu uygulandığı zaman, bu
artışın 24. saatte 10 μM Gef + 1 μM CuB konsantrasyonuna düştüğü
bulundu. Aynı şekilde HCT-116 hücrelerine CuB+Gef kombinasyonu
uygulandığı zaman belirlenen aktif kaspaz-3 miktarlarının, tek başına CuB
ve tek başına Gef uygulandığı duruma göre yine daha yüksek olduğu
gözlendi. Buna göre, HCT-116 hücrelerinde, bu ajanlar tek başına ve
birlikte uygulandığında belirlenen aktif kaspaz-3 miktarlarının doza bağlı
olarak arttığı belirlendi (p<0.05) (Grafik 13).
Sonuç olarak, her iki hücre hattında da tek başına
uygulamaya göre birlikte kullanımın kaspaz-3 aktivasyonunda daha etkili
olduğu gözlendi (Grafik 12 ve 13).
96
Grafik 13: HCT-116 hücrelerine Gef, CuB ve bu ajanların birlikteliğinin 24 saat
inkübasyonu sonunda görülen aktif kaspaz 3 oranları. *; p<0.05.
4.8.
Gen İfade Düzeylerinin Kantitatif Değerlendirilmesi
Bcl-2, Bax, Bak, Bad ve Siklin D1 genlerinin ifade düzeyinin
kantitatif değerlendirilmesi için Light Cycler cihazı kullanıldı. HT-29 ve
HCT-116 hücre hatlarından elde edilen cDNA’larda Bcl-2, Bax, Bak, Bad,
Siklin D1 ve bu genlerin normalizasyonu için seçilen GAPDH genlerine
özgül primerler ve UPL LNA probları kullanılarak çalışıldı.
Bcl-2 geninin mRNA düzeyinde ifadesini kantitatif olarak
gösteren Real Time PCR tepkimesine ait amplifikasyon eğrisi Şekil 26’da
gösterildi.
Şekil 26: Bcl-2 geninin mRNA düzeyinde ifadesini kantitatif olarak gösteren
amplifikasyon eğrileri. Bcl-2 geninin Real Time PCR tepkimesine ait Cp değerleri
yatay eksende yer almaktadır. Dikey eksende floresan sinyal izlenmektedir.
97
Bax geninin mRNA düzeyinde ifadesini kantitatif olarak
gösteren Real Time PCR tepkimesine ait amplifikasyon eğrisi Şekil 27’de
gösterildi.
Şekil 27: Bax geninin mRNA düzeyinde ifadesini kantitatif olarak gösteren
amplifikasyon eğrileri. Bax geninin Real Time PCR tepkimesine ait Cp değerleri
yatay eksende yer almaktadır. Dikey eksende floresan sinyal izlenmektedir.
Bak geninin mRNA düzeyinde ifadesini kantitatif olarak
gösteren Real Time PCR tepkimesine ait amplifikasyon eğrisi Şekil 28’de
gösterildi.
98
Şekil 28: Bak geninin mRNA düzeyinde ifadesini kantitatif olarak gösteren
amplifikasyon eğrileri. Bak geninin Real Time PCR tepkimesine ait Cp değerleri
yatay eksende yer almaktadır. Dikey eksende floresan sinyal izlenmektedir.
Bad geninin mRNA düzeyinde ifadesini kantitatif olarak
gösteren Real Time PCR tepkimesine ait amplifikasyon eğrisi Şekil 29’da
gösterildi.
99
Şekil 29: Bad geninin mRNA düzeyinde ifadesini kantitatif olarak gösteren
amplifikasyon eğrileri. Bad geninin Real Time PCR tepkimesine ait Cp değerleri
yatay eksende yer almaktadır. Dikey eksende floresan sinyal izlenmektedir.
Siklin D1 geninin mRNA düzeyinde ifadesini kantitatif olarak
gösteren Real Time PCR tepkimesine ait amplifikasyon eğrisi Şekil 30’da
gösterildi.
Şekil 30: Siklin D1 geninin mRNA düzeyinde ifadesini kantitatif olarak gösteren
amplifikasyon eğrileri. SiklinD geninin Real Time PCR tepkimesine ait Cp değerleri
yatay eksende yer almaktadır. Dikey eksende floresan sinyal izlenmektedir.
GAPDH geninin mRNA düzeyinde ifadesini kantitatif olarak
gösteren Real Time PCR tepkimesine ait amplifikasyon eğrisi Şekil 31’de
gösterildi.
100
Şekil 31: GAPDH geninin mRNA düzeyinde ifadesini kantitatif olarak gösteren
amplifikasyon eğrileri. GAPDH geninin Real Time PCR tepkimesine ait Cp değerleri
yatay eksende yer almaktadır. Dikey eksende floresan sinyal izlenmektedir.
Göreceli gen ifadesi sonuçları REST programı kullanılarak
“Pfaffl” matematiksel yöntemi ile hesaplandı. Pfaffl eşitliği aşağıda
belirtilmiştir.
Eşitlikte belirtilen Ct, tepkime sırasında oluşan floresan
sinyalin eşik değeri geçtiği andaki döngü sayısını ifade etmektedir. Ct
değeri tepkimenin başında mevcut olan mRNA (cDNA) miktarı ile ters
orantılıdır. ∆Ct değeri ise kontrol ile örneklerin Ct değerleri arasındaki farkı
göstermektedir. Eşitlikte belirtilen E, PCR etkinliğini, elde edilen R ise ifade
oranını göstermektedir.
101
4.9.
Gen İfade Düzeylerinin Karşılaştırması
4.9.1. CuB ve Gef’in Bcl-2, Bax, Bak, Bad, ve Siklin D1
Genlerinin İfade Düzeylerine Etkisi
HT-29 ve HCT-116 hücrelerine CuB ve Gef ayrı ayrı ve Gef +
CuB kombine uygulanmasından sonra Bcl-2, Bax, Bak, Bad, ve Siklin D1
genlerinin
ifade
düzeylerinin
doza
bağlı
olarak
karşılaştırmalı
değerlendirmeleri yapıldı. Bu genlerin mRNA ifade düzeylerini belirlemek
için kantitatif Real-time PCR yöntemi kullanıldı.
HT-29
hücrelerinde
anti-apoptotik
özellikteki
Bcl-2
ve
proliferasyonda rolü olan Siklin D1 mRNA ifade düzeylerinde 24 saat
sonunda CuB’nin tek başına veya Gef ile birlikte uygulanmasından sonra
anlamlı düzeyde azalma belirlendi (p<0.05). Kullanılan en yüksek doz olan
10 μM Gef + 0.5 μM CuB konsantrasyonunda Bcl-2 mRNA düzeyinin
yaklaşık 2.6 kat azaldığı, Siklin D1 mRNA düzeyinin ise yaklaşık 7 kat
azaldığı gözlendi (p<0.05). Apoptotik özellikte olan Bad, Bax ve Bak
mRNA ifade düzeylerinde kontrole göre artış gözlendi. CuB’nin tek başına
ve Gef ile birlikte uygulanması sonucunda Bad ve Bax mRNA ifade
düzeylerinin istatistiksel olarak anlamlı düzeyde arttığı belirlendi (p<0.05).
Ayrıca tek başına Gef uygulanmasının ardından Bax mRNA düzeyinde de
anlamlı bir artış olduğu gözlendi (p<0.05). Kullanılan en yüksek doz olan
10 μM Gef + 0.5 μM CuB konsantrasyonunda Bad mRNA düzeyinin
yaklaşık 2.6 kat, Bax mRNA ifade düzeyinin ise yaklaşık 4 kat arttığı
gözlendi (p<0.05) (Grafik 14).
102
Grafik 14: HT-29 hücrelerinin doza bağlı olarak Gef, CuB ve bu ajanların birlikte
uygulanması sonrasında Bcl-2, Bad, Bax, Bak ve Siklin D1 mRNA düzeylerindeki
değişiklik. Hedef genin ifade düzeyleri GAPDH mRNA ifade düzeyi temel alınarak
normalize edildi. *; p<0.05.
HCT-116 hücrelerinde anti-apoptotik özellikteki Bcl-2 ve
proliferasyonda rolü olan Siklin D1 mRNA ifade düzeylerinde 24 saat
sonunda CuB’nin tek başına veya Gef ile birlikte uygulanmasından sonra
anlamlı düzeyde azalma belirlendi (p<0.05). Kullanılan en yüksek doz olan
10 μM Gef + 10 μM CuB konsantrasyonunda Bcl-2 mRNA düzeyinin
yaklaşık 3.2 kat, Siklin D1 mRNA düzeyinin ise yaklaşık 6.3 kat azaldığı
gözlendi (p<0.05). Apoptotik özellikte olan Bad, Bax ve Bak mRNA ifade
düzeylerinde yine kontrole göre artış gözlendi. Ancak, CuB ve Gef’in
sadece kombine uygulanması sonucunda Bad mRNA ifade düzeyinde
istatistiksel olarak anlamlı bir artış gözlenirken, Bax ve Bak mRNA ifade
düzeylerinin bu ilaçların hem tek başına hem de birlikte uygulanması
sonucunda istatistiksel olarak anlamlı düzeyde arttığı gözlendi (p<0.05).
Kullanılan
en
yüksek
doz
olan
10
μM
Gef
+
10
μM
CuB
konsantrasyonunda Bad ve Bax mRNA düzeyinin yaklaşık 1.9 kat, Bak
mRNA düzeyinin ise yaklaşık 1.8 kat arttığı belirlendi (p<0.05) (Grafik 15).
103
Grafik 15: HCT-116 hücrelerinin doza bağlı olarak Gef, CuB ve bu ajanların birlikte
uygulanması sonrasında Bcl-2, Bad, Bax, Bak ve Siklin D1 mRNA düzeylerindeki
değişiklik. Hedef genin ifade düzeyleri GAPDH mRNA ifade düzeyi temel alınarak
normalize edildi. *; p<0.05.
4.10. Protein İfade Düzeylerinin Karşılaştırması
4.10.1 Bcl-2, Bax, Bak, p27kip1 ve Siklin D1 proteinlerinin
protein düzeyinde ifade düzeylerinin Belirlenmesi
Western blot yöntemi için Bcl-2 antikoru, Bax antikoru, Bak
antikoru, p27kip1 antikoru ve siklin D1 antikoru olmak üzere 5 farklı
apoptotik
ve
proliferatif
yolakta
yer
alan
proteinlere
ait
antikor
kullanılmıştır. HT-29 ve HCT-116 hücrelerine CuB’in tek başına ve Gef ile
birlikte uygulandığında 24 saat sonunda pro-apoptotik özellikteki Bax ve
Bak protein ifade düzeylerinde artış belirlenirken, anti-apoptotik özellikteki
Bcl-2 protein ifade düzeylerinde azalma gözlendi. Özellikle HT-29
hücrelerinde
Bax
protein
ifade
düzeyindeki
artışın
kontrol
ile
karşılaştırıldığında oldukça belirgin bir düzeyde olduğu gözlendi. CuB’nin
104
tek başına ve Gef ile birlikte uygulamasından sonra proliferasyonda rolü
olan Siklin D1 protein ifadelenme düzeyinde bir azalma gözlendi. p27kip1
protein ifadelenme düzeyinde ise ilaçların birlikte uygulaması sonucunda
her iki hücre hattında da kontrole göre belirgin şekilde bir artış gözlendi
(Şekil 32).
Şekil 32: HT-29 ve HCT-116 hücrelerinde 24 saat süreyle belirli dozlarda Gef, CuB
ve bu ilaçların birlikte kullanılması sonucunda Bcl-2, Bax, Bak, p27kip1 ve Siklin D1
protein düzeylerini gösteren protein bantları
105
5. TARTIŞMA
Tümör
hücrelerinin
gelişimini
önleyen
(anti-neoplastik)
kemoterapötik ajanlar, sitotoksik etkileri ile tümör hücrelerinin büyüme ve
çoğalmalarını baskılayarak apoptoza neden olurken, tümör hücrelerinin
çevresindeki sağlıklı hücrelere verdikleri hasar ile bu hücrelerin de
ölümüne yol açmaktadırlar
191,231
. Sağlıklı hücreler üzerinde en düşük
sitotoksik etkiye sahip olan kemoterapötik ajan arayışı, araştırmaları
bitkilerden elde edilen doğal bitkisel ilaçlara yönlendirmiştir. Alternatif ve
tamamlayıcı tıpta en çok kullanılan ürünler olan bu bitkisel ilaçlar,
yüzyıllardır anti-kanser ajanlar olarak kullanılmaya devam etmektedir
193
191-
. Ayrıca, çoklu ilaçlarla kombinasyon terapisi, toksisiteyi azaltmak ve
sinerjik
etkiyi
uygulanmaktadır
arttırmak
191-193,232
için
kanser
tedavisinde
yaygın
olarak
. Bu amaç doğrultusunda çalışmamızda, anti-
neoplastik etkili ve doğal bitkisel bir ürün olan CuB’nin tek başına ve antineoplastik bir ajan olan Gef ile birlikte kolon kanser hücreleri üzerindeki
apoptotik ve anti-proliferatif etkileri araştırıldı.
Bitkilerde doğal olarak bulunan fitokimyasalların, kanserin
görülme sıklığını azaltarak kanser tedavisinde, özellikle tamamlayıcı
tedavide önemli yeri olduğu yapılan çalışmalarla desteklenmektedir
235
231,233-
. Kukurbitasinler, doğada bol bulunan ve yaygın olarak kullanılan
fitokimyasallardır
193-196
. Kukurbitasin ailesinin bir üyesi olan CuB’nin çeşitli
insan kanser hücre hatlarında ve ksenograft tümör modellerinde apoptotik
ve anti-proliferatif etki göstererek tümör büyümesini inhibe ettiği ve çeşitli
anti-kanser
ajanlarla
gösterilmiştir
203,205,207,209-214,236-241
JAK-STAT
sinyal
etkisini
iletim
arttırabildiği
yapılan
çalışmalarda
. CuB’nin tümör önleyici mekanizması
yolağını
durdurmasının
yanı
sıra,
hücre
döngüsünün bozulması, apoptoz uyarımı, hücre iskeletinin bozulması ve
farklılaşma da dahil olmak üzere çeşitli etkileri içerir
210-212,241
. CuB’nin
büyümeyi önleyici etkisi, JAK/STAT yolağının inhibisyonu ile artan apoptoz
106
ve G2/M faz kontrol noktası ile ilişkilidir
215,216,241,242
. Bu nedenle, CuB
agresif kanser türleri için yeni bir tedavi stratejisi sağlar. Bununla birlikte,
CuB’nin HT-29 ve HCT-116 insan kolon karsinoma hücrelerine karşı etki
mekanizması ile ilgili herhangi bir çalışma halen yapılmamıştır.
Yaptığımız literatür araştırması sonucunda kolon kanseri
olgularının
çoğu adenokarsinoma olduğundan bu konuda yapılan
çalışmalarda daha çok HT-29 ve HCT-116 kolon adenokarsinoma hücre
hatlarının tercih edildiği görülmektedir
243
. HT-29 ve HCT-116 hücreleri
benzer morfolojiye sahip olsalar da, genetik profilleri birbirinden oldukça
farklıdır. HT-29 hücrelerinde p53 geni mutasyona uğramış ve inaktif iken,
HCT-116 hücrelerinde p53 geni mutasyona uğramamış ve aktiftir
244
. Bu
nedenle HCT-116 hücreleri apoptotik uyarılmaya karşı HT-29 hücrelerine
göre daha duyarlıdır. Ayrıca HT-29 hücrelerinde Ras proto-onkogeni
normal ve inaktif iken, HCT-116 hücrelerinde mutant ve aktiftir
245
. Bunun
yanı sıra bu hücrelerin çalışmadaki önemi, kolonik epitelyum yapının pek
çok özelliğini göstermeleridir
246
. Bu amaçla çalışmamızda kolon kanser
modeli olarak HT-29 ve HCT-116 hücrelerinin her ikisi de kullanılmıştır.
Çalışmamızda, HT-29 ve HCT-116 hücrelerine CuB’nin tek
başına ve Gef ile birlikte uygulanması sonucunda, doza ve zamana bağlı
olarak hücre canlılık oranlarında azalmaya neden olduğunu belirledik.
Buna göre tek başına CuB uygulandığında her iki hücre hattında,
hücrelerin yarısını öldürmek için gerekli olan IC50 dozunun zamana bağlı
olarak azaldığı bulundu. Buna göre HT-29 hücrelerinde IC50 dozu 24.
Saatte 10 μM iken, 48. saatte ise 5 μM olduğu belirlenirken, HCT-116
hücrelerinde ise 24. saatteki IC50 dozu yaklaşık 80 μM iken, 48. Saatte
yaklaşık 50 μM olduğu belirlendi (Grafik 2). CuB’nin Gef ile birlikte
uygulandığında hücre canlılık oranlarında daha belirgin bir azalmanın
meydana geldiği gözlendi. Buna göre, HT-29 hücrelerinde 24 saatlik CuB
+ Gef uygulamasında IC50 değerinin 10 μM Gef + 0,5 μM CuB
107
birlikteliğinde, HCT-116 hücrelerinde ise 24 saatlik CuB + Gef uygulaması
için IC50 değerinin 10 μM Gef + 10 μM CuB uygulamasında görüldü (Grafik
3). Bu verilerden yola çıkarak CuB’nin Gef ile birlikte uygulanmasının
hücreleri CuB’e daha duyarlı hale getirdiğini söyleyebiliriz. Sonuçlarımızla
uyumlu olacak şekilde çeşitli kanser hücre hatlarının kullanıldığı
çalışmalarda CuB’in bu hücreleri farklı ajanlara ve klasik kemoterapi
ilaçlarına duyarlı hale getirdiği gösterilmiştir
200,207,212,247-251
. Yapılan çeşitli
in-vitro çalışmalarda da kolon kanser hücreleri üzerine etkili olduğu
gösterilen
CuB,
değerlendirilmiştir
yeni
247,252
anti-kanser
ajan
olarak
klinik
açıdan
. Bu çalışmalardan birinde, Yasuda ve ark. SW480
kolon kanser hücrelerinde CuB’nin uygulandığında, SW480 hücrelerine
20, 40 ve 80 nM dozlarda 24, 48 ve 72 saat süre ile CuB uygulandığında;
20 nM doz için hücre canlılık oranı yaklaşık % 80 civarında iken, 40 ve 80
nM dozları için bu oranın yaklaşık % 65 olduğunu belirtmişlerdir
247
. Bir
diğer çalışmada ise Caco-2 kolon kanser hücrelerinde CuB’nin etkisi
araştırıldığı zaman, 1, 5, 10, 50, 100 ve 150 μM artan dozlarda CuB
uygulandığında 48 saatlik inkübasyonun sonunda canlılık oranının doza
bağlı bir şekilde azaldığı, dolayısı ile apoptotik etkinin doza bağlı olarak
arttığı belirlenmiştir 254. CuB’nin kolon kanser hücreleri üzerine olan etkisini
araştıran çalışmalar bu iki çalışma ile sınırlı olmakla birlikte, literatürde
hepatoma
249,253
252,260
203,248
, lösemi
, osteosarkoma
254
211,239
, lenfoma
, gırtlak
211
207,213,255,256
, glioblastoma
, meme
210
, melanoma
209,236,257-259
ve akciğer
kanseri gibi çeşitli kanser hücre hatları ile yapılan çalışmalar da
mevcuttur. Sonuçlarımız ve yapılan birçok çalışma arasındaki doz ve
zaman farklılıkları, farklı kanser hücre hatlarının kullanılmasından,
başlangıçta kültür kaplarına ekilen hücre sayısının ve deney ortamının
farklı olmasından, çalışmalarda kullanılan HT-29 ve HCT-116 hücre
hatlarının pasaj sayılarının farklılığından ve hücrelerin apoptoza giderken
kullanmış olabileceği yardımcı farklı moleküler mekanizmaların varlığından
ileri gelebilir. Ayrıca bu çalışmalardan elde edilen hücre canlılık oranları ve
apoptotik değerler sadece tek bir analiz yönteminin sonucu olarak
108
verilmiştir. Chen ve ark.
Duangmano ve ark.
ve ark.
248
257
251
, Yasuda ve ark.
247
, Chan ve ark.
sadece akım sitometrisini, Zhang ve ark.
, Lee ve ark. 254, Dakeng ve ark.
259
253
239,261
,
, Zhou
, Duangmano ve ark. 258 ve
Kongtun ve ark. 252 ise sadece MTT analizi sonuçlarının canlılık değerlerini
kullanmışlardır. Elde edilen bu verilerin MTT analizi, LDH analizi, DNA
Fragmentasyon analizi ve hücrelerin florösan mikroskobunda morfolojik
açıdan değerlendirilmesi gibi birbirini doğrulayabilecek nitelikte olan
yöntemlerle desteklenmemesi de bu çalışmalar için bir dezavantaj olabilir.
Bizim çalışmamızda ise, HT-29 ve HCT-116 hücrelerine CuB’nin tek
başına ve Gef ile birlikte uygulanması sonrasında, hücre canlılık oranları
ve hücrelerin apoptoza yöneldiğine dair elde ettiğimiz değerler MTT
analizi, AO/EtBr ile hücrelerin florösan mikroskobunda morfolojik açıdan
değerlendirilmesi, besiyerine salınan LDH miktarının belirlenmesi, kalitatif
ve kantitatif DNA Fragmentasyon analizi, BrdU ELISA yöntemi, aktif
kaspaz-3 ELISA yöntemi ile de doğrulanmıştır.
CuB ile yapılan araştırmalar sadece kanser hücre kültürleri
ile sınırlı kalmayıp, hayvan kanser modellerinde de çeşitli çalışmalar
yapılmıştır. Bu çalışmalarda da CuB’nin tek başına veya diğer anti-kanser
ajanlar ile birlikte kullanımının tümör hücrelerinin sayısını azalttığı
gösterilmiştir
203,207,212-214,238,239,241,250,254
. Hayvan modellerinde CuB tek
başına veya bir başka anti-kanser ajan ile birlikte uygulandığında
melanoma, osteosarkoma, hepatoma, pankreas, larinks tümörlerinin
büyüklüğünü azaltmaktadır
203,212,250,253,254,256,261,262
. Bir molekül tek başına
uygulandığı zaman, kanser hücrelerinin ortadan kaldırılma ihtimali daha
düşük olduğu için, günümüzde kanser tedavisinde birden fazla sayıda ajan
içeren tedavi rejimleri uygulanmaktadır
203,207,212-214,253,254
. Benzer şekilde
farklı fare tümör modellerinde methotrexate, docetaxell, gemsitabin,
AG490, MG132 ve N-acetyl-L-cysteine gibi ajanların CuB’nin de dahil
olduğu çeşitli kukurbitasinlerin daha etkili olmasına neden olduğu
gösterilmiştir
200,203,207,212-214,250,263
. Bu durum kukurbitasinlerin standart
109
kemoterapötikler ile birlikte kullanıldığı zaman hastalığın kontrol altında
tutulmasında daha yararlı olabileceğini göstermektedir. Biz de tez
çalışmamızda bu verilerle benzer şekilde CuB’nin, Gef ile birlikte
uygulandığında HT-29 ve HCT-116 hücreleri üzerine olan etkisinin,
CuB’nin tek başına kullanılmasına oranla arttığını belirledik.
Çalışmamızda HT-29 ve HCT-116 hücrelerine, CuB’in tek
başına ve Gef ile birlikte uygulanması sonrasında belirlenen hücre canlılık
oranlarındaki
azalmanın
altında
yatan
moleküler
mekanizmanın,
apoptozdan mı yoksa nekrozdan mı kaynaklı olduğunu belirlemek için
hücreler öncelikle AO/EtBr ile boyanarak floresan mikroskobunda
incelendi (Şekil 22 ve 23). Buna göre HT-29 ve HCT-116 kolon kanser
hücrelerinin yüksek CuB konsantrasyonlarında ve düşük CuB+Gef
kombinasyonunda apoptoza daha çok yöneldiği belirlendi (Grafik 4 ve 5).
Elde edilen bulgular, apoptoz üzerine en etkili CuB dozunun HT-29
hücreleri için 24. saatte 0,5 µM konsantrasyonunda olduğu, HCT-116
hücreleri için 24. saatte 40 µM konsantrasyonunda olduğu ve her iki hücre
hattında da CuB’nin Gef ile birlikte uygulandığında, aynı doz ve sürede
daha etkin olabileceğini gösterdi. Diğer yandan, CuB, bulgularımızla
paralellik
gösterecek
191,237,252,260,264
şekilde
düşük
sitotoksik
etkiye
sahiptir
. Bu bulguların doğruluğu besi yerine salınan LDH miktarının
belirlenmesi ile test edildi. Hipoksik durumlarından dolayı kanser hücreleri,
enerji
için
anaerobik
glikolize
bağımlıdırlar.
Dolayısıyla
kanser
hücrelerinde, anaerobik glikolizin son basamağı olan laktatın pirüvata
çevrimi için gerekli olan laktat dehidrogenaz enziminin sitoplazmadaki
miktarında artış görülmektedir. Çalışmamızda, HT-29 ve HCT-116
hücreleri için en etkili apoptoz dozları olarak belirlenmiş olan CuB
dozlarının Gef ile birlikte uygulanması sonrasında oluşan sitotoksik etki
LDH düzeyinde kontrole göre anlamlı bir artış ile doğrulandı. LDH testine
göre düşük ilaç konsantrasyonlarında hücrelerde gözlenen ölüm nedeninin
110
nekroz olmadığı, hücre kültür ortamına salınan LDH miktarının az olması
ile meydana geldiği belirlendi (Grafik 6 ve 7).
CuB’nin tek başına ve Gef ile birlikteliğinin hücre çoğalması
üzerine olan etkisi, BrdU ELISA yöntemiyle de belirlendi. Bu yöntemde
hücre kültür ortamına eklenen BrdU DNA sentezi gerçekleşen hücrelerin
DNA’sına katılmaktadır. Daha sonra BrdU’ya özgü olan antikorlar ile
muamele edildiğinde DNA’ya katılmış olan BrdU miktarı replikasyon
geçiren hücrelerin oranını yansıtmaktadır
265,266
. BrdU ELISA deneyinin
sonuçlarına göre, CuB’nin her iki hücrenin çoğalma oranını doza bağlı
olarak azalttığı belirlendi. Buna göre kontrol ile karşılaştırıldığında 24.
saatte DNA sentez oranındaki en yüksek azalmanın HT-29 hücreleri için
%62,7 ile 0,5 μM CuB ve HCT-116 hücreleri için %60 ile 40 μM CuB
dozunda olduğu görüldü. CuB+Gef uygulamasında ise bu oranların daha
da azaldığı belirlendi (HT-29 için; 24 saat CuB+Gef için %56,7; HCT-116
için; 24 saat CuB+Gef için %53,2) (Grafik 8 ve 9). Yapılan çalışmalarda
CuB’nin hücre döngüsünü çeşitli aşamalarda durdurabildiği gösterilmiştir.
Örneğin, Yasuda ve ark. kolon kanser hücre hattı olan SW480 hücrelerine
24 ve 48 saat süre ile 20, 40 ve 80 nM artan konsantrasyonlarda CuB
uygulandığı zaman, kolon kanser hücrelerini hücre döngüsünün G2
fazında durduğu belirlenmiştir
247
. Yine bir başka bir çalışmada ise, SKBR-
3 ve MCF-7 meme kanser hücrelerine 50-100 μM konsantrasyonlarında
CuB, 24 ve 48 saat uygulandıktan, hem 24. hem de 48. saatte G2/M
geçişinin engellendiği gösterilmiştir
259
. Bir başka çalışmada da pankreas
kanser hücre hattı olan PANC-1 hücrelerine 0.1, 0.3 ve 1 μM artan
konsantrasyonlarda CuB uygulandığında hücrelerin G2 fazında biriktiği ve
M aşamasına giren hücre sayısının azaldığı bildirilmiştir
240
. Bu
çalışmalara ek olarak meme, pankreas, hepatoma, deri ve larinks kanser
hücre
hatları
ile
yapılan
çalışmalarda
hücrelere
değişen
konsantrasyonlarda CuB uygulandığı zaman hücre döngüsünü S ve G2/M
fazlarında durdurduğu gösterilmiştir
207,213,257,258,261
. Bu sonuçlarla uyumlu
111
olacak şekilde CuB’nin tek başına ve Gef ile birlikte uygulandığında DNA
sentez fazına giren HT-29 ve HCT-116 hücre sayısının azaldığı
bulunmuştur.
Ancak
çalışmamızda
hücrelerin
fazına
girme
S
kullandığımız
yüzdesini
yöntem
sadece
belirlediğinden dolayı hücre
döngüsünün hangi aşamada durduğunun anlaşılması için akım sitometrisi
kullanılarak hücresel DNA içeriğinin belirlenmesi daha kesin bir bilgiye
ulaşmamızı sağlayabilir.
Programlanmış hücre ölümünde genel olarak kromatin
yoğunlaşarak çekirdek zarının altında birikir, DNA’nın fragmentasyonu,
hücrenin küçülmesi ve tomurcuklanması görülmektedir
128
. Ancak bazı
durumlarda DNA fragmentasyonu olmadan da apoptozun meydana
gelebileceği bildirilmiştir
görülen
apoptotik
267-269
. Bu nedenle floresan mikroskobunda
hücrelerdeki
DNA
fragmentasyonunun
varlığının
araştırılması amacıyla HT-29 ve HCT-116 hücrelerine CuB ve Gef
uygulanan hücrelerde oluşan DNA fragmentasyonunun varlığı hem hücre
ölümü belirleyici ELISA yöntemi ile kantitatif olarak (Grafik 10 ve 11), hem
de hücrelerden elde edilen genomik DNA’nın agaroz jelde yürütülmesi ile
kalitatif olarak (Şekil 24 ve 25) araştırıldı. Buna göre CuB’in tek başına ve
Gef ile birlikte uygulandığında DNA fragmentasyonuna neden olduğu ve iki
ilacın kombinasyonunun daha fazla DNA parçaları oluşturduğu belirlendi.
Çalışmamızla benzer şekilde uygulanan farklı anti-kanser ajanların HT-29
ve HCT-116 hücrelerinde de DNA fragmentasyonunun gerçekleştiği
gösterilmiştir 270-275.
Apoptoza uğrayan hücrelerde DNA fragmentasyonunun
gerçekleşebilmesi için kaspaz-3 enziminin aktifleşerek bir endonükleaz
olan CAD molekülünü aktif hale getirmesi gerekmektedir. Aktifleşen bu
endonükleaz ise nükleozomlar arasından DNA’yı parçalara ayırarak
fragmentasyona neden olmaktadır
276,277
. CuB ve Gef uygulanan HT-29 ve
HCT-116 hücrelerinde gördüğümüz DNA fragmentasyonunun ve apoptotik
112
olayların yıkım fazının başlatıcısı konumunda olan kaspaz-3’ün aktivitesini
araştırmak amacıyla, hücrelerdeki aktif kaspaz-3 miktarı ELISA yöntemi ile
araştırıldı. Bunun sonucunda CuB’nin, Gef’in ve kombine grupların her iki
hücre hattına uygulanması sonucunda, ilaç uygulanmamış kontrol
hücrelerine oranla doza bağımlı olarak aktif kaspaz-3 enzim düzeyinde
artış olduğu belirlendi (Grafik 12 ve 13). İçsel ve dışsal apoptotik
yolaklarda kaspazlar arasında hücre ölümünün doğrulanmasında en
önemli role sahip olan kaspaz-3 aktivitesinde gözlemlenen protein
düzeyindeki bu artış, HT-29 ve HCT-116 hücrelerinin apoptoza giderken
p53’ten bağımsız bir yolak izlediğini ve hücre ölümünün kaspaz kaskadını
kullanarak apoptozdan kaynaklandığını gösterdi. Kukurbitasinlerin kanser
hücre hatları üzerindeki etkilerini araştıran çalışmalara bakıldığında, hücre
tipine özgü apoptotik cevap gözlenmektedir. Örneğin Boykin ve ark.’larının
yaptıkları bir çalışmada kukurbitasin IIa’nın hepatoma, akciğer ve prostat
kanser hücrelerinde (H22, NCI-H1299, PC-3, CWR22Rv-1) kaspaz-3
aktivasyonuna neden olarak apoptoza yol açtığı bildirilmiştir
278
. Yine
yapılan başka bir çalışmada, kukurbitasinlerin bir türevi olan 23,24Dihydrocucurbitacin B (DHCB)’e maruz bırakılan Bcap37 meme kanser
hücrelerinde gerçekleşen apoptotik cevapta kaspaz 3 aktivasyonu olduğu
bildirilmiştir 279.
Çalışmamız, diğer kanser hücre hatları üzerine CuB’nin
apoptotik sürece olan etkilerini gösteren çalışmalar 200,203,212,213,250,253,261,262
ile paralellik göstermektedir. Ayrıca, CuB’nin diğer anti-kanser ajanlar ile
birlikte kullanımı sonucunda, CuB’nin tek başına kullanıldığında göstermiş
olduğu apoptotik etkiden daha fazla artış meydana geldiği yapılan çeşitli
çalışmalar ile de gösterilmiştir
200,203,212,213,250,253
. Bu sonuçlar, CuB’nin
diğer kemoterapötik ajanlarla beraber kullanılmasının en etkili doz ve
süreye ulaşmada, tek başına kullanılmasına göre çok daha yararlı
olabileceğini göstermiştir. HT-29 ve HCT-116 hücre hatları üzerine
apoptotik etkileri belirlenen birçok fitokimyasal bulunmaktadır
231,275,280-284
.
113
Ancak, şimdiye kadar HT-29 veya HCT-116 hücrelerine CuB’nin
uygulanmasına ilişkin literatürde hiçbir çalışmaya rastlanılmamıştır.
HT-29
ve
HCT-116
hücrelerinde
gözlenen
apoptozun
moleküler mekanizmalarını ortaya çıkartmak için CuB, Gef ve kombine
olarak uygulanan ve uygulanmayan her iki hücrede de apoptoz ile ilişkili
olduğu bilinen Bcl-2, Bax, Bak ve Bad genlerinin ve hücre döngüsünün
G1/S fazının kontrol noktasında görev alan siklin D1 geninin ifade
düzeyleri kantitatif Real Time PCR yöntemi ile araştırılırken, Bcl-2, Bax ve
Bak proteinlerinin ve siklin D1 ve hücre döngüsü inhibitörlerinden biri olan
p27kip1 proteinlerinin ifade düzeyleri Western Blot yöntemi ile araştırıldı.
Hücreler apoptotik bir uyarı ile karşılaştıkları zaman içsel ve dışsal
apoptotik yolaktan biri aktive olur
116-119
. İçsel yolakta görevli olan Bcl-2
protein ailesi, apoptozun düzenlenmesinde önemli bir role sahiptir. Bcl-2,
Bcl-xL, Mcl-l gibi anti-apoptotik proteinler apoptozu inhibe eder iken, Bax,
Bak, Bad gibi pro-apoptotik proteinler apoptozu uyarmaktadırlar
116-118
. Bu
bilgiler ışığında anti-apoptotik protein Bcl-2 ve pro-apoptotik proteinler
Bax, Bak ve Bad mRNA’larının düzeylerini belirlemeye yönelik yaptığımız
deneylerin sonuçlarına göre; HT-29 hücrelerine CuB’in tek başına ve Gef
ile birlikte uygulanmasını takiben Bcl-2 mRNA düzeyinde görülen azalma
ile ve Bax ve Bad mRNA düzeylerinde görülen artışın istatistiksel açıdan
anlamlı olduğu bulundu (p<0.05). Ancak Bak mRNA miktarında görülen
artışın ise istatistiksel açıdan anlamlı olmadığı belirlendi (p>0.05) (Grafik
14). HCT-116 hücrelerinde ise; Bcl-2 mRNA düzeyinde görülen azalmanın
ve Bax, Bak ve Bad mRNA düzeylerinde görülen artışın istatistiksel açıdan
anlamlı olduğu belirlendi (p<0.05) (Grafik 15). Anti-apoptotik protein Bcl-2
ve pro-apoptotik proteinler Bax ve Bak proteinlerinin ifade düzeylerini
belirlemeye yönelik yaptığımız Western Blot deneylerinin sonuçlarına göre
ise; her iki hücre hattına CuB’nin tek başına ve Gef ile birlikte
uygulanmasını takiben Bcl-2 protein ifade düzeyinde azalma görülürken,
Bax ve Bak protein ifade düzeylerinde artış belirlendi (Şekil 32). CuB’nin,
114
HT-29 ve HCT-116 hücrelerinde Bcl-2, Bax, Bak ve Bad genlerinin mRNA
ve protein ifade düzeylerine olan etkisi ile ilgili herhangi bir çalışmaya
literatürde rastlamamakla birlikte, Thoennissen ve ark.
PL45, ve Panc-1 pankreatik kanser hücrelerinde,
PANC-1
pankreas
kanseri
hücrelerinde
karsinoma hücrelerinde, Liu ve ark.
hücrelerinde
yapmış
oldukları
ve
212
Zhang ve ark.
HepG2
207,213,255,256
MiaPaCa-2,
240
hepatoselüler
Hep-2 larinks kanser
çalışmalarla,
CuB’nin
uygulaması
sonrasında doza bağımlı olarak Bcl-2 ve Bcl-xL protein düzeylerinde
belirgin bir azalma olduğunu belirtmişlerdir. Buna karşın SW480 kolon
kanser hücrelerinde yapılan bir çalışmada, CuB’nin etkisi ile gerçekleşen
apoptoz moleküler seviyede incelendiğinde 20-80 nM CuB uygulanan
kolon kanser hücrelerinde 24 ve 48 saat sonra Bcl-2 ve Bcl-xL protein
düzeylerinde belirgin bir değişiklik gözlenmedi
sıra Shi ve ark.
213
247
. Bu çalışmaların yanı
SU-DHL-1 ve Karpas 299 anaplastik büyük hücre
lenfoma (ALCL) hücrelerinde, Su ve ark.
hücrelerinde ve Tseng ve ark.
285
263
A172 ve U251 glioblastoma
ATC-CD133+ anaplastik tiroid kanser
hücrelerinde yapmış oldukları çalışmalarla, kukurbitasin I uygulaması
sonrasında doza bağımlı olarak Bcl-2 ve Bcl-xL mRNA ve protein
miktarlarında
belirgin
bir
azalma
olduğunu
belirtmişlerdir.
Ayrıca,
kukurbitasin D ve E türevlerinin Bcl-2, Bcl-xL ve Mcl-1 protein düzeylerine
olan etkisine ilişkin başka çalışmalar da bulunmaktadır
286,287
. Bulgularımız
bu çalışmalar ile paralellik göstermektedir. mRNA ve protein ifadelenme
düzeyinde bulduğumuz bu sonuçlar, CuB’nin tek başına ve Gef ile birlikte
uygulamasından sonra görülen apoptotik etkide Bcl-2 protein ailesi
üyelerinin anahtar rol oynadığını göstermektedir. Buradan yola çıkarak
HT-29 ve HCT-116 hücrelerinde görülen apoptotik cevapta içsel apoptotik
yolağın aktive olduğunu söyleyebiliriz.
Siklinler, hücre döngüsünün çeşitli fazlarını aktive eden
spesifik proteinlerdir. D-tipi siklinlerden Siklin D1, CDK4 ve CDK6’ya
bağlanarak onları aktive eder ve G1 fazının S fazına ilerleyişinden
115
sorumludur
156,288
. Cip/Kip ailesi üyesi olan p27Kip1 CDKI, siklin-CDK
164
kompleksine bağlanarak kinaz aktivitesini engeller
. Bu bilgilere
dayanarak, çalışmamızda HT-29 ve HCT-116 hücrelerine CuB’nin tek
başına ve Gef ile birlikte uygulanmasını takiben siklin D1 mRNA
düzeyinde görülen azalmanın istatistiksel açıdan anlamlı olduğu bulundu
(p<0.05) (Grafik 14 ve 15). Yine her iki hücre hattına CuB’nin tek başına
ve Gef ile birlikte uygulanmasını takiben Siklin D1 protein ifade düzeyinde
belirgin bir azalma görülürken, p27kip1 protein ifadelenme düzeyinde her
iki hücre hattında da kontrole göre bir artış belirlendi (Şekil 32). CuB’nin,
HT-29 ve HCT-116 hücrelerinde siklin D1 ve p27kip1 genlerinin mRNA ve
protein
düzeylerine
olan
etkisi
ile
ilgili
bir
çalışmaya
literatürde
rastlamamakla birlikte, farklı hücre hatları ile yapılan diğer çalışmalar ile
sonuçlarımız paralellik gösterdi. Dakeng ve ark.
259
, SKBR-3 and MCF-7
meme kanser hücrelerine, Duangmano ve ark.
257
, MDA-MB-231,
MCF7:5C, SKBR-3 meme kanser hücrelerinde, Zhang ve ark.
pankreas kanseri hücrelerinde ve Li ve ark.
287
240
, PANC-1
, HL-60 akut miyeloblastik
lösemi hücrelerinde CuB uygulaması sonrasında siklin D1 protein
düzeyinde azalma, p21 ve p27kip1 protein düzeylerinde anlamlı bir artış
belirlemişlerdir.
Bulgularımız
CuB'nin
tek
başına
ve
Gef
ile
birlikte
uygulanmasının in vitro olarak anti-kanserojenik etki gösterdiğini ortaya
çıkarmıştır. Bu durum HT-29 ve HCT-116 kolon kanser hücrelerinde
büyümenin baskılanması ve apoptozun uyarılması ile gösterilmiştir. CuB
ve Gef’in kombine bir şekilde kullanılması ise sinerjistik bir etki göstermiş
olup, CuB’nin tek başına gösterdiği apoptotik orandan daha yüksek bir
değer elde edilmiştir.
Sonuç olarak çalışmamız, HT-29 ve HCT-116 insan kolon
kanseri hücre hatlarında CuB'nin tek başına ve Gef ile birlikte uygulanması
sonucu apoptozu uyarıcı ve proliferasyonu baskılayıcı özelliğini gösteren
116
ilk çalışmadır. Ayrıca, Bcl-2, Bax, Bak, Bad, siklin D1 ve p27kip1 mRNA ve
protein düzeyleri ile ilgili elde ettiğimiz bulgular ve p53 mutant HT-29 ve
p53 yabanıl tip HCT-116 hücrelerinin kullanılmış olması, CuB’nin apoptotik
süreçte p53’den bağımsız olarak içsel apoptotik yolağı uyardığını
göstermektedir. Çalışmamız, CuB’nin, Gef gibi kanser tedavisinde
kullanılan
anti-neoplastik
ajanlarla
birlikte
uygulanmasının,
kanser
hücrelerinin apoptoza yönelmesinde gerekli olan etkin doz ve süreyi
azaltabileceği doğrulanmıştır.
117
6. SONUÇ
Bu tez çalışmasında CuB’nin tek başına ve Gef ile birlikte
doza ve zamana bağımlı olarak kullanımları sonucunda kolon kanser
hücre hatları olan HT-29 ve HCT-116 hücreleri üzerine olan etkilerini
araştırdık.
İlaç
uygulaması
sonunda
24.
saatte
hücre
kültürleri
sonlandırılarak hücrelerin canlılık, nekroz ve apoptotik oranları uygun
yöntemler
kullanılarak
belirlendi.
Ayrıca,
CuB
ve
Gef’in
DNA
fragmentasyonu, DNA sentezi ve kaspaz aktivasyonuna olan etkileri
araştırıldı. Buna ek olarak araştırmamızda, ilaçların HT-29 ve HCT-116
hücrelerinde apoptoz ve hücre proliferasyonu ile ilişkili olan genlerin ve
proteinlerin ifadesi üzerine etkisi Real-time PCR ve Western Blot
yöntemleri kullanılarak araştırıldı.
HT-29 ve HCT-116 hücrelerinde Gef ve CuB’nin ayrı ayrı
uygulandıkları zaman hücre çoğalmasını engelleyerek hücreleri apoptoza
yönlendirdikleri belirlendi. Ancak Gef ve CuB’nin birlikte uygulanması
sonrasında apoptoz oranı, DNA sentez oranı, kaspaz-3 aktivasyon miktarı,
DNA fragmentasyon miktarı ve apoptotik ve proliferatif genlerin ve
proteinlerin ifadelerindeki değişiklikler daha fazla artış gösterdi. Ayrıca
yaptığımız bu tez çalışması sonucunda ilaç uygulanan hücrelerde içsel
yolakta görev alan ve anti-apoptotik bir gen olan Bcl-2 mRNA miktarının
azalışının ve proapoptotik genler olan Bax, Bak, Bad mRNA miktarlarının
artışının
istatiksel
açıdan
anlamlı
olması
(p<0.05),
yine
hücre
proliferasyonunda görevli bir gen olan Siklin D1 mRNA düzeyinde anlamlı
azalmanın görülmüş olması (p<0.05) ise hücrelerde içsel apoptotik yolağın
aktifleştini ve hücresel proliferasyonu baskıladığını ortaya çıkardı. Bu
durum hücrelerde Bcl-2, Siklin D1 protein düzeylerinin azaldığının, buna
karşılık Bax, Bak ve p27kip1 protein düzeylerinin arttığının bulunmasıyla
doğrulandı.
118
Fizyolojik bir süreç olan apoptoz, inflamasyona neden
olmadığından ve çevre dokulara zarar vermediğinden kanser tedavisinde
tercih edilen bir yöntemdir. Çalışmamız, HT-29 ve HCT-116 hücrelerinde
CuB’nin Gef etkisi ile 24 saatte düşük doz konsantrasyonlarda hücre
ölümünün tetiklenebildiğini ve hücre proliferasyonunun baskılanabildiğini
göstermektedir. Sonuç olarak, yapılacak in vitro ve in vivo çalışmalar ile
CuB’nin, Gef gibi anti-neoplastik ajanlar ile düşük dozlu birliktelikleri
sonucunda HT-29, HCT-116 ve diğer kolon kanser hücre hatları üzerine
olan potansiyel kanser önleyici etkisinin belirlenmesi, daha etkin tedavi
seçeneklerinin geliştirilmesine olanak sağlayacağı gibi, bu molekülün
uyardığı ya da baskıladığı sinyal yolaklarının tanımlanması, bu yolaklara
özgül olabilecek yeni moleküllerin tasarlanmasına ve kolon kanseri
tedavisinde
daha
başarılı
yaklaşımların
ortaya
çıkmasına
olanak
sağlayacaktır.
119
7. ÖZET
Kolon Kanser Hücre Hatlarında Reseptör Tirozin Kinaz
Ve JAK-STAT İnhibitörlerinin Apoptotik Ve Anti-Proliferatif Etkilerinin
Araştırılması
Kolon kanseri, dünyada kadın ve erkeklerde ölüme neden
olan en yaygın 4. kanser tipidir. Epidermal Büyüme Faktörü Reseptörü
(EGFR), kolorektal kanser olgularında sıklıkla ifade edilmekte olan bir
tirozin kinaz (TK) reseptörüdür. Gefitinib (Gef), EGFR’nün hücre içi TK
bölgesinin ATP bağlanma yerine bağlanan, oral olarak aktif TK
inhibitörüdür. JAK-STAT gibi EGFR ile ilişkili sinyal yolakları kanser
gelişiminde önemli bir rol oynar. Triterpenoid bir bileşik olan Kukurbitasin B
(CuB), güçlü anti-tümör aktivitesi ile JAK-STAT sinyal yolağının seçici ve
kuvvetli bir inhibitörüdür. Bu çalışmada, CuB’nin tek başına ve Gef ile
birlikte kullanımının HT-29 ve HCT-116 kolon kanser hücre hatları üzerine
olan apoptotik ve anti-proliferatif etkilerini araştırmayı amaçladık.
Çalışmamızda, p53 mutant HT-29 ve p53 yabanıl tip HCT116 insan kolon adenokarsinom hücre hatlarında, çeşitli doz ve
inkübasyon sürelerinde, CuB’nin tek başına ve Gef ile birlikte uygulanması
sonrasında,
MTT
yöntemi,
AO/EtBr
boyaması
ve
BrdU
ELISA
yöntemleriyle hücre canlılığı belirlendi. Apoptotik oran LDH, DNA
Fragmentasyon ve Kaspaz-3 ELISA yöntemleri kullanılarak değerlendirildi.
Apoptotik ve proliferatif sinyal iletim yolaklarında görev alan Bcl-2, Bax,
Bak, Bad, siklin D1 ve p27kip1 genlerinin mRNA ve protein ifade
düzeylerinin belirlenmesi için kantitatif Real-Time PCR ve Western Blot
yöntemleri kullanıldı.
120
Sonuçlarımız CuB’nin tek başına ve Gef ile birlikte
kullanılmasının doza bağlı olarak her iki hücre hattında apoptotik cevaba
neden olduğunu gösterdi. Aynı zamanda, CuB’nin apoptotik etkisinin Gef
varlığında daha da arttığını belirledik. Bu bulgular, kontrol grubu ile
karşılaştırıldığında, apoptotik ve anti-proliferatif genlerin ve proteinlerin,
sırasıyla mRNA ve protein ifade düzeylerindeki uygun değişimlerin olması
ile doğrulandı. Elde ettiğimiz veriler, CuB’nin kolon kanser tedavisinde
potansiyel
anti-neoplastik
ajan
olarak
yararlı
olabileceğini
düşündürmektedir. Sonuç olarak çalışmamız, JAK/STAT yolağı hedefli
kanser
tedavisinde,
CuB’nin
kemoterapötik
ajanlarla
birlikte
kullanılmasının, uygun apoptotik ve anti-proliferatif etkiye düşük doz ve
sürede ulaştırabilmesine bağlı olarak, klinik açıdan yararlı olabileceğine
dikkat çekmektedir. Buna ek olarak, kukurbitasinlerin moleküler etkilerinin
tam olarak belirlenmesi kolon kanser tedavisi için yeni moleküler
hedeflerin tanımlanmasına olanak sağlayacaktır.
Anahtar kelimeler: Kukurbitasin B, Gefitinib, HCT-166 hücre
hattı, HT-29 hücre hattı, Real-time PCR, Western Blot
121
8. SUMMARY
Investigation of the Apoptotic and Anti-Proliferative
Effects Of Receptor Tyrosine Kinase and JAK/STAT Pathway
Inhibitors in Colon Cancer Cell Lines
Colon cancer is the fourth most common cause of cancer
death in men and women in the world. The Epithelial Growth Factor
Receptor (EGFR) is a tyrosine kinase (TK) receptor that is frequently
overexpressed in colorectal cancer. Gefitinib (Gef) is an orally active
inhibitor of TK that targets the ATP binding site of the intracellular TK
domain of EGFR. The EGFR-associated signaling pathways, such as
JAK-STAT, play an important role in cancer development. Cucurbitacin B
(CuB) is a triterpenoid compound, which is a potent and selective inhibitor
of JAK-STAT signaling pathway with potent antitumor activity. In this
study, we aimed to investigate the apoptotic and anti-proliferative effects
of CuB as a single agent and in combination with Gef on HT-29 ve HCT116 colon cancer cell lines.
In our study, cell viability was identified in the p53 mutant HT29 and p53 wild type HCT-116 human colon adenocancer cell lines by
MTT assay method and AO/EtBr staining and BrdU ELISA methods, for
different dosages and incubation times, following CuB alone and in
combination with Gef treatments. Apoptotic ratio was assessed using
LDH, DNA Fragmentation and Caspase-3 ELISA methods. Quantitative
Real-Time PCR and Western Blot methods were used for analysis of
mRNA and protein expression levels of Bcl-2, Bax, Bak, Bad, cyclin D and
p27kip1 genes which take part in apoptotic and proliferative signal
pathways.
122
Our results showed that treatment with CuB alone and in
combination with Gef resulted in an apoptotic response in a dose
dependent manner in both cell lines. We also found that the apoptotic
effects of CuB increased in the presence of Gef. These results were also
confirmed with appropriate changes in the mRNA and protein expression
levels of apoptotic and anti-proliferative genes and proteins, in comparison
to the control group. Our data suggest that CuB could be useful as a
potential anti-neoplastic agent in the management of colon cancer. In
conclusion, our study draws attention to the possible clinical effectiveness
of use of CuB with chemotherapeutic agents with the opportunity of
attaining convenient apoptotic and anti-proliferative effect with reduced
dose and time in cancer treatment targeting JAK/STAT pathway. In
addition to this, determination of the exact molecular effects of
cucurbitacins would allow us to identify new molecular targets for the
treatment of the colon cancer.
Key Words: Cucurbitacin B, Gefitinib, HCT-116 cell line, HT29 cell line, Real-time PCR, Western Blot
123
9. KAYNAKLAR
1. Alberts B, Johnson A, Lewis J, Raff M, Roberts K, Walter P.
Molecular biology of the cell. 4th ed. New York: Garland Science;
2002.
2. Weinberg RA. The Biology of Cancer. 1st ed. New York: Garland
Science; 2007.
3. Croce CM. Oncogenes and cancer. N Engl J Med 2008; 385: 503511.
4. Doğu GG, Çıtıl R, Dikilitaş M, Özkan M, Er Ö, Öztürk A, Altınbaş M.
Kemoterapi alan hastaların sosyodemografik ve tanısal özellikleri.
Erciyes Tıp Dergisi 2007; 29(2): 132-138.
5. Vogelstein B, Kinzler KW. The Genetics Basis of Human Cancer.
2nd ed. New York: The McGraw-Hill Companies Inc; 2002.
6. Merlo LM, Pepper JW, Reid BJ, et al. Cancer as an evolutionary
and ecological process. Nat Rev Cancer 2006; 6: 924-935.
7. Jemal A, Siegel R, Ward E, Hao Y. Cancer Statistics. CA Cancer J
Clin. 2008; 58(2): 71-96.
8. Jemal A, Siegel R, Ward E, Hao Y, Xu J, Thun MJ. Cancer
statistics. CA Cancer J Clin 2009; 59: 225-249.
9. Ries LA, Wingo PA, Miller DS, Howe HL, Weir HK, Rosenberg HM,
et al., The annual report to the nation on the status of cancer, 19731997, with a special section on colorectal cancer. Cancer 2000;
88(10): 2398-424.
124
10. Alemdaroglu, K., Akçal, T., Bugra, D, editörler. Kolonun anatomisi.
Kolon Rektum ve Anal Bölge Hastalıkları. İstanbul: Türk Kolon ve
Rektum Cerrahisi Derneği; 2003.
11. Buğra D. Kolon, Rektum, Anal Bölge Anatomisi. Kolorektal Özel
Sayısı. Türkiye Klinikleri Journal of Surgery 2004; 9(1): 1-9.
12. Sayek İ, editör. Kolorektal Karsinomlar. Temel Cerrahi Cilt I.
Ankara: Günes Kitapevi Ltd. Sti; 1991.
13. [internette]. [11 Ocak 2012 tarihinde okundu]. elektronik adresi:
http://www.furkan.com.tr/4-sindirim.html
14. Yılmazlar T, Öztürk E. Kolon Kanseri. Kolon & Rektal Cerrahinin El
Kitabı. Corman ML, Allison SI, Kuehne JP, editörler. Alabaz Ö,
çeviri editörü. Adana: Nobel Tıp Kitapevleri; 2004. sayfa 423–474.
15. Itzkowitz SH, Kim YS. Colonic polyps and polyposis syndromes. In:
Feldman M, Scharschmidt B.F, Sleisenger M.H, editors. Sleisenger
and Fordtran’s Gastrointestinal and Liver Disease. 7th ed. W.B.
Saunders Company pres; 2003. p.1865-1942.
16. [internette]. [12 Nisan 2012 tarihinde okundu]. elektronik adresi:
http://www.meb.unibonn.de/cancer.gov/Media/CDR0000415500.jpg
17. Ahmed
FE.
Effect
of
environmental/chemopreventive
diet,
life
factors
style,
on
and
other
colorectal
cancer
development, and assessment of the risks. J Environ Sci Health C
Environ Carcinog Ecotoxicol Rev. 2004; 22(2): 91–147.
18. Terzıc J, Grıvennġkov S, Karın E, Karın M. Inflammation and Colon
Cancer. Gastroenterology 2010; 138: 2101–2114.
125
19. Erturk T, Kaygusuz A, Dagtekin T, Dinçel U, Kınacı E, Çalıskan YK.
Bir Olgu Nedeniyle Kolonda Senkron Tumor Tanısında Güçlükler.
İstanbul Tıp Dergisi 2004; 4: 45-48.
20. Skibber JM, Minsky BD, Hoff PM. Cancer of the colon. In: DeVita
VT, Hellman S, Rosenberg SA. editors. Cancer Principles &
Practice
of
Oncology.
6th
Ed.
Philadelphia:
Lippincott
Williams&Williams; 2001. p. 1216-1271.
21. Edwards BK, Howe HL, Ries LA, Thun MJ, Rosenberg HM, Yancik
R, et al. Annual report to the nation on the status of cancer, 19731999, featuring implications of age and aging on U.S. cancer
burden. Cancer 2002; 94(10): 2766-92.
22. Ay ME, Terzioglu O, Terzi C, Ay Öİ. Kolorektal Kanserlerde, p21,
p27,
p57
Siklin
Bagımlı
Kinaz
İnhibitör
Geni
(cdkı)
Ekspresyonlarının Degerlendirilmesi. Akademik Gastroenteroloji
Dergisi 2006; 5 (1): 20-25.
23. Oskay S. P53-/- ve P53 +/+ HCT116 Kolon Kanser Hücre
Serilerinde Radyasyonun Hücre Proliferasyonu ve Telomeraz
Aktivitesi
Üzerine
Etkisi.
Yüksek
Lisans.
Ankara:
Ankara
Üniversitesi; 2008.
24. [internette]. [12 Nisan 2012 tarihinde okundu]. elektronik adresi:
http://www.kolonrektum.com/kolon-rektum-polipleri,
http://www.kolonkanser.com/
25. Sağkan RI. Bazı Sitokinlerin İnsan Kolon Kanseri Hücrelerinde
CAIX İfade Düzeylerine Etkilerinin Belirlenmesi. Doktora. Balıkesir:
Balıkesir Üniversitesi; 2009.
26. Korkmaz F. Isırgan Otu (Urtica Dioica) Ekstresinin Kolon Kanseri
Hücre Serileri Üzerindeki Apoptotik, Antiproliferatif ve Antioksidan
126
Etkilerinin
Araştırılması.
Yüksek
Lisans.
Ankara:
Ankara
Üniversitesi; 2010.
27. Çiftlikçi
A.
Kolorektal
Kanserlerde
Tümör
Belirleyicilerinin
İncelenmesi. Yüksek Lisans. Malatya: İnönü Üniversitesi; 2002.
28. Deveci KD, Yüce H, Etem H, Doğru O, Özercan İ. Kolorektal
kanserlerdeki Kromozomal Değişikliklerin Tespiti. F.Ü. Sağlık 2004;
18: 175-180.
29. Levin B, Raijman I. Malignant tumors of the colon and rectum. In:
Haubrich
WS,
Schaffner
F,
Berk
JE,
editors.
Bockus
Gastroenterology Volume II. 5th ed. Philadelphia, Pennsylvania:
W.B. Saunders company; 1995: p. 1744-1772.
30. Doğan AL, Güç D. Sinyal iletimi mekanizmaları ve kanser.
Hacettepe Tıp Dergisi 2004; 35: 34-42.
31. McCormick F. Signalling networks that cause cancer. Trends in Cell
Biol. 1999; 9(12): M53-M56.
32. American Cancer Society. Colorectal Cancer Staging. CA Cancer J
Clin 2005; 54: 362-365.
33. Pawson T, Raina M, Nash P. Interaction domains: From simple
binding events to complex cellular behavior. FEBS Letters 2002;
513: 2-10.
34. Pawson T. Regulation and targets of receptor tyrosine kinases. Eur
J Cancer 2002; 38(5): 3-10.
35. Fisher DA, Lakshmanan J. Metabolism and effects of epidermal
growth factor and related growth factors in mammals. Endoc. Rev.
1990; 11(3): 418-422.
127
36. Das M. “Epidermal growth factor: mechanism of action”, Int. Rev.
Cytol., 1982; 78: 233-236.
37. Blume-Jensen P, Hunter T. Oncogenic kinase signaling. Nature
2001; 411: 355-64.
38. Bağdatoğşu ÖT. Saydam G. Gastrointestinal Kanserli Hastalarda G
protein β3 geni (GNB3) C 825T Polimorfizminin Değerlendirilmesi.
Doktora. Mersin: Mersin Üniversitesi; 2008.
39. Jones RJ, Brunton VG, Frame MC. Adhesion-linked kinase in
cancer; emphasis on Src, focal adhesion kinase and PI 3-kinase.
Eur J Cancer 2000; 36: 1595-606.
40. Frame MC. Src in cancer: Deregulation and consequences for cell
behavior. Biochim Biophys Acta 2002; 1602:114-30.
41. Kim JA. Targeted therapies for the treatment of cancer. Am J Surg
2003; 186: 264-8.
42. Hirsch FR, Scagliotti GV, Langer CJ, et al. Epidermal growth factor
family of receptors in preneoplasia and lung cancer: Perspectives
for targeted therapies. Lung Cancer 2003; 41: 29-42.
43. Cohen S. Isolation of a mouse submaxillary gland protein
accelerating incisor eruption and eyelid opening in the new-born
animal. J Biol Chem 1962; 237: 1555-1562.
44. Cohen S, Carpenter G, King L Jr. Epidermal growth factor-receptorprotein
kinase
interactions.
Co-purification
of
receptor
and
epidermal growth factor-enhanced phosphorylation activity. J Biol
Chem 1980; 255: 4834-4842.
128
45. O’Keefe EJ, Pledger WJ. A Model of Cell Cycle Control: Sequential
Events Regulated By Growth Factors. Mol Cell Endocrinol 1983;
31(2-3): 167-186.
46. Downward J, Yarden Y, Mayes E, et al. Close smilarity of epidermal
growth factor receptor and v-erbB oncogene protein sequences.
Nature 1984; 307: 521-527.
47. Layfield LJ, Bernard PS, Goldstein NS. Color multiplex polymerase
chain reaction for quantitative analyis of epidermal growth factor
receptor genes in colorectal adenocarcinoma. J Surg Oncol 2003;
83: 227-231.
48. Herbest RS. Review of epidermal growth factor receptor biology. Int
J Radiation Oncology Biol Phys 2004; 59: 21-26.
49. Burgess AW. EGFR family: structure physiology signalling and
therapeutic targets. Growth Factors. 2008; 26(5): 263-74.
50. Ferguson KM. Structure-based view of epidermal growth factor
receptor regulation. Annu Rev Biophys. 2008; 37: 353-73.
51. Turgut A. Kolorektal karsinomalarda EGFR Ekspresyonunun
prognostik önemi. Tıpta Uzmanlık. Ankara: Gülhane Askeri Tıp
Akademisi; 2007.
52. Aaronson SA. Growth factors and cancer. Science 1991; 254:
1146–1153.
53. Venook AP. Epidermal growth factor receptor-targeted treatment for
advanced colorectal carcinoma. Cancer 2005; 103: 2435–46.
54. Scaltriti M, Baselga J. The epidermal growth factor receptor
pathway: a model for targeted therapy. Clin Cancer Res 2006;
12(18): 5268 – 5272.
129
55. Yano S, Kondo K, Yamaguchi M, et al. Distribution and function of
EGFR in human tissue and the effect of EGFR tyrosine kinase
inhibition. Anticancer Res 2003; 23: 3639–50.
56. Mendelsohn J, Baselga J. Status of epidermal growth factor
receptor antagonists in the biology and treatment of cancer. J Clin
Oncol 2003; 21: 2787-99.
57. Yarden Y, Sliwkowski MX. Untangling the ErbB signalling network.
Nat Rev Mol Cell Biol 2001; 2: 127-137.
58. Das M. Epidermal growth factor: mechanism of action. Int Rev Cytol
1982; 78: 233-236.
59. Salomon DS, Brandt R, Ciardiello F, Normanno N. Epidermal
growth factor-related peptides and their receptors in human
malignancies. Crit Rev Oncol Hematol 1995; 19(3): 183-232.
60. Johnson LN. Protein kinase inhibitors: contributions from structure
to clinical compounds. Q Rev Biophys 2009; 42(1): 1-40.
61. Pinkas-Kramarski R, Soussan L, Waterman H, et al. Diversification
of Neu differentiation factor and epidermal growth factor signaling
by combinatorial receptor interactions. EMBO J 1996; 15(10):
2452–67.
62. Karunagaran D, Tzahar E, Beerli RR, et al. ErbB2 is a common
auxiliary subunit of NDF and EGF receptors: implications for breast
cancer. Embo J 1996; 15: 254-264.
63. Perry Je, Grossmann ME, Tindall DJ. Epidermal growth factor
induces cyclin D1 in a human prostate cancer cell line. Prostate
1998; 35: 117-124.
130
64. Sheng H, Shao J, Townsend CM Jr, et al. Phosphatydilinositol 3kinase mediates proliferative signals in intestinal epithelial cells. Gut
2003; 52: 1472-1478.
65. Casanova ML, Larcher F, Casanova B, et al. A critical role for rasmediated,
epidermal
growth
factor
receptor-dependent
angiogenesis in mouse skin carcinogenesis. Cancer Res 2002; 62:
3402-3407.
66. Suzuki S, Dobashi Y, Sakurai H, Nishikawa K, Hanawa M, Ooi A.
Protein overexpression and gene amplification of epidermal growth
factor receptor in nonsmall cell lung carcinomas. Cancer 2005; 103:
1265-1273.
67. McKay JA, Murray LJ, Curan S, Ross VG, Clark C, Murray GI, et al.
Evaluation of the epidermal growth factor receptor (EGFR) in
colorectal tumors and lymph node metastases. European Journal of
Cancer 2002; 38: 2258-2264.
68. Waxman ES, Herbst RS. The role of the epidermal growth factor
receptor in the treatment of colorectal carcinoma. Semin Oncol
Nurs 2002; 18: 20-29.
69. Roberts RB, Min L, Washington MK, et al. Importance of epidermal
growth factor receptor signaling in establishment of adenomas and
maintenance of carcinomas during intestinal tumorigenesis. Proc
Natl Acad Sci U S A 2002; 99(3): 1521–6.
70. Brunton VG, Ozanne BW, Paraskeva C, et al. A role for epidermal
growth factor receptor, c-Src and focal adhesion kinase in an in
vitro model for the progression of colon cancer. Oncogene 1997;
14(3): 283-93.
131
71. Levitzki A. Tyrosine kinases as targets for cancer therapy.
European Journal of Cancer 2002; 38(5): 11–18.
72. Madhusudan S, Ganesan TS. Tyrosine kinase inhibitors in cancer
therapy. Clin Biochem 2004; 37: 618-635.
73. Carter P. Improving the efficacy of antibody-based cancer
therapies. Nat Rev Cancer 2001; 1: 118 –129.
74. Harris M. Monoclonal antibodies as therapeutic agents for cancer.
Lancet Oncol 2004; 5: 292–302.
75. Trikha M, Yan L, Nakada MT. Monoclonal antibodies as
therapeutics in oncology. Curr Opin Biotechnol 2002; 13: 609–614.
76. Burton DR, Woof JM. Human antibody effector function. Adv
Immunol 1992; 51: 1– 84.
77. Rowinsky EK. Signal events: Cell signal transduction and its
inhibition in cancer. Oncologist. 2003; 8(3): 5-17.
78. Krause DS, Van Etten RA. Tyrosine kinases as targets for cancer
therapy. N Engl J Med 2005; 353: 172–87.
79. Hartmann JT, Haap M, Kopp HG, Lipp HP. Tyrosine kinase
inhibitors - a review on pharmacology, metabolism and side effects.
Curr Drug Metab 2009; 10: 470–81.
80. Pawson T. Regulation and targets of receptor tyrosine kinases. Eur
J Cancer 2002; 38(5): 3-10.
81. Bhise SB, Nalawade AD, Wadhawa H. Role of protein tyrosine
kinase inhibitors in cancer therapeutics. Indian J Biochem Biophys
2004; 41: 273-280.
132
82. Levitzki A, Mishani E. Tyrphostins and other tyrosine kinase
inhibitors. Annu Rev Biochem 2006; 75: 93–109.
83. Zhang J, Yang PL, Gray NS. Targeting cancer with small molecule
kinase inhibitors. Nat Rev Cancer 2009; 9: 28–39.
84. Kisseleva T, Bhattacharya S, Braunstein J, Schindler CW. Signaling
through the JAK/STAT pathway, recent advances and future
challenges. Gene 2002; 285: 1-24.
85. Hebenstreit D, Horejs-Hoeck J, Duschl A. JAK/STAT-dependent
gene regulation by cytokines. Drug News Perspect 2005; 18: 243249.
86. Darnell JE Jr. Studies of IFN-induced transcriptional activation
uncover the Jak-STAT pathway. J Interferon Cytokine Res 1998;
18: 549-54.
87. Remy I, Wilson IA, Michnick SW. Erythropoietin receptor activation
by a ligand induced conformation change. Science 1999; 283: 990–
993.
88. Clevenger CV. Roles and regulation of STAT family transcription
factors in Human breast cancer. Am J Pathol 2004; 165: 14491460.
89.
Sadowski HB, Shuai K, Darnell JE Jr, Gilman MZ. A common
nuclear signal transduction pathway activated by growth factor and
cytokine receptors. Science 1993; 261: 1739-44.
90.
Sandberg EM, Wallace TA, Godeny MD, VonDerLinden D, Sayeski
PP. Jak2 tyrosine kinase: a true jak of all trades? Cell Biochem
Biophys 2004; 41: 207– 232.
133
91.
Schindler CW. JAK-STAT signaling in human disease. J Clin Invest
2002; 109(9): 1133-7.
92.
Chen W, Daines MO, Khurana Hershey GK. Turning off signal
transducer and activator of transcription (STAT): The negative
regulation of STAT signaling. J Allergy Clin Immunol 2004; 114(3):
476-89.
93.
Wilks AF. Two putative protein-tyrosine kinases identified by
application of the polymerase chain reaction. PNAS 1989; 86: 160316077.
94.
[internette]. [14 Ekim 2011 tarihinde okundu]. elektronik adresi:
Janus
Roman
God
of
Begginings;
www.novareinna.com/festive/janus.html
95.
Wilks AF, Harpur AG, Kurban RR, Ralph SJ, Zurcher G, Ziemiecki
A. Two novel protein-tyrosine kinases, each with a second
phosphotransferase-related catalytic domain, define a new class of
protein kinase. Mol Cell Biol 1991; 11(4): 2057–65.
96.
Bowman T, Garcia R, Turkson J, et al. STATs in oncogenesis.
Oncogene 2000; 19: 2474-88.
97.
Benekli M, Baer MR, Baumann H, Wetzler M. Signal Transducer
and activator of transcription proteins in leukemias. Blood 2003;
101: 2940-54.
98.
Leonard WJ. Cytokines and immunodeficiency diseases. Nat Rev
Immunol 2001; 1(3): 200-8.
99.
Quesnelle KM, Boehm AL, Grandis JR. STAT-Mediated EGFR
Signaling in Cancer. Journal of Cellular Biochemistry. 2007; 102:
311–319.
134
100. Bromberg J. STAT proteins and oncogenesis. J Clin Invest
2002;109: 1139–1142.
101. Becker S, Groner B, Müller CW. Three-dimensional structure of the
STAT3-homodimer bound to DNA. Nature 1998; 394: 145–151.
102. Chen X, Vinkemeier U, Zhao Y, Jeruzalmi D, Darnell JE Jr, Kuriyan
J. Crystal structure of a tyrosine phosphorylated STAT-1 dimer
bound to DNA. Cell 1998; 93: 827–839.
103. Xi S, Zhang Q, Dyer KF, Lerner EC, Smithgall TE, Gooding WE, et
al. Src kinases mediate STAT growth pathways in squamous cell
carcinoma of the head and neck. J Biol Chem 2003; 278: 31574-83.
104. Krebs DL, Hilton DJ. SOCS proteins: negative regulators of
cytokine signaling. Stem Cells 2001; 19: 378-387.
105. Shuai K. Regulation of cytokine signaling pathways by PIAS
proteins" Cell Research 2006; 16: 196-202.
106. Benekli M, Xia Z, Donohue KA, Ford LA, Pixley LA, Baer MR, et al.
Constitutive
activity
of
signal
transducer
and
activator
of
transcription 3 protein in acute myeloid leukemia blasts is
associated with short disease-free survival. Blood 2002; 99: 252-7.
107. Mitchell TJ, John S. Signal transducer and activator of transcription
(STAT) signalling and T-cell lymphomas. Immunology 2005; 114:
301-12.
108. Hodge DR, Xiao W, Wang LH, Li D, Farrar WL. Activating mutations
in STAT-3 and STAT-5 differentially affect cellular proliferation and
apoptotic resistance in multiple myeloma cells. Cancer Biol Ther
2004; 3: 188-94.
135
109. Messina JL, Yu H, Riker AI, Munster PN, Jove RL, Daud AI.
Activated STAT-3 in melanoma. Cancer Control. 2008; 15: 196-201.
110. Sánchez-Ceja SG, Reyes-Maldonado E, Vázquez-Manríquez ME,
López-Luna JJ, Belmont A, Gutiérrez-Castellanos S. Differential
expression of STAT-5 and Bcl-xL, and high expression of Neu and
STAT-3 in non-small-cell lung carcinoma. Lung Cancer 2006; 54:
163-8.
111. Barton BE, Karras JG, Murphy TF, Barton A, Huang HF. Signal
transducer and activator of transcription 3 (STAT-3) activation in
prostate cancer: Direct STAT-3 inhibition induces apoptosis in
prostate cancer lines. Mol Cancer Ther 2004; 3: 11-20.
112. Choi JH, Ahn MJ, Park CK, Han HX, Kwon SJ, Lee YY, Kim IS.
Phospho-STAT-3 expression and correlation with VEGF, p53, and
Bcl-2 in gastric carcinoma using tissue microarray. APMIS 2006;
114: 619-25.
113. Lassmann S, Schuster I, Walch A, Göbel H, Jütting U, Makowiec F,
et al. STAT-3 mRNA and protein expression in colorectal cancer:
effects on STAT-3-inducible targets linked to cell survival and
proliferation. Clin Pathol 2007; 60: 173-9.
114. Puthier D, Thabard W, Rapp M, Etrillard M, Harousseau J, Bataille
R, Amiot M. Interferon alpha extends the survival of human
myeloma cells through an upregulation of the Mcl-1 antiapoptotic
molecule. Br J Haematol 2001; 112: 358-63.
115. Yang J, Chatterjee-Kishore M, Staugaitis SM, Nguyen H,
Schlessinger
K,
Levy
DE,
Stark
GR.
Novel
roles
of
unphosphorylated STAT-3 in oncogenesis and transcriptional
regulation. Cancer Res 2005; 65: 939-47.
136
116. Altunkaynak BZ, Özbek E. Programlanmış hücre ölümü: apoptoz
nedir? Tıp Arş Der 2008; 6(2): 93-104.
117. Saikumar P, Dong Z, Mikhailov V, Denton M, Weinberg JM,
Venkatachalam MA. Apoptosis: definition, mechanisms, and
relevance to disease. Am J Med 1999; 107(5): 489-506.
118. Kerr JF, Wyllie AH, Currie AR. Apoptosis: a basic biological
phenomenon with wide ranging implications in tissue kinetics. Br J
Cancer 1972; 26(4): 239-57.
119. Elmore S. Apoptosis: a review of programmed cell death. Toxicol
Pathol 2007; 35(4): 495-516.
120. Danial NN, Korsmeyer SJ. Cell death: critical control points. Cell
2004; 116: 205-19.
121. Hengartner MO. The biochemistry of apoptosis. Nature 2000; 407:
770-6.
122. Jin Z, El-Deiry WS. Overview of cell death signaling pathways.
Cancer Biol Ther 2005; 4(2): 139-63.
123. Chinnaiyan AM, O’Rourke K, Tewari M, Dixit VM. FADD, a novel
death domain-containing protein, interacts with the death domain of
Fas and initiates apoptosis. Cell 1995; 81(4): 505–12.
124. Riedl S, Yigong S. Molecular mechanisms of caspase regulation
during apoptosis. Nat Rev Mol Biol 2004; 5: 897-907.
125. Lamkanfi M, Festjens N, Declercq W, Vanden Bergle T,
Vandenabeele P. Caspases in cell survival, proliferation and
differentiation. Cell Death Differ 2007; 14: 44-55.
137
126. Li H, Zhu H, Xu CJ, Yuan J. Cleavage of BID by caspase 8
mediates the mitochondrial damage in the Fas patway of apoptosis.
Cell 1998; 94(4): 491-501.
127. Donepudi M, Mac Sweeney A, Briand C, Grutter MG. Insights into
the regulatory mechanism for caspase-8 activation. Mol Cell 2003;
11(2): 543–9.
128. Klener P Jr, Andera L, Klener P, Necas E, Zivny J. Cell death
signalling
pathways
in
the
pathogenesis
and
therapy
of
haematologic malignancies: overview of apoptotic pathways. Folia
Biol (Praha) 2006; 52(1-2): 34-44.
129. Green DR, Kroemer G. The pathophysiology of mitochondrial cell
death. Science 2004; 305 (5684): 626–9.
130. Goldstein JC, Waterhouse NJ, Juin P, Evan GI, Green DR. The
coordinate release of cytochrome c during apoptosis is rapid,
complete and kinetically invariant. Nat Cell Biol 2000; 2(3):156–62.
131. Kluck RM, Bossy-Wetzel E, Green DR, Newmeyer DD. The release
of cytochrome c from mitochondria: a primary site for Bcl-2
regulation of apoptosis. Science 1997; 275(5303): 1132-6.
132. Cory S, Huang DC, Adams JM. The Bcl-2 family: roles in cell
survival and oncogenesis. Oncogene 2003; 22(53): 8590–607.
133. Puentes-Prior D, Salvesen GS. The protein structures that shape
caspase activity, specificity, activation and inhibition. Biochem J
2004; 384: 201-232.
134. Shi Y. Mechanisms of caspase activation and inhibition during
apoptosis. Mol Cell 2002; 9(3): 459-70.
138
135. Tsujimoto Y. Role of Bcl-2 family of proteins in apoptosis,
apoptosomes or mitochondria. Genes Cell 1998; 3: 697-707.
136. Zou H, Li Y, Liu X, Wang X. An APAF-1-cytochrome c multimeric
complex is a functional apoptosome that activates procaspase-9. J
Biol Chem 1999; 274(17):11549–56.
137. [internette]. [22 Mayıs 2012 tarihinde okundu]. elektronik adresi:
http://www.bioscience.org/2009/v14/af/3509/fulltext.asp?bframe=fig
ures.htm&doi=yes
138. Miyashita T, Krajewski S, Krajewska M, Wang HG, Lin HK,
Liebermann DA, et al. Tumor suppressor P53 is regulator of Bcl-2
and Bax gene expression in vitro and in vivo. Oncogene 1994; 9:
1799-1805.
139. Özkaya AB. HCT-116 Kolon Kanser Hücre Hattında Yeşil Çay
Etken Maddesi Olan (-)-epigallokatekin-3-gallat’ın Apoptoz Üzerine
Etkisinin İncelenmesi. Yüksek Lisans Tezi. İzmir: Dokuz Eylül
Üniversitesi; 2009.
140. Cregan SP, Mac Laurin JG, Craig CG, Robertson GS, Nicholson
DW, Park DS, Slack R. Bax-dependent caspase-3 activation is a
key determinant in p53-induced apoptosis in neurons. J neuroscr
1999; 19 (18): 7860-69.
141. Levin AJ. P53, the cellular gatekeeper for growth and division. Cell
1997; 83(3): 323-31.
142. Kumar S. Caspase function in programmed cell death. Cell Death
Differ 2007; 14: 32-43.
143. Donepudi M, Grutter MG. Structure and zymogen activation of
caspase. Biophsical Chem 2002; 101: 145-53.
139
144. Öztürk F. Apopitoz. İnönü Üniversitesi Tıp Fakültesi Dergisi 2002;
9(2): 143–148.
145. Yehielly F, Deiss LP. Apoptosis and cancer, Basic Science of
Cancer In: Kruh GD, Tew KD, editors. Chapter 11. Philadelpphia:
Current Medicine ınc; 2000.
146. Igney FH, Krammer PH. Death and anti-death: Tumor resistance to
apoptosis. Nat Rev Cancer 2002; 2: 277-88.
147. Okada H, Mak TW. Patway of apoptotik and non-apoptotik death in
tumour cells. Nat Rev Cancer 2004; 4: 592-603.
148. Jaattela M. Escaping cell death, survival proteins in cancer. Exp
Cell Research 1999; 248(1): 30-43.
149. Fadeel B, Orrenius S. Apoptosis: a basic biological phenomenon
with wide-ranging implications in human disease. J İnternal Med
2005; 258: 479-517.
150. Jaattela M. Multiple cell death patways as regulators of tumor
initiation and progression. Oncogene 2004; 449(2): 175-185.
151. Kaufmann SH, Earnshaw WC. Induction of apoptosis by cancer
chemotherapy. Exp Cell Res 2000; 256: 42–9.
152. Alberts B, Johnson A, Lewis J, Raff M, Roberts K, Walter P. The
Cell Cycle And Programmed Cell Death. Molecular Biology of the
Cell. Garland Science 2007; 991.
153. Zetterberg A, EngstromW, Larsson O. Growth activation of resting
cells: induction of balanced and imbalanced growth. Ann N Y Acad
Sci 1982; 397: 130–147.
140
154. Murray AW. Recycling the cell cycle: cyclins revisited. Cell 2004;
116: 221–234.
155. Nigg EA. Cyclin-dependent protein kinases: key regulators of the
eukaryotic cell cycle. Bioessays 1995; 17(6): 471–80.
156. Stephen JE. Cell Cycle Checkpoints: Preventing an Identity Crisis.
Science 1996; 274 (5293): 1664-1672.
157. Sheng H, Shao J, Townsend CM Jr, Evers BM. Phosphatydilinositol
3-kinase mediates proliferative signals in intestinal epithelial cells.
Gut 2003; 52: 1472-1478.
158. Macaluso M, Montanari M, Cinti C, Giordano A. Modulation of cell
cycle components by epigenetic and genetic events. Semin Oncol
2005; 32(5): 452-7.
159. Sherr CJ. Cancer Cell Cycles. Science 1996; 274: 19672-7.
160. Zhang H. Molecular signaling and genetic pathways of senescence:
Its role in tumorigenesis and aging. J Cell Physiol 2007; 210(3):
567-74.
161. Tetsu O, McCormick F. Β-catenin regulates expression of cyclin D1
in colon carcinoma cells. Nature 1999; 398; 422-426.
162. Murillo CA, Rychahou PG, Evers BM. RNAi-mediated inhibiton of
cyclin D1 decreases colon cancer cell proliferation and MMP protein
expression. Alim Tract 2004; 199: 11.
163. Tsihlias J, Kapusta L, Singerland J. The Prognostic Significance of
Altered Cyclin-Dependent Kinase Inhibitors in Human Cancer.
Anneual Review of Medicine 1999; 50: 401-23.
141
164. Nho RS, Sheaff RJ. p27Kip1 Contributions to Cancer. Progression
in Cell Cycle Research 2003; 5: 249-59.
165. Deschênes C, Vézina A, Beaulieu JF, Rivard N. Role of p27Kip1 in
Human Intestinal Cell Differentiation. Gastroenterology 2001; 120:
423-38.
166. Bastians H, Townsley FM, Ruderman JV. The Cyclin-Dependent
Kinase Inhibitor p27Kip1 Induces N-terminal Proteolytic Cleavage of
Cyclin A. PNAS 1998; 95: 5374-81.
167. Blain S, Massagué J. Breast cancer banishes p27 from nucleus.
Nat Med 2002; 8: 1076-8.
168. Viglietto G, Motti ML, Bruni P, Melillo RM, D'Alessio A, Califano D,
et al. Cytoplasmic relocalization and inhibition of the cyclindependent
kinase
inhibitor
p27Kip1
by
PKB/Akt-mediated
phosphorylation in breast cancer. Nat Med 2002; 8: 1136-44.
169. Elledge SJ, Harper JW. Cdk inhibitors: on the threshold of
checkpoints and development. Curr Opin Cell Biol 1994; 6: 847-52.
170. Shin I, Yakes FM, Rojo F, Shin NY, Bakin AV, Baselga J, et al.
PKB/Akt mediates cell-cycle progression by phosphorylation of
p27Kip1 at threonine 157 and modulation of its cellular localization.
Nat Med 2002; 8: 1145-52.
171. Liang J, Zubovitz J, Petrocelli T, Kotchetkov R, Connor MK, Han K,
et al. PKB/Akt phosphorylates p27, impairs nuclear import of p27
and opposes p27-mediated G1 arrest. Nat Med 2002; 8: 1153-60.
172. Adams PD, Kaelin WG. Negative Control Elements of the Cell
Cycle in Human Tumors. Current Opinion in Cell Biology 1998; 10:
791-7.
142
173. Narita Y, Nagane M, Mishima K, Huang HJ, Furnari FB, Cavenee
WK.
Mutant
epidermal
growth
factor
receptor
signaling
downregulates p27 through activation of the phosphatidylinositol 3kinase/Akt pathway in glioblastomas. Cancer Res 2002; 62: 67646769.
174. Liang YC, Lin-Shiau SY, Chen CF, Lin JK. Inhibition of cyclindependent kinases 2 and 4 activities as well as induction of Cdk
inhibitors p21 and p27 during growth arrest of human breast
carcinoma cells by (-)-epigallocatechin-3-gallate. J Cell Biochem
1999; 75: 1–12.
175. Woodburn JR. The epidermal growth factor receptor and its
inhibition in cancer therapy. Pharmacol Ther 1999; 82: 241–250.
176. Lurje G, Lenz HJ. EGFR signaling and drug discovery. Oncology
2009; 77(6): 400-410.
177. Raymond E, Faivre S, Armand JP. Epidermal growth factor receptor
tyrosine kinase as a target for anticancer therapy. Drugs 2000; 60:
15-23.
178. Wakeling AE, Guy SP, Woodburn JR, et al. ZD1839 (Iressa): an
orally active inhibitor of epidermal growth factor signaling with
potential for cancer therapy. Cancer Res 2002; 62: 5749–5754.
179. Lubet RA, Szabo E, Christov K, Bode AM, Ericson ME, Steele VE,
et al. Effects of gefitinib (Iressa) on mammary cancers: preventive
studies with varied dosages, combinations with vorozole or
targretin, and biomarker changes. Mol Cancer Ther 2008; 7(4): 9729.
143
180. Paez JG, Janne PA, Lee JC, et al. EGFR mutations in lung cancer:
correlation with clinical response to gefitinib therapy. Science 2004;
304: 1497– 500.
181. Woodburn JR, Barker AJ, Wakeling A, Valcaccia BE, Cartlidge SA,
Davies DH. 6-Amino-4(3-methyl-phenylamino)- quinazoline: an
EGF receptor tyrosine kinase inhibitor with activity in a range of
human tumour xenografts. Proc Am Assoc Cancer Res 1996; 37:
390–391.
182. Barker AJ. Studies leading to the identification of ZD1839
(IRESSA): an orally active, selective epidermal growth factor
receptor tyrosine kinase inhibitor targeted to the treatment of
cancer. Bioorg Med Chem Lett 2001; 11: 1911–1914.
183. [internette]. [28 Mayıs 2012 tarihinde okundu]. elektronik adresi:
FDA
Drug
Approvals
http://www.fda.gov/cder/foi/label/2003/21399_iressa_lbl.
List,
pdf>
(2003).
184. Cohen MH, Williams GA, Sridhara R, et al. United States Food and
Drug Administration Drug Approval summary: Gefitinib (ZD1839;
Iressa) tablets. Clin Cancer Res 2004; 10: 1212-1218.
185. [internette]. [19 Şubat 2012 tarihinde okundu]. elektronik adresi:
http://en.wikipedia.org/wiki/File:Gefitinib_structure.svg
186. Dancey J, Sausville EA. Issues and progress with protein kinase
inhibitors for the treatment of cancer. Nature Rev Drug Disc 2003;
2: 296–313.
187. Ciardiello F, Caputo R, Bianco R, Damiano V, Pomatico G, De
Placido S, et al. Antitumor effect and potentiation of cytotoxic drugs
activity in human cancer cells by ZD-1839 (Iressa), an epidermal
144
growth factor receptorselective tyrosine kinase inhibitor. Clin
Cancer Res 2000; 6: 2053-2063.
188. Sirotnak FM. Studies with ZD1839 in preclinical models. Semin
Oncol 2003; 30: 12-20.
189. Dancey J, Sausville EA. Issues and progress with protein kinase
inhibitors for the treatment of cancer. Nature Rev Drug Discov.
2003; 2: 325–334.
190. Sirotnak FM, Zakowski MF, Miller VA, et al. Efficacy of cytotoxic
agents against human tumor xenografts is markedly enhanced by
coadministration of ZD1839 (Iressa), an inhibitor of EGFR tyrosine
kinase. Clin Cancer Res 2000; 6: 4885-92.
191. Lee CC, Houghton P. Cytotoxicity of plants from Malaysia and
Thailand used traditionally to treat cancer. J Ethnopharmacol 2005;
100: 237–243.
192. McGovern PE, Christofidou-SolomidouM, Wang W, Dukes F,
Davidson T, El-Deiry WS. Anticancer activity of botanical
compounds in ancient fermented beverages (review). Int J Oncol
2010; 37: 5–14.
193. Jayaprakasam
antiinflammatory
B,
Seeram
activities
NP,
of
Nair
MG.
cucurbitacins
Anticancer
from
and
Cucurbita
andreana. Cancer Lett 2003; 189(1): 11–16.
194. Efferth T, Kahl S, Paulus K, Adams M, Rauh R, Boechzelt H, et al.
Phytochemistry and pharmacogenomics of natural products derived
from traditional Chinese medicine and Chinese materia media with
activity against tumor cells. Mol Cancer Ther 2008; 7: 152–161.
145
195. Ramos S. Cancer chemoprevention and chemotherapy: dietary
polyphenols and signalling pathways. Mol Nutr Food Res 2008; 52:
507–526.
196. Chen JC, Chiu MH, Nie RL, Cordell GA, Qiu SX. Cucurbitacins and
cucurbitane glycosides: structures and biological activities. Nat Prod
Rep 2005; 22: 386–399.
197. Peters RR, Farias MR, Ribeiro-do-Valle RM. Anti-inflammatory and
analgesic effects of cucurbitacins from Wilbrandia ebracteata.
Planta Med 1997; 63: 525–528.
198. Peters RR, Baier Krepsky P, Siqueira-Junior JM, da Silva Rocha
JC, Marques Bezerra M, de Albuquerque Ribeiro R, de BrumFernandes AJ, et al. Nitric oxide and cyclooxygenase may
participate in the analgesic and anti-inflammatory effect of the
cucurbitacins fraction from Wilbrandia ebracteata. Life Sci 2003; 73:
2185–2197.
199. Lee KH. Discovery and development of natural product-derived
chemotherapeutic
agents
based
on
a
medicinal
chemistry
approach. J Nat Prod 2010; 73(3): 500-16.
200. Lee DH, Iwanski GB, Thoennissen NH. Cucurbitacin: ancient
compound shedding new light on cancer treatment. Scientific World
Journal 2010; 10: 413-8.
201. Lavie D, Glotter E. The cucurbitanes, a group of tetracyclic
triterpenes. Fortschr Chem Org Naturst 1971; 29: 307-62.
202. Escandell JM, Kaler P, Recio MC, Sasazuki T, Shirasawa S,
Augenlicht L, et al. Activated kRas protects colon cancer cells from
cucurbitacin-induced apoptosis: The role of p53 and p21. Biochem
Pharmacol 2008; 76: 198-207.
146
203. Zhang M, Zhang H, Sun C, Shan X, Yang X, Li-Ling J, Deng Y.
Targeted constitutive activation of signal transducer and activator of
transcription 3 in human hepatocellular carcinoma cells by
cucurbitacin B. Cancer Chemother Pharmacol 2009; 63: 635-642.
204. [internette]. [19 Şubat 2012 tarihinde okundu]. elektronik adresi:
http://home.ncifcrf.gov/mtdp/catalog/compounds/49451.html
205. Clericuzio M, Mella M, Vita-Finzi P, Zema M, Vidari G. Cucurbitane
triterpenoids from Leucopaxillus gentianeus. J Nat Prod 2004; 67:
1823–1828.
206. Peters RR, Saleh TF, Lora M, Patry C, de Brum-Fernandes AJ,
Farias MR, et al. Anti-inflammatory effects of the products from
Wilbrandia ebracteata on carrageenan-induced pleurisy in mice.
Life Sci 1999; 64(26): 2429-37.
207. Liu T, Zhang M, Zhang H, Sun C, Deng Y. Inhibitory effects of
cucurbitacin B on laryngeal squamous cell carcinoma. Eur Arch
Otorhinolaryngol 2008; 265(10): 1225-1232.
208. Aggarwal BB, Sethi G, Ahn KS, Sandur SK, Pandey MK,
Kunnumakkara AB, et al. Targeting signal-transducer-and-activatorof-transcription-3 for prevention and therapy of cancer: modern
target but ancient solution. Ann N Y Acad Sci 2006; 1091: 151-69.
209. Wakimoto N, Yin D, O’Kelly J, Haritunians T, Karlan B, Said J, et al.
Cucurbitacin B has a potent antiproliferative effect on breast cancer
cells in vitro and in vivo. Cancer Sci 2008, 99: 1793–1797.
210. Yin D, Wakimoto N, Xing H, Lu D, Huynh T, Wang X, et al.
Cucurbitacin B markedly inhibits growth and rapidly affects the
cytoskeleton in glioblastoma multiforme. Int J Cancer 2008, 123:
1364–1375.
147
211. Haritunians T, Gueller S, Zhang L, Badr R, Yin D, Xing H, et al.
Cucurbitacin B induces differentiation, cell cycle arrest, and actin
cytoskeletal alterations in myeloid leukemia cells. Leuk Res 2008,
32: 1366–1373.
212. Thoennissen NH, Iwanski GB, Doan NB, Okamoto R, Lin P,
Abbassi S, et al. Cucurbitacin B induces apoptosis by inhibition of
the JAK/STAT pathway and potentiates antiproliferative effects of
gemcitabine on pancreatic cancer cells. Cancer Res 2009; 69:
5876–5884.
213. Liu T, Zhang M, Zhang H, Sun C, Yang X, Deng Y, et al. Combined
antitumor activity of cucurbitacin B and docetaxel in laryngeal
cancer. Eur J Pharmacol 2008; 587: 78-84.
214. Shi X, Franko B, Frantz C, Amin HM, Lai R. JSI-124 (cucurbitacin I)
inhibits
Janus
kinase-3/signal
transducer
and
activator
of
transcription-3 signalling, downregulates nucleophosmin-anaplastic
lymphoma kinase (ALK), and induces apoptosis in ALK-positive
anaplastic large cell lymphoma cells. Br J Haematol 2006; 135: 26–
32.
215. Toyonaga T, Nakano K, Nagano M, Zhao G, Yamaguchi K, Kuroki
S, et al. Blockade of constitutively activated Janus kinase/signal
transducer and activator of transcription-3 pathway inhibits growth
of human pancreatic cancer. Cancer Lett 2003; 201(1): 107–116.
216. Jing N, Tweardy DJ. Targeting Stat3 in cancer therapy. Anticancer
Drugs 2005; 16: 601–607.
217. Fogh J, Fogh JM, Orfeo T. One hundred and twenty-seven cultured
human tumor cell lines producing tumors in nude mice. J Natl
Cancer Inst 1977; 59: 221-226.
148
218. Fogh J, Trempe G. New human tumor cell lines in human tumor
cells in vitro. In Human Tumor Cells in Vitro. In: J. Fogh, editor. New
York: Plenum Pres;1975. p.115-159.
219. [internette].
[01
Ocak
2012’da
okundu].
elektronik
adresi:
http://www.lgcstandardsatcc.org/LGCAdvancedCatalogueSearch/ProductDescription/tabid/1
068/Default.aspx?ATCCNum=HTB-38&Template=cellBiology
220. [internette].
[01
Ocak
2012’da
okundu].
elektronik
adresi:
http://www.lgcstandards-atcc.org/Attachments/1986.jpg
221. Brattain MG, Fine WD, Khaled FM, Thompson J, Brattain DE.
Heterogeneity of malignant cells from a human colonic carcinoma.
Cancer Res 1981; 41: 1751-1756.
222. Brattain MG, Brattain DE, Sarrif AM, McRae LJ, Fine WD, Hawkins
JG. Enhancement of growth of human colon tumor cell lines by
feeder layers of murine fibroblasts. J Natl Cancer Inst 1982; 69:
767-771.
223. [internette].
[01
Ocak
2010’da
okundu].
elektronik
adresi:
http://www.lgcstandardsatcc.org/LGCAdvancedCatalogueSearch/ProductDescription/tabid/1
068/Default.aspx?ATCCNum=CCL-247&Template=cellBiology
224. [internette].
[01
Ocak
2010’da
okundu].
elektronik
adresi:
http://www.lgcstandards-atcc.org/Attachments/1762.jpg
225. Rubins JB, Greatens T, Kratzke RA, Tan AT, Polunovsky VA,
Bitterman
P.
Lovastatin
induces
apoptosis
in
malignant
mesothelioma cells. Am J Respir Crit Care Med 1998; 157(5 Pt 1):
1616-22.
149
226. Korzeniewski C, Callewaert DM. An enzyme-release assay for
natural cytotoxicity. J Immunol Methods 1983; 64(3): 313-20.
227. Decker T, Lohmann-Matthes ML. A quick and simple method for the
quantitation of lactate dehydrogenase release in measurements of
cellular cytotoxicity and tumor necrosis factor (TNF) activity. J
Immunol Methods 1988; 115(1): 61-9.
228. Coşkun-Arı FF. Western Blotlama Yöntemi ile Protein Tespiti. In:
Uygulamalı Hücre Kültürü Teknikleri Kurs Kitabı-I. Karaöz E, Ovalı
E, eidtörler. 2003a; 189-198. Isparta Türkiye.
229. Coşkun-Arı FF. Western Blot Uygulaması. In: Uygulamalı Hücre
Kültürü Teknikleri Kurs Kitabı-II. Karaöz E, Ovalı E, editörler. 2003b:
72-79. Isparta Türkiye.
230. Pfaffl MW, Horgan GW, Dempfle L. Relative expression software
tool (REST) for group-wise comparison and statistical analysis of
relative expression results in real-time PCR. Nucleic Acids Res
2002; 30(9): e36.
231. Swaffar DS, Holley CJ, Fitch RW, Elkin KR, Zhang C, Sturgill JP, et
al. Phytochemical investigation and in vitro cytotoxic evaluation of
alkaloids from Abuta rufescens. Planta Med 2012; 78(3): 230-2.
232. Vuorelaa P, Leinonenb M, Saikkuc P, Tammelaa P, Rauhad JP,
Wennberge T, et al. Natural products in the process of finding new
drug candidates. Curr Med Chem 2004; 11(11): 1375-89.
233. Setzer WN, Setzer MC. Plant-derived triterpenoids as potential
antineoplastic agents. Mini Rev Med Chem 2003; 3(6) :540-56.
150
234. Mehta RG, Murillo G, Naithani R, Peng X. Cancer chemoprevention
by natural products: how far have we come? Pharm Res 2010;
27(6): 950-61.
235. Chen H, Yao K, Nadas J, Bode AM, Malakhova M, Oi N, et al.
Prediction of molecular targets of cancer preventing flavonoid
compounds using computational methods. PLoS One 2012; 7(5):
e38261.
236. Tannin-Spitz T, Grossman S, Dovrat S, Gottlieb HE, Bergman M.
Growth inhibitory activity of cucurbitacin glucosides isolated from
Citrullus colocynthis on human breast cancer cells. Biochem
Pharmacol 2007; 73(1): 56-67.
237. Bartalis J, Halaweish FT. Relationship between cucurbitacins
reversed-phase
high-performance
liquid
chromatography
hydrophobicity index and basal cytotoxicity on HepG2 cells. J
Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci 2005; 818(2): 15966.
238. Blaskovich MA, Sun J, Cantor A, Turkson J, Jove R, Sebti SM.
Discovery
of
JSI-124
(cucurbitacin
I),
a
selective
Janus
kinase/signal transducer and activator of transcription 3 signaling
pathway inhibitor with potent antitumor activity against human and
murine cancer cells in mice. Cancer Res 2003; 63(6): 1270-9.
239. Chan KT, Li K, Liu SL, Chu KH, Toh M and Xie WD: Cucurbitacin B
inhibits STAT3 and the Raf/Mek/Erk pathway in leukemia cell line
K562. Cancer Lett 2009; 289: 46-52.
240. Zhang M, Sun C, Shan X, Yang X, Li-Ling J, Deng Y. Inhibition of
pancreatic cancer cell growth by cucurbitacin B through modulation
151
of signal transducer and activator of transcription 3 signaling.
Pancreas 2010; 39(6): 923-9.
241. Sun J, Blaskovich MA, Jove R, Livingston SK, Coppola D, Sebti
SM. Cucurbitacin Q: a selective STAT3 activation inhibitor with
potent antitumor activity. Oncogene 2005; 24(20): 3236-45.
242. Sahu RP, Srivastava SK. The Role of STAT-3 in the Induction of
Apoptosis in Pancreatic Cancer Cells by Benzyl Isothiocyanate. J
Natl Cancer Inst 2009; 101: 176–193.
243. Kang H, O'Connell JB, Leonardi MJ, Maggard MA, McGory ML, Ko
CY. Rare tumors of the colon and rectum: a national review. Int J
Colorectal Dis 2007; 22(2): 183-9.
244. Rodrigues NR, Rowman A, Smith ME, Kerr IB, Bodmer WF,
Gannon JV, et al. p53 mutations in colorectal cancer. Proc Natl
Acad Sci USA 1990; 87: 7555–7559.
245. Schroy PC, Brown SS, Kim K, Johnson KA, Murnane MJ, Yang S,
et al. Detection of p21ras mutations in colorectal adenomas and
carcinomas by enzyme-linked immunosorbent assay. Cancer 1995;
76: 201–209.
246. Evans ME, Jones DP, Ziegler TR. Glutamine prevents cytokineinduced apoptosis in human colonic epithelial cells. J Nutr 2003;
133(10): 3065-71.
247. Yasuda S, Yogosawa S, Izutani Y, Nakamura Y, Watanabe H,
Sakai T. Cucurbitacin B induces G2 arrest and apoptosis via a
reactive oxygen species-dependent mechanism in human colon
adenocarcinoma SW480 cells. Mol Nutr Food Res 2010; 54: 559–
565.
152
248. Zhou X, Yang J, Wang Y, Li W, Li-Ling J, Deng Y, et al.
Cucurbitacin B inhibits 12-O-tetradecanoylphorbol 13-acetateinduced invasion and migration of human hepatoma cells through
inactivating mitogen-activated protein kinase and PI3K/Akt signal
transduction pathways. Hepatol Res 2012; 42(4): 401-11.
249. Ouyang D, Zhang Y, Xu L, Li J, Zha Q, He X. Histone deacetylase
inhibitor valproic acid sensitizes B16F10 melanoma cells to
cucurbitacin B treatment. Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai)
2011; 43(6): 487-95.
250. Iwanski GB, Lee DH, En-Gal S, Doan NB, Castor B, Vogt M, et al.
Cucurbitacin B, a novel in vivo potentiator of gemcitabine with low
toxicity in the treatment of pancreatic cancer. Br J Pharmacol 2010;
160(4): 998-1007.
251. Chen W, Leiter A, Yin D, Meiring M, Louw VJ, Koeffler HP.
Cucurbitacin B inhibits growth, arrests the cell cycle, and
potentiates antiproliferative efficacy of cisplatin in cutaneous
squamous cell carcinoma cell lines. Int J Oncol 2010; 37(3): 737-43.
252. Kongtun
S,
Jiratchariyakul
W,
Kummalue T, Tan-ariya
P,
Kunnachak S, Frahm AW. Cytotoxic properties of root extract and
fruit juice of Trichosanthes cucumerina. Planta Med 2009; 75: 839–
842.
253. Zhang Y, Ouyang D, Xu L, Ji Y, Zha Q, Cai J, et al. Cucurbitacin B
induces rapid depletion of the G-actin pool through reactive oxygen
species-dependent actin aggregation in melanoma cells. Acta
Biochim Biophys Sin (Shanghai). 2011; 43(7): 556-67.
254. Lee DH, Thoennissen NH, Goff C, Iwanski GB, Forscher C, Doan
NB, et al. Synergistic effect of low-dose cucurbitacin B and low153
dose methotrexate for treatment of human osteosarcoma. Cancer
Lett 2011; 306(2): 161-70.
255. Liu T, Peng H, Zhang M, Deng Y, Wu Z. Cucurbitacin B, a small
molecule inhibitor of the Stat3 signaling pathway, enhances the
chemosensitivity of laryngeal squamous cell carcinoma cells to
cisplatin. Eur J Pharmacol 2010; 641(1): 15-22.
256. Liu T, Zhang M, Deng Y, Zhang H, Sun C, Yang X, et al. Effects of
cucurbitacin B on cell proliferation and apoptosis in Hep-2 cells. Lin
Chung Er Bi Yan Hou Tou Jing Wai Ke Za Zhi 2008; 22(9): 403-7.
257. Duangmano S, Sae-Lim P, Suksamrarn A, Patmasiriwat P, Domann
FE. Cucurbitacin B Causes Increased Radiation Sensitivity of
Human Breast Cancer Cells via G2/M Cell Cycle Arrest J Oncol
2012; 2012: 601682.
258. Duangmano S, Dakeng S, Jiratchariyakul W, Suksamrarn A, Smith
DR, Patmasiriwat P. Antiproliferative Effects of Cucurbitacin B in
Breast
Cancer
Cells:
Down-Regulation
of
the
c-
Myc/hTERT/Telomerase Pathway and Obstruction of the Cell
Cycle. Int J Mol Sci 2010; 11(12): 5323-38.
259. Dakeng S, Duangmano S, Jiratchariyakul W, U-Pratya Y, Bögler O,
Patmasiriwat P. Inhibition of Wnt signaling by cucurbitacin B in
breast cancer cells: reduction of Wnt-associated proteins and
reduced translocation of galectin-3-mediated β-catenin to the
nucleus. J Cell Biochem 2012; 113(1): 49-60.
260. Lang KL, Silva IT, Zimmermann LA, Machado VR, Teixeira MR,
Lapuh MI, et al. Synthesis and cytotoxic activity evaluation of
dihydrocucurbitacin B and cucurbitacin B derivatives. Bioorg Med
Chem 2012; 20(9): 3016-30.
154
261. Chan KT, Meng FY, Li Q, Ho CY, Lam TS, To Y, et al. Cucurbitacin
B induces apoptosis and S phase cell cycle arrest in BEL-7402
human hepatocellular carcinoma cells and is effective via oral
administration. Cancer Lett 2010; 294(1): 118-24.
262. Molavi O, Ma Z, Mahmud A, Alshamsan A, Samuel J, Lai R, et al.
Polymeric micelles for the solubilization and delivery of STAT3
inhibitor cucurbitacins in solid tumors. Int J Pharm 2008; 347(1-2):
118-27.
263. Su Y, Li G, Zhang X, Gu J, Zhang C, Tian Z, et al. JSI-124 inhibits
glioblastoma multiforme cell proliferation through G(2)/M cell cycle
arrest and apoptosis augment. Cancer Biol Ther 2008; 7(8): 1243-9.
264. Meng D, Qiang S, Lou L, Zhao W. Cytotoxic cucurbitane-type
triterpenoids from
Elaeocarpus hainanensis. Planta Med 2008;
74(14): 1741-4.
265. Muir D, Varon S, Manthorpe M. An enzyme-linked immunosorbent
assay
for
bromodeoxyuridine
incorporation
using
fixed
microcultures. Anal Biochem 1990; 185(2): 377-82.
266. Hawker JR Jr. Chemiluminescence-based BrdU ELISA to measure
DNA synthesis. J Immunol Methods 2003; 274(1-2): 77-82.
267. Ucker DS, Obermiller PS, Eckhart W, Apgar JR, Berger NA, Meyers
J. Genome digestion is a dispensable consequence of physiological
cell death mediated by cytotoxic T lymphocytes. Mol Cell Biol 1992;
12(7): 3060-9.
268. Oberhammer F, Wilson JW, Dive C, Morris ID, Hickman JA,
Wakeling AE, et al. Apoptotic death in epithelial cells: cleavage of
DNA to 300 and/or 50 kb fragments prior to or in the absence of
internucleosomal fragmentation. EMBO J 1993; 12(9): 3679-84.
155
269. Sakahira H, Enari M, Ohsawa Y, Uchiyama Y, Nagata S. Apoptotic
nuclear morphological change without DNA fragmentation. Curr Biol
1999; 9(10): 543-6.
270. Rezaei PF, Fouladdel S, Hassani S, Yousefbeyk F, Ghaffari SM,
Amin G, et al. Induction of apoptosis and cell cycle arrest by
pericarp polyphenol-rich extract of Baneh in human colon
carcinoma HT29 cells. Food Chem Toxicol 2012; 50(3-4): 1054-9.
271. Altonsy
MO,
Andrews
SC.
Diallyl
disulphide,
a
beneficial
component of garlic oil, causes a redistribution of cell-cycle growth
phases,
induces
apoptosis,
and
enhances
butyrate-induced
apoptosis in colorectal adenocarcinoma cells (HT-29). Nutr Cancer
2011; 63(7): 1104-13.
272. Yuan HD, Quan HY, Zhang Y, Kim SH, Chung SH. 20(S)Ginsenoside Rg3-induced apoptosis in HT-29 colon cancer cells is
associated with AMPK signaling pathway. Mol Med Report 2010;
3(5): 825-31.
273. Tsai YL, Chiu CC, Yi-Fu Chen J, Chan KC, Lin SD. Cytotoxic
effects of Echinacea purpurea flower extracts and cichoric acid on
human colon cancer cells
through induction of apoptosis. J
Ethnopharmacol 2012; 143(3): 914-9.
274. Park JB, Lee MS, Cha EY, Lee JS, Sul JY, Song IS, et al.
Magnolol-Induced Apoptosis in HCT-116 Colon Cancer Cells Is
Associated with the AMP-Activated Protein Kinase Signaling
Pathway. Biol Pharm Bull 2012; 35(9): 1614-20.
275. Manikandan R, Beulaja M, Arulvasu C, Sellamuthu S, Dinesh D,
Prabhu D, et al. Synergistic anticancer activity of curcumin and
156
catechin: an in vitro study using human cancer cell lines. Microsc
Res Tech 2012; 75(2): 112-6.
276. Nicholson DW, Thornberry NA. Caspases: killer proteases. Trends
Biochem Sci 1997; 22(8): 299-306.
277. Enari M, Sakahira H, Yokoyama H, Okawa K, Iwamatsu A, Nagata
S. A caspase-activated DNase that degrades DNA during
apoptosis, and its inhibitor ICAD. Nature 1998; 391(6662): 43-50.
278. Boykin C, Zhang G, Chen YH, Zhang RW, Fan XE, Yang WM, et al.
Cucurbitacin IIa: a novel class of anti-cancer drug inducing nonreversible actin aggregation and inhibiting survivin independent of
JAK2/STAT3 phosphorylation. Br J Cancer 2011; 104(5): 781-9.
279. Yang L, Wu S, Zhang Q, Liu F, Wu P. 23,24-Dihydrocucurbitacin B
induces
G2/M
cell-cycle
arrest
and
mitochondria-dependent
apoptosis in human breast cancer cells (Bcap37). Cancer Lett
2007; 256(2): 267-78.
280. Suzui M, Inamine M, Kaneshiro T, Morioka T, Yoshimi N, Suzuki R,
et al. Indole-3-carbinol inhibits the growth of human colon
carcinoma cells but enhances the tumor multiplicity and volume of
azoxymethane-induced rat colon carcinogenesis. Int J Oncol 2005;
27(5): 1391-9.
281. Tabopda TK, Mitaine-Offer AC, Miyamoto T, Tanaka C, Mirjolet JF,
Duchamp O, et al. Triterpenoid saponins from Hydrocotyle
bonariensis Lam. Phytochemistry 2012; 73(1): 142-7.
282. Malek SN, Lee GS, Hong SL, Yaacob H, Wahab NA, Faizal Weber
JF, et al. Phytochemical and cytotoxic investigations of Curcuma
mangga rhizomes. Molecules 2011; 16(6): 4539-48.
157
283. Watson JL, Hill R, Lee PW, Giacomantonio CA, Hoskin DW.
Curcumin induces apoptosis in HCT-116 human colon cancer cells
in a p21-independent manner. Exp Mol Pathol 2008; 84(3): 230-3.
284. Scott DW, Loo G. Curcumin-induced GADD153 gene up-regulation
in human colon cancer cells. Carcinogenesis 2004; 25(11): 215564.
285. Tseng LM, Huang PI, Chen YR, Chen YC, Chou YC, Chen YW, et
al. Targeting signal transducer and activator of transcription 3
pathway
by
cucurbitacin
I
diminishes
self-renewing
and
radiochemoresistant abilities in thyroid cancer-derived CD133+
cells. J Pharmacol Exp Ther 2012; 341(2): 410-23.
286. Ding N, Yamashita U, Matsuoka H, Sugiura T, Tsukada J, Noguchi
J, et al. Apoptosis induction through proteasome inhibitory activity
of cucurbitacin D in human T-cell leukemia. Cancer 2011; 117(12):
2735-46.
287. Li Y, Wang R, Ma E, Deng Y, Wang X, Xiao J, et al. The induction
of G2/M cell-cycle arrest and apoptosis by cucurbitacin E is
associated with increased phosphorylation of eIF2alpha in leukemia
cells. Anticancer Drugs 2010; 21(4): 389-400.
288. Murray AW. Recycling the cell cycle: cyclins revisited. Cell 2004;
116: 221–234.
158
10. EKLER
Doktora eğitimim ve tez çalışmalarım süresince ilgisini ve
desteğini daima hissettiğim, engin mesleki bilgi ve tecrübeleriyle
eğitimimde ve çalışmalarımda yoluma ışık tutan, ileri görüşlülüğü ve geniş
bakış açısı ile bana her zaman yol gösteren, sevgi ve hoşgörüsü ile daima
yanımda olan değerli hocam, tez danışmanım, Sn Prof. Dr. Sevda
MENEVŞE’ye,
Doktora eğitimim süresince engin bilgi ve deneyimlerini
büyük bir özveriyle aktaran, desteklerini her zaman hissettiğim çok değerli
hocalarım Sn Prof. Dr. Adnan MENEVŞE’ye ve Sn Prof. Dr. Abdullah
EKMEKÇİ’ye,
Doktora tezimin oluşturulmasında ve her aşamasında
bilgisini ve desteğini her zaman hissettiğim, dostluğunu, yapıcı tutumunu
ve içten yardımlarını esirgemeyen Sn Yrd. Doç. Dr. Ebru ALP’e,
Doktora eğitimim boyunca dostluklarını, tez çalışmalarım
sırasında ise yardımlarını esirgemeyen, birlikte çalışmaktan mutluluk
duyduğum tüm değerli bölüm arkadaşlarıma,
Ailem… Hiçbir teşekkür benim için yaptıklarının karşılığı
olamayacak… Sonsuz sevgilerini her zaman yanımda hissettiğim, büyük
bir özveri ile her zaman ve her konuda bana destek olan, güvenen ve
inanan, büyük emek ve fedakarlıkları ile bugünlere gelmemi sağlayan
annem Sıdıka Rana YAR, babam Fatih YAR ve canımdan çok sevdiğim
biricik kardeşim Cemre Eda YAR’a minnet ve şükran duygularımla,
SONSUZ TEŞEKKÜRLERİMİ SUNARIM…
159
11. ÖZGEÇMİŞ
Adı
: Atiye Seda
Soyadı
: YAR
Doğum Yeri ve Tarihi
: Şanlıurfa, 01.01.1980
Eğitimi
:
2008 -
Gazi Üniversitesi Sağlık Bilimleri Enstitüsü, Tıbbi
Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı, Doktora Eğitimi
2005 - 2008
Gazi Üniversitesi Sağlık Bilimleri Enstitüsü, Tıbbi
Biyoloji ve Genetik Ana Bilim Dalı, Yüksek Lisans
Eğitimi
2004 - 2006
Gazi Üniversitesi Eğitim Bilimleri Enstitüsü, Biyoloji
Öğretmenliği, Tezsiz Yüksek Lisans Eğitimi
2004 - 2005
Ankara Üniversitesi Adli Tıp Enstitüsü, Adli Biyoloji
Anabilim Dalı, Özel Öğrenci
1999 - 2004
Hacettepe Üniversitesi Fen Fakültesi, Biyoloji Bölümü,
Lisans Eğitimi
1995 - 1998
Antalya Çağlayan Lisesi, Lise Eğitimi
1991 - 1995
AKEV Koleji, Ortaokul Eğitimi
1986 - 1991
Selçuk İlkokulu, İlkokul Eğitimi
Yabancı Dili
: İngilizce
Üye Olduğu Bilimsel Kuruluşlar:
Tıbbi Biyoloji ve Genetik Derneği
Moleküler Kanser Araştırmaları Derneği (MOKAD)
The European Association for Cancer Research (EACR)
Bilimsel Etkinlikleri:
Projeler:
1. 2012 yılında Gazi Üniversitesi BAP fonunca desteklenen “Mutant ve
Yabanıl Tip HCT-116 Kolon Kanser Hücre Hatlarında Farnesil
Transferaz İnhibitörünün Apoptotik ve Anti-proliferatif Etkilerinin
Araştırılması” konulu 01/2012-50 kodlu proje.
2. 2011 yılında Gazi Üniversitesi BAP fonunca desteklenen “Kolon
Kanser Hücre Hatlarında Reseptör Tirozin Kinaz Ve JAK-STAT
İnhibitörlerinin Apoptotik ve Anti-proliferatif Etkilerinin Araştırılması”
konulu 01/2011-56 kodlu proje.
3. 2011 yılında TÜBİTAK fonunca desteklenen “Kolon Kanser Hücre
Hatlarında Akt ve ERK1/2 inhibitörlerinin apoptotik ve antiproliferatif etkilerinin araştırılması” konulu 111S054 kodlu proje.
4. 2010 yılında Gazi Üniversitesi BAP fonunca desteklenen “Tiroid
kanser hücre hatlarında Timokinon ve Genistein’in telomeraz
aktivitesi ve apoptozis üzerine etkisi” konulu 01/2010-68 kodlu proje
5. 2010 yılında Gazi Üniversitesi BAP fonunca desteklenen “Yara yaşı
tayininde apoptotik yolaktaki ilgili genlerin ifadelenmesi” konulu
01/2010-78 kodlu proje.
161
6. 2009 yılında Gazi Üniversitesi BAP fonunca desteklenen “Tıkayıcı
Koroner Arter Hastalığı Üzerine Genetik Özelliklerin Etkisi” konulu
01/2009-15 kodlu proje.
7. 2008 yılında Gazi Üniversitesi BAP fonunca desteklenen “Ratlarda
gebeliğin
değişik
dönemlerinde
intrauterin
dokularda
PGF
reseptörlerinin belirlenmesi” konulu 01/2008-33 kodlu proje.
8. 2007
yılında
Gazi
Üniversitesi
BAP
fonunca
desteklenen
“Streptozotocin ile oluşturulmuş diyabetli sıçanlarda Resveratrol
kullanımı
sonucunda
Cyclooxygenase-2
Cyclooxygenase-1
(COX-2)
genlerinin
(COX-1)
ve
ekspresyonlarının
araştırılması” konulu 01/2007-34 kodlu proje.
162
Download